PT1551805E - Δ-lactamas γ-fenil-substituídas e utilizações relacionadas - Google Patents

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Yaping Shen
David L Burgoyne
Ronald W Lauener
Yuanlin Zhou
Patrick Rebstein
Samuel D M Abraham
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Dart Neuroscience Cayman Ltd
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Description

DESCRIÇÃO
Δ-LACTAMAS γ-FENIL-SUBSTITUÍDAS E UTILIZAÇÕES RELACIONADAS
CAMPO TÉCNICO
Esta invenção refere-se a compostos de Δ-lactama, e em particular a Δ-lactamas γ-fenil-substituidas, e a utilizações terapêuticas a elas relacionadas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A Resposta Inflamatória (Inflamação) A inflamação é uma resposta do hospedeiro localizada a microrganismos invasores ou lesões nos tecidos que envolvem células do sistema imunitário. Os sinais clássicos de inflamação incluem rubor (eritema), inchaço (edema), dor e aumento da produção de calor (pirema) no local da lesão. A resposta inflamatória permite ao corpo reconhecer de forma especifica e eliminar um organismo invasor e/ou reparar uma lesão num tecido. Muitas das alterações agudas no local da infamação podem ser directamente ou indirectamente atribuídas ao influxo maciço de leucócitos (por exemplo, neutrófilos, eosinófilos, linfócitos, monócitos) que é intrínseco a esta resposta. A infiltração e acumulação leucocitica nos tecidos resulta na sua activação e subsequente libertação de mediadores inflamatórios tais como LTB4, prostaglandinas, TNF-oí, IL-Ιβ, IL —8, IL-5, IL-6, histamina, proteases e espécies reactivas de oxigénio, por exemplo. A inflamação normal é um processo altamente regulado que é estreitamente controlado a vários niveis para cada um dos tipos de células envolvidos na resposta. Por exemplo, a expressão da citocina pro-inflamatória TNF-oí é controlada ao 1 nível da expressão génica, tradução, modificação pós-tradução e libertação da forma madura da membrana celular. Muitas das proteínas cuja expressão é aumentada durante a inflamação são controladas pelo factor de transcrição, NF-κΒ. As respostas pró-inflamatórias são normalmente contrariadas por mecanismos anti-inflamatórios tais como a geração de IL-10 ou IL-4. Uma característica da resposta inflamatória normal é que tem uma natureza temporária e é seguida por uma fase de resolução que leva o estado do tecido de volta para o seu estado anterior. Pensa-se que a fase de resolução envolve o aumento da expressão de mecanismos anti-inflamatórios, tais como IL-10, assim como a inibição da expressão de processos pro-inflamatórios.
Doença Inflamatória A doença inflamatória ocorre quando uma resposta inflamatória é iniciada que não seja apropriada ou não se resolva do modo normal mas pelo contrário persista e resulte num estado inflamatório crónico. A doença inflamatória pode ser sistémica (por exemplo, lúpus), ou localizada em tecidos ou órgãos particular e exerce um enorme peso pessoal e económico na sociedade. Exemplos de algumas das doenças inflamatórias mais comuns e problemáticas são a artrite reumatóide, a doença inflamatória do intestino, a psoríase, a asma, o enfisema, a colite e a lesão de isquemia-reperfusão.
Um tema subjacente comum na doença inflamatória é uma perturbação da resposta imunitária celular que resulta no reconhecimento de proteínas do hospedeiro (antigénios) como estranhas. Assim, a resposta inflamatória torna-se mal direccionada para tecidos do hospedeiro com células efectoras a se direccionarem contra órgãos ou tecidos específicos 2 resultando frequentemente em danos irreversíveis. 0 aspecto de auto-reconhecimento da doença auto-imune é frequentemente reflectido pela expansão clonal de subconjuntos de células-T caracterizados por um subtipo particular de receptor de célula T (TCR) no estado de doença. A doença inflamatória é também frequentemente caracterizada por um desequilíbrio nos níveis de subconjuntos de células T auxiliares (Th) (i.e., células Thl vs. células Th2).
As estratégias terapêuticas destinadas à cura de doenças inflamatórias geralmente pertencem a uma de duas categorias: (a) inibição dos processos que são sobre-expressos no estado de doença ou (b) estimulação das vias anti-inflamatórias nas células ou nos tecidos afectados. A maioria dos regimes actualmente utilizados na prática clínica caem na primeira categoria. Alguns exemplos dos quais são corticoesteróides e fármacos não esteróides anti-inflamatórios (NSAIDs).
Muitos dos processos nos tecidos, celulares e bioquímicos que são perturbados na doença inflamatória foram elucidados e isto permitiu o desenvolvimento de modelos experimentais ou testes para mimetizar o estado de doença. Estes testes in vitro permitem a selecção e o rastreio de compostos com uma elevada probabilidade de eficácia terapêutica na doença inflamatória relevante. Assim, os testes actualmente utilizados para modelar a importância dos leucócitos activados no desenvolvimento da inflamação aguda e na manutenção do estado crónico de inflamação são ensaios que monitorizam a quimiotaxia dos leucócitos e a desgranulação celular e síntese de citocinas e ensaios de produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS) in vitro. Uma vez que um resultado da activação aguda ou crónica de neutrófilos é a libertação de ROS com resultantes danos nos tecidos, um 3 ensaio para sequestradores de ROS permite a detecção de compostos com potencial eficácia terapêutica. Os ensaios celulares para detectar inibidores da libertação de TNF-α de células estimuladas de macrófagos ou monociticas são uma componente importante de um modelo in vitro para inflamação uma vez que existe uma sobre-expressão desta citocina e verificou-se que contribui para a patologia em muitas doenças inflamatórias. Uma vez que se mostrou que um aumento de cAMP em células afectadas modula ou diminui a resposta inflamatória, a monitorização dos niveis celulares de AMP cíclico (cAMP) e a actividade das vias que controlam os níveis de cAMP permite a detecção de potenciais compostos anti-inflamatórios. Os ensaios podem incluir a monitorização do nível do próprio cAMP, da actividade da fosfodiesterase, ou alterações no elemento da actividade da (CRE-luciferase) de resposta ao cAMP.
Artrite Reumatóide A artrite reumatóide (RA), a forma mais comum de artrite inflamatória, é um distúrbio auto-imune de etiologia desconhecida que afecta 1% da população adulta e caracteriza-se por uma sinovite (inflamação do revestimento sinovial das articulações) erosiva, crónica, simétrica e com um frequente envolvimento multissistémico. De forma interessante, é 3-6 vezes mais prevalente nas mulheres que nos homens. A maioria dos pacientes apresentam uma evolução flutuante da doença que, se não for tratada, resulta na destruição progressiva da articulação, deformação, incapacidade e morte prematura. Os sintomas indicativos da RA incluem dor e inchaço das articulações (geralmente simétrico), rigidez matinal das articulações e dos músculos, fraqueza/fadiga geral e febre e perda de peso. A RA resulta em mais de 9 milhões de consultas 4 médicas e mais de 250000 hospitalizações por ano nos EUA em cada ano. Afecta frequentemente pacientes nos seus anos mais produtivos e, como tal, a incapacidade resulta em perdas económicas significativas.
Descobertas recentes estabeleceram que os antecedentes genéticos, especialmente a estrutura dos genes de histocompatibilidade major (MHC) da classe II, desempenha um papel crítico na susceptibilidade de um indivíduo e na gravidade da doença. O conhecimento actual das redes de citocinas, quimioicnas, factores de crescimento e moléculas de adesão levou a se verificar que as vias dependentes das células T e independentes das células T contribuem para a iniciação e perpetuação da artrite reumatóide. Além disso, aprendeu-se muito sobre os acontecimentos celulares e bioquímicos específicos responsáveis pela destruição óssea e das cartilagens que caracteriza este distúrbio. Ao nível dos tecidos, a RA caracteriza-se pela hiperplasia sinovial, hipertrofia, angiogénese e ligação e invasão de fibroblastos sinoviais para a cartilagem e os ossos adjacentes. Na RA activa existem niveis acrescidos de citocinas pro-inflamatórias TNF-α, IL-1 e IL-6 em relação às citocinas anti-inflamatórias nas articulações afectadas.
Tratamentos Actuais para Artrite Reumatóide e Outras Doenças Inflamatórias
Actualmente não existe cura ou prevenção (profilaxia) disponível para a artrite reumatóide, apenas regimes que abordam sintomas tais como dor e rigidez. As cinco principais modalidades de tratamento para esta doença incluem medicação (farmacológica) , física (exercício), protecção das articulações e alterações de estilos de vida e cirurgia. 5 A terapia para a artrite reumatóide pode ser dividida em três grupos: fármacos não esteróides anti-inflamatórios (NSAIDs), fármacos anti-reumáticos modificadores da doença (DMARDs) também conhecidos como agentes de segunda linha e corticoesteróides.
Os NSAIDs reduzem a dor a baixas doses e aliviam alguns dos sintomas inflamatórios (inchaço e rigidez) a doses mais elevadas através da inibição da síntese da prostaglandina. Exemplos de NSAIDs que não carecem de prescrição incluem o ácido acetilsalicílico (ASA®, Aspirina®, Anacin®, etc.) e ibuprofeno (Motrin®, Advil®, etc) . Exemplos de NSAIDs que carecem de prescrição incluem Naprosyn®, Relafen®, Indocid®, Voltaren®, Feldene® e Clinoril®. Apesar destas medicações atacarem de forma eficaz a componente inflamatória aguda da artrite reumatóide, apenas tratam os sintomas e não alteram a progressão da doença subjacente. Os efeitos secundários prejudiciais dos NSAIDs podem ser sérios com a administração prolongada e são sobretudo gastrointestinais (azia, sangramento e úlceras).
Os DMARDs são frequentemente receitados se a inflamação persiste durante mais de 6 semanas ou quando a artrite afecta várias articulações em simultâneo. São geralmente administrados além de um NSAID ou esteróide. Vários DMARDs funcionam através da supressão das células imunitárias envolvidas na resposta inflamatória permitindo assim travar a progressão da doença. No entanto, são incapazes de reverter danos permanentes nas articulações. Os fármacos mais comuns desta classe são sais de ouro, metotrexato, azatioprina, sulfasalazina, hidroxicloroquina, penicilamina e cloroquina. Os DMARDs mutas vezes levam várias semanas para que se observem os efeitos benéficos e em muitos casos o modo exacto 6 de eficácia na artrite reumatóide é desconhecido. Os efeitos secundários são numerosos incluindo inflamações na boca, erupções, diarreia e náuseas. Efeitos secundários mais sérios que carecem de uma monitorização cuidadosa através de testes regulares ao sangue e à urina incluem danos no fígado e nos rins, uma diminuição excessiva na contagem de glóbulos brancos (supressão imunitária) e na contagem de plaquetas (coagulação do sangue).
Os corticoesteróides são frequentemente prescritos em pacientes com RA com inflamação extrema acompanhada por dor aguda, inchaço e rigidez das articulações. São também usados para tratar a artrite reumatóide sistémica que pode afectar o revestimento dos pulmões e dos vasos sanguíneos. A via de administração é geralmente oral (i.e. prednisona) mas o fármaco pode também ser injectado directamente na articulação, veia, músculo ou local alternativo afectado pela inflamação. Os efeitos secundários da utilização prolongada de esteróides na artrite reumatóide são sérios e incluem cataratas, elevada pressão sanguínea, perda de massa muscular, nódoas negras, adelgaçamento da pele e dos ossos, aumento de peso, diabetes e susceptibilidade a infecções. Mesmo se apenas 5% dos pacientes diagnosticados com artrite reumatóide desenvolverão um grau mais grave da doença (envolvendo a debilitação e danos irreversíveis das articulações) estes certamente não têm um conjunto de terapias ideal disponível para gerir de forma satisfatória e/ou curar a doença. Os NSAIDs actualmente disponíveis (mesmo inibidores COX-2 selectivos) podem melhorar com sucesso os sintomas agudos da artrite reumatóide tais como o inchaço, a dor e a rigidez das articulações. No entanto, não afectam ou a progressão da destruição das articulações ou não conseguem qualquer inversão na erosão articular ou óssea. Fármacos de 7 segunda linha, tais como DMARD's ou corticoesteróides podem temporariamente atrasar a progressão da doença e reduzir os sintomas, mas geralmente sofrem de um perfil de efeitos secundários inaceitável ou uma resposta de pacientes variável e não podem inverter os danos existentes nas articulações. Existe uma necessidade significativa para agentes terapêuticos que param ou revertem de forma irreversível a progressão da doença na artrite reumatóide. WO00/14083A apresenta γ-fenil-A-lactonas e seus análogos, com utilizações farmacêuticas a elas relacionadas.
RESUMO DA INVENÇÃO
Num aspecto, a presente invenção proporciona compostos com a fórmula seguinte:
em que: o azoto na posição 1 é substituído com hidrogénio; as posições 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11 e 18 são substituídas com hidrogénio; as posições 17 e 19 são substituídas com OR8 em que R8 é um grupo hidrocarbilo Ci-io; cada um dos carbonos nas posições 5, 13, 15 e 16 é -W ou independentemente substituído em cada ocorrência com H, -R7(W)n, em que: 8 W é seleccionado de -NH2, -CN, -X, -OH, -N02, -SH, -NHR8, -NR8R8, -OR8, e -SR8; cada R7 é independentemente um grupo hidrocarbilo, halocarbilo ou hidro-halocarbilo Ci-C30 em que n dos átomos de hidrogénio ou halogéneo de R7 são substituídos por um número igual de grupos W independentemente seleccionados em cada localização; o cada R e mdependentemente um grupo hidrocarbilo, halocarbilo ou hidro-halocarbilo C1-C30; n é seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4 e 5; e X é seleccionado de -Br, -Cl, -F, e -I; em que a posição 12 é substituída por hidrocarbilo Ci_6, ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, na forma de um estereoisómero isolado ou uma mistura destes.
Noutro aspecto, esta invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo um composto da invenção tal como descrito acima e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Noutro aspecto, esta invenção proporciona um composto da invenção tal como descrito acima, para utilização no tratamento ou na prevenção de uma condição ou doença inflamatória num paciente.
Noutro aspecto, esta invenção proporciona um composto da invenção tal como descrito acima que modula os níveis da adenosina 5'-monofosfato cíclica intracelulares num paciente. Noutro aspecto, esta invenção proporciona um composto da invenção tal como descrito acima que trata ou previne uma doença ou condição num paciente, em que a doença ou condição está associada a condições patológicas que são moduladas 9 através da inibição de enzimas associados com mensageiros celulares secundários.
Noutro aspecto, esta invenção proporciona um composto da invenção tal como descrito acima que trata ou previne a proliferação celular descontrolada num paciente.
Noutro aspecto, esta invenção proporciona um composto da invenção tal como descrito acima que trata ou previne a rejeição de transplante num paciente.
Noutro aspecto, esta invenção proporciona um composto da invenção tal como descrito acima que trata ou previne condições associadas ao sistema nervoso central num paciente. A presente invenção proporciona ainda os outros compostos e utilizações tal como apresentado no conjunto de reivindicações anexo.
Este e outros aspectos e formas de realização da presente invenção serão evidentes por referência à descrição detalhada seguinte. Para tal, são aqui apresentadas várias referências que descreve em maior detalhe certos procedimentos, compostos e/ou composições.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona compostos, composições e compostos para utilização no tratamento e/ou na prevenção de várias condições de doença. Por exemplo, num aspecto, a presente invenção proporciona compostos para utilização no tratamento e/ou prevenção de uma doença inflamatória. A utilização inclui a administração a um indivíduo que deles necessite de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um 10 composto da invenção ou de um seu sal f armaceuticamente aceitável, ou de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição contendo um composto da invenção ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável.
Deste modo, tal como apresentado acima no Resumo da Invenção, esta invenção dirige-se a compostos com a seguinte fórmula:
em que: o azoto na posição 1 é substituído com hidrogénio; as posições 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11 e 18 são substituídas com hidrogénio; as posições 17 e 19 são substituídas com OR8 em que R8 é um grupo hidrocarbilo Ci-io; cada um dos carbonos nas posições 5, 13, 15 e 16 é independentemente substituído em cada ocorrência com H, -W ou -R7(W)n, em que: W é seleccionado de -NH2, -CN, -X, -OH, -N02, -SH, -NHR8, -NR8R8, -OR8 e -SR8; cada R7 é independentemente um grupo hidrocarbilo, halocarbiolo ou hidro-halocarbilo C1-C30 em que n dos átomos de hidrogénio ou halogéneo de R7 são substituídos por um número igual de grupos W independentemente seleccionados em cada localização; 11 cada R8 é independentemente um grupo hidrocarbilo, halocarbilo ou hidro-halocarbilo C1-C30; n é seleccionado deO, 1, 2, 3, 4e5; e X é seleccionado de -Br, -Cl, -F, e -I; em que a posição 12 é substituída por hidrocarbilo C1-6, ou um seu sal ou solvato f armaceuticamente aceitável, na forma de um estereoisómero isolado ou uma mistura destes.
Noutro aspecto, o composto da invenção tem a configuração S no carbono 3. Noutro aspecto, o composto da invenção tem a configuração R no carbono 3. Noutro aspecto, o composto da invenção tem a configuração S no carbono 5. Noutro aspecto, o composto da invenção tem a configuração R no carbono 5.
Noutros aspectos, no composto da invenção, assim como em composições compreendendo o composto da invenção e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável: o carbono na posição 13 é independentemente substituído com hidrogénio e -W; o carbono na posição 13 é substituído com -NH2, -NHR8 ou -NR8R8; o carbono na posição 13 é substituído com -CN, -X, -OH, N02, -SH ou -0R8; o carbono na posição 13 é substituído com -R7(W)n.
Noutro aspecto, exactamente dois dos carbonos nas posições 11, 12 e 13 são substituídos com hidrogénio.
Noutro aspecto, não mais que um dos carbonos nas posições 11, 12 e 13 é substituído com hidrogénio.
Noutro aspecto da presente invenção que proporciona um composto da invenção, podem ser usados os seguintes critérios 12 isoladamente ou em qualquer combinação para descrever ainda mais o ou os compostos da invenção, em que estes critérios são apenas uma exemplificação, podendo-se encontrar aqui outros critérios noutros locais: o carbono na posição 13 é substituído com -R7(W)n; exactamente dois dos carbonos nas posições 11, 12 e 13 são substituídos com hidrogénio; W é -OR8; R7 é um grupo hidrocarbono Ci-io em que n dos átomos de hidrogénio ou halogénio de R7 são substituídos por um número igual de grupos W independentemente seleccionados a cada localização; R7 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo substituído por alcenilo, alcenilo substituído por arilo, arilo substituído por alcinilo, alcinilo substituído por arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, bicicloalquilo, bicicloalcenilo, alquilcicloalquilo, alcenilcicloalquilo, alcinilcicloalquilo, cicloalquilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalquilo, cicloalcenilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalcenilo, cicloalquilo e policicloalquilo fundido com arilo; R8 é um grupo hidrocarbilo Ci_i0; R8 é um grupo ciclo-hidrocarbolo Ci_i0; R8 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo substituído por alcenilo, alcenilo substituído por arilo, arilo substituído por alcinilo, alcinilo substituído por arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, bicicloalquilo, bicicloalcenilo, alquilcicloalquilo, alcenilcicloalquilo, alcinilcicloalquilo, cicloalquilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalquilo, cicloalcenilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalcenilo, cicloalquilo e policicloalquilo fundido com arilo; n é 0; o carbono 3 tem a configuração S; o carbono 3 tem a configuração R; o carbono 5 tem a configuração S; o carbono 5 tem a configuração R; as posições 1, 3, 4, 5, 6, 7, 13 9, 10, 11, 13, 15, 16, e 18 são substituídas com hidrogénio, e a posição 12 é substituída com hidrocarbilo Ci, e a posição 17 é substituída com -O-ciclopentilo, e a posição 19 é substituída com -O-metilo, em que opcionalmente as posições 3 e 5 têm ambas a estereoquímica S. Qualquer um destes compostos podem estar na forma de um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável de acordo com a presente invenção.
Nos compostos da invenção o anel contendo N é monocíclico e saturado, como apresentado no Resumo da Invenção.
Em formas de realização preferidas dos compostos da invenção, W é seleccionado de -NH2, -NHR8, e -NR8R8; W é seleccionado de -NH2, -CN, -X, -OH, -N02, -SH, -NHR8, -NR8R8, -OR8 e -SR8; ou W é -OR8.
Noutras formas de realização preferidas dos compostos da invenção, R7 é um grupo hidrocarbilo C1-30 em que n dos átomos de hidrogénio ou halogénio de R7 são substituídos por um número igual de grupos W independentemente seleccionados a cada localização; R7 é um grupo hidrocarbilo C1-10 em que n dos átomos de hidrogénio ou halogénio de R7 são substituídos por um número igual de grupos W independentemente seleccionados a cada localização; ou R7 é seleccionado de alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo substituído por alcenilo, alcenilo substituído por arilo, arilo substituído por alcinilo, alcinilo substituído por arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, bicicloalquilo, bicicloalcenilo, alquilcicloalquilo, alcenilcicloalquilo, alcinilcicloalquilo, cicloalquilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalquilo, cicloalcenilo substituído 14 por arilo, arilo substituído por cicloalcenilo, cicloalquilo e policicloalquilo fundido com arilo;
Noutras formas de realização preferidas do composto da invenção, R8 é um grupo hidrocarbilo C1-30; R8 é um grupo hidrocarbilo Ci_i0; R8 é seleccionado de alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo substituído por alcenilo, alcenilo substituído por arilo, arilo substituído por alcinilo, alcinilo substituído por arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, bicicloalquilo, bicicloalcenilo, alquilcicloalquilo, alcenilcicloalquilo, alcinilcicloalquilo, cicloalquilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalquilo, cicloalcenilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalcenilo, cicloalquilo e policicloalquilo fundido com arilo.
Noutras formas de realização preferidas do composto da invenção, n é 0; n é 1; n é 2; n é 3; n é 4; n é 5; n é superior a 0; n é 1 ou 2;e n é 1 ou 2 ou 3.
Um composto preferido da invenção é um composto da fórmula seguinte:
como um único estereoisómero ou uma mistura destes, ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável. 15
Outro composto preferido da invenção é um composto da seguinte fórmula:
na da ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, forma de um único estereoisómero ou uma mistura destes. Outro composto preferido da invenção é um composto seguinte fórmula:
na ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, forma de um único estereoisómero ou uma mistura destes.
Também se menciona aqui um composto da seguinte fórmula: 16 ο
ch3 ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, na forma de um único estereoisómero ou uma mistura destes.
Outro composto preferido da invenção é um composto da seguinte fórmula:
O
ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, na forma de um único estereoisómero ou uma mistura destes.
Outro composto preferido da invenção é um composto da seguinte fórmula: 17
ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, na forma de um único estereoisómero ou uma mistura destes.
Nos compostos acima, um sal farmaceuticamente aceitável inclui sais de adição de ácido e sais de adição de base.
Sais de adição de ácido referem-se àqueles sais formados a partir de compostos da invenção e ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e semelhantes, e/ou ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maléico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfónico, ácido etanossulfónico, ácido p-toluenossulfónico, ácido salicílico e semelhantes.
Sais de adição de base referem-se àqueles sais formados a partir de compostos da invenção e bases inorgânicas tais como sais de sódio, potássio, lítio, amónio, cálcio, magnésio, ferro, zinco, cobre, manganês, alumínio e semelhantes. Sais adequados incluem os sais de amónio, potássio, sódio, cálcio e magnésio derivados de bases não tóxicas orgânicas farmaceuticamente aceitáveis incluindo sais de aminas 18 primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas incluindo aminas substituídas que ocorrem naturalmente, aminas cíclicas e resinas de permuta iónica básicas, tais como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, trimetamina, diciclo-hexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaínas, hidrabramina, colina, betaína, etilenodiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, e semelhantes. e
Nos compostos e composições acima, um grupo hidrocarbilo é formado exclusivamente por carbono e hidrogénio e inclui, por exemplo, qualquer de alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo substituído por alcenilo, alcenilo substituído por arilo, arilo substituído por alcinilo, alcinilo substituído por arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, bicicloalquilo, bicicloalcenilo, alquilcicloalquilo, alcenilcicloalquilo, alcinilcicloalquilo, cicloalquilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalquilo, cicloalcenilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalcenilo, cicloalquilo e policicloalquilo fundido com arilo. Um grupo ciclo-hidrocarbilo é também formado em exclusivo por carbono e hidrogénio, e inclui pelo menos um anel, em que exemplos de grupos ciclo-hidrocarbilo incluem quaisquer de arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo substituído por alcenilo, alcenilo substituído por arilo, arilo substituído por alcinilo, alcinilo substituído por arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, bicicloalquilo, bicicloalcenilo, alquilcicloalquilo, alcenilcicloalquilo, alcinilcicloalquilo, cicloalquilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalquilo, cicloalcenilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalcenilo, cicloalquilo 19 policicloalquilo fundido com arilo. Num aspecto da invenção, o grupo ciclo-hidrocarbilo é seleccionado de ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo e ciclo-hexilo. Noutro aspecto, o grupo ciclo-hidrocarbilo é ciclopentilo.
Um grupo halocarbilo é formado exclusivamente por carbono e halogénio, e inclui os grupos hidrocarbilo identificados acima em que cada hidrogénio é substituído por um halogénio seleccionado de flúor, cloro, bromo e iodo, preferentemente flúor e cloro. Um grupo hidro-halocarbilo, que pode também ser referido como um grupo halo-hidrocarbilo, é formado exclusivamente por carbono, hidrogénio e halogénio, e inclui os grupos hidrocarbilo específicos identificados acima em que alguns, mas não todos, os átomos de hidrogénio são substituídos com átomos de halogénio seleccionados de flúor, cloro, bromo e iodo, preferentemente flúor e/ou cloro. Definições representativas destes grupos hidrocarbilo (que podem ser substituídos com átomos de halogénio para proporcionar os seus derivados halocarbilo e hidro-halocarbilo) são proporcionados abaixo. "Alquilo" refere-se a uma cadeia acíclica de átomos de carbono que pode ser ramificada ou não ramificada (linear). Metilo, etilo, propilo (incluindo n-propilo e iso-propilo), butilo (incluindo n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, e t-butilo), pentilo (incluindo diversos isómeros) e hexilo (incluindo diversos isómeros) são grupos alquilo com 1 a 6 átomos de carbono (comummente referidos como grupos alquilo inferiores), e são exemplos de grupos alquilo da invenção. "Alcenilo" refere-se a um grupo alifático insaturado com pelo menos uma ligação dupla. 20 "Alcinilo" refere-se a um hidrocarboneto insaturado que pode ter uma cadeia ou linear ou ramificada e pode ter uma ou mais ligações triplas. Grupos preferidos não têm mais que cerca de 12 átomos de carbono e podem ser etilo, propinilo, 4-metilpentilo e assim sucessivamente, e seus isómeros estruturais. "Aralquilo" refere-se a um grupo alquilo substituído por um radical arilo. Por exemplo, benzilo. "Aralquinilo" refere-se a um grupo alcinilo substituído por um anel arilo. Por exemplo, ArC^C-, ArCH2CH2CH2C=c- e assim sucessivamente. "Cicloalquilo" refere-se a um arranjo cíclico de átomos de carbono, em que ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo são grupos cicloalquilo da invenção com 3-6 átomos de carbono. Grupos adicionais no âmbito de "cicloalquilo" tais como aqui definidos são grupos policicloalquilo, definidos abaixo. "Cicloalcenilo" refere-se a um grupo alcenilo cíclico. Grupos cicloalcenilo adequados incluem, por exemplo, ciclopentenilo e ciclo-hexenilo.
Um grupo policicloalquilo é um arranjo de átomos de carbono em que pelo menos um átomo de carbono é parte de pelo menos dois anéis identificáveis separadamente. 0 grupo policicloalquilo pode conter uma ponte entre dois átomos de carbono, em que biciclo[1.1.0]butilo, biciclo[3.2.1]octilo, biciclo[5,2.0]nonilo, triciclo [2.2.1. O1]heptilo, norbornilo e pinanilo são exemplos representativos. O grupo policicloalquilo pode conter um ou mais sistemas de anéis fundidos, em que decalinilo (radical da decalina) e per- 21 hidroantracenilo são exemplos representativos. 0 grupo policicloalquilo pode conter uma ligação espiro, na qual um único átomo é o único membro comum dos dois anéis. Espiro[3.4]octilo, espiro[3.3]heptilo e espiro[4.5]decilo são exemplos representativos. "Halogéneo" refere-se a flúor, cloro, bromo e iodo.
Grupo "heterociclilo" refere-se a um sistema de anéis de 3 a 15 membros estável fundido a um grupo fenilo ao qual está ligado R7, que consiste em átomos de carbono e de um a cinco heteroátomos seleccionados do grupo que consiste em azoto, oxigénio e enxofre. Para os fins desta invenção, o grupo heterociclilo pode ser um sistema de anéis monociclico, biciclico ou triciclico, que pode incluir anéis fundidos ou em ponte; e os átomos de azoto, carbono ou enxofre no grupo heterociclilo podem ser opcionalmente oxidados; o átomo de azoto pode ser opcionalmente quaternizado; e o grupo heterociclilo pode ser aromático ou parcialmente ou totalmente saturado. 0 grupo heterociclilo pode estar ligado ao grupo fenilo ao qual R7 está ligado a qualquer heteroátomo ou átomo de carbono que resulta no critério de um composto estável. Exemplos de tais grupos heterociclilo incluem, mas não estão limitados a, azepinilo, acridinilo, benzimidazolilo, benztiazolilo, benzoxazolilo, benzopiranilo, benzopiranonilo, benzofuranilo, benzofuranonilo, benzotienilo, carbazolilo, cinnolinilo, deca-hidroisoquinolilo, dioxolanilo, furanilo, furanonilo, isotiazolilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, isotiazolidinilo, indolilo, isoindolilo, indolinilo, isoindolinilo, indolizinilo, isoxazolilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, naftiridinilo, oxadiazolilo, octa-hidroindolilo, octa-hidroisoindolilo, 2-oxopiperazinilo, 2-oxopiperidinilo, 22 2-oxopirrolidinilo, 2-oxoazepinilo, oxazolilo, oxazolidinilo, oxiranilo, piperidinilo, piperazinilo, 4-piperidonilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, pteridinilo, purinilo, pirrolilo, pirrolidinilo, pirazolilo, pirazolidinilo, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, quinolinilo, quinuclidinilo, isoquinolinilo, tiazolilo, tiazolidinilo, tiadiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, tetra-hidrofurilo, triazinilo, tetra-hidropiranilo, tienilo, tiamorfolinilo, sulfóxido de tiamorfolinilo, e sulfona de tiamorfolinilo.
Tal como aqui utilizadas, as seguintes abreviaturas têm os significados seguintes:
Abreviatura Nome completo 5-ASA Ácido 5-aminosalicílico Ab Anticorpo ABTS 2,2'-azino-di-[sulfonato de 3- etilbenztiazolina] ACD Ácido citrato dextrose AcOH Ácido acético ACVP American College of Veterinary Practice ANOVA Análise de Variância Ar Árgon BCR-ABL Oncogene na translocação cromossómica 9:22 em CML BINAP 2,2'-Bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftilo Bn Benzilo BnBr Brometo de benzilo BOC terc-Butoxicarbonilo CAMP Adenosina 3' -5'-monofosfato cíclica cat Catalítico 23
Abreviatura Nome completo CD Designação de cluster CFA Adjuvante completo de Freund cGMP Guanosina 3'-5'-monofosfato cíclica CIA Artrite Induzida pelo Colagénio CLL Leucemia linfocítica crónica CML Leucemia mielogénica crónica CNS Sistema Nervoso Central Con A Concanavalina A COX Ciclo-oxigenase cPent Ciclopentilo cPentBr Brometo de ciclopentilo CRE Elemento de resposta cAMP CsA Ciclosporina A DMAP 4-Dimetilaminopiridina DMARD Fármaco anti-reumático modificador da doença DMF N, IV-Dimetilf ormamida DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucléico dppf 1,1'-Bis(difenilfosfino)ferroceno dppp l,3-Bis(difenilfosfino)propano ECso Concentração à qual se nota 50% do efeito máximo observável EDTA Ácido etilenodiaminotetraacético ELISA Teste de imunoadsorção associada a enzima EtOAc Acetato de etilo EtOH Álcool etílico FBS Soro fetal bovino FCS Soro fetal vitelino f MLP Formil-metionil leucina fenilalanina g. i . Gastrointestinal Η & E Hematoxilina e eosina 2 4
Abreviatura Nome completo HARBS Local de ligação de rolipram de elevada afinidade HBSS Solução de sais equilibrada de Hanks HMPA Hexametilfosforamida HPLC Cromatografia líquida de elevada pressão i ·Ρ· Intraperitoneal IBD Doença inflamatória do intestino IBMX 3-1sobutil-l-metilxantina IC Concentração inibitória IC50 Concentração à qual se observa 50% da inibição IFA Adjuvante incompleto de Freund IFN-γ Interferão gama IL Interleucina LAH Hidreto de lítio alumínio LDA Diisopropilamida de lítio LN Nodo linfático LPS Lipopolissacárido LTB4 Leucotrieno B4 luc luciferase Me Metilo MeOH Álcool metílico MHC Classe de histocompatibilidade major MLR Reacção linfocítica mista MPO Metiloperoxidase Ms Metanossulfonilo MsCl Cloreto de metanossulfonilo NBS iV-Bromosuccinimida n-BuLi n-Butil-lítio n-BuSH n-Butanotiol NF-kB Factor capa B nuclear NSAID Fármaco anti-inflamatório não esteróide 25
Abreviatura Nome completo p.t. Pós-transplante PBS Tampão fosfato salino Pcc Citocromo C de pomba PDE Fosfodiesterase PEG Polietileno glicol PG Prostaglandina PMS Metossulfato de fenazina PMSF Fluoreto de fenil metil sulfonilo pTsOH Mono-hidrato de ácido p-toluenossulfónico Py Piridina RA Artrite reumatóide RF Factor reumatóide Rf Factor de retardação ROS Espécie reactiva de oxigénio RPMI Rosewell Park Memorial Institute RTX Resiniferitoxina SAR Relação estrutura actividade TBAF Fluoreto de tetrabutilamónio TBDMS terc-Butildimetilsililo TBDMSC1 Cloreto de terc-butildimetilsililo TCR Receptor de célula T TEA Trietilamina Tf Trifluorornetanossulfonilo TFA Ácido trifluoroacético Th T auxiliar THF Tetra-hidrofurano TNBS Ácido sulfónico trinitrobenzeno TNF-a Factor de necrose tumoral alfa Trolox® Ácido 6-hidroxi-2.5.7.8-tetrametilcroman-2- carboxilico TsOH Mono-hidrato de ácido p-toluenossulfónico 26
Abreviatura Nome completo XTT Sal interno de 2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfo-fenil]-2H-tetrazólio 5-carboxanilida μΜ Micro molar
Quando qualquer variável ocorre mais do que uma vez em qualquer constituinte ou em compostos da invenção, a sua definição em cada ocorrência é independente da sua definição em qualquer outra ocorrência. As combinações de substituintes e/ou variáveis são apenas permissíveis se tais combinações resultam em compostos estáveis. Os compostos úteis nos métodos e composições da presente invenção, assim como os compostos da presente invenção, podem ter centros assimétricos e ocorrer na forma de racematos, misturas racémicas e como diaestereómeros individuais, ou enantiómeros sendo todas as formas isoméricas incluídas na presente invenção. Um racemato ou mistura racémica não implica uma mistura 50:50 dos estereoisómeros.
Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas contendo um composto da invenção tal como apresentado acima, em combinação com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Estas composições podem ser usadas para o tratamento de inflamação ou de outras condições tais como aqui apresentadas. Estas composições podem também ser formadas num medicamento que pode ser usado no tratamento de, por exemplo, inflamação.
Estas composições são úteis como, por exemplo, padrões de testes, métodos convenientes de produzir cargas em bruto, ou composições farmacêuticas. Uma quantidade testável de um composto da invenção é uma quantidade que é facilmente mensurável por procedimentos e técnicas de teste 27 convencionais bem conhecidas e apreciadas pelos peritos na técnica. Quantidades testáveis de um composto da invenção irão geralmente variar de cerca de 0,001% em peso a cerca de 80% em peso da totalidade do peso da composição. Veículos inertes incluem qualquer material que não se degrada ou de outro modo reage covalentemente com um composto da invenção. Exemplos de veículos inertes são a água; tampões aquosos, tais como aqueles que são geralmente úteis em análise de Cromatografia Líquida de Elevada Eficiência (HPLC); solventes orgânicos, tais como acetonitrilo, acetato de etilo, hexano e semelhantes; e veículos farmaceuticamente aceitáveis. "Veículos farmaceuticamente aceitáveis" para utilização terapêutica são bem conhecidos na técnica farmacêutica, e são descritos, por exemplo, em Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro Edit. 1985). Por exemplo, pode-se usar solução salina e tampão fosfato salino a pH fisiológico estéreis. Podem ser proporcionados na composição farmacêutica conservantes, estabilizantes, corantes e mesmo agentes aromatizantes. Por exemplo, podem ser adicionados como conservantes, benzoato de sódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzóico. Id. a 1449. Além disso, podem ser usados antioxidantes e agentes de suspensão. Id.
Assim, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica ou veterinária (aqui de seguida, simplesmente referida como uma composição farmacêutica) contendo um composto da invenção tal como descrito acima, adicionado a e misturado com um veículo farmaceuticamente aceitável. A invenção proporciona ainda uma composição, preferentemente uma composição farmacêutica, contendo uma quantidade eficaz 28 de um composto de (1-4) tal como descrito acima, em associação com um veiculo farmaceuticamente aceitável.
As composições farmacêuticas da presente invenção podem estar em qualquer forma que permita a administração da composição a um paciente. Por exemplo, a composição pode ser na forma de um sólido, liquido ou gás (aerossol) . As vias típicas de administração incluem, sem limitação, oral, tópica, parentérica, sublingual, rectal, vaginal e intranasal. 0 termo parentérico tal como aqui usado inclui injecções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, injecção intraesternal ou técnicas de infusão. Composições farmacêuticas da invenção são formuladas de modo a permitir que os ingredientes nelas contidos tenham biodisponibilidade aquando da administração da composição a um paciente. As composições que serão administradas a um paciente tomam a forma de uma ou mais unidades de dosagem, em que por exemplo, um comprimido pode ser uma unidade de dosagem única, e um recipiente de um composto da invenção em forma e aerossol pode conter diversas unidades de dosagem.
Os materiais usados na preparação das composições farmacêuticas deverão ser farmaceuticamente puros e não tóxicos nas quantidades usadas. Será evidente para aqueles competentes na técnica que a dose óptima do ou dos ingredientes activos na composição farmacêutica dependerá de uma variedade de factores. Factores relevantes incluem, sem limitação, o tipo de indivíduo (por exemplo, humano), a forma particular do ingrediente activo, o modo de administração e a composição utilizada.
Em geral, a composição farmacêutica inclui um (em que "um" refere-se aqui, e ao longo desta especificação, um ou mais) 29 composto activo da invenção tal como aqui descrito, em adição e mistura com um ou mais veículos. 0(s) veículo(s) podem ser em partículas, de modo que as composições são, por exemplo, em forma de comprimido ou pó. 0 ou os veículos podem ser líquidos, com as composições sendo, por exemplo, um xarope oral ou um líquido injectável. Além disso, o ou os veículos podem ser gasosos, de modo a proporcionar uma composição em aerossol útil, por exemplo, em administração por inalação.
Quando se pretende uma administração oral, a composição é preferentemente em forma sólida ou líquida, em que se incluem formas semi-sólidas, semi-líquidas, em suspensão e em gel no âmbito das formas consideradas aqui como sólida ou líquida.
Como composição sólida para administração oral, a composição pode ser formulada num pó, grânulo, comprimido, pílula, cápsula, pastilha elástica, hóstia ou formas semelhantes. Uma tal composição sólida irá tipicamente conter um ou mais diluentes inertes ou veículos comestíveis. Além disso, podem estar presentes, um ou mais dos adjuvantes seguintes: aglutinantes tais como carboximetilcelulose, etil celulose, celulose microcristalina, ou gelatina; excipientes tais como amido, lactose ou dextrinas, agentes desintegrantes tais como ácido algínico, alginato de sódio, Primogel, amido de milho e semelhantes; lubrificantes tais como estearato de magnésio ou Sterotex; agentes deslizantes tais como dióxido de silicone coloidal; agentes adoçantes tais como sacarose ou sacarina, um agente aromatizante como a hortelã-pimenta, salicilato de metilo ou aroma a laranja, e um agente corante.
