MXPA05003547A - Delta-lactamas sustituidas con gamma-fenilo y usos relacionados con ellas. - Google Patents

Delta-lactamas sustituidas con gamma-fenilo y usos relacionados con ellas.

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Abstract

Se discuten ?-lactamas sustituidas con (-fenilo. Ellas pueden ser formuladas en composiciones farmaceuticas, y/o usadas en el tratamiento o prevencion de inflamacion u otras condiciones o estados de enfermedad.

Description

DELTA-LAC TAMAS SUSTITUIDAS CON G AM M A-F EN I LO Y USOS RELACIONADOS CON ELLAS CAMPO TECNICO Esta invención está dirigida a compuestos de ?-lactamas, y en particular a ?-lactamas sustituidas con y-fenilo, y a usos terapéuticos relacionados con ellas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN LA RESPUESTA INFLAMATORIA (INFLAMACIÓN^ La inflamación es una respuesta del huésped esencial localizada, a microorganismos que invaden o dañan tejidos, que involucra células del sistema inmune. Los signos clásicos de inflamación incluyen enrojecimiento (eritema), hinchazón (edema), dolor y producción de calor aumentada (pirema) en el sitio del daño. La respuesta inflamatoria permite al cuerpo reconocer superficialmente y eliminar un organismo invasor y/o reparar el daño del tejido. La mayoría de los cambios agudos en el sitio de la inflamación son ya sea directa o indirectamente, atribuibles al influjo masivo de leucocitos (por ejemplo, neutrófilos, eosinófilos, linfocitos, monocitos) lo que es intrínseco a esta respuesta. La infiltración y acumulación leucocítica en tejidos da como resultado su activación y liberación subsiguiente de los mediadores inflamatorios tales como LTB4, prostaglandinas, TNF-a, IL-?ß, IL-8, IL-5, IL-6, histamina, proteasas y especies reactivas al oxígeno, por ejemplo. La inflamación normal es un proceso altamente regulado que es estrechamente controlado en varios niveles para cada uno de los tipos de células involucradas en la respuesta. Por ejemplo, la expresión de la citoquina pro-inflamatoria TNF- se controla a nivel de expresión, traslación, modificación tra nsacciona I y liberación genética de la forma madura desde la membrana celular. Muchas de las proteínas con regulación ascendente durante la inflamación están controladas mediante el factor de transcripción, NF- ?. Las respuestas pro-inflamatorias normalmente son enfrentadas por mecanismos endógenos anti-inflamatorios tales como la generación de IL-10 o IL-4. Una característica de una respuesta inflamatoria normal es que es de naturaleza temporal, y está seguida por una fase de resolución que devuelve el estado del tejido a su condición anterior. Se piensa que la fase de resolución involucra regulación ascendente de mecanismos anti inflamatorios, tales como IL-10, así como también regulación descendente de los procesos pro-inflamatorios.
ENFERMEDAD INFLAMATORIA La enfermedad inflamatoria ocurre cuando se inicia una respuesta inflamatoria que es ¡napropiada y/o no se resuelve de la forma normal y que en lugar de ello persiste y de como resultado un estado inflamatorio crónico. La enfermedad inflamatoria puede ser sistémica (por ejemplo, lupus) o localizada en tejidos u órganos particulares y ejerce una enorme carga personal y económica sobre la sociedad. Ejemplos de algunas de las enfermedades inflamatorias más comunes y problemáticas son artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria de los intestinos, psoriasis, asma, enfisema, colitis y daños por reperfusión de isquemia. Un tema fundamental en la enfermedad inflamatoria es una perturbación de la respuesta inmune celular que da como resultado el reconocimiento de proteínas del huésped (antígenos) como extraños. Por eso, la respuesta inflamatoria se dirige equivocadamente a los tejidos del huésped con las células efectoras apuntando a órganos o tejidos específicos que con frecuencia resultan con daños irreversibles. Este aspecto de auto-reconocimiento de la enfermedad auto-inmune con frecuencia se refleja por la expansión clonal de subconjuntos de células T caracterizados por un subtipo receptor de células T (TCR) en el estado de enfermedad. Frecuentemente, la enfermedad inflamatoria se caracteriza también por un desbalance en los niveles de los subconjuntos de ayudantes T (Th) (es decir, células Th1 contra células Th2). Las estrategias terapéuticas dirigidas a curar enfermedades inflamatorias usualmente caen dentro de una de dos categorías: (a) modulación descendente de procesos que están regulados de forma ascendente en el estado de la enfermedad, o (b) regulación ascendente de las vías anti-inflamatorias en las células o tejidos afectados. La mayoría de los regímenes empleados actualmente en el tratamiento clínico caen dentro de la primera categoría. Algunos ejemplos de estos son los fármacos corticoesteroides y los fármacos anti-inflamatorios sin esferoides (NASID, según siglas en inglés de Non-Steroidal Anti-lnflamatory Drugs). La mayoría de los procesos celulares y bioquímicos de tejidos que resultan perturbados en la enfermedad antí-inflamatoria han sido elucidados, y esto ha permitido el desarrollo de modelos o pruebas experimentales para simular el estado de la enfermedad. Estas pruebas in-v¡tro permiten la selección y búsqueda de compuestos con una alta probabilidad de eficacia terapéutica en la enfermedad inflamatoria relevante. Por ello, las pruebas actualmente empleadas usadas para modelar la importancia de los leucocitos activados en el desarrollo de la inflamación aguda y mantenimiento del estado inflamatorio crónico, son pruebas que vigilan la quimiotaxia y la desgranulación celular de los leucocitos, y la síntesis de citoquina y las pruebas de producción in-vitro de especies reactivas al oxígeno ROS, según siglas en inglés de Reactive Oxygen Species). Dado que un resultado de la activación neutrofila aguda o crónica es la liberación de ROS con el resultante daño de tejidos, una prueba para detección de necrófagos de ROS permite detectar los compuestos con eficacia terapéutica potencial.
Las pruebas celulares para detectar inhibidores de liberación de TNF-a a partir de células macrófagas o monocíticas estimuladas, son un componente importante de un modelo in-vitro para inflamación mientras esta citoquina es regulada en forma ascendente y ha demostrado contribuir a la patología en muchas enfermedades inflamatorias. Dado que el AMPc elevado en las células afectadas ha demostrado que modula o baja la respuesta inflamatoria, la vigilancia de los niveles celulares cíclicos de AMP (AMPc), y la actividad de las vías que controlan los niveles de AMPc, permite la detección de compuestos anti-inflamatorios potenciales. Las pruebas pueden incluir vigilar el nivel de AMPc por solamente, la actividad de fosfodiesterasa, o los cambios en la actividad luciferasa del elemento de respuesta de AMPc.
ARTRITIS REU ATOIDE La artritis reumatoide (AR), la más común de las artritis inflamatorias, es un desorden auto-inmune de etiología desconocida que afecta al 1% de la población adulta, y se caracteriza por sinovitis erosiva simétrica, crónica (inflamación del revestimiento de la articulación sinovial) e involucramiento multisistema frecuente. De forma interesante, es de 3 a 6 veces más prevalente en las mujeres que en los hombres. La mayoría de los pacientes muestran un curso crónico fluctuante de la enfermedad, que si se deja sin tratar, da como resultado destrucción progresiva de las articulaciones, deformidad, incapacidad, y muerte prematura. Los síntomas indicativos de AR incluyen dolor e hinchazón de las articulaciones (usualmente simétrica), rigidez matinal de articulaciones y músculos, debilidad / fatiga general y fiebre, y pérdida de peso. La AR tiene como resultado más de 9 millones de visitas al médico y más de 250,000 hospitalizaciones por año en los Estados Unidos cada año. Afecta frecuentemente a pacientes en sus años más productivos, y por ello, la discapacidad tiene como resultado mayores pérdidas económicas. Recientes revelaciones han establecido que el antecedente genético, especialmente la estructura de los genes histocompatibilidad principal de clase II (MHC, según siglas en inglés de Major Histocompatibility), juega un papel crítico en la susceptibilidad de un individuo y en la severidad de la enfermedad. La comprensión actual de las redes de citoquina, quimioquinas, factores de crecimiento y moléculas de adhesión, ha conducido a la apreciación de que las vías dependientes de células T e independientes de células T, contribuyen a la iniciación y perpetuación de la artritis reumatoide. Adicionalmente, se ha aprendido mucho acerca de los eventos celulares y bioquímicos específicos responsables de la destrucción de huesos y cartílagos que caracteriza este desorden. En el nivel de tejidos, la AR se caracteriza por hiperplasía sinovial, hipertrofia, angiogénesis y adjunción e invasión de fibroblastos sinoviales en el cartílago y hueso adyacente. En la AR activa hay niveles aumentados de las citoquinas pro-inflamatorias TNF- , IL-1 e IL-6 con relación a las citoquinas inflamatorias en las articulaciones afectadas.
TRATAMIENTOS ACTUALES PARA LA ARTRITIS REUMATOIDE Y OTRAS ENFERMEDADES INFLAMATORIAS En el presente, no hay cura o prevención (profiláctica) disponible para la artritis reumatoide, solamente regímenes dirigidos a los síntomas tales como dolor y rigidez. Las cinco modalidades de tratamiento principales para esta enfermedad incluyen medicación (farmacológica), física (ejercicio), protección de las articulaciones y cambios en el estilo de vida y cirugía. Las terapias para la artritis reumatoide se pueden dividir en tres grupos: fármacos anti-inflamatorios sin esferoides (NSAID, según siglas en inglés de Nonsteroidal Anti-I nflamatory Drugs), fármacos antirreumátícos modificadores de la enfermedad (DMARD, según siglas en inglés de Disease Modifying Anti-Rheumatic Drugs), también conocidos como agentes de segunda línea y corticoesteriodes. Los NSAID reducen el dolor en bajas dosis y alivian algunos de los síntomas inflamatorios (hinchazón y rigidez) en dosis más altas mediante la inhibición de síntesis de prostaglandina. Ejemplos de NSAIDS sin prescripción incluyen ácido acetilsalicílico (ASA®, Aspirina®, Anacina®, etc). e ibuprofeno (Motrin®, Advil®, etc.). Ejemplos de NSAID que requieren prescripción incluyen Naprosina®, Relaten®, Indocid®, Voltaren®, Feldene®, y Clinoril®. A pesar de que estos medicamentos se dirigen al componente agudo inflamatorio de la artritis reumatoide, solamente tratan los síntomas, y no cambian la progresión de la enfermedad subyacente. Los efectos colaterales perjudiciales de los NSAID, pueden ser serios con administración prolongada, y son principalmente gastrointestinales (ardor de estómago, sangramiento o úlceras). Los DMARD se prescriben con frecuencia si persiste la inflamación por más de 6 semanas o cuando la artritis afecta muchas articulaciones simultáneamente. Ellos se administran usualmente adicionalmente a un NSAID o esteroide. Muchos DMARD trabajan suprimiendo las células inmunes involucradas en la respuesta inflamatoria, haciendo más lento el progreso de la enfermedad. Sin embargo, son incapaces de reversar el daño permanente en la articulación. Los fármacos más comunes de esta clase son las sales de oro, metotrexato, azatioprina, sufasalazina, hidroxicloroquína, penicilamina y cloroquina. Los DMARD con frecuencia toman varias semanas para que puedan verse los efectos benéficos y en la mayoría de los casos, el modo exacto de eficacia en la artritis reumatoide es desconocido. Los efectos colaterales son numerosos incluyendo llagas en la boca, sarpullidos, diarrea y náuseas. Efectos laterales más serios que necesitan vigilancia cuidadosa a través de pruebas de sangre y orina regulares incluyen daños al hígado y riñon, excesiva disminución del contaje de leucocitos en sangre (supresión inmune) y contaje de plaquetas (coagulación sanguínea).
