PT1859041E - Moléculas para transportar um composto através da barreira hematoencefálica - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MOLÉCULAS PARA TRANSPORTAR UM COMPOSTO ATRAVÉS DA BARREIRA HEMATOENCEFÁLICA"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a aperfeiçoamentos no campo da administração de fármaco, particularmente, a invenção refere-se a um polipéptidos, da presente invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

No desenvolvimento de uma nova terapia para patologias cerebrais, a barreira hematoencefálica (BBB, do inglês blood-brain barrier) é considerada como um obstáculo maior para a utilização potencial de fármacos para tratar distúrbios do sistema nervoso central (CNS). 0 mercado acidente vascular global de fármacos para CNS era de $33 mil milhões em 1998, que era aproximadamente metade do mercado global de fármacos cardiovasculares, mesmo que nos Estados Unidos, quase duas vezes mais pessoas sofrem de distúrbios do CNS do que as que são acometidas por doenças cardiovasculares. 0 motivo para esta falta de estabilidade é que mais de 98% de todos os fármacos potenciais para o CNS não atravessam a barreira hematoencefálica. Além disso, mais de 99% do desenvolvimento mundial de fármacos para o CNS estão dedicados somente à descoberta de fármacos para CNS, e menos de 1% está voltado para a administração de fármaco para o CNS. Esta proporção poderia explicar a razão pela qual nenhum tratamento está atualmente disponível para as principais doenças neurológicas tais como tumores cerebrais, doença de Alzheimer e cerebral. 2 0 cérebro é protegido contra substâncias potencialmente tóxicas através da presença de dois sistemas de barreira: a barreira hematoencefálica (BBB) e a barreira sangue-cérebro-espinal (BCSFB, do inglês blood-cerebrospinal fluid barrier) . A BBB é considerada como a rota principal para a captação de ligandos de soro uma vez que sua área de superfície é aproximadamente 5000 vezes maior do que a de BCSFB. O endotélio cerebral, que constitui a BBB, representa o principal obstáculo para a utilização de fármacos potenciais contra muitos distúrbios do CNS. Como regra geral, apenas as moléculas lipofílicas menores que cerca de 500 Daltons podem atravessar a BBB, isto é, a partir do sangue para o cérebro. Entretanto, o tamanho de muitos fármacos que mostram resultados promissores em estudos animais para tratar distúrbios do CNS é consideravelmente maior. Desta maneira, as substâncias terapêuticas peptídicas e protéicas são geralmente excluídas do transporte a partir do sangue para o cérebro, devido à permeabilidade insignificante da parede endotelial dos capilares cerebrais a estes fármacos. As células endoteliais dos capilares cerebrais (BCECs, do inglês brain capillary endothelial cells) estão intimamente seladas por junções impermeáveis, têm poucas janelas e poucas vesículas endocíticas em comparação com capilares de outros órgãos. As BCECs estão cercadas pela matriz extracelular, astrócitos, pericitos e células microgliais. A estreita associação de células endoteliais com os processos podais dos astrócitos e a membrana basal de capilares é importante para o desenvolvimento e manutenção das propriedades da BBB que permitem o controlo rigoroso da troca hematoencefálica. uma A publicação internacional W02004/060403 divulga 3 invenção feita pelos inventores com relação a moléculas para transportar um fármaco através da barreia hematoencefálica. De outra maneira, até hoje, não há nenhuma abordagem de administração de fármaco eficiente disponível para o cérebro. Os métodos sob investigação para administração de fármaco peptídico e protéico no cérebro podem ser divididos em três estratégias principais. Em primeiro lugar, os procedimentos invasivos incluem a administração intraventricular direta de fármacos por meio de cirurgia, e o rompimento temporário da BBB através da perfusão intracarotidea de soluções hiperosmolares. Em segundo lugar, a estratégia farmacologicamente baseada consiste em facilitar a passagem através da BBB pelo aumento da solubilidade lipidica de péptidos ou proteínas. Em terceiro lugar, as estratégias fisiologicamente baseadas exploram os diversos mecanismos de veiculo na BBB, que foram caracterizados recentemente. Nesta abordagem, os fármacos são ligados a um vetor de proteina que atua como veiculo de administração dirigido a receptores na BBB. Esta abordagem é altamente especifica e apresenta alta eficácia com uma extrema flexibilidade para indicações clinicas com alvos ilimitados. A última abordagem foi, e ainda é, investigada pelos inventores, que apresentaram as moléculas descritas na publicação mencionada antes e aquelas da presente invenção. A patente U.S. n° 5,807,980 descreve inibidores derivados de Inibidor da Tripsina Pancreática Bovina (aprotinina) bem como um método para sua preparação e utilização terapêutica. Estes péptidos são utilizados para o tratamento de uma condição caracterizada por uma aparência ou quantidade anormal de fator tecidual e/ou fator VlIIa 4 tal como trombose anormal. A patente U.S. n° 5,780,265 descreve inibidores da serina protease que são capazes de inibir a calicreína plasmática. A patente U.S. n° 5,118,668 descreve variantes do Inibidor da Tripsina Pancreática Bovina.

Seria muito desejado ser proporcionado com moléculas melhoradas que podem atuar como veiculos ou vetores para transportar um composto ou fármaco através da BBB de um individuo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objetivo é proporcionar uma melhoria no campo de administração de fármaco.

Outro objetivo é proporcionar um método flexivel e não-invasivo e veículo para transportar um composto ou fármaco através da barreia hematoencefálica de um indivíduo. O presente pedido divulga novas moléculas que podem ser capazes, por exemplo, de transportar compostos desejáveis através da barreia hematoencefálica. É divulgado um polipéptido biologicamente ativo que pode ser capaz de atravessar (isto é, que atravessa) uma camada celular a imitar (que imita) uma barreira hematoencefálica de mamífero num ensaio in vitro, o polipéptido pode ser selecionado, por exemplo, a partir do grupo de - aprotinina (SEQ ID NO.:98), - um análogo de aprotinina 5 - um fragmento de aprotinina que pode compreender (ou pode consistir essencialmente em) a sequência de aminoácidos s definida na SEQ ID N0.:1, - um análogo biologicamente ativo da SEQ ID N0.:1, - um fragmento biologicamente ativo da SEQ ID N0.:1, e; - um fragmento biologicamente ativo de um análogo da SEQ ID NO.:1. A presente invenção refere-se a um péptido com a sequência TFFYGGSRGKRNNFKTEEY. É divulgado um polipéptido biologicamente ativo que pode ser capaz de atravessar (isto é, que atravessa) uma camada celular a imitar (que imita) uma barreia hematoencefálica de mamífero num ensaio in vitro, o polipéptido pode ser selecionado, por exemplo, a partir do grupo de, um fragmento de aprotinina que pode compreender a sequência de aminoácidos s definida na SEQ ID N0.:1, - um análogo biologicamente ativo da SEQ ID N0.:1, - um fragmento biologicamente ativo da SEQ ID N0.:1, e; - um fragmento biologicamente ativo de um análogo da SEQ ID NO.:1. 0 fragmento de aprotinina divulgado pode consistir na sequência definida na SEQ ID N0.:1. É também divulgado um fragmento de aprotinina que pode compreender a SEQ ID N0.1 e pode ter um comprimento a partir de cerca de 19 aminoácidos a cerca de 54 aminoácidos, por exemplo, a partir de 10 a 50 aminoácidos de comprimento, a partir de 10 a 30 aminoácidos de comprimento, etc. O análogo biologicamente ativo da SEQ ID NO.:l, pode ter um comprimento a partir de cerca de 19 aminoácidos a cerca 6 de 54 aminoácidos (por exemplo, incluindo por exemplo 21 a 23, 25 a 34, 36 a 50 e 52 a 54), ou a partir de cerca de 19 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, ou a partir de cerca de 19 aminoácidos a cerca de 34 aminoácidos (por exemplo, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34), de a partir de 19 aminoácidos a cerca de 23 aminoácidos ou de cerca de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 35, 51, aminoácidos.

Um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido (por exemplo, de 19 aminoácidos) descrito no presente documento pode incluir, por exemplo, um polipéptido de cerca de 7, 8, 9 ou 10 a 18 aminoácidos. Portanto, um fragmento biologicamente ativo da SEQ ID NO.:l ou de um análogo da SEQ ID NO.:l pode ter um comprimento de cerca de 7 a cerca de 18 aminoácidos ou a partir de cerca de 10 a cerca de 18. A patente U.S. n° identificado neste A patente U.S. n° identificado neste

5,807,980 descreve documento como SEQ 5,780,265 descreve documento como SEQ um polipéptido que é ID NO.:102. um polipéptido que é ID NO.:103. A sequência de aminoácidos s da aprotinina (SEQ ID NO.:98), a sequência de aminoácidos s da Angiopep-1, bem como algumas sequências de análogos biologicamente ativos podem ser encontradas, por exemplo, no pedido internacional n° PCT/CA2004/000011 publicado em 22 de julho de 2004 sob o dominio de publicação internacional n° WO 2004/060403. Adicionalmente, a publicação internacional n° WO 04/060403 descreve um polipéptido que é identificado como SEQ ID NO.: 104. 7 A Patente U.S. n° 5,118,668 descreve polipéptidos que têm a sequência ilustrada na SEQ ID NO.: 105.

Exemplos de análogos de aprotinina podem ser encontrados ao realizar um programa protein blast (Genebank: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) da sequência de aprotinina sintética (ou parte desta) divulgada no pedido internacional n° PCT/CA2004/000011. Os análogos de aprotinina exemplificativos podem ser encontrados, por exemplo, sob números de acesso CAA37967 (GI:58005), 1405218C (GL3604747) etc. É divulgado um polipéptido biologicamente ativo que pode ser capaz de atravessar (isto é, que atravessa) uma camada celular a imitar (que imita) uma barreira hematoencefálica de mamífero num ensaio in vitro, o polipéptido pode ser selecionado, por exemplo, a partir do grupo de, - um fragmento de aprotinina a partir de 19 a 54 (por exemplo, 19-50) aminoácidos de comprimento, que pode compreender a SEQ ID NO.:l, - um fragmento de aprotinina que consiste na SEQ ID NO.:l, - um análogo biologicamente ativo da SEQ ID NO.:l de cerca de 19 a 50 aminoácidos de comprimento, e; - um fragmento biologicamente ativo da SEQ ID NO.:l (de a partir de 10 a 18 aminoácidos) ou fragmento biologicamente ativo de um análogo da SEQ ID NO.:l (de cerca de 10 a 18 aminoácidos). É divulgado um análogo biologicamente ativo da SEQ ID NO.:l que pode ser selecionado, por exemplo, a partir do grupo que consiste em - um análogo da SEQ ID NO.:l que pode compreender pelo menos 35% de identidade com a sequência de aminoácidos s da SEQ ID NO.:1, - um análogo da SEQ ID NO. : 1 que pode compreender pelo menos 40% de identidade com a sequência de aminoácidos s da SEQ ID NO. : 1, - um análogo da SEQ ID NO. : 1 que pode compreender pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos s da SEQ ID NO. : 1 r - um análogo da SEQ ID NO. : 1 que pode compreender pelo menos 60% de identidade com a sequência de aminoácidos s da SEQ ID NO. : 11 - um análogo da SEQ ID NO. :1 que pode compreender pelo menos 7 0% de identidade com a sequência de aminoácidos s da SEQ ID NO. : 11 - um análogo da SEQ ID NO. : 1 que pode compreender pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácidos s da SEQ ID NO. : 11 - um análogo da SEQ ID NO. : 1 que pode compreender pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos s da SEQ ! ID NO. : 1 e; - um análogo da SEQ ID NO. : 1 que pode compreender pelo menos 95% (isto é, 96%, 97 %, 98%, 99% e 100% ) de identidade com a sequência de aminoácidos s da SEQ ID NO.:1. O análogo biologicamente ativo da SEQ ID NO.:l da invenção tem uma sequência de aminoácidos s que consiste numa sequência de aminoácidos s definida na SEQ ID NO.:97. É divulgado um análogo biologicamente ativo da SEQ ID NO.:l que pode compreender a sequência de aminoácidos s definida na SEQ ID NO.:67 (isto é, o polipéptido n° 67 que é uma versão amidada da SEQ ID NO.:67 (Angiopep-1)). isto é

Os polipéptidos divulgados podem ser amidados 9 podem ter uma sequência de aminoácidos s amidada. Por exemplo, o polipéptido da SEQ ID NO.:67 pode ser amidado (polipéptido no. 67). É divulgado um polipéptido biologicamente ativo que pode ser capaz de atravessar (isto é, que atravessa) uma camada celular a imitar (que imita) uma barreia hematoencefálica de mamifero num ensaio in vitro, o polipéptido pode ser selecionado, por exemplo, a partir do grupo de, - um fragmento de aprotinina a partir de 19 a 54 (por exemplo, 19-50) aminoácidos de comprimento, que pode compreender a SEQ ID NO.:l, - um fragmento de aprotinina que consiste a SEQ ID NO.:l, - um análogo biologicamente ativo da SEQ ID NO.:l de cerca de 19 a 50 aminoácidos de comprimento, desde que o referido análogo não compreenda as SEQ ID NO.: 102, 103, 104 ou 105 e desde que quando o referido análogo consistir na SEQ ID NO.:67 o referido análogo seja amidado, - um fragmento biologicamente ativo da SEQ ID NO.:l a partir de 10 a 18 aminoácidos, e; - um fragmento biologicamente ativo de um análogo da SEQ ID NO.:l de cerca de 10 a 18 aminoácidos. O fragmento biologicamente ativo divulgado da SEQ ID NO.:l ou o fragmento biologicamente ativo de um análogo da SEQ ID NO.:l pode compreender pelo menos 9 ou pelo menos 10 aminoácidos (consecutivos ou contíguos) da SEQ ID NO.l ou do análogo da SEQ ID NO.:l.