Quando a composição está na forma de uma cápsula, por exemplo, uma cápsula de gelatina, pode conter, além dos 30 materiais do tipo acima, um veiculo liquido tal como polietileno glicol, ciclodextrina ou um óleo gordo. A composição pode estar na forma de um liquido, por exemplo, um elixir, xarope, solução, emulsão ou suspensão. 0 liquido pode ser para administração oral ou para administração por injecção, como dois exemplos. Quando se pretendem para administração oral, as composições preferidas contêm, além dos presentes compostos, um ou mais de um aqente adoçante, conservantes, corantes e potenciadores de aroma. Numa composição que se pretende ser administrada por injecção, pode-se incluir um ou mais de um surfactante, conservante, agente molhante, agente dispersante, agente de suspensão, tampão, estabilizante e agente isotónico.
As composições farmacêuticas liquidas da invenção, quer sejam soluções, suspensões ou outra forma semelhante, podem incluir, um ou mais dos seguintes adjuvantes: diluentes estéreis tais como água para injecção, solução salina, preferentemente solução salina fisiológica, solução de Ringer, cloreto de sódio isotónico, óleos fixos tais como mono ou diglicéridos sintéticos que podem servir como solvente ou meio de suspensão, polietileno glicóis, glicerina, ciclodextrina, propileno glicol ou outros solventes; agentes antibacterianos, tais como álcool benzilico ou metil parabeno; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetracético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade tais como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parentérica pode ser encerrada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas fabricados em vidro ou plástico. Prefere-se como adjuvante solução salina 31 fisiológica. Uma composição farmacêutica aceitável é preferentemente estéril.
Uma composição liquida que se destina para administração parentérica ou oral contém uma quantidade de um composto da invenção tal que uma dosagem adequada seria obtida. Tipicamente, esta quantidade é pelo menos 0,01% de um composto da invenção na composição. Quando se pretende a administração oral, esta quantidade pode ser variada para estar entre 0,1% e cerca de 70% do peso da composição. As composições orais preferidas contêm entre cerca de 4% e cerca de 50% do composto activo da invenção. As composições e preparações preferidas de acordo com a presente invenção são preparadas de tal modo que uma unidade de dosagem parentérica contém entre 0,01% e 1% em peso do composto activo. A composição farmacêutica pode ser destinada para administração tópica, em cujo caso o veiculo pode adequadamente compreender uma base de solução, emulsão, unguento ou gel. A base, por exemplo, pode compreender um ou mais dos seguintes: petrolatum, lanolina, polietileno glicóis, cera de abelha, óleo mineral, diluentes tais como água e álcool, e emulsionantes e estabilizantes. Podem estar presentes agentes espessantes numa composição farmacêutica para administração tópica. Se for pretendida para administração transdérmica, a composição pode incluir um emplastro transdérmico ou um dispositivo de iontoforese. As formulações tópicas podem conter uma concentração do composto da invenção de cerca de 0,1% a cerca de 10% p/v (peso por unidade de volume). A composição pode ser pretendida para administração rectal, na forma, por exemplo, de um supositório que irá derreter no 32 recto e libertar o fármaco. A composição para administração rectal pode conter uma base oleaginosa como excipiente adequado não irritante. Tais bases incluem, sem limitação, lanolina, manteiga de cacau e polietileno glicol. A composição pode incluir vários materiais que modificam a forma física de uma unidade de dosagem sólida ou líquida. Por exemplo, a composição pode incluir materiais que formam uma capa de revestimento à volta dos ingredientes activos. Os materiais que formam a capa de revestimento são tipicamente inertes, e podem ser seleccionados de, por exemplo, açúcar, goma-laca, e outros agentes de revestimento entéricos. Alternativamente, os ingredientes activos podem ser encerrados numa cápsula de gelatina. A composição em forma sólida ou líquida podem incluir um agente que se liga ao ou aos componentes activos e assistem assim na administração dos componentes activos. Agentes adequados que podem actuar nesta capacidade incluem um anticorpo monoclonal ou policlonal, uma proteína ou um lipossoma. A composição farmacêutica da presente invenção pode consistir em unidades de dosagem gasosas, por exemplo, pode estar na forma de um aerossol. 0 termo aerossol é usado para denotar uma variedade de sistemas desde aqueles de natureza coloidal até sistemas que consistem em embalagens pressurizadas. A administração pode ser um gás liquefeito ou comprimido ou por um sistema de bombagem adequado que administra os ingredientes activos. Os aerossóis de compostos da invenção podem ser administrados em sistemas de uma única fase, bifásicos ou trifásicos de modo a administrar o ou os ingredientes activos. A administração do aerossol inclui o 33 recipiente, espaçadores e formam um kit pelo perito desnecessária válvulas, activadores, válvulas, outros semelhantes necessários, Os aerossóis preferidos podem na técnica, sem qualquer sub-recipientes, que em conjunto ser determinados experimentação
Qualquer que seja a forma sólida, liquida ou gasosa, a composição farmacológica da presente invenção pode conter um ou mais agentes farmacológicos conhecidos usados no tratamento da inflamação (incluindo a artrite).
As composições farmacêuticas podem ser preparadas por metodologias bem conhecidas na técnica farmacêutica. A composição que se pretende ser administrada por injecção pode ser preparada através da combinação do composto da invenção com água de modo a formar uma solução. Pode-se adicionar um surfactante para facilitar a formação de uma suspensão ou solução homogénea. Os surfactantes são compostos que interactuam de forma não covalente com o composto da invenção de modo a facilitar a dissolução ou a suspensão homogénea do composto activo no sistema de administração aquoso.
Os compostos da invenção aqui apresentados, ou composições compreendendo um ou mais destes compostos e um veiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, podem ser usados no tratamento ou na prevenção de uma doença ou condição inflamatória num paciente, em que o tratamento compreende a administração ao paciente que dele necessite de um composto ou de uma composição de acordo com a presente invenção, em que a quantidade é eficaz para tratar ou prevenir a condição ou doença inflamatória do paciente. 34 A condição ou doença inflamatória pode ser uma condição ou doença autoimunes; a condição ou doença inflamatória pode envolver inflamação aguda ou crónica dos compartimentos ósseos e/ou de cartilagem das articulações; a condição ou doença inflamatória pode ser uma artrite seleccionada de artrite reumatóide, artrite gotosa ou artrite reumatóide juvenil; a condição ou doença inflamatória pode ser asma; a condição ou doença pode estar associada à desregulação das células T; a condição ou doença pode estar associada com elevados níveis de citocinas inflamatórias (por exemplo, em que a citocina inflamatória é IL-2, ou em que a citocina inflamatória é IFN-γ, ou em que a citocina inflamatória é TNF-α); a condição ou doença inflamatória pode ser esclerose múltipla; a condição ou doença inflamatória pode ser sarcoidose pulmonar; a condição ou doença inflamatória pode ser inflamação ou alergia ocular; a condição ou doença inflamatória pode ser uma doença inflamatória do intestino (por exemplo, doença de Crohn ou colite ulcerosa); e a condição ou doença inflamatória pode ser uma doença inflamatória cutânea (por exemplo, psoríase ou dermatite).
Além disso, a presente invenção proporciona compostos para utilização na modulação dos níveis de adenosina 5'-monofosfato cíclica intracelular num paciente, compreendendo a administração a um paciente que necessite uma quantidade de um composto ou de uma composição de acordo com a presente invenção, em que a quantidade é eficaz para modular os níveis de adenosina 5'-monofosfato cíclica intracelular do paciente. 0 paciente pode ter uma doença ou condição inflamatória.
Além disso, a presente invenção proporciona compostos para utilização no tratamento ou na prevenção de uma doença ou condição num paciente, em que a doença ou condição está 35 associada com condições patológicas que são moduladas através da inibição de enzimas associados com mensageiros celulares secundários, compreendendo o método a administração a um paciente que necessite de um composto ou de uma composição da presente invenção, em que a quantidade é eficaz para tratar ou prevenir a doença ou condição associada com condições patológicas que são moduladas pela inibição de enzimas associadas com mensageiros celulares secundários. A enzima pode ser AMP cíclico fosfodiesterase; ou a enzima pode ser uma f osf odiesterase 4; ou a enzima pode ser uma fosfodiesterase 3; ou as enzimas podem ser tanto a f osf odiesterase 4 como a f osf odiesterase 3; ou a enzima pode ser uma GMP cíclico fosfodiesterase.
Além disso, a presente invenção proporciona um composto para utilização no tratamento ou na prevenção da rejeição de transplante num paciente, compreendendo a administração a um paciente que necessite de um composto ou de uma composição da presente invenção, em que a quantidade é eficaz para tratar ou prevenir a rejeição de transplante no paciente. A rejeição pode ser devida à doença do enxerto contra o hospedeiro.
Além disso, a presente invenção proporciona um composto para utilização no tratamento ou na prevenção da proliferação celular descontrolada num paciente, compreendendo a administração a um paciente que necessite de um composto ou de uma composição da presente invenção, em que a quantidade é eficaz para tratar ou prevenir a proliferação celular descontrolada no paciente. A proliferação celular descontrolada num paciente pode ser causada por um cancro seleccionado de leucemia e tumores sólidos. 36
Além disso, a presente invenção proporciona um composto para utilização no tratamento ou na prevenção de condições associadas com o sistema nervoso central (SNC) num paciente, compreendendo a administração a um paciente que necessite de um composto ou de uma composição da presente invenção, em que a quantidade é eficaz para tratar ou prevenir condições associadas com o sistema nervoso central (SNC) no paciente. A condições associadas com o sistema nervoso central (SNC) pode ser depressão.
Numa utilização da presente invenção, o composto da invenção, ou uma composição compreendendo um ou mais compostos da invenção e um veiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, podem, apesar de não ser necessário, conseguir um ou mais dos seguintes resultados desejados no indivíduo ao qual foi administrado um composto da invenção tal como definido acima, ou uma composição contendo um destes compostos e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável: 1. Inibição da geração de espécies reactivas de oxigénio a partir de neutrófilos primários; 2. Inibição de quimiotaxia de neutrófilos; 3. Inibição da produção de TNF-a; 4. Inibição de edema; 5. Sequestração de radicais de oxigénio; 6. Inibição de AMP cíclico fosfodiesterases 1, 3 e/ou 4 e PDEs relacionadas tal como PDE7; 7. Potenciar a indução de actividade de transcrição mediada por CRE em células humanas monocíticas; 8. Inibição de PDE, preferentemente PDE4, PDE4, ou PDE3 e PDE4; 9. Inibição da produção de citocinas por subconjuntos de células T activados; 37 10. Inibição da libertação de mieloperoxidase de neutrófilos; 11. Baixa razão de IC50PDE4(cat):IC50PDE4(HARBS); 12. Inibição da rejeição de enxerto; 13. Inibição de parâmetros clínicos e histopatológicos de doença na doença inflamatória do intestino; e 14. Inibição de parâmetros clínicos e histopatológicos de artrite num modelo de artrite induzido por colagénio murino.
Assim, os compostos da invenção podem ser usados para o tratamento da inflamação, incluindo tanto, inflamação aguda como crónica assim como certos distúrbios de proliferação (cancros). Tal como aqui usada, inflamação inclui, sem limitação, espondilite anquilosante, artrite (em que este termo engloba mais de 100 tipos de doenças reumáticas), asma, doença de Crohn, síndrome de fibromialgia, gota, inflamações do cérebro (incluindo esclerose múltipla, demência por SIDA, encefalopatia de Lyme, encefalite de herpes, doença de Creutzfeld-Jakob, e toxoplasmose cerebral), enfisema, doença inflamatória do intestino, síndrome do intestino irritável, lesão isquemia-reperfusão sarcoidose pulmonar eritematosa juvenil, doença de Kawasaki, osteoartrite, doença inflamatória pélvica, artrite psoriática (psoríase), artrite reumatóide, psoríase, transplante de tecido/órgão, escleroderma, espondiloartropatias, lúpus sistémico eritematoso, sarcoidose pulmonar, e colite ulcerosa. Tal como aqui utilizado, doenças proliferativas incluem, sem limitação, todas as leucemias e tumores sólidos que são susceptíveis de sofrer diferenciação ou apoptose por intermédio da interrupção do seu ciclo celular. A invenção apresenta um método para a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da 38 invenção, incluindo seus sais, composições, etc. Tal como aqui utilizado, a quantidade real abrangida pelo termo "quantidade terapeuticamente eficaz" irá depender da via de administração, do tipo de animal de sangue quente a ser tratado, e das características físicas do anima de sangue quente específico sob consideração. Estes factores e a sua relação para determinar esta quantidade são bem conhecidos pelos peritos na técnica médica. Esta quantidade e o método de administração podem ser ajustados de modo a se conseguir uma eficácia óptima mas irão depender de factores tais como o peso, a dieta, outra medicação em curso e outros factores que serão reconhecidos pelos peritos na técnica médica.
Uma quantidade eficaz de um composto ou composição da presente invenção será suficiente para tratar a inflamação num animal de sangue quente, tal como humano. Os métodos de administração de quantidade eficazes de agentes anti-inflamatórios são bem conhecidos na técnica e incluem a administração de formas de inalação, orais ou parenterais. Tais formas de dosagem incluem, mas não se limitam a, soluções, comprimidos, cápsulas, implantes de libertação sustentada e sistemas de administração transdérmica parenterais; ou sistemas de dosagem por inalação que utilizam inaladores de pós secos ou dispositivos de inalação multidose pressurizados. A quantidade e a frequência da dosagem, são, seleccionados para criar um nível eficaz do agente sem efeitos nocivos. Irá geralmente situar-se na gama de uma dosagem de desde cerca de 0,01 a 100 mg/kg/dia, e tipicamente desde cerca de 0,1 a 10 mg/kg/dia, quando administrados oralmente ou por via intravenosa. Também, a gama de dosagem irá ser tipicamente de 39 cerca de 0,01 a 1 mg/kg/dia quando administrada por via intranasal ou por inalação.
Os compostos da invenção, incluindo os compostos usados nas utilizações e composições apresentadas acima, podem ser preparados de acordo com os Esquemas apresentados nos exemplos seguintes. Os exemplos seguintes são proporcionados a titulo ilustrativo e não de limitação.
Excepto se referido de outro modo, cromatografia "flash" e cromatografia em coluna podem ser realizadas usando sílica gel 60 da Merck (230-400 mesh). A cromatografia "flash" pode ser realizada de acordo com o procedimento apresentado em: "Purification of Laboratory Chemicals", 3a. edição, Butterworth-Heinemann Ltd. , Oxford (1988), Eds. D. D. Perrin e W. L. F. Armarego, página 23. A cromatografia em coluna refere-se ao processo através do qual o caudal de eluente através de um material de enchimento é determinado por gravidade. Em todos os casos, pode-se usar intermutavelmente cromatografia "flash" e cromatografia radial. A cromatografia radial é realizada usando sílica gel num equipamento Chromatotron Modelo # 7924T (Harrison Research, Paio Alto,
Califórnia). Excepto se indicado de outro modo, os valores Rf referidos são obtidos por cromatografia em camada fina usando Sílica Gel 60 F254 (Merck KGaA, 64271, Darmstadt, Alemanha). Igualmente, excepto se indicado de outro modo, os reagentes químicos foram obtidos de fornecedores químicos convencionais, tais como Aldrich (Milwaukee, WI; www.aldrich.sial.com); EM Industries, Inc. (Hawthorne, NY; www.emscience.com); Fisher Scientific Co. (Hampton, NH; www.fischer.com); e Lancaster Synthesis, Inc. (Windham, NH; www.lancaster.co.uk). Os gases foram obtidos da Praxair (Vancouver, B.C.). As linhas celulares, excepto se indicado 40 de outro modo, foram obtidas de fontes públicas ou comerciais, por exemplo, American Tissue Culture Collection (ATCC, Rockville, MD).
EXEMPLOS DE SÍNTESE E DE REFERÊNCIA Síntese de Intermediários dos Compostos da Invenção e exemplos de referência
Os intermediários usados na preparação dos compostos da invenção podem ser preparados por métodos apresentados no seguinte Esquema Reaccional 1. Por exemplo, o anidrido misto, obtido a partir do ácido (3,4-dimetoxifenil) acético 16 (Aldrich) e do cloreto de trimetilacetilo, é feito reagir com o anião lítio de (S)-(-)-4-benzil-2-oxazolidinona para resultar no composto 17. A adição de Michael enantiosselectiva do enolato de titânio da oxazolidinona quiral 17 ao acrilato de terc-butilo proporcionou o composto 18 com uma funcionalidade carboxilato com um grupo protector adequado. A hidrólise do auxiliar quiral com hidróxido de lítio e peróxido de hidrogénio resulta no ácido carboxílico 19. A redução selectiva do composto 19 com BH3-THF origina o composto 20 contendo o álcool primário. 41
EscpjÍeaia de Reagçao 1
aHs. THP mo
A síntese dos compostos 17 - 20 neste Esquema Reaccional é especificamente descrita abaixo. Síntese do Composto 17
Solução 1: Adicionou-se trietilamina (12,8 mL, 91,7 mmol) e depois cloreto de trimetil acetilo (10,4 mL, 84,2 mmol) a uma solução de solution ácido (3,4-dimetoxiphenil) acético 16 42 (15,0 g, 76,5 mmol) em THF (120 mL) a 0°C e a mistura foi agitada durante uma hora.
Solução 2: Num segundo recipiente, adicionou-se n-butil-litio (2,5 M em hexanos, 33,7 mL, 84,2 mmol) a uma solução de (S)-(-)-4-benzil-2-oxazolidinona (14,9 g, 84,2 mmol) em THF anidro (75 mL) a -78°C. Esta solução foi agitada durante uma hora e depois adicionada à solução 1 a 0°C através de uma cânula. A mistura resultante foi aquecida de 0°C até à temperatura ambiente, agitada durante 24 horas, depois diluída com solução saturada de NaHCCb (300 mL) , e extraída com CH2C12 (3 x 200 mL). A fase orgânica combinada foi lavada com NaCl saturado (2 x 150 mL) , seca sobre MgSCh, filtrada e o filtrado concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel (hexanos/EtOAc, 4:1) para resultar no composto 17 (19,04 g, 70%) na forma de um sólido branco. Síntese dos Compostos 18 e 19
Adicionou-se lentamente isopropóxido de titânio (0,42 mL, 1,41 mmol) a uma solução de tetracloreto de titânio (0,50 mL, 4,50 mmol) em diclorometano anidro (10 mL) a 0°C. A mistura resultante foi agitada a 0°C durante 5 minutos e depois adicionou-se di-isopropiletilamina (1,04 mL, 5,91 mmol). Após 15 minutos, adicionou-se uma solução do composto 17 (2,0 g,
5,63 mmol) em diclorometano (10 mL) . A mistura foi agitada durante 90 minutos a 0°C, depois adicionou-se acrilato de terc-butilo (1,24 mL, 8,45 mmol). A mistura reaccional foi aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante 36 horas e depois diluída com cloreto de amónio saturado (50 mL) . A camada aquosa foi extraída com diclorometano (3 x 50 mL) e as fases orgânica combinadas foram lavadas com HC1 a IN 43 (2 χ 75), água (2 x 75 mL) e NaCl saturado (2 x 75 mL) . Após secar sobre MgS04, a filtração e a evaporação do filtrado sob vácuo originou o composto em bruto 18 (2,69 g) que foi usado sem purificação suplementar. 0 composto em bruto 18 (2,69 g) foi dissolvido numa mistura de 3:1 THF/água (85 mL) e arrefecido a 0 C. Adicionou-se hidróxido de lítio mono-hidratado (466,6 mg, 11,12 mmol) e peróxido de hidrogénio a 30% (2,5 mL, 22,25 mmol) e a mistura foi agitada a 0°C durante 3 horas. Adicionou-se uma solução de sulfito de sódio (3,06 g, 24,46 mmol) seguida de bicarbonato de sódio a 0,5 N (41 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas e depois concentrada sob vácuo. A fase aquosa foi diluída com HC1 a 5% a pH = 2 e depois extraída com EtOAc (3 x 75 mL) . As fases orgânicas combinadas foram secas sobre MgS04, filtradas e o filtrado concentrado sob vácuo. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel usando 0,2% de ácido acético em 20% de acetato de etilo/hexanos para resultar no composto 19 (1,09 g, 60% em dois passos) na forma de um óleo amarelo claro. Síntese do Composto 20
Adicionou-se BH3-THF (solução a 1, 0 M em THF, 37,6 mL, 0, 0376 moles) gota a gota ao longo de 20 minutos a uma solução do composto 19 (12,18 g, 0,0376 moles) em THF anidro (50 mL) a 18°C. O banho de arrefecimento foi então removido, e a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. Adicionou-se uma solução saturada de NaHC03 (50 mL) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 75 mL) . A fase orgânica combinada foi lavada com NaCl saturado (2 x 75 mL) . A fase orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e o filtrado 44 evaporado sob vácuo. 0 resíduo foi purificado por cromatografia em coluna, eluindo com 50% EtOAc em hexanos para resultar no composto 20 (10,52 g, 91%) na forma de um óleo incolor.
Alternativamente, intermediários dos compostos da invenção com diferentes grupos alcoxi no anel fenilo podem ser sintetizados pelos métodos descritos abaixo no Esquema Reaccional 2. Por exemplo, o álcool 3-hidroxi-4-metoxibenzílico 31 comercialmente disponível é selectivamente protegido como o derivado benziloxi 32 por tratamento de 31 com brometo de benzilo e carbonato de potássio em tolueno sob refluxo para resultar em 89% do produto desejado após cristalização. Faz-se então reagir o composto 32 com cloreto de metanossulfonilo na presença de trietilamina e CH2C12 para resultar no composto 33, que é usado sem purificação suplementar. 0 produto em bruto 33 é então colocado em DMF e tratado com cianeto de potássio na presença de 18-coroa-6. Após processamento e purificação, o nitrilo 34 é isolado com um rendimento de 91% em dois passos. A hidrólise do nitrilo 34 com hidróxido de potássio é então conseguida para resultar no ácido carboxílico 35 desejado com um rendimento de 95%. 0 tratamento do composto 35 com cloreto de trimetilacetilo resulta num anidrido misto que é feito reagir com o anião lítio de (S)-(-)-4-benzil-2-oxazolidinona para fornecer o composto 36 com um rendimento de 75%. A adição enantiosselectiva de Michael do enolato de titânio da oxazolidinona quiral 36 ao acrilato de tert-butilo proporciona o composto 37 com a funcionalidade carboxilato com um grupo protector adequado. A hidrogenação do composto 37 resultou no álcool com rendimento quantitativo, o qual é convertido no derivado ciclopentiloxi 38 com um rendimento de 64% por tratamento com brometo de ciclopentilo, carbonato de 45 potássio e iodeto de potássio em DMF. Deste modo, qualquer número de derivados alcoxi no anel fenilo pode ser preparado usando o brometo de alquilo correspondente ou o brometo de alquilo funcionalizado. A hidrólise do auxiliar quiral com hidróxido de lítio e peróxido de hidrogénio resulta no ácido carboxilico 39 com um rendimento de 91%. A redução selectiva do composto 39 com BH3-THF resulta no composto 40 (rendimento 89%) contendo o álcool primário.
Esquema cie Reacção 2
dilsoprapileti lassíria
ClfcCfe
46 A síntese dos compostos 32-40 neste Esquema Reaccional é especificamente descrita abaixo. Síntese do Composto 32 A uma suspensão rapidamente agitada de álcool 3-hidroxi-4-metoxibenzílico 31 (30,0 g, 195 mmol), adiciona-se carbonato de potássio (62,2 g, 450 mmol), e 18-coroa-6 (0,40 g, 1 mol%) em tolueno (350 mL) a uma solução de brometo de benzilo (25,6 g, 150 mmol) em tolueno (150 mL) ao longo de 20 min. A mistura reaccional foi submetida a refluxo durante 16 horas, após o que a mistura foi diluída com éter dietílico (400 mL) e lavada sucessivamente com NaOH (1 N, 2 x 250 mL) , solução aquosa saturada de NaHC03 (2 x 250 mL) , e salmoura (2 x 300 mL) . A fase de éter dietílico foi seca sobre MgSCt anidro, e o solvente foi removido para resultar num sólido amarelo pálido (42,1 g) que foi cristalizado com EtOAc e hexanos para resultar no composto 32 (32, 7 g, 89%) na forma de um sólido cristalino branco. Síntese do Composto 33 O composto 32 (30,0 g, 122,8 mmol) foi dissolvido em diclorometano (300 mL) e arrefecido até 0°C, e depois adicionou-se Et3N (20,4 mL, 147,36 mmol) e cloreto de metanossulfonilo (11,40 mL, 147,36 mmol). O banho de gelo foi removido, e a solution foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura foi depois diluída com diclorometano (700 mL) , lavada sucessivamente com solução aquosa saturada de NaHC03 (2 x 300 mL) e H20 (2 x 300 mL). A fase orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e o filtrado foi concentrado para resultar no composto 33 (33,08 g) na forma 47 de um sólido amarelo pálido que foi usado no passo seguinte sem purificação suplementar. Síntese do Composto 34 A uma solução do 33 em bruto (33,08 g) em DMF anidra (200 mL) adicionou-se KCN (15,99 g, 245,6 mmol) e 18-coroa-6 (5,19 g, 19,65 mmol). A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas, depois vertida em água (1,5 L) . 0 precipitado foi recolhido e dissolvido em EtOAc (600 mL), lavado com H20 (2 x 200 mL) e salmoura (2 x 200 mL) . A fase orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e o filtrado foi concentrado para resultar no composto 34 (28,5 g, rendimento de 91% em dois passo) na forma de um sólido branco sujo. Síntese do Composto 35
Uma mistura do composto 34 (28,0 g, 110,5 mmol) e KOH (94,0 g, 167,5 mmol) em H20 (170 mL) foi aquecida sob refluxo durante 12 horas. Depois, a mistura reaccional foi arrefecida até à temperatura ambiente, foi diluída com H20 (1.6 L) e acidificada com 12 N HC1 a pH=2. O precipitado resultante foi recolhido e seco sobre P2O5 para resultar no composto 35 (28,8 g, 95%) na forma de um sólido branco. Síntese do Composto 36
Solução 1: Adicionou-se trietilamina (17,7 mL, 126,92 mmol) seguida por cloreto de trimetil acetilo (14,3 mL, 116,35 mmol) a uma solução do composto 35 (28,8 g, 105, 77 mmol) em THF (250 mL) a 0°C e a mistura foi agitada durante uma hora. Solução 2: Num segundo recipiente, adicionou-se n-butil-lítio (2,5 M em hexanos, 46,5 mL, 116,35 mmol) a uma solução de 48 (S) - (-)-4-benz il-2-oxazolidinona (20,6 g, 116.35 mmol) em THF anidro (145 mL) a -78°C. Esta solução foi agitada durante uma hora e depois adicionada à solução 1 a 0°C. A mistura resultante foi aquecida de 0°C até à temperatura ambiente, agitada durante 24 horas, depois diluída com solução saturada de NaHC03 (400 mL) , e extraída com CH2C12 (4 x 300 mL) . A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura (200 mL), seca sobre MgSCq, filtrada e o filtrado concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel (hexanos/EtOAc, 4:1) para resultar no material de partida (15,93 g) e no composto 36 (15,30 g, 75% com base na recuperação do material de partida) na forma de um sólido branco. Síntese do Composto 37
Adicionou-se lentamente isopropóxido de titânio (2,6 mL, 8,69 mmol) a uma solução de tetracloreto de titânio (3,1 mL, 27,8 mmol) em diclorometano anidro (100 mL) a 0°C. A mistura resultante foi agitada a 0°C durante 5 minutos e depois adicionou-se di-isopropiletilamina (6,7 mL, 38,24 mmol). Após 15 minutos, uma solução do composto 36 (15 g, 34,76 mmol) em diclorometano (100 mL) foi adicionada. A mistura foi agitada durante 90 minutos a 0°C, depois adicionou-se acrilato de terc-butilo (15,3 mL, 104,28 mmol). A mistura reaccional foi agitada durante 3 dias a 0°C e depois diluída com cloreto de amónio saturado (300 mL). A camada aquosa foi extraída com diclorometano (3 x 300 mL) e as fases orgânicas combinadas foram lavadas com HC1 a 5% (2 x 400 mL) , água (2 x 300 mL) e NaCl saturado (400 mL). Após secar sobre MgS04, filtração e evaporação do filtrado sob vácuo resultou no composto em bruto 37 (21,0 g). Uma porção do composto em bruto 37 (2,1 g) foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel 49 eluída com EtOAc/Hexanos (1:2) para resultar no composto em bruto 37 (1,55 g) na forma de um xarope. Síntese do Composto 38
Uma mistura do composto 37 (1,55 g, 2,77 mmol) e 10% Pd/C (150 mg) em EtOAc/AcOH (5:1,60 mL) foi agitada sob H2 (balão) durante 18 horas. A mistura foi filtrada em celite e o filtrado foi evaporado até à secura para resultar no composto fenólico intermediário (1,30 g, 100%).
Uma suspensão do composto fenólico (0,30 g, 0,639 mmol), K2C03 anidro (0,132 g, 0,958 mmol), e Kl (5 mg) em DMF anidra (1,5 mL) foi agitada e aguecida a 65°C, e depois adicionou-se brometo de ciclopentilo (0,10 mL, 0,958 mmol) gota a gota. A mistura agitada foi aquecida a 65°C durante mais 21 horas. Após arrefecer até à temperatura ambiente, a mistura reaccional foi diluída com Et20 (50 mL) e lavada com H20 (2 x 25 mL). A fase orgânica foi seca com MgSCq e o solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel com hexanos/EtOAc (4: 1) como eluente para resultar no composto 38 (0,22 g, 64%) na forma de um xarope incolor. Síntese do Composto 39 O composto 38 (3,5 g, 6,51 mmol) foi dissolvido em THF/H20 (3:1,60 mL) e arrefecido até 0°C. Adicionou-se hidróxido de lítio mono-hidratado (0,546 g, 13,02 mmol) e 30% de peróxido de hidrogénio (2,98 mL, 26,04 mmol) e a mistura foi agitada a 0°C durante 3 horas. Adicionou-se uma solução de sulfito de sódio (3,61 g, 28,64 mmol) em água (19 mL) , seguida por bicarbonato de sódio a 0,5 N (35 mL). A mistura foi agitada à 50 temperatura ambiente durante 2 horas e depois concentrada sob vácuo. A fase aquosa foi diluída com HC1 a 5% até pH = 2 e depois extraída com EtOAc (3 x 75 mL) . As fases orgânicas combinadas foram secas sobre MgS04, filtradas e o filtrado concentrado sob vácuo. 0 produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel usando 0,2% de ácido acético em acetato de etilo/hexanos (1:4) como eluente para resultar no composto 39 (2,24 g, 91%) na forma de um sólido branco. Síntese do Composto 40
Adicionou-se BH3-THF (1,0 M solução em THF, 2,70 mL, 2,70 mmol) gota a gota ao longo de 40 minutos a uma solução do composto 39 (2,23 g, 2,64 mmol) em THF anidro (15 mL) a 18°C. O banho de arrefecimento foi então removido, e a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente for 18 horas. Adicionou-se uma solução aquosa saturada de NaHC03 (15 mL) , e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 50 mL) . A fase orgânica combinada foi lavada com NaCl saturado (2 x 50 mL) . A fase orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e o filtrado evaporado sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel, eluindo com 25% EtOAc em hexanos para resultar no composto 40 (1,91 g, 89%) na forma de um óleo incolor.
Podem ser preparados intermediários adicionais na preparação dos compostos da invenção tal como descrito abaixo no Esquema Reaccional 3. Em geral, a conversão do composto 20 no intermediário chave 46 foi conseguida numa sequência de cinco passos como se segue. O traramento do composto 20 com complexo azida de zinco/bis-piridina, trifenilfosfina e azodicarboxilato de di-isopropilo em tolueno resulta 51 suavemente na azida correspondente 44 com um rendimento de 91%. 0 composto 44 é então hidrogenado na presença de 10% Pd-C e a amina resultante 45 é convertida no composto 46 (63% ao longo de dois passo) por tratamento com NaOH em DMF.
OMe 46 A síntese dos compostos 44-46 neste Esquema Reaccional é especificamente descrita abaixo. Síntese do Composto 44
Preparação do complexo ZnN6.2Py: A uma solução agitada de Zn (N03) 2 · 6H20 (3,57 g, 12,0 mmol) em H20 (6 mL) adicionou-se gota a gota uma solução de NaN3 (1,56 g, 24,0 mmol) in H20 (12 mL) . A suspensão branca foi levada a 50 C num banho de óleo, depois adicionou-se piridina (2,0 mL, 24,7 mmol) gota a gota formando um precipitado branco denso. Continuou-se a agitação à medida que a mistura foi lentamente arrefecida até à temperatura ambiente. O sal foi filtrado, lavado com água gelada e seco sob vácuo para originar ZnN6.2Py (2,99 g, 81%) na forma de um sólido branco. 52
Adicionou-se azodicarboxilato de di-isopropilo (1,30 mL, 6,59 mmol) a uma suspensão do composto 20 (1,0 g, 3,30 mmol) ,
ZnN6.2Py (0,76 g, 2,47 mmol) e Ph3P (1,73 g, 6,59 mmol) em tolueno anidro (20 mL) . A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 18 horas. A mistura foi concentrada, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com hexanos/EtOAc (9:1) para resultar no composto 44 (1,01 g, 91%) na forma de um óleo incolor. Síntese do Composto 45
Uma mistura do composto 44 (1, 00 g, 2.98 mmol) e 10% Pd/C (100 mg) em EtOAc (30 mL) foi agitada sob H2 (balão) durante 18 horas. A mistura foi filtrada em celite e o filtrado foi evaporado até à secura para resultar no composto 45 (0,923 g, 100%) na forma de um xarope incolor. Síntese do Composto 46
Adicionou-se hidróxido de sódio (5 N, 0,14 mL, 0,70 mmol) a uma solução do composto 45 (0,21 g, 0,68 mmol) em THF (1 mL) e MeOH (1 mL) . A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 18 horas. A mistura foi concentrada, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com hexanos/EtOAc (9:1) para resultar no composto 46 (0,091 g, 63%) na forma de um sólido branco. Síntese dos Compostos da Invenção e exemplos de referência
Os compostos da invenção podem ser preparados pelos métodos descritos abaixo no Esquema Reaccional 4. Nesta abordagem, o composto 46 é tratado com NaH e brometo de benzilo em DMF para resultar no composto 47 com um rendimento de 80%. O 53 composto 47 é então colocado em THF e alquilado com 4-(benziloxi)-3-metoxibrometo de benzilo para originar os produtos de acoplamento desejados 48 e 49 numa razão de 7,2:1 com um rendimento de 86%. Estes dois isómeros podem ser separados por cromatografia em coluna de sílica gel. A des-O-benzilação do composto 49 usando 10% Pd/C como catalisador ocorre facilmente e o fenol 50 é isolado com um rendimento de 98%. Hidrogenólise suplementar sob elevada pressão pode então resultar no composto 51.
Esquema Reaccional 4
H2, Pd/C
Métodos alternativos para proteger o azoto da lactama podem também ser usados no seguinte Esquema Reaccional 5. Por exemplo, a protecção N de 46 como a N-t-butoxicarbonilamida pode ser conseguida usando di-terc-butildicarbonato e trietilamina em diclorometano para originar o derivado 52 com um rendimento de 95%. A alquilação do composto 52 com 4- 54 (benziloxi)-3-metoxibrometo de benzilo resulta no composto 53 com um rendimento de 67%. 0 composto 53 é uma mistura diasteromérica. A remoção do grupo protector N-BOC no composto 53 com ácido trifluoroacético em diclorometano origina o produto 54 com um rendimento de 74%. A hidrogenólise do composto 54 usando 10% Pd/C como catalisador proporciona a mistura diastereomérica 55 com um rendimento de 81%.
Esquema Reaccional 5
CF3COOH
A síntese dos compostos 47-55 nos Esquemas Reaccionais 6 e 7 é especificamente descrita abaixo. 55 Síntese do Composto 47 0 composto 46 (0,184 g, 0,782 mmol) foi dissolvido em DMF (5 mL) e arrefecido até 0°C, adicionando-se NaH (0,0344 g, 60% em óleo mineral, 0,860 mmol). Após duas horas, adicionou-se lentamente brometo de benzilo (0,14 mL, 1,173 mmol) e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante mais 18 horas. O solvente foi evaporado e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com EtOAc para resultar no composto 47 (0,203 g, 80%) na forma de um sólido branco. Síntese dos Compostos 48 e 49
A uma solução do composto 47 (0,23 g, 0,707 mmol) em THF anidro (4 mL) sob árgon, adicionou-se lentamente LDA [0,85 mmol, preparada a partir de n-BuLi (0,34 mL, solução de 2,5 M em hexano, 0,85 mmol) e di-isopropilamina (0,12 mL, 0,85
mmol)] em THF (2 mL) a -78°C. A mistura foi agitada a -78°C durante uma hora, e depois adicionou-se HMPA (0,18 mL, 1,06 mmol) à mistura acima através de uma seringa. Após 15
minutos, adicionou-se 4-(benziloxi)-3-metoxibrometo de benzilo (0,434 g, 1,41 mmol) em THF (1 mL) . A mistura resultante foi agitada durante mais 2 horas a -78°C. O excesso de base foi neutralizado 0°C com solução aquosa saturada de NH4C1 (10 mL), e a solução resultante foi extraída com EtOAc (3 x 30 mL). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (2 x 40 mL) , secas sobre MgS04, filtradas e o filtrado foi evaporado até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com hexanos/EtOAc (3 : 2) para resultar nos compostos 49 (0,295 g, 75,6%) e 48 (0,041 mg, 10,5%) na forma de espumas brancas. 56 Síntese dos Compostos 50 e 51
Uma mistura do composto 49 (0,25 g, 0,453 mmol) e 10% Pd/C (50 mg) em EtOAc (20 mL) foi agitada sob H2 (balão) durante 48 horas. A mistura foi filtrada em celite e o filtrado foi evaporado até à secura para resultar no composto 50 (0,204 g, 98%) na forma de uma espuma branca. Hidrogenólise suplementar do composto 50 sob pressão elevada resulta no composto 51. Síntese do Composto 52
Adicionou-se di-tert-butil dicarbonato (0,724 g, 3,32 mmol) a uma solução do composto 46 (0,39 g, 1,66 mmol), Et2N (0,46 mL, 3,22 mmol) e DMAP (0.040 g) em CH2C12 (12 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 4 horas. A mistura foi concentrada, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com hexanos/EtOAc (2: 1) para resultar no composto 52 (0,543 g, 98%) na forma de um sólido branco. Síntese do Composto 53 A uma solução do composto 52 (0,54 g, 1,61 mmol) em THF anidro (7 mL) sob árgon adicionou-se lentamente LDA [1,93 mmol, preparada a partir de n-BuLi (0,77 mL, 2,5 M solução em hexano, 1,93 mmol) e di-isopropilamina (0,27 mL, 1,93 mmol)] em THF (4 mL) a -78°C. A mistura foi agitada a -78°C durante uma hora, e depois adicionou-se HMPA (0,42 mL, 2,42 mmol) à mistura acima através de uma seringa. Após 15 minutos, adicionou-se 4-(benziloxi)-3-metoxibrometo de benzilo (0,989 g, 3,22 moles) em THF (2 mL) . A mistura resultante foi agitada durante mais 4 horas a -78°C. O excesso de base foi neutralizado a 0°C com solução aquosa de NH4C1 (20 mL), e a 57 solução resultante foi extraída com EtOAc (4 x 50 mL). A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura saturada (2 x 50 mL), seca sobre MgS04, filtrada e o filtrado foi evaporado até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com hexanos/EtOAc (4: 1) para resultar no composto 53 (0,604 g, 67%) na forma de uma espuma branca. Síntese do Composto 54
Adicionou-se ácido trifuloroacético (10 mL) a uma solução do composto 53 (0,557 g, 0,990 mmol) em C2C12 (10 mL). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 2 horas e depois concentrada sob vácuo. O resíduo foi dissolvido em CH2C12 (100 mL) e lavado com NaHOC3 saturada (3 x 2 0 mL) . A camada orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e o filtrado concentrado sob vácuo. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel usando 5% MeOH em acetato de etilo como eluente para resultar no composto 54 (0,349 g, 76%) na forma de uma espuma branca. Síntese do Composto 55
Uma mistura do composto 54 (0,30 g, 0,65 mmol) e 10% Pd/C (30 mg) em EtOAc/AcOH (1: 1,10 mL) foi agitada sob H2 (balão) durante 5 horas. A mistura foi filtrada em celite e o filtrado foi evaporado até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com
EtOAc/MeOH (9: 1) para resultar no composto 55 (0,195 g, 81%) na forma de um sólido branco.