Los corticosteroides frecuentemente se prescriben en pacientes con AR que presentan inflamación extrema acompañada por dolor, hinchazón y rigidez severos en las articulaciones. También se usan para tratar artritis reumatoide sistémica que puede afectar la capa exterior de los pulmones y los vasos sanguíneos. La ruta de administración usualmente es oral (es decir, prednisona), pero el fármaco también se puede inyectar directamente en la articulación, vena, músculo o sitio alternativo afectado por la inflamación. Los efectos colaterales de largo plazo de uso de esferoides en artritis reumatoide son serios e incluyen cataratas, presión sanguínea alta, atrofia muscular, magulladuras, adelgazamiento de la piel y de los huesos, aumento de peso, diabetes y susceptibilidad a infecciones. Aún cuando se piensa que sólo un 5% de los pacientes diagnosticados con artritis reumatoide desarrollarán la enfermedad más severa (incluyendo daño de articulaciones debilitante e irreversible), quienes lo hacen ciertamente no tienen un juego ideal de terapias disponibles para manejar y/o curar satisfactoriamente la enfermedad. Los NSAID actualmente disponibles (aún los inhibidores de COX-2 selectivos) pueden mejorar exitosamente los síntomas agudos de la artritis reumatoide, tales como hinchazón, dolor y rigidez de las articulaciones. Sin embargo, no afectan ni el progreso de la destrucción de las articulaciones ni efectúan ninguna reversión en la erosión articular o de los huesos. Los fármacos de segunda línea tales como DMARD o corticoesteroides, pueden hacer temporalmente más lenta la progresión de la enfermedad, y reducir los síntomas, pero usualmente sufren de un perfil de efectos colaterales inaceptables de respuesta variable de los pacientes, y no pueden reversar el daño existente en las articulaciones. Hay una necesidad significativa de agentes terapéuticos que detengan o reversen efectivamente el progreso de la enfermedad en la artritis reumatoide.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, la presente invención proporciona compuestos de la siguiente fórmula: en donde: cada uno de los carbonos en las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18 y 19, así como también el nitrógeno en la posición 1, es sustituido independientemente en cada ocurrencia con H, -W o -R7(W)n en donde: W es seleccionada de -NH2, -CONH2, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO,, -SH, -COX, -NHR3, -NRSR8, -CONHR3, -CONR8R8, -COORs, -COR8, -OCOR8, -ORs, -BH2, -BHR8, -BR3R8, -B02H2, -B02R8R8, -PH2, - P H R ¾, -PR8R3, -POR8, -P02R8, -P03R8, -SR8, -SOR8, -SONH2, -SONHR8, -SONR;íR8, -S02NH2, -S02NHR3 y -S02NR8R8; cada R7 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de 1 a 30 átomos de carbono, en donde n de los átomos de hidrógeno o de halógeno de R7 se sustituyen por un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada ubicación; o dos grupos -R7 adyacentes, junto con los carbonos en las posiciones 12 y 13 o las posiciones 11 y 13 a las cuales están unidos, forman un grupo heterocíclico; cada R8 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono; n es seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y X es seleccionado de -Br, -Cl, -F y -I; o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de los mismos, como un estereoisómero aislado o una mezcla de los mismos. En otro aspecto, esta invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de la invención como se describe anteriormente y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, esta invención proporciona un método para tratar o prevenir una condición o enfermedad inflamatoria en un paciente, en donde el método comprende administrar a un paciente que lo necesita, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención según se describió anteriormente. En otro aspecto, esta invención proporciona un método para modular los niveles intracelulares cíclicos de 5'-monof osfato de adenosina dentro de un paciente, en donde el método comprende administrar a un paciente que lo necesita, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención según se describió anteriormente. En otro aspecto, esta invención proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o condición en un paciente, en donde el método comprende administrar a un paciente que lo necesita, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención según se describió anteriormente, y la enfermedad y la condición está asociada con condiciones patológicas que están moduladas por la inhibición de enzimas asociadas con mensajeros celulares secundarios. En otro aspecto, esta invención proporciona un método para tratar o prevenir la proliferación celular no controlada en un paciente, en donde el método comprende administrar a un paciente que lo necesita, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención según se describió anteriormente. En otro aspecto, esta invención proporciona un método para tratar o prevenir el rechazo de transplantes en un paciente, en donde el método comprende administrar a un paciente que lo necesita, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención según se describió anteriormente. En otro aspecto, esta invención proporciona un método para tratar o prevenir condiciones asociadas con el sistema nervioso central en un paciente, en donde el método comprende administrar a un paciente que lo necesita, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención según se describió anteriormente. Estos y otros aspectos y modalidades de la presente invención, serán evidentes con referencia a la descripción detallada que sigue. Para este fin, se exponen diversas referencias aquí, las cuales describen en más detalle ciertos procedimientos, compuestos y/o composiciones, y están incorporadas a la presente solicitud en su totalidad como referencia.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona compuestos, composiciones y métodos útiles para el tratamiento y/o prevención de diversas condiciones de enfermedad. Por ejemplo, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar y/o prevenir una enfermedad inflamatoria. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención o una sal de éste, farmacéuticamente aceptable, o una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que contiene un compuesto de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. De acuerdo con esto, como se expuso anteriormente en la breve descripción de la invención, esta invención está dirigida a compuestos de la siguiente fórmula: 19 en donde: cada uno de los carbonos en las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18 y 19, así como también el nitrógeno en la posición 1, es sustituido Independientemente en cada ocurrencia con H, -W o -R7(W)n en donde: W es seleccionada de -NH2, -CONH,, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -N02, -SH, -COX, -NHR8, -N R8R8, -CONHR8, -CONR6R8, -COOR'5, -COR", -OCOR8, -OR8, -BH2, -BHR8, -BR8R8, -B02H2, -B02R8R'\ -PH2, -PHR8, -PR8R8, -POR8, -P02R8, -P03R8, -SR8, -SOR8, -SONH2, -SONHR8, -S0NR3R8, -S02NH2, -S02NHR8 y -S02NR8R8; cada R' es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de 1 a 30 átomos de carbono, en donde n de los átomos de hidrógeno o de halógeno de R' se sustituyen por un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada ubicación; o dos grupos -Rr adyacentes, junto con los carbonos en las posiciones 12 y 13 o las posiciones 11 y 13 a las cuales están unidos, forman un grupo heterocíclico; cada R8 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono; n es seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y X es seleccionado de -Br, -Cl, -F y -I; o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de los mismos, como un estereoisómero aislado o una mezcla de los mismos. En otro aspecto, el compuesto de la invención tiene la configuración S en el carbono 3. En otro aspecto, el compuesto de la invención tiene la configuración R en el carbono 3. En otro aspecto, el compuesto de la invención tiene la configuración S en el carbono 5. En otro aspecto, el compuesto de la invención tiene la configuración R en el carbono 5. en otro aspecto, ninguno de los carbonos en las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, o 19 de la invención se sustituye con una porción heterocícl ica. En otros aspectos, en el compuesto de la invención, así como también en las composiciones que contienen el compuesto de la invención y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable: Los carbonos en la posición 4 o 6, y preferiblemente tanto en la posición 4 como en la 6, se sustituyen exclusivamente con hidrógeno; el carbono en la posición 19 se sustituye con -W, el carbono en la posición 19 se sustituye con -NH2, -NHR8 o -NR8R3, el carbono en la posición 19 se sustituye con -CN, -X, OH, -N02, -SH u -OR8, un carbono en las posiciones 17 y 18 se sustituye con hidrógeno, al menos un carbono en las posiciones 17 y 18 se sustituye con -W, al menos un carbono en las posiciones 17 y 18 se sustituye con -NH2, -CONH2, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -N02, -SH, -COX, -NHR8, -NR8R8, -CONHR8, CONR3R8, -COOR8, -COR8, -OCOR8, u -OR3; al menos un carbono en las posiciones 17 y 18 se sustituye con -NH2, -NHR8 o -NRSR3, y/o al menos un carbono en las posiciones 17 y 18 se sustituye con -CN, -X, -OH, -N02, -SH, u -OR8. En otro aspecto, sólo uno de los carbonos en las posiciones 17, 18 y 19 se sustituye con hidrógeno. En otro aspecto, exactamente dos de los carbonos en las posiciones 17, 18 y 19 se sustituyen con hidrógeno. En otro aspecto, no más de uno de los carbonos en las posiciones 17, 18 y 19 se sustituyen con hidrógeno. En otros aspectos, en el compuesto de la invención, así como en las composiciones que contienen el compuesto de la invención y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, el carbono en la posición 7 se sustituye exclusivamente con hidrógeno; el carbono en la posición 3 se sustituye con hidrógeno, el carbono en la posición 3 se sustituye con -W, el carbono en la posición 3 se sustituye con halógeno, el carbono en la posición 3 se sustituye con -R7(W)n; el carbono en la posición 3 se sustituye con hidrocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono, los carbonos en las posiciones 9 y 10 se sustituyen con hidrógeno, los carbonos en las posiciones 11, 12 y 13 se sustituyen independientemente con hidrógeno y -W, sólo uno de los carbonos en las posiciones 11 y 12 se sustituye con hidrógeno, el carbono en la posición 11 y/o 12 se sustituye con -NH2, -CONH2, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -N02, -SH, -COX, -NHR8, -NR8R8, -CONHR8, CONR8R8, -COOR8, -COR8, -OCOR8, u -OR8; el carbono en la posición 11 y/o 12 se sustituye con -NH2, -NHR8 o -NR8R8, el carbono en la posición 11 y/o 12 se sustituye con -CN, -X, -OH, -N02, -SH, u -OR8, el carbono en la posición 13 se sustituye con -NH2, -CONH2l -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO:, -SH, -COX, -NHR8, -NR8R8, -CONHR3, CONR8R8, -COOR8, -COR8, -OCOR8, u -OR8; el carbono en la posición 13 se sustituye con -NH2, -NHR8 o -NR8R8, el carbono en la posición 13 se sustituye con -CN, -X, -OH, -N02, -SH, u -OR8, al menos un carbono de las posiciones 11, 12 y 13 se sustituye con -R7(W)n; En otro aspecto, sólo uno de los carbonos en las posiciones 11, 12, y 13 se sustituye con hidrógeno. En otro aspecto, exactamente dos de los carbonos en las posiciones 11, 12 y 13 se sustituyen con hidrógeno. En otro aspecto, no más de uno de los carbonos en las posiciones 11, 12 y 13 se sustituyen con hidrógeno.