Os polipéptidos divulgados podem ter uma sequência de aminoácidos s que pode compreender de 1 a 12 substituições de aminoácidos (isto é, SEQ ID NO.:91). Por exemplo, a substituição de aminoácidos pode ser entre 1 a 10 10 substituições de aminoácidos, ou de 1 a 5 substituições de aminoácidos. A substituição de aminoácidos pode ser uma substituição de aminoácidos não-conservadora ou uma substituição de aminoácidos conservadora.

Por exemplo, quando um polipéptido divulgado compreender aminoácidos que são idênticos àqueles da SEQ ID NO.:l e outros aminoácidos que não são idênticos (não-idênticos), aqueles que são não-idênticos pode ser uma substituição de aminoácidos conservadora. A comparação de aminoácidos idênticos e não-idênticos pode ser realizada ao olhar para um local correspondente.

Exemplos de análogo da SEQ ID NO.:l que pode ter pelo menos 35% de identidade incluem, por exemplo, um polipéptido que compreende (consiste em) a sequência de aminoácidos s definida na SEQ ID NO.:91 (cerca de 36,8% de

identidade, isto é, 7 aminoácidos de 19 aminoácidos de SEQ ID NO.:91 são idênticos à SEQ ID NO.:l), um polipéptido que compreende (consiste em) a sequência de aminoácidos s definida na SEQ ID NO.:98 (cerca de 68,4% de identidade, isto é, 13 aminoácidos de 19 aminoácidos são idênticos à SEQ ID NO.:l), um polipéptido que compreende (consiste em) a sequência de aminoácidos s definida na SEQ ID NO.:67 (cerca de 73,7% de identidade, isto é, 14 aminoácidos de 19 aminoácidos são idênticos à SEQ ID NO.:l), um polipéptido que compreende (consiste em) a sequência de aminoácidos s definida na SEQ ID NO.: 76 (cerca de 73,7% de identidade, isto é, 14 aminoácidos de 19 aminoácidos são idênticos à SEQ ID NO.:l) e um polipéptido que compreende (consiste em) a sequência de aminoácidos s definida na SEQ ID NO.:5 (cerca de 79% de identidade, isto é, 15 aminoácidos de 19 aminoácidos são idênticos à SEQ ID 11 NO. : 1) .

Exemplos de análogo de SEQ ID NO.:l que pode ter pelo menos 60% de identidade incluem, por exemplo, um polipéptido que compreende (consiste em) a sequência de aminoácidos s definida na SEQ ID NO.:98 (cerca de 68,4% de identidade, isto é, 13 aminoácidos de 19 aminoácidos são

idênticos à SEQ ID NO.:l), um polipéptido que compreende (consiste em) a sequência de aminoácidos s definida na SEQ ID NO.:67 (cerca de 73,7% de identidade, isto é, 14 aminoácidos de 19 aminoácidos são idênticos à SEQ ID NO.:l), um polipéptido que compreende (consiste em) a sequência de aminoácidos s definida na SEQ ID NO.: 76 (cerca de 73,7% de identidade, isto é, 14 aminoácidos de 19 aminoácidos são idênticos à SEQ ID NO.:l) e um polipéptido que compreende (consiste em) a sequência de aminoácidos s definida na SEQ ID NO.:5 (cerca de 79% de identidade, isto é, 15 aminoácidos de 19 aminoácidos são idênticos à SEQ ID NO.:l).

Exemplos de análogo da SEQ ID NO.:l que pode ter pelo menos 70% de identidade incluem, por exemplo, um polipéptido que compreende (consiste em) a sequência de aminoácidos s definida na SEQ ID NO.:67 (cerca de 73,7% de identidade, isto é, 14 aminoácidos de 19 aminoácidos são idênticos à SEQ ID NO.:l), SEQ ID NO.: 76 (cerca de 73,7% de identidade, isto é, 14 aminoácidos de 19 aminoácidos são idênticos à SEQ ID NO.:l), SEQ ID NO.:5 (cerca de 79 % de identidade, isto é, 15 aminoácidos de 19 aminoácidos são idênticos à SEQ ID NO.:l).

De acordo com a presente invenção, o veiculo é selecionado do grupo que consiste no péptido 97 (Angiopep-2)) . O 12 veículo pode ser utilizado, por exemplo, para transportar um agente ligado ao mesmo através de uma barreira hematoencefálica. 0 veículo pode ser capaz de atravessar a barreira hematoencefálica após a ligação ao agente e, portanto, pode ser capaz de transportar o agente através da barreira hematoencefálica.

Os polipéptidos podem estar numa forma isolada ou numa forma substancialmente purificada.

Mais particularmente, um veículo para transportar um agente ligado ao mesmo pela uma barreira hematoencefálica, em que o veículo pode ser capaz de atravessar a barreira hematoencefálica após a ligação ao agente e dessa forma transportar o agente através da barreira hematoencefálica. 0 veículo pode compreender pelo menos um polipéptido divulgado (desde que quando o referido polipéptido ou veículo consistir na SEQ ID NO.:67, o referido polipéptido é modificado por um grupo, por exemplo, amidado). Por exemplo, o veículo pode ser selecionado de uma classe de moléculas relacionadas à aprotinina. A atividade de transporte que é efetuada pelo veículo não afeta a integridade da barreira hematoencefálica. 0 transporte de um agente pode resultar, por exemplo, na administração do agente ao sistema nervoso central (CNS) de um indivíduo.

Deve ser entendido aqui que o péptido da presente invenção podem ser quimicamente sintetizado (por exemplo, síntese em fase sólida) ou podem ser produzidos por tecnologia de DNA recombinante. Os codões que codificam aminoácidos específicos são bem conhecidos na técnica e são 13 discutidos, por exemplo, em Biochemistry (third edition; 1988, Lubert Stryer, Stanford University, W. H. Freeman and Company, Nova Iorque). Uma sequência de nucleótidos que codifica um veiculo da presente invenção está, portanto, aqui divulgada. Mais particularmente, as sequências de nucleótidos (desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos ou derivados dos mesmos) que codificam um polipéptido selecionado da SEQ ID NO.: 97, são divulgadas. Uma sequência de nucleótidos exemplificativa que codifica um análogo de aprotinina é ilustrada na SEQ ID NO. : 106 e pode ser encontrada no Gene Bank sob n° de acesso X04666. Esta sequência codifica um análogo de aprotinina que tem uma lisina na posição 16 (com referência à Sequência de aminoácidos s codificada por SEQ ID NO. : 106) em vez de uma valina como encontrado na SEQ ID NO.: 98. Uma mutação na sequência de nucleótidos da SEQ ID NO.: 106 pode ser introduzida por métodos conhecidos na técnica para alterar a produção do péptido da SEQ ID NO.: 98 que tem uma valina na posição 16. As técnicas conhecidas podem ser utilizadas para introduzir mutações adicionais na sequência de nucleótidos para codificar análogos da presente invenção. Os fragmentos podem ser obtidos a partir desta sequência de nucleótidos por meio de digestão enzimática ou reação em cadeia da polimerase, etc. Alternativamente, uma sequência de nucleótidos desejada pode ser quimicamente sintetizada por métodos conhecidos na técnica. uma É divulgado um conjugado que pode compreender um veiculo que consiste no péptido da presente invenção, e um agente selecionado do grupo que consiste, por exemplo, num fármaco (por exemplo, um fármaco de molécula pequena, por exemplo, um antibiótico), um medicamento, um marcador detectável, uma proteína (por exemplo, uma enzima), 14 composto à base de proteína (por exemplo, um complexo de proteína que compreende um ou cadeia de polipéptido) e um polipéptido (péptido) . 0 agente pode ser mais particularmente, uma molécula que é ativa no nível do sistema nervoso central. 0 agente pode ser qualquer agente para tratar ou detectar uma doença neurológica. 0 veículo que é parte do conjugado é selecionado de um péptido com a sequência TFFYGGSRGKRNNFKTEEY. 0 agente pode ter um peso molecular máximo de cerca de 160.000 Daltons. A atividade de transporte pode ser efetuada por transcitose mediada por receptor ou transcitose mediada por adsorvente. O agente pode ser um capaz de ser transportado por tal mecanismo. O conjugado pode estar na forma de uma proteína de fusão que pode ter uma primeira porção que consiste essencialmente no veículo da presente invenção e uma segunda porção que consiste essencialmente numa proteína ou agente com base em proteína.

As doenças neurológicas exemplificativas que podem ser tratadas ou detectadas pelo veículo e/ou conjugado é uma doença selecionada, por exemplo, do grupo que consiste num tumor cerebral, uma metástase cerebral, esquizofrenia, epilepsia, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, acidente vascular cerebral e disfunções relacionadas com a barreira hematoencefálica (por exemplo, obesidade). 15 A disfunção relacionada com a barreira hematoencefálica é a obesidade. 0 agente que pode ser conjugado com o veiculo da presente invenção pode ser uma leptina. Um conjugado que compreende uma leptina e um veiculo pode ser utilizado, por exemplo, no tratamento da obesidade. 0 marcador detectável pode ser um agente de radioimagem. Exemplo de um marcador que pode ser conjugado com o veiculo da presente invenção inclui, por exemplo, e sem caráter limitativo, um isótopo, um marcador fluorescente (por exemplo, rodamina), uma molécula repórter (por exemplo, biotina), etc. Outros exemplos de marcadores detectáveis incluem, por exemplo, uma proteina fluorescente verde, biotina, uma proteina histag e β-galactosidase.

Exemplo de uma proteína ou composto à base de proteína que pode ser conjugado com o veículo da presente invenção inclui, sem caráter limitativo, um anticorpo, um fragmento de anticorpo (por exemplo, um fragmento de ligação de anticorpo tal como fragmento Fv, F(ab)2, F(ab)2' e Fab e similares), um fármaco peptídico ou à base de proteína (por exemplo, um modulador farmacológico positivo (agonista) ou um inibidor farmacológico (antagonista)) etc. Outros exemplos de agente incluem toxinas celulares (por exemplo, monometil auristatina E (MMAE), toxinas de endotoxinas e exotoxinas bacterianas; toxinas da difteria, toxinas de botunilum, toxinas tetânicas, toxinas pertussis, enterotoxinas estafilocócicas, toxina da síndrome do choque tóxico TSST-1, toxina adenilato ciclase, toxina shiga, enterotoxina da cólera, e outras) e compostos antiangiogénicos (endostatina, catequinas, nutricêuticos, quimiocina IP-10, inibidores da 16 metaloproteinase da matriz (MMPIs), anastelina, vironectina, antitrombina, inibidores da tirosina quinase, inibidores do VEGF, anticorpos contra receptor, herceptina, avastina e panitumumab e outros). 0 agente pode ser um fármaco de molécula pequena tal como um fármaco anticancro (por exemplo, para tratar um tumor cerebral). Um fármaco anticancro pode incluir, por exemplo, um fármaco que tem um grupo que permite sua conjugação ao veiculo da presente invenção. Exemplos de fármaco anticancro incluem, por exemplo, um fármaco que pode ser selecionado do grupo que consiste em paclitaxel (Taxol), vinblastina, vincristina, etoposideo, doxorrubicina, ciclofosfamida, taxotere, melfalan, clorambucil, e qualquer combinação. 0 conjugado divulgado pode compreender a fórmula R-L-M ou seus sais f armaceuticamente aceitáveis, em que R é uma classe de moléculas relacionadas à aprotinina (por exemplo, aprotinina, fragmento de aprotinina, Angiopep-1, Angiopep-2, análogos, derivados ou fragmentos). Por exemplo, R pode ser um veiculo selecionado de uma classe de moléculas relacionadas à aprotinina capaz de atravessar a barreira hematoencefálica após ligação a L-M e desse modo transportar M através da barreira hematoencefálica. L pode ser um ligante ou uma ligação (ligação quimica). M pode ser um agente selecionado do grupo que consiste num fármaco (por exemplo, um fármaco de molécula pequena) , um medicamento, um marcador (detectável) , uma proteina ou composto à base de proteina (por exemplo, anticorpo, um fragmento de anticorpo), um antibiótico, um agente anticancro, um composto antiangiogénico e um polipéptido ou qualquer molécula ativa no nivel do sistema nervoso 17 central. Deve ser entendido aqui que a fórmula R-L-M não pretende ser restrita a uma ordem especifica ou proporção especifica. Como exemplificado aqui, M pode ser encontrado em diversas proporções em relação a R.