Alternativamente, os compostos da invenção podem ser preparados pelos métodos descritos no Esguema Reaccional 6. 58
Em geral, o tratamento do composto 40 com o complexo azida de zinco/bis-piridina, trifenilfosfina e di-isopropil azodicarboxilato em tolueno resulta na azida correspondente 56. O composto em bruto 56 é então hidrogenado na presença de 10% Pd-C para resultar no composto 57 com um rendimento de 76% em dois passos. O passo de ciclização da lactama envolve uma reacção num único recipiente com uma sequência de três passos usando solvólise de éster terc-butilico com ácido p-toluenossulfónico mono-hidratado, esterificação em metanol, e ciclização da lactama com adição de trietilamina para proporcionar o composto 58 com um rendimento de 96% ao longo dos três passos. A N-protecção do 58 resultante com carbonato de di-terc-butilo e trietilamina em diclorometano proporciona o derivado N-t-butoxicarbonilamida 59 com um rendimento de 84%. A alquilação do composto 59 com LDA e 4-(benziloxi) -3-metoxibrometo de benzilo resulta no composto 60 com um rendimento de 74%. O composto 60 é uma mistura diaestereomérica com uma razão R/S de 1:1. A remoção do grupo protector N-BOC no composto 60 com ácido trifluoroacético em diclorometano resulta no produto alvo 61 com um rendimento de 74%. A hidrogenólise do composto 61 usando 10% Pd/C como catalisador proporciona o produto final 62 com um rendimento de 81%. 59
Esquema Reaccional 6
MeO
ΜθΟ
NH,
I.TsOH, MeOH
MeO. BnO
NBOC cPentO OMe 60
NBOC
NH ,1. LDAA* I OMe cPentO OBn
OMe 59
((B0C)70 Et3N cPentO'
OMe 58
CF3COOH
A síntese dos Compostos 56-62 neste Esquema Reaccional é especificamente descrita abaixo. Síntese do Composto 56
Adicionou-se di-isopropil mmol) a uma suspensão do azodicarboxilato (1,62 mL, 8,24 composto 40 (1,5 g, 4,12 mmol), 60 ΖηΝ6.2Py (0,95 g, 3,09 mmol) e Ph3P (2,16 g, 8,24 mmol) em tolueno anidro (20 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas. A mistura foi então concentrada, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com 15% of EtOAc em hexanos para resultar no composto 56 (1,59 g) na forma de um óleo incolor. Síntese do Composto 57
Uma mistura do composto 56 em bruto (1,59 g) e 10% Pd/C (80 mg) em EtOAc (20 mL) foi agitada sob H2 (balão) durante 20 horas. A mistura foi filtrada em celite e o filtrado foi evaporado até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com
EtOAc/MeOH/EtsN (85: 14: 1) para resultar no composto 57 (1,14 g, 76% ao longo de dois passo) na forma de um óleo incolor. Síntese do Composto 58 O composto 57 (0,301 g, 0,825 mmol) foi dissolvido em tolueno (18 mL) e MeOH (2 mL) e tratado com pTs0H-H20 (0, 472 g, 2,48 mmol). A solução foi aquecida sob refluxo durante 1,5 horas usando um dispositivo Dean-Stark. O dispositivo Dean-Stark foi então removido e adicionou-se Et3N (0,35 mL, 2,48 mmol) à solução, a qual foi aquecida sob refluxo durante mais 4 horas. O solvente foi evaporado e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel eluída com 2% AcOH em EtOAc para proporcionar o composto 58 (0,228 g, 96%) na forma de um sólido branco. 61 Síntese do Composto 59
Adicionou-se di-tert-butil dicarbonato (0,935 g, 4,28 mmol) a uma solução do composto 58 (0,62 g, 2,14 mmol), Et3N (0,60 mL, 4,28 mmol) e DMAP (0, 060 g) em CH2CI2 (20 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 5 horas. A mistura foi concentrada, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com hexanos/EtOAc (3: 1) para resultar no composto 59 (0,696 g, 84%) na forma de um sólido branco. Síntese do Composto 60 A uma solução do composto 59 (0,60 g, 1,54 mmol) em THF anidro (5 mL) sob árgon adicionou-se lentamente LDA [1,85 mmol, preparada a partir de n-BuLi (0,74 mL, 2,5 M solução em hexano, 1,85 mmol) e di-isopropilamina (0,26 mL, 1,85 mmol)] em THF (2 mL) a -78°C. A mistura foi agitada a -78°C durante uma hora, e depois adicionou-se HMPA (0,40 mL, 2,30 mmol) à mistura acima através de uma seringa. Após 15 minutos, adicionou-se 4-(benziloxi)-3-metoxibrometo de benzilo (0,71 g, 2,30 mmol) em THF (2 mL). A mistura resultante foi agitada durante mais 4 horas a -78°C. O excesso de base foi neutralizado a 0°C com solução aquosa saturada de NH4C1 (20 mL) , e a solução resultante foi extraída com EtOAc (3 x 60 mL). A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura saturada (2 x 50 mL), seca sobre MgS04, filtrada e o filtrado foi evaporado até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com hexanos/EtOAc (7: 3) para resultar no composto 60 (0,693 g, 74%) na forma de uma espuma branca. 62 Síntese do Composto 61
Adicionou-se ácido trifluoroacético (3 mL) a uma solução do composto 60 (0,63 g, 1,02 mmol) em CH2CI2 (3 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 4 horas, diluída com tolueno (20 mL) e depois concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel usando 5% MeOH em acetato de etilo como eluente para resultar no composto 61 (0,39 g, 74%) na forma de um sólido branco. Síntese do Composto 62
Uma mistura do composto 61 (0,28 g, 0,54 mmol) e 10% Pd/C (27 mg) em EtOAc/AcOH (1: 1,6 mL) foi agitada sob H2 (balão) for 5 horas. A mistura foi filtrado em celite e o filtrado foi evaporado até à secura. 0 resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com EtOAc/MeOH (97: 3) para resultar no composto 62 (0,20 g, 84%) na forma de uma espuma branca.
Alternativamente, compostos da invenção podem ser preparados por métodos similares àqueles descritos abaixo nos Esquemas Reaccionais 7 e 8. Por exemplo, no Esquema Reaccional 8, a protecção do álcool primário no composto 40 pode ser conseguida usando brometo de benzilo (BnBr) e carbonato de césio em DMF para resultar no derivado benziloxi 188. O composto 188 pode então ser convertido no seu ácido correspondente 189 através da reacção do composto 188 com ácido trifluoroacético. 63
Esquema Reaccional 7
0 composto 189 pode então ser usado para preparar compostos da invenção tal como apresentado abaixo no Esquema Reaccional 8 . 64
Escfuerria de Reacção 8
A síntese dos compostos 223-227 neste Esquema Reaccional é especificamente descrita abaixo. Síntese do Composto 223 A. As seguintes soluções (Solução 1 e Solução 2) foram preparadas independentemente. Solução 1: Adicionou-se trietilamina seguida por cloreto de trimetil acetilo a uma solução do composto 189 em THF a 0°C, e a mistura foi agitada 65 durante uma hora. Solução 2: Adicionou-se n-Butil-litio a uma solução of (R)-(-)-4-benzil-2-oxazolidinona em THF anidro a -78°C, e a mistura foi agitada durante uma hora. B. A solução 2 foi adicionada à Solução 1 através de uma cânula. Deixou-se a mistura resultante a 0°C aquecer até à temperatura ambiente. Após agitar à temperatura ambiente durante 24 horas, a mistura foi diluida com a solução saturada de NaHC03, e extraída com CH2CI2. As camada orgânicas foram combinadas, lavadas com H20, secas sobre MgS04, filtradas, e o filtrado concentrado sob vácuo. 0 resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel para resultar no derivado de (R)-(-)-4-benzil-2-oxazolidinona desejado. C. Adicionou-se lentamente n-butil-lítio a uma solução of di-isopropilamina em THF anidro a -78°C. A mistura reaccional foi agitada a -78 C sob árgon durante 1 hora a -78 C. 0 derivado de (R)-(-)-4-benzil-2-oxazolidinone em THF a -78°C foi adicionado e a mistura reaccional foi agitada durante 1 hora. Uma solução de brometos de 3-metil benzilo em THF foi então adicionada numa porção à mistura reaccional. A mistura resultante foi aquecida a 0°C e agitada durante mais 2 horas. 0 excesso de base foi neutralizado a 0°C com solução aquosa de NH4CI, e a solução resultante foi extraída com CH2C12.
As camadas orgânicas foram combinadas, lavadas sucessivamente com NaHC03 saturado e H20, secas sobre MgS04, filtradas, e o filtrado foi concentrado sob vácuo. 0 resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel para resultar no composto 223. Síntese do Composto 224 66
Agitou-se o composto 223 e 10% Pd/C em EtOAc sob H2 (balão) durante 20 horas. A mistura foi filtrada através de Celite e o filtrado foi concentrado sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel para resultar no composto 224. Síntese do Composto 225
Adicionou-se di-isopropil azodicarboxilato a uma suspensão do composto 224 com adição e mistura com ZnN6.2Py e Ph3P em tolueno anidro. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas. A mistura foi concentrada sob vácuo, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel para resultar no composto 225. Síntese do Composto 226
Adicionou-se Li0H*H20 e H202 (30% em H20) a uma solução do composto 225 em THF/H20 (3: 1) a 0°C. A mistura reaccional foi agitada a 0°C durante 3 horas. Uma solução de Na2S03 em água foi então adicionada seguida por uma solução de NaHC03 a 0,5 N. A mistura foi agitada durante 2 horas, e depois evaporou-se o THF sob vácuo. Esta solução aquosa foi diluída com 2N HC1 até pH = 2 e depois extraída com EtOAc. As fases orgânicas combinadas foram secas sobre MgS04, filtradas e o filtrado foi evaporado até à secura. 0 óleo resultante foi purificado usando cromatografia em coluna em sílica gel para resultar no composto 226. Síntese do Composto 227
Agitou-se o composto 226 e 10% Pd/C em EtOAc sob H2 (balao) for 20 horas. A mistura foi filtrada através de Celite e o 67 filtrado foi evaporado até à secura. 0 resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel para resultar no composto ácido desejado. 0 composto ácido foi dissolvido em tolueno e MeOH e tratado com pTs0H*H20. A solução foi aquecida sob refluxo durante 1,5 horas usando um dispositivo Dean-Stark. 0 dispositivo Dean-Stark foi então removido e adicionou-se Et2N à solução, que foi aquecida sob refluxo durante mais 4 horas. 0 solvente foi evaporado e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel para originar o composto desejado 227.
Tal como descrito em secções anteriores, os compostos da invenção, ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, podem conter um o mais centros assimétricos e podem assim originar enantiómeros, diastereómeros, e outras formas estereoisoméricas que podem ser definidas, em termos de estereoquímica absoluta, como (R) - ou (S)- ou, como (D)- or (L)- para aminoácidos. Pretende-se que a presente invenção inclua todos os isómeros possíveis, assim como as suas formas racémicas, enriquecidas opticamente e opticamente puras. Podem ser preparados isómeros opticamente activos ( + ) e (-) , (R)- e (S)-, ou (D)- e (L)- usando sintões quirais ou reagentes quirais, ou resolvidos usando técnicas convencionais, tais como HPLC de fase reversa utilizando uma fase estacionária quiral. Quando os compostos aqui descritos possuem ligações duplas olefínicas ou outros centros de assimetria geométrica, e excepto se especificado de outro modo, pretende-se que os compostos incluam ambos os isómeros geométricos E e Z. Do mesmo modo, também se pretendem incluir todas as formas tautoméricas.
As tabelas seguintes são proporcionadas para definir as estruturas dos compostos da invenção e exemplos de referência 68 listados nos exemplos de utilidade. Todos os compostos nestas tabelas foram preparados usando a metodologia aqui descrita ou a metodologia descrita para compostos similares tal como aqui proporcionado. As abreviaturas usadas nas tabelas sao as seguintes: Ac é acetilo, Bn é benzilo, Me é metilo , Et é etilo, Bu é butilo, Hex é hexilo, Ph é fenilo, Pent é pentilo, Pr é propilo, Hept é heptilo, 4-ClPh é 4- clorofenilo, BOC é benziloxicarbonilo, cPent é ciclopentilo, iBu é isobutilo, e iPr é isopropilo.
Estrutura Composto No. Ri=OMe, R2=OBn, R3=OMe, R4=OMe, Q=NBn 49 R1=OMe, R2=OH, R3=OMe, R4=OMe, Q=NBn 50 R1=OMe, R2=OH, R3=OMe, R4=OMe, Q=NH 51 69 ο
Estrutura Composto No. Ri=OMe, R2=OBn, RJ=OMe, R4=OMe, Q=NBOC 53 R1=OMe, R2=OBn, R3=OMe, R4=OMe, Q=NH 54 R1=OMe, R2=OH, R3=OMe, R4=OMe, Q=NH 55 R1=OMe, R2=OBn, R3=OcPent, R4=OMe, Q=NBOC 60 R^OMe, R2=OBn, R3=OcPent, R4=OMe, Q=NH 61 R1=OMe, R2=OH, R3=OcPent, R4=OMe, Q=NH 62
Estrutura Composto No. R1=OMe, R2=OBn, R3=OMe, R4=OMe, R5=H, Q=NBn 48 R2=Me, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 227 R2=H, R2=F, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 228
70 R1=H, R2=CF3, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 229 R4=H, R2=H, R3=OiPr, R4=OMe, R3=H, Q=NH 230 R4=H, R2=F, R3=OEt, R4=OMe, R5=H, Q=NH 231 R1=OPh, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, W=H, Q=NH 232 R2=H, R2=Me, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 233 R4=H, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 234 R4=OMe, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 235 R4=H, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=Me, Q=NH 236 R2=H, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=C1, Q=NH 237 R4=CF3, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 238 R1=C1, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 239 R4=0 (4-ClPh) , R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 240 R2=H, R2=iPr, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 241 R4=H, R2=OBu, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 242 R4=H, R2=OPh, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 243 R4=CF3, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=C1, Q=NH 244 R2=H, R2=OCF3, R3=0cPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 245 R1=OEt, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 246 R1=OPr, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 247 R1=OBu, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 248 R1=OPent, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 249 R1=OHex, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 250 R1=OHept, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 251 R2=Me, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NAc 252 R4=Me, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NC(0)Ph 253 R4=Me, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NiBu 254 R4=H, R2=CF3, R3=OiPr, R4=OMe, R5=H, Q=NH 255 Ri=OBn, R2=H, R3=OEt, R4=OMe, R5=H, Q=NH 256 R1=OBn, R2=H, R3=OiPr, R4=OMe, R5=H, Q=NH 257 R4=H, R2=H, R3=OEt, R4=OMe, R5=H, Q=NH 258 R4=F, R2=F, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 259 Ri=OBn, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 260 71
Além dos compostos anteriores, o seguinte composto 261 foi preparado com os materiais de partida apropriados usando a metodologia aqui descrita:
EXEMPLOS DE UTILIDADE
Os testes biológicos in vitro e in vivo mostraram que os compostos da invenção apresentam uma gama de potentes actividade biológicas contra alvos relevantes para a atrite reumatóide, outras doenças inflamatórias e doenças relacionadas não inflamatórias tal como descrito abaixo.
Tal como aqui usado, "tratamento da inflamação" refere-se tanto a terapia para inflamação, como para a prevenção do desenvolvimento de uma resposta inflamatória. Uma quantidade eficaz de um composto ou composição da presente invenção é usada para tratar a inflamação num animal de sangue quente, tal como humano. Os métodos para a administração de quantidades eficazes de agentes anti-inflamatórios são bem conhecidas na técnica e incluem a administração de formas de inalação, orais ou parentéricas. Tais formas de dosagem incluem, mas não estão limitadas a, soluções parentéricas, 72 cápsulas, implantes de libertação controlada e sistemas de administração transdérmica; ou formas de dosagem por inalação utilizando inaladores de pós secos ou dispositivos de inalação multidose pressurizados. A quantidade e a frequência da dosagem são seleccionadas para criar um nível eficaz do agente sem efeitos prejudiciais. Irá geralmente situar-se na gama de uma dosagem de desde cerca de 0,01 a 10 mg/kg/dia, quando administrados oralmente ou por via intravenosa. Também, a gama de dosagem irá ser tipicamente de cerca de 0,01 a 1 mg/kg/dia quando administrada por via intranasal ou por inalação. A administração de compostos ou composições da presente invenção pode ser realizada em combinação com a administração de outros agentes. Por exemplo, pode ser desejado co-administrar um glucocorticóide devido ao seu efeito na artrite.
Geração de Espécies Reactivas de Oxigénio por Neutrófilos Activados
Os neutrófilos compreendem mais de 90% do infiltrado leucocitário no fluido sinovial dos pacientes com artrite reumatóide (RA) e crê-se que contribuem tanto para as fases aguda e crónica desta e de muitas outras doenças inflamatórias através da libertação de mediadores pro-inflamatórios, enzimas de degradação da matriz e radicais de oxigénio tóxicos que resultam em lesões nos tecidos. Um mecanismo patogénico proposto é que as células são incapazes de fazer fagocitose de substâncias pro-inflamatórias de grandes dimensões, tais como complexos imunes o endotélio danificado presente nas articulações. Consequentemente, os grânulos neutrofílicos fundem-se com a membrana plasmática no 73 local da activação, em vez de internamente com vacúolos fagociticos, permitindo a libertação extracelular de espécies de oxigénio reactivas (ROS) pro-inflamatórias e outras substâncias tóxicas.
A activação dos neutrófilos pode ser medida pela quantificação de ROS geradas in vitro. A medição de ROS permite a quantificação especifica de uma espécie pro-inflamatória e é também uma medida geral da activação de neutrófilos. 0 método mais sensivel para a medição da produção de ROS por neutrófilos é a quimioluminescência potenciada por luminol. 0 sistema de teste utilizado para avaliar a capacidade dos compostos em inibir a geração de ROS em neutrófilos é indicativa da actividade anti-inflamatória que pode ser eficaz em estados de doença incluindo mas sem limitação a artrite reumatóide e a doença inflamatória do intestino.
Incubaram-se neutrófilos primários humanos acabados de isolar (5 x 106 células/mL) com as concentrações necessárias de composto ou de veiculo durante 30 minutos a 37°C em tampão HBSS (pH 7,4) contendo Ca2+. Usou-se wortmanina (100 nM) como controlo positivo. Transferiram-se aliquotas de cada amostra para uma microplaca à qual se adicionou luminol (1 μΜ) ; obtido da Sigma; No. Catálogo A8511. A activação dos neutrófilos foi imediatamente inicada através da adição de (1 M) fMLP; obtido da Sigma; No. Catálogo F3506. Registou-se a produção de luz de cada poço durante 30 minutos num luminómetro de microplacas. A produção total de luz (integral da produção ao longo do tempo) foi determinada para cada poço. As actividade inibidoras dos fármacos testados contra a geração de ROS dos neutrófilos é expressa como percentagem de actividade em relação a um controlo sem fármaco (100% de 74 activação ou geração de ROS) contendo 0,25% de DMSO. As concentrações de composto em teste necessária para inibir a geração de ORS a 50% dos valores de controlo (IC50's) foram determinadas a partir de curvas de concentração-resposta através de análise de regressão não linear. Os resultados são apresentados na Tabela 1. TABELA 1
Inibição da Desgranulação de Neutrófilos Por Compostos em Teste Tal Como Medida Pela Produção De ROS
COMPOSTO NÚMERO GAMA DE IC50 (μΜ) <1 1-10 10-100 >100 54 X 61 X 62 X 55 X
Tal como ilustrado na Tabela 1, compostos representativos da presente invenção apresentam ICso's na gama de 1-100 μΜ. Este resultado mostra que estes compostos potencialmente bloqueiam a geração de espécies reactivas de oxigénio pro-inflamatórias por neutrófilos in vitro. Este resultado pode advir da inibição da fosfodiesterase e/ou da sequestração química. Esta propriedade é preditiva de actividade anti-inflamatória in vivo devido ao papel estabelecido de lesão tecidular mediada por ROS, por exemplo, na artrite reumatóide, distúrbios inflamatórios do intestino e na psoríase. 75
Desgranulação Neutrofílica (Libertação de Mieloperoxidase)
Os granulócitos neutrofílicos contêm vários tipos de organelos conhecidos como grânulos. Estes corpos sub-celulares contêm uma diversa gama de agentes bactericidas, incluindo proteases e outras enzimas hidroliticas que são essenciais para a resposta inflamatória normal mas que contribuem para lesão aguda dos tecidos quando os neutrófilos estão activados de forma crónica e/ou inapropriada por doença. Uma das enzimas caracteristicas dos grânulos é a mieloperoxidase (MPO) que catalisa a conversão de peróxido de hidrogénio em hipo-halogeneto. A MPO é libertada para o meio extracelular por estimulação da desgranulação e é um indice fiável da activação dos neutrófilos. 0 seguinte sistema de teste pode ser usado para avaliar a capacidade de um composto da invenção em inibir a libertação de MPO dos neutrófilos, o que é indicativo de actividade anti-reumatóide assim como de outras doenças nas quais está implicada a activação neutrofílica inapropriada.
Recolhem-se dois tubos de sangue humano (12 mL) para tunos anticoagulantes ACD (Fisher; No. Catálogo 02-684-29). O sangue é misturado com 4 mL de 6% dextrano em solução salina. A mistura de sangue é recolhida numa seringa de 60 cc. Coloca-se a seringa com a ponta para cima numa bancada durante 30 min. A camada de soro superior é colocada sobre 4 mL de Histopaque (Sigma; No. Catálogo 1077-1) num tubo de centrífuga de 15 mL. O tubo é centrifugado durante 30 min a 2000 rpm. O sobrenadante é descartado. O sedimento é misturado com 3 mL de H2O fria, seguidamente com 1 mL de NaCl a 6N após 30 segundos. O tubo é centrifugado durante 5 min a 1100 rpm. O sedimento em cada tubo é combinado e lavado duas vezes com 10 mL (HBSS); Solução Salina Balanceada de Hank 76 (Stem Cell Ltd.; No. Catálogo LMC 75). As células sao contadas e diluídas até 2xl06 células/mL.
Pipetam-se células (0,3 mL) para tubos de microcentrífuga previamente marcados. As células são incubadas com 5 yg/mL de citocalasina B, 10 nM de PGE2 e a concentração desejada do composto de teste ou de veículo (0,5% DMSO) durante 5 min a 37°C. Usa-se wortmanina ou rolipram como controlo positivo. Adiciona-se 100 nM fMLP a cada tubo excepto no controlo. Após 30 min de incubação, as células são colocadas em gelo e centrifugadas a 13000 rpm durante 3 min. Pipeta-se 50 yL de sobrenadante para poços apropriados de uma placa de 96 poços (triplicado) Adiciona-se 100 yL de substrato a cada poço (0,53 mM o-dianisidina; Sigma, No. Catálogo D 3252, 0,147 mM H202 em tampão fosfato a pH 6,0). A placa é incubada durante 30 min a 37 C. A reacção é terminada pela adição de 50 yL de H2SC>4 a 4N em cada poço. Para preparar uma curva de calibração, pipetam-se 200 yL de 1, 0,1, 0,01, e 0,001 mg/mL de peroxidase de rábano para os poços (triplicado). A placa é lida num leitor ELISA a 405 nm.
Quimiotaxia dos Neutrófilos O processo de quimiotaxia (migração leucocitária dirigida ao longo de um gradiente de quimiocinas) é essencial para a acumulação de elevados números de neutrófilos associados com manifestações patológicas da inflamação (por exemplo, deterioração na articulação reumatóide). A quimiotaxia é um mecanismo primário através do qual os neutrófilos migram do lúmen dos vasos sanguíneos para o local da inflamação e como tal é um processo comum associado com lesões tecidulares mediadas por neutrófilos em muitas doenças inflamatórias. A inibição específica da migração neutrofílica para a 77 articulação inflamada é um alvo terapêutico válido na artrite reumatóide e muitas doenças inflamatórias. 0 seguinte sistema de ensaio in vitro pode ser usado para avaliar a capacidade de compostos da invenção em inibir a quimiotaxia, o que é indicativo de actividade anti-reumatóide in vivo e de actividade contra doenças inflamatórias nas quais estão implicados neutrófilos na lesão tecidular associada.
Adiciona-se um tampão de quimiotaxia contendo o quimioatractor fMLP (10 μΜ) a cada poço de uma placa de quimiotaxia e insere-se um filtro assegurando o contacto entre o filtro e o tampão de quimiotaxia no poço. Usa-se uma concentração sub-máxima de quimioactractor. Para a determinação da migração espontânea das células certos poços não recebem o quimioatractor, mas apenas tampão. Incubam-se neutrófilos acabados de recolher (1 x 106) com veículo (0,125% DMSO) ± composto de teste durante 1 hora a 37°C. As suspensões celulares com tratamento e controlo são então cuidadosamente ressuspendidas e adiciona-se 20 yL de células na parte superior do filtro em cada poço. A placa é incubada durante 1,5 horas a 37°C sob 5% de C02. As células são então removidas da parte superior do filtro por aspiração e a totalidade da placa é centrifugada. O filtro é removido e adicionam-se concentrações conhecidas de células aos poços não usados para preparar uma curva de calibração. Adiciona-se uma solução de XTT (Sigma; No. Catálogo X 4251)/PMS (Sigma; No. Catálogo P 7626) preparada em tampão a cada poço e as células são incubadas por mais 1-2 horas e mede-se a absorvância a 450 nm. Os valores de absorvância são convertidos em números de células usando a curva de calibração. Os valores de IC50 são médias de pelo menos três experiências separadas com determinações em triplicado. 78
Inibição da Produção de TNF-α em Linfócitos T CD4+ Humanos Primários Estimulados com Concanavalina-A
Sabe-se que linfócitos T activados produzem TNF-α e podem constituir uma fonte significativa deste mediador da inflamação em regiões localizadas da inflamação tal como o sinovial reumatóide ou as lesões psoriáticas. Os sobrenadantes de células T CD4+ humanas primárias estimuladas com conA que foram incubadas na presença ou ausência de um composto de teste, foram analisadas para TNF-α usando um sistema ELISA (Pharmigen; conjunto de anticorpos anti-TNF recomendados 18631-D e 18642-D). Foram induzidas quantidades substanciais de TNF-α em células T tratadas com veiculo estimuladas com conA.
Tal como ilustrado na Tabela 2, compostos representativos da presente invenção foram capazes de inibir fortemente a produção de TNF-α derivado de células T. Este resultado contrasta com a menor potência destes compostos na inibição da libertação de TNF-α induzida por LPS no sangue completo humano. Isto pode ser devido à diferente sensibilidade dos monócitos/macrófagos versus linfócitos T a elevações no AMPc intracelular relativamente às vias regulatórias que influenciam a produção de TNF-α. Este resultado sugere que os compostos da invenção podem ser usados no tratamento de doenças envolvendo a produção de TNF-a. TABELA 2
Efeitos dos Compostos em Teste na Produção de TNF-ot Em Células T CD4+ Humanas Estimuladas Por ConA 79
COMPOSTO NÚMERO GAMA DE IC50 TNF-cx (μΜ) <2 2,0-20 >20 54 X 55 X 62 X ROLIPRAM X ZARDAVERINE X
Inibição da Função Auxiladora de Linfócitos T Humanos
Introdução e Racional
Muitas doenças inflamatórias com uma etiologia auto-imune incluindo a artrite reumatóide e a psoriase caracterizam-se por um desequilíbrio na função das células T auxiliares de subconjuntos de linfócitos T auto-reactivos resultando na iniciação e na manutenção de um estado pro-inflamatório. Este desequilíbrio é frequentemente manifestado como uma expressão excessiva de um fenótipo Thl e/ou supressão de um fenótipo Th2. As células T que secretam IL-2 e INF-γ são designadas Thl ou células do tipo 1. Estas células estão envolvidas através de imunidade mediada por células directa pela activação de macrófagos e de vias celulares citotóxicas. As células que produzem IL-4, IL-5 e IL-10 são denominadas Th2 ou células do tipo 2 e regulam a resposta imunitária humoral. Compostos representativos da presente invenção inibiram a função Thl mais fortemente do que a função Th2 in vitro em células T CD4+ humanas primárias estimuladas com concanavalina A. Assim, estes compostos podem ter valor terapêutico por serem capazes de eliminar células Thl sem afectar as células Th2 num grau significativo resultando 80 assim numa correcção do desequilíbrio numa doença inflamatória auto-imune caracterizada por elevadas respostas Thl. 0 teste nas células T humanas primárias envolve a sua activação por concanavalina A (conA); (Sigma, No. Catálogo C 5275), seguida da detecção por ELISA de citocinas para qualquer um dos perfis. No caso dos perfis Thl, usam-se IL-2 e INF—γ como termos de comparação, enquanto que IL-10 é o indicador para o perfil Th2. Biologicamente, estes indicadores são úteis pelo facto de IL-2 ser o principal mitogénio de células T enquanto que IL-10 representa um agente imunossupressor poderoso mas selectivo. Métodos
Recolhem-se aproximadamente 60 cc de sangue humano completo em tubos do tipo "vacutainer". Separam-se em alíquotas 15 mL de Ficoll Paque 1077 em 6 tubos cónicos estéreis de 50 mL. Uma alíquota de sangue (10 mL) foi lentamente disposta numa camada no topo do Ficoll Paque mantendo o tubo na vertical e pousando a ponta da pipeta na borda interior do tubo e permitindo ao sangue correr lentamente pela parede do tubo. Os tubos foram centrifugados a 1700 rpm durante 30 minutos à temperatura ambiente. A camada de plasma acima da banda leucocitária foi removida por espiração e usou-se uma pipeta de Pasteur para levantar a banda leucocitária e transferi-la para um tubo cónico estéril de 50 mL. As células de cada tubo de gradiente de leucócitos foram transferidas para tubos cónicos de 50 mL separados. Adicionou-se PBS estéril a pH 7,4 a cada tubo cónico de 50 mL contendo células da banda de leucócitos para um volume de 50 mL. Os tubos foram centrifugados a 1100 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante 81 foi removido por aspiração e as células foram ressuspendidas e 50 mL de PBS a pH 7,4. Os tubos foram de novo centrifugados a 1100 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi removido por aspiração e as células foram ressuspendidas em meio apropriado a ma densidade de 5 x 107 células/mL ou 2 x 106 células/mL.
Preparação de Linfócitos em Bruto: Células da preparação de leucócitos foram ressuspendidas em meio BASAL (AcitCyte™) ou RPMI 1640 com 10% FBS + 2 mM glutamina a uma densidade de 1 x 106 células/mL.
Preparação de células T CD4+: Células da preparação de leucócitos foram ressuspendidas em PBS estéril a pH 7,4 suplementado com 2-6% de Soro Fetal Bovino (FBS) a uma densidade de 5 x 107 células/mL. As células estavam então prontas para serem isoladas.
Isolamento de Células T CD4+ (StemSep™) I) Marcaçao Imunomagnética:
Adicionou-se um cocktail de anticorpos (100 pL; Stem Cell Technologies, No. Catálogo 14062) para cada mL de células e misturou-se bem. Após 30 minutos de incubação em gelo, adicionou-se 60 pL de colóide magnético para cada mL de células e misturou-se bem. Após 30 minutos finais de incubação em gelo, as células estavam prontas para separação magnética. II) Procedimento de Separação (Alimentação por gravidade): 82 A amostra foi carregada para o topo da coluna. A torneira de passagem foi rodada para permitir que o meio fluísse para baixo através da coluna, e o meio foi recolhido num tubo de recolha. Adicionou-se à coluna PBS suplementado com 2-6% FBS até se terem recolhido três volumes de coluna (não incluindo o volume da amostra inicial). As células foram lavadas, contadas e ressuspendidas em RPMI 1640 com 10% FBS + 2 mM L-glutamina a uma densidade de 1 x 106 células/mL.
Procedimento de Ensaio de IL-2, IFN-γ, TNF-ot e IL-10
Isolaram-se células T CD4+ tal como descrito acima. As células foram suspendidas em meio RPMI 1640 (Stem Cell Technologies Inc.; No. Catálogo 36750) com 10% FBS +2 mM L-glutamina numa densidade de 1 x 106 células/mL. As células foram mantidas em gelo enquanto foram preparados os compostos de teste. Os compostos de teste foram preparados numa placa de ensaios de 96 poços estéril a 50X a concentração de teste desejada final; todos os poços continham uma quantidade igual de veículo dimetilsulfóxido. Adicionaram-se as células T CD4+ (500 pL) a cada poço de uma placa de ensaios de 24 poços. Adicionou-se uma única alíquota (10 pL) de cada solução de trabalho de composto de teste aos poços apropriados; dois poços foram deixados como controlos estimulado e não estimulado. Adicionou-se concanavalina A (10 pL) (50X a concentração final) a 10 pg/mL a cada poço com a excepção dos poços de controlo não estimulado. As células foram incubadas a 37°C durante 48 horas. O meio acondicionado foi então avaliado por ELISA para a quantiade de IL-2, IFN-γ, TNF-α e IL-10 presente. 83
Resultados e Discussão
As Tabelas 3A, 3B e 3C representam um resumo de dados ao longo de indivíduos relativamente à potência dos compostos da invenção na sua capacidade de inibir citocinas que são prováveis promover ou diminuir uma resposta Thl ou Th2. Nas Tabelas 3A, 3B e 3C, é observado o efeito dos compostos representativos da presente invenção na produção de IL-2, IFN-γ e IL-10 em células T CD4+ humanas periféricas estimladas com 10 yg/mL de Concanavalina A durante 48 horas. Os IC50's são médias de pelo menos três experiências separadas realizadas em triplicado. As condições para o isolamento das células T CD4 + , incubação e a detecção das linfocinas são discutidas na secção de Métodos acima.
Alguns membros desta série de compostos (em particular aqueles que inibem tanto PDE4 e PDE3) originam um perfil de citocinas de células T activadas que pode potencialmente corrigir o desequilíbrio de células Thl em relação a células Th2 observado em artrite reumatóide e outras doenças inflamatórias tais como a psoríase. A Tabela 3A apresenta exemplos de um membro desta série que demonstrou uma inibição selectiva de um perfil Thl das células seleccionadas CD4+ estimuladas com conA; em particular.
Enquanto que a potência absoluta dos compostos varia dependendo do análogo utilizado, o efeito é claramente diferente daquele apresentado por Rolipram (Sigma; Catálogo No. R 6520). Observou-se que rolipram inibe tanto a síntese de IL-2 como de IL-10 por 48 horas. Pelo contrário, a estimulação por conA de IL-10 não é inibida por vários compostos de invenção enquanto que os mesmos sobrenadantes apresentam níveis reduzidos de IL-10. A depressão de um 84 perfil de citocinas Thl irá necessitar do aumento das células Th2 no local da inflamação. 0 beneficio acrescido da inibição da produção de IL-2 poderá, sob as circunstâncias certas, tornar células T reactivas anérgicas (isto é, células T que não respondem aos seus estímulos mitogénicos usuais através de TCR no contexto de MHC II) . Alternativamente, poderá também causar a apoptose de células T auto-reactivas. Deste modo, esta propriedade de inibição de Thl, sustentando Th2 dos compostos da invenção poderia proporcionar o potencial de conseguir uma melhoria terapêutica nas doenças mediadas por Thl tais como artrite reumatóide, psoríase e doença inflamatória do intestino, entre outras doenças.
TABELA 3A
Efeito dos Compostos em Teste nos Perfis Thl em Células T CD4+ Humanas Primárias Estimuladas com Concanavalina A
GAMA DE IC50 IL-2 (μΜ) COMPOSTO 0,02-0,2 0,2-2,0 2,0-20 >20 54 X 55 X 62 X ROLIPRAM X ZARDAVERINE X 85
TABELA 3B
Efeito dos Compostos em Teste nos Perfis Thl em Células T CD4+ Humanas Primárias Estimuladas com Concanavalina A
GAMA DE ICso INF-GAMA (μΜ) COMPOSTO 0,02-0,2 0,2-2,0 2,0-20 >20 54 X 55 X 62 X ROLIPRAM X ZARDAVERINE X
TABELA 3C
Efeito dos Compostos em Teste nos Perfis Th2 em Células T CD4+ Humanas Primárias Estimuladas com Concanavalina A
GAMA DE IC50 IL-10 (μΜ) COMPOSTO 0,02-0,2 O CM 1 CM O 2,0-20 >20 54 X 55 X 62 X ROLIPRAM X ZARDAVERINE X
Sequestração de Radicais de Oxigénio
Crê-se que os oxidantes e os radicais livres produzidos por neutrófilos e outras células contribuem para a patogénese da 86 artrite reumatóide e de outras doenças inflamatórias. De forma consistente com este envolvimento, os compostos capazes de inactivar radicais livres (antioxidantes) têm actividades anti-inflamatórias na artrite reumatóide e outras doenças inflamatórias.
Compostos representativos da presente invenção inibiram a formação de radicais livres num teste in vitro convencional usado para medir a actividade antioxidante de materiais biológicos. A base do ensaio (um kit da RANDOX: Total Anti-Oxidant status) é a capacidade dos antioxidantes numa amostra em diminuir a formação de cor devido ao catião radical estável, ABTS*+. 0 cromogénio ABTS (2,2'-Azino-di-[3-etilbenztiazolina sulfonato] (Sigma; No. Catálogo A 1888)) (610 μΜ) é incubado com uma solução de substrato (peroxidase (metmioglobina) (6,1 μΜ) e H202 (250 M) ) em conjunto com um composto da invenção dissolvido em DMSO durante exactamente 3 minutos a 37°C. A produção do catião radical ABTS*+ que tem uma cor azul-esverdeada relativamente estável foi medida a 600 nM. A actividade antioxidante de 100 μΜ de composto de teste foi determinada como descrito acima. O controlo positivo usado foi um antioxidante biológico potente, Trolox® (ácido 6-hidroxi-2.5.7.8-tetrametilcroman-2-carboxílico). A inibição da formação de cor (actividade antioxidante) pelos compostos em teste é expressa em relação ao controlo positivo Trolox® (100% de inibição). Os resultados são apresentados na Tabela 4. A supressão de cor neste ensaio pode ser devida à inibição da produção de, ou à extinção do radical ABTS*+. 87 TABELA 4
Actividade Antioxidante dos Compostos
Número do Composto Gama de actividade anti-oxidante (% do controlo) 1-25 25-50 50-75 75-100 54 X 55 X
As características antioxidantes destes compostos poderia contribuir para as actividades anti-inflamatórias in vivo e ser de eficácia terapêutica em doenças inflamatórias envolvendo radicais de oxigénio. Assim, a actividade antioxidante dos compostos da invenção poderia constituir um mecanismo adicional de acção anti-inflamatória além da inibição da AMPc fosfodiesterase.
Inflamação Aguda-Edema na Orelha de Ratinho Induzida por Resiniferitoxina
Uma das caracteristicas primárias da inflamação é um aumento na dilatação e permeabilidade vascular conduzindo à extravasão de, e colecção de fluidos no, interstício resultando em vermelhão e inchaço. Em particular, a artrite reumatóide é caracterizada por um edema pronunciado das articulações afectadas resultando numa dor significativa e rigidez. 0 modelo de inflamação da orelha de ratinho é um teste in vivo convencional para inflamação que se baseia no aumento do peso da orelha que pode ser atribuído ao edema induzido por mediadores inflamatórios. RTX (resiniferitoxina; Sigma, No. Catálogo R 8756)) é um diterpeno isolado da planta
Euphorbia poisonii e é um análogo ultra-potente da 88 capsaicina. RTX actua através da estimulação selectiva de terminações nervosas nociceptivas e sensíveis ao calor em tecidos, provocando o edema neurogénico. Um composto representativo da invenção, quando administrado oralmente, inibiu o desenvolvimento do edema induzido pela aplicação tópica de RTX. 0 edema tal como induzido neste modelo é inibido por inibidores da PDE4 e é deste modo um sistema in vivo útil para a diferenciação da eficácia de compostos em teste que possuam potências in vitro comparáveis.
Separaram-se ratinhos (CD1, Charles River Laboratories) em grupos (n=5-8) e foram identificados. Para administração oral (p.o.), forneceram-se aos animais 10 mg/kg de composto de teste em 100 pL de PEG-200, e depois o edema foi induzido usando 0,1 pg/orelha RTX após um período de espera de 1,5 horas. Após a indução do edema, os ratinhos foram sacrificados, e removeu-se um disco padrão de tecido da orelha. Cada disco de tecido foi imediatamente pesado arredondando à 10a de mg. Os dados foram analisados tomando a diferença de cada orelha esquerda relativamente à orelha direita, calculando a média +/-EPM. A significância estatística foi testada por um teste-t 2 amostras nas diferenças dos pesos das orelhas esquerda/direita do grupo de controlo vs. o grupo experimental. TABELA 5
Inibição do Edema na Orelha de Ratinho Induzido pela
Resiniferitoxina pela Administração Oral de Compostos em Teste Número do Composto % Inibição do Edema 62 30 89
Inibição das fosfodiesterases dos nucleótidos ciclicos
Inibição da AMPc Fosfodiesterase 4 0 aumento de AMPc em células envolvidas na inflamação tais como neutrófilos, células endoteliais, macrófagos, eosinófilos, basófilos, linfócitos T, etc., geralmente conduz à inibição do perfil de citocinas inflamatórias tais como a inibição da expressão do factor de necrose tumoral (TNF-cx). A expressão da citocina anti-inflamatória interleucina-10 (IL-10) é regulada positivamente por AMPc em muitas células num local de inflamação. Uma vez que a degradação de AMPc na célula é realizada através de AMPc fosfodiesterases (PDEs), são de interesse inibidores específicos destas enzimas. Tais compostos teriam o efeito de elevar o AMPc intracelular nas células que expressam as isoenzimas PDE que inibem especificamente. Apesar de existirem pelo menos nove famílias diferentes de PDEs de nucleótidos cíclicos, a família das PDE4 é de particular interesse. Isto é devido ao facto de muitos dos tipos celulares típicos que participam na resposta inflamatória expressam predominantemente PDE4 relativamente às outras PDEs. Mostrou-se que os inibidores de PDE4 tal como rolipram elevam especificamente AMPs em células inflamatórias tais como neutrófilos e eosinófilos e suprimem o seu fenótipo inflamatório. Um inibidor de PDE4 terapeuticamente eficaz tem desejavelmente efeitos secundários mínimos, incluindo a indução da secreção de ácido gástrico, vómitos e efeitos no SNC. Inibidores PDE4 sem efeitos secundários prometem como uma nova geração de terapias anti-inflamatórias para doenças incluindo asma, doença inflamatória do intestino, artrite reumatóide, psoríase e transplantação alogénica, entre outras. 90
Fez-se um rastreio aos compostos desta invenção para actividade contra 5 das principais classes de fosfodiestereases de nucleótidos cíclicos de mamíferos (denominadas PDE1 a 5). As PDE' s 1 a 4 utilizam AMPc como substrato, enquanto que PDE 5 usa GMPc. A larga especificidade do inibidor de PDE 3-isobutil-metilxantina (IBMX; Sigma; No. Catálogo 17018)) foi usada como um controlo positivo em todos os ensaios. As PDE's para os vários ensaios foram parcialmente purificadas das seguintes células/tecidos; PDE1 (coração bovino), PDE2 (plaquetas humanas), PDE3 (plaquetas humanas), PDE 4 (células promonocíticas U937 humanas) e PDE5 (plaquetas humanas).