En los compuestos de la invención, y las composiciones que contienen uno o más compuestos de la invención y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, el carbono en la posición 6 preferiblemente no es sustituido con =0 ni con =S; el carbono en la posición 4 preferiblemente no es sustituido con =0; el anillo fenilo enlazado al carbono en la posición 5 preferiblemente es sustituido con no más de 4 átomos de hidrógeno, y el anillo fenilo enlazado al carbono en la posición 5 preferiblemente es sustituido con no más de cuatro grupos R7(W)„. En otro aspecto de la presente invención que proporciona un compuesto de la invención, se puede usar los siguientes criterios solos o en cualquier combinación para describir adicionalmente los compuestos de la invención, en donde estos criterios son a manera de ejemplo solamente y se puede encontrar otros criterios en otra parte en la presente solicitud: las posiciones 4 y 6 se sustituyen exclusivamente con hidrógeno; la posición 19 se sustituye con -W; la posición 19 se sustituye con -CN, -X, -OH, -N02, -SH, u -OR8, un carbono en las posiciones 17 y 18 se sustituye con hidrógeno; al menos un carbono en las posiciones 17 y 18 se sustituye con -W; al menos un carbono en las posiciones 17 y 18 se sustituye con -NH2, -CONH2, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -N02. -SH, -COX, -NHR8, -NR8R8, -CONHR8, CONR8R8, -COOR8. -COR8, -OCOR8, u -OR8; al menos un carbono en las posiciones 17 y 18 se sustituye con -CN, -X, -OH, -N02, -SH, u -OR3, sólo uno de los carbonos en las posiciones 17m 18 y 19 se sustituye con hidrógeno; el carbono en la posición 7 se sustituye exclusivamente con hidrógeno; el carbono en la posición 3 se sustituye con hidrógeno, R8 o X; los carbonos en las posiciones 9 y 10 se sustituyen con hidrógeno; los carbonos en las posiciones 11, 12, y 13 se sustituyen independientemente con hidrógeno y -W; sólo uno de los carbonos en las posiciones 11 y 12 se sustituye con hidrógeno; un carbono seleccionado de las posiciones 11 y 12 se sustituye con -CN, -X, -OH, -N02, -SH, u -OR8, al menos un carbono de las posiciones 11, 12 y 13 se sustituye con R7(W)n; al menos un carbono de las posiciones 11, 12 y 13 se sustituye con hidrocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono; halocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono, o hidrohalocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono; exactamente dos de los carbonos en las posiciones 11, 12 y 13 se sustituyen con hidrógeno; W se selecciona entre -OCHO, -OH, -OCOR8 y -OR3; W se selecciona entre -NH2, -CN, -X, -OH, -N02, -SH, NHR8, -NR8R8, -OR8 y SR8; W es -OR8; R7 es un grupo hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono en donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R7 se sustituyen por un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada ubicación; R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo sustituido con alquenilo, alquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con alquinilo, alquinilo sustituido con arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, bicicloalquilo, bicicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquenilcicloalquilo, alquinilcicloalquilo, cicloalquilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquilo, cicloalquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquenilo, cicloalquilo y policicloalquilo fusionados con arilo; R8 es un grupo hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono; Rs es un grupo ciclohídrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono; R° es seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, a ra I q u i I o , alquilarilo, arilo sustituido con alquenilo, alquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con alquinilo, alquinilo sustituido con arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, bicicloalquilo, bicicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquenilcicloalquilo, alquinilcicloalquilo, cicloalquilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquilo, cicloalquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquenilo, cicloalquilo y policicloalquilo fusionados con arilo; n es 0; la posición 1 se sustituye con hidrógeno; el carbono 3 tiene la configuración S, el carbono 3 tiene la configuración R; el carbono 5 tiene la configuración S, el carbono 5 tiene la configuración R, en donde las posiciones 3, 4, 6, 7, 9 y 10 se sustituyen con hidrógeno, una de las posiciones 11 y 12 se sustituye con hidrógeno, y una de las posiciones 17 y 18 se sustituye con hidrógeno; al menos un carbono de las posiciones 11, 12 y 13 se sustituye con hidrocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono, halocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono o hidrohalocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono, y exactamente dos de los carbonos en las posiciones 11 , 12 y 13 se sustituyen con hidrógeno; la posición 19 se sustituye con -CN, -X, -OH, -N02, -SH, u -OR8, y un carbono en las posiciones 17 y 18 se sustituye con -CN, -X, -OH, -N02, -SH, u -OR8; las posiciones 3, 4, 6, 7, 9 y 10 se sustituyen con hidrógeno, y al menos un carbono de las posiciones 11, 12 y 13 se sustituye con idrocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono, halocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono o hidrohalocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono, y una de las posiciones 17 y 18 se sustituye con hidrógeno, y la posición 19 se sustituye con -CN, -X, -OH, -N02, -SH, u -OR8, y al menos un carbono en las posiciones 17 y 18 se sustituye con -CN, -X, -OH, -N02, -SH, u -OR8;, y un carbono en las posiciones 17 y 18 se sustituye con hidrógeno; las posiciones 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11 y 18 se sustituyen con hidrógeno, y las posiciones 17 y 19 se sustituyen con -OR8, en donde R8 es un grupo hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono, y la posición 12 se sustituye con hidrocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono, halocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono o hidrohalocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono; las posiciones 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 15, 16 y 18 se sustituyen con hidrógeno, y la posición 12 se sustituye con hidrocarbilo de 1 átomo de carbono, y la posición 17 se sustituye con hidrógeno, y la posición 12 se sustituye con hidrocarbilo de 1 átomo de carbono, y la posición 17 se sustituye con -O-ciclopentilo, y la posición 19 se sustituye con -O-metilo, en donde opcionalmente las posiciones 3 y 5 tienen ambas la estereoquímica S. Cualquiera de los compuestos puede estar en la forma de una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de acuerdo con la presente invención. o dos grupos R7 adyacentes, junto con los carbonos en las posiciones 12 y 13 o posiciones 11 y 13 a las cuales están unidos, formando un grupo 1 ,3-dioxolanilo; En los compuestos de la invención, el anillo que contiene N es monocíclico y saturado, como se muestra en la Breve Descripción de la Invención. En modalidades preferidas de los compuestos de la invención, W se selecciona entre -NH2, -NHR8 y -NR8R8; W se selecciona entre -CONH2, -COOH, -CN, -CHO, -COX, CONHR8, CONR8R8, -COOR8, -COR8; W se selecciona entre -OCHO, -OH, -OCOR8, y -OR8; W se selecciona entre -BH2, -BHR8, -BR8R8, -B02H2, -B02R8R8, -PH2, -PHR8, -PR8R8, -POR8, -P02R8, -P03R8, -SR8, -SOR8, -SONH2, -SONHR8, -SONR8R8, -S02NH2, -S02NHR8 y -S02NR8R8; W se selecciona entre -NH2, -CN, -X, -OH, -N02, -SH, -NHR8, -NR8R8, -ORa y -SR8; o W es -OR8. En otras modalidades preferidas de los compuestos de la invención, R7 es un grupo hidrocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono en donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R7 se sustituyen por igual número de grupos W independientemente seleccionados en cada ubicación; R7 es un grupo hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono, en donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R7 se sustituyen por una cantidad igual de grupos W independientemente seleccionados en cada ubicación; o R7 es seleccionado entre alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, alquila rilo, arilo sustituido con alquenilo, alquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con alquinilo, alquinilo sustituido con arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, bicicloalquilo, bicicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquenilcicloalquilo, alquinilcicloalquilo, c i cloa I quilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquilo, cicloalquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquenilo, cicloalquilo y policicloalquilo fusionados con arilo. En otras modalidades preferidas del compuesto de la invención, R8 es un grupo hidrocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono, R8 es un grupo hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono; o R8 se selecciona entre alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo sustituido con alquenilo, alquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con alquinilo, alquinilo sustituido con arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, bicicloalquilo, bicicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquenilcicloalquilo, alquinilcicloalquilo, cicloalquilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquilo, cicloalquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquenilo, cicloalquilo y policicloalquilo fusionados con arilo. En otras modalidades preferidas del compuesto de la invención, n es 0; n es 1; n es 2; n es 3; n es 4; n es 5; n es mayor que cero; n es 1 o 2; y n es 1 , o 2, o 3. Un compuesto preferido de la invención es un compuesto de la siguiente fórmula: como un estereoisomero simple o una mezcla del mismo, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Otro compuesto preferido de la invención, es un compuesto de la siguiente fórmula: o una sal o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable, como un estereoisómero simple o una mezcla de los mismos. Otro compuesto preferido de la invención, es un compuesto de la siguiente fórmula: o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, como un estereoisómero simple o una mezcla de los mismos. Otro compuesto preferido de la invención es un compuesto de la siguiente fórmula: o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, como un estereoisómero simple o una mezcla de los mismos. Otro compuesto preferido de la invención es un compuesto de la siguiente fórmula: o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, como un estereoisómero simple o una mezcla de los mismos. Otro compuesto preferido de la invención es un compuesto de la siguiente fórmula: o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, como un estereoisómero simple o una mezcla de los mismos. En los compuestos anteriores, una sal farmacéuticamente aceptable incluye sales de adición acida y sales de adición básica. Las sales de adición acida se refieren a aquellas sales formadas a partir de compuestos de la invención y ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido hidrobrómico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y/o sales orgánicas tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico, y similares. Las sales de adición básica incluyen aquellas sales derivadas de compuestos de la invención y bases inorgánicas, tales como sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, cinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Las sales apropiadas incluyen las sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio derivadas de bases orgánicas no tóxicas farmacéuticamente aceptables, incluyendo sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas incluyendo aminas sustituidas