Por exemplo, os conjugados de fórmula R-L-M ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, podem ser utilizados para transportar M através de uma barreira hematoencefálica, onde R pode ser, por exemplo, um veiculo selecionado do grupo que consiste nos péptido Nos: 5, 67, 76, 91 e 97 como descrito aqui. 0 veiculo pode ser capaz de atravessar a barreira hematoencefálica após ligação a L-M e pode transportar, portanto, M através da barreira hematoencefálica. M pode ser um agente útil para tratar ou diagnosticar uma doença neurológica.

Deve ser entendido aqui que quando mais de um sitio de conjugação de veiculo estiver disponível ou presente, mais de um fármaco ou molécula de fármaco pode ser conjugado ao veículo da presente invenção. Portanto, o conjugado pode compreender uma ou mais moléculas de fármaco. 0 conjugado pode ser ativo por si só, isto é, o fármaco pode ser ativo mesmo quando associado com o veículo. 0 composto pode ou não ser liberado a partir do veículo, isto é, geralmente após o transporte através da barreira hematoencefálica. 0 composto pode ser, portanto, liberável do conjugado (ou do veículo) e pode tornar-se ativo depois disso. Mais particularmente, o agente pode ser liberável do veículo após o transporte através da barreira hematoencefálica. 18 É divulgado um conjugado para transportar um agente através de uma barreira hematoencefálica, o conjugado pode compreender: (a) um veiculo; e (b) um agente ligado ao veiculo, onde o conjugado é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica e desse modo transportar o agente através da barreira hematoencefálica. É divulgada a utilização de um veiculo da presente invenção para transportar um agente através de uma barreira hematoencefálica de um mamifero necessitado do mesmo. É divulgada a utilização de uma classe de moléculas relacionadas com a aprotinina para transportar um composto ligado a estas através da barreira hematoencefálica de um doente. É divulgada a utilização de um veiculo ou um conjugado como descrito aqui para o diagnóstico de uma doença neurológica ou uma doença do sistema nervoso central. Por exemplo, o veiculo ou conjugado pode ser utilizado para a detecção in vivo de uma doença neurológica. 0 veiculo é selecionado de um péptido com a sequência TFFYGGSRGKRNNFKTEEY. É divulgada a utilização de uma classe de moléculas relacionadas com a aprotinina na preparação de um medicamento. É divulgada a utilização de uma classe de moléculas relacionadas com a aprotinina na preparação de um medicamento para tratar uma doença neurológica, ou para 19 tratar um distúrbio do sistema nervoso central. É divulgada a utilização de um veiculo ou conjugado descrito agui, na preparação de um medicamento para tratar uma doença cerebral (uma doença associada com o cérebro) ou doença neurológica, para o diagnóstico de uma doença cerebral ou doença neurológica ou para transportar um agente através da barreira hematoencefálica. É divulgada a utilização de um veiculo ou conjugado da presente invenção para tratar um mamífero que tem, por exemplo, uma doença neurológica ou para o diagnóstico de uma doença neurológica um mamífero necessitado do mesmo. A doença neurológica inclui, por exemplo, um tumor cerebral, uma metástase cerebral, esguizofrenia, epilepsia, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, acidente vascular cerebral e disfunções relacionadas com a barreira hematoencefálica. É divulgado um método para transportar um agente através da barreira hematoencefálica de um mamífero (humano, animal), gue pode compreender a etapa de administrar ao mamífero um composto que compreende o agente ligado a uma classe de moléculas relacionada à aprotinina. É divulgado um método para tratar uma doença neurológica de um doente que compreende administrar no doente um medicamento que compreende uma classe de moléculas relacionadas à aprotinina, e um composto adaptado para tratar a doença, sendo que o composto é ligado à classe de moléculas relacionada à aprotinina. 20 É divulgado um método para tratar um distúrbio do sistema nervoso central de um doente que compreende administrar ao doente um medicamento que compreende uma classe de moléculas relacionada à aprotinina, e um composto adaptado para tratar a doença, sendo que o composto é ligado à aprotinina. É divulgado um método para transportar um agente através de uma barreira hematoencefálica, que compreende a etapa de administrar num indivíduo uma composição farmacêutica aqui divulgada. É divulgado um método para tratar um mamífero (por exemplo, um doente) necessitado do mesmo (por exemplo, um doente que tem uma doença neurológica) . O método pode compreender administrar um veículo, da presente invenção ao mamífero. É divulgado um método para (de) diagnosticar (isto é, um método de diagnóstico) uma doença neurológica num mamífero (por exemplo, um doente) necessitado do mesmo. O método pode compreender administrar um veículo da presente invenção ao mamífero (indivíduo humano, doente, animal). A administração pode ser realizada por via intra-arterial, intranasal, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica ou per os. A composição farmacêutica pode ser administrada ao mamífero numa quantidade terapeuticamente eficaz.

Um mamífero necessitado (indivíduo com necessidade) pode ser, por exemplo, um mamífero I que tem ou está em risco 21 de contrair uma doença neurológica, uma doença no sistema nervoso central, cancro cerebral, uma metástase cerebral, etc. É divulgada uma composição farmacêutica que pode compreender, por exemplo: - um veiculo da presente invenção; e - um veiculo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser utilizada, por exemplo, para o tratamento de uma doença neurológica. A composição farmacêutica pode ser utilizada, por exemplo, para o diagnóstico de uma doença neurológica. A composição farmacêutica pode ser utilizada, por exemplo, para transportar um agente através de uma barreira hematoencefálica. A composição farmacêutica pode ser utilizada, por exemplo, para a administração de um agente ao CNS de um indivíduo. A composição farmacêutica pode ser utilizada, por exemplo, para tratar um distúrbio no sistema nervoso central de um mamífero necessitado desta. A composição farmacêutica pode ser utilizada para a administração de um agente ao CNS de um indivíduo.

Deve ser entendido no presente documento que sais farmaceuticamente aceitáveis de um veículo (polipéptido) ou de um conjugado são divulgados. 22 A composição (composição farmacêutica) pode compreender, desta maneira, um medicamento preparado como definido aqui em associação com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Para o propósito da presente invenção os seguintes termos são definidos abaixo. 0 termo "veiculo" ou "vetor" pretende significar um composto ou molécula tal como um polipéptido que é capaz de transportar um composto. Por exemplo, o transporte pode ocorrer através da barreira hematoencefálica. 0 veiculo pode ser ligado (covalentemente ou não) ou conjugado com outro composto ou agente e, desta maneira, pode ser capaz de transportar o outro composto ou agente através da barreira hematoencefálica. Por exemplo, o veiculo pode ligar-se a receptores presentes nas células endoteliais cerebrais e, desta maneira, ser transportado através da barreira hematoencefálica por meio de transcitose. 0 veiculo pode ser uma molécula através da qual altos niveis de transporte transendotelial podem ser obtidos, sem afetar a integridade da barreira hematoencefálica. 0 veiculo é um péptido e pode ser naturalmente ocorrente ou produzido por sintese quimica ou tecnologia genética recombinante (engenharia genética).

Histag 0 termo "conjugado" pretende significar uma combinação de um veiculo e outro composto ou agente. A conjugação pode ser quimica em natureza, tal como através de um ligante, ou genética em natureza, por exemplo, por tecnologia genética recombinante, tal como numa proteina de fusão tal com, por exemplo, uma molécula repórter (por exemplo, proteina fluorescente verde, ε-galactosidase, 23 etc.). A expressão "fármaco de molécula pequena" pretende significar um fármaco que tem um peso molecular de 1000 g/mol ou menos.

Os termos "tratamento", "tratar" e similares pretendem significar obter um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado, por exemplo, inibição de crescimento de célula cancerígena, morte de uma célula cancerígena ou melhora de uma doença ou condição neurológica. O efeito pode ser profilático em termos de prevenir completa ou parcialmente uma doença ou sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. "Tratamento" como aqui utilizado abrange qualquer tratamento de uma doença num mamífero, particularmente um ser humano, e inclui: (a) prevenir que uma doença ou estado patológico (por exemplo, prevenir o cancro) ocorra num indivíduo que pode estar predisposto à doença porém que ainda não foi diagnosticado com a mesma; (b) inibir uma doença, (por exemplo, interromper seu desenvolvimento); ou (c) suavizar uma doença (por exemplo, reduzir os sintomas associados com uma doença). "Tratamento" como aqui utilizado abrange qualquer administração de um agente ou composto farmacêutico a um indivíduo para tratar, curar, aliviar, aperfeiçoar, reduzir ou inibir uma condição no indivíduo, inclusive, sem caráter limitativo, administrar um conjugado veículo-agente a um indivíduo. O termo "cancro" pretende significar qualquer malignidade celular cuja única característica é a perda de controlos normais que resulta em crescimento desregulado, falta de 24 diferenciação e capacidade de invadir tecidos locais e metastatizar. 0 cancro pode se desenvolver em qualquer tecido ou qualquer órgão. Mais especificamente, cancro pretende incluir, sem caráter limitativo, cancro do cérebro. 0 termo "administrar" e "administração" pretende significar um modo de administração inclusive, sem caráter limitativo, por via intra-arterial, intranasal, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica ou per os. Uma dose diária pode ser dividida em uma, duas ou mais doses numa forma adequada para que seja administrada em uma, duas ou mais vezes durante um periodo de tempo. 0 termo "terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" pretende significar uma quantidade de um composto suficiente para melhorar substancialmente algum sintoma associado com uma doença ou uma condição médica. Por exemplo, no tratamento do cancro ou uma condição mental ou neurológica ou doença no CNS, um agente ou composto que reduza, previna, retarde, suprima, ou interrompa qualquer sintoma da doença ou condição poderia ser terapeuticamente eficaz. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente ou composto não é necessária para curar uma doença ou condição mas irá proporcionar um tratamento para uma doença ou condição de modo que o inicio da doença ou condição seja retardado, impedido, ou prevenido, ou os sintomas da doença ou condição são melhorados, ou o termo da doença ou condição é alterado ou, por exemplo, é menos grave ou a recuperação é acelerada num indivíduo. 0 veículo da presente invenção pode ser utilizado em 25 combinação com métodos convencionais de tratamento e/ou terapia bem como podem ser utilizados separadamente dos métodos convencionais de tratamento e/ou terapia.

Quando os conjugados divulgados forem administrados em terapias de combinação com outros agentes, estes podem ser administrados de forma sequencial ou simultânea num indivíduo. Alternativamente, as composições farmacêuticas podem ser compreendidas de uma combinação de um conjugado veiculo-agente aqui divulgado em associação com um excipiente farmaceuticamente aceitável, como descrito aqui, e outro agente terapêutico ou profilático conhecido na técnica.