Os extractos citoplasmáticos de U937 foram preparados pela sonicação de células U937 (ATCC: No. Catálogo CRL-159) em tampão de lise (20 mM Tris Cl, 1 mM EDTA, 5 mM β-mercaptoethanol, 1 μΜ pepstatina, 1 pg/mL leupeptina, 1 mM benzamidina e 0,1 mM PMSF). Os extractos celulares sonicados foram então centrifugados a 70000 g durante 30 minutos e os sobrenadantes foram removidos. Adicionou-se sacarose a uma concentração final de 0,25 M, separaram-se alíquotas e armazenou-se a -80°C
Realizaram-se reacções PDE durante 30 minutos a 37°C em volumes de 20 pL volumes em 1 pM [3H] cAMP (Amersham sítio internet http://www.apbiotech.com), 0,5 U/mL de 5' nucleotidase (Sigma), 50 mM Tris Cl, 10 mM MgCl pH 7,5. 0 extracto U937 foi adicionado de modo que menos de 10% do substrato era consumido. O composto em teste ou o veículo foi adicionado à concentração desejada. Tipicamente, os compostos foram testados a seis diluições de 10 vezes desde 100 pM a 1 nM. As reacções foram realizadas em duplicado. As reacções foram terminadas pela adição de 200 pL de uma resina de 91 permita aniónica Dowex 1-8 400 Cl- numa razão de 1 resina: 2 metanol: 1 H2O. As amostras foram misturadas por inversão e depois deixaram-se repousar durante 2-3 horas. Uma alíquota de 65 yL foi removida, seca numa dispositivo Lumaplate (Packard; No. Catálogo 6005165) e contadas num contador de cintilações Packard (TopCount™) durante 1,5 minutos. A Tabela 6 mostra a actividade inibidora de compostos da invenção contra PDE4 isolada de uma linha celular promonocitica humana, U937. Utilizando as condições de ensaio PDE4 aqui descritas, inibidores típicos da PDE4 tais como Rolipram e Ro-20-1724 (Calbiochem: No. Catálogo 557502) originam valores IC50 em concordância com aqueles encontrados na literatura (revisão em Schudt et al., 1996). Além disso, a utilização de IBMX (Sigma; No. Catálogo 17018) que inibe as PDEs 1, 3 e 4 não mostra qualquer inibição adicional (dados não apresentados), de novo consistente com a descoberta de que a PDE predominante nas células U937 é PDE4. A inibição de PDE4 (ou mais precisamente, de isoformas específicas de PDE4) com um subsequente aumento de AMPc intracelular e da activaçao da proteína cinase A é um alvo terapêutico nas doenças inflamatórias ou auto-imunes em que as células causadoras ou os tecidos envolvidos expressam predominantemente esta isoforma PDE. Relativamente à artrite reumatóide, mostrou-se que o inibidor de PDE4 Rolipram era activo em modelos animais da doença tais como a artrite induzida por colagénio em ratazana (Nyman et al., Clin. Exp. Immunol. 105(3), 415-419,1997). 92 TABELA 6
Inibição de AMPc Fosfodiesterase 4 de Células U937 Humanas
Composto Número Gama IC5o (μΜ) 0, 1-1 1-10 54 X 61 X 62 X 55 X 227 X 228 X 229 X 230 X 231 X 232 X 233 X 234 X 235 X 236 X 237 X 238 X 239 X 261 <0,1 240 X 241 X 242 X 243 X 244 X 245 X 246 X 247 X 93
Composto Número Gama IC5o (μΜ) 0, 1-1 1-10 248 X 249 X 250 X 251 X 252 X 253 >10 254 X 255 X 256 <0, 1 257 <0, 1 258 X 259 X 260 <0,1
Inibição da AMPc Fosfodiesterase 3
Compostos da invenção foram avaliados relativamente à actividade inibidora contra PDE3 de plaquetas humanas de modo a verificar se a inibição de PDE4 e a inibição de PDE3 podiam ser separadas e também os farmacóforos necessários para cada. Inibidores combinados PDE3/4 podem ser especialmente eficazes como agentes terapêuticos em doenças em que os tipos de células causadores/envolvidos expressam tanto PDE4 como PDE3, por exemplo células T em doenças inflamatórias tais como artrite, doença inflamatória do intestino, psoríase e transplantação alogénica. Em tais doenças, inibidores combinados PDE3/4 pode ter vantagens relativamente a um inibidor PDE4 selectivo tal como o Rolipram. 94
Prepararam-se extractos de células tal como descrito acima para as células U937. 0 ensaio de PDE3 foi realizado usando extractos de plaquetas tal como descrito acima para o ensaio PDE4. As plaquetas contêm PDE2, 3 e 5. No entanto, PDE2 e 5 utilizam preferentemente GMPc, pelo que num ensaio com AMPc como substrato não são detectadas. Além disso, nas condições usadas neste ensaio, o Rolipram não tem efeito e o inibidor de PDE3 conhecido trequinsina (Calbiochem; No. Catálogo. 382425) é um potente inibidor confirmando que o ensaio é especifico para PDE3. A Tabela 7 apresenta os IC5o's para compostos da invenção para a inibição de PDE3. As actividades de PDE3 e PDE4 parecem ser separáveis e os compostos apresentam uma grande gama de selectividade para PDE4 vs. PDE3. Alguns compostos são específicos para PDE4, alguns compostos são mais potentes contra PDE4 do que PDE3, e alguns compostos têm aproximadamente a mesma potência contra PDE4 e PDE3. Deste modo, os compostos da invenção podem ser seleccionados pela sua actividade PDE4/3 para permitir a máxima potência contra diferentes tipos de células. TABELA 7
Inibição de AMPc Fosfodiesterase 3 de Plaquetas Humanas
Composto Número Gama IC50 (pM) 0, 1-1 1-10 >100 54 X 61 X 62 X 55 X 95
Composto Número Gama IC50 (μΜ) i—1 1 i—1 O 1-10 >100 227 X 228 X 229 X 231 X 255 X 256 X 257 X 259 X 260 X
Especificidade de Isozima de PDE
Os compostos da invenção podem ser testados para especificidade relativamente a isozima PDE pelo ensaio seguinte. Faz-se o rastreio aos compostos em teste (a 100 μΜ) relativamente à actividade contra PDE1, 2 e 5, usando métodos bioquímicos convencionais. O inibidor de PDE de larga especificidade 3-isobutil-l-metilxantina (IBMX) é usado como controlo positivo em todos os ensaios. As PDE's para os vários ensaios são parcialmente purificados das seguintes células/tecidos; PDE1 (coração bovino), PDE2 (plaquetas humanas) e PDE5 (plaquetas humanas).
Deslocamento do Rolipram do seu Local de Ligação com Elevada Afinidade (HARBS) na AMPc Fosfodiesterase 4
Existe uma necessidade para inibidores da fosfodiesterase 4 que não tenham efeitos indesejáveis incluindo náuseas e vómitos. Modelos animais mostraram que a sua actividade é altamente correlacionada com a capacidade de um composto em deslocar [3H]-Rolipram de um local de elevada afinidade de 96 ligação de células no cérebro e no sistema nervoso central (SNC) [Duplantier 1996, Barnette 1996]. Um ensaio de deslocamento do Local de Ligação do Rolipram com Elevada Afinidade (HARBS) é usado para prever o potencial emético de um composto da presente invenção. Compostos representativos da presente invenção apresentaram uma baixa afinidade para o confórmero HARBS de PDE4 sugerindo que estes compostos não serão susceptiveis de causar efeitos secundários associados ao mecanismo de actuação associados com inibidores PDE4 de primeira geração tais como Rolipram.
Ratinhos CD1 fêmea foram sacrificados através da injecção intraperitoneal de 100 yL de etanol, e o tecido cerebral foi homogeneizado em 5 mL de Tris-HCI gelado, pH 8,00 suplementado com 1,2 mM MgCl2, 1 mM benzamidina (Sigma; No. Catálogo B 6506) e 0,1 mM PMSF (Sigma; No. Catálogo P 7626). A suspensão foi centrifugada duas vezes a 30000 x G a 4°C e o sobrenadante foi descartado. O sedimento foi ressuspendido em tampão, e ajustado a uma concentração de proteína de 0,5 mg/mL. Os fármacos a serem testados foram dissolvidos em DMSO e pipetados em triplicado para uma microplaca de 96 poços a concentrações na gama de 1 a 30000 nM. Suplementou-se 10 mL de preparação membranar com 100 yL de 0,235 yM [3H]-Rolipram em DMSO, e dispensou-se 100 yL em cada poço da microplaca. A placa foi incubada a 4°C durante 1 hora. O conteúdo da placa foi aspirado através de uma plica filtrante Whatman GF/C, e lavado com 4x200 yL de tampão gelado. A placa foi seca durante a noite, adicionou-se 30 yL de Microscint 20 (Packard; No. Catálogo 6013621) a cada poço e a placa foi lida num contador de cintilações com um tempo de amostragem de 2 minutos/poço. Os valores representando ligação não específica (definidos por contagens usando 20 yM de Rolipram) foram subtraídos de todos os pontos. Realizaram-se 97
Os determinações em triplicado a cada concentração, resultados são apresentados na Tabela 8. PDE4: HARBS indica a razão da concentração IC50 necessária para inibir a actividade catalítica para a concentração necessária para deslocar 50% do Rolipram do local de ligação de elevada afinidade.
Nestas condições de ensaio, o Rolipram é capaz de deslocar o 3H-Rolipram de um local de ligação com elevada afinidade no cérebro de ratinho com uma IC50 de cerca de 10 nM (dados não apresentados). Assim, o Rolipram liga-se com uma afinidade 20-40 vezes mais elevada no seu local de elevada afinidade que a concentração necessária para a meia inibição máxima da actividade catalítica de PDE4. Esta afinidade preferencial para HARBS relativamente ao confórmero catalítico tem sido correlacionada com os efeitos secundários negativos da primeira geração de inibidores de PDE4; nomeadamente vómitos e efeitos no SNC.
Os dados apresentados na Tabela 8 indicam que os compostos testados são muito menos potentes na ligação a este local do que o Rolipram. Por exemplo, o Rolipram e o composto 234 têm IC50' s muito similares contra a actividade catalítica de PDE4 (280 e 250 nM respectivamente) , no entanto, as suas actividades HARBS são 10 nM e 210 nM, respectivamente. Assim, o composto 234 é aproximadamente 28 vezes menos potente que o Rolipram para interacção com o confórmero HARBS de PDE4. A razão das ICso's para PDE4catalítico relativamente a PDE4HARBS para o Rolipram e o composto 234 é 28 e 1,2, respectivamente. Esta razão para o composto 234 compara muito favoravelmente com valores apresentados para inibidores de segunda geração de PDE4 nos quais a actividade HARBS foi reduzida através de esforços SAR. Por exemplo, as razões apresentadas para SB 207499 (Ariflo) e RP 73401 (piclamilast) , dois inibidores 98 específicos de PDE4 que foram testados em ensaios de fase II para a asma são 1 e 3 respectivamente. Assim, os compostos da presente invenção podem apresentar efeitos emetogéncios in vivo que são muito inferiores aos do Rolipram, Ro 20-1724 ou outros inibidores de PDE4 de primeira geração. TABELA 8
Teste da Afinidade de Compostos para o Local de Ligaçao com Elevada Afinidade do Rolipram de PDE4 no Cérebro de Ratinhos
Composto Número Gama IC5o (μΜ) PDE4:HARBS (razão) 0,01-0,1 0, 1-1 1-10 >10 54 X >1 61 X <1 62 X >1 55 X >1 227 X <1 228 X <1 229 X <1 230 X >1 231 X <1 234 X >1 235 X >1 236 X >1 261 X >1 246 X >1 247 X >1 248 X <1 249 X <1 250 X <1 99
Composto Número Gama IC50 (μΜ) PDE4:HARBS (razão) 1—1 O 1 5-1 O O 0,1-1 1-10 >10 251 X <1 252 X <1 253 X >1 254 X <1 255 X <1 256 X >1 257 X <1 258 X >1 259 X <1 260 X <1
Potenciação da Actividade de Luciferasa com Elemento de Resposta de AMPc Induzido pela Forscolina em Células Monociticas U937 Humanas
De modo a demonstrar a capacidade dos compostos da presente invenção para elevar cAMP em células intactas, usou-se a transfecção de células com uma construção plasmídica contendo um elemento de resposta a AMPc (CRE) num promotor que controla a expressão de um gene repórter da luciferase (Stratagene; Path Detect™: No. Catálogo 219076) para permitir a monitorização com sensibilidade dos níveis intracelulares de AMPc através da detecção da produção de luz num luminómetro. O tratamento farmacológico das células transfectadas com um composto proporcionando uma combinação do inibidor PDE e agonista da adenilil ciclase (receptor ou activador intracelular) resulta nem níveis aumentados de AMPc intracelular detectáveis por intermédio de uma produção de 100 luz mais elevada. Verificou-se que PDE4 AMPc era actividade de fosfodiesterase de nucleótido cíclico predominante em células U937, e como tal este tipo de célula transfectada com a construção CRE-luciferase pode servir como um ensaio de rastreio celular conveniente para compostos com actividade de inibição da PDE 4. Assim mostrou-se que compostos da presente invenção proporcionam um aumento na expressão de luciferase em células U937 tratadas com o activador da adenilil ciclase forscolina.
As células U937 pro-monocíticas humanas foram mantidas em meio RPMI contendo 10% de FCS e 2 mM glutamato. As células U937 foram transfectadas transientemente tal como descrito em Biotechniques Vol. 17 (6): 1058, 1994. Resumidamente, as células foram crescidas em meio contendo soro até uma densidade de 5 x 106 células/mL e depois ressuspendidas em meio contendo soro a uma densidade de aproximadamente 1 x 107 células/mL. 400 pL das células foram transferidos para uma cuvete de electroporação contendo 10 pg de vector repórter (pCRE-luc) num volume de 4 0 pL H20. O ADN do vector repórter foi preparado a partir de E. coli DH5 α usando o kit de endonuclease livre de ADN (Qiagen) conforme as instruções do fabricante. As células U937 foram electroporadas à temperatura ambiente usando um electroporador BIORAD. A capacitância foi regulada para 1050 pF e a voltagem foi de 280V. A constante de tempo foi anotada após cada electroporação. As células foram então diluídas em 4 mL de meio e soro e plaquearam- se 200 pL de células por poço.
Deixou-se as células recuperar durante 16-18 horas. As células foram então tratadas com um composto de teste ou veículo na presença ou ausência de 10 pM de forscolina durante 4 horas a 37°C. 101 0 ensaio da luciferase foi realizado conforme as instruções do fabricante (Tropix). Resumidamente, as células foram centrifugadas durante 4 minutos a 1200 rpm e removeu-se o meio sobrenadante. Lisaram-se os sedimentos em 15 pL de tampão de lise (Tropix). O ensaio da luciferase foi realizado usando 10 pL de lisado celular com 10 pL de tampão A e 25 pL de tampão B. A actividade da luciferase foi obtida usando um luminómetro com um atraso de 5 segundos seguido por um tempo de leitura de 10 segundos.
Como ilustrado na Tabela 9, compostos representativos da invenção potenciam a indução da actividade da luciferase em células U937 tratadas com 10 pM de forscolina. Nenhum dos compostos de teste por si só, induziram uma actividade de luciferase significativa, indicando uma baixa actividade de adenilil ciclase basal nestas células. Este resultado demonstra que estes compostos são capazes de elevar os níveis de AMPc numa linha celular que expressa predominantemente PDE4, consistente com as observações nos ensaios enzimáticos. Existe uma larga correlação entre a actividade inibidora de PDE4 in vitro e a potência da indução da CRE luciferase. O ensaio da CRE luciferase ou suas variantes (diferentes tipos celulares ou características da construção) serve assim como um ensaio SAR celular de salvaguarda/validação para ensaios enzimáticos PDE4 in vitro para optimização da eficácia para compostos da presente invenção. TABELA 9
Potenciação da Actividade de CRE-Luciferasa por Compostos em Teste em Células U937 Co-Incubadas com o Activador da Adenilil Cilcase Forscolina 102
Composto Número Gama IC5o (μΜ) i—l 1 i—1 O 1-25 >25 54 X 61 X 62 X 55 X 227 X 228 X 229 X 231 X 255 X 256 X 257 X 259 X 260 X
Efeitos de Compostos da Invenção no Crescimento de Células Transformadas - Potenciais Actividades Anti-cancro
Introdução A linha celular derivada da leucemia mielóide humana transformada BCR-ABL, K562 (ATCC; No. Catálogo CRL 243) pode ser usada para determinar como os compostos da presente invenção afectam o crescimento de células transformadas. 0 aumento do AMPc intracelular é um modo de causar a paragem do ciclo celular ou a apoptose em diversas doenças malignas, em particular em certos casos de leucemias (por exmeplo, CLL) . Foi registado que tais mecanismos intracelulares (isto é, AMPc) originam a diferenciação de clones leucémicos indiferenciados. Em particular, mostrou-se que o aumento do 103 AMPc intracelular (usando um análogo do AMP cíclico) em células de leucemia mileóide tranformadas p210 BCR-ABL é anti-proliferativo através da inibição de uma cinase 4 dependente de ciclina e subsequente sub-expressão de c-myc. Assim, a capacidade anti-proliferativa de compostos da presente invenção em células K562 cultivadas pode ser comparada com vários inibidores da fosfodiesterase usando um ensaio de assimilação de 3H-timidina. Métodos Células K562 (células de leucemia mielogénica crónica humana) (90 pL) são inoculadas em placas de ensiao de 96 poços a uma densidade de 1 x 105 células/mL em RPMI 1640 suplementado com 10% FBS/2 mM L-glutamina. As amostras a serem testadas são preparadas em placas de ensaio de 96 poços a lOx a concentração final desejada. Todas as diluições das amostras contêm quantidades iguais de DMSO para compensar para a %DMSO da maior concentração de amostra usada. São examinadas nove concentrações de composto em teste para efeitos no crescimento até uma concentração máxima de 100 μΜ. Adicionam-se 10 pL das amostras e dos controlos (DMSO/controlo de crescimento normal) às células aliquotadas. As células são incubadas a 37°C/ 5% C02 durante 48 horas. Após a incubação de 48 horas, adiciona-se 20 pL de 3H-timidina a cada poço para uma concentração final de 1 pCi/mL. As células são então incubadas a 37°C/5% C02 durante 4 a 6 horas. Após um pulso de timidina de 4-6 horas, as placas são envolvidas em plástico e congeladas a -20°C durante a noite num congelador ventilado. As células são recolhidas e são determinadas contagens de 3H-timidina. De modo a distinguir entre actividade citotóxica e citostática, são preparadas curvas de crescimento em que o valor CPM médio da densidade de inoculação das células é 104 representado na mesma curva que o valor CPM médio para a proliferação máxima atingida após 48 horas (células de controlo de crescimento com DMSO). As células são diluídas 1:2 para uma concentração de 7,8 x 103 células/mL a 2 x 106 células/mL. Inocula-se 90 pL de cada diluição celular numa placa de ensaios de 96 poços e deixa-se equilibrar durante aproximadamente 4 horas a 37°C/5% C02 antes do pulso de 3H-timidina. As células K562 são inoculadas em placas de 96 poços a 1 x 105 células/mL em RPMI 1640 suplementado with 10% FBS/2 mM L-glutamina . Adicionam- se várias concentrações de composto em teste ou veículo (DMSO) e as células são incubadas a 3 7 °C/5% C02 durante 48 horas. As células são então pulsadas a 37°C/5% C02 durante 4 a 6 horas com 1 pCi/mL 3H-timidina. A radioactividade incorporada no ADN é determinada após se recolher em filtros de fibras de vidro e contagem de cintilações.
Eficácia em Modelos Animais Específicos de Doença
Inflamatória e Auto-imunidade
Os estudos de prova de conceito em modelos de doença específicos foram realizados em animais para demonstrar de forma suplementar a actividade enzimática, celular e anti-inflamatória geral dos compostos lactona e lactama da presente invenção. Os estudos da literatura mostraram que a elevação de cAMP intracelular através da administração de inibidores de fosfodiesterase, activadores da adenilil ciclase, ou ambos, pode reduzir a doença estabelecida e/ou prevenir o desenvolvimento da doença em vários modelos animais de doença inflamatória. A eficácia dos compostos da invenção pode ser demonstrada em modelos animais da doença de Crohn, da artrite reumatóide e da rejeição de transplante. Relativamente à doença de Crohn, pode ser usado um modelo 105 colite pré-clínico estabelecido; colite induzida pelo ácido trinitrobenzenossulfónico (TNBS) na ratazana. Para artrite reumatóide, pode-se utilizar a artrite induzida por colagénio (CIA) no ratinho. Para mimetizar a rejeição de transplante humana, pode ser usado um modelo murino de transplantação de aloenxerto da pele da cauda.
Doença Inflamatória do Intestino (Doença de Crohn) A doença inflamatória do intestino (IBD) é um termo para doenças inflamatórias flutuantes, crónicas, presentemente incuráveis do tracto gastrointestinal, incluindo a doença de Crohn e a colite ulcerosa. Sintomas destes distúrbios incluem dor abdominal (geralmente no lado inferior direito do abdómen) e diarreia com sangramento rectal, perda de peso e febre à medida que a doença progride. A etiologia da IBD é desconhecida, no entanto estudos epidemiológicos sugerem uma associação entre a doença a infecção virai (particularmente sarampo) in utero ou cedo na vida. A Crohn's and Colitis Foundation of America (CCFA) estima que 1-2 milhões de pessoas nos Estados Unidos sofrem da doença de Crohn e IBD's relacionadas sendo que aqueles de descendência Europeia com risco acrescido. Os níveis de incidência aumentaram significativamente nos 60 anos desde que foi descrita (Crohn) pela primeira vez. Apenas nos Estados Unidos, os custos económicos destas doenças são estimados em 1,8-2,6 mil milhões de dólares por ano. O tratamento comum para IBD consiste na administração oral ou
intra-colónica de ácido 5- aminossalicílico (5-ASA), um derivado NSAID que é clivado em ASA (o fármaco activo) no tracto g.i. inferior. Outros tratamentos principais de IBD incluem corticoesteróides e imunossupressores (por exemplo, 106 6-mercaptopurina ou azatioprina) ou suas combinações. Recentemente, foi aprovada terapia anti-TNF-α para o tratamento de doença de Crohn grave que é resistente às terapias convencionais. Esta abordagem terapêutica valida a importância do factor de necrose tumral em IBD. Mesmo com as abordagens anti-TNF-α existe muito espaço para melhoria nas actuais modalidades de tratamento tanto do ponto de vista dos efeitos secundários como da eficácia. azatioprina) ou suas
Os compostos da presente invenção podem ser testados no modelo de colite induzida pelo ácido trinitro- benzenossulfónico (TNBS) na ratazana (Morris et al.,
Gastroenterology 96: 795-803,1989; Kim, H.-S. e Berstad, A.,
Scandinavian Journal of Gastroenterology 27: 529-537, 1992;
Ward, Lancet ii: 903-905, 1977; e Shorter et al., Am. J. Dig. Dis. 17: 1024-1032,1972)). As vantagens deste modelo de IBD particular incluem (a) o desenvolvimento da doença na ratazana é mediado pelo sistema imunitário em que as células T Thl desempenham um papel importante tal como se pensa ser o caso na doença humana, (b) uma única instilação de TNBS induz a doença com persistência e gravidade consistentes (c) o modelo é barato, (d) longa duração da inflamação (até 8 semanas), (e) uma variante do modelo na qual a colite é reactivada mimetiza a natureza reincidente da doença humana, (f) as lesões são histopatologicamente similares àquelas em humanos (g) a patologia clínica mimetiza as doenças humanas, tais como necrose, formação de úlceras, infiltração granulocítica, edema do intestino, diarreia e adesões, e (h) muitos fármacos usados para tratar IBD são activos no modelo TNBS. O modelo de ratazana de TNBS da inflamação gastrointestinal é um modelo pré-clínico aceite para IBD humana. As manifestações clínicas e histopatológicas da doença apresentam uma boa similaridade com a doença humana e 107 muitos fármacos actualmente usados para o tratamento de IBD em humanos têm eficácia neste modelo. A eficácia de um composto da invenção neste modelo implicaria que o composto poderia ser usado em terapia da doença inflamatória do intestino, incluindo doença de Crohn e colite ulcerosa, entre outras.
Artrite Reumatóide
Introdução e Racional 0 modelo de artrite induzida pelo colagénio (CIA) em ratinhos é um modelo adequado para avaliar potenciais fármacos activos na artrite reumatóide humana (Trentham, D. E., Arthritis Rheum. 25: 911-916, 1982; Brahn, E., Clin. Orthop. 265: 42- 53, 1991; Holmdahl, R. et al., Arthritis Rheum. 29: 106, 1986). Partilha muitas das alterações moleculares, celulares e histopatológicas identificadas como caracteristicas da doença humana; esteas incluem (a) proliferação pronunciada de células compreendendo a membrana sinovial das articulações, (b) formação de um tecido invasivo semelhante a um pano, (c) infiltração de macrófagos, granulócitos e linfócitos e (d) destruição do osso e da cartilagem. Tal como a artrite reumatóide, os animais com CIA apresentam elevados niveis no soro de complexos de imunoglobulina tais como o factor reumatóide (RF) e anticorpos anti-colagénio e citocinas inflamatórias na região sinovial tais como o factor de necrose tumoral (TNF-α). Além disso, o envolvimento da activação/expansão clonal das células T auxiliares restritas à MHC de classe II na região sinovial foi demonstrada. Radiografias de articulações afectadas mostram alterações erosivas similares àquelas observadas em humanos com AR e a artrite progressiva resulta frequentemente numa deformação e 108 disfunção da articulação semelhante a AR. Além disso, muitos compostos que reduzem os sintomas da doença humana tais como biológicos anti-TNF, corticoesteróides e DMARDS são eficazes neste modelo animal. 0 desenvolvimento/progressão da doença no modelo CIA ocorre tanto na fase imune (precoce) como na fase inflamatória permitindo assim a avaliação de uma larga gama de fármacos com diversos modos farmacológicos de acção.
Rejeição de Transplante
Testes In Vitro: Activação, Diferenciação e Função de Células T CD4+: Métodos
Os ratinhos transgénicos AND-TCR (Kaye J. et al., Nature 341: 746-749, 1989) são usados para proporcionar uma fonte de células T CD4+ especificas de antigénio naive. 0 receptor antigénico de célula T-AND reconhece um péptido derivado do citoromo C de pombo (pcc) no contexto da molécula MHC de classe II I-Ek.
Para examinar o papel de um composto de teste na activação e proliferação de células T CD4+ naive, cultivam-se 1 x 105 células T do nódulo linfático AND com 1 x 106 células de baço B10.BR irradiadas na presença de várias concentrações do péptido pcc (0-10 μΜ) em placas de 96 poços. A proliferação é avaliada pela incorporação de 3H timidina. Todas as condições dos ensaios são realizadas em triplicado. O fenótipo de activação da superfície celular das células T é avaliado por análise de citometria de fluxo. 109 A diferenciação de células T CD4+ para as linhagens Thl e Th2 é realizada como se segue: cultivam-se 1 x 105 células T do nódulo linfático AND com 107 células de baço B10.BR irradiadas em 2 mL de meio de cultura com os seguintes suplementos: para diferenciação de células Thl, 100 U/mL IFN- Y, 25U/mL IL-2 e 10 yg/mL anti-IL-4; para diferenciação de células Th2, 150 U/mL IL-4, 25 U/mL IL-2 e 10 yg/mL anti-IFN-cx.
Após 3-4 dias os poços são divididos 1:4 com as mesmas adições. Após 7 dias as células são recolhidas e lavadas 3 vezes para remover citocinas nos sobrenadantes. As células cultivadas (1 x 105) são reestimuladas com 5 x 105 células de baço B10BR irradiadas na presença de 5 yM de péptido pcc em 250 yL de meio de cultura sem qualquer adição de citocinas. Os sobrenadantes são recolhidos após 40 horas e avaliados para IL-2, IL-4 e IFN-γ por ELISA. Os compostos de teste são adicionados ao longo da diferenciação da cultura.
As células cultivadas Thl e Th2 geradas na ausência dos compostos de teste são testadas relativamente à proliferação e actividade de citocinas, tal como descrito acima durante estimulação antigénica na presença de composto.
Testes In Vitro: Activação, Diferenciação e Função de Células T CD8+: Métodos
Os ratinhos transgénicos 2C-TCR (Sha W. C. et al., Nature 335: 271-274, 1988) são usados para proporcionar uma fonte de células T CD8+ especificas de antigénio naive. O receptor antigénico de célula 2C-T reconhece um péptido 2C derivado da enzima alfa-cetoglutarato desidrogenase mitocontrial no contexto da molécula MHC de classe I Db. 110
Para testar a eficácia de um composto de teste na activação e proliferação de células T CD8+ naive, isolam-se suspensões de células isoladas de células T do nódulo linfático (LN) 2C a partir dos ratinhos transgénicos 2C-TCR. As células 2C-T são estimuladas com esplenócitos TAP-/- H-2d irradiados ou a linha celular T2 TAP-/- transfectada com Ld na presença de várias concentrações do péptido 2C (0-10 μΜ) . A proliferação é avaliada pela incorporação de 3H timidina. O fenótipo de activação da superfície celular das células T é avaliado por análise de citometria de fluxo.
As células T citotóxicas são geradas pela activação das células 2C-T com esplenócitos H-2d. As células são cultivadas durante 7-10 dias na presença de 25 U/mL IL-2. A actividade citotóxica letal das culturas é testada com um ensaio de lobertação de Cr51 usando células alvo T2-Ld na presença de diversas concentrações do péptido 2C. O efeito dos compostos na diferenciação de células T CD8+ naive em células letais citotóxicas, é avaliada pela adição dos compostos de teste durante a activação primária e o período de cultura. 0 efeito dos compostos de teste na activação de células T CD8+ citotóxicas e na função efectora é medio usando o ensaio de libertação de Cr51 e o ensaio de incorporação de 3H timidina na presença das referidas concentrações do composto.
Teste In Vivo: Modelo Murino de Transplantação de Aloenxerto da Pele da Cauda O composto 54 foi avaliado no seguinte modelo de transplantação in vivo. 111 Métodos A pele da cauda de ratinhos dadores H-2b C57BL/6 foi transplantada para ratinhos fêmea receptores H-2d BALB/c (Lagodzinski, Z. et al., Immunology 71: 148-150 (1990)).
Foram incluídos por grupo cinco ratinhos. Foram incluídos no estudo sete grupos de ratinhos consistindo em quatro grupos de teste tratados com o composto de teste e três controlos que incluem grupos não tratados, tratados apenas com veiculo e tratados com ciclosporina A (CsA; Sigma; No. Catálogo C 3662) . O composto do teste e CsA foram administrados duas vezes por dia por via intraperitoneal a uma dose de 10 mg/kg com início no primeiro dia antes da transplantação e durante 15 dias após a transplantação, incluindo o dia da transplantação. Os ratinhos foram monitorizados e pontuados diariamente ao longo de 15 dias após transplantação para rejeição de enxerto.
Resultados e Discussão A rejeição do aloenxerto de pele é primeiramente mediada por linfócitos T com pouca evidência de um papel significativo de anticorpos na maioria das circunstâncias. A rejeição do aloenxerto de pele requer a activação das populações de células T efectoras citotóxicas e auxiliares. A rejeição do enxerto foi avaliada através da monitorização da necrose do aloenxerto. Uma vez que a pele da cauda é visivelmente distinta da pele do tronco do ratinho que a rodeia, o decurso da rejeição pode ser facilmente monitorizado. Os enxertos completamente intactos receberam uma pontuação de 100%. A rejeição completa foi definida como uma necrose do enxerto de >90%. Uma rejeição aguda do enxerto geralmente ocorre através de uma série de acontecimentos visualmente óbvios, começando 112 com inchaço e eritema do enxerto. Estes acontecimentos são seguidos por uma dessecação do enxerto e formação de crosta sobre a maioria ou a totalidade do enxerto, sinalizando a perda de tecido do enxerto viável. A formação de crosta é subsequentemente seguida por um encolhimento e formação de cicatriz.
Um composto representativo da invenção, Composto 54, demonstrou uma melhoria significativa na sobrevivência do enxerto quando comparado com o grupo controlo (veiculo apenas, β-ciclodextrina; Sigma; No. Catálogo C 4767) (Tabela 10) . TABELA 10
Efeito dos Compostos na Rejeição de Enxerto num Modelo de Transplantação Murino da Pele da Cauda
Composto Sobrevivência média do enxerto (dias) Taxa de sobrevivência do enxerto (% 9 dias após o transplante) # de enxertos que sobrevivem após 16 dias p.t. Não tratado 8 ± 1 0 0 Veiculo 8,5 ± 1 0 0 Rolipram 11,5 ±3,7 50 1 Ciclosporina 13,5 ± 3,3 75 2 54 11,5 ± 3,3 75 0 O grupo de controlo teve uma média de 8,5 dias de sobrevivência dos aloenxertos de pele enquanto que os grupos tratados com o composto 54 apresentaram uma sobrevivência de 11,5 dias. Por comparação com a Ciclosporina A, os compostos da invenção, dos quais o composto 54 é representativo, podem 113 também ser usados em todas as indicações em que a Ciclosporina A é usada. As actividades diferenciais destes compostos assim como a sua selectividade nas citocinas inibidas sugere um mecanismo que não resulta em imunossupressão mas sim imunomodulação. A capacidade do composto 54 em suprimir a rejeição de aloenxerto neste modelo implica que podem ser de utilidade terapêutica em doenças tais como esclerose múltipla, doença inflamatória do intestino, artrite reumatóide, psoríase, transplantação de órgãos e todas as doenças auto-imunes. Por exemplo, muitos fármacos para o tratamento de psoríase são usados na transplantação de órgãos ou demonstraram eficácia nessa utilização. Assim, a eficácia dos fármacos imunomoduladores ou imunossupressores na transplantação de órgãos parece ser preditiva da eficácia na psoríase, augurando boas possibilidades para esta série de compostos como uma terapia para a psoríase. 04-04-2013 114

Claims (13)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um composto da fórmula:
    em que: o azoto na posição 1 é substituído por hidrogénio; posições 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11 e 18 são substituídas por hidrogénio; posições 17 e 19 são substituídas por OR8 onde R8 é um grupo hidrocarbilo Ci_i0; cada um dos carbonos nas posições 5, 13, 15 e 16 é independentemente substituído em cada ocorrência por H, -w ou -R7(W)n, em que: W é seleccionado de -NH2 , -CN, -X, -OH, -N02, -SH, - NHR8, -NR8R8, -OR8 e -SR8, cada R7 é independentemente um grupo hidrocarbilo C1-C30, halocarbilo ou hidrohalocarbilo em que n dos átomos de hidrogénio ou halogéneo de R7 são substituídos por um número igual de grupos W independentemente selecionado em cada lugar; cada R8 é independentemente um grupo hidrocarbilo C1-C30, halocarbilo ou hidrohalocarbilo; n é selecionado de 0, 1, 2, 3, 4 e 5; e X é selecionado de -Br, -Cl, -F e -I; 1 onde a posição 12 é substituída por hidrocarbilo Ci-6 ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato do mesmo, como um único estereoisómero ou mistura deste.
  2. 2. 0 composto de acordo com a reivindicação 1 em que: exactamente dois dos carbonos nas posições 11, 12 e 13 são substituídos por hidrogénio; W é -0R8 ; R7 é um grupo hidrocarbilo Ci-Cio em que n dos átomos de hidrogénio ou halogéneo de R7 são substituídos por um número igual de grupos W independentemente selecionados em cada lugar; R7 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo substituído por alcenilo, alcenilo substituído por arilo, arilo substituído por alcinilo, alcinilo substituído por arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, bicicloalquilo, bicicloalcenilo, alquilcicloalquilo, alcenilcicloalquilo, alcinilcicloalquilo, cicloalquilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalquilo, cicloalcenilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalcenilo, cicloalquilo e policicloalquilo fundido com arilo; R8 é um grupo hidrocarbilo Ci-Cio; R8 é um grupo ciclohidrocarbilo Ci-Cio; R8 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo substituído por alcenilo, alcenilo substituído por arilo, arilo substituído por alcinilo, alcinilo substituído por arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, bicicloalquilo, bicicloalcenilo, alquilcicloalquilo, alcenilcicloalquilo, alcinilcicloalquilo, cicloalquilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalquilo, cicloalcenilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalcenilo, cicloalquilo e policicloalquilo fundido com arilo; 2 n é Ο; ο composto tem uma configuração S no carbono 3; o composto tem uma configuração R no carbono 3; o composto tem uma configuração S no carbono 5; o composto tem uma configuração R no carbono 5; posições 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 15, 16 e 18 são substituídas por hidrogénio; a posição 12 é substituída por hidrocarbilo Ch; a posição 17 é substituída por -O-ciclopentilo; e a posição 19 é substituída por -O-metilo onde ambas as posições 3 e 5 tem facultativamente a estereoquímica S.
  3. 3. O sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do composto de acordo com a reivindicação 1.
  4. 4. 0 composto:
    3
    ΉΗ
    Ο
    4
  5. 5 ο
    ο
    6
    Ο Ο
    Ο ·:
    5 ο
    ο
    6
    Ο Ο
    Ο ·:
    7 ο
    8
    ο
    9
    ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato dos mesmos. 5. 0 composto de acordo com a reivindicação 4, em que o composto é: 10
    ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
  6. 6. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto de qualquer uma das reivindicações 1-5 ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato do mesmo, e um veiculo farmacêuticamente aceitável, diluente ou excipiente.
    7. Utilização de um composto de qualquer uma das reivindicações 1-5, ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato do mesmo, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um estado inflamatório ou doença num paciente.
    8. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato do mesmo, na preparação de um medicamento para a modulação dos niveis de adenosina 5'-monofosfato cíclica intracelulares num paciente.
    9. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, ou um sal farmacêuticamente aceitável ou 11 solvato do mesmo, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença ou estado num paciente, onde a doença ou estado está associado a condições patológicas que são moduladas por inibição de enzimas associadas a mensageiros celulares secundários.
    10. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato do mesmo, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de rejeição de transplante num paciente.
    11. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato do mesmo, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de proliferação celular descontrolada num paciente.
    12. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato do mesmo, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de estados associados ao sistema nervoso central (CNS) num paciente.
    13. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato do mesmo para utilização no tratamento ou prevenção de uma doença ou estado como reivindicado na reivindicação 7, 9 ou 12, para a modulação dos níveis de adenosina 5'-monofosfato cíclica intracelulares num paciente tal como reivindicado na reivindicação 8, para o tratamento ou prevenção de rejeição de transplante como reivindicado na reivindicação 10, ou para o tratamento ou prevenção de proliferação celular descontrolada como reivindicado na reivindicação 11. 12 04-04-2013 13 RESUMO Δ-LACTAMAS γ-FENIL-SUBSTITUÍDAS E UTILIZAÇÕES RELACIONADAS γ-Fenil Δ-Lactamas-substituídas são reveladas. Podem ser formuladas em composições farmacêuticas e /ou utilizadas para o tratamento ou prevenção de inflamação ou outras condições ou estados de doença.