de forma natural, aminas cíclicas y resinas de intercambio de ion básico, tales como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, trimetamina, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaínas, hidrabamina, colina, betaína, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etílpiperidina, y similares. En los compuestos y composiciones anteriores, un grupo hidrocarbilo se forma exclusivamente a partir de carbono e hidrógeno, e incluye, por ejemplo, cualquiera de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquiio, alquilarilo, arilo sustituido con alquenilo, alquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con alquinilo, alquinilo sustituido con arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, bicicloalquilo, bicicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquenilcicloalquilo, alquinilcicloalquilo, cicloalquilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquilo, cicloalquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquenilo, cicloalquilo y policicloalquilo fusionados con arilo. Un grupo ciclohidroxicarbonilo es formado también exclusivamente a partir de carbono e hidrógeno, e incluye al menos un anillo, en donde los grupos ciciohidrocarbilo de ejemplo incluyen cualquiera de arilo, aralquiio, alquilarilo, arilo sustituido con alquenilo, alquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con alquinilo, alquinilo sustituido con arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, bicicloalquilo, bicicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquenilcicloalquilo, alquinilcicloalquilo, cicloalquilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquilo, cicloalquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquenilo, cicloalquilo y policicloalquilo fusionados con arilo. En un aspecto de la invención, el grupo ciciohidrocarbilo se selecciona entre ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. En otro aspecto, el grupo ciciohidrocarbilo es ciclopentilo. Un grupo halocarbilo se forma exclusivamente a partir de carbono y halógeno, e incluye los grupos hidrocarbilo identificados anteriormente en donde cada hidrógeno es reemplazado con un halógeno seleccionado entre fluoro, cloro, bromo y yodo, preferiblemente fluoro y cloro. Un grupo hidrohalocarbilo, el cual también puede denominarse como un grupo halohidrocarbilo, se forma exclusivamente a partir de carbono, hidrógeno y halógeno, e incluye los grupos hidrocarbilo específicos identificados anteriormente en donde algunos de los átomos de hidrógeno, pero no todos, se reemplazan con átomos de halógeno seleccionados entre flúor, cloro, bromo y yodo, preferiblemente flúor y/o cloro. Las definiciones representativas de estos grupos hidrocarbilo (los cuales pueden ser sustituidos con átomos de halógeno para proporcionar derivados halocarbilo e hidrocarbilo de los mismos) se proporcionan más adelante. "Alquilo" se refiere a una cadena de átomos de carbono acíclica, que puede ser ramificada o no ramificada (lineal). Metilo, etilo, propilo (incluyendo n-propilo e iso-propilo), butilo (incluyendo n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, y t-butilo), pentilo (incluyendo numerosos isómeros) y hexilo (incluyendo numerosos isómeros) son grupos alquilo que tienen de 1 a 6 átomos de carbono (comúnmente denominados grupos alquilo inferiores), son ejemplos de grupos alquilo de la invención. "Alquenilo" se refiere a un grupo alifático insaturado que tiene al menos un doble enlace. "Alquinilo" se refiere a un hidrocarburo insaturado que puede ser de cadena recta o ramificada y tiene uno o más enlaces triples. Los grupos preferidos no tienen más de aproximadamente 12 átomos de carbono y pueden ser etilo, propinilo, 4-metilpentinilo y así sucesivamente, e isómeros estructurales de los mismos. "Aralquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido por un radical arilo. Por ejemplo, bencilo. "Aralquinilo" se refiere a un grupo alquinilo sustituido por un anillo arilo. Por ejemplo, ArCfC-, ArCH2CH2CH2C = C- y así sucesivamente. "Cicloalquilo" se refiere a un arreglo cíclico de átomos de carbono, en donde los grupos ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloalquilo de la invención tienen de 3 a 6 átomos de carbono. Los grupos adicionales dentro del alcance de "cicloalquilo" como se definen aquí, son grupos policicloalquilo, definidos más adelante. "Cicloalquenilo" se refiere a un grupo alquenilo cíclico. Los grupos cicloalquenilo apropiados incluyen, por ejemplo, ciclopentenilo y ciclohexenilo. Un grupo policicloalquilo es un arreglo de átomos de carbono en donde al menos un átomo de carbono es una parte de al menos dos anillos identificables separadamente. El grupo policicloalquilo puede contener puentes entre dos átomos de carbono, en donde b iciclo [ 1.1.0] buti lo , biciclo[3.2.1]octilo, biciclo[5.2.0]nonilo, triciclo[2.2.1.01]heptilo, norbornilo y pinanilo son ejemplos representativos. El grupo policicloalquilo puede contener uno o más sistemas de anillo fusionados, en donde decalinilo (radical de decalin) y perhidroantracenilo son ejemplos representativos. El grupo policicloalq uilo puede contener una unión espiro, en la cual un átomo simple es el único miembro común de dos anillos. Espiro[3.4]octilo, espiro[3.3]heptilo y espiro[4.5]decilo son ejemplos representativos. "Halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo y yodo. Grupo "Heterociclilo" se refiere a sistema de anillo estable de 3 a 15 miembros fusionado al grupo fenilo al cual está unido R7, el cual consiste en átomos de carbono y desde uno hasta cinco heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre. Para propósitos de esta invención, el grupo heterociclilo puede ser un sistema de anillos monocíclico, bicíclico o tricíclico, el cual puede incluir sistemas de anillo fusionados o puenteados; y los átomos de nitrógeno, carbono o azufre en el grupo heterociclilo pueden ser oxidizados opcionalmente; el átomo de nitrógeno puede ser cuaternizado opcionalmente; y el grupo heterociclilo puede ser aromático o saturado parcial o totalmente. El grupo heterociclilo puede estar unido al grupo fenilo al cual está unido R7 en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que de como resultado la creación de un compuesto estable. Ejemplos de estos grupos heterociclilo incluyen, pero no están limitados a, azepinilo, acridinilo, benzimidaxolilo, benztiazolilo, benzoxazolilo, benzopiranilo, benzopiranonilo, benzofuranilo, benzofuranonilo, benzotienilo, carbazolilo, cinolinilo, decahidroisoquinolilo, dioxolanilo, furanilo, furanonilo, isotiazolilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, isotiazolidinilo, indolilo, ¡soindolilo, ¡ndolinilo, isoindolinilo, ¡ndolizinilo, isoxazolilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, naftiridinilo, oxadiazolilo, octahidroindolilo, octahidroisoindolilo, 2-oxopiperazinilo, 2-oxopiperidinilo, 2-oxopirrolidinilo, 2-oxazepinilo, oxazolilo, oxazolidinilo, oxiranilo, piperidinilo, piperazinilo, 4-piperidonilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, pteridinilo, purinilo, pirrolilo, pirrolidinilo, pirazolilo, pirazol id i nilo, pjridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, piradazinilo, quinasolinilo, quinoxalinilo, quinolinilo, quinuclidinilo, isoquinolinilo, tiazolilo, tiazolidinilo, tiadiazolilo, tiazolilo, tetrazolilo, tetrahidrof urilo, triazinilo, tetrahidropiranilo, tienilo, tiamorfolinilo, sulfóxido de tiamorfolinilo y sulfona de tiamorfolinilo. Como se usa aquí, las siguientes abreviaturas tienen los significados indicados: Abreviatura Nombre completo 5-ASA Ácido 5-aminosalicílico Ab Anticuerpo ABTS 2,2'-azino-di-[sulfonato de 3-etilbenztiazolina] ACD Dextrosa de citrato ácido AcOH Ácido acético ACVP American College of Veterinary Practice ANOVA Análisis de varianza AR Argón BCR-ABL Oncogen en el cromosoma 9:22 transolcación Abreviatura Nombre completo BINAP 2,2'-B¡s(difenilfosfin)-1 , 1 '-binaftilo Bn Bencilo BnBr Bromuro de bencilo BOC tert-Butoxicarbonilo AMPc 3'-5'-monofosfato de adenosina cíclico cat Catalítico CD Denominación de agrupación CFA Adyuvante de Freund completo GMPc 3'-5'-monofosfato de guanosina cíclica CIA Artritis inducida por colágeno CLL Leucemia linfocítica crónica CML Leucemia mielogenosa crónica SNC Sistema nervioso central ConA Concanavalina A COX Ciclooxigenasa cPent Ciclopentilo cPentBr Bromuro de ciclopentilo CRE Elemento de respuesta de AMPc CsA Ciclosporina A DMAP 4-d¡metilaminopiridina DMARD Fármaco anti-reumático modificador de la enfermedad DMF ?/, ?-dimetilformamida I Abreviatura Nombre completo i DMSO Sulfóxido de dimetilo ADN Ácido desoxirribonucleico dppf 1,1'-Bis(difenilfosfino)ferroceno dppp 1,3-Bis(difenilfosfino)propano E C50 Concentración en la cual se nota un 50% del efecto máximo observable EDTA ácido etilendiaminotetraacético ELISA Prueba de inmunoabsorbencia relacionada con enzima EtOAc Acetato de etilo EtOH Alcohol etílico FBS Suero fetal bovino FCS Suero de cría bovina f MLP Fenilalanina de metionil-formil leucina g-i- Gastrointestinal H&E Hematoxilina y eosina HARBS Sitio de enlace rolipram de alta afinidad HBSS Solución de Sal de Hanks Balanceada HMPA Hexametilfosforamida HPLC Cromatografía líquida de alta presión i.p. intraperitoneal IBD Enfermedad Inflamatoria Intestinal IBMX 3-¡sobutil-1-metilxantina IC Concentración inhibidora Abreviatura Nombre completo IC50 Concentración en la cual se observa 50% de inhibición IFA Adyuvante incompleto de Freund IFN-? Gamma ¡nterferón IL Interleucina LAH Hidruro de litio y aluminio LDA Diisopropilamida de litio LN Nodo linfático LPS Lipopolisacárido LTB4 Leucotrieno B4 luc Luciferasa Me Metilo MeOH alcohol metílico MHC Clase de histocompatibilidad principal MLR Reacción de linfocito mixta MPO Mieloperoxidasa Ms Metanosulfonilo MsCI Cloruro de metanosulfonilo NBS /V-Bromosuccinimida n-BuL¡ n-Butil-litio n-BuSH n-butanoetiol ¡NF-KB Factor nuclear kappa B jNSAID Fármaco anti inflamatorio no esferoide Abreviatura Nombre completo p.t. Posterior al transplante PBS Solución salina regulada fosfatada Pee Citocromo C de paloma PDE Fosfodiesterasa PEG Polietilénglicol PG Prostaglandina PMS Metosulfto de fenazina P SF Fluoruro de fenil-metil-sulfonilo pTsOH monohidrato de ácido p-Toluenosulfónico Py Pirid ina RA Artritis reumatoide RF Factor reumatoide Rf Factor de retardo ROS Especies de oxígeno reactivo RP I Roxwell Park Memorial Institute RTX Resinifeitoxina SAR Relaciond e actividad estructural TBAF Fluoruro de tetrabutilamonio TBDMS ferf-Butildimetilsililo TBDMSCI Cloruro de rerf-Butildimetilsililo TCR Receptor de células T TEA Trietilamina Tf Trifluorometanosulfonilo Abreviatura Nombre completo TFA Ácido trifluoroacético Th Ayudante T i THF Tetrahidrofurano ! TNBS ácido trinitrobencenosulfónico TNF-a Factor de necrosis tumoral alfa Trolox® ácido 6-hidroxi-2.5.7.8-tetrametilcroman-2-carboxílico TsOH Monohidrato de ácido p-Toluenosulfónico XTT Sal interior de 2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfo-fenil]- 2H-tetrazolio-5-carboxanilida µ? Micro molar Cuando aparece cualquier variable más de una vez en cualquier constituyente o en compuestos de la invención, su definición en cada aparición es independiente de su definición en cualquier otra aparición. Son permisibles combinaciones de sustituyentes y/o variables sólo su estas combinaciones dan como resultado componentes estables. Los compuestos útiles en los métodos y composiciones de la presente invención, así como también los compuestos de la presente invención, pueden tener centros asimétricos y aparecer como racematos, mezclas racémicas y como diaesterómeros individuales, o enantiómeros con todas las formas isoméricas incluidas en la presente invención. Un racemato o mezcla racémica no implica una mezcla 50:50 de