Os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados por métodos conhecidos e utilizados na técnica. 0 termo "derivado funcional" pretende significar uma sequência biologicamente ativa de "derivado químico", "fragmento" , ou "variante" ou parte de um veículo ou agente ou conjugado e um seu sal aqui divulgado. Um derivado funcional de veiculo pode ser capaz de ser ligado ou conjugado com outro composto ou agente e atravessar a barreira hematoencefálica e, desse modo, ser capaz de transportar o outro composto ou agente através da barreira hematoencefálica. 0 termo "derivado químico" pretende significar um veículo, um agente, ou um conjugado aqui divulgado, que contém porções químicas adicionais que não fazem parte do veículo, agente ou conjugado veículo-agente. As modificações covalentes estão incluídas dentro do âmbito 26 desta invenção. Um derivado químico pode ser convenientemente preparado por síntese química direta, utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Tais modificações podem ser, por exemplo, introduzidas dentro de um veículo de proteína ou péptido, agente ou conjugado veículo-agente ao reagir resíduos de aminoácido direcionados com um agente de derivação orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais ou resíduos terminais selecionados. Um veículo de derivado químico é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica e ser ligado ou conjugado com outro composto ou agente e, desse modo, ser capaz de transportar o outro composto ou agente através da barreira hematoencefálica. Níveis muito altos de transporte transendotelial através da barreira hematoencefálica podem ser obtidos sem qualquer efeito sobre a integridade de barreira hematoencefálica. 0 termo "agente" pretende significar, sem distinção, um anticorpo, um fármaco (tal como um fármaco medicinal) ou um composto tal como um agente ou composto terapêutico, um marcador, um traçador ou um composto de formação de imagens. 0 termo "agente terapêutico" ou "agente" pretende significar qualquer agente e/ou medicamento e/ou fármaco utilizado para tratar os sintomas de uma doença, condição física ou mental, lesão ou infecção e inclui, porém sem caráter limitativo, antibióticos, agentes anticancro, agentes antiangiogénicos e moléculas ativas ao nível do sistema nervoso central Paclitaxel, por exemplo, pode ser administrado por via intravenosa para tratar o cancro cerebral. 27 0 termo "condição" pretende significar qualquer situação que cause dor, desconforto, enfermidade, doença ou incapacidade (mental ou fisica) a ou num indivíduo, inclusive doença neurológica, lesão, infecção, ou dor crónica ou aguda. As doenças neurológicas que podem ser tratadas incluem, porém sem caráter limitativo, tumores cerebrais, metástases cerebrais, esquizofrenia, epilepsia, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington e acidente vascular cerebral.

Como aqui utilizado, o termo "composição farmacêutica" significa quantidades terapeuticamente eficazes do agente juntamente com os diluentes farmaceuticamente aceitáveis, conservantes, solubilizantes, emulsificantes, adjuvante e/ou veículos. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" como aqui utilizado refere-se àquela quantidade que proporciona um efeito terapêutico numa dada condição e regime de administração. Tais composições são líquidas ou liofilizadas ou então são formulações secas e incluem diluentes de teor de tampão variado (por exemplo, Tris-HC1, acetato, fosfato), pH e resistência iónica, aditivos tais como albumina ou gelatina para evitar a absorção por superfícies, detergentes (por exemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sais de ácidos biliares). Os agentes solubilizantes (por exemplo, glicerol, polietileno glicerol), antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabissulfito de sódio), conservantes (por exemplo, timerosal, álcool benzílico, parabenos), substâncias de volume ou modificadores de tonicidade (por exemplo, lactose, manitol), ligação covalente de polímeros tais como polietileno glicol à proteína, complexação com iões de metal, ou incorporação do material dentro ou sobre preparações em partículas de compostos poliméricos tais 28 como ácido polilático, ácido poliglicólico, hidrogéis, etc., ou sobre lipossomas, microemulsões, micelas, vesículas unilamelares ou multilamelares, "ghosts" de eritrócitos, ou esferoplastos. Tais composições irão influenciar o estado físico, a solubilidade, a estabilidade, a taxa de liberação in vivo, e a taxa de depuração in vivo. As composições de liberação controlada ou sustentada incluem formulação em depósitos lipofílicos (por exemplo, ácidos gordos, ceras, óleos). As composições em partículas revestidas com polímeros (por exemplo, poloxámeros ou poloxaminas) também estão abrangidas pela invenção. São também divulgados revestimentos protetores de formas de partículas, inibidores da protease ou acentuadores da permeação para diversas vias de administração, incluindo as vias parentéricas, pulmonares, nasais, orais, vaginais, retais. A composição farmacêutica pode ser administrada por via parentérica, paracanceral, transmucosal, transdérmica, intramuscular, intravenosa, intradermal, subcutânea, intraperitoneal, intraventricular, intracraniana e intratumoral.

Além disso, como utilizado aqui "veículo farmaceuticamente aceitável" ou "veículo farmacêutico" são conhecidos na técnica e incluem, porém sem caráter limitativo, tampão fosfato 0,01-0,1 M ou 0,05 M ou 0,8% de solução salina. Adicionalmente, tais veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser soluções aquosas ou não-aquosas, suspensões, e emulsões. Exemplos de solventes não-aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis tal como oleato de etilo. Os veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e meios tamponados. Os veículos 29 parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, lactato de Ringer ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem repositores de fluido e nutriente, repositores de eletrólito tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer, e similares. Os conservantes e outros aditivos também podem estar presentes, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes de intercalação, gases inertes e similares.

Um "análogo" deve ser aqui entendido como um polipéptido que se origina de uma sequência original ou de uma parte de uma sequência original e que pode compreender uma ou mais modificações; por exemplo, uma ou mais modificações na sequência de aminoácidos s (por exemplo, uma adição, deleção, inserção, substituição de aminoácido etc.), uma ou mais modificações na cadeia principal da cadeia lateral de um ou mais aminoácidos, ou uma adição de um grupo ou outra molécula a um ou mais aminoácidos (cadeias laterais ou cadeia principal). Um "análogo" é, portanto, entendido aqui como uma molécula que tem uma atividade biológica e estrutura química (ou uma parte de sua estrutura) similar àquela de um polipéptido aqui descrito. Um análogo compreende um polipéptido que pode ter, por exemplo, uma ou mais inserções de aminoácido, numa ou em cada extremidade do polipéptido e/ou dentro da sequência de aminoácidos s do polipéptido.

Um "análogo" pode ter uma similaridade de sequência e/ou identidade de sequência com a de uma sequência original ou uma parte de uma sequência original e também pode ter uma modificação de sua estrutura como discutido aqui. 0 grau de similaridade entre duas sequências baseia-se na 30 percentagem de identidades (aminoácidos idênticos) e de substituição conservativa. A similaridade ou identidade pode ser comparada, por exemplo, sobre uma região de 2, 3, 4, 5, 10, 19, 20 aminoácidos ou mais (e qualquer número entre estes). A identidade pode incluir aqui, aminoácidos que são idênticos ao péptido original e que podem ocupar a mesma posição ou posição similar quando comparados com o polipéptido original. Um análogo que tem, por exemplo, 50% de identidade com um polipéptido original pode incluir, por exemplo, um análogo que compreende 50% da sequência de aminoácidos do polipéptido original e similaridade com as outras percentagens. Deve ser entendido aqui que intervalos podem ser encontrados entre os aminoácidos de análogos que são idênticos ou similares aos aminoácidos do péptido original. Os intervalos podem não incluir aminoácidos, incluir um ou mais aminoácidos que não são idênticos ou similares ao péptido original. Os análogos biologicamente ativos dos veiculos (polipéptidos) da presente invenção são aqui divulgados. A percentagem de identidade pode ser determinada, por exemplo, com algoritmo n GAP, BESTFIT, ou FASTA em Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, que utiliza pesos de intervalo padrão.

Por exemplo um análogo divulgado pode compreender ou ter 50% de identidade com uma sequência de aminoácidos s original e uma parte do aminoácido restante que ocupa uma posição similar pode ser, por exemplo, uma substituição de aminoácido não-conservativa ou conservativa. 31

Portanto, são divulgados análogos que podem ter pelo menos 90% de similaridade de sequência com uma sequência original ou uma parte de uma sequência original. Um "análogo" pode ter, por exemplo, pelo menos 35%, 50 %, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% (96%, 97%, 98%, 99% e 100%) de similaridade de sequência com uma sequência original ou uma parte de uma sequência original. Do mesmo modo, um "análogo" pode ter, por exemplo, pelo menos 35%, 50 %, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% (96%, 97%, 98%, 99% e 100%) de similaridade de sequência com uma sequência original com uma combinação de uma ou mais modificações numa cadeia principal ou cadeia lateral de um aminoácido, ou uma adição de um grupo ou outra molécula, etc. Aminoácidos exemplificativos que são destinados a serem similares (um aminoácido conservativo) a outros são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, aqueles listados na Tabela 1.

Os análogos divulgados também compreendem aqueles que têm pelo menos 35%, 50 %, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% (96%, 97%, 98%, 99% e 100%) de identidade de sequência com uma sequência original ou uma parte de uma sequência original, do mesmo modo, um "análogo" pode ter, por exemplo, 35%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade (sequência) com uma sequência original (isto é, um análogo que é pelo menos 35%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% idêntico a um péptido original) com uma combinação de uma ou mais modificações numa cadeia principal ou cadeia lateral de um aminoácido, ou uma adição de um grupo ou outra molécula, etc.

Um "fragmento" deve ser entendido aqui como um polipéptido que se origina de uma parte de uma sequência original ou de base ou de um análogo da referida sequência de base. Os 32 fragmentos abrangem polipéptidos que têm truncamentos de um ou mais aminoácidos, em que o truncamento pode originar-se do terminal amino (N-terminal) , terminal carboxi (C-terminal), ou do interior da proteina. Um fragmento pode compreender a mesma sequência que a parte correspondente da sequência original.

Desta maneira, os polipéptidos biologicamente ativos na forma dos polipéptidos originais, fragmentos (modificados ou não), análogos (modificados ou não), derivados (modificados ou não), homólogos, (modificados ou não) do veiculo descrito aqui são divulgados.

Deste modo, quaisquer polipéptidos que têm uma modificação comparada a um polipéptido original que não destrói significativamente uma atividade biológica desejada são divulgados. É bem conhecido na técnica que inúmeras modificações podem ser feitas nos polipéptidos da presente invenção sem afetar de forma prejudicial sua a atividade biológica. Estas modificações podem, por outro lado, manter ou aumentar a atividade biológica do polipéptido original ou podem otimizar uma ou mais das particularidades (por exemplo, estabilidade, biodisponibilidade, etc.) dos polipéptidos que, em alguns casos podem ser necessários ou desejados. Os polipéptidos divulgados compreendem por exemplo, aqueles que contêm sequências de aminoácidos modificadas por processos naturais, tal como processamento pós-traducional, ou por meio de métodos de modificação quimica que são conhecidos na técnica. As modificações podem ocorrer em qualquer lugar num polipéptido incluindo a cadeia principal do polipéptido, as cadeias laterais de aminoácido e os terminais amino ou carboxi. Será entendido que o mesmo 33 tipo de modificação pode estar presente em niveis iguais ou variados em diversos sitios num dado polipéptido. Do mesmo modo, um dado polipéptido pode conter muitos tipos de modificações. Os polipéptidos podem ser ramificados como um resultado da ubiquitinação, e estes podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Os polipéptidos cíclicos, ramificados e cíclicos ramificados podem resultar de processos naturais pós-traducionais ou podem ser feitos por métodos sintéticos. As modificações compreendem por exemplo, sem caráter limitativo, peguilação, acetilação, acilação, adição de grupo acetomidometilo (Acm), ADP-ribosilação, alquilação, amidação, biotinilação, carbamoilação, carboxietilação, esterificação, ligação covalente à fiavina, ligação covalente a uma porção heme, ligação covalente de um nucleótido ou derivado de nucleótido, ligação covalente de fármaco, ligação covalente de um marcador (por exemplo, fluorescente, radioativo, etc.), ligação covalente de um lípido ou derivado de lípido, ligação covalente de fosfatidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação de dissulfeto, desmetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cistina, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição mediada por RNA de transferência de aminoácidos a proteínas tais como arginilação e ubiquitinação, etc.

Como discutido acima, a modificação de polipéptidos pode compreender, por exemplo, inserção de aminoácido (isto é, adição), deleção e substituição (isto é, troca), tanto 34 conservativa como não-conservativa (por exemplo, D-aminoácidos, desaminoácidos) na sequência de polipéptidos onde tais alterações não alteram substancialmente a atividade biológica total do polipéptido.

Exemplos de substituições podem ser aqueles, que são conservativos (isto é, onde um resíduo é substituído por outro do mesmo tipo ou grupo geral) ou quando desejado, não-conservativos (isto é, onde um resíduo é substituído por um aminoácido de outro tipo) . Além disso, um aminoácido não-naturalmente ocorrente pode substituir um aminoácido naturalmente ocorrente (isto é, substituição de aminoácido conservativo não-naturalmente ocorrente ou uma substituição de aminoácido não-conservativo não-naturalmente ocorrente).