    DESCRIÇÃO Δ-LACTAMAS γ-FENIL-SUBSTITUÍDAS E UTILIZAÇÕES RELACIONADAS CAMPO TÉCNICO Esta invenção refere-se a compostos de Δ-lactama, e em particular a Δ-lactamas γ-fenil-substituidas, e a utilizações terapêuticas a elas relacionadas. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A Resposta Inflamatória (Inflamação) A inflamação é uma resposta do hospedeiro localizada a microrganismos invasores ou lesões nos tecidos que envolvem células do sistema imunitário. Os sinais clássicos de inflamação incluem rubor (eritema), inchaço (edema), dor e aumento da produção de calor (pirema) no local da lesão. A resposta inflamatória permite ao corpo reconhecer de forma especifica e eliminar um organismo invasor e/ou reparar uma lesão num tecido. Muitas das alterações agudas no local da infamação podem ser directamente ou indirectamente atribuídas ao influxo maciço de leucócitos (por exemplo, neutrófilos, eosinófilos, linfócitos, monócitos) que é intrínseco a esta resposta. A infiltração e acumulação leucocitica nos tecidos resulta na sua activação e subsequente libertação de mediadores inflamatórios tais como LTB4, prostaglandinas, TNF-oí, IL-Ιβ, IL —8, IL-5, IL-6, histamina, proteases e espécies reactivas de oxigénio, por exemplo. A inflamação normal é um processo altamente regulado que é estreitamente controlado a vários niveis para cada um dos tipos de células envolvidos na resposta. Por exemplo, a expressão da citocina pro-inflamatória TNF-oí é controlada ao 1 nível da expressão génica, tradução, modificação pós-tradução e libertação da forma madura da membrana celular. Muitas das proteínas cuja expressão é aumentada durante a inflamação são controladas pelo factor de transcrição, NF-κΒ. As respostas pró-inflamatórias são normalmente contrariadas por mecanismos anti-inflamatórios tais como a geração de IL-10 ou IL-4. Uma característica da resposta inflamatória normal é que tem uma natureza temporária e é seguida por uma fase de resolução que leva o estado do tecido de volta para o seu estado anterior. Pensa-se que a fase de resolução envolve o aumento da expressão de mecanismos anti-inflamatórios, tais como IL-10, assim como a inibição da expressão de processos pro-inflamatórios. Doença Inflamatória A doença inflamatória ocorre quando uma resposta inflamatória é iniciada que não seja apropriada ou não se resolva do modo normal mas pelo contrário persista e resulte num estado inflamatório crónico. A doença inflamatória pode ser sistémica (por exemplo, lúpus), ou localizada em tecidos ou órgãos particular e exerce um enorme peso pessoal e económico na sociedade. Exemplos de algumas das doenças inflamatórias mais comuns e problemáticas são a artrite reumatóide, a doença inflamatória do intestino, a psoríase, a asma, o enfisema, a colite e a lesão de isquemia-reperfusão. Um tema subjacente comum na doença inflamatória é uma perturbação da resposta imunitária celular que resulta no reconhecimento de proteínas do hospedeiro (antigénios) como estranhas. Assim, a resposta inflamatória torna-se mal direccionada para tecidos do hospedeiro com células efectoras a se direccionarem contra órgãos ou tecidos específicos 2 resultando frequentemente em danos irreversíveis. 0 aspecto de auto-reconhecimento da doença auto-imune é frequentemente reflectido pela expansão clonal de subconjuntos de células-T caracterizados por um subtipo particular de receptor de célula T (TCR) no estado de doença. A doença inflamatória é também frequentemente caracterizada por um desequilíbrio nos níveis de subconjuntos de células T auxiliares (Th) (i.e., células Thl vs. células Th2). As estratégias terapêuticas destinadas à cura de doenças inflamatórias geralmente pertencem a uma de duas categorias: (a) inibição dos processos que são sobre-expressos no estado de doença ou (b) estimulação das vias anti-inflamatórias nas células ou nos tecidos afectados. A maioria dos regimes actualmente utilizados na prática clínica caem na primeira categoria. Alguns exemplos dos quais são corticoesteróides e fármacos não esteróides anti-inflamatórios (NSAIDs). Muitos dos processos nos tecidos, celulares e bioquímicos que são perturbados na doença inflamatória foram elucidados e isto permitiu o desenvolvimento de modelos experimentais ou testes para mimetizar o estado de doença. Estes testes in vitro permitem a selecção e o rastreio de compostos com uma elevada probabilidade de eficácia terapêutica na doença inflamatória relevante. Assim, os testes actualmente utilizados para modelar a importância dos leucócitos activados no desenvolvimento da inflamação aguda e na manutenção do estado crónico de inflamação são ensaios que monitorizam a quimiotaxia dos leucócitos e a desgranulação celular e síntese de citocinas e ensaios de produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS) in vitro. Uma vez que um resultado da activação aguda ou crónica de neutrófilos é a libertação de ROS com resultantes danos nos tecidos, um 3 ensaio para sequestradores de ROS permite a detecção de compostos com potencial eficácia terapêutica. Os ensaios celulares para detectar inibidores da libertação de TNF-α de células estimuladas de macrófagos ou monociticas são uma componente importante de um modelo in vitro para inflamação uma vez que existe uma sobre-expressão desta citocina e verificou-se que contribui para a patologia em muitas doenças inflamatórias. Uma vez que se mostrou que um aumento de cAMP em células afectadas modula ou diminui a resposta inflamatória, a monitorização dos niveis celulares de AMP cíclico (cAMP) e a actividade das vias que controlam os níveis de cAMP permite a detecção de potenciais compostos anti-inflamatórios. Os ensaios podem incluir a monitorização do nível do próprio cAMP, da actividade da fosfodiesterase, ou alterações no elemento da actividade da (CRE-luciferase) de resposta ao cAMP. Artrite Reumatóide A artrite reumatóide (RA), a forma mais comum de artrite inflamatória, é um distúrbio auto-imune de etiologia desconhecida que afecta 1% da população adulta e caracteriza-se por uma sinovite (inflamação do revestimento sinovial das articulações) erosiva, crónica, simétrica e com um frequente envolvimento multissistémico. De forma interessante, é 3-6 vezes mais prevalente nas mulheres que nos homens. A maioria dos pacientes apresentam uma evolução flutuante da doença que, se não for tratada, resulta na destruição progressiva da articulação, deformação, incapacidade e morte prematura. Os sintomas indicativos da RA incluem dor e inchaço das articulações (geralmente simétrico), rigidez matinal das articulações e dos músculos, fraqueza/fadiga geral e febre e perda de peso. A RA resulta em mais de 9 milhões de consultas 4 médicas e mais de 250000 hospitalizações por ano nos EUA em cada ano. Afecta frequentemente pacientes nos seus anos mais produtivos e, como tal, a incapacidade resulta em perdas económicas significativas. Descobertas recentes estabeleceram que os antecedentes genéticos, especialmente a estrutura dos genes de histocompatibilidade major (MHC) da classe II, desempenha um papel crítico na susceptibilidade de um indivíduo e na gravidade da doença. O conhecimento actual das redes de citocinas, quimioicnas, factores de crescimento e moléculas de adesão levou a se verificar que as vias dependentes das células T e independentes das células T contribuem para a iniciação e perpetuação da artrite reumatóide. Além disso, aprendeu-se muito sobre os acontecimentos celulares e bioquímicos específicos responsáveis pela destruição óssea e das cartilagens que caracteriza este distúrbio. Ao nível dos tecidos, a RA caracteriza-se pela hiperplasia sinovial, hipertrofia, angiogénese e ligação e invasão de fibroblastos sinoviais para a cartilagem e os ossos adjacentes. Na RA activa existem niveis acrescidos de citocinas pro-inflamatórias TNF-α, IL-1 e IL-6 em relação às citocinas anti-inflamatórias nas articulações afectadas. Tratamentos Actuais para Artrite Reumatóide e Outras Doenças Inflamatórias Actualmente não existe cura ou prevenção (profilaxia) disponível para a artrite reumatóide, apenas regimes que abordam sintomas tais como dor e rigidez. As cinco principais modalidades de tratamento para esta doença incluem medicação (farmacológica) , física (exercício), protecção das articulações e alterações de estilos de vida e cirurgia. 5 A terapia para a artrite reumatóide pode ser dividida em três grupos: fármacos não esteróides anti-inflamatórios (NSAIDs), fármacos anti-reumáticos modificadores da doença (DMARDs) também conhecidos como agentes de segunda linha e corticoesteróides. Os NSAIDs reduzem a dor a baixas doses e aliviam alguns dos sintomas inflamatórios (inchaço e rigidez) a doses mais elevadas através da inibição da síntese da prostaglandina. Exemplos de NSAIDs que não carecem de prescrição incluem o ácido acetilsalicílico (ASA®, Aspirina®, Anacin®, etc.) e ibuprofeno (Motrin®, Advil®, etc) . Exemplos de NSAIDs que carecem de prescrição incluem Naprosyn®, Relafen®, Indocid®, Voltaren®, Feldene® e Clinoril®. Apesar destas medicações atacarem de forma eficaz a componente inflamatória aguda da artrite reumatóide, apenas tratam os sintomas e não alteram a progressão da doença subjacente. Os efeitos secundários prejudiciais dos NSAIDs podem ser sérios com a administração prolongada e são sobretudo gastrointestinais (azia, sangramento e úlceras). Os DMARDs são frequentemente receitados se a inflamação persiste durante mais de 6 semanas ou quando a artrite afecta várias articulações em simultâneo. São geralmente administrados além de um NSAID ou esteróide. Vários DMARDs funcionam através da supressão das células imunitárias envolvidas na resposta inflamatória permitindo assim travar a progressão da doença. No entanto, são incapazes de reverter danos permanentes nas articulações. Os fármacos mais comuns desta classe são sais de ouro, metotrexato, azatioprina, sulfasalazina, hidroxicloroquina, penicilamina e cloroquina. Os DMARDs mutas vezes levam várias semanas para que se observem os efeitos benéficos e em muitos casos o modo exacto 6 de eficácia na artrite reumatóide é desconhecido. Os efeitos secundários são numerosos incluindo inflamações na boca, erupções, diarreia e náuseas. Efeitos secundários mais sérios que carecem de uma monitorização cuidadosa através de testes regulares ao sangue e à urina incluem danos no fígado e nos rins, uma diminuição excessiva na contagem de glóbulos brancos (supressão imunitária) e na contagem de plaquetas (coagulação do sangue). Os corticoesteróides são frequentemente prescritos em pacientes com RA com inflamação extrema acompanhada por dor aguda, inchaço e rigidez das articulações. São também usados para tratar a artrite reumatóide sistémica que pode afectar o revestimento dos pulmões e dos vasos sanguíneos. A via de administração é geralmente oral (i.e. prednisona) mas o fármaco pode também ser injectado directamente na articulação, veia, músculo ou local alternativo afectado pela inflamação. Os efeitos secundários da utilização prolongada de esteróides na artrite reumatóide são sérios e incluem cataratas, elevada pressão sanguínea, perda de massa muscular, nódoas negras, adelgaçamento da pele e dos ossos, aumento de peso, diabetes e susceptibilidade a infecções. Mesmo se apenas 5% dos pacientes diagnosticados com artrite reumatóide desenvolverão um grau mais grave da doença (envolvendo a debilitação e danos irreversíveis das articulações) estes certamente não têm um conjunto de terapias ideal disponível para gerir de forma satisfatória e/ou curar a doença. Os NSAIDs actualmente disponíveis (mesmo inibidores COX-2 selectivos) podem melhorar com sucesso os sintomas agudos da artrite reumatóide tais como o inchaço, a dor e a rigidez das articulações. No entanto, não afectam ou a progressão da destruição das articulações ou não conseguem qualquer inversão na erosão articular ou óssea. Fármacos de 7 segunda linha, tais como DMARD's ou corticoesteróides podem temporariamente atrasar a progressão da doença e reduzir os sintomas, mas geralmente sofrem de um perfil de efeitos secundários inaceitável ou uma resposta de pacientes variável e não podem inverter os danos existentes nas articulações. Existe uma necessidade significativa para agentes terapêuticos que param ou revertem de forma irreversível a progressão da doença na artrite reumatóide. WO00/14083A apresenta γ-fenil-A-lactonas e seus análogos, com utilizações farmacêuticas a elas relacionadas. RESUMO DA INVENÇÃO Num aspecto, a presente invenção proporciona compostos com a fórmula seguinte:
    em que: o azoto na posição 1 é substituído com hidrogénio; as posições 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11 e 18 são substituídas com hidrogénio; as posições 17 e 19 são substituídas com OR8 em que R8 é um grupo hidrocarbilo Ci-io; cada um dos carbonos nas posições 5, 13, 15 e 16 é -W ou independentemente substituído em cada ocorrência com H, -R7(W)n, em que: 8 W é seleccionado de -NH2, -CN, -X, -OH, -N02, -SH, -NHR8, -NR8R8, -OR8, e -SR8; cada R7 é independentemente um grupo hidrocarbilo, halocarbilo ou hidro-halocarbilo Ci-C30 em que n dos átomos de hidrogénio ou halogéneo de R7 são substituídos por um número igual de grupos W independentemente seleccionados em cada localização; o cada R e mdependentemente um grupo hidrocarbilo, halocarbilo ou hidro-halocarbilo C1-C30; n é seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4 e 5; e X é seleccionado de -Br, -Cl, -F, e -I; em que a posição 12 é substituída por hidrocarbilo Ci_6, ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, na forma de um estereoisómero isolado ou uma mistura destes. Noutro aspecto, esta invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo um composto da invenção tal como descrito acima e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Noutro aspecto, esta invenção proporciona um composto da invenção tal como descrito acima, para utilização no tratamento ou na prevenção de uma condição ou doença inflamatória num paciente. Noutro aspecto, esta invenção proporciona um composto da invenção tal como descrito acima que modula os níveis da adenosina 5'-monofosfato cíclica intracelulares num paciente. Noutro aspecto, esta invenção proporciona um composto da invenção tal como descrito acima que trata ou previne uma doença ou condição num paciente, em que a doença ou condição está associada a condições patológicas que são moduladas 9 através da inibição de enzimas associados com mensageiros celulares secundários. Noutro aspecto, esta invenção proporciona um composto da invenção tal como descrito acima que trata ou previne a proliferação celular descontrolada num paciente. Noutro aspecto, esta invenção proporciona um composto da invenção tal como descrito acima que trata ou previne a rejeição de transplante num paciente. Noutro aspecto, esta invenção proporciona um composto da invenção tal como descrito acima que trata ou previne condições associadas ao sistema nervoso central num paciente. A presente invenção proporciona ainda os outros compostos e utilizações tal como apresentado no conjunto de reivindicações anexo. Este e outros aspectos e formas de realização da presente invenção serão evidentes por referência à descrição detalhada seguinte. Para tal, são aqui apresentadas várias referências que descreve em maior detalhe certos procedimentos, compostos e/ou composições. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona compostos, composições e compostos para utilização no tratamento e/ou na prevenção de várias condições de doença. Por exemplo, num aspecto, a presente invenção proporciona compostos para utilização no tratamento e/ou prevenção de uma doença inflamatória. A utilização inclui a administração a um indivíduo que deles necessite de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um 10 composto da invenção ou de um seu sal f armaceuticamente aceitável, ou de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição contendo um composto da invenção ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável. Deste modo, tal como apresentado acima no Resumo da Invenção, esta invenção dirige-se a compostos com a seguinte fórmula:
    em que: o azoto na posição 1 é substituído com hidrogénio; as posições 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11 e 18 são substituídas com hidrogénio; as posições 17 e 19 são substituídas com OR8 em que R8 é um grupo hidrocarbilo Ci-io; cada um dos carbonos nas posições 5, 13, 15 e 16 é independentemente substituído em cada ocorrência com H, -W ou -R7(W)n, em que: W é seleccionado de -NH2, -CN, -X, -OH, -N02, -SH, -NHR8, -NR8R8, -OR8 e -SR8; cada R7 é independentemente um grupo hidrocarbilo, halocarbiolo ou hidro-halocarbilo C1-C30 em que n dos átomos de hidrogénio ou halogéneo de R7 são substituídos por um número igual de grupos W independentemente seleccionados em cada localização; 11 cada R8 é independentemente um grupo hidrocarbilo, halocarbilo ou hidro-halocarbilo C1-C30; n é seleccionado deO, 1, 2, 3, 4e5; e X é seleccionado de -Br, -Cl, -F, e -I; em que a posição 12 é substituída por hidrocarbilo C1-6, ou um seu sal ou solvato f armaceuticamente aceitável, na forma de um estereoisómero isolado ou uma mistura destes. Noutro aspecto, o composto da invenção tem a configuração S no carbono 3. Noutro aspecto, o composto da invenção tem a configuração R no carbono 3. Noutro aspecto, o composto da invenção tem a configuração S no carbono 5. Noutro aspecto, o composto da invenção tem a configuração R no carbono 5. Noutros aspectos, no composto da invenção, assim como em composições compreendendo o composto da invenção e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável: o carbono na posição 13 é independentemente substituído com hidrogénio e -W; o carbono na posição 13 é substituído com -NH2, -NHR8 ou -NR8R8; o carbono na posição 13 é substituído com -CN, -X, -OH, N02, -SH ou -0R8; o carbono na posição 13 é substituído com -R7(W)n. Noutro aspecto, exactamente dois dos carbonos nas posições 11, 12 e 13 são substituídos com hidrogénio. Noutro aspecto, não mais que um dos carbonos nas posições 11, 12 e 13 é substituído com hidrogénio. Noutro aspecto da presente invenção que proporciona um composto da invenção, podem ser usados os seguintes critérios 12 isoladamente ou em qualquer combinação para descrever ainda mais o ou os compostos da invenção, em que estes critérios são apenas uma exemplificação, podendo-se encontrar aqui outros critérios noutros locais: o carbono na posição 13 é substituído com -R7(W)n; exactamente dois dos carbonos nas posições 11, 12 e 13 são substituídos com hidrogénio; W é -OR8; R7 é um grupo hidrocarbono Ci-io em que n dos átomos de hidrogénio ou halogénio de R7 são substituídos por um número igual de grupos W independentemente seleccionados a cada localização; R7 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo substituído por alcenilo, alcenilo substituído por arilo, arilo substituído por alcinilo, alcinilo substituído por arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, bicicloalquilo, bicicloalcenilo, alquilcicloalquilo, alcenilcicloalquilo, alcinilcicloalquilo, cicloalquilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalquilo, cicloalcenilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalcenilo, cicloalquilo e policicloalquilo fundido com arilo; R8 é um grupo hidrocarbilo Ci_i0; R8 é um grupo ciclo-hidrocarbolo Ci_i0; R8 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo substituído por alcenilo, alcenilo substituído por arilo, arilo substituído por alcinilo, alcinilo substituído por arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, bicicloalquilo, bicicloalcenilo, alquilcicloalquilo, alcenilcicloalquilo, alcinilcicloalquilo, cicloalquilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalquilo, cicloalcenilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalcenilo, cicloalquilo e policicloalquilo fundido com arilo; n é 0; o carbono 3 tem a configuração S; o carbono 3 tem a configuração R; o carbono 5 tem a configuração S; o carbono 5 tem a configuração R; as posições 1, 3, 4, 5, 6, 7, 13 9, 10, 11, 13, 15, 16, e 18 são substituídas com hidrogénio, e a posição 12 é substituída com hidrocarbilo Ci, e a posição 17 é substituída com -O-ciclopentilo, e a posição 19 é substituída com -O-metilo, em que opcionalmente as posições 3 e 5 têm ambas a estereoquímica S. Qualquer um destes compostos podem estar na forma de um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável de acordo com a presente invenção. Nos compostos da invenção o anel contendo N é monocíclico e saturado, como apresentado no Resumo da Invenção. Em formas de realização preferidas dos compostos da invenção, W é seleccionado de -NH2, -NHR8, e -NR8R8; W é seleccionado de -NH2, -CN, -X, -OH, -N02, -SH, -NHR8, -NR8R8, -OR8 e -SR8; ou W é -OR8. Noutras formas de realização preferidas dos compostos da invenção, R7 é um grupo hidrocarbilo C1-30 em que n dos átomos de hidrogénio ou halogénio de R7 são substituídos por um número igual de grupos W independentemente seleccionados a cada localização; R7 é um grupo hidrocarbilo C1-10 em que n dos átomos de hidrogénio ou halogénio de R7 são substituídos por um número igual de grupos W independentemente seleccionados a cada localização; ou R7 é seleccionado de alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo substituído por alcenilo, alcenilo substituído por arilo, arilo substituído por alcinilo, alcinilo substituído por arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, bicicloalquilo, bicicloalcenilo, alquilcicloalquilo, alcenilcicloalquilo, alcinilcicloalquilo, cicloalquilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalquilo, cicloalcenilo substituído 14 por arilo, arilo substituído por cicloalcenilo, cicloalquilo e policicloalquilo fundido com arilo; Noutras formas de realização preferidas do composto da invenção, R8 é um grupo hidrocarbilo C1-30; R8 é um grupo hidrocarbilo Ci_i0; R8 é seleccionado de alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo substituído por alcenilo, alcenilo substituído por arilo, arilo substituído por alcinilo, alcinilo substituído por arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, bicicloalquilo, bicicloalcenilo, alquilcicloalquilo, alcenilcicloalquilo, alcinilcicloalquilo, cicloalquilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalquilo, cicloalcenilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalcenilo, cicloalquilo e policicloalquilo fundido com arilo. Noutras formas de realização preferidas do composto da invenção, n é 0; n é 1; n é 2; n é 3; n é 4; n é 5; n é superior a 0; n é 1 ou 2;e n é 1 ou 2 ou 3. Um composto preferido da invenção é um composto da fórmula seguinte:
    como um único estereoisómero ou uma mistura destes, ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável. 15 Outro composto preferido da invenção é um composto da seguinte fórmula:
    na da ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, forma de um único estereoisómero ou uma mistura destes. Outro composto preferido da invenção é um composto seguinte fórmula:
    na ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, forma de um único estereoisómero ou uma mistura destes. Também se menciona aqui um composto da seguinte fórmula: 16 ο
    ch3 ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, na forma de um único estereoisómero ou uma mistura destes. Outro composto preferido da invenção é um composto da seguinte fórmula: O
    ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, na forma de um único estereoisómero ou uma mistura destes. Outro composto preferido da invenção é um composto da seguinte fórmula: 17
    ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, na forma de um único estereoisómero ou uma mistura destes. Nos compostos acima, um sal farmaceuticamente aceitável inclui sais de adição de ácido e sais de adição de base. Sais de adição de ácido referem-se àqueles sais formados a partir de compostos da invenção e ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e semelhantes, e/ou ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maléico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfónico, ácido etanossulfónico, ácido p-toluenossulfónico, ácido salicílico e semelhantes. Sais de adição de base referem-se àqueles sais formados a partir de compostos da invenção e bases inorgânicas tais como sais de sódio, potássio, lítio, amónio, cálcio, magnésio, ferro, zinco, cobre, manganês, alumínio e semelhantes. Sais adequados incluem os sais de amónio, potássio, sódio, cálcio e magnésio derivados de bases não tóxicas orgânicas farmaceuticamente aceitáveis incluindo sais de aminas 18 primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas incluindo aminas substituídas que ocorrem naturalmente, aminas cíclicas e resinas de permuta iónica básicas, tais como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, trimetamina, diciclo-hexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaínas, hidrabramina, colina, betaína, etilenodiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, e semelhantes. e Nos compostos e composições acima, um grupo hidrocarbilo é formado exclusivamente por carbono e hidrogénio e inclui, por exemplo, qualquer de alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo substituído por alcenilo, alcenilo substituído por arilo, arilo substituído por alcinilo, alcinilo substituído por arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, bicicloalquilo, bicicloalcenilo, alquilcicloalquilo, alcenilcicloalquilo, alcinilcicloalquilo, cicloalquilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalquilo, cicloalcenilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalcenilo, cicloalquilo e policicloalquilo fundido com arilo. Um grupo ciclo-hidrocarbilo é também formado em exclusivo por carbono e hidrogénio, e inclui pelo menos um anel, em que exemplos de grupos ciclo-hidrocarbilo incluem quaisquer de arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo substituído por alcenilo, alcenilo substituído por arilo, arilo substituído por alcinilo, alcinilo substituído por arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, bicicloalquilo, bicicloalcenilo, alquilcicloalquilo, alcenilcicloalquilo, alcinilcicloalquilo, cicloalquilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalquilo, cicloalcenilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalcenilo, cicloalquilo 19 policicloalquilo fundido com arilo. Num aspecto da invenção, o grupo ciclo-hidrocarbilo é seleccionado de ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo e ciclo-hexilo. Noutro aspecto, o grupo ciclo-hidrocarbilo é ciclopentilo. Um grupo halocarbilo é formado exclusivamente por carbono e halogénio, e inclui os grupos hidrocarbilo identificados acima em que cada hidrogénio é substituído por um halogénio seleccionado de flúor, cloro, bromo e iodo, preferentemente flúor e cloro. Um grupo hidro-halocarbilo, que pode também ser referido como um grupo halo-hidrocarbilo, é formado exclusivamente por carbono, hidrogénio e halogénio, e inclui os grupos hidrocarbilo específicos identificados acima em que alguns, mas não todos, os átomos de hidrogénio são substituídos com átomos de halogénio seleccionados de flúor, cloro, bromo e iodo, preferentemente flúor e/ou cloro. Definições representativas destes grupos hidrocarbilo (que podem ser substituídos com átomos de halogénio para proporcionar os seus derivados halocarbilo e hidro-halocarbilo) são proporcionados abaixo. "Alquilo" refere-se a uma cadeia acíclica de átomos de carbono que pode ser ramificada ou não ramificada (linear). Metilo, etilo, propilo (incluindo n-propilo e iso-propilo), butilo (incluindo n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, e t-butilo), pentilo (incluindo diversos isómeros) e hexilo (incluindo diversos isómeros) são grupos alquilo com 1 a 6 átomos de carbono (comummente referidos como grupos alquilo inferiores), e são exemplos de grupos alquilo da invenção. "Alcenilo" refere-se a um grupo alifático insaturado com pelo menos uma ligação dupla. 20 "Alcinilo" refere-se a um hidrocarboneto insaturado que pode ter uma cadeia ou linear ou ramificada e pode ter uma ou mais ligações triplas. Grupos preferidos não têm mais que cerca de 12 átomos de carbono e podem ser etilo, propinilo, 4-metilpentilo e assim sucessivamente, e seus isómeros estruturais. "Aralquilo" refere-se a um grupo alquilo substituído por um radical arilo. Por exemplo, benzilo. "Aralquinilo" refere-se a um grupo alcinilo substituído por um anel arilo. Por exemplo, ArC^C-, ArCH2CH2CH2C=c- e assim sucessivamente. "Cicloalquilo" refere-se a um arranjo cíclico de átomos de carbono, em que ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo são grupos cicloalquilo da invenção com 3-6 átomos de carbono. Grupos adicionais no âmbito de "cicloalquilo" tais como aqui definidos são grupos policicloalquilo, definidos abaixo. "Cicloalcenilo" refere-se a um grupo alcenilo cíclico. Grupos cicloalcenilo adequados incluem, por exemplo, ciclopentenilo e ciclo-hexenilo. Um grupo policicloalquilo é um arranjo de átomos de carbono em que pelo menos um átomo de carbono é parte de pelo menos dois anéis identificáveis separadamente. 0 grupo policicloalquilo pode conter uma ponte entre dois átomos de carbono, em que biciclo[1.1.0]butilo, biciclo[3.2.1]octilo, biciclo[5,2.0]nonilo, triciclo [2.2.1. O1]heptilo, norbornilo e pinanilo são exemplos representativos. O grupo policicloalquilo pode conter um ou mais sistemas de anéis fundidos, em que decalinilo (radical da decalina) e per- 21 hidroantracenilo são exemplos representativos. 0 grupo policicloalquilo pode conter uma ligação espiro, na qual um único átomo é o único membro comum dos dois anéis. Espiro[3.4]octilo, espiro[3.3]heptilo e espiro[4.5]decilo são exemplos representativos. "Halogéneo" refere-se a flúor, cloro, bromo e iodo. Grupo "heterociclilo" refere-se a um sistema de anéis de 3 a 15 membros estável fundido a um grupo fenilo ao qual está ligado R7, que consiste em átomos de carbono e de um a cinco heteroátomos seleccionados do grupo que consiste em azoto, oxigénio e enxofre. Para os fins desta invenção, o grupo heterociclilo pode ser um sistema de anéis monociclico, biciclico ou triciclico, que pode incluir anéis fundidos ou em ponte; e os átomos de azoto, carbono ou enxofre no grupo heterociclilo podem ser opcionalmente oxidados; o átomo de azoto pode ser opcionalmente quaternizado; e o grupo heterociclilo pode ser aromático ou parcialmente ou totalmente saturado. 0 grupo heterociclilo pode estar ligado ao grupo fenilo ao qual R7 está ligado a qualquer heteroátomo ou átomo de carbono que resulta no critério de um composto estável. Exemplos de tais grupos heterociclilo incluem, mas não estão limitados a, azepinilo, acridinilo, benzimidazolilo, benztiazolilo, benzoxazolilo, benzopiranilo, benzopiranonilo, benzofuranilo, benzofuranonilo, benzotienilo, carbazolilo, cinnolinilo, deca-hidroisoquinolilo, dioxolanilo, furanilo, furanonilo, isotiazolilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, isotiazolidinilo, indolilo, isoindolilo, indolinilo, isoindolinilo, indolizinilo, isoxazolilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, naftiridinilo, oxadiazolilo, octa-hidroindolilo, octa-hidroisoindolilo, 2-oxopiperazinilo, 2-oxopiperidinilo, 22 2-oxopirrolidinilo, 2-oxoazepinilo, oxazolilo, oxazolidinilo, oxiranilo, piperidinilo, piperazinilo, 4-piperidonilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, pteridinilo, purinilo, pirrolilo, pirrolidinilo, pirazolilo, pirazolidinilo, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, quinolinilo, quinuclidinilo, isoquinolinilo, tiazolilo, tiazolidinilo, tiadiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, tetra-hidrofurilo, triazinilo, tetra-hidropiranilo, tienilo, tiamorfolinilo, sulfóxido de tiamorfolinilo, e sulfona de tiamorfolinilo. Tal como aqui utilizadas, as seguintes abreviaturas têm os significados seguintes: Abreviatura Nome completo 5-ASA Ácido 5-aminosalicílico Ab Anticorpo ABTS 2,2'-azino-di-[sulfonato de 3- etilbenztiazolina] ACD Ácido citrato dextrose AcOH Ácido acético ACVP American College of Veterinary Practice ANOVA Análise de Variância Ar Árgon BCR-ABL Oncogene na translocação cromossómica 9:22 em CML BINAP 2,2'-Bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftilo Bn Benzilo BnBr Brometo de benzilo BOC terc-Butoxicarbonilo CAMP Adenosina 3' -5'-monofosfato cíclica cat Catalítico 23 Abreviatura Nome completo CD Designação de cluster CFA Adjuvante completo de Freund cGMP Guanosina 3'-5'-monofosfato cíclica CIA Artrite Induzida pelo Colagénio CLL Leucemia linfocítica crónica CML Leucemia mielogénica crónica CNS Sistema Nervoso Central Con A Concanavalina A COX Ciclo-oxigenase cPent Ciclopentilo cPentBr Brometo de ciclopentilo CRE Elemento de resposta cAMP CsA Ciclosporina A DMAP 4-Dimetilaminopiridina DMARD Fármaco anti-reumático modificador da doença DMF N, IV-Dimetilf ormamida DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucléico dppf 1,1'-Bis(difenilfosfino)ferroceno dppp l,3-Bis(difenilfosfino)propano ECso Concentração à qual se nota 50% do efeito máximo observável EDTA Ácido etilenodiaminotetraacético ELISA Teste de imunoadsorção associada a enzima EtOAc Acetato de etilo EtOH Álcool etílico FBS Soro fetal bovino FCS Soro fetal vitelino f MLP Formil-metionil leucina fenilalanina g. i . Gastrointestinal Η & E Hematoxilina e eosina 2 4 Abreviatura Nome completo HARBS Local de ligação de rolipram de elevada afinidade HBSS Solução de sais equilibrada de Hanks HMPA Hexametilfosforamida HPLC Cromatografia líquida de elevada pressão i ·Ρ· Intraperitoneal IBD Doença inflamatória do intestino IBMX 3-1sobutil-l-metilxantina IC Concentração inibitória IC50 Concentração à qual se observa 50% da inibição IFA Adjuvante incompleto de Freund IFN-γ Interferão gama IL Interleucina LAH Hidreto de lítio alumínio LDA Diisopropilamida de lítio LN Nodo linfático LPS Lipopolissacárido LTB4 Leucotrieno B4 luc luciferase Me Metilo MeOH Álcool metílico MHC Classe de histocompatibilidade major MLR Reacção linfocítica mista MPO Metiloperoxidase Ms Metanossulfonilo MsCl Cloreto de metanossulfonilo NBS iV-Bromosuccinimida n-BuLi n-Butil-lítio n-BuSH n-Butanotiol NF-kB Factor capa B nuclear NSAID Fármaco anti-inflamatório não esteróide 25 Abreviatura Nome completo p.t. Pós-transplante PBS Tampão fosfato salino Pcc Citocromo C de pomba PDE Fosfodiesterase PEG Polietileno glicol PG Prostaglandina PMS Metossulfato de fenazina PMSF Fluoreto de fenil metil sulfonilo pTsOH Mono-hidrato de ácido p-toluenossulfónico Py Piridina RA Artrite reumatóide RF Factor reumatóide Rf Factor de retardação ROS Espécie reactiva de oxigénio RPMI Rosewell Park Memorial Institute RTX Resiniferitoxina SAR Relação estrutura actividade TBAF Fluoreto de tetrabutilamónio TBDMS terc-Butildimetilsililo TBDMSC1 Cloreto de terc-butildimetilsililo TCR Receptor de célula T TEA Trietilamina Tf Trifluorornetanossulfonilo TFA Ácido trifluoroacético Th T auxiliar THF Tetra-hidrofurano TNBS Ácido sulfónico trinitrobenzeno TNF-a Factor de necrose tumoral alfa Trolox® Ácido 6-hidroxi-2.5.7.8-tetrametilcroman-2- carboxilico TsOH Mono-hidrato de ácido p-toluenossulfónico 26 Abreviatura Nome completo XTT Sal interno de 2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfo-fenil]-2H-tetrazólio 5-carboxanilida μΜ Micro molar Quando qualquer variável ocorre mais do que uma vez em qualquer constituinte ou em compostos da invenção, a sua definição em cada ocorrência é independente da sua definição em qualquer outra ocorrência. As combinações de substituintes e/ou variáveis são apenas permissíveis se tais combinações resultam em compostos estáveis. Os compostos úteis nos métodos e composições da presente invenção, assim como os compostos da presente invenção, podem ter centros assimétricos e ocorrer na forma de racematos, misturas racémicas e como diaestereómeros individuais, ou enantiómeros sendo todas as formas isoméricas incluídas na presente invenção. Um racemato ou mistura racémica não implica uma mistura 50:50 dos estereoisómeros. Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas contendo um composto da invenção tal como apresentado acima, em combinação com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Estas composições podem ser usadas para o tratamento de inflamação ou de outras condições tais como aqui apresentadas. Estas composições podem também ser formadas num medicamento que pode ser usado no tratamento de, por exemplo, inflamação. Estas composições são úteis como, por exemplo, padrões de testes, métodos convenientes de produzir cargas em bruto, ou composições farmacêuticas. Uma quantidade testável de um composto da invenção é uma quantidade que é facilmente mensurável por procedimentos e técnicas de teste 27 convencionais bem conhecidas e apreciadas pelos peritos na técnica. Quantidades testáveis de um composto da invenção irão geralmente variar de cerca de 0,001% em peso a cerca de 80% em peso da totalidade do peso da composição. Veículos inertes incluem qualquer material que não se degrada ou de outro modo reage covalentemente com um composto da invenção. Exemplos de veículos inertes são a água; tampões aquosos, tais como aqueles que são geralmente úteis em análise de Cromatografia Líquida de Elevada Eficiência (HPLC); solventes orgânicos, tais como acetonitrilo, acetato de etilo, hexano e semelhantes; e veículos farmaceuticamente aceitáveis. "Veículos farmaceuticamente aceitáveis" para utilização terapêutica são bem conhecidos na técnica farmacêutica, e são descritos, por exemplo, em Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro Edit. 1985). Por exemplo, pode-se usar solução salina e tampão fosfato salino a pH fisiológico estéreis. Podem ser proporcionados na composição farmacêutica conservantes, estabilizantes, corantes e mesmo agentes aromatizantes. Por exemplo, podem ser adicionados como conservantes, benzoato de sódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzóico. Id. a 1449. Além disso, podem ser usados antioxidantes e agentes de suspensão. Id. Assim, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica ou veterinária (aqui de seguida, simplesmente referida como uma composição farmacêutica) contendo um composto da invenção tal como descrito acima, adicionado a e misturado com um veículo farmaceuticamente aceitável. A invenção proporciona ainda uma composição, preferentemente uma composição farmacêutica, contendo uma quantidade eficaz 28 de um composto de (1-4) tal como descrito acima, em associação com um veiculo farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas da presente invenção podem estar em qualquer forma que permita a administração da composição a um paciente. Por exemplo, a composição pode ser na forma de um sólido, liquido ou gás (aerossol) . As vias típicas de administração incluem, sem limitação, oral, tópica, parentérica, sublingual, rectal, vaginal e intranasal. 0 termo parentérico tal como aqui usado inclui injecções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, injecção intraesternal ou técnicas de infusão. Composições farmacêuticas da invenção são formuladas de modo a permitir que os ingredientes nelas contidos tenham biodisponibilidade aquando da administração da composição a um paciente. As composições que serão administradas a um paciente tomam a forma de uma ou mais unidades de dosagem, em que por exemplo, um comprimido pode ser uma unidade de dosagem única, e um recipiente de um composto da invenção em forma e aerossol pode conter diversas unidades de dosagem. Os materiais usados na preparação das composições farmacêuticas deverão ser farmaceuticamente puros e não tóxicos nas quantidades usadas. Será evidente para aqueles competentes na técnica que a dose óptima do ou dos ingredientes activos na composição farmacêutica dependerá de uma variedade de factores. Factores relevantes incluem, sem limitação, o tipo de indivíduo (por exemplo, humano), a forma particular do ingrediente activo, o modo de administração e a composição utilizada. Em geral, a composição farmacêutica inclui um (em que "um" refere-se aqui, e ao longo desta especificação, um ou mais) 29 composto activo da invenção tal como aqui descrito, em adição e mistura com um ou mais veículos. 0(s) veículo(s) podem ser em partículas, de modo que as composições são, por exemplo, em forma de comprimido ou pó. 0 ou os veículos podem ser líquidos, com as composições sendo, por exemplo, um xarope oral ou um líquido injectável. Além disso, o ou os veículos podem ser gasosos, de modo a proporcionar uma composição em aerossol útil, por exemplo, em administração por inalação. Quando se pretende uma administração oral, a composição é preferentemente em forma sólida ou líquida, em que se incluem formas semi-sólidas, semi-líquidas, em suspensão e em gel no âmbito das formas consideradas aqui como sólida ou líquida. Como composição sólida para administração oral, a composição pode ser formulada num pó, grânulo, comprimido, pílula, cápsula, pastilha elástica, hóstia ou formas semelhantes. Uma tal composição sólida irá tipicamente conter um ou mais diluentes inertes ou veículos comestíveis. Além disso, podem estar presentes, um ou mais dos adjuvantes seguintes: aglutinantes tais como carboximetilcelulose, etil celulose, celulose microcristalina, ou gelatina; excipientes tais como amido, lactose ou dextrinas, agentes desintegrantes tais como ácido algínico, alginato de sódio, Primogel, amido de milho e semelhantes; lubrificantes tais como estearato de magnésio ou Sterotex; agentes deslizantes tais como dióxido de silicone coloidal; agentes adoçantes tais como sacarose ou sacarina, um agente aromatizante como a hortelã-pimenta, salicilato de metilo ou aroma a laranja, e um agente corante. Quando a composição está na forma de uma cápsula, por exemplo, uma cápsula de gelatina, pode conter, além dos 30 materiais do tipo acima, um veiculo liquido tal como polietileno glicol, ciclodextrina ou um óleo gordo. A composição pode estar na forma de um liquido, por exemplo, um elixir, xarope, solução, emulsão ou suspensão. 0 liquido pode ser para administração oral ou para administração por injecção, como dois exemplos. Quando se pretendem para administração oral, as composições preferidas contêm, além dos presentes compostos, um ou mais de um aqente adoçante, conservantes, corantes e potenciadores de aroma. Numa composição que se pretende ser administrada por injecção, pode-se incluir um ou mais de um surfactante, conservante, agente molhante, agente dispersante, agente de suspensão, tampão, estabilizante e agente isotónico. As composições farmacêuticas liquidas da invenção, quer sejam soluções, suspensões ou outra forma semelhante, podem incluir, um ou mais dos seguintes adjuvantes: diluentes estéreis tais como água para injecção, solução salina, preferentemente solução salina fisiológica, solução de Ringer, cloreto de sódio isotónico, óleos fixos tais como mono ou diglicéridos sintéticos que podem servir como solvente ou meio de suspensão, polietileno glicóis, glicerina, ciclodextrina, propileno glicol ou outros solventes; agentes antibacterianos, tais como álcool benzilico ou metil parabeno; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetracético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade tais como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parentérica pode ser encerrada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas fabricados em vidro ou plástico. Prefere-se como adjuvante solução salina 31 fisiológica. Uma composição farmacêutica aceitável é preferentemente estéril. Uma composição liquida que se destina para administração parentérica ou oral contém uma quantidade de um composto da invenção tal que uma dosagem adequada seria obtida. Tipicamente, esta quantidade é pelo menos 0,01% de um composto da invenção na composição. Quando se pretende a administração oral, esta quantidade pode ser variada para estar entre 0,1% e cerca de 70% do peso da composição. As composições orais preferidas contêm entre cerca de 4% e cerca de 50% do composto activo da invenção. As composições e preparações preferidas de acordo com a presente invenção são preparadas de tal modo que uma unidade de dosagem parentérica contém entre 0,01% e 1% em peso do composto activo. A composição farmacêutica pode ser destinada para administração tópica, em cujo caso o veiculo pode adequadamente compreender uma base de solução, emulsão, unguento ou gel. A base, por exemplo, pode compreender um ou mais dos seguintes: petrolatum, lanolina, polietileno glicóis, cera de abelha, óleo mineral, diluentes tais como água e álcool, e emulsionantes e estabilizantes. Podem estar presentes agentes espessantes numa composição farmacêutica para administração tópica. Se for pretendida para administração transdérmica, a composição pode incluir um emplastro transdérmico ou um dispositivo de iontoforese. As formulações tópicas podem conter uma concentração do composto da invenção de cerca de 0,1% a cerca de 10% p/v (peso por unidade de volume). A composição pode ser pretendida para administração rectal, na forma, por exemplo, de um supositório que irá derreter no 32 recto e libertar o fármaco. A composição para administração rectal pode conter uma base oleaginosa como excipiente adequado não irritante. Tais bases incluem, sem limitação, lanolina, manteiga de cacau e polietileno glicol. A composição pode incluir vários materiais que modificam a forma física de uma unidade de dosagem sólida ou líquida. Por exemplo, a composição pode incluir materiais que formam uma capa de revestimento à volta dos ingredientes activos. Os materiais que formam a capa de revestimento são tipicamente inertes, e podem ser seleccionados de, por exemplo, açúcar, goma-laca, e outros agentes de revestimento entéricos. Alternativamente, os ingredientes activos podem ser encerrados numa cápsula de gelatina. A composição em forma sólida ou líquida podem incluir um agente que se liga ao ou aos componentes activos e assistem assim na administração dos componentes activos. Agentes adequados que podem actuar nesta capacidade incluem um anticorpo monoclonal ou policlonal, uma proteína ou um lipossoma. A composição farmacêutica da presente invenção pode consistir em unidades de dosagem gasosas, por exemplo, pode estar na forma de um aerossol. 0 termo aerossol é usado para denotar uma variedade de sistemas desde aqueles de natureza coloidal até sistemas que consistem em embalagens pressurizadas. A administração pode ser um gás liquefeito ou comprimido ou por um sistema de bombagem adequado que administra os ingredientes activos. Os aerossóis de compostos da invenção podem ser administrados em sistemas de uma única fase, bifásicos ou trifásicos de modo a administrar o ou os ingredientes activos. A administração do aerossol inclui o 33 recipiente, espaçadores e formam um kit pelo perito desnecessária válvulas, activadores, válvulas, outros semelhantes necessários, Os aerossóis preferidos podem na técnica, sem qualquer sub-recipientes, que em conjunto ser determinados experimentação Qualquer que seja a forma sólida, liquida ou gasosa, a composição farmacológica da presente invenção pode conter um ou mais agentes farmacológicos conhecidos usados no tratamento da inflamação (incluindo a artrite). As composições farmacêuticas podem ser preparadas por metodologias bem conhecidas na técnica farmacêutica. A composição que se pretende ser administrada por injecção pode ser preparada através da combinação do composto da invenção com água de modo a formar uma solução. Pode-se adicionar um surfactante para facilitar a formação de uma suspensão ou solução homogénea. Os surfactantes são compostos que interactuam de forma não covalente com o composto da invenção de modo a facilitar a dissolução ou a suspensão homogénea do composto activo no sistema de administração aquoso. Os compostos da invenção aqui apresentados, ou composições compreendendo um ou mais destes compostos e um veiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, podem ser usados no tratamento ou na prevenção de uma doença ou condição inflamatória num paciente, em que o tratamento compreende a administração ao paciente que dele necessite de um composto ou de uma composição de acordo com a presente invenção, em que a quantidade é eficaz para tratar ou prevenir a condição ou doença inflamatória do paciente. 34 A condição ou doença inflamatória pode ser uma condição ou doença autoimunes; a condição ou doença inflamatória pode envolver inflamação aguda ou crónica dos compartimentos ósseos e/ou de cartilagem das articulações; a condição ou doença inflamatória pode ser uma artrite seleccionada de artrite reumatóide, artrite gotosa ou artrite reumatóide juvenil; a condição ou doença inflamatória pode ser asma; a condição ou doença pode estar associada à desregulação das células T; a condição ou doença pode estar associada com elevados níveis de citocinas inflamatórias (por exemplo, em que a citocina inflamatória é IL-2, ou em que a citocina inflamatória é IFN-γ, ou em que a citocina inflamatória é TNF-α); a condição ou doença inflamatória pode ser esclerose múltipla; a condição ou doença inflamatória pode ser sarcoidose pulmonar; a condição ou doença inflamatória pode ser inflamação ou alergia ocular; a condição ou doença inflamatória pode ser uma doença inflamatória do intestino (por exemplo, doença de Crohn ou colite ulcerosa); e a condição ou doença inflamatória pode ser uma doença inflamatória cutânea (por exemplo, psoríase ou dermatite). Além disso, a presente invenção proporciona compostos para utilização na modulação dos níveis de adenosina 5'-monofosfato cíclica intracelular num paciente, compreendendo a administração a um paciente que necessite uma quantidade de um composto ou de uma composição de acordo com a presente invenção, em que a quantidade é eficaz para modular os níveis de adenosina 5'-monofosfato cíclica intracelular do paciente. 0 paciente pode ter uma doença ou condição inflamatória. Além disso, a presente invenção proporciona compostos para utilização no tratamento ou na prevenção de uma doença ou condição num paciente, em que a doença ou condição está 35 associada com condições patológicas que são moduladas através da inibição de enzimas associados com mensageiros celulares secundários, compreendendo o método a administração a um paciente que necessite de um composto ou de uma composição da presente invenção, em que a quantidade é eficaz para tratar ou prevenir a doença ou condição associada com condições patológicas que são moduladas pela inibição de enzimas associadas com mensageiros celulares secundários. A enzima pode ser AMP cíclico fosfodiesterase; ou a enzima pode ser uma f osf odiesterase 4; ou a enzima pode ser uma fosfodiesterase 3; ou as enzimas podem ser tanto a f osf odiesterase 4 como a f osf odiesterase 3; ou a enzima pode ser uma GMP cíclico fosfodiesterase. Além disso, a presente invenção proporciona um composto para utilização no tratamento ou na prevenção da rejeição de transplante num paciente, compreendendo a administração a um paciente que necessite de um composto ou de uma composição da presente invenção, em que a quantidade é eficaz para tratar ou prevenir a rejeição de transplante no paciente. A rejeição pode ser devida à doença do enxerto contra o hospedeiro. Além disso, a presente invenção proporciona um composto para utilização no tratamento ou na prevenção da proliferação celular descontrolada num paciente, compreendendo a administração a um paciente que necessite de um composto ou de uma composição da presente invenção, em que a quantidade é eficaz para tratar ou prevenir a proliferação celular descontrolada no paciente. A proliferação celular descontrolada num paciente pode ser causada por um cancro seleccionado de leucemia e tumores sólidos. 36 Além disso, a presente invenção proporciona um composto para utilização no tratamento ou na prevenção de condições associadas com o sistema nervoso central (SNC) num paciente, compreendendo a administração a um paciente que necessite de um composto ou de uma composição da presente invenção, em que a quantidade é eficaz para tratar ou prevenir condições associadas com o sistema nervoso central (SNC) no paciente. A condições associadas com o sistema nervoso central (SNC) pode ser depressão. Numa utilização da presente invenção, o composto da invenção, ou uma composição compreendendo um ou mais compostos da invenção e um veiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, podem, apesar de não ser necessário, conseguir um ou mais dos seguintes resultados desejados no indivíduo ao qual foi administrado um composto da invenção tal como definido acima, ou uma composição contendo um destes compostos e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável: 1. Inibição da geração de espécies reactivas de oxigénio a partir de neutrófilos primários; 2. Inibição de quimiotaxia de neutrófilos; 3. Inibição da produção de TNF-a; 4. Inibição de edema; 5. Sequestração de radicais de oxigénio; 6. Inibição de AMP cíclico fosfodiesterases 1, 3 e/ou 4 e PDEs relacionadas tal como PDE7; 7. Potenciar a indução de actividade de transcrição mediada por CRE em células humanas monocíticas; 8. Inibição de PDE, preferentemente PDE4, PDE4, ou PDE3 e PDE4; 9. Inibição da produção de citocinas por subconjuntos de células T activados; 37
    10. Inibição da libertação de mieloperoxidase de neutrófilos;
    11. Baixa razão de IC50PDE4(cat):IC50PDE4(HARBS);
    12. Inibição da rejeição de enxerto;
    13. Inibição de parâmetros clínicos e histopatológicos de doença na doença inflamatória do intestino; e
    14. Inibição de parâmetros clínicos e histopatológicos de artrite num modelo de artrite induzido por colagénio murino. Assim, os compostos da invenção podem ser usados para o tratamento da inflamação, incluindo tanto, inflamação aguda como crónica assim como certos distúrbios de proliferação (cancros). Tal como aqui usada, inflamação inclui, sem limitação, espondilite anquilosante, artrite (em que este termo engloba mais de 100 tipos de doenças reumáticas), asma, doença de Crohn, síndrome de fibromialgia, gota, inflamações do cérebro (incluindo esclerose múltipla, demência por SIDA, encefalopatia de Lyme, encefalite de herpes, doença de Creutzfeld-Jakob, e toxoplasmose cerebral), enfisema, doença inflamatória do intestino, síndrome do intestino irritável, lesão isquemia-reperfusão sarcoidose pulmonar eritematosa juvenil, doença de Kawasaki, osteoartrite, doença inflamatória pélvica, artrite psoriática (psoríase), artrite reumatóide, psoríase, transplante de tecido/órgão, escleroderma, espondiloartropatias, lúpus sistémico eritematoso, sarcoidose pulmonar, e colite ulcerosa. Tal como aqui utilizado, doenças proliferativas incluem, sem limitação, todas as leucemias e tumores sólidos que são susceptíveis de sofrer diferenciação ou apoptose por intermédio da interrupção do seu ciclo celular. A invenção apresenta um método para a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da 38 invenção, incluindo seus sais, composições, etc. Tal como aqui utilizado, a quantidade real abrangida pelo termo "quantidade terapeuticamente eficaz" irá depender da via de administração, do tipo de animal de sangue quente a ser tratado, e das características físicas do anima de sangue quente específico sob consideração. Estes factores e a sua relação para determinar esta quantidade são bem conhecidos pelos peritos na técnica médica. Esta quantidade e o método de administração podem ser ajustados de modo a se conseguir uma eficácia óptima mas irão depender de factores tais como o peso, a dieta, outra medicação em curso e outros factores que serão reconhecidos pelos peritos na técnica médica. Uma quantidade eficaz de um composto ou composição da presente invenção será suficiente para tratar a inflamação num animal de sangue quente, tal como humano. Os métodos de administração de quantidade eficazes de agentes anti-inflamatórios são bem conhecidos na técnica e incluem a administração de formas de inalação, orais ou parenterais. Tais formas de dosagem incluem, mas não se limitam a, soluções, comprimidos, cápsulas, implantes de libertação sustentada e sistemas de administração transdérmica parenterais; ou sistemas de dosagem por inalação que utilizam inaladores de pós secos ou dispositivos de inalação multidose pressurizados. A quantidade e a frequência da dosagem, são, seleccionados para criar um nível eficaz do agente sem efeitos nocivos. Irá geralmente situar-se na gama de uma dosagem de desde cerca de 0,01 a 100 mg/kg/dia, e tipicamente desde cerca de 0,1 a 10 mg/kg/dia, quando administrados oralmente ou por via intravenosa. Também, a gama de dosagem irá ser tipicamente de 39 cerca de 0,01 a 1 mg/kg/dia quando administrada por via intranasal ou por inalação. Os compostos da invenção, incluindo os compostos usados nas utilizações e composições apresentadas acima, podem ser preparados de acordo com os Esquemas apresentados nos exemplos seguintes. Os exemplos seguintes são proporcionados a titulo ilustrativo e não de limitação. Excepto se referido de outro modo, cromatografia "flash" e cromatografia em coluna podem ser realizadas usando sílica gel 60 da Merck (230-400 mesh). A cromatografia "flash" pode ser realizada de acordo com o procedimento apresentado em: "Purification of Laboratory Chemicals", 3a. edição, Butterworth-Heinemann Ltd. , Oxford (1988), Eds. D. D. Perrin e W. L. F. Armarego, página 23. A cromatografia em coluna refere-se ao processo através do qual o caudal de eluente através de um material de enchimento é determinado por gravidade. Em todos os casos, pode-se usar intermutavelmente cromatografia "flash" e cromatografia radial. A cromatografia radial é realizada usando sílica gel num equipamento Chromatotron Modelo # 7924T (Harrison Research, Paio Alto, Califórnia). Excepto se indicado de outro modo, os valores Rf referidos são obtidos por cromatografia em camada fina usando Sílica Gel 60 F254 (Merck KGaA, 64271, Darmstadt, Alemanha). Igualmente, excepto se indicado de outro modo, os reagentes químicos foram obtidos de fornecedores químicos convencionais, tais como Aldrich (Milwaukee, WI; www.aldrich.sial.com); EM Industries, Inc. (Hawthorne, NY; www.emscience.com); Fisher Scientific Co. (Hampton, NH; www.fischer.com); e Lancaster Synthesis, Inc. (Windham, NH; www.lancaster.co.uk). Os gases foram obtidos da Praxair (Vancouver, B.C.). As linhas celulares, excepto se indicado 40 de outro modo, foram obtidas de fontes públicas ou comerciais, por exemplo, American Tissue Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). EXEMPLOS DE SÍNTESE E DE REFERÊNCIA Síntese de Intermediários dos Compostos da Invenção e exemplos de referência Os intermediários usados na preparação dos compostos da invenção podem ser preparados por métodos apresentados no seguinte Esquema Reaccional 1. Por exemplo, o anidrido misto, obtido a partir do ácido (3,4-dimetoxifenil) acético 16 (Aldrich) e do cloreto de trimetilacetilo, é feito reagir com o anião lítio de (S)-(-)-4-benzil-2-oxazolidinona para resultar no composto 17. A adição de Michael enantiosselectiva do enolato de titânio da oxazolidinona quiral 17 ao acrilato de terc-butilo proporcionou o composto 18 com uma funcionalidade carboxilato com um grupo protector adequado. A hidrólise do auxiliar quiral com hidróxido de lítio e peróxido de hidrogénio resulta no ácido carboxílico 19. A redução selectiva do composto 19 com BH3-THF origina o composto 20 contendo o álcool primário. 41 EscpjÍeaia de Reagçao 1
    aHs. THP mo
    A síntese dos compostos 17 - 20 neste Esquema Reaccional é especificamente descrita abaixo. Síntese do Composto 17 Solução 1: Adicionou-se trietilamina (12,8 mL, 91,7 mmol) e depois cloreto de trimetil acetilo (10,4 mL, 84,2 mmol) a uma solução de solution ácido (3,4-dimetoxiphenil) acético 16 42 (15,0 g, 76,5 mmol) em THF (120 mL) a 0°C e a mistura foi agitada durante uma hora. Solução 2: Num segundo recipiente, adicionou-se n-butil-litio (2,5 M em hexanos, 33,7 mL, 84,2 mmol) a uma solução de (S)-(-)-4-benzil-2-oxazolidinona (14,9 g, 84,2 mmol) em THF anidro (75 mL) a -78°C. Esta solução foi agitada durante uma hora e depois adicionada à solução 1 a 0°C através de uma cânula. A mistura resultante foi aquecida de 0°C até à temperatura ambiente, agitada durante 24 horas, depois diluída com solução saturada de NaHCCb (300 mL) , e extraída com CH2C12 (3 x 200 mL). A fase orgânica combinada foi lavada com NaCl saturado (2 x 150 mL) , seca sobre MgSCh, filtrada e o filtrado concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel (hexanos/EtOAc, 4:1) para resultar no composto 17 (19,04 g, 70%) na forma de um sólido branco. Síntese dos Compostos 18 e 19 Adicionou-se lentamente isopropóxido de titânio (0,42 mL, 1,41 mmol) a uma solução de tetracloreto de titânio (0,50 mL, 4,50 mmol) em diclorometano anidro (10 mL) a 0°C. A mistura resultante foi agitada a 0°C durante 5 minutos e depois adicionou-se di-isopropiletilamina (1,04 mL, 5,91 mmol). Após 15 minutos, adicionou-se uma solução do composto 17 (2,0 g, 5,63 mmol) em diclorometano (10 mL) . A mistura foi agitada durante 90 minutos a 0°C, depois adicionou-se acrilato de terc-butilo (1,24 mL, 8,45 mmol). A mistura reaccional foi aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante 36 horas e depois diluída com cloreto de amónio saturado (50 mL) . A camada aquosa foi extraída com diclorometano (3 x 50 mL) e as fases orgânica combinadas foram lavadas com HC1 a IN 43 (2 χ 75), água (2 x 75 mL) e NaCl saturado (2 x 75 mL) . Após secar sobre MgS04, a filtração e a evaporação do filtrado sob vácuo originou o composto em bruto 18 (2,69 g) que foi usado sem purificação suplementar. 0 composto em bruto 18 (2,69 g) foi dissolvido numa mistura de 3:1 THF/água (85 mL) e arrefecido a 0 C. Adicionou-se hidróxido de lítio mono-hidratado (466,6 mg, 11,12 mmol) e peróxido de hidrogénio a 30% (2,5 mL, 22,25 mmol) e a mistura foi agitada a 0°C durante 3 horas. Adicionou-se uma solução de sulfito de sódio (3,06 g, 24,46 mmol) seguida de bicarbonato de sódio a 0,5 N (41 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas e depois concentrada sob vácuo. A fase aquosa foi diluída com HC1 a 5% a pH = 2 e depois extraída com EtOAc (3 x 75 mL) . As fases orgânicas combinadas foram secas sobre MgS04, filtradas e o filtrado concentrado sob vácuo. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel usando 0,2% de ácido acético em 20% de acetato de etilo/hexanos para resultar no composto 19 (1,09 g, 60% em dois passos) na forma de um óleo amarelo claro. Síntese do Composto 20 Adicionou-se BH3-THF (solução a 1, 0 M em THF, 37,6 mL, 0, 0376 moles) gota a gota ao longo de 20 minutos a uma solução do composto 19 (12,18 g, 0,0376 moles) em THF anidro (50 mL) a 18°C. O banho de arrefecimento foi então removido, e a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. Adicionou-se uma solução saturada de NaHC03 (50 mL) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 75 mL) . A fase orgânica combinada foi lavada com NaCl saturado (2 x 75 mL) . A fase orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e o filtrado 44 evaporado sob vácuo. 0 resíduo foi purificado por cromatografia em coluna, eluindo com 50% EtOAc em hexanos para resultar no composto 20 (10,52 g, 91%) na forma de um óleo incolor. Alternativamente, intermediários dos compostos da invenção com diferentes grupos alcoxi no anel fenilo podem ser sintetizados pelos métodos descritos abaixo no Esquema Reaccional 2. Por exemplo, o álcool 3-hidroxi-4-metoxibenzílico 31 comercialmente disponível é selectivamente protegido como o derivado benziloxi 32 por tratamento de 31 com brometo de benzilo e carbonato de potássio em tolueno sob refluxo para resultar em 89% do produto desejado após cristalização. Faz-se então reagir o composto 32 com cloreto de metanossulfonilo na presença de trietilamina e CH2C12 para resultar no composto 33, que é usado sem purificação suplementar. 0 produto em bruto 33 é então colocado em DMF e tratado com cianeto de potássio na presença de 18-coroa-6. Após processamento e purificação, o nitrilo 34 é isolado com um rendimento de 91% em dois passos. A hidrólise do nitrilo 34 com hidróxido de potássio é então conseguida para resultar no ácido carboxílico 35 desejado com um rendimento de 95%. 0 tratamento do composto 35 com cloreto de trimetilacetilo resulta num anidrido misto que é feito reagir com o anião lítio de (S)-(-)-4-benzil-2-oxazolidinona para fornecer o composto 36 com um rendimento de 75%. A adição enantiosselectiva de Michael do enolato de titânio da oxazolidinona quiral 36 ao acrilato de tert-butilo proporciona o composto 37 com a funcionalidade carboxilato com um grupo protector adequado. A hidrogenação do composto 37 resultou no álcool com rendimento quantitativo, o qual é convertido no derivado ciclopentiloxi 38 com um rendimento de 64% por tratamento com brometo de ciclopentilo, carbonato de 45 potássio e iodeto de potássio em DMF. Deste modo, qualquer número de derivados alcoxi no anel fenilo pode ser preparado usando o brometo de alquilo correspondente ou o brometo de alquilo funcionalizado. A hidrólise do auxiliar quiral com hidróxido de lítio e peróxido de hidrogénio resulta no ácido carboxilico 39 com um rendimento de 91%. A redução selectiva do composto 39 com BH3-THF resulta no composto 40 (rendimento 89%) contendo o álcool primário. Esquema cie Reacção 2
    dilsoprapileti lassíria ClfcCfe
    46 A síntese dos compostos 32-40 neste Esquema Reaccional é especificamente descrita abaixo. Síntese do Composto 32 A uma suspensão rapidamente agitada de álcool 3-hidroxi-4-metoxibenzílico 31 (30,0 g, 195 mmol), adiciona-se carbonato de potássio (62,2 g, 450 mmol), e 18-coroa-6 (0,40 g, 1 mol%) em tolueno (350 mL) a uma solução de brometo de benzilo (25,6 g, 150 mmol) em tolueno (150 mL) ao longo de 20 min. A mistura reaccional foi submetida a refluxo durante 16 horas, após o que a mistura foi diluída com éter dietílico (400 mL) e lavada sucessivamente com NaOH (1 N, 2 x 250 mL) , solução aquosa saturada de NaHC03 (2 x 250 mL) , e salmoura (2 x 300 mL) . A fase de éter dietílico foi seca sobre MgSCt anidro, e o solvente foi removido para resultar num sólido amarelo pálido (42,1 g) que foi cristalizado com EtOAc e hexanos para resultar no composto 32 (32, 7 g, 89%) na forma de um sólido cristalino branco. Síntese do Composto 33 O composto 32 (30,0 g, 122,8 mmol) foi dissolvido em diclorometano (300 mL) e arrefecido até 0°C, e depois adicionou-se Et3N (20,4 mL, 147,36 mmol) e cloreto de metanossulfonilo (11,40 mL, 147,36 mmol). O banho de gelo foi removido, e a solution foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura foi depois diluída com diclorometano (700 mL) , lavada sucessivamente com solução aquosa saturada de NaHC03 (2 x 300 mL) e H20 (2 x 300 mL). A fase orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e o filtrado foi concentrado para resultar no composto 33 (33,08 g) na forma 47 de um sólido amarelo pálido que foi usado no passo seguinte sem purificação suplementar. Síntese do Composto 34 A uma solução do 33 em bruto (33,08 g) em DMF anidra (200 mL) adicionou-se KCN (15,99 g, 245,6 mmol) e 18-coroa-6 (5,19 g, 19,65 mmol). A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas, depois vertida em água (1,5 L) . 0 precipitado foi recolhido e dissolvido em EtOAc (600 mL), lavado com H20 (2 x 200 mL) e salmoura (2 x 200 mL) . A fase orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e o filtrado foi concentrado para resultar no composto 34 (28,5 g, rendimento de 91% em dois passo) na forma de um sólido branco sujo. Síntese do Composto 35 Uma mistura do composto 34 (28,0 g, 110,5 mmol) e KOH (94,0 g, 167,5 mmol) em H20 (170 mL) foi aquecida sob refluxo durante 12 horas. Depois, a mistura reaccional foi arrefecida até à temperatura ambiente, foi diluída com H20 (1.6 L) e acidificada com 12 N HC1 a pH=2. O precipitado resultante foi recolhido e seco sobre P2O5 para resultar no composto 35 (28,8 g, 95%) na forma de um sólido branco. Síntese do Composto 36 Solução 1: Adicionou-se trietilamina (17,7 mL, 126,92 mmol) seguida por cloreto de trimetil acetilo (14,3 mL, 116,35 mmol) a uma solução do composto 35 (28,8 g, 105, 77 mmol) em THF (250 mL) a 0°C e a mistura foi agitada durante uma hora. Solução 2: Num segundo recipiente, adicionou-se n-butil-lítio (2,5 M em hexanos, 46,5 mL, 116,35 mmol) a uma solução de 48 (S) - (-)-4-benz il-2-oxazolidinona (20,6 g, 116.35 mmol) em THF anidro (145 mL) a -78°C. Esta solução foi agitada durante uma hora e depois adicionada à solução 1 a 0°C. A mistura resultante foi aquecida de 0°C até à temperatura ambiente, agitada durante 24 horas, depois diluída com solução saturada de NaHC03 (400 mL) , e extraída com CH2C12 (4 x 300 mL) . A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura (200 mL), seca sobre MgSCq, filtrada e o filtrado concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel (hexanos/EtOAc, 4:1) para resultar no material de partida (15,93 g) e no composto 36 (15,30 g, 75% com base na recuperação do material de partida) na forma de um sólido branco. Síntese do Composto 37 Adicionou-se lentamente isopropóxido de titânio (2,6 mL, 8,69 mmol) a uma solução de tetracloreto de titânio (3,1 mL, 27,8 mmol) em diclorometano anidro (100 mL) a 0°C. A mistura resultante foi agitada a 0°C durante 5 minutos e depois adicionou-se di-isopropiletilamina (6,7 mL, 38,24 mmol). Após 15 minutos, uma solução do composto 36 (15 g, 34,76 mmol) em diclorometano (100 mL) foi adicionada. A mistura foi agitada durante 90 minutos a 0°C, depois adicionou-se acrilato de terc-butilo (15,3 mL, 104,28 mmol). A mistura reaccional foi agitada durante 3 dias a 0°C e depois diluída com cloreto de amónio saturado (300 mL). A camada aquosa foi extraída com diclorometano (3 x 300 mL) e as fases orgânicas combinadas foram lavadas com HC1 a 5% (2 x 400 mL) , água (2 x 300 mL) e NaCl saturado (400 mL). Após secar sobre MgS04, filtração e evaporação do filtrado sob vácuo resultou no composto em bruto 37 (21,0 g). Uma porção do composto em bruto 37 (2,1 g) foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel 49 eluída com EtOAc/Hexanos (1:2) para resultar no composto em bruto 37 (1,55 g) na forma de um xarope. Síntese do Composto 38 Uma mistura do composto 37 (1,55 g, 2,77 mmol) e 10% Pd/C (150 mg) em EtOAc/AcOH (5:1,60 mL) foi agitada sob H2 (balão) durante 18 horas. A mistura foi filtrada em celite e o filtrado foi evaporado até à secura para resultar no composto fenólico intermediário (1,30 g, 100%). Uma suspensão do composto fenólico (0,30 g, 0,639 mmol), K2C03 anidro (0,132 g, 0,958 mmol), e Kl (5 mg) em DMF anidra (1,5 mL) foi agitada e aguecida a 65°C, e depois adicionou-se brometo de ciclopentilo (0,10 mL, 0,958 mmol) gota a gota. A mistura agitada foi aquecida a 65°C durante mais 21 horas. Após arrefecer até à temperatura ambiente, a mistura reaccional foi diluída com Et20 (50 mL) e lavada com H20 (2 x 25 mL). A fase orgânica foi seca com MgSCq e o solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel com hexanos/EtOAc (4: 1) como eluente para resultar no composto 38 (0,22 g, 64%) na forma de um xarope incolor. Síntese do Composto 39 O composto 38 (3,5 g, 6,51 mmol) foi dissolvido em THF/H20 (3:1,60 mL) e arrefecido até 0°C. Adicionou-se hidróxido de lítio mono-hidratado (0,546 g, 13,02 mmol) e 30% de peróxido de hidrogénio (2,98 mL, 26,04 mmol) e a mistura foi agitada a 0°C durante 3 horas. Adicionou-se uma solução de sulfito de sódio (3,61 g, 28,64 mmol) em água (19 mL) , seguida por bicarbonato de sódio a 0,5 N (35 mL). A mistura foi agitada à 50 temperatura ambiente durante 2 horas e depois concentrada sob vácuo. A fase aquosa foi diluída com HC1 a 5% até pH = 2 e depois extraída com EtOAc (3 x 75 mL) . As fases orgânicas combinadas foram secas sobre MgS04, filtradas e o filtrado concentrado sob vácuo. 0 produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel usando 0,2% de ácido acético em acetato de etilo/hexanos (1:4) como eluente para resultar no composto 39 (2,24 g, 91%) na forma de um sólido branco. Síntese do Composto 40 Adicionou-se BH3-THF (1,0 M solução em THF, 2,70 mL, 2,70 mmol) gota a gota ao longo de 40 minutos a uma solução do composto 39 (2,23 g, 2,64 mmol) em THF anidro (15 mL) a 18°C. O banho de arrefecimento foi então removido, e a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente for 18 horas. Adicionou-se uma solução aquosa saturada de NaHC03 (15 mL) , e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 50 mL) . A fase orgânica combinada foi lavada com NaCl saturado (2 x 50 mL) . A fase orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e o filtrado evaporado sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel, eluindo com 25% EtOAc em hexanos para resultar no composto 40 (1,91 g, 89%) na forma de um óleo incolor. Podem ser preparados intermediários adicionais na preparação dos compostos da invenção tal como descrito abaixo no Esquema Reaccional 3. Em geral, a conversão do composto 20 no intermediário chave 46 foi conseguida numa sequência de cinco passos como se segue. O traramento do composto 20 com complexo azida de zinco/bis-piridina, trifenilfosfina e azodicarboxilato de di-isopropilo em tolueno resulta 51 suavemente na azida correspondente 44 com um rendimento de 91%. 0 composto 44 é então hidrogenado na presença de 10% Pd-C e a amina resultante 45 é convertida no composto 46 (63% ao longo de dois passo) por tratamento com NaOH em DMF.