estereoisómeros. En otra modalidad, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de la invención como se indicó anteriormente, en combinación con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden usarse para el tratamiento de inflamación u otras condiciones tal como se discute en la presente solicitud. Estas composiciones pueden estar formadas también en un medicamento, el cual puede ser usado en el tratamiento de, por ejemplo, inflamación. Estas composiciones son útiles, como por ejemplo, pruebas estándar, medios convenientes para realizar envíos a granel o composiciones farmacéuticas. Una cantidad que puede someterse a prueba de un compuesto de la invención es una cantidad que es medible fácilmente mediante procedimientos y técnicas de prueba estándar tal como son bien conocidos por ios expertos en la material Las cantidades que pueden someterse a prueba de un compuesto de la invención, generalmente variarán desde aproximadamente 0.001 % por peso hasta aproximadamente 80 % por peso del peso total de la composición. Los portadores inertes incluyen cualquier material que no se degrade o de otra forma reaccione covalentemente con un compuesto de la invención. Ejemplos de portadores inertes apropiados son agua; reguladores acuosos, tales como los que generalmente son útiles en análisis de Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC, según siglas en inglés de High Performance Liquid Cromatography); solventes orgánicos, tales como acetonitrilo, acetato de etilo, hexano y similares; y portadores farmacéuticamente aceptables. Los "portadores farmacéuticamente aceptables" par uso terapéutico son bien conocidos en materia farmacéutica, y están descritos, por ejemplo, en Reminqtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit., 1985). Por ejemplo, puede usarse salina estéril y salina reguladora fosfatada en pH fisiológico. Se puede proporcionar preservativos, estabilizadores, colorantes y aún agentes saborizantes en la composición farmacéutica. Por ejemplo, se puede añadir benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico como preservativos. kL en 1449. Adicionalmente, se puede usar agentes antioxidantes y agentes suspensores. . Así, la presente invención proporciona una composición farmacéutica o veterinaria (en lo sucesivo, denominada simplemente como composición farmacéutica) que contiene un compuesto de la invención como se describe anteriormente, en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. La invención proporciona además una composición, preferiblemente una composición farmacéutica, que contiene una cantidad efectiva de un compuesto de (1-4) como se describe anteriormente, en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden estar en cualquier forma que permita que la composición sea administrada a un paciente. Por ejemplo, la composición puede estar en la forma de un sólido, líquido o gas (aerosol). Las vías de administración típicas incluyen, sin limitación, oral, tópica, parenteral, sublingual, rectal, vaginal e intranasal. El término parenteral como se usa en la presente solicitud, incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, inyección intraesternal o técnicas de infusión. Las composiciones farmacéuticas de la invención están formuladas de tal forma que permiten a los ingredientes activos contenidos en ellas estar biodisponibles bajo administración de la composición a un paciente. Las composiciones que serán administradas a un paciente toman la forma de una o más unidades de dosis, en donde por ejemplo, una tableta puede ser una sola unidad de dosis, y un contenedor de un compuesto de la invención en forma de aerosol puede mantener una pluralidad de unidades de dosis. Los materiales usados en la preparación de las composiciones farmacéuticas deben ser farmacéuticamente puros y no tóxicos en las cantidades usadas. Será evidente para los conocedores de la técnica que la dosis óptima de los ingredientes activos en la composición farmacéutica dependerán de una variedad de factores. Los factores relevante incluyen, sin limitación, el tipo de sujeto (por ejemplo, humano), la forma particular del ingrediente activo, la forma de administración y la composición empleada. En general, la composición farmacéutica incluye un (en don de "un" se refiere aquí, y a través de esta especificación, a uno o más) compuesto activo de la invención tal como se describe en la presente, en mezcla con uno o más portadores. Los portadores pueden ser en partículas, de tal forma que las composiciones sean, por ejemplo, en forma de tabletas o polvo. Los portadores pueden ser líquidos, y las composiciones pueden ser, por ejemplo, un jarabe oral o un líquido inyectable. Adicionalmente, los portadores pueden ser gaseosos, de forma que se proporciona una composición en aerosol útil, por ejemplo, para su administración por inhalación. Cuando está destinada para administración oral, la composición preferiblemente está en forma sólida o líquida, en las cuales están incluidas las formas sem i-sólidas, semi-líquidas, suspensión y gel, dentro de las formas consideradas en la presente como sólidas o líquidas. Como una composición sólida para administración oral, la composición puede estar formulada en un polvo, gránulo, tableta comprimida, pildora, cápsula, goma de mascar, barquillo o forma similar. Esta composición sólida contendrá típicamente uno o más diluyentes inertes o portadores comestibles. Adicionalmente, uno o más de los siguientes adyuvantes pueden estar presentes: aglomerantes tales como carboximetilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina o gelatina; excipientes tales como almidón, lactosa o dextrinas, agentes desintegradores tales como ácido algínico, alginato de sodio, Primogel, almidón de maíz y similares; lubricantes tales como estearato de magnesio o Sterotex; deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes endulzantes tales como sacarosa o sacarina, un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante de naranja, y un agente colorante. Cuando la composición está en la forma de una cápsula, por ejemplo, una cápsula de gelatina, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido tal como polietilenglicol, ciclodextrina o un ácido graso. La composición puede estar en la forma de un líquido, por ejemplo, un elíxir, jarabe, solución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser para administración oral o para suministro mediante inyección, como dos ejemplos. Cuando está destinada para administración oral, la composición preferida contiene, además de los presentes compuestos, uno o más de un agente endulzante, preservativos, colorantes y mejorador de sabor. En una composición que se desea administrar mediante inyección, se puede incluir uno o más de un agente tensioactivo, preservativo, agente humectante, agente dispersante, agente suspensor, regulador, agente estabilizador e isotónico. Las composiciones farmacéuticas líquidas de la invención, siempre que sean soluciones, suspensiones y otra forma similar, pueden incluir uno o más de los siguientes adyuvantes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferiblemente salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijos tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como el solvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, ciclodextrina, propilenglicol u otros solventes; agentes antibacteriales tales como alcohol bencílico o metilparabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelatantes tales como ácido etilenodiaminotetraacético; reguladores tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral puede estar encerrada en ampollas, jeringas desechables o frascos de dosis múltiples elaborados de vidrio o de plástico. La salina fisiológica es un adyuvante preferido. Una composición farmacéutica inyectable es preferiblemente estéril. Una composición líquida que está destinada para administración parenteral u oral debe contener al menos una cantidad de un compuesto de la invención de forma tal que se obtenga una dosis apropiada. Típicamente, esta cantidad es al menos 0.01% de un compuesto de la invención en la composición. Cuando está destinada para administración oral, esta cantidad puede ser variada para que esté entre 0.1% y aproximadamente 70% del peso de la composición. Las composiciones orales preferidas contienen entre aproximadamente 4% y aproximadamente 50% del compuesto activo de la invención. Las composiciones y preparaciones preferidas de acuerdo con la presente invención se preparan de tal forma que una unidad de dosis parenteral contenga entre 0.01% y 1% por peso de compuesto activo. La composición farmacéutica puede estar destinada para administración tópica, en cuyo caso el portador puede contener apropiadamente una solución, emulsión, ungüento o base de gel. La base, por ejemplo, puede contener uno o más de los siguientes: petrolato, lanolina, polietilenglicoles, cera de abejas, aceite mineral, diluyentes tales como agua y alcohol y emulsif icadores y estabilizadores. Los agentes espesantes pueden estar presentes en una composición farmacéutica para administración tópica. Si está destinada para administración transdérmica, la composición puede incluir un parche transdérmico o dispositivo de iontoforesis. Las formulaciones tópicas pueden contener una concentración del compuesto de la invención desde aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 10% de peso por unidad de volumen. La composición puede estar destinada para administración rectal, en la forma, por ejemplo, de un supositorio en cual se fundirá en el recto y liberará el fármaco. La composición para administración rectal puede contener una base oleaginosa como un excipiente no irritante apropiado. Estas bases incluyen, sin limitación, lanolina, manteca de cacao y polietilenglicol. La composición puede incluir varios materiales que modifican la forma física de una unidad de dosis sólida o líquida. Por ejemplo, la composición puede incluir materiales que forman una cubierta de revestimiento alrededor de los ingredientes activos. Los materiales que forman la cubierta de revestimiento típicamente son inertes, y pueden ser seleccionados por ejemplo, entre azúcar, laca, y otros agentes entéricos para revestimiento. Alternativamente, los ingredientes activos pueden ser encapsulados en una cápsula de gelatina. La composición en forma sólida o líquida puede incluir un agente que se enlace con los componentes activos y de esta manera ayude a la liberación de los componentes activos. Los agentes apropiados que pueden actuar en esta capacidad incluyen un anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína o un liposoma. La composición farmacéutica de la presente invención puede consistir en unidades de dosis gaseosas, por ejemplo, puede estar en la forma de un aerosol. El término aerosol se usa para denotar una variedad de sistemas que abarca desde aquellos de naturaleza coloidal hasta sistemas que consisten en paquetes presurizados. La liberación puede ser mediante un gas licuado o comprimido o mediante un sistema de bomba apropiado que dispense los ingredientes activos. Los aerosoles de los compuestos de la invención pueden ser suministrados en sistemas de una sola fase, bifásicos o trifásicos con el fin de liberar los ingredientes activos. La liberación del aerosol incluye el contenedor necesario, activadores, válvulas, subcontenedores, espaciadores y similares, los cuales juntos pueden formar un equipo. Los aerosoles preferidos pueden ser determinados por una conocedor de la materia, sin experimentación indebida. Ya sea en forma sólida, líquida o gaseosa, la composición farmacéutica de la presente invención puede contener uno o más agentes farmacológicos conocidos usados en el tratamiento de inflamación (incluyendo artritis).
Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse mediante metodología bien conocida en materia farmacéutica. Una composición dirigida a ser administrada mediante inyección, puede prepararse combinando el compuesto de la invención con agua de manera de formar una solución. Se puede añadir un agente tensioactivo para facilitar la formación de una solución o suspensión homogénea. Los agentes tensioactivos son compuestos que interactúan no covalentemente con el compuesto de la invención, de tal manera que facilitan la disolución de suspensión homogénea del compuesto activo en el sistema de suministro acuoso. Los compuestos de la invención discutidos aquí, o las composiciones que contienen uno o más de estos compuestos y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, pueden usarse en un método para tratar o prevenir una condición o enfermedad inflamatoria en un paciente, en donde el método comprende administrar al paciente que lo necesita una cantidad de un compuesto o composición de acuerdo con la presente invención, en donde la cantidad es efectiva para tratar o prevenir la condición o enfermedad inflamatoria del paciente. La condición o enfermedad inflamatoria puede ser una condición o enfermedad auto inmune; la condición o enfermedad inflamatoria puede involucrar inflamación aguda o crónica de los compartimientos de las articulaciones del hueso y/o cartílago; la condición o enfermedad inflamatoria puede ser una artritis seleccionada entre artritis reumatoide, artritis gotosa, o artritis reumatoide juvenil; la condición o enfermedad inflamatoria puede ser asma; la condición o enfermedad inflamatoria puede estar asociada con la desregulación de las células T, la condición o enfermedad puede estar asociada con niveles elevados de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, en donde la citoquina inflamatoria es IL-2, o en donde la citoquina inflamatoria es IFN-?, o en donde la citoquina inflamatoria es TNF-a); la condición o enfermedad inflamatoria puede ser esclerosis múltiple; la condición o enfermedad inflamatoria puede ser sarcadosis pulmonar; la condición o enfermedad inflamatoria puede ser inflamación o alergia ocular; la condición o enfermedad inflamatoria puede ser una enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa); y la condición o enfermedad inflamatoria puede ser una enfermedad inflamatoria cutánea (por ejemplo, psoriasis o dermatitis). Adicionalmente, la presente invención proporciona un método para modular los niveles de 5'-monofosfato de adenosina cíclicos en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesita, una cantidad de un compuesto o composición de acuerdo con la presente invención, en donde la cantidad es efectiva para modular los niveles de 5'-monofosfato de adenosina cíclicos del paciente. El paciente puede tener una condición o enfermedad inflamatoria. Adicionalmente, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o condición en un paciente, en donde la enfermedad o condición está asociada con condiciones patológicas que son moduladas mediante enzimas inhibidoras asociadas con mensajeros celulares secundarios, el método comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad de un compuesto o una composición de la presente invención, en donde la cantidad es efectiva para tratar o prevenir una enfermedad o condición asociada con condiciones patológicas que son moduladas por enzimas inhibidoras asociadas con mensajeros celulares secundarios. La enzima puede ser una AMP cíclica; o la enzima puede ser una fosfodiesterasa 4; o la enzima puede ser una fosfodiesterasa 3; o las enzimas pueden ser tanto fosfodiesterasa 4 como fosfodiesterasa 3; o la enzima puede ser una fosfodiesterasa GMP cíclica. Adicionalmente, la presente invención proporciona un método para el tratamiento o prevención del rechazo de trasplantes en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesita, una cantidad de un compuesto o composición de la presente invención, en donde la cantidad es efectiva para tratar o prevenir el rechazo de trasplante en el paciente. El rechazo puede ser debido a injerto contra enfermedad del huésped. Adicionalmente, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir la proliferación celular incontrolada en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesita, una cantidad de un compuesto o composición de acuerdo con la presente invención, en donde la cantidad es efectiva para tratar o prevenir la proliferación celular incontrolada en el paciente. La proliferación celular incontrolada puede ser causada por un cáncer seleccionado entre leucemia y tumores sólidos. Adicionalmente, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir condiciones asociadas con el sistema nervioso central (SNC) en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad de un compuesto o composición de acuerdo con la presente invención, en donde la cantidad es efectiva para tratar o prevenir condiciones asociadas con el sistema nervioso central (SNC) en el paciente. La condición asociada con el sistema nervioso central (SNC) puede ser depresión. En un método de la presente invención, un compuesto de la invención, o una composición que contiene uno o más compuestos de la invención y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, puede, a pesar de no ser necesario, lograr uno o más de los siguientes resultados deseados en el sujeto al cual le ha sido administrado un compuesto de la invención tal como se definió anteriormente, o una composición que contiene uno de estos compuestos y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable: 1. Inhibición de generación de especies reactivas al oxígeno a partir de neutrófilos primarios: 2. Inhibición de quimiotaxia neutrófila; 3. Inhibición de producción de TNF-a; 4. Inhibición de edema; . Depuración de radicales de oxígeno: 6. Inhibición de fosfodiesterasas 1, 3, 4 A P cíclicas , y PDE relacionados, tales como PDE7; 7. Potenciación de inducción de actividad de transcripción mediada por CRE en células monocíticas humanas; 8. Inhibición de PDE, preferiblemente PDE4, PDE3, o PDE3 y PDE4; 9. Inhibición de producción de citoquina por subconjuntos de células T activados; 10. Inhibición de liberación de mieloperoxidasa neutrófila: 11. Baja proporción de lC5o PDE4(cat): lC5oPDE4(HARBS); 12. Inhibición de rechazo de implante; 13. Inhibición de parámetros clínicos e histopatológicos de artritis en un modelo de artritis inducido por montaje de murina. Así, el método inventivo puede ser usado para tratar inflamación, incluyendo tanto inflamación aguda como inflamación crónica, así como también ciertos desórdenes proliferativos (cánceres). Como se usa aquí, la inflamación incluye, sin limitación, espondilitis anquilosante, artritis (en donde este término comprende más de 100 tipos de enfermedades reumáticas), asma, enfermedad de Crohn, síndrome de fibromialgia, gota, inflamaciones del cerebro (incluyendo esclerosis múltiple, demencia AIDS, encefalopatía de Lyme, encefalitis por herpes, enfermedad de Creutzfeld-Jacob, y toxoplasmosis cerebral), enfisema, enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome de intestino irritable, daño por reperfusión isquémica, sarcoidosis pulmonar eritematosa juvenil, enfermedad de Kawasaki, osteoartritis, enfermedad inflamatoria pélvica, artritis psoriásica (psoriasis), artritis reumatoide, psoriasis, trasplante de tejido u órgano, escleroderma, espondiloartropatías, lupus eritematoso sistémico, sarcoidosis pulmonar, y colitis ulcerativa. Como se usa aquí, los desórdenes proliferativos incluyen, sin limitación, todas las leucemias y tumores sólidos que son susceptibles de experimentar diferenciación o apoptosis bajo interrupción de su ciclo celular. El método inventivo proporciona la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención, incluyendo sus sales, composiciones, etc. Como se usa aquí, la cantidad actual comprendida por el término "cantidad terapéuticamente efectiva" dependerá de la ruta de administración, el tipo de animal de sangre caliente que va a ser tratado y las características físicas del animal de sangre caliente específico bajo consideración. Estos factores y su relación para determinar esta cantidad son bien conocidos por los practicantes entrenados en las ciencias médicas. Esta cantidad y el método para su administración, pueden ser ajustados para lograr eficacia óptima, pero dependerá de factores tales como peso, dieta, medicación concurrente y otros factores que los conocedores de las técnicas médicas reconocerán. Una cantidad efectiva de un compuesto o composición de la presente invención, será suficiente para tratar la inflamación en un animal de sangre caliente, tal como un ser humano. Los métodos para administrar cantidades efectivas de agentes anti-inflamatorios son bien conocidos en la técnica, e incluyen la administración de formas inhaladas, orales o parenterales. Estas formas de dosis incluyen, pero no están limitadas a, soluciones parenterales, tabletas, cápsulas, implantes y sistemas de liberación prolongada, o sistemas de dosis por inhalación que emplean inhaladores de polvo seco o dispositivos de inhalación presurizados de dosis múltiples. La cantidad y frecuencia de dosis se seleccionan para crear un nivel efectivo del agente sin efectos dañinos. Generalmente abarca desde una dosis de aproximadamente 0.01 hasta 100 mg/kg/día, y típicamente desde aproximadamente 0.1 hasta 10 mg/kg/día en donde se administre oralmente o por vía intravenosa. También, la escala de dosis será típicamente desde aproximadamente 0.01 hasta 1 mg/kg/día en donde se administre intranasalmente o por inhalación. Los compuestos de la invención incluyendo los compuestos usados en los métodos y composiciones expuestos anteriormente, pueden ser preparados de acuerdo con los Esquemas expuestos en los siguientes ejemplos. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no a mantera de limitación. A menos que se indique otra cosa, la cromatografía instantánea y la cromatografía de columna fueron realizadas usando gel de sílice 60 Merck (malla 200-400). La cromatografía instantánea puede llevarse a cabo de acuerdo con el procedimiento señalado en "Purification of Laboratory Chemicals", 3era. edición, Butterworth-Heinemann Ltd., Oxford (1988), Eds. D.D.Perrin y W.L.F. Armarego, página 23. La cromatografía de columna se refiere al proceso en donde la tasa de flujo del eluyente a través de un material de empaque está determinada por la gravedad. En todos los casos, la cromatografía instantánea y la cromatografía radial pueden ser usadas de forma intercambiable. La cromatografía radial se realiza usando gel de sílice en un Cromatotron modelo # 7924T (Harrison Research, Palo Alto, California). A menos que se indique otra cosa, los valores Rf citados, se obtienen mediante cromatografía de capa delgada usando gel de sílice 60 F254 (Merck KgaA, 64271, Darmstadt, Alemania). También, a menos que se indique de otra forma, los reactantes y reactivos químicos se obtuvieron de casas de suministro de sustancias químicas estándares, tales como Aldrich (Milwaukee, Wl; www.aldrich.sial.com); EM Industries, Inc. (Hawthorne, NY; www.emscience.com); Fischer Scientific Co. (Hampton, NH; www.fischer1.com); y Lancaster Synthesis, Inc. (Windham, NH; www.lancaster.co.uk). Los gases se obtuvieron de Praxair (Vancouver, B.C.). Las líneas de células, a menos que se indique otra cosa, fueron obtenidas de fuentes públicas o comerciales, por ejemplo, American Tissue Culture Collection (ATCC, Rockville, MD).
EJEMPLOS DE SÍNTESIS SÍNTESIS DE INTERMEDIARIOS DE LOS COMPUESTOS DE LA INVENCIÓN Los intermediarios usados en la preparación de los compuestos de la invención pueden ser preparados mediante métodos que se presentan en el siguiente Esquema de Reacción 1. Por ejemplo, el anhídrido mixto, obtenido de ácido (3,4-dimetoxifenil)acético 16 disponible comercialmente (Aldrich) y cloruro de trimetilacetilo, se hace reaccionar con el anión de litio de (S)-(-)-4-bencil-2-oxazolidinona para obtener el compuesto 17. La adición enantioselectiva Michael del enolato de titanio de la ozaxolidinona quiral 17 al acrilato de tert-butilo proporciona el compuesto 18 con la funcionalidad carboxilato con un grupo protector apropiado. La hidrólisis del auxiliar quiral con hidróxido de litio y peróxido de hidrógeno produce el ácido carboxílico 19. La reducción selectiva del compuesto 19 con BH3-THF proporciona el compuesto 20 que contiene el alcohol primario.
ESQUEMA DE REACCIÓN 1 La síntesis de los compuestos 17-20 en este esquema de reacción se describe específicamente más adelante.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 17 Solución 1: Se añadió trietilamina (128 mL, 91.7 mmol) seguida por cloruro de trimetil-acetilo (10.4 mL, 84.2 mmol) a una solución de ácido (3,4-dimetoxifenil)acético 16 (15.0 g, 76.5 mmol) en THF (120 mL) a 0°C y se agitó la mezcla durante una hora. Solución 2: En un segundo matraz, se añadió n-butil-litio (2.5 M en hexanos, 33.7 mL, 84.2 mmol) a una solución de (S)(-)-4-bencil-2-oxazolidinona (14.9 g, 84.2 mmol) en THF seco (75 mL) a -78°C. Esta solución se agitó durante una hora y luego se añadió a la solución 1 a 0°C por medio de una cánula. La mezcla resultante se calentó desde 0°C hasta temperatura ambiente , se agitó durante 24 horas, luego se diluyó con solución saturada de NaHC03 (300 mL), y se extrajo con CH2CH3 (3 x 200 mL). Se lavó la capa orgánica combinada con NaCI saturado (2 x 150 ML), se secó sobre MgS04, se filtró, y se concentró el filtrado bajo presión reducida. Se purificó el residuo por cromatografía de columna en gel de sílice (hexanos/EtOAc, 4:1) para obtener el compuesto 17 (19.04 g, 70%) como un sólido blanco.