Como deve ser entendido, os aminoácidos naturalmente ocorrentes podem ser sub-classifiçados como ácidos, básicos, neutros e polares, ou neutros e não-polares. Além disso, três dos aminoácidos codificados são aromáticos. Pode ser útil que os polipéptidos codificados que diferem do polipéptido divulgado determinado contenham codões substituídos por aminoácidos, que sejam do mesmo tipo ou grupo que aquele do aminoácido que será substituído. Desta maneira, em alguns casos, os aminoácidos básicos Lys, Arg e His podem ser intercambiáveis; os aminoácidos acídicos Asp e Glu podem ser intercambiáveis; os aminoácidos polares neutros Ser, Thr, Cys, Gin, e Asn podem ser intercambiáveis; os aminoácidos alifáticos não-polares Gly, Ala, Vai, Ile, e Leu são intercambiáveis porém devido ao facto do tamanho de Gly e Ala ser mais estreitamente relacionado e Vai, Ile e Leu serem mais estreitamente relacionados uns com os outros, e os aminoácidos 35 aromáticos Phe, Trp e Tyr podem ser intercambiáveis.

Deve ser ainda observado que se os polipéptidos forem feitos sinteticamente, as substituições por aminoácidos, que não são naturalmente codificados por DNA (aminoácido não-naturalmente ocorrente ou aminoácido não-natural) também podem ser feitas.

Um aminoácido não-naturalmente ocorrente deve ser entendido aqui como um aminoácido que não é naturalmente produzido ou encontrado num mamifero. Um aminoácido não-naturalmente ocorrente compreende um D-aminoácido, um aminoácido que tem um grupo acetilaminometilo ligado a um átomo de enxofre de uma cisteina, um aminoácido peguilado, etc. A inclusão de um aminoácido não-naturalmente ocorrente numa sequência de polipéptidos definida irá gerar, portanto, um derivado do polipéptido original. Os aminoácidos não-naturalmente ocorrentes (resíduos) incluem também os aminoácidos ómegas da fórmula NH2(CH2) nCOOH em que n é 2-6, aminoácidos não-polares neutros, tais como sarcosina, t-butil alanina, t-butil glicina, N-metil isoleucina, norleucina, etc. A fenilglicina pode ser substituída por Trp, Tyr ou Phe; a citrulina e o sulfóxido de metionina são não-polares neutros, o ácido cistéico é ácido, e a ornitina é básica. A prolina pode ser substituída por hidroxiprolina e mantém as propriedades que conferem conformação. É conhecido na técnica que os análogos podem ser gerados por mutagénese substitucional e mantêm a atividade biológica dos polipéptidos. Estes análogos têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de proteína removida e um resíduo diferente inserido em seu local. Exemplos de 36 36 substituições conservativas" substituições então outro "substituições adicionalmente aminoácido, é identificados como "substituições são apresentadas na Tabela 1. Se tais resultarem numa alteração não desejada, tipo de substituição, denominada exemplificativas" na Tabela 1, ou como descrito aqui em referência a classes de introduzida e os produtos classificados.

Em alguns casos pode ser de interesse modificar a atividade biológica de um polipéptido por substituição inserção, ou deleção de aminoácido. Por exemplo, a modificação de um polipéptido pode resultar num aumento na atividade biológica de polipéptido, pode modular sua toxicidade, pode resultar em alterações em biodisponibilidade ou em estabilidade, ou pode modular sua atividade imunológica ou identidade imunológica. As modificações substanciais na função ou identidade imunológica são realizadas pela seleção de substituições que diferem significativamente em seu efeito ao manter (a) a estrutura da cadeia principal do polipéptido na área da substituição, por exemplo, como uma folha ou conformação helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sitio alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Os resíduos naturalmente ocorrentes são divididos em grupos com base em propriedades de cadeia lateral comuns: (1) hidrofóbicos: norleucina, metionina (Met), Alanina (Ala), Valina (Vai), Leucina (Leu), Isoleucina (Ile), Histidina (His), Triptófano (Trp), Tirosina (Tyr),

Fenilalanina (Phe), (2) hidrofilicos neutros: Cisteina (Cys), Serina (Ser), Treonina (Thr) (3) ácidos/negativamente carregados: Ácido aspártico 37 (Asp), Ácido glutámico (Glu) (4) básicos: Asparagina (Asn), Glutamina (Gin), Histidina (His), Lisina (Lys), Arginina (Arg) (5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: Glicina (Gly), Prolina (Pro); (6) aromáticos: Triptófano (Trp), Tirosina (Tyr),

Fenilalanina (Phe), Histidina (His), (7) polares: Ser, Thr, Asn, Gin (8) básicos positivamente carregados: Arg, Lys, His, e; (9) carregados: Asp, Glu, Arg, Lys, His

As substituições não-conservativas irão acarretar a troca de um elemento de uma destas classes por outra. Uma substituição conservativa irá acarretar a troca de um elemento de um dos mesmos grupos por outro elemento dos mesmos grupos. Alternativamente, outras substituições conservativas de aminoácido estão listadas na Tabela 1.

Tabela 1. Substituição de aminoácidos ilResíduo jSubstituição exemplificativa jSubstituição :l original j \ conservativa

Ala (A) iVal, Leu, Ile Ival· | Arg (R) SLys, Gin, Asn jLys i Asn (N) jGln, His, Lys, Arg jGln í Asp (D) |Glu \Glu j Cys (C) sSer sSer i Gin (Q) | Asn iAsn ! Glu (E) jAsp jAsp i IGly (G) \ Pro iPro ; IHis (H) jAsn, Gin, Lys, Arg |Arg ! jlle (I) jLeu, Vai, Met, Ala, Phe, jLeu i jnorleucina \ ;!Leu (L) jNorleucina, Ile, Vai, Met, jlle sAla, Phe \ 38

Resíduo original íSubstituição exemplificativa sSubstituição j jconservativa Lys (K) | Arg, Gin, Asn SArg jMet (M) sLeu, Phe, Ile sLeu Phe (F) jLeu, Vai, Ile, Ala jLeu Pro (P) sGly sGly Ser (S) jThr jThr Thr (T) j Ser jSer Trp (W) iTyr iTyr Tyr (Y) |Trp, Phe, Thr, Ser jPhe Vai (V) |Ile, Leu, Met, jnorleucina Phe, Ala, |Leu

Um análogo biologicamente ativo pode ser, por exemplo, um análogo que tem pelo menos uma substituição de aminoácido (isto é, não-conservativa ou conservativa) na sequência original. Um análogo biologicamente ativo também pode ser, por exemplo, um análogo que tem uma inserção de um ou mais aminoácidos.

Outros análogos exemplificativos incluem por exemplo: - Um análogo da SEQ ID N0.1 que pode ter a fórmula I: Xi-SEQ ID NO.:1-X2 - Um análogo de Angiopep-1 que pode ter a fórmula II: Xi~ Angiopep-l-X2 e - Um análogo de Angiopep-2 pode ter a fórmula III: X2-Angiopep-2-X2

Xi e X2 podem ser independentemente uma sequência de aminoácidos entre 0 a cerca de 100 (por exemplo, entre 0 a cerca de 30 a 50) aminoácidos. Xi e X2 podem ser derivados de aminoácidos consecutivos de aprotinina ou análogos de aprotinina (sequência de aminoácidos homóloga) ou podem ser qualquer outra sequência de aminoácidos (sequência de 39 aminoácidos heteróloga). Um composto de fórmula I, II ou III também pode compreender uma substituição, deleção ou inserção de aminoácido dentro da sequência de aminoácidos de Angiopep-1, Angiopep-2 ou SEQ ID N0.1. 0 análogo entretanto seria de preferência biologicamente ativo como determinado por um dos ensaios aqui descritos ou por meio de qualquer ensaio similar ou equivalente.

Um polipéptido biologicamente ativo (por exemplo, veiculo) pode ser identificado pela utilização de um dos ensaios ou métodos aqui descritos. Por exemplo, um veiculo candidato pode ser produzido por sintese de péptido convencional, conjugado com Taxol como aqui descrito e testado num modelo in vivo como aqui descrito. Um veiculo biologicamente ativo pode ser identificado, por exemplo, com base na sua eficácia para aumentar a sobrevivência de um animal que foi injetado com células de tumor e tratado com o conjugado comparado com um controlo que não foi tratado com um conjugado. Do mesmo modo, um veiculo biologicamente ativo pode ser identificado com base no seu local no parênquima num ensaio de perfusão cerebral in situ.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 ilustra um exemplo de análise que utiliza géis de Tricina; A Figura 2 ilustra o método de ligação do veiculo da presente invenção a paclitaxel; A Figura 3 ilustra o efeito do tratamento de modelo de glioblastoma em ratos Lewis com paclitaxel conjugado a aprotinina; 40 A Figura 4 ilustra o efeito do tratamento de modelo de glioblastoma em murganhos nus com paclitaxel conjugado a AngioPep-1; A Figura 5 ilustra o protocolo utilizado para conjugar aprotinina com IgG utilizando o reticulador BS3; A Figura 6 ilustra o protocolo utilizado para conjugar aprotinina com IgG utilizando o reticulador sulfo-EMCS; A Figura 7 ilustra a penetração no cérebro de conjugados de IgG-aprotinina; A Figura 8 ilustra o efeito do tratamento do conjugado

Taxol-Angiopep-2 sobre a sobrevivência de murganhos implantados com glioblastoma (murganhos nus, atimicos) e; A Figura 9 ilustra a estrutura de polipéptidos exemplificativos da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma molécula que pode atuar como vetor ou veiculo para transportar um agente, medicamento ou outra molécula até o cérebro e/ou sistema nervoso central (CNS). Os agentes, medicamentos ou outras moléculas que são incapazes ou ineficazes para atravessar a barreira hematoencefálica por eles próprios, serão transportados através da barreira hematoencefálica quando ligados ou acoplados (conjugados) ao vetor ou veiculo. Alternativamente, um agente que é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica por si próprio também pode ter seu transporte aumentado quando conjugado ao veiculo da presente invenção. Tais conjugados podem estar na forma de 41 uma composição, tal como uma composição farmacêutica, para tratamento de uma condição ou doença.

Desenho de Moléculas Candidatas como Vetores Veículos

Na publicação Internacional n° W02004/060403, os inventores divulgaram que o AngioPep-1 (SEQ ID NO.:67) e a aprotinina (SEQ ID NO.:98) são vetores eficazes para transportar moléculas desejadas através da barreira hematoencefálica. Os inventores demonstram aqui que outras moléculas também poderiam ser utilizadas como veículos para transportar um agente através da barreira hematoencefálica. Em concordância, os péptidos que têm domínios similares como aprotinina e Angiopep-1 e uma forma modificada de Angiopep-1 (amidada, péptido n° 67) foram, portanto, concebidas como potenciais vetores veículos. Estes péptidos derivados parecem com a aprotinina e Angiopep-1, porém compreendem inserções de aminoácidos diferentes e suportam cargas diferentes. Até aqui, 96 péptidos apresentados na Tabela 2, bem como péptidos adicionais listados na listagem de sequência, foram testados quanto ao seu potencial como veículos.