    OMe 46 A síntese dos compostos 44-46 neste Esquema Reaccional é especificamente descrita abaixo. Síntese do Composto 44 Preparação do complexo ZnN6.2Py: A uma solução agitada de Zn (N03) 2 · 6H20 (3,57 g, 12,0 mmol) em H20 (6 mL) adicionou-se gota a gota uma solução de NaN3 (1,56 g, 24,0 mmol) in H20 (12 mL) . A suspensão branca foi levada a 50 C num banho de óleo, depois adicionou-se piridina (2,0 mL, 24,7 mmol) gota a gota formando um precipitado branco denso. Continuou-se a agitação à medida que a mistura foi lentamente arrefecida até à temperatura ambiente. O sal foi filtrado, lavado com água gelada e seco sob vácuo para originar ZnN6.2Py (2,99 g, 81%) na forma de um sólido branco. 52 Adicionou-se azodicarboxilato de di-isopropilo (1,30 mL, 6,59 mmol) a uma suspensão do composto 20 (1,0 g, 3,30 mmol) , ZnN6.2Py (0,76 g, 2,47 mmol) e Ph3P (1,73 g, 6,59 mmol) em tolueno anidro (20 mL) . A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 18 horas. A mistura foi concentrada, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com hexanos/EtOAc (9:1) para resultar no composto 44 (1,01 g, 91%) na forma de um óleo incolor. Síntese do Composto 45 Uma mistura do composto 44 (1, 00 g, 2.98 mmol) e 10% Pd/C (100 mg) em EtOAc (30 mL) foi agitada sob H2 (balão) durante 18 horas. A mistura foi filtrada em celite e o filtrado foi evaporado até à secura para resultar no composto 45 (0,923 g, 100%) na forma de um xarope incolor. Síntese do Composto 46 Adicionou-se hidróxido de sódio (5 N, 0,14 mL, 0,70 mmol) a uma solução do composto 45 (0,21 g, 0,68 mmol) em THF (1 mL) e MeOH (1 mL) . A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 18 horas. A mistura foi concentrada, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com hexanos/EtOAc (9:1) para resultar no composto 46 (0,091 g, 63%) na forma de um sólido branco. Síntese dos Compostos da Invenção e exemplos de referência Os compostos da invenção podem ser preparados pelos métodos descritos abaixo no Esquema Reaccional 4. Nesta abordagem, o composto 46 é tratado com NaH e brometo de benzilo em DMF para resultar no composto 47 com um rendimento de 80%. O 53 composto 47 é então colocado em THF e alquilado com 4-(benziloxi)-3-metoxibrometo de benzilo para originar os produtos de acoplamento desejados 48 e 49 numa razão de 7,2:1 com um rendimento de 86%. Estes dois isómeros podem ser separados por cromatografia em coluna de sílica gel. A des-O-benzilação do composto 49 usando 10% Pd/C como catalisador ocorre facilmente e o fenol 50 é isolado com um rendimento de 98%. Hidrogenólise suplementar sob elevada pressão pode então resultar no composto 51. Esquema Reaccional 4
    H2, Pd/C
    Métodos alternativos para proteger o azoto da lactama podem também ser usados no seguinte Esquema Reaccional 5. Por exemplo, a protecção N de 46 como a N-t-butoxicarbonilamida pode ser conseguida usando di-terc-butildicarbonato e trietilamina em diclorometano para originar o derivado 52 com um rendimento de 95%. A alquilação do composto 52 com 4- 54 (benziloxi)-3-metoxibrometo de benzilo resulta no composto 53 com um rendimento de 67%. 0 composto 53 é uma mistura diasteromérica. A remoção do grupo protector N-BOC no composto 53 com ácido trifluoroacético em diclorometano origina o produto 54 com um rendimento de 74%. A hidrogenólise do composto 54 usando 10% Pd/C como catalisador proporciona a mistura diastereomérica 55 com um rendimento de 81%. Esquema Reaccional 5
    CF3COOH
    A síntese dos compostos 47-55 nos Esquemas Reaccionais 6 e 7 é especificamente descrita abaixo. 55 Síntese do Composto 47 0 composto 46 (0,184 g, 0,782 mmol) foi dissolvido em DMF (5 mL) e arrefecido até 0°C, adicionando-se NaH (0,0344 g, 60% em óleo mineral, 0,860 mmol). Após duas horas, adicionou-se lentamente brometo de benzilo (0,14 mL, 1,173 mmol) e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante mais 18 horas. O solvente foi evaporado e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com EtOAc para resultar no composto 47 (0,203 g, 80%) na forma de um sólido branco. Síntese dos Compostos 48 e 49 A uma solução do composto 47 (0,23 g, 0,707 mmol) em THF anidro (4 mL) sob árgon, adicionou-se lentamente LDA [0,85 mmol, preparada a partir de n-BuLi (0,34 mL, solução de 2,5 M em hexano, 0,85 mmol) e di-isopropilamina (0,12 mL, 0,85 mmol)] em THF (2 mL) a -78°C. A mistura foi agitada a -78°C durante uma hora, e depois adicionou-se HMPA (0,18 mL, 1,06 mmol) à mistura acima através de uma seringa. Após 15 minutos, adicionou-se 4-(benziloxi)-3-metoxibrometo de benzilo (0,434 g, 1,41 mmol) em THF (1 mL) . A mistura resultante foi agitada durante mais 2 horas a -78°C. O excesso de base foi neutralizado 0°C com solução aquosa saturada de NH4C1 (10 mL), e a solução resultante foi extraída com EtOAc (3 x 30 mL). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (2 x 40 mL) , secas sobre MgS04, filtradas e o filtrado foi evaporado até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com hexanos/EtOAc (3 : 2) para resultar nos compostos 49 (0,295 g, 75,6%) e 48 (0,041 mg, 10,5%) na forma de espumas brancas. 56 Síntese dos Compostos 50 e 51 Uma mistura do composto 49 (0,25 g, 0,453 mmol) e 10% Pd/C (50 mg) em EtOAc (20 mL) foi agitada sob H2 (balão) durante 48 horas. A mistura foi filtrada em celite e o filtrado foi evaporado até à secura para resultar no composto 50 (0,204 g, 98%) na forma de uma espuma branca. Hidrogenólise suplementar do composto 50 sob pressão elevada resulta no composto 51. Síntese do Composto 52 Adicionou-se di-tert-butil dicarbonato (0,724 g, 3,32 mmol) a uma solução do composto 46 (0,39 g, 1,66 mmol), Et2N (0,46 mL, 3,22 mmol) e DMAP (0.040 g) em CH2C12 (12 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 4 horas. A mistura foi concentrada, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com hexanos/EtOAc (2: 1) para resultar no composto 52 (0,543 g, 98%) na forma de um sólido branco. Síntese do Composto 53 A uma solução do composto 52 (0,54 g, 1,61 mmol) em THF anidro (7 mL) sob árgon adicionou-se lentamente LDA [1,93 mmol, preparada a partir de n-BuLi (0,77 mL, 2,5 M solução em hexano, 1,93 mmol) e di-isopropilamina (0,27 mL, 1,93 mmol)] em THF (4 mL) a -78°C. A mistura foi agitada a -78°C durante uma hora, e depois adicionou-se HMPA (0,42 mL, 2,42 mmol) à mistura acima através de uma seringa. Após 15 minutos, adicionou-se 4-(benziloxi)-3-metoxibrometo de benzilo (0,989 g, 3,22 moles) em THF (2 mL) . A mistura resultante foi agitada durante mais 4 horas a -78°C. O excesso de base foi neutralizado a 0°C com solução aquosa de NH4C1 (20 mL), e a 57 solução resultante foi extraída com EtOAc (4 x 50 mL). A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura saturada (2 x 50 mL), seca sobre MgS04, filtrada e o filtrado foi evaporado até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com hexanos/EtOAc (4: 1) para resultar no composto 53 (0,604 g, 67%) na forma de uma espuma branca. Síntese do Composto 54 Adicionou-se ácido trifuloroacético (10 mL) a uma solução do composto 53 (0,557 g, 0,990 mmol) em C2C12 (10 mL). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 2 horas e depois concentrada sob vácuo. O resíduo foi dissolvido em CH2C12 (100 mL) e lavado com NaHOC3 saturada (3 x 2 0 mL) . A camada orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e o filtrado concentrado sob vácuo. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel usando 5% MeOH em acetato de etilo como eluente para resultar no composto 54 (0,349 g, 76%) na forma de uma espuma branca. Síntese do Composto 55 Uma mistura do composto 54 (0,30 g, 0,65 mmol) e 10% Pd/C (30 mg) em EtOAc/AcOH (1: 1,10 mL) foi agitada sob H2 (balão) durante 5 horas. A mistura foi filtrada em celite e o filtrado foi evaporado até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com EtOAc/MeOH (9: 1) para resultar no composto 55 (0,195 g, 81%) na forma de um sólido branco. Alternativamente, os compostos da invenção podem ser preparados pelos métodos descritos no Esguema Reaccional 6. 58 Em geral, o tratamento do composto 40 com o complexo azida de zinco/bis-piridina, trifenilfosfina e di-isopropil azodicarboxilato em tolueno resulta na azida correspondente 56. O composto em bruto 56 é então hidrogenado na presença de 10% Pd-C para resultar no composto 57 com um rendimento de 76% em dois passos. O passo de ciclização da lactama envolve uma reacção num único recipiente com uma sequência de três passos usando solvólise de éster terc-butilico com ácido p-toluenossulfónico mono-hidratado, esterificação em metanol, e ciclização da lactama com adição de trietilamina para proporcionar o composto 58 com um rendimento de 96% ao longo dos três passos. A N-protecção do 58 resultante com carbonato de di-terc-butilo e trietilamina em diclorometano proporciona o derivado N-t-butoxicarbonilamida 59 com um rendimento de 84%. A alquilação do composto 59 com LDA e 4-(benziloxi) -3-metoxibrometo de benzilo resulta no composto 60 com um rendimento de 74%. O composto 60 é uma mistura diaestereomérica com uma razão R/S de 1:1. A remoção do grupo protector N-BOC no composto 60 com ácido trifluoroacético em diclorometano resulta no produto alvo 61 com um rendimento de 74%. A hidrogenólise do composto 61 usando 10% Pd/C como catalisador proporciona o produto final 62 com um rendimento de 81%. 59 Esquema Reaccional 6 MeO
    ΜθΟ
    NH, I.TsOH, MeOH MeO. BnO
    NBOC cPentO OMe 60 NBOC NH ,1. LDAA* I OMe cPentO OBn
    OMe 59 ((B0C)70 Et3N cPentO'
    OMe 58 CF3COOH
    A síntese dos Compostos 56-62 neste Esquema Reaccional é especificamente descrita abaixo. Síntese do Composto 56 Adicionou-se di-isopropil mmol) a uma suspensão do azodicarboxilato (1,62 mL, 8,24 composto 40 (1,5 g, 4,12 mmol), 60 ΖηΝ6.2Py (0,95 g, 3,09 mmol) e Ph3P (2,16 g, 8,24 mmol) em tolueno anidro (20 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas. A mistura foi então concentrada, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com 15% of EtOAc em hexanos para resultar no composto 56 (1,59 g) na forma de um óleo incolor. Síntese do Composto 57 Uma mistura do composto 56 em bruto (1,59 g) e 10% Pd/C (80 mg) em EtOAc (20 mL) foi agitada sob H2 (balão) durante 20 horas. A mistura foi filtrada em celite e o filtrado foi evaporado até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com EtOAc/MeOH/EtsN (85: 14: 1) para resultar no composto 57 (1,14 g, 76% ao longo de dois passo) na forma de um óleo incolor. Síntese do Composto 58 O composto 57 (0,301 g, 0,825 mmol) foi dissolvido em tolueno (18 mL) e MeOH (2 mL) e tratado com pTs0H-H20 (0, 472 g, 2,48 mmol). A solução foi aquecida sob refluxo durante 1,5 horas usando um dispositivo Dean-Stark. O dispositivo Dean-Stark foi então removido e adicionou-se Et3N (0,35 mL, 2,48 mmol) à solução, a qual foi aquecida sob refluxo durante mais 4 horas. O solvente foi evaporado e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel eluída com 2% AcOH em EtOAc para proporcionar o composto 58 (0,228 g, 96%) na forma de um sólido branco. 61 Síntese do Composto 59 Adicionou-se di-tert-butil dicarbonato (0,935 g, 4,28 mmol) a uma solução do composto 58 (0,62 g, 2,14 mmol), Et3N (0,60 mL, 4,28 mmol) e DMAP (0, 060 g) em CH2CI2 (20 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 5 horas. A mistura foi concentrada, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com hexanos/EtOAc (3: 1) para resultar no composto 59 (0,696 g, 84%) na forma de um sólido branco. Síntese do Composto 60 A uma solução do composto 59 (0,60 g, 1,54 mmol) em THF anidro (5 mL) sob árgon adicionou-se lentamente LDA [1,85 mmol, preparada a partir de n-BuLi (0,74 mL, 2,5 M solução em hexano, 1,85 mmol) e di-isopropilamina (0,26 mL, 1,85 mmol)] em THF (2 mL) a -78°C. A mistura foi agitada a -78°C durante uma hora, e depois adicionou-se HMPA (0,40 mL, 2,30 mmol) à mistura acima através de uma seringa. Após 15 minutos, adicionou-se 4-(benziloxi)-3-metoxibrometo de benzilo (0,71 g, 2,30 mmol) em THF (2 mL). A mistura resultante foi agitada durante mais 4 horas a -78°C. O excesso de base foi neutralizado a 0°C com solução aquosa saturada de NH4C1 (20 mL) , e a solução resultante foi extraída com EtOAc (3 x 60 mL). A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura saturada (2 x 50 mL), seca sobre MgS04, filtrada e o filtrado foi evaporado até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com hexanos/EtOAc (7: 3) para resultar no composto 60 (0,693 g, 74%) na forma de uma espuma branca. 62 Síntese do Composto 61 Adicionou-se ácido trifluoroacético (3 mL) a uma solução do composto 60 (0,63 g, 1,02 mmol) em CH2CI2 (3 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 4 horas, diluída com tolueno (20 mL) e depois concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel usando 5% MeOH em acetato de etilo como eluente para resultar no composto 61 (0,39 g, 74%) na forma de um sólido branco. Síntese do Composto 62 Uma mistura do composto 61 (0,28 g, 0,54 mmol) e 10% Pd/C (27 mg) em EtOAc/AcOH (1: 1,6 mL) foi agitada sob H2 (balão) for 5 horas. A mistura foi filtrado em celite e o filtrado foi evaporado até à secura. 0 resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel eluída com EtOAc/MeOH (97: 3) para resultar no composto 62 (0,20 g, 84%) na forma de uma espuma branca. Alternativamente, compostos da invenção podem ser preparados por métodos similares àqueles descritos abaixo nos Esquemas Reaccionais 7 e 8. Por exemplo, no Esquema Reaccional 8, a protecção do álcool primário no composto 40 pode ser conseguida usando brometo de benzilo (BnBr) e carbonato de césio em DMF para resultar no derivado benziloxi 188. O composto 188 pode então ser convertido no seu ácido correspondente 189 através da reacção do composto 188 com ácido trifluoroacético. 63 Esquema Reaccional 7
    0 composto 189 pode então ser usado para preparar compostos da invenção tal como apresentado abaixo no Esquema Reaccional 8 . 64 Escfuerria de Reacção 8
    A síntese dos compostos 223-227 neste Esquema Reaccional é especificamente descrita abaixo. Síntese do Composto 223 A. As seguintes soluções (Solução 1 e Solução 2) foram preparadas independentemente. Solução 1: Adicionou-se trietilamina seguida por cloreto de trimetil acetilo a uma solução do composto 189 em THF a 0°C, e a mistura foi agitada 65 durante uma hora. Solução 2: Adicionou-se n-Butil-litio a uma solução of (R)-(-)-4-benzil-2-oxazolidinona em THF anidro a -78°C, e a mistura foi agitada durante uma hora. B. A solução 2 foi adicionada à Solução 1 através de uma cânula. Deixou-se a mistura resultante a 0°C aquecer até à temperatura ambiente. Após agitar à temperatura ambiente durante 24 horas, a mistura foi diluida com a solução saturada de NaHC03, e extraída com CH2CI2. As camada orgânicas foram combinadas, lavadas com H20, secas sobre MgS04, filtradas, e o filtrado concentrado sob vácuo. 0 resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel para resultar no derivado de (R)-(-)-4-benzil-2-oxazolidinona desejado. C. Adicionou-se lentamente n-butil-lítio a uma solução of di-isopropilamina em THF anidro a -78°C. A mistura reaccional foi agitada a -78 C sob árgon durante 1 hora a -78 C. 0 derivado de (R)-(-)-4-benzil-2-oxazolidinone em THF a -78°C foi adicionado e a mistura reaccional foi agitada durante 1 hora. Uma solução de brometos de 3-metil benzilo em THF foi então adicionada numa porção à mistura reaccional. A mistura resultante foi aquecida a 0°C e agitada durante mais 2 horas. 0 excesso de base foi neutralizado a 0°C com solução aquosa de NH4CI, e a solução resultante foi extraída com CH2C12. As camadas orgânicas foram combinadas, lavadas sucessivamente com NaHC03 saturado e H20, secas sobre MgS04, filtradas, e o filtrado foi concentrado sob vácuo. 0 resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel para resultar no composto 223. Síntese do Composto 224 66 Agitou-se o composto 223 e 10% Pd/C em EtOAc sob H2 (balão) durante 20 horas. A mistura foi filtrada através de Celite e o filtrado foi concentrado sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel para resultar no composto 224. Síntese do Composto 225 Adicionou-se di-isopropil azodicarboxilato a uma suspensão do composto 224 com adição e mistura com ZnN6.2Py e Ph3P em tolueno anidro. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas. A mistura foi concentrada sob vácuo, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel para resultar no composto 225. Síntese do Composto 226 Adicionou-se Li0H*H20 e H202 (30% em H20) a uma solução do composto 225 em THF/H20 (3: 1) a 0°C. A mistura reaccional foi agitada a 0°C durante 3 horas. Uma solução de Na2S03 em água foi então adicionada seguida por uma solução de NaHC03 a 0,5 N. A mistura foi agitada durante 2 horas, e depois evaporou-se o THF sob vácuo. Esta solução aquosa foi diluída com 2N HC1 até pH = 2 e depois extraída com EtOAc. As fases orgânicas combinadas foram secas sobre MgS04, filtradas e o filtrado foi evaporado até à secura. 0 óleo resultante foi purificado usando cromatografia em coluna em sílica gel para resultar no composto 226. Síntese do Composto 227 Agitou-se o composto 226 e 10% Pd/C em EtOAc sob H2 (balao) for 20 horas. A mistura foi filtrada através de Celite e o 67 filtrado foi evaporado até à secura. 0 resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel para resultar no composto ácido desejado. 0 composto ácido foi dissolvido em tolueno e MeOH e tratado com pTs0H*H20. A solução foi aquecida sob refluxo durante 1,5 horas usando um dispositivo Dean-Stark. 0 dispositivo Dean-Stark foi então removido e adicionou-se Et2N à solução, que foi aquecida sob refluxo durante mais 4 horas. 0 solvente foi evaporado e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel para originar o composto desejado 227. Tal como descrito em secções anteriores, os compostos da invenção, ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, podem conter um o mais centros assimétricos e podem assim originar enantiómeros, diastereómeros, e outras formas estereoisoméricas que podem ser definidas, em termos de estereoquímica absoluta, como (R) - ou (S)- ou, como (D)- or (L)- para aminoácidos. Pretende-se que a presente invenção inclua todos os isómeros possíveis, assim como as suas formas racémicas, enriquecidas opticamente e opticamente puras. Podem ser preparados isómeros opticamente activos ( + ) e (-) , (R)- e (S)-, ou (D)- e (L)- usando sintões quirais ou reagentes quirais, ou resolvidos usando técnicas convencionais, tais como HPLC de fase reversa utilizando uma fase estacionária quiral. Quando os compostos aqui descritos possuem ligações duplas olefínicas ou outros centros de assimetria geométrica, e excepto se especificado de outro modo, pretende-se que os compostos incluam ambos os isómeros geométricos E e Z. Do mesmo modo, também se pretendem incluir todas as formas tautoméricas. As tabelas seguintes são proporcionadas para definir as estruturas dos compostos da invenção e exemplos de referência 68 listados nos exemplos de utilidade. Todos os compostos nestas tabelas foram preparados usando a metodologia aqui descrita ou a metodologia descrita para compostos similares tal como aqui proporcionado. As abreviaturas usadas nas tabelas sao as seguintes: Ac é acetilo, Bn é benzilo, Me é metilo , Et é etilo, Bu é butilo, Hex é hexilo, Ph é fenilo, Pent é pentilo, Pr é propilo, Hept é heptilo, 4-ClPh é 4- clorofenilo, BOC é benziloxicarbonilo, cPent é ciclopentilo, iBu é isobutilo, e iPr é isopropilo.
    Estrutura Composto No. Ri=OMe, R2=OBn, R3=OMe, R4=OMe, Q=NBn 49 R1=OMe, R2=OH, R3=OMe, R4=OMe, Q=NBn 50 R1=OMe, R2=OH, R3=OMe, R4=OMe, Q=NH 51 69 ο
    Estrutura Composto No. Ri=OMe, R2=OBn, RJ=OMe, R4=OMe, Q=NBOC 53 R1=OMe, R2=OBn, R3=OMe, R4=OMe, Q=NH 54 R1=OMe, R2=OH, R3=OMe, R4=OMe, Q=NH 55 R1=OMe, R2=OBn, R3=OcPent, R4=OMe, Q=NBOC 60 R^OMe, R2=OBn, R3=OcPent, R4=OMe, Q=NH 61 R1=OMe, R2=OH, R3=OcPent, R4=OMe, Q=NH 62 Estrutura Composto No. R1=OMe, R2=OBn, R3=OMe, R4=OMe, R5=H, Q=NBn 48 R2=Me, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 227 R2=H, R2=F, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 228
    70 R1=H, R2=CF3, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 229 R4=H, R2=H, R3=OiPr, R4=OMe, R3=H, Q=NH 230 R4=H, R2=F, R3=OEt, R4=OMe, R5=H, Q=NH 231 R1=OPh, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, W=H, Q=NH 232 R2=H, R2=Me, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 233 R4=H, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 234 R4=OMe, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 235 R4=H, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=Me, Q=NH 236 R2=H, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=C1, Q=NH 237 R4=CF3, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 238 R1=C1, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 239 R4=0 (4-ClPh) , R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 240 R2=H, R2=iPr, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 241 R4=H, R2=OBu, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 242 R4=H, R2=OPh, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 243 R4=CF3, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=C1, Q=NH 244 R2=H, R2=OCF3, R3=0cPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 245 R1=OEt, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 246 R1=OPr, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 247 R1=OBu, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 248 R1=OPent, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 249 R1=OHex, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 250 R1=OHept, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 251 R2=Me, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NAc 252 R4=Me, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NC(0)Ph 253 R4=Me, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NiBu 254 R4=H, R2=CF3, R3=OiPr, R4=OMe, R5=H, Q=NH 255 Ri=OBn, R2=H, R3=OEt, R4=OMe, R5=H, Q=NH 256 R1=OBn, R2=H, R3=OiPr, R4=OMe, R5=H, Q=NH 257 R4=H, R2=H, R3=OEt, R4=OMe, R5=H, Q=NH 258 R4=F, R2=F, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 259 Ri=OBn, R2=H, R3=OcPent, R4=OMe, R5=H, Q=NH 260 71 Além dos compostos anteriores, o seguinte composto 261 foi preparado com os materiais de partida apropriados usando a metodologia aqui descrita:
    EXEMPLOS DE UTILIDADE Os testes biológicos in vitro e in vivo mostraram que os compostos da invenção apresentam uma gama de potentes actividade biológicas contra alvos relevantes para a atrite reumatóide, outras doenças inflamatórias e doenças relacionadas não inflamatórias tal como descrito abaixo. Tal como aqui usado, "tratamento da inflamação" refere-se tanto a terapia para inflamação, como para a prevenção do desenvolvimento de uma resposta inflamatória. Uma quantidade eficaz de um composto ou composição da presente invenção é usada para tratar a inflamação num animal de sangue quente, tal como humano. Os métodos para a administração de quantidades eficazes de agentes anti-inflamatórios são bem conhecidas na técnica e incluem a administração de formas de inalação, orais ou parentéricas. Tais formas de dosagem incluem, mas não estão limitadas a, soluções parentéricas, 72 cápsulas, implantes de libertação controlada e sistemas de administração transdérmica; ou formas de dosagem por inalação utilizando inaladores de pós secos ou dispositivos de inalação multidose pressurizados. A quantidade e a frequência da dosagem são seleccionadas para criar um nível eficaz do agente sem efeitos prejudiciais. Irá geralmente situar-se na gama de uma dosagem de desde cerca de 0,01 a 10 mg/kg/dia, quando administrados oralmente ou por via intravenosa. Também, a gama de dosagem irá ser tipicamente de cerca de 0,01 a 1 mg/kg/dia quando administrada por via intranasal ou por inalação. A administração de compostos ou composições da presente invenção pode ser realizada em combinação com a administração de outros agentes. Por exemplo, pode ser desejado co-administrar um glucocorticóide devido ao seu efeito na artrite. Geração de Espécies Reactivas de Oxigénio por Neutrófilos Activados Os neutrófilos compreendem mais de 90% do infiltrado leucocitário no fluido sinovial dos pacientes com artrite reumatóide (RA) e crê-se que contribuem tanto para as fases aguda e crónica desta e de muitas outras doenças inflamatórias através da libertação de mediadores pro-inflamatórios, enzimas de degradação da matriz e radicais de oxigénio tóxicos que resultam em lesões nos tecidos. Um mecanismo patogénico proposto é que as células são incapazes de fazer fagocitose de substâncias pro-inflamatórias de grandes dimensões, tais como complexos imunes o endotélio danificado presente nas articulações. Consequentemente, os grânulos neutrofílicos fundem-se com a membrana plasmática no 73 local da activação, em vez de internamente com vacúolos fagociticos, permitindo a libertação extracelular de espécies de oxigénio reactivas (ROS) pro-inflamatórias e outras substâncias tóxicas. A activação dos neutrófilos pode ser medida pela quantificação de ROS geradas in vitro. A medição de ROS permite a quantificação especifica de uma espécie pro-inflamatória e é também uma medida geral da activação de neutrófilos. 0 método mais sensivel para a medição da produção de ROS por neutrófilos é a quimioluminescência potenciada por luminol. 0 sistema de teste utilizado para avaliar a capacidade dos compostos em inibir a geração de ROS em neutrófilos é indicativa da actividade anti-inflamatória que pode ser eficaz em estados de doença incluindo mas sem limitação a artrite reumatóide e a doença inflamatória do intestino. Incubaram-se neutrófilos primários humanos acabados de isolar (5 x 106 células/mL) com as concentrações necessárias de composto ou de veiculo durante 30 minutos a 37°C em tampão HBSS (pH 7,4) contendo Ca2+. Usou-se wortmanina (100 nM) como controlo positivo. Transferiram-se aliquotas de cada amostra para uma microplaca à qual se adicionou luminol (1 μΜ) ; obtido da Sigma; No. Catálogo A8511. A activação dos neutrófilos foi imediatamente inicada através da adição de (1 M) fMLP; obtido da Sigma; No. Catálogo F3506. Registou-se a produção de luz de cada poço durante 30 minutos num luminómetro de microplacas. A produção total de luz (integral da produção ao longo do tempo) foi determinada para cada poço. As actividade inibidoras dos fármacos testados contra a geração de ROS dos neutrófilos é expressa como percentagem de actividade em relação a um controlo sem fármaco (100% de 74 activação ou geração de ROS) contendo 0,25% de DMSO. As concentrações de composto em teste necessária para inibir a geração de ORS a 50% dos valores de controlo (IC50's) foram determinadas a partir de curvas de concentração-resposta através de análise de regressão não linear. Os resultados são apresentados na Tabela 1. TABELA 1 Inibição da Desgranulação de Neutrófilos Por Compostos em Teste Tal Como Medida Pela Produção De ROS COMPOSTO NÚMERO GAMA DE IC50 (μΜ) <1 1-10 10-100 >100 54 X 61 X 62 X 55 X Tal como ilustrado na Tabela 1, compostos representativos da presente invenção apresentam ICso's na gama de 1-100 μΜ. Este resultado mostra que estes compostos potencialmente bloqueiam a geração de espécies reactivas de oxigénio pro-inflamatórias por neutrófilos in vitro. Este resultado pode advir da inibição da fosfodiesterase e/ou da sequestração química. Esta propriedade é preditiva de actividade anti-inflamatória in vivo devido ao papel estabelecido de lesão tecidular mediada por ROS, por exemplo, na artrite reumatóide, distúrbios inflamatórios do intestino e na psoríase. 75 Desgranulação Neutrofílica (Libertação de Mieloperoxidase) Os granulócitos neutrofílicos contêm vários tipos de organelos conhecidos como grânulos. Estes corpos sub-celulares contêm uma diversa gama de agentes bactericidas, incluindo proteases e outras enzimas hidroliticas que são essenciais para a resposta inflamatória normal mas que contribuem para lesão aguda dos tecidos quando os neutrófilos estão activados de forma crónica e/ou inapropriada por doença. Uma das enzimas caracteristicas dos grânulos é a mieloperoxidase (MPO) que catalisa a conversão de peróxido de hidrogénio em hipo-halogeneto. A MPO é libertada para o meio extracelular por estimulação da desgranulação e é um indice fiável da activação dos neutrófilos. 0 seguinte sistema de teste pode ser usado para avaliar a capacidade de um composto da invenção em inibir a libertação de MPO dos neutrófilos, o que é indicativo de actividade anti-reumatóide assim como de outras doenças nas quais está implicada a activação neutrofílica inapropriada. Recolhem-se dois tubos de sangue humano (12 mL) para tunos anticoagulantes ACD (Fisher; No. Catálogo 02-684-29). O sangue é misturado com 4 mL de 6% dextrano em solução salina. A mistura de sangue é recolhida numa seringa de 60 cc. Coloca-se a seringa com a ponta para cima numa bancada durante 30 min. A camada de soro superior é colocada sobre 4 mL de Histopaque (Sigma; No. Catálogo 1077-1) num tubo de centrífuga de 15 mL. O tubo é centrifugado durante 30 min a 2000 rpm. O sobrenadante é descartado. O sedimento é misturado com 3 mL de H2O fria, seguidamente com 1 mL de NaCl a 6N após 30 segundos. O tubo é centrifugado durante 5 min a 1100 rpm. O sedimento em cada tubo é combinado e lavado duas vezes com 10 mL (HBSS); Solução Salina Balanceada de Hank 76 (Stem Cell Ltd.; No. Catálogo LMC 75). As células sao contadas e diluídas até 2xl06 células/mL. Pipetam-se células (0,3 mL) para tubos de microcentrífuga previamente marcados. As células são incubadas com 5 yg/mL de citocalasina B, 10 nM de PGE2 e a concentração desejada do composto de teste ou de veículo (0,5% DMSO) durante 5 min a 37°C. Usa-se wortmanina ou rolipram como controlo positivo. Adiciona-se 100 nM fMLP a cada tubo excepto no controlo. Após 30 min de incubação, as células são colocadas em gelo e centrifugadas a 13000 rpm durante 3 min. Pipeta-se 50 yL de sobrenadante para poços apropriados de uma placa de 96 poços (triplicado) Adiciona-se 100 yL de substrato a cada poço (0,53 mM o-dianisidina; Sigma, No. Catálogo D 3252, 0,147 mM H202 em tampão fosfato a pH 6,0). A placa é incubada durante 30 min a 37 C. A reacção é terminada pela adição de 50 yL de H2SC>4 a 4N em cada poço. Para preparar uma curva de calibração, pipetam-se 200 yL de 1, 0,1, 0,01, e 0,001 mg/mL de peroxidase de rábano para os poços (triplicado). A placa é lida num leitor ELISA a 405 nm. Quimiotaxia dos Neutrófilos O processo de quimiotaxia (migração leucocitária dirigida ao longo de um gradiente de quimiocinas) é essencial para a acumulação de elevados números de neutrófilos associados com manifestações patológicas da inflamação (por exemplo, deterioração na articulação reumatóide). A quimiotaxia é um mecanismo primário através do qual os neutrófilos migram do lúmen dos vasos sanguíneos para o local da inflamação e como tal é um processo comum associado com lesões tecidulares mediadas por neutrófilos em muitas doenças inflamatórias. A inibição específica da migração neutrofílica para a 77 articulação inflamada é um alvo terapêutico válido na artrite reumatóide e muitas doenças inflamatórias. 0 seguinte sistema de ensaio in vitro pode ser usado para avaliar a capacidade de compostos da invenção em inibir a quimiotaxia, o que é indicativo de actividade anti-reumatóide in vivo e de actividade contra doenças inflamatórias nas quais estão implicados neutrófilos na lesão tecidular associada. Adiciona-se um tampão de quimiotaxia contendo o quimioatractor fMLP (10 μΜ) a cada poço de uma placa de quimiotaxia e insere-se um filtro assegurando o contacto entre o filtro e o tampão de quimiotaxia no poço. Usa-se uma concentração sub-máxima de quimioactractor. Para a determinação da migração espontânea das células certos poços não recebem o quimioatractor, mas apenas tampão. Incubam-se neutrófilos acabados de recolher (1 x 106) com veículo (0,125% DMSO) ± composto de teste durante 1 hora a 37°C. As suspensões celulares com tratamento e controlo são então cuidadosamente ressuspendidas e adiciona-se 20 yL de células na parte superior do filtro em cada poço. A placa é incubada durante 1,5 horas a 37°C sob 5% de C02. As células são então removidas da parte superior do filtro por aspiração e a totalidade da placa é centrifugada. O filtro é removido e adicionam-se concentrações conhecidas de células aos poços não usados para preparar uma curva de calibração. Adiciona-se uma solução de XTT (Sigma; No. Catálogo X 4251)/PMS (Sigma; No. Catálogo P 7626) preparada em tampão a cada poço e as células são incubadas por mais 1-2 horas e mede-se a absorvância a 450 nm. Os valores de absorvância são convertidos em números de células usando a curva de calibração. Os valores de IC50 são médias de pelo menos três experiências separadas com determinações em triplicado. 78 Inibição da Produção de TNF-α em Linfócitos T CD4+ Humanos Primários Estimulados com Concanavalina-A Sabe-se que linfócitos T activados produzem TNF-α e podem constituir uma fonte significativa deste mediador da inflamação em regiões localizadas da inflamação tal como o sinovial reumatóide ou as lesões psoriáticas. Os sobrenadantes de células T CD4+ humanas primárias estimuladas com conA que foram incubadas na presença ou ausência de um composto de teste, foram analisadas para TNF-α usando um sistema ELISA (Pharmigen; conjunto de anticorpos anti-TNF recomendados 18631-D e 18642-D). Foram induzidas quantidades substanciais de TNF-α em células T tratadas com veiculo estimuladas com conA. Tal como ilustrado na Tabela 2, compostos representativos da presente invenção foram capazes de inibir fortemente a produção de TNF-α derivado de células T. Este resultado contrasta com a menor potência destes compostos na inibição da libertação de TNF-α induzida por LPS no sangue completo humano. Isto pode ser devido à diferente sensibilidade dos monócitos/macrófagos versus linfócitos T a elevações no AMPc intracelular relativamente às vias regulatórias que influenciam a produção de TNF-α. Este resultado sugere que os compostos da invenção podem ser usados no tratamento de doenças envolvendo a produção de TNF-a. TABELA 2 Efeitos dos Compostos em Teste na Produção de TNF-ot Em Células T CD4+ Humanas Estimuladas Por ConA 79 COMPOSTO NÚMERO GAMA DE IC50 TNF-cx (μΜ) <2 2,0-20 >20 54 X 55 X 62 X ROLIPRAM X ZARDAVERINE X Inibição da Função Auxiladora de Linfócitos T Humanos Introdução e Racional Muitas doenças inflamatórias com uma etiologia auto-imune incluindo a artrite reumatóide e a psoriase caracterizam-se por um desequilíbrio na função das células T auxiliares de subconjuntos de linfócitos T auto-reactivos resultando na iniciação e na manutenção de um estado pro-inflamatório. Este desequilíbrio é frequentemente manifestado como uma expressão excessiva de um fenótipo Thl e/ou supressão de um fenótipo Th2. As células T que secretam IL-2 e INF-γ são designadas Thl ou células do tipo 1. Estas células estão envolvidas através de imunidade mediada por células directa pela activação de macrófagos e de vias celulares citotóxicas. As células que produzem IL-4, IL-5 e IL-10 são denominadas Th2 ou células do tipo 2 e regulam a resposta imunitária humoral. Compostos representativos da presente invenção inibiram a função Thl mais fortemente do que a função Th2 in vitro em células T CD4+ humanas primárias estimuladas com concanavalina A. Assim, estes compostos podem ter valor terapêutico por serem capazes de eliminar células Thl sem afectar as células Th2 num grau significativo resultando 80 assim numa correcção do desequilíbrio numa doença inflamatória auto-imune caracterizada por elevadas respostas Thl. 0 teste nas células T humanas primárias envolve a sua activação por concanavalina A (conA); (Sigma, No. Catálogo C 5275), seguida da detecção por ELISA de citocinas para qualquer um dos perfis. No caso dos perfis Thl, usam-se IL-2 e INF—γ como termos de comparação, enquanto que IL-10 é o indicador para o perfil Th2. Biologicamente, estes indicadores são úteis pelo facto de IL-2 ser o principal mitogénio de células T enquanto que IL-10 representa um agente imunossupressor poderoso mas selectivo. Métodos Recolhem-se aproximadamente 60 cc de sangue humano completo em tubos do tipo "vacutainer". Separam-se em alíquotas 15 mL de Ficoll Paque 1077 em 6 tubos cónicos estéreis de 50 mL. Uma alíquota de sangue (10 mL) foi lentamente disposta numa camada no topo do Ficoll Paque mantendo o tubo na vertical e pousando a ponta da pipeta na borda interior do tubo e permitindo ao sangue correr lentamente pela parede do tubo. Os tubos foram centrifugados a 1700 rpm durante 30 minutos à temperatura ambiente. A camada de plasma acima da banda leucocitária foi removida por espiração e usou-se uma pipeta de Pasteur para levantar a banda leucocitária e transferi-la para um tubo cónico estéril de 50 mL. As células de cada tubo de gradiente de leucócitos foram transferidas para tubos cónicos de 50 mL separados. Adicionou-se PBS estéril a pH 7,4 a cada tubo cónico de 50 mL contendo células da banda de leucócitos para um volume de 50 mL. Os tubos foram centrifugados a 1100 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante 81 foi removido por aspiração e as células foram ressuspendidas e 50 mL de PBS a pH 7,4. Os tubos foram de novo centrifugados a 1100 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi removido por aspiração e as células foram ressuspendidas em meio apropriado a ma densidade de 5 x 107 células/mL ou 2 x 106 células/mL. Preparação de Linfócitos em Bruto: Células da preparação de leucócitos foram ressuspendidas em meio BASAL (AcitCyte™) ou RPMI 1640 com 10% FBS + 2 mM glutamina a uma densidade de 1 x 106 células/mL. Preparação de células T CD4+: Células da preparação de leucócitos foram ressuspendidas em PBS estéril a pH 7,4 suplementado com 2-6% de Soro Fetal Bovino (FBS) a uma densidade de 5 x 107 células/mL. As células estavam então prontas para serem isoladas. Isolamento de Células T CD4+ (StemSep™) I) Marcaçao Imunomagnética: Adicionou-se um cocktail de anticorpos (100 pL; Stem Cell Technologies, No. Catálogo 14062) para cada mL de células e misturou-se bem. Após 30 minutos de incubação em gelo, adicionou-se 60 pL de colóide magnético para cada mL de células e misturou-se bem. Após 30 minutos finais de incubação em gelo, as células estavam prontas para separação magnética. II) Procedimento de Separação (Alimentação por gravidade): 82 A amostra foi carregada para o topo da coluna. A torneira de passagem foi rodada para permitir que o meio fluísse para baixo através da coluna, e o meio foi recolhido num tubo de recolha. Adicionou-se à coluna PBS suplementado com 2-6% FBS até se terem recolhido três volumes de coluna (não incluindo o volume da amostra inicial). As células foram lavadas, contadas e ressuspendidas em RPMI 1640 com 10% FBS + 2 mM L-glutamina a uma densidade de 1 x 106 células/mL. Procedimento de Ensaio de IL-2, IFN-γ, TNF-ot e IL-10 Isolaram-se células T CD4+ tal como descrito acima. As células foram suspendidas em meio RPMI 1640 (Stem Cell Technologies Inc.; No. Catálogo 36750) com 10% FBS +2 mM L-glutamina numa densidade de 1 x 106 células/mL. As células foram mantidas em gelo enquanto foram preparados os compostos de teste. Os compostos de teste foram preparados numa placa de ensaios de 96 poços estéril a 50X a concentração de teste desejada final; todos os poços continham uma quantidade igual de veículo dimetilsulfóxido. Adicionaram-se as células T CD4+ (500 pL) a cada poço de uma placa de ensaios de 24 poços. Adicionou-se uma única alíquota (10 pL) de cada solução de trabalho de composto de teste aos poços apropriados; dois poços foram deixados como controlos estimulado e não estimulado. Adicionou-se concanavalina A (10 pL) (50X a concentração final) a 10 pg/mL a cada poço com a excepção dos poços de controlo não estimulado. As células foram incubadas a 37°C durante 48 horas. O meio acondicionado foi então avaliado por ELISA para a quantiade de IL-2, IFN-γ, TNF-α e IL-10 presente. 83 Resultados e Discussão As Tabelas 3A, 3B e 3C representam um resumo de dados ao longo de indivíduos relativamente à potência dos compostos da invenção na sua capacidade de inibir citocinas que são prováveis promover ou diminuir uma resposta Thl ou Th2. Nas Tabelas 3A, 3B e 3C, é observado o efeito dos compostos representativos da presente invenção na produção de IL-2, IFN-γ e IL-10 em células T CD4+ humanas periféricas estimladas com 10 yg/mL de Concanavalina A durante 48 horas. Os IC50's são médias de pelo menos três experiências separadas realizadas em triplicado. As condições para o isolamento das células T CD4 + , incubação e a detecção das linfocinas são discutidas na secção de Métodos acima. Alguns membros desta série de compostos (em particular aqueles que inibem tanto PDE4 e PDE3) originam um perfil de citocinas de células T activadas que pode potencialmente corrigir o desequilíbrio de células Thl em relação a células Th2 observado em artrite reumatóide e outras doenças inflamatórias tais como a psoríase. A Tabela 3A apresenta exemplos de um membro desta série que demonstrou uma inibição selectiva de um perfil Thl das células seleccionadas CD4+ estimuladas com conA; em particular. Enquanto que a potência absoluta dos compostos varia dependendo do análogo utilizado, o efeito é claramente diferente daquele apresentado por Rolipram (Sigma; Catálogo No. R 6520). Observou-se que rolipram inibe tanto a síntese de IL-2 como de IL-10 por 48 horas. Pelo contrário, a estimulação por conA de IL-10 não é inibida por vários compostos de invenção enquanto que os mesmos sobrenadantes apresentam níveis reduzidos de IL-10. A depressão de um 84 perfil de citocinas Thl irá necessitar do aumento das células Th2 no local da inflamação. 0 beneficio acrescido da inibição da produção de IL-2 poderá, sob as circunstâncias certas, tornar células T reactivas anérgicas (isto é, células T que não respondem aos seus estímulos mitogénicos usuais através de TCR no contexto de MHC II) . Alternativamente, poderá também causar a apoptose de células T auto-reactivas. Deste modo, esta propriedade de inibição de Thl, sustentando Th2 dos compostos da invenção poderia proporcionar o potencial de conseguir uma melhoria terapêutica nas doenças mediadas por Thl tais como artrite reumatóide, psoríase e doença inflamatória do intestino, entre outras doenças. TABELA 3A Efeito dos Compostos em Teste nos Perfis Thl em Células T CD4+ Humanas Primárias Estimuladas com Concanavalina A GAMA DE IC50 IL-2 (μΜ) COMPOSTO 0,02-0,2 0,2-2,0 2,0-20 >20 54 X 55 X 62 X ROLIPRAM X ZARDAVERINE X 85 TABELA 3B Efeito dos Compostos em Teste nos Perfis Thl em Células T CD4+ Humanas Primárias Estimuladas com Concanavalina A GAMA DE ICso INF-GAMA (μΜ) COMPOSTO 0,02-0,2 0,2-2,0 2,0-20 >20 54 X 55 X 62 X ROLIPRAM X ZARDAVERINE X TABELA 3C Efeito dos Compostos em Teste nos Perfis Th2 em Células T CD4+ Humanas Primárias Estimuladas com Concanavalina A GAMA DE IC50 IL-10 (μΜ) COMPOSTO 0,02-0,2 O CM 1 CM O 2,0-20 >20 54 X 55 X 62 X ROLIPRAM X ZARDAVERINE X Sequestração de Radicais de Oxigénio Crê-se que os oxidantes e os radicais livres produzidos por neutrófilos e outras células contribuem para a patogénese da 86 artrite reumatóide e de outras doenças inflamatórias. De forma consistente com este envolvimento, os compostos capazes de inactivar radicais livres (antioxidantes) têm actividades anti-inflamatórias na artrite reumatóide e outras doenças inflamatórias. Compostos representativos da presente invenção inibiram a formação de radicais livres num teste in vitro convencional usado para medir a actividade antioxidante de materiais biológicos. A base do ensaio (um kit da RANDOX: Total Anti-Oxidant status) é a capacidade dos antioxidantes numa amostra em diminuir a formação de cor devido ao catião radical estável, ABTS*+. 0 cromogénio ABTS (2,2'-Azino-di-[3-etilbenztiazolina sulfonato] (Sigma; No. Catálogo A 1888)) (610 μΜ) é incubado com uma solução de substrato (peroxidase (metmioglobina) (6,1 μΜ) e H202 (250 M) ) em conjunto com um composto da invenção dissolvido em DMSO durante exactamente 3 minutos a 37°C. A produção do catião radical ABTS*+ que tem uma cor azul-esverdeada relativamente estável foi medida a 600 nM. A actividade antioxidante de 100 μΜ de composto de teste foi determinada como descrito acima. O controlo positivo usado foi um antioxidante biológico potente, Trolox® (ácido 6-hidroxi-2.5.7.8-tetrametilcroman-2-carboxílico). A inibição da formação de cor (actividade antioxidante) pelos compostos em teste é expressa em relação ao controlo positivo Trolox® (100% de inibição). Os resultados são apresentados na Tabela 4. A supressão de cor neste ensaio pode ser devida à inibição da produção de, ou à extinção do radical ABTS*+. 87 TABELA 4 Actividade Antioxidante dos Compostos Número do Composto Gama de actividade anti-oxidante (% do controlo) 1-25 25-50 50-75 75-100 54 X 55 X As características antioxidantes destes compostos poderia contribuir para as actividades anti-inflamatórias in vivo e ser de eficácia terapêutica em doenças inflamatórias envolvendo radicais de oxigénio. Assim, a actividade antioxidante dos compostos da invenção poderia constituir um mecanismo adicional de acção anti-inflamatória além da inibição da AMPc fosfodiesterase. Inflamação Aguda-Edema na Orelha de Ratinho Induzida por Resiniferitoxina Uma das caracteristicas primárias da inflamação é um aumento na dilatação e permeabilidade vascular conduzindo à extravasão de, e colecção de fluidos no, interstício resultando em vermelhão e inchaço. Em particular, a artrite reumatóide é caracterizada por um edema pronunciado das articulações afectadas resultando numa dor significativa e rigidez. 0 modelo de inflamação da orelha de ratinho é um teste in vivo convencional para inflamação que se baseia no aumento do peso da orelha que pode ser atribuído ao edema induzido por mediadores inflamatórios. RTX (resiniferitoxina; Sigma, No. Catálogo R 8756)) é um diterpeno isolado da planta Euphorbia poisonii e é um análogo ultra-potente da 88 capsaicina. RTX actua através da estimulação selectiva de terminações nervosas nociceptivas e sensíveis ao calor em tecidos, provocando o edema neurogénico. Um composto representativo da invenção, quando administrado oralmente, inibiu o desenvolvimento do edema induzido pela aplicação tópica de RTX. 0 edema tal como induzido neste modelo é inibido por inibidores da PDE4 e é deste modo um sistema in vivo útil para a diferenciação da eficácia de compostos em teste que possuam potências in vitro comparáveis. Separaram-se ratinhos (CD1, Charles River Laboratories) em grupos (n=5-8) e foram identificados. Para administração oral (p.o.), forneceram-se aos animais 10 mg/kg de composto de teste em 100 pL de PEG-200, e depois o edema foi induzido usando 0,1 pg/orelha RTX após um período de espera de 1,5 horas. Após a indução do edema, os ratinhos foram sacrificados, e removeu-se um disco padrão de tecido da orelha. Cada disco de tecido foi imediatamente pesado arredondando à 10a de mg. Os dados foram analisados tomando a diferença de cada orelha esquerda relativamente à orelha direita, calculando a média +/-EPM. A significância estatística foi testada por um teste-t 2 amostras nas diferenças dos pesos das orelhas esquerda/direita do grupo de controlo vs. o grupo experimental. TABELA 5 Inibição do Edema na Orelha de Ratinho Induzido pela Resiniferitoxina pela Administração Oral de Compostos em Teste Número do Composto % Inibição do Edema 62 30 89 Inibição das fosfodiesterases dos nucleótidos ciclicos Inibição da AMPc Fosfodiesterase 4 0 aumento de AMPc em células envolvidas na inflamação tais como neutrófilos, células endoteliais, macrófagos, eosinófilos, basófilos, linfócitos T, etc., geralmente conduz à inibição do perfil de citocinas inflamatórias tais como a inibição da expressão do factor de necrose tumoral (TNF-cx). A expressão da citocina anti-inflamatória interleucina-10 (IL-10) é regulada positivamente por AMPc em muitas células num local de inflamação. Uma vez que a degradação de AMPc na célula é realizada através de AMPc fosfodiesterases (PDEs), são de interesse inibidores específicos destas enzimas. Tais compostos teriam o efeito de elevar o AMPc intracelular nas células que expressam as isoenzimas PDE que inibem especificamente. Apesar de existirem pelo menos nove famílias diferentes de PDEs de nucleótidos cíclicos, a família das PDE4 é de particular interesse. Isto é devido ao facto de muitos dos tipos celulares típicos que participam na resposta inflamatória expressam predominantemente PDE4 relativamente às outras PDEs. Mostrou-se que os inibidores de PDE4 tal como rolipram elevam especificamente AMPs em células inflamatórias tais como neutrófilos e eosinófilos e suprimem o seu fenótipo inflamatório. Um inibidor de PDE4 terapeuticamente eficaz tem desejavelmente efeitos secundários mínimos, incluindo a indução da secreção de ácido gástrico, vómitos e efeitos no SNC. Inibidores PDE4 sem efeitos secundários prometem como uma nova geração de terapias anti-inflamatórias para doenças incluindo asma, doença inflamatória do intestino, artrite reumatóide, psoríase e transplantação alogénica, entre outras. 90 Fez-se um rastreio aos compostos desta invenção para actividade contra 5 das principais classes de fosfodiestereases de nucleótidos cíclicos de mamíferos (denominadas PDE1 a 5). As PDE' s 1 a 4 utilizam AMPc como substrato, enquanto que PDE 5 usa GMPc. A larga especificidade do inibidor de PDE 3-isobutil-metilxantina (IBMX; Sigma; No. Catálogo 17018)) foi usada como um controlo positivo em todos os ensaios. As PDE's para os vários ensaios foram parcialmente purificadas das seguintes células/tecidos; PDE1 (coração bovino), PDE2 (plaquetas humanas), PDE3 (plaquetas humanas), PDE 4 (células promonocíticas U937 humanas) e PDE5 (plaquetas humanas). Os extractos citoplasmáticos de U937 foram preparados pela sonicação de células U937 (ATCC: No. Catálogo CRL-159) em tampão de lise (20 mM Tris Cl, 1 mM EDTA, 5 mM β-mercaptoethanol, 1 μΜ pepstatina, 1 pg/mL leupeptina, 1 mM benzamidina e 0,1 mM PMSF). Os extractos celulares sonicados foram então centrifugados a 70000 g durante 30 minutos e os sobrenadantes foram removidos. Adicionou-se sacarose a uma concentração final de 0,25 M, separaram-se alíquotas e armazenou-se a -80°C Realizaram-se reacções PDE durante 30 minutos a 37°C em volumes de 20 pL volumes em 1 pM [3H] cAMP (Amersham sítio internet http://www.apbiotech.com), 0,5 U/mL de 5' nucleotidase (Sigma), 50 mM Tris Cl, 10 mM MgCl pH 7,5. 0 extracto U937 foi adicionado de modo que menos de 10% do substrato era consumido. O composto em teste ou o veículo foi adicionado à concentração desejada. Tipicamente, os compostos foram testados a seis diluições de 10 vezes desde 100 pM a 1 nM. As reacções foram realizadas em duplicado. As reacções foram terminadas pela adição de 200 pL de uma resina de 91 permita aniónica Dowex 1-8 400 Cl- numa razão de 1 resina: 2 metanol: 1 H2O. As amostras foram misturadas por inversão e depois deixaram-se repousar durante 2-3 horas. Uma alíquota de 65 yL foi removida, seca numa dispositivo Lumaplate (Packard; No. Catálogo 6005165) e contadas num contador de cintilações Packard (TopCount™) durante 1,5 minutos. A Tabela 6 mostra a actividade inibidora de compostos da invenção contra PDE4 isolada de uma linha celular promonocitica humana, U937. Utilizando as condições de ensaio PDE4 aqui descritas, inibidores típicos da PDE4 tais como Rolipram e Ro-20-1724 (Calbiochem: No. Catálogo 557502) originam valores IC50 em concordância com aqueles encontrados na literatura (revisão em Schudt et al., 1996). Além disso, a utilização de IBMX (Sigma; No. Catálogo 17018) que inibe as PDEs 1, 3 e 4 não mostra qualquer inibição adicional (dados não apresentados), de novo consistente com a descoberta de que a PDE predominante nas células U937 é PDE4. A inibição de PDE4 (ou mais precisamente, de isoformas específicas de PDE4) com um subsequente aumento de AMPc intracelular e da activaçao da proteína cinase A é um alvo terapêutico nas doenças inflamatórias ou auto-imunes em que as células causadoras ou os tecidos envolvidos expressam predominantemente esta isoforma PDE. Relativamente à artrite reumatóide, mostrou-se que o inibidor de PDE4 Rolipram era activo em modelos animais da doença tais como a artrite induzida por colagénio em ratazana (Nyman et al., Clin. Exp. Immunol. 105(3), 415-419,1997). 92 TABELA 6 Inibição de AMPc Fosfodiesterase 4 de Células U937 Humanas Composto Número Gama IC5o (μΜ) 0, 1-1 1-10 54 X 61 X 62 X 55 X 227 X 228 X 229 X 230 X 231 X 232 X 233 X 234 X 235 X 236 X 237 X 238 X 239 X 261 <0,1 240 X 241 X 242 X 243 X 244 X 245 X 246 X 247 X 93 Composto Número Gama IC5o (μΜ) 0, 1-1 1-10 248 X 249 X 250 X 251 X 252 X 253 >10 254 X 255 X 256 <0, 1 257 <0, 1 258 X 259 X 260 <0,1 Inibição da AMPc Fosfodiesterase 3 Compostos da invenção foram avaliados relativamente à actividade inibidora contra PDE3 de plaquetas humanas de modo a verificar se a inibição de PDE4 e a inibição de PDE3 podiam ser separadas e também os farmacóforos necessários para cada. Inibidores combinados PDE3/4 podem ser especialmente eficazes como agentes terapêuticos em doenças em que os tipos de células causadores/envolvidos expressam tanto PDE4 como PDE3, por exemplo células T em doenças inflamatórias tais como artrite, doença inflamatória do intestino, psoríase e transplantação alogénica. Em tais doenças, inibidores combinados PDE3/4 pode ter vantagens relativamente a um inibidor PDE4 selectivo tal como o Rolipram. 94 Prepararam-se extractos de células tal como descrito acima para as células U937. 0 ensaio de PDE3 foi realizado usando extractos de plaquetas tal como descrito acima para o ensaio PDE4. As plaquetas contêm PDE2, 3 e 5. No entanto, PDE2 e 5 utilizam preferentemente GMPc, pelo que num ensaio com AMPc como substrato não são detectadas. Além disso, nas condições usadas neste ensaio, o Rolipram não tem efeito e o inibidor de PDE3 conhecido trequinsina (Calbiochem; No. Catálogo. 382425) é um potente inibidor confirmando que o ensaio é especifico para PDE3. A Tabela 7 apresenta os IC5o's para compostos da invenção para a inibição de PDE3. As actividades de PDE3 e PDE4 parecem ser separáveis e os compostos apresentam uma grande gama de selectividade para PDE4 vs. PDE3. Alguns compostos são específicos para PDE4, alguns compostos são mais potentes contra PDE4 do que PDE3, e alguns compostos têm aproximadamente a mesma potência contra PDE4 e PDE3. Deste modo, os compostos da invenção podem ser seleccionados pela sua actividade PDE4/3 para permitir a máxima potência contra diferentes tipos de células. TABELA 7 Inibição de AMPc Fosfodiesterase 3 de Plaquetas Humanas Composto Número Gama IC50 (pM) 0, 1-1 1-10 >100 54 X 61 X 62 X 55 X 95 Composto Número Gama IC50 (μΜ) i—1 1 i—1 O 1-10 >100 227 X 228 X 229 X 231 X 255 X 256 X 257 X 259 X 260 X Especificidade de Isozima de PDE Os compostos da invenção podem ser testados para especificidade relativamente a isozima PDE pelo ensaio seguinte. Faz-se o rastreio aos compostos em teste (a 100 μΜ) relativamente à actividade contra PDE1, 2 e 5, usando métodos bioquímicos convencionais. O inibidor de PDE de larga especificidade 3-isobutil-l-metilxantina (IBMX) é usado como controlo positivo em todos os ensaios. As PDE's para os vários ensaios são parcialmente purificados das seguintes células/tecidos; PDE1 (coração bovino), PDE2 (plaquetas humanas) e PDE5 (plaquetas humanas). Deslocamento do Rolipram do seu Local de Ligação com Elevada Afinidade (HARBS) na AMPc Fosfodiesterase 4 Existe uma necessidade para inibidores da fosfodiesterase 4 que não tenham efeitos indesejáveis incluindo náuseas e vómitos. Modelos animais mostraram que a sua actividade é altamente correlacionada com a capacidade de um composto em deslocar [3H]-Rolipram de um local de elevada afinidade de 96 ligação de células no cérebro e no sistema nervoso central (SNC) [Duplantier 1996, Barnette 1996]. Um ensaio de deslocamento do Local de Ligação do Rolipram com Elevada Afinidade (HARBS) é usado para prever o potencial emético de um composto da presente invenção. Compostos representativos da presente invenção apresentaram uma baixa afinidade para o confórmero HARBS de PDE4 sugerindo que estes compostos não serão susceptiveis de causar efeitos secundários associados ao mecanismo de actuação associados com inibidores PDE4 de primeira geração tais como Rolipram. Ratinhos CD1 fêmea foram sacrificados através da injecção intraperitoneal de 100 yL de etanol, e o tecido cerebral foi homogeneizado em 5 mL de Tris-HCI gelado, pH 8,00 suplementado com 1,2 mM MgCl2, 1 mM benzamidina (Sigma; No. Catálogo B 6506) e 0,1 mM PMSF (Sigma; No. Catálogo P 7626). A suspensão foi centrifugada duas vezes a 30000 x G a 4°C e o sobrenadante foi descartado. O sedimento foi ressuspendido em tampão, e ajustado a uma concentração de proteína de 0,5 mg/mL. Os fármacos a serem testados foram dissolvidos em DMSO e pipetados em triplicado para uma microplaca de 96 poços a concentrações na gama de 1 a 30000 nM. Suplementou-se 10 mL de preparação membranar com 100 yL de 0,235 yM [3H]-Rolipram em DMSO, e dispensou-se 100 yL em cada poço da microplaca. A placa foi incubada a 4°C durante 1 hora. O conteúdo da placa foi aspirado através de uma plica filtrante Whatman GF/C, e lavado com 4x200 yL de tampão gelado. A placa foi seca durante a noite, adicionou-se 30 yL de Microscint 20 (Packard; No. Catálogo 6013621) a cada poço e a placa foi lida num contador de cintilações com um tempo de amostragem de 2 minutos/poço. Os valores representando ligação não específica (definidos por contagens usando 20 yM de Rolipram) foram subtraídos de todos os pontos. Realizaram-se 97 Os determinações em triplicado a cada concentração, resultados são apresentados na Tabela 8. PDE4: HARBS indica a razão da concentração IC50 necessária para inibir a actividade catalítica para a concentração necessária para deslocar 50% do Rolipram do local de ligação de elevada afinidade. Nestas condições de ensaio, o Rolipram é capaz de deslocar o 3H-Rolipram de um local de ligação com elevada afinidade no cérebro de ratinho com uma IC50 de cerca de 10 nM (dados não apresentados). Assim, o Rolipram liga-se com uma afinidade 20-40 vezes mais elevada no seu local de elevada afinidade que a concentração necessária para a meia inibição máxima da actividade catalítica de PDE4. Esta afinidade preferencial para HARBS relativamente ao confórmero catalítico tem sido correlacionada com os efeitos secundários negativos da primeira geração de inibidores de PDE4; nomeadamente vómitos e efeitos no SNC. Os dados apresentados na Tabela 8 indicam que os compostos testados são muito menos potentes na ligação a este local do que o Rolipram. Por exemplo, o Rolipram e o composto 234 têm IC50' s muito similares contra a actividade catalítica de PDE4 (280 e 250 nM respectivamente) , no entanto, as suas actividades HARBS são 10 nM e 210 nM, respectivamente. Assim, o composto 234 é aproximadamente 28 vezes menos potente que o Rolipram para interacção com o confórmero HARBS de PDE4. A razão das ICso's para PDE4catalítico relativamente a PDE4HARBS para o Rolipram e o composto 234 é 28 e 1,2, respectivamente. Esta razão para o composto 234 compara muito favoravelmente com valores apresentados para inibidores de segunda geração de PDE4 nos quais a actividade HARBS foi reduzida através de esforços SAR. Por exemplo, as razões apresentadas para SB 207499 (Ariflo) e RP 73401 (piclamilast) , dois inibidores 98 específicos de PDE4 que foram testados em ensaios de fase II para a asma são 1 e 3 respectivamente. Assim, os compostos da presente invenção podem apresentar efeitos emetogéncios in vivo que são muito inferiores aos do Rolipram, Ro 20-1724 ou outros inibidores de PDE4 de primeira geração. TABELA 8 Teste da Afinidade de Compostos para o Local de Ligaçao com Elevada Afinidade do Rolipram de PDE4 no Cérebro de Ratinhos Composto Número Gama IC5o (μΜ) PDE4:HARBS (razão) 0,01-0,1 0, 1-1 1-10 >10 54 X >1 61 X <1 62 X >1 55 X >1 227 X <1 228 X <1 229 X <1 230 X >1 231 X <1 234 X >1 235 X >1 236 X >1 261 X >1 246 X >1 247 X >1 248 X <1 249 X <1 250 X <1 99 Composto Número Gama IC50 (μΜ) PDE4:HARBS (razão) 1—1 O 1 5-1 O O 0,1-1 1-10 >10 251 X <1 252 X <1 253 X >1 254 X <1 255 X <1 256 X >1 257 X <1 258 X >1 259 X <1 260 X <1 Potenciação da Actividade de Luciferasa com Elemento de Resposta de AMPc Induzido pela Forscolina em Células Monociticas U937 Humanas De modo a demonstrar a capacidade dos compostos da presente invenção para elevar cAMP em células intactas, usou-se a transfecção de células com uma construção plasmídica contendo um elemento de resposta a AMPc (CRE) num promotor que controla a expressão de um gene repórter da luciferase (Stratagene; Path Detect™: No. Catálogo 219076) para permitir a monitorização com sensibilidade dos níveis intracelulares de AMPc através da detecção da produção de luz num luminómetro. O tratamento farmacológico das células transfectadas com um composto proporcionando uma combinação do inibidor PDE e agonista da adenilil ciclase (receptor ou activador intracelular) resulta nem níveis aumentados de AMPc intracelular detectáveis por intermédio de uma produção de 100 luz mais elevada. Verificou-se que PDE4 AMPc era actividade de fosfodiesterase de nucleótido cíclico predominante em células U937, e como tal este tipo de célula transfectada com a construção CRE-luciferase pode servir como um ensaio de rastreio celular conveniente para compostos com actividade de inibição da PDE 4. Assim mostrou-se que compostos da presente invenção proporcionam um aumento na expressão de luciferase em células U937 tratadas com o activador da adenilil ciclase forscolina. As células U937 pro-monocíticas humanas foram mantidas em meio RPMI contendo 10% de FCS e 2 mM glutamato. As células U937 foram transfectadas transientemente tal como descrito em Biotechniques Vol. 17 (6): 1058, 1994. Resumidamente, as células foram crescidas em meio contendo soro até uma densidade de 5 x 106 células/mL e depois ressuspendidas em meio contendo soro a uma densidade de aproximadamente 1 x 107 células/mL. 400 pL das células foram transferidos para uma cuvete de electroporação contendo 10 pg de vector repórter (pCRE-luc) num volume de 4 0 pL H20. O ADN do vector repórter foi preparado a partir de E. coli DH5 α usando o kit de endonuclease livre de ADN (Qiagen) conforme as instruções do fabricante. As células U937 foram electroporadas à temperatura ambiente usando um electroporador BIORAD. A capacitância foi regulada para 1050 pF e a voltagem foi de 280V. A constante de tempo foi anotada após cada electroporação. As células foram então diluídas em 4 mL de meio e soro e plaquearam- se 200 pL de células por poço. Deixou-se as células recuperar durante 16-18 horas. As células foram então tratadas com um composto de teste ou veículo na presença ou ausência de 10 pM de forscolina durante 4 horas a 37°C. 101 0 ensaio da luciferase foi realizado conforme as instruções do fabricante (Tropix). Resumidamente, as células foram centrifugadas durante 4 minutos a 1200 rpm e removeu-se o meio sobrenadante. Lisaram-se os sedimentos em 15 pL de tampão de lise (Tropix). O ensaio da luciferase foi realizado usando 10 pL de lisado celular com 10 pL de tampão A e 25 pL de tampão B. A actividade da luciferase foi obtida usando um luminómetro com um atraso de 5 segundos seguido por um tempo de leitura de 10 segundos. Como ilustrado na Tabela 9, compostos representativos da invenção potenciam a indução da actividade da luciferase em células U937 tratadas com 10 pM de forscolina. Nenhum dos compostos de teste por si só, induziram uma actividade de luciferase significativa, indicando uma baixa actividade de adenilil ciclase basal nestas células. Este resultado demonstra que estes compostos são capazes de elevar os níveis de AMPc numa linha celular que expressa predominantemente PDE4, consistente com as observações nos ensaios enzimáticos. Existe uma larga correlação entre a actividade inibidora de PDE4 in vitro e a potência da indução da CRE luciferase. O ensaio da CRE luciferase ou suas variantes (diferentes tipos celulares ou características da construção) serve assim como um ensaio SAR celular de salvaguarda/validação para ensaios enzimáticos PDE4 in vitro para optimização da eficácia para compostos da presente invenção. TABELA 9 Potenciação da Actividade de CRE-Luciferasa por Compostos em Teste em Células U937 Co-Incubadas com o Activador da Adenilil Cilcase Forscolina 102 Composto Número Gama IC5o (μΜ) i—l 1 i—1 O 1-25 >25 54 X 61 X 62 X 55 X 227 X 228 X 229 X 231 X 255 X 256 X 257 X 259 X 260 X Efeitos de Compostos da Invenção no Crescimento de Células Transformadas - Potenciais Actividades Anti-cancro Introdução A linha celular derivada da leucemia mielóide humana transformada BCR-ABL, K562 (ATCC; No. Catálogo CRL 243) pode ser usada para determinar como os compostos da presente invenção afectam o crescimento de células transformadas. 0 aumento do AMPc intracelular é um modo de causar a paragem do ciclo celular ou a apoptose em diversas doenças malignas, em particular em certos casos de leucemias (por exmeplo, CLL) . Foi registado que tais mecanismos intracelulares (isto é, AMPc) originam a diferenciação de clones leucémicos indiferenciados. Em particular, mostrou-se que o aumento do 103 AMPc intracelular (usando um análogo do AMP cíclico) em células de leucemia mileóide tranformadas p210 BCR-ABL é anti-proliferativo através da inibição de uma cinase 4 dependente de ciclina e subsequente sub-expressão de c-myc. Assim, a capacidade anti-proliferativa de compostos da presente invenção em células K562 cultivadas pode ser comparada com vários inibidores da fosfodiesterase usando um ensaio de assimilação de 3H-timidina. Métodos Células K562 (células de leucemia mielogénica crónica humana) (90 pL) são inoculadas em placas de ensiao de 96 poços a uma densidade de 1 x 105 células/mL em RPMI 1640 suplementado com 10% FBS/2 mM L-glutamina. As amostras a serem testadas são preparadas em placas de ensaio de 96 poços a lOx a concentração final desejada. Todas as diluições das amostras contêm quantidades iguais de DMSO para compensar para a %DMSO da maior concentração de amostra usada. São examinadas nove concentrações de composto em teste para efeitos no crescimento até uma concentração máxima de 100 μΜ. Adicionam-se 10 pL das amostras e dos controlos (DMSO/controlo de crescimento normal) às células aliquotadas. As células são incubadas a 37°C/ 5% C02 durante 48 horas. Após a incubação de 48 horas, adiciona-se 20 pL de 3H-timidina a cada poço para uma concentração final de 1 pCi/mL. As células são então incubadas a 37°C/5% C02 durante 4 a 6 horas. Após um pulso de timidina de 4-6 horas, as placas são envolvidas em plástico e congeladas a -20°C durante a noite num congelador ventilado. As células são recolhidas e são determinadas contagens de 3H-timidina. De modo a distinguir entre actividade citotóxica e citostática, são preparadas curvas de crescimento em que o valor CPM médio da densidade de inoculação das células é 104 representado na mesma curva que o valor CPM médio para a proliferação máxima atingida após 48 horas (células de controlo de crescimento com DMSO). As células são diluídas 1:2 para uma concentração de 7,8 x 103 células/mL a 2 x 106 células/mL. Inocula-se 90 pL de cada diluição celular numa placa de ensaios de 96 poços e deixa-se equilibrar durante aproximadamente 4 horas a 37°C/5% C02 antes do pulso de 3H-timidina. As células K562 são inoculadas em placas de 96 poços a 1 x 105 células/mL em RPMI 1640 suplementado with 10% FBS/2 mM L-glutamina . Adicionam- se várias concentrações de composto em teste ou veículo (DMSO) e as células são incubadas a 3 7 °C/5% C02 durante 48 horas. As células são então pulsadas a 37°C/5% C02 durante 4 a 6 horas com 1 pCi/mL 3H-timidina. A radioactividade incorporada no ADN é determinada após se recolher em filtros de fibras de vidro e contagem de cintilações. Eficácia em Modelos Animais Específicos de Doença Inflamatória e Auto-imunidade Os estudos de prova de conceito em modelos de doença específicos foram realizados em animais para demonstrar de forma suplementar a actividade enzimática, celular e anti-inflamatória geral dos compostos lactona e lactama da presente invenção. Os estudos da literatura mostraram que a elevação de cAMP intracelular através da administração de inibidores de fosfodiesterase, activadores da adenilil ciclase, ou ambos, pode reduzir a doença estabelecida e/ou prevenir o desenvolvimento da doença em vários modelos animais de doença inflamatória. A eficácia dos compostos da invenção pode ser demonstrada em modelos animais da doença de Crohn, da artrite reumatóide e da rejeição de transplante. Relativamente à doença de Crohn, pode ser usado um modelo 105 colite pré-clínico estabelecido; colite induzida pelo ácido trinitrobenzenossulfónico (TNBS) na ratazana. Para artrite reumatóide, pode-se utilizar a artrite induzida por colagénio (CIA) no ratinho. Para mimetizar a rejeição de transplante humana, pode ser usado um modelo murino de transplantação de aloenxerto da pele da cauda. Doença Inflamatória do Intestino (Doença de Crohn) A doença inflamatória do intestino (IBD) é um termo para doenças inflamatórias flutuantes, crónicas, presentemente incuráveis do tracto gastrointestinal, incluindo a doença de Crohn e a colite ulcerosa. Sintomas destes distúrbios incluem dor abdominal (geralmente no lado inferior direito do abdómen) e diarreia com sangramento rectal, perda de peso e febre à medida que a doença progride. A etiologia da IBD é desconhecida, no entanto estudos epidemiológicos sugerem uma associação entre a doença a infecção virai (particularmente sarampo) in utero ou cedo na vida. A Crohn's and Colitis Foundation of America (CCFA) estima que 1-2 milhões de pessoas nos Estados Unidos sofrem da doença de Crohn e IBD's relacionadas sendo que aqueles de descendência Europeia com risco acrescido. Os níveis de incidência aumentaram significativamente nos 60 anos desde que foi descrita (Crohn) pela primeira vez. Apenas nos Estados Unidos, os custos económicos destas doenças são estimados em 1,8-2,6 mil milhões de dólares por ano. O tratamento comum para IBD consiste na administração oral ou intra-colónica de ácido 5- aminossalicílico (5-ASA), um derivado NSAID que é clivado em ASA (o fármaco activo) no tracto g.i. inferior. Outros tratamentos principais de IBD incluem corticoesteróides e imunossupressores (por exemplo, 106 6-mercaptopurina ou azatioprina) ou suas combinações. Recentemente, foi aprovada terapia anti-TNF-α para o tratamento de doença de Crohn grave que é resistente às terapias convencionais. Esta abordagem terapêutica valida a importância do factor de necrose tumral em IBD. Mesmo com as abordagens anti-TNF-α existe muito espaço para melhoria nas actuais modalidades de tratamento tanto do ponto de vista dos efeitos secundários como da eficácia. azatioprina) ou suas Os compostos da presente invenção podem ser testados no modelo de colite induzida pelo ácido trinitro- benzenossulfónico (TNBS) na ratazana (Morris et al., Gastroenterology 96: 795-803,1989; Kim, H.-S. e Berstad, A., Scandinavian Journal of Gastroenterology 27: 529-537, 1992; Ward, Lancet ii: 903-905, 1977; e Shorter et al., Am. J. Dig. Dis. 17: 1024-1032,1972)). As vantagens deste modelo de IBD particular incluem (a) o desenvolvimento da doença na ratazana é mediado pelo sistema imunitário em que as células T Thl desempenham um papel importante tal como se pensa ser o caso na doença humana, (b) uma única instilação de TNBS induz a doença com persistência e gravidade consistentes (c) o modelo é barato, (d) longa duração da inflamação (até 8 semanas), (e) uma variante do modelo na qual a colite é reactivada mimetiza a natureza reincidente da doença humana, (f) as lesões são histopatologicamente similares àquelas em humanos (g) a patologia clínica mimetiza as doenças humanas, tais como necrose, formação de úlceras, infiltração granulocítica, edema do intestino, diarreia e adesões, e (h) muitos fármacos usados para tratar IBD são activos no modelo TNBS. O modelo de ratazana de TNBS da inflamação gastrointestinal é um modelo pré-clínico aceite para IBD humana. As manifestações clínicas e histopatológicas da doença apresentam uma boa similaridade com a doença humana e 107 muitos fármacos actualmente usados para o tratamento de IBD em humanos têm eficácia neste modelo. A eficácia de um composto da invenção neste modelo implicaria que o composto poderia ser usado em terapia da doença inflamatória do intestino, incluindo doença de Crohn e colite ulcerosa, entre outras. Artrite Reumatóide Introdução e Racional 0 modelo de artrite induzida pelo colagénio (CIA) em ratinhos é um modelo adequado para avaliar potenciais fármacos activos na artrite reumatóide humana (Trentham, D. E., Arthritis Rheum. 25: 911-916, 1982; Brahn, E., Clin. Orthop. 265: 42- 53, 1991; Holmdahl, R. et al., Arthritis Rheum. 29: 106, 1986). Partilha muitas das alterações moleculares, celulares e histopatológicas identificadas como caracteristicas da doença humana; esteas incluem (a) proliferação pronunciada de células compreendendo a membrana sinovial das articulações, (b) formação de um tecido invasivo semelhante a um pano, (c) infiltração de macrófagos, granulócitos e linfócitos e (d) destruição do osso e da cartilagem. Tal como a artrite reumatóide, os animais com CIA apresentam elevados niveis no soro de complexos de imunoglobulina tais como o factor reumatóide (RF) e anticorpos anti-colagénio e citocinas inflamatórias na região sinovial tais como o factor de necrose tumoral (TNF-α). Além disso, o envolvimento da activação/expansão clonal das células T auxiliares restritas à MHC de classe II na região sinovial foi demonstrada. Radiografias de articulações afectadas mostram alterações erosivas similares àquelas observadas em humanos com AR e a artrite progressiva resulta frequentemente numa deformação e 108 disfunção da articulação semelhante a AR. Além disso, muitos compostos que reduzem os sintomas da doença humana tais como biológicos anti-TNF, corticoesteróides e DMARDS são eficazes neste modelo animal. 0 desenvolvimento/progressão da doença no modelo CIA ocorre tanto na fase imune (precoce) como na fase inflamatória permitindo assim a avaliação de uma larga gama de fármacos com diversos modos farmacológicos de acção. Rejeição de Transplante Testes In Vitro: Activação, Diferenciação e Função de Células T CD4+: Métodos Os ratinhos transgénicos AND-TCR (Kaye J. et al., Nature 341: 746-749, 1989) são usados para proporcionar uma fonte de células T CD4+ especificas de antigénio naive. 0 receptor antigénico de célula T-AND reconhece um péptido derivado do citoromo C de pombo (pcc) no contexto da molécula MHC de classe II I-Ek. Para examinar o papel de um composto de teste na activação e proliferação de células T CD4+ naive, cultivam-se 1 x 105 células T do nódulo linfático AND com 1 x 106 células de baço B10.BR irradiadas na presença de várias concentrações do péptido pcc (0-10 μΜ) em placas de 96 poços. A proliferação é avaliada pela incorporação de 3H timidina. Todas as condições dos ensaios são realizadas em triplicado. O fenótipo de activação da superfície celular das células T é avaliado por análise de citometria de fluxo. 109 A diferenciação de células T CD4+ para as linhagens Thl e Th2 é realizada como se segue: cultivam-se 1 x 105 células T do nódulo linfático AND com 107 células de baço B10.BR irradiadas em 2 mL de meio de cultura com os seguintes suplementos: para diferenciação de células Thl, 100 U/mL IFN- Y, 25U/mL IL-2 e 10 yg/mL anti-IL-4; para diferenciação de células Th2, 150 U/mL IL-4, 25 U/mL IL-2 e 10 yg/mL anti-IFN-cx. Após 3-4 dias os poços são divididos 1:4 com as mesmas adições. Após 7 dias as células são recolhidas e lavadas 3 vezes para remover citocinas nos sobrenadantes. As células cultivadas (1 x 105) são reestimuladas com 5 x 105 células de baço B10BR irradiadas na presença de 5 yM de péptido pcc em 250 yL de meio de cultura sem qualquer adição de citocinas. Os sobrenadantes são recolhidos após 40 horas e avaliados para IL-2, IL-4 e IFN-γ por ELISA. Os compostos de teste são adicionados ao longo da diferenciação da cultura. As células cultivadas Thl e Th2 geradas na ausência dos compostos de teste são testadas relativamente à proliferação e actividade de citocinas, tal como descrito acima durante estimulação antigénica na presença de composto. Testes In Vitro: Activação, Diferenciação e Função de Células T CD8+: Métodos Os ratinhos transgénicos 2C-TCR (Sha W. C. et al., Nature 335: 271-274, 1988) são usados para proporcionar uma fonte de células T CD8+ especificas de antigénio naive. O receptor antigénico de célula 2C-T reconhece um péptido 2C derivado da enzima alfa-cetoglutarato desidrogenase mitocontrial no contexto da molécula MHC de classe I Db. 110 Para testar a eficácia de um composto de teste na activação e proliferação de células T CD8+ naive, isolam-se suspensões de células isoladas de células T do nódulo linfático (LN) 2C a partir dos ratinhos transgénicos 2C-TCR. As células 2C-T são estimuladas com esplenócitos TAP-/- H-2d irradiados ou a linha celular T2 TAP-/- transfectada com Ld na presença de várias concentrações do péptido 2C (0-10 μΜ) . A proliferação é avaliada pela incorporação de 3H timidina. O fenótipo de activação da superfície celular das células T é avaliado por análise de citometria de fluxo. As células T citotóxicas são geradas pela activação das células 2C-T com esplenócitos H-2d. As células são cultivadas durante 7-10 dias na presença de 25 U/mL IL-2. A actividade citotóxica letal das culturas é testada com um ensaio de lobertação de Cr51 usando células alvo T2-Ld na presença de diversas concentrações do péptido 2C. O efeito dos compostos na diferenciação de células T CD8+ naive em células letais citotóxicas, é avaliada pela adição dos compostos de teste durante a activação primária e o período de cultura. 0 efeito dos compostos de teste na activação de células T CD8+ citotóxicas e na função efectora é medio usando o ensaio de libertação de Cr51 e o ensaio de incorporação de 3H timidina na presença das referidas concentrações do composto. Teste In Vivo: Modelo Murino de Transplantação de Aloenxerto da Pele da Cauda O composto 54 foi avaliado no seguinte modelo de transplantação in vivo. 111 Métodos A pele da cauda de ratinhos dadores H-2b C57BL/6 foi transplantada para ratinhos fêmea receptores H-2d BALB/c (Lagodzinski, Z. et al., Immunology 71: 148-150 (1990)). Foram incluídos por grupo cinco ratinhos. Foram incluídos no estudo sete grupos de ratinhos consistindo em quatro grupos de teste tratados com o composto de teste e três controlos que incluem grupos não tratados, tratados apenas com veiculo e tratados com ciclosporina A (CsA; Sigma; No. Catálogo C 3662) . O composto do teste e CsA foram administrados duas vezes por dia por via intraperitoneal a uma dose de 10 mg/kg com início no primeiro dia antes da transplantação e durante 15 dias após a transplantação, incluindo o dia da transplantação. Os ratinhos foram monitorizados e pontuados diariamente ao longo de 15 dias após transplantação para rejeição de enxerto. Resultados e Discussão A rejeição do aloenxerto de pele é primeiramente mediada por linfócitos T com pouca evidência de um papel significativo de anticorpos na maioria das circunstâncias. A rejeição do aloenxerto de pele requer a activação das populações de células T efectoras citotóxicas e auxiliares. A rejeição do enxerto foi avaliada através da monitorização da necrose do aloenxerto. Uma vez que a pele da cauda é visivelmente distinta da pele do tronco do ratinho que a rodeia, o decurso da rejeição pode ser facilmente monitorizado. Os enxertos completamente intactos receberam uma pontuação de 100%. A rejeição completa foi definida como uma necrose do enxerto de >90%. Uma rejeição aguda do enxerto geralmente ocorre através de uma série de acontecimentos visualmente óbvios, começando 112 com inchaço e eritema do enxerto. Estes acontecimentos são seguidos por uma dessecação do enxerto e formação de crosta sobre a maioria ou a totalidade do enxerto, sinalizando a perda de tecido do enxerto viável. A formação de crosta é subsequentemente seguida por um encolhimento e formação de cicatriz. Um composto representativo da invenção, Composto 54, demonstrou uma melhoria significativa na sobrevivência do enxerto quando comparado com o grupo controlo (veiculo apenas, β-ciclodextrina; Sigma; No. Catálogo C 4767) (Tabela 10) . TABELA 10 Efeito dos Compostos na Rejeição de Enxerto num Modelo de Transplantação Murino da Pele da Cauda Composto Sobrevivência média do enxerto (dias) Taxa de sobrevivência do enxerto (% 9 dias após o transplante) # de enxertos que sobrevivem após 16 dias p.t. Não tratado 8 ± 1 0 0 Veiculo 8,5 ± 1 0 0 Rolipram 11,5 ±3,7 50 1 Ciclosporina 13,5 ± 3,3 75 2 54 11,5 ± 3,3 75 0 O grupo de controlo teve uma média de 8,5 dias de sobrevivência dos aloenxertos de pele enquanto que os grupos tratados com o composto 54 apresentaram uma sobrevivência de 11,5 dias. Por comparação com a Ciclosporina A, os compostos da invenção, dos quais o composto 54 é representativo, podem 113 também ser usados em todas as indicações em que a Ciclosporina A é usada. As actividades diferenciais destes compostos assim como a sua selectividade nas citocinas inibidas sugere um mecanismo que não resulta em imunossupressão mas sim imunomodulação. A capacidade do composto 54 em suprimir a rejeição de aloenxerto neste modelo implica que podem ser de utilidade terapêutica em doenças tais como esclerose múltipla, doença inflamatória do intestino, artrite reumatóide, psoríase, transplantação de órgãos e todas as doenças auto-imunes. Por exemplo, muitos fármacos para o tratamento de psoríase são usados na transplantação de órgãos ou demonstraram eficácia nessa utilização. Assim, a eficácia dos fármacos imunomoduladores ou imunossupressores na transplantação de órgãos parece ser preditiva da eficácia na psoríase, augurando boas possibilidades para esta série de compostos como uma terapia para a psoríase. 04-04-2013 114 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto da fórmula:
    em que: o azoto na posição 1 é substituído por hidrogénio; posições 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11 e 18 são substituídas por hidrogénio; posições 17 e 19 são substituídas por OR8 onde R8 é um grupo hidrocarbilo Ci_i0; cada um dos carbonos nas posições 5, 13, 15 e 16 é independentemente substituído em cada ocorrência por H, -w ou -R7(W)n, em que: W é seleccionado de -NH2 , -CN, -X, -OH, -N02, -SH, - NHR8, -NR8R8, -OR8 e -SR8, cada R7 é independentemente um grupo hidrocarbilo C1-C30, halocarbilo ou hidrohalocarbilo em que n dos átomos de hidrogénio ou halogéneo de R7 são substituídos por um número igual de grupos W independentemente selecionado em cada lugar; cada R8 é independentemente um grupo hidrocarbilo C1-C30, halocarbilo ou hidrohalocarbilo; n é selecionado de 0, 1, 2, 3, 4 e 5; e X é selecionado de -Br, -Cl, -F e -I; 1 onde a posição 12 é substituída por hidrocarbilo Ci-6 ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato do mesmo, como um único estereoisómero ou mistura deste. 2. 0 composto de acordo com a reivindicação 1 em que: exactamente dois dos carbonos nas posições 11, 12 e 13 são substituídos por hidrogénio; W é -0R8 ; R7 é um grupo hidrocarbilo Ci-Cio em que n dos átomos de hidrogénio ou halogéneo de R7 são substituídos por um número igual de grupos W independentemente selecionados em cada lugar; R7 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo substituído por alcenilo, alcenilo substituído por arilo, arilo substituído por alcinilo, alcinilo substituído por arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, bicicloalquilo, bicicloalcenilo, alquilcicloalquilo, alcenilcicloalquilo, alcinilcicloalquilo, cicloalquilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalquilo, cicloalcenilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalcenilo, cicloalquilo e policicloalquilo fundido com arilo; R8 é um grupo hidrocarbilo Ci-Cio; R8 é um grupo ciclohidrocarbilo Ci-Cio; R8 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo substituído por alcenilo, alcenilo substituído por arilo, arilo substituído por alcinilo, alcinilo substituído por arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, bicicloalquilo, bicicloalcenilo, alquilcicloalquilo, alcenilcicloalquilo, alcinilcicloalquilo, cicloalquilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalquilo, cicloalcenilo substituído por arilo, arilo substituído por cicloalcenilo, cicloalquilo e policicloalquilo fundido com arilo; 2 n é Ο; ο composto tem uma configuração S no carbono 3; o composto tem uma configuração R no carbono 3; o composto tem uma configuração S no carbono 5; o composto tem uma configuração R no carbono 5; posições 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 15, 16 e 18 são substituídas por hidrogénio; a posição 12 é substituída por hidrocarbilo Ch; a posição 17 é substituída por -O-ciclopentilo; e a posição 19 é substituída por -O-metilo onde ambas as posições 3 e 5 tem facultativamente a estereoquímica S. 3. O sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do composto de acordo com a reivindicação 1. 4. 0 composto:
    3
    ΉΗ
    Ο
    4
  7. 7 ο
    8
    ο
    9
    ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato dos mesmos. 5. 0 composto de acordo com a reivindicação 4, em que o composto é: 10
    ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo. 6. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto de qualquer uma das reivindicações 1-5 ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato do mesmo, e um veiculo farmacêuticamente aceitável, diluente ou excipiente. 7. Utilização de um composto de qualquer uma das reivindicações 1-5, ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato do mesmo, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um estado inflamatório ou doença num paciente.
  8. 8. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato do mesmo, na preparação de um medicamento para a modulação dos niveis de adenosina 5'-monofosfato cíclica intracelulares num paciente.
  9. 9. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, ou um sal farmacêuticamente aceitável ou 11 solvato do mesmo, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença ou estado num paciente, onde a doença ou estado está associado a condições patológicas que são moduladas por inibição de enzimas associadas a mensageiros celulares secundários.
  10. 10. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato do mesmo, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de rejeição de transplante num paciente.
  11. 11. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato do mesmo, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de proliferação celular descontrolada num paciente.
  12. 12. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato do mesmo, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de estados associados ao sistema nervoso central (CNS) num paciente.
  13. 13. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, ou um sal farmacêuticamente aceitável ou solvato do mesmo para utilização no tratamento ou prevenção de uma doença ou estado como reivindicado na reivindicação 7, 9 ou 12, para a modulação dos níveis de adenosina 5'-monofosfato cíclica intracelulares num paciente tal como reivindicado na reivindicação 8, para o tratamento ou prevenção de rejeição de transplante como reivindicado na reivindicação 10, ou para o tratamento ou prevenção de proliferação celular descontrolada como reivindicado na reivindicação 11. 12 04-04-2013 13 Europglsches Patentamt European patent&ffice Qfftca européen desbrevets European Patent Office Postbus 5818 2280 HV RIJSWIJK ΝΕΤΗ ER LAN OS Tel. +31 (0)70 340-2040 Fax +31 (0)70 340-3018: McNeeney, Stephen Phillip Potter Clarkson LLP The Belgrave Centre Talbot Street Nottingham NG1 5GG ROYAUME UNI For any questions about this communication: Tel.:+31 (0)70 340 45 00 Date 07.03.13 Reference Application No ./Patent No. FB15290/E19697E 03753187.8 - 1451 / 1551805 Applioant/Proprietor Dart NeuroScience (Cayman) Ltd Decision to grant a European patent pursuant to Article 97(1) EPC Following examination of European patent application No. 03753187.8 a European patent with the title and the supporting documents indicated in the communication pursuant to Rule 71 (3) EPC dated 02.11.12 is héreby granted ih respect of the designated Contractihg States. Patent No, Date of filing Priority claimed Designated Contracting States and Proprietor(s) 1551805 30.09.03 01,10.02/USA 263338 AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES Fl FR GB GR HU ΙΕ IT LI LU MC NL PT RO SE SI SK TR Dart NeuroScience (Cayman) Ltd 10 Market Street POBox 774 Camana Bay Grand Kayman KY1-9Ó06/KY This decision will take effect on the date on which the European Patent Bulletin mentions the grant (Art. 97(3) EPC). The mention of the grant will be published in European Patent Bulletin 13/14 of 03.04.13. Examining Division Diederen J Bosma P Zervas B ^esPatev,^
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