SÍNTESIS DE LOS COMPUESTOS 18 Y 19 Se añadió lentamente isopropóxido de titanio (0.42 mL, 1.41 mmol) a una solución de tetracloruro de titanio (0.50 mL, 4.50 mmol) en diclorometano seco (10 mL) a 0°C. Se agitó la mezcla resultante a 0°C durante 5 minutos, luego se añadió düsopropiletilamina (1.04 mL, 5.91 mmol). Después de 15 minutos, se añadió una solución del compuesto 17 (2.0 g, 5.63 mmol) en diclorometano (10 mL). Se agitó la mezcla durante 90 minutos a 0°C, luego se añadió acrilato de tert-butilo (1.24 mL, 8.45 mmol). Se calentó la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente y se agitó durante 36 horas y luego se diluyó con cloruro de amonio saturado (50 mL). Se extrajo la capa acuosa con diclorometano (3 x 50 mL), y luego se lavaron las capas orgánicas combinadas con 1N HCI (2 x 75), agua (2 x 75 mL) y NaCI saturado (2 x 75 mL). Después de secar sobre MgSo4, la filtración y evaporación del filtrado in vacuo produjo el compuesto 18 crudo (2.69 g), el cual se usó sin purificación adicional. Se disolvió el compuesto 18 crudo (2.69 g) en una mezcla de 3:1 THF/agua (95 mL) y se enfrió hasta 0°C. Se añadió monohidrato de hidróxido de litio (466.6 mg, 11.12 mmol) y peróxido de hidrógeno al 39% (2.5 mL, 22.25 mmol) y se agitó la mezcla a 0°C durante 3 horas. Se añadió una solución de sulfito de sodio (3.06 g, 24.46 mmol) seguida por 0.5N de bicarbonato de socio (41 mL). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se concentró in vacuo. Se diluyó la fase acuosa con HCI al 5% hasta un pH = 2 y luego se extrajo con EtOAc (3 x 75 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgS04, se filtraron y se concentró el filtrado in vacuo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice usando ácido acético al 0.2% en acetato de etilo/hexanos al 20% para obtener el compuesto 19 (1.09 g, 60% sobre dos pasos) como un líquido amarillo claro.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 20 Se añadió por goteo BH3-THF (1.0 M de solución en THF, 37.6 mL, 0.0376 moles) durante 20 minutos a una solución del compuesto 19 (12.18 g, 0.0376 moles) en THF seco (50 mL) a -18°C. Luego se quitó el baño de enfriamiento, y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 16 horas. Se añadió solución de NaHCO3 saturada (50 mL), se extrajo la fase acuosa con EtOAc (3 x 75 mL). Se lavó la capa orgánica combinada con NaCI saturado (2 x 75 mL). Se secó la fase orgánica sobre MgS0 , se filtró y el filtrado se evaporó in vacuo. Se purificó el residuo mediante cromatografía de columna, eluyendo con EtOAc al 50% en hexanos para obtener el compuesto 20 (10.52 g, 91%) como un aceite incoloro. Alternativamente, se puede sintetizar intermediarios de los compuestos de la invención que tengan diferentes grupos alcoxi en el anillo fenilo, mediante los métodos descritos más adelante en el Esquema de Reacción 2. Por ejemplo, el alcohol 3-hidroxi-a-metoxibencílico 31 disponible comercialmente se protege selectivamente como el derivado benciloxi 32 por tratamiento de 31 con bromuro de bencilo y carbonato de potasio en tolueno refluyente para producir 89% del producto deseado después de la cristalización. Luego se hace reaccionar el compuesto 32 con cloruro de metanosulfonilo en la presencia de trietilamina y CH2CH2 para producir el compuesto 33, el cual se usa sin purificación adicional. El producto 33 crudo se coloca luego en DMF y se trata con cianuro de potasio en la presencia de 18-corona-6. Después del desarrollo y purificación, se aisla el nitrilo 34 en rendimiento de 91% sobre dos pasos. Luego se logra la hidrólisis del nitrilo 34 con hidróxido de potasio para obtener el ácido carboxilico 35 deseado en rendimiento de 95%. El tratamiento del compuesto 35 con cloruro de trimetilacetilo produce un anhídrido mixto que se hace reaccionar con el anión litio de (S)-(-)-4-bencil-2-oxazolidinona para dar el compuesto 36 en rendimiento de 75%. La adición Michael enantioselectiva del enolato de titanio de la oxazolidinona quiral 36 a acrilato de tert-butilo proporciona el compuesto 37 con la funcionalidad carboxilato con un grupo protector apropiado. La hidrogenación del compuesto 37 produce el alcohol en rendimiento cuantitativo, el cual es convertido al derivado ciclopentiloxi 38 en rendimiento de 64% mediante tratamiento con bromuro de ciclopentilo, carbonato de potasio y yoduro de potasio en DMF. De acuerdo con esto, se puede hacer cualquier cantidad de derivados alcoxi en el anillo fenilo usando el bromuro de alquilo correspondiente o bromuro de alquilo f uncionalizado . La hidrólisis del auxiliar quiral con hidróxido de litio y peróxido de hidrógeno produce el ácido carboxilico 39, con rendimiento de 91%. La reducción selectiva del compuesto 39 con BH3-THF produce el compuesto 40 (89% de rendimiento) que contiene el alcohol primario.
ESQUEMA DE REACCIÓN 2 La síntesis de los compuestos 32-40 en este esquema de reacción se describe específicamente más adelante.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 32 A una suspensión agitada rápidamente de alcohol 3-hidroxi-4-metoxibencílico 31 (30.0 g, 195 mmol), carbonato de potasio (62.2 g, 450 mmol) y 18-corona-6 (0.40 g, 1 mol%) en tolueno (350 mL) se le añadió una solución de bromuro de bencilo (25.6 g, 150 mmol) en tolueno (150 mL) durante 20 min. La mezcla de reacción se refluyó durante 16 horas, después de lo cual se diluyó la mezcla con éter dietílico (400 mL) y se lavó sucesivamente con NaOH (1N, 2 x 250 mL), NaHC03 acuoso saturado (2 x 250 mL), y salmuera (2 x 300 mL). Se secó la capa de éter dietílico sobre MgS04 anhidro, y se eliminó el solvente para proporcionar un sólido amarillo claro (42.1 g) que se cristalizó con EtOAc y hexanos para producir el compuesto 32 (32.7 g, 89%) como un sólido cristalino blanco.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 33 Se disolvió el compuesto 32 (30.0 g, 122.8 mmol) en diclorometano (300 mL) y se enfrió hasta 0°C, y luego se le añadió Et3N (20.4 mL, 147.36 mmol) y cloruro de metanosulfonilo (11.40 mL, 147.36 mmol). Se quitó el baño de hielo, y se agitó la solución a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego se diluyó la mezcla con diclorometano (700 mL), se lavó sucesivamente con NaHC03 acuoso saturado (2 x 300 mL) y H20 (2 x 300 mL). Se secó la fase orgánica sobre MgS04, se filtró y se concentró el filtrado para obtener el compuesto 33 (33.08 g) como un sólido amarillo claro que se usó para el siguiente paso sin purificación adicional.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 34 A una solución de 33 crudo (33.08 g) en DMF seco (200 mL) se le añadió KCN (15.99 g, 245.6 mmol) y 18-corona-6 (5.19 g, 19.65 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 18 horas, luego se vació en agua (1.5 L). Se recolectó el precipitado y se disolvió en EtOAc (600 mL), se lavó con H20 (2 x 200 mL) y salmuera (2 x 200 mL). Se secó la fase orgánica sobre MgS04, se filtró y se concentró el filtrado para obtener el compuesto 34 (28.5 g, 91% de rendimiento sobre dos pasos) como un sólido de color crudo.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 35 Se calentó una mezcla del compuesto 34 (28.0 g, 110.5 mmol) y KOH (94.0 g, 167.5 mmol) en H20 (170 mL) por reflujo durante 12 horas. Después se enfrió la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente , se diluyó con H20 (1.6 L) y se acidificó con 12N de HCL hasta pH = 2. Se recolectó el precipitado resultante y se secó sobre P205 para obtener el compuesto 353 (28.8 g, 95%) como un sólido blanco.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 36 Solución 1: Se añadió trietilamina (17.7 mL, 126.92 mmol) seguida por cloruro de trimetil-acetilo (14.3 mL, 116.35 mmol), a una solución del compuesto 35 (28.8 g, 105.77 mmol) en THF (250 mL) a 0°C y se agitó la mezcla durante 1 hora. Solución 2: En un segundo matraz, se añadió n-butil-litio (2.5 M en hexanos, 46.5 mL, 116.35 mmol) a una solución de (S)-(-)-4-bencil-2-oxazolidinona (206 g, 116.35 mmol) en THF seco (145 mL) a -78°C. Esta solución se agitó durante una hora y luego se añadió a la solución 1 a 0°C. Se calentó la mezcla resultante desde 0°C hasta temperatura ambiente , se agitó durante 24 horas, luego se diluyó con solución de NaHC03 saturada (400 mL), y se extrajo con CH2CI2 (4 x 300 mL). Se lavó la capa orgánica combinada con salmuera (200 mL), se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró el filtrado bajo presión reducida. Se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice (hexanos/EtOAc, 4:1) para obtener el material inicial (15.93 g) y el compuesto 36 (15.30 g, 75% basado en la recuperación de material inicial) como un sólido blanco.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 37 Se añadió lentamente isopropóxido de titanio (2.6 mL, 8.69 mmol) en una solución de tetracloruro de titanio (3.1 mL, 27.8 mmol) en diclorometano seco (100 mL) a 0°C. Se agitó la mezcla resultante a 0°C durante 5 minutos, luego se añadió diisopropiletilamina (6.7 mL, 38.24 mmol). Después de 15 minutos, se añadió una solución del compuesto 36 (15 g, 34.76 mmol) en diclorometano (100 mL). Se agitó la mezcla durante 90 minutos a 0°C, luego se añadió acrilato de tert-butilo (15.3 mL, 104.28 mmol). Se agitó la mezcla de reacción durante 3 días a 0°C y luego se diluyó con cloruro de amonio saturado (300 mL). Se extrajo la capa acuosa con diclorometano (3 x 300 mL), y se lavaron las capas orgánicas combinadas con HCI al 5% (2 x 400 mL), agua (2 x 300 mL) y NaCI saturado (400 mL). Después de secar sobre MgS04, la filtración y evaporación ¡n vacuo dio el compuesto crudo 37 (21.0 g). Una porción de 37 crudo (2.1 g) se purificó mediante cromatografía de columna en gel de sílice eluido con EtOAc/hexanos (1:2), para obtener el compuesto 37 puro (1.55 g) como un jarabe.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 38 Se agitó una mezcla del compuesto 37 (1.55 g, 2.77 mmol) y Pd/C al 10% (150 mg) en EtOAc/AcOH (5:1, 60 mL) se agitó bajo H2 (globo) durante 18 horas. Se filtró la mezcla sobre celite y se evaporó el filtrado hasta secar para proporcionar el compuesto fenólico intermediario (1.30 g, 100%). Se agitó una suspensión del compuesto fenólico (0.30 g, 0.639 mmol) , K2C03 anhidro (0.132 g, 0.958 mmol) y Kl (5 mg) en DNF seco(1.5 mL) y se calentó hasta 65°C, y luego se le añadió por goteo bromuro de ciclopentilo (0.10 mL, 0.958 mmol). La mezcla agitada se calentó a 65°C durante 21 horas adicionales. Después de enfriamiento a temperatura ambiente, se diluyó la mezcla de reacción con Et20 (50 mL) y se lavó con H20 (2 x 25 mL). Se secó la capa orgánica con gS04, y se evaporó el solvente. Se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice con hexanos/EtOAc (4:1) como eluyente para obtener el compuesto 38 (0.22 g, 64%) como un jarabe incoloro.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 39 Se disolvió el compuesto 38 (3.5 g, 6.51 mmol) en THF/H20 (3:1, 60 mL) y se enfrió hasta 0°C. Se añadió monohidrato de hidróxido de litio (0.546 g, 13.02 mmol) y peróxido de hidrógeno al 30% (2.98 mL, 26.04 mmol) y se agitó la mezcla a 0°C durante 3 horas. Se añadió una solución de sulfito de sodio (3.61 g, 28.64 mmol) en agua (19 mL), seguida por 0.5N de bicarbonato de sodio (35 mL). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se concentró in vacuo. Se diluyó la fase acuosa con HCI al 5% hasta pH =2 y luego se extrajo con EtOAc (3 x 75 mL). Se secaron las capas orgánicas combinadas sobre MgS04> se filtraron y se concentró el filtrado in vacuo. Se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice usando ácido acético al 0.2% en acetato de etilo/hexanos (1:4) como eluyente para obtener el compuesto 39 (2.24 g, 91%) como un sólido blanco.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 40 Se añadió por goteo BH3-THF (1.0 M de solución en THF, 2.70 ml_, 2.70 mmol) durante 40 minutos a una solución del compuesto 39 (2.23 g, 2.64 mmol) en THF seco (15 mL) a -18°C. Luego se eliminó el baño de enfriamiento, y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 18 horas. Se añadió solución acuosa saturada de NaHC03 (15 mL), y se extrajo la fase acuosa con EtOAc (3 x 50 mL). Se lavó la fase orgánica combinada con NaCI saturado (2 x 50 mL). Se secó la capa orgánica sobre MgS04, se filtró y se evaporó el filtrado in vacuo. Se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice, eluyendo con 25% de EtOAc en hexanos para obtener el compuesto 40 (1.91 g, 89%) como un aceite incoloro. Los intermediarios adicionales usados en la preparación de los compuestos de la invención, pueden ser preparados como se describe más adelante en el Esquema de Reacción 3. En general, la conversión del compuesto 20 en el intermediario clave 46 se logró en una secuencia de cinco pasos, como sigue. El tratamiento del compuesto 20 con complejo azida de zinc / bis piridina, trifenilfosfína y azodicarboxilato de diisopropilo en tolueno permite obtener fluidamente la correspondiente azida 44 en rendimiento de 91%. El compuesto 44 se hidrogena luego en la presencia de Rd-C al 10% y la amina 45 resultante se convierte en el compuesto 46 (63% sobre dos pasos) por tratamiento con NaOH en DMF.
ESQUEMA DE REACCION 3 La síntesis de los compuestos 44 - 46 en este esquema de reacción se describe específicamente más adelante.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 44 Preparación de complejo XnN62Py: A una solución agitada de Zn(N03)26H20 (3.57 g, 12.0 mmol) en H20 (6 mL) se le añadió por goteo una solución de NaN3 (1.56 g, 24.0 mmol) en H20 (12 mL). La suspensión blanca se llevó a 50°C en un baño de aceite, luego se le añadió por goteo piridina (2.0 mL, 24.7 mmol) formando un precipitado blanco denso. Se continuó la agitación mientras la mezcla se enfrió lentamente a temperatura ambiente . Se filtró la sal, se lavó con agua helada con hielo y se secó in vacuo para obtener ZnN62Py (2.99 g, 81%) como un sólido blanco. Se añadió azodicarboxilato de diisopropilo (1.30 mL, 6.59 mmol) a una suspensión del compuesto 20 (1.0 g, 3.30 mmol), ZnNe.2Py (0.76 g, 2.47 mmol) y Ph3P (1.73 g, 6.59 mmol) en tolueno anhidro (20 mL). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 18 horas. Se concentró la mezcla y se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice eluido con hexanos/EtOAc (9:1) para obtener el compuesto 44 (1.01 g, 91%) como un aceite incoloro.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 45 Se agitó una mezcla del compuesto 44 (1.00 g, 2.98 mmol) y Pd/C 10% (100 mg) en EtOAc (30 mL) bajo H2 (globo) durante 18 horas. Se filtró la mezcla en celite y se evaporó el filtrado hasta secar para obtener el compuesto 45 (0.923 g, 100%) como un jarabe incoloro.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 46 Se añadió hidróxido de sodio (5N, 0.14 mL, 0.70 mmol) a una solución del compuesto 45 (0.21 g, 0.68 mmol) en THF (1 mL) y MeOH (1 mL9. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 18 horas. Se concentró la mezcla, y se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice eluido con hexanos/EtOAc (9:1) para obtener el compuesto 46 (0.091 g, 63%) como un sólido blanco.
SÍNTESIS DE LOS COMPUESTOS DE LA INVENCIÓN Los compuestos de la invención se pueden preparar por medio de los métodos descritos más adelante en el Esquema de Reacción 4. En este enfoque, el compuesto 46 se trata con NaH y bromuro de bencilo en DMF para obtener el compuesto 47 en un rendimiento de 80%. Luego el compuesto 47 es colocado en THF y alquilado con bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo para obtener los productos 48 y 49 en una razón de 7.2:1 en rendimiento de 86%. Estos dos isómeros pueden separarse por cromatografía de columna en gel de sílice. La des-O-bencilación del compuesto 49 usando Pd/C 10% como catalizador, procede fácilmente y se aisla el fenol 50 en rendimiento de 98%. La hidrogenólisis adicional bajo alta presión puede entonces producir el compuesto 51. ESQUEMA DE REACCIÓN 4 « 90 Se puede usar métodos alternativos para proteger el nitrógeno lactama como se ilustra en el siguiente Esquema de Reacción 5. Por ejemplo, la N-protección de 46 como la N-t-butoxicarbonilamida puede lograrse usando di-tert-butildicarbonato y trietilamina en diclorometano para obtener el derivado 52 en rendimiento de 95%. La alquilación del compuesto 52 con bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo produce el compuesto 53 en rendimiento del 57%. El compuesto 53 es una mezcla diaestereomérica. La eliminación del grupo protector N-BOC en el compuesto 53 con ácido trifluoroacético en diclorometano da el producto 54 en 74% de rendimiento. La hidrogenólisis del compuesto 54 usando Pd/C 10% como catalizador proporciona la mezcla diaestereomérica 55 en rendimiento de 81%.
ESQUEMA DE REACCION 5 CFjCOOH La síntesis de los compuestos 47-55 en los Esquemas de Reacción 6 y 7, se describe más adelante.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 47 Se disolvió el compuesto 46 (0.184 g, 0.782 mmol) en DMF (5 mL) y se enfrió hasta 0°C, se añadió NaH (0.0344 g, 60% en aceite mineral, 0.860 mmol). Después de dos horas, se añadió lentamente bromuro de bencilo (0.14 mL, 1.173 mmol) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante otras 18 horas. Se evaporó el solvente y se purificó el residuo resultante mediante cromatografía de columna en gel de sílice eluido con EtOAc para obtener el compuesto 47 (0.203 g, 80%) como un sólido blanco.
SÍNTESIS DE LOS COMPUESTOS 48 Y 49 A una solución del compuesto 47 (0.23 g, 0.707 mmol) en THF seco (4 mL) bajo argón, se le añadió lentamente LDA [0.85 mmol, preparado a partir de n-BuLi (o.34 mL, solución de 2.5 M en hexano, 0.85 mmol) y diisopropilamina (0.12 mL, 0.85 mmol)] en THF (2 mL) a -78°C. Se agitó la mezcla a -78°C durante una hora, y luego se añadió HMPA (0.18 mL, 1.06 mmol) a la mezcla anterior por medio de una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo (0.434 g, 1.41 mmol) en THF (1 mL). Se agitó la mezcla resultante durante dos horas adicionales a -78°C. La base en exceso se enfrió rápidamente a 0o con NH4CI acuoso saturado (10 mL), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 30 mL). Se lavaron las capas orgánicas combinadas con salmuera (2 x 40 mL), se secaron sobre MgS04, se filtraron, y se evaporó el filtrado hasta secar. Se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice eluido con hexanos/EtOAc (3:2) para dar los compuestos 49 (0.295 g, 75.6%) y 48 (0.041 mg, 10.5%) como espumas blancas.
SÍNTESIS DE LOS COMPUESTOS 50 Y 51 Se agitó una mezcla del compuesto 49 (0.25 g, 0.453 mmol) y Pd/c 10% (50 mg) en EtOAc (20 mL) bajo H2 (globo) durante 48 horas. Se filtró la mezcla en celite y se evaporó el filtrado hasta secar para obtener el compuesto 50 (0.204 g, 98%) como una espuma blanca. La hidrogenólisis adicional del compuesto 50 bajo presión alta produce el compuesto 51.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 52 Se añadió dicarbonato de ti-tert-buti lo (0.724 g, 3.32 mmol) a una solución del compuesto 46 (0.39 g, 1.66 mmol), Et3N (0.46 mL, 3.22 mmol), y DMAP (0.040 g) en CH2CI2 (12 mL). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 4 horas. Se concentró la mezcla, y se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice eluido con hexanos/EtOAc (3:2) para obtener el compuesto 52 (0.543 g, 98%) como un sólido blanco.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 53 A una solución del compuesto 52 (0.54 g, 1.61 mmol) en THF seco (7 mL) bajo argón, se le añadió lentamente LDA [1.93 mmol, preparado a partir de n-BuLi (0.77 mL, solución de 2.5 M en hexano, 1.93 mmol) y diisopropilamina (0.27 mL, 1.93 mmol)] en THF (4 mL) a -78°C. Se agitó la mezcla a -78°C durante una hora, y luego se añadió HMPA