Deve ser entendido aqui que nos seguintes experimentos, os péptidos foram selecionados com base na sua maior atividade comparados com outros. 42

Tabela 2: Desenho de 96 péptidos de domínio similar à aprotinina e Angiopep-1 com cargas e inserções de aminoácido diferentes das Péptidos ordenados em Sinpep (Califórnia, EUA)

Características proteínas Aprot-sint Blkunin-H 1-30 Amilóide Kuntz-lnhblb 1 Péptido (CARGA (+6)

#Pep 1 1 3 4 5 8 7 8 0 10 11 12 13 14 13 1« 17 18 IS T F V Y G G C ft A K R N K F K s A E D 2 t F q Y G G C M G N Q H ti F V T E K E 3 p F F Y G G c G G N R N *i F 0 T E Ê 4 s Ψ Y Y G G c L α N K N H Y L R E E E 5 T F F Y G G c R A K R H N F K R A K Y 6 T F F Y G G c R G K R a N F K R A K Y 7 T F F r G fi c R A K K « H Y K R A K Y 3 T F F Y G G c R G X X N « F K R A K Y 9 T F q Y G G c R A K R N H F K R A K Y 10 T F Q Y G G c R G K K N ti F X R A K Y CARGA (+5) it 12 13 14 15 se

%? p 10 T CARGA (+4) CARGA (+3)

CARGA (+2) HUMANO HUMANO HUMANO HUMANO HUMANO HUMANO 19 2G 21 22 23 24 25

ti K X K l K K K L K K ti i D

A A A A. A A A A A 43 CARGA (+1)

HUMANO HUMANO HUMANO HUMANO HUMANO HUMANO CARGA (+0)

HUMANO HUMANO HUMANO HUMANO

Aprotininavs Aprotinina M-Term (1 hélice a, A-term) (2 8 lâminas, Y-term) (1 a, ap)

AngioPep AngioPep-1 AngioPep-1 (lisina) AngioPep-1 (4Y) cys ponte cys-Nterminal cys-Cterminal cys-Nterminal Cys-Cterminal pro carga (+4) carga (+3)-cys carga (+4) carga (+4)-cys carga (+5) carga (+6) carga (+7) carga (+0) troca cys (-) troca cys(+) carga (-4) Q no lugar de F Mistura de ANGIOPEP TFPI TFPI (somínio similar) Carga+5 (humano) Carga+5 (humano) TFPI (C-terminal) (2Y) TFPI (C-terminal truncado)

Basic- Synbl Péptidos Synb3 Infiltração (pantp43- 5t 57 5» 55 5β 61«2 É3 M R P D F c l ε P P ¥ T Q P C V A R 1 A R I I R Y F Y « A K A G l c <3 T F V 55 Y S c c R A K R N N Y K S A E D c H 66 P 0 F c l E P P Y T G P C V A fl Ϊ I ft

89 R r K Y G G C s. a H M H N F E T L E E 90 R F K Y ç G c L G H K H N f L R L K Y R F K Y G 6 c L G n K N H Y 1. R L K Y 92 K T K R K R K K Q R V K T A Y E E í F 93 K T K R K R X K H ft V K I A Y 94 R G 6 95 R R L 56 R Q l 68) 44

Seleção com Modelo In Vitro

Um modelo in vitro foi utilizado para ensaio de rastreio e para estudos mecanicistas de transporte de fármaco para o cérebro. Este eficiente modelo in vitro da barreira hematoencefálica foi desenvolvido pela empresa CELLIAL™ Technologies. Ao fornecer resultados reproduzíveis, o modelo in vitro foi utilizado para avaliar a capacidade de veiculos diferentes atingirem o cérebro. 0 modelo consiste numa co-cultura de células endoteliais de bovino dos capilares cerebrais e células gliais de ratos. 0 modelo apresenta aspectos ultra-estruturais caracteristicos do endotélio cerebral inclusive junções impermeáveis, ausência de fenestração, ausência de canais transendoteliais, baixa permeabilidade a moléculas hidrofilicas e uma alta resistência elétrica. Além disso, este modelo apresentou um bom coeficiente de correlação entre análises in vitro e in vivo de uma ampla gama de moléculas testadas. Até agora, todos os dados obtidos mostram que este modelo de BBB imita estreitamente a situação in vivo pela reprodução de algumas das complexidades do ambiente celular que existem in vivo, enquanto mantém as vantagens experimentais associadas com a cultura de tecido. Muitos estudos validaram esta co-cultura celular como o modelo in vitro mais reproduzível da BBB. 0 modelo in vitro de BBB foi estabelecido por meio da utilização de uma co-cultura de BBCECs e astrócitos. Antes da cultura celular, insertos de placa (Millicell-PC 3,0 μΜ; 30 mm de diâmetro) foram revestidos no lado superior com colagénio de cauda de rato. Estes então foram ajustados em microplacas de seis poços que contêm os 45 astrócitos e BBCECs foram semeadas no lado superior dos filtros em 2 mL de meio de co-cultura. Este meio BBCEC foi trocado três vezes por semana. Sob estas condições, BBCECs diferenciados formaram uma monocamada confluente 7 dias mais tarde. Os experimentos foram realizados entre 5 e 7 dias após a confluência ser atingida. 0 coeficiente de permeabilidade de sacarose foi medido para verificar a permeabilidade endotelial.

As culturas primárias de astrócitos misturados foram preparadas a partir de córtex cerebral de rato recém-nascido (Dehouck Μ. P., Meresse S., Delorme P., Fruchart J. C, Cecchelli, R. An Easier, Reproductible, and Mass-Production Method to Study the Blood-Brain Barrier In

Vitro. J. Neurochem, 54, 1798-1801, 1990). Em resumo, após a remoção das meninges, o tecido cerebral foi forçado suavemente através de uma peneira de nylon de 82 pm. Os astrócitos foram semeados em microplacas de seis poços numa concentração de l,2xl05 células/mL em 2 mL de meio de cultura ótimo (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor. O meio foi trocado duas vezes por semana.

As células endoteliais de bovino dos capilares cerebrais (BBCECs) foram obtidas da Cellial Technologies. As células foram cultivadas na presença de meio DMEM suplementado com 10% (v/v) de soro de cavalo e 10% de soro de bezerro inativado pelo calor, 2 mM de glutamina, 50 pg/mL de gentamicina, e 1 ng/mL de fator de crescimento de fibroblasto básico, adicionados a cada dia.

Originalmente, num primeiro nivel de seleção, 96 péptidos como descrito na Tabela 2 foram testados como veiculo com 46 o modelo in vitro da BBB. Cada péptido foi adicionado ao lado superior dos insertos revestidos ou não-revestidos com células endoteliais durante 90 minutos a 37 °C. Após a incubação, os péptidos no lado inferior das câmaras foram resolvidos por eletroforese. Os géis de eletroforese foram corados com azul de Coomassie para visualizar os péptidos como ilustrado com alguns péptidos (sem caráter limitativo) na Figura 1. O AngioPep-1 (tanto SEQ ID NO.:67 como o péptido n° 67 (forma amidada)) é geralmente utilizado aqui como uma referência ou para fins de comparação. Na Figura 1, cada péptido inicial aplicado no lado superior dos filtros foi carregado sobre gel de eletroforese (ini) como controlo. Após 90 minutos de transcitose, um volume de 50 pL do lado basolateral dos filtros revestidos com células endoteliais (+) ou não-revestidos (-) também foi carregado sobre géis de Tricina. Para visualizar os péptidos os géis foram corados com azul de Coomassie.

Após o primeiro nivel de rastreio, os péptidos detectados no lado inferior das câmaras por coloração por azul de Coomassie (5, 8, 45, 67, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 90 e 91) foram selecionados para estudo adicional com os péptidos iodados. Em resumo, os péptidos selecionados foram iodados com procedimentos padrão que utilizam esferas de iodo (iodo-beads) da Sigma. Duas esferas de iodo foram utilizadas para cada proteína. Estas esferas foram lavadas duas vezes com 3 mL de tampão fosfato (PB) sobre um filtro Whatman™ e ressuspensos em 60 pL de PB. 125I (1 mCi) da Amersham-Pharmacia biotech foi adicionado à suspensão de esfera durante 5 min à temperatura ambiente. A iodação de cada péptido foi iniciada pela adição de 100 pg (80-100 pl) da suspensão de 47 esfera. Após uma incubação de 10 min à temperatura ambiente, os sobrenadantes foram aplicados sobre uma coluna de dessalinização pré-embalada com 5 mL de dextran™ i p c reticulado da Pierce e as I-proteinas foram eluidas com 10 mL de PBS. Frações de 0,5 mL foram coletadas e a radioatividade em 5 yL de cada fração foi medida. As frações que correspondem a I-proteinas foram combinadas e dialisadas contra tampão Ringer/Hepes, pH 7,4. A eficiência da radiomarcação foi entre 0,6 - 1,0 x 108 cpm/100 pg de proteína.

Os péptidos iodados também foram investigados com o modelo in vitro da BBB. Cada péptido foi adicionado ao lado superior dos insertos revestidos ou não-revestidos com células endoteliais durante 90 minutos a 37 °C. Após a incubação, os péptidos no lado inferior das câmaras foram precipitados com TCA. Os resultados foram expressos como proporções em cpm. Para cada [ I]-peptido o número de cpm na câmara inferior foi dividido pelo número total de cpm adicionado no filtro revestido com células endoteliais (+células/iniciais) ou não-revestido (-células/iniciais). A proporção entre o número de [ 125I]-péptido encontrado na câmara inferior de filtros revestidos com ou sem células endoteliais também foi calculada (+células/-células) . Uma proporção muito baixa de -células/iniciais indica que os filtros podem interferir nos péptidos (péptidos 5 e 8). Uma proporção alta de +células/iniciais e +células/-células indica uma passagem melhor dos péptidos através das células endoteliais cerebrais. Os resultados dos 18 péptidos anteriormente selecionados estão apresentados na Tabela 3. 48

Tabela 3

Resultados do rastreio de rastreio péptido após o segundo nivel de Péptidos Proporções N° -células/iniciais +células/iniciais +células/iniciais 5 0,111 0,051 0,46 8 0,086 0,039 0,46 45 0,163 0,049 0,30 67 0,403 0,158 0,39 70 0,143 0,032 0,23 71 0,072 0,027 0,37 72 0,209 0,029 0,014 73 0,056 0,017 0,30 74 0,146 0,036 0,24 75 0,207 0,087 0,42 76 0,222 0,084 0,38 77 0,224 0,063 0,28 78 0,125 0,075 0,60 79 0,194 0,078 0,40 81 0,203 0,088 0,43 82 0,120 0,043 0,36 90 0,284 0,134 0,47 91 0,406 0,158 0,30 Aprotinina 0,260 0,022 0,08 A partir destes resultados, 12 péptidos com proporções de +células/-células geralmente maiores do que 0,35 foram selecionados, isto e, 5, 8, 67, 75, 76, 77, 78, 79, 81 , 82, 90 e 91. Os péptidos n° 91 e n° 77 também foram selecionados para investigação adicional devido a suas proporções de + células/- células (>0,2).

Os 12 péptidos selecionados foram então investigados por meio da avaliação dos seus coeficientes de permeabilidade utilizando o modelo in vitro de BBB. O efeito de cada péptido selecionado a 250 nM sobre a integridade da BBB 49 foi determinado pela medição da permeabilidade de sacarose [14C] no modelo de BBB sobre monocamadas de BBCEC desenvolvidas em filtros na presença de astrócitos. Para realizar este teste, as monocamadas de célula endotelial desenvolvidas em insertos foram transferidas para placas de 6 poços contendo 2 mL de Ringer-Hepes por poço (compartimento basolateral) durante duas horas a 37 °C. A solução de Ringer-Hepes era composta de NaCl 150 mM, KC1 5,2 mM, CaCl2 2,2 mM, MgCl2 0,2 mM, NaHCCh 6 mM, Hepes 5 mM, Hepes 2,8 mM, pH 7,4. Em cada câmara apical, o meio de cultura foi substituído por 1 mL de Ringer-Hepes contendo a sacarose marcada com [14C]. Em momentos diferentes, os insertos foram colocados em outro poço. A passagem de sacarose [14C] foi medida a 37 °C, em filtros sem células ou com filtros revestidos com células de BBCEC. Os péptidos são adicionados no início do experimento no tempo zero. Os resultados foram organizados num gráfico como depuração de sacarose (pL) como uma função do tempo (min).

Depuração (pL) = [C] A x VA

[C] L

[C]A = Concentração de traçador albuminal VA = Volume de câmara abluminal [C]L = Concentração de traçador luminal A inclinação da variação linear (pL/min) é o coeficiente de permeabilidade de sacarose do filtro sem células (Psf) e um revestido com células de BBCEC (PSt) na presença do péptido. O coeficiente de permeabilidade (Pe) foi calculado como: 1/Pe = (1/PSt-l/PSf/ área do filtro (4,2 cm2) 50

Foram selecionados os péptidos com Pe mais alto: 67, 76, 90, 91,5,79, 8, e 78. A perfusão cerebral in situ (em murganhos) foi utilizada como o quarto nivel de seleção para selecionar os melhores péptidos. Este procedimento também distingue entre compostos restantes no compartimento vascular cerebral daqueles que atravessaram a membrana endotelial abluminal para entrar no parênquima cerebral. De facto, as técnicas de depleção de capilar pós-perfusão permitem calcular se a molécula realmente atravessa o endotélio para entrar no parênquima cerebral. A utilização desta técnica é demonstra aqui que acumular na fração do Tabela 4 péptidos parênquima específicos tendem cerebral (ver Tabela a se 4) . Péptidos Volume de distribuição (perfusão 5 min) N° Homogenato Capilares Parênquima (mL/1OOg) (mL/1OOg) 0, 0 (mL/lOOg) 0, 0 5 312 217 73 95 27 8 250 204 82 46 18 25 1141 1082 95 60 5 67 38 13 34 25 65 76 40 16 40 24 60 78 198 181 90 16 10 79 70 52 74 18 26 90 87 76 88 11 12 91 47 24 59 23 41 Quatro péptidos, nomeadamente 5, 67, 76 e : 91, apresentaram os niveis mais altos de distribuição no parênquima com um volume superior a 20 mL/100 g e que representa pelo menos 25% do volume obtido no cérebro inteiro (homogenato), 51 desta maneira mostrando o potencial mais alto como veiculo para utilização como vetores de transporte. 0 péptido 79 foi eliminado devido ao seu volume inferior de distribuição no parênquima cerebral (18 mL/lOOg). 0 péptido 67 representa a forma amidada de AngioPep-1 descrita no pedido anterior que os inventores depositaram. A amidação de um péptido afeta a carga total do péptido. Conforme evidente nas Tabelas 2 e 3, dois péptidos que têm uma carga diferente não têm necessariamente a mesma atividade. 0 vetor ou veiculo divulgado pode ser, desse modo, utilizado num método para transportar um agente através da barreira hematoencefálica que compreende administrar a um individuo um agente que compreende um ingrediente ativo ou um agente farmacêutico ligado a um veiculo, tal como aprotinina ou um derivado funcional desta (isto é, um análogo de aprotinina, um fragmento de aprotinina, um derivado de aprotinina, um análogo de um fragmento de aprotinina). 0 veiculo e conjugado podem ser administrados ao doente por via intra-arterial, intranasal, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica ou per os. 0 agente pode ser, por exemplo, um composto antiangiogénico. 0 agente pode ter um peso máximo de 160.000 Daltons. Como discutido aqui, o agente pode ser um marcador ou um fármaco tal como um fármaco de molécula pequena, uma proteina, um péptido ou uma enzima. O fármaco pode ser adaptado para tratar, por exemplo, uma doença neurológica ou um distúrbio no sistema nervoso central de um doente. O fármaco pode ser um fármaco citotóxico e o marcador pode ser um marcador detectável tal como um 52 marcador radioativo, uma proteína fluorescente verde, uma proteina histag ou β-galactosidase. 0 agente pode ser administrado, por exemplo, dentro do sistema nervoso central de um doente.

As utilizações, métodos, compostos, agentes, fármacos ou medicamentos aqui mencionados não podem alterar a integridade da barreira hematoencefálica do doente. 0 péptido da invenção pode ser selecionado de um péptido definido na SEQ ID NO.: 97. 0 péptido 97 pode ser utilizado por ligação do mesmo a um agente ou um composto para transportar o agente ou composto através da barreira hematoencefálica de um doente. 0 agente ou composto pode ser adaptado para tratar uma doença neurológica ou para tratar um distúrbio do sistema nervoso central. 0 veículo da presente invenção, o péptido 97 pode ser ligado ou marcado com um marcador detectável tal como um agente de radioimagem, tal como aqueles que emitem radiação, para detecção de uma doença ou condição, por exemplo através da utilização de um conjugado agente de radioimagem-anticorpo-veículo, em que o anticorpo se liga a um antigénio específico da doença ou condição. Outras moléculas de ligação para além dos anticorpos e que são conhecidas e utilizadas na técnica também são também aqui divulgadas. Alternativamente, o veículo da presente invenção pode ser ligado a um agente terapêutico, para tratar uma doença ou condição, ou pode ser ligado ou marcado com misturas do mesmo. 0 tratamento pode ser realizado por meio da administração de um conjugado 53 veículo-agente a um indivíduo em condições que permitem o transporte do agente através da barreira hematoencefálica.

Um agente terapêutico conforme aqui utilizado pode ser um fármaco, um medicamento, um agente que emite radiação, uma toxina celular (por exemplo, um agente quimioterapêutico) e/ou seu fragmento biologicamente ativo, e/ou suas misturas para permitir a morte celular ou pode ser um agente para tratar, curar, aliviar, melhorar, diminuir ou inibir uma doença ou condição num indivíduo tratado. Um agente terapêutico pode ser um produto sintético ou um produto de microrganismo fúngico, bacteriano ou outro, tal como micoplasma, de origem virai etc., animal, tal como réptil, ou planta. Um agente terapêutico e/ou seu fragmento biologicamente ativo pode ser um agente enzimaticamente ativo e/ou seu fragmento, ou pode atuar por meio da inibição ou bloqueio de uma via celular importante e/ou essencial ou pela competição com um componente celular naturalmente ocorrente importante e/ou essencial.

Exemplos de agentes de radioimagem que emitem de radiação (rádio-marcadores detectáveis) que podem ser adequados são exemplificados por índio-111, tecnécio-99, ou baixa dose de iodo-131.

Os marcadores detectáveis, ou marcadores, para utilização na divulgação podem ser um radiomarcador, um marcador fluorescente, um marcador ativo para ressonância magnética nuclear, um marcador luminescente, um marcador cromóforo, um isótopo de emissão de positrão para tomógrafo PET, marcador quimioluminescente, ou um marcador enzimático. Os marcadores fluorescentes incluem proteína fluorescente 54 verde (GFP), fluoresceína, e rodamina. Os marcadores quimioluminescentes incluem luciferase e β-galactosidase. Os marcadores enzimáticos incluem peroxidase e fosfatase. Um histag também pode ser um marcador detectável. É entendido que um agente pode ser libertado do veiculo após o transporte através da barreira hematoencefálica, por exemplo, por clivagem enzimática ou ruptura de uma ligação química entre o veículo e o agente. 0 agente de libertação pode então funcionar na sua capacidade pretendido na ausência do veículo. EXEMPLO 1

Estratégias para conjugação de fármaco (paclitaxei)

Para conjugação, o paclitaxel (TAXOL™) tem 2 posições estratégicas (posição C2' e Cl) . A Figura 2 ilustra o método de ligação do vetor ou veículo da presente invenção ao paclitaxel. Em resumo, o paclitaxel é feito reagir com piridina anidrido succínico durante 3 horas à temperatura ambiente para ligar um grupo succinilo na posição 2'. Tal 2'-succinil paclitaxel tem uma ligação de éster clivável na posição 2 ' que mediante clivagem pode simplesmente libertar ácido succínico. Esta ligação de éster clivável pode ser adicionalmente utilizada para diversas modificações com ligantes, se desejado. 0 2'-O-succinil paclitaxel resultante é então feito reagir com EDC/NHS em DMSO durante 9 horas à temperatura ambiente, seguido pela adição do veículo ou vetor em Ringer/DMSO durante um tempo de reação adicional de 4 horas à temperatura ambiente. A reação de conjugação representada na Figura 2 é monitorada por HPLC. Cada intermediário, tal como paclitaxel, 2'-0- 55 succinil paclitaxel e 2'-O-NHS-succinil paclitaxel, é purificado e validado utilizando abordagens diferentes tais como HPLC, cromatografia em camada fina, RMN (troca 13C ou 3Η) , ponto de fusão, espectrometria de massa. 0 conjugado final é analisado por espectrometria de massa e eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS. Isto permite determinar o número de moléculas de paclitaxel conjugadas em cada vetor. A capacidade de transcitose do conjugado Aprotinina-Paclitaxel foi determinada e está relatada adiante na Tabela 5.

Tabela 5

Determinação da capacidade de transcitose do conjugado aprotinina-Taxol através da BBB

Transcitose Integridade de sacarose (Pe IO"3 cm/min) (Pe 10“3 cm/min)

Controlo

Aprotinina 0,2 0,28

Aprotinina- 0,21 0,24

Taxol 0,22 A conjugação não afeta a capacidade de aprotinina através da barreira A integridade da barreira também é mantida

Como observado na Tabela 5, a conjugação de paclitaxel com aprotinina ainda foi capaz de atravessar o modelo in vitro da barreira hematoencefálica sem afetar a integridade da sacarose, desse modo provando que a molécula (também aqui referidas como vetores ou veículos) de aprotinina ainda mantém sua atividade quando conjugada com uma grande entidade química tal como o paclitaxel. 56 0 estudo de sobrevivência no modelo de tumor cerebral em rato foi então conduzido para verificar se o paclitaxel que foi conjugado ainda está ativo in vivo. Para o modelo de tumor cerebral em rato, os ratos receberam um implante intracerebral de 50.000 células do CNS-1 célula de glioma. Três (3) dias depois, os animais receberam tratamento com veiculo (aprotinina), Paclitaxel (5 mg/kg) ou Paclitaxel-Aprotinina (5 mg/kg) por injeção intravenosa. O tratamento foi então administrado toda semana até o animal ser sacrificado (ver Figura 3) . Os ratos foram monitorizados todos os dias quanto a sintomas clinicos e perda de peso. De acordo com o protocolo da boa prática animal, os animais foram sacrificados quando uma perda de peso foi observada durante 3 dias consecutivos ou antes, se a perda de peso for maior que 20% do peso inicial do animal.

Por meio da utilização do mesmo protocolo experimental, quando injetado só, na dose máxima tolerada (54 mg/kg), o paclitaxel foi incapaz de aumentar a sobrevida do murganho (Laccabue et al., 2001 Câncer, 92 (12): 3085-92). O estudo de sobrevida também foi conduzido em murganhos implantados com um xenoenxerto de tumor cerebral humano. Para o modelo de tumor cerebral em murganhos, os murganhos receberam um implante intracerebral de 500.000 células de glioma humano U87. 3 dias após o implante os animais receberam tratamento com Paclitaxel-Angiopep 1 (5 mg/kg) ou veiculo por injeção intravenosa. O tratamento foi então administrado toda semana até o animal ser sacrificado. Os murganhos foram monitorizados todos os dias quanto a sintomas clinicos e perda de peso. De acordo com o protocolo da boa prática animal, os animais foram sacrificados quando uma perda de peso for observada 57 durante 3 dias consecutivos ou antes, se a perda de peso for maior que 20% do peso inicial do animal. Foi observado agora que a média de sobrevida do grupo de controlo era 19 ± 2 dias. Para a análise estatística um aumento de 20% na sobrevida foi considerado significativo. Como pode ser visto na Figura 4, o conjugado Paclitaxel-AngioPep-1 manteve sua atividade, apresentando um efeito estatisticamente significativo. O tempo de sobrevida dos animais tratados com paclitaxel-angioPep 1 é significativamente prolongado quando comparado com o grupo de controlo (p <0,05, n=8).

EXEMPLO II

Estratégias para conjugação de anticorpos

Uma vez que as proteínas têm, em geral, diversos grupos amino disponíveis para conjugação, o acoplamento de amina que utiliza ativação sulfo-NHS/EDC deve ser utilizado para reticular anticorpos terapêuticos com os vetores (veículos) divulgados. Esta abordagem foi selecionada por ser uma técnica de acoplamento rápida, simples e reproduzível, pois o conjugado resultante é estável ao mesmo tempo em que ainda mantém a atividade biológica do anticorpo e tem uma alta capacidade de conjugação que pode ser controlada de forma fiável e uma baixa interação não-específica durante os procedimentos de acoplamento.

Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo (Fab e Fab'2) foram conjugados com o vetor para aumentar sua administração ao cérebro. Diversas abordagens de conjugação foram utilizadas primeiramente para conjugar IgGs com aprotinina, provando que os veículos divulgados 58 se comportaram exatamente como a aprotinina.

Diferentes reticuladores, tais como BS3 [Bis (sulfossuccinimidil)suberato] , NHS/EDC (N-hidroxissuccinimida e N-etil-N'(dimetilaminopropil)carbodimida ou Sulfo-EMCS ([N-e-ácido maleimidocapróico]hidrazida) foram testados para a conjugação de IgG. O BS3 é um éster Homobifuncional N-hidroxissuccinimida que atinge aminas primárias acessíveis. NHS/EDC cria uma conjugação de grupos amina primária com grupos carboxilo. Sulfo-EMCS são grupos reativos heterobifuncionais (maleimida e NHS-éster) que são reativos para: grupos sulfidrilo e amino. A conjugação de IgG com aprotinina que utiliza o reticulador BS3 (Figura 5) ou sulfo-EMCS (Figura 6) foi avaliada primeiro. 0 transporte de IgG ou conjugados de IgG através da BBB foi então testado. A absorção de [125I]-IgG no lado luminal dos capilares cerebrais de murganhos foi medida utilizando o método de perfusão cerebral in situ adaptado no laboratório do inventor para o estudo de absorção de fármaco no cérebro do murganho (Dagenais et al., 2000, J. Cereb. Blood Flow Metab. 20(2):381-386). As constantes de transporte para BBB foram determinadas como anteriormente descrito por Smith (1996, Pharm. Biotechnol. 8:285-307). A absorção de IgG foi expressa como o volume de distribuição (Vd) a partir da seguinte equação:

Vd=Q*br/C*pf em que Q*br é a quantidade calculada de conjugado [1251 ] — 59

IgG ou [ 125I ]-IgG-aprotinina por grama de hemisfério cerebral direito e C*pf é a concentração de traçador marcado medida no perfusato.

Os resultados do mesmo experimento indicam que há uma absorção cerebral maior para [ 125I ]-IgG-aprotinina conjugado do que para [1251] — IgG não conjugado (ver Figura 7) . A conjugação de IgGs com aprotinina aumenta a sua acumulação no parênquima cerebral in vivo.

EXEMPLO III

Efeito do conjugado Taxol-Angiopep-2 sobre a sobrevida de murganhos

Este estudo com Taxol-Angiopep-2 (referido aqui por péptido n° 97) (o angiopep2 não é amidado) foi conduzido para determinar se a conjugação de Taxol com Angiopep-2 poderia aumentar a sobrevida de murganhos. A estrutura do Angiopep-2 está ilustrada na SEQ ID NO.: 97. Para este experimento, os murganhos receberam um implante intracerebral de 500.000 células de glioma humano U87. Após 3 dias após a implantação, os animais foram tratados com o veiculo (DMSO/Ringer-Hepes 80:20 v/v (isto é, controlo)) ou conjugado Taxol-Angiopep-2 (3:1, isto é, proporção de 3 moléculas de Taxol para cada péptido; TxlAn2 (5 mg/kg)) por injeções na veia da cauda (Figura 8) . Os murganhos foram monitorizados todos os dias quanto a sintomas clínicos e perda de peso. Os tratamentos foram administrados até os animais serem sacrificados. Como mostrado na Tabela 6, observou-se que a média de sobrevida 60 era de 18 dias para o grupo de controlo se a média de sobrevida dos murganhos que receberam o conjugado Taxol-Angiopep-2 for de 21 dias (Figura 8) . A curva de sobrevida obtida por murganhos tratados com conjugado Taxol-Angiopep-2 (em vermelho) indica que a média de sobrevida foi aumentada, de forma significativa, em 17% (Figura 8). As análises estatísticas também apresentadas na Tabela 6 indicam que a administração do conjugado Taxol-Angiopep-2 aumentou a sobrevida, de forma significativa, em 17% (valores p = 0,048).

Tabela 6. Resumo dos resultados do estudo de sobrevida a. Média de sobrevida Dias Aumentado Controlo 18,0 ( ^ ) Conjugado TxlAn2 21,0 + 17 b. Análise estatística (valores p) Controlo vs conjugado p = 0,048 Txlan2

Murganhos (n) 7 7 diferenças estatísticas sim SEQUÊNCIAS SEQ ID NO. :

1 T F V Y G G C R A K R N N F K S A E D 2 T F Q Ύ G G c M G N G N N F V T B K E 3 P F F Y G G c G G N R N ΚΓ F D T S E Y 4 s F Y Y G G c L G N K N ΚΓ Y L R E E B 5 T F F Y r~« ^3 G c R A K R N N F K R K Y O péptido n° 5 compreende a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO.:5 e é amidado no seu terminal-N (ver, por exemplo, Figura 9) 61 6 Τ F Ρ Υ G G C R G Κ R Ν Ν F Κ R Α Κ Υ 7 rj*6 3? ρ Υ G G C R Α Κ Κ Η Ν Υ κ R Α Κ Υ 8 Τ F F Υ G G C R G Κ Κ Ν Ν F κ R Α Κ Υ 9 ÍJ-l F Q Υ G G C R Α κ R Ν Ν F κ R Α Κ Υ 10 Τ F Q Υ G G C R G κ Κ Ν Ν F κ R Α κ Υ 11 Τ F F y G G C Χϊ G κ R Ν Κ F κ R Α κ Υ 12 *3? F F Υ G G S L G κ R Ν Ν F κ R Α κ Υ 13 Ρ F F Υ G G C G G κ Κ Η Ν F κ R Α κ Υ 14 τ F F Υ G G C R G κ G Η Ν Υ κ R Α κ Υ 15 Ρ F ρ Υ G G C R G κ R Ν Ν ρ L R Α κ Υ 16 τ F F Υ G G C R G κ R Ν Ν F Κ R Ε κ Υ 17 Ρ F F Υ G G C R Α κ Κ Ν Ν F Κ R Α κ Ε 18 τ 3? F Υ G G C R G κ R Ν Ν F κ R Α κ D 19 τ Ρ F Υ G G C R Α κ R Ν Ν F D R Α κ Υ 20 τ F F Υ G G C R G κ Κ Ν Ν F Κ R Α Ξ Υ 21 Ρ F ρ Υ G G C G Α Ν R Ν ν F Κ R Α κ Υ 22 ip F F Υ G G C G G κ Κ Ν Ν ρ Κ Τ Α κ Υ 23 Τ F F Υ G G C R G Η R Ν Ν F L R Α κ Υ 24 τ F F Υ G G C R G Μ R Ν Μ F Κ ap Α κ Υ 25 τ F F Υ G G S R G Ν R Ν Ν ρ Κ Τ Α κ Υ 26 τ ρ F Υ G G C L G Ν G Ν Ν F Κ R Α κ Υ 27 τ F ρ Υ G G C L G Ν R Ν Ν F 1 R Α κ Υ 62 28 Τ F F γ G G C L G Ν R Ν Ν F Κ τ Α Κ γ 29 Τ F ρ Υ G G C R G Ν G Ν Ν F κ S Α Κ Υ 30 Τ ρ F Υ G G C R G Κ Κ Ν Ν F D R Ε Κ Υ 31 Τ F F Υ G G C R G Κ R Ν Ν F L R Ε κ Ε 32 Τ F F Υ G G C R G Κ G Ν Ν ρ D R Α κ Υ 33 ÍJI F F Υ G G S R G κ G υ Ν F D R Α κ Υ 34 Τ F ρ Υ G G C R G Ν G Ν Ν F V Τ Α κ Υ 35 Ρ F F Υ G G Γ* ’ίμ- G G Κ G Ν Ν Υ V Τ Α κ γ 36 τ F F Υ G G C L G κ G Μ Ν F L Τ Α κ Υ 37 S F F Υ G G C L G Η Κ Ν Ν F L τ Α κ Υ 38 τ F F Υ G G C G G Ν Κ Ν Ν F V R Ε κ Υ 39 τ F F Υ G G C Μ G Ν Κ Ν Ν F V R Ε κ Υ 40 τ F ρ Υ G G S Η G Ν κ Ν Ν F V R Ε κ Υ 41 Ρ ρ F Υ G G C ]j G Ν R Ν Κ Υ V R Ε κ Υ 42 τ F F γ G G C L G Ν R Ν 3SF ρ V R Ε κ Υ 43 τ F F Υ G G C L G Ν Κ Ν Ν Υ V R Ε κ Υ 44 γ F F Υ G G C G G Ν G Ν Ν F L Τ Α Κ Υ 45 Τ F F γ G G C R G Κ R Μ Ν F L Τ Α Ε Υ 46 Τ ρ ρ Υ G G C R G Ν G Μ Ν ρ Κ S Α Ε Υ 47 Ρ F F Υ G G C L G Ν Κ Ν Ν F Κ τ Α Ε Υ 48 τ F F Υ G G C R G Ν R Ν Ν F Κ Ι*ρ Ε Ε Υ 49 τ F F Υ G G C R G Κ R Ν Ν F κ Τ Ε Ε D 50 Ρ F ρ Υ G G C G G Ν G Ν Ν ρ V R Ξ Κ Υ 51 S ρ F Υ G G C Μ G Ν G itf Η F V R Ε Κ Υ 52 Ρ F F Υ G G C G G Ν G Ν Ν F L R Ε Κ γ 53 τ F F γ G G C L G Κ G Ν Ν F V R Ε Κ Υ 54 S F ρ Υ G G G L G Ν G Ν Ν Υ L R Ε Κ Υ 55 τ ρ F Υ G G S L G Ν G Ν Ν F V R Ξ Κ Υ 56 τ F F γ G G C R G Μ G Ν Ν F V Τ Α Ε Υ 57 Ί) F ρ Υ G G C L G Κ G Ν Ν F V 3 Α Ξ Υ 58 τ F F Υ G G C L G Ν R Ν ti F D R Α Ε γ 59 τ F F Υ G G C L G Ν R Ν Ν F L R Ε Ε Υ 60 τ F F Υ G G C L G Ν Κ Ν Ν Υ L R Ε Ε Υ 61 Ρ ρ F Υ G G C G G Ν R Ν Ν γ L R Ε Ε Υ 63 62 Ρ ρ F Υ G G S G G Ν R Ν Ν Υ L R Ε Ε Υ 63 Μ R Ρ D F C L Ε Ρ Ρ Υ Τ G Ρ C V Α R I 64 Α R I X R Υ F Υ Ν Α Κ Α G L C Q Τ F V Υ G 65 Υ G G C R Α Κ R Ν Ν Υ Κ S Α Ε D C Μ R τ C G 66 Ρ D F C L Ε Ρ Ρ Υ Τ G Ρ C V Α R I I R Υ F Υ 67 Τ F F Υ G G C R G Κ R Ν Ν F Κ Τ Ε Ε Υ

0 péptido n 67 compreende a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO. : 67 e é amidado no seu terminal-N (ver, por exemplo, Figura 9) 68 K p F Y G G C R G K R N N F K T E E Y 69 pjn F Y Y G G C R G K R N N γ K T E Ξ Y 70 T p ρ γ G G s R G K R N N F κ T B E Y 71 c T F F Y G c C R G K R N N F K T E Ε Y 72 T F F Y G G c R G K R N N F K T E Ξ Y c 73 c pp F F Y G s C R G K R N N F K T Ξ Ε Y 74 T F F Y G G s R G K R N N F K T E Ξ Y c 75 P F F Y G G c R G K R N N F K T 12 E Y 76 T F F Y G G c R G K R N N F κ T K E Y 0 péptido o n 76 compreende i sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO. : 7 6 e é amidado no seu terminal-N (ver, por exemplo, Figura 9) 77 T F ρ γ G G K R G K R N N F E Ξ Y 78 T F F Y G G c R G K R N N P K T K R Y 79 T F F Y G G K R G K R N N p κ T A E Y 80 T F F Y G G K R G K R ΚΓ N F κ T A G Y 81 T F F Y G G K R G K R N N F K R E K Y 81 T F F Y G G c G G N G N ΚΓ F L T A K Y 82 T p F Y G G c R G N R N N F L t A E Y 83 T ' F F Y G G c R G N G N N F K s A E Y 84 P F F Y G G c L G N Κ N N F |ζ rjt A B Y 85 T F F Y G G c R G N R N N F E E Y 86 T F F Y G G c R G K R N N F κ T E E D 87 P F F γ G G c G G N G N KF p V R E K Y 64

88RFKYG GCLGNMNNFETLEE 89 R F K Y G GCLGNKNNF LRLKY 91RFKYGGCLGNKHRYLRLKY 0 péptido n° 91 compreende a sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO.: 91 e é amidado no seu terminal-N (ver, por exemplo, Figura 9).

92 K T K R K R K K G R V K I A Y E E I 3? K N Y 93 K T K R K R K K Q R V K I A Y 94 R G G R L S Y S R R F s T S T G R 95 R R L S Y S R R R F 9S R Q I K I w F Q N R R M K W K K 97 T F F Y G G S R G K R ΚΓ N F K T E E Y 98 M R P D F c L Ξ P P Y T G P c V A R I I R Y F Y N A K A G L c Q T F V Y G G c R A K R N N F K S A E D C M R T C G G A 99 T F p Y G G C R G K R N N F K T K E Y 100 R F K Y G G c L G N K N N Y L R L K Y 101 T F F Y G G c R A K R N N F K R A K Y 102 N A K A G L c G T F V Y G G C L A K R N N F E S A E D C M R T C G G A 103 Y G G C R A K R N N F K S A E D C M R IJI C G G A 104 G L C Q T F V Y G G C R A K R N N F K s A E 105 L C Q T F V Y G G C E A K R N N F K s A SEQ ID NO . 106 atgagaccag atttctgcct cgagccgccg tacactgggc cctgcaaagc tcgtatcatc cgttacttct acaatgcaaa ggcaggcctg tgtcagacct tcgtatacgg cggctgcaga gctaagcgta acaacttcaa atccgcggaa gactgcatgc gtacttgcgg tggtgcttag

Lisboa, 8 de Junho de 2012

Claims (1)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Péptido com a sequência TFFYGGSRGKRNNFKTEEY. Lisboa, 8 de Junho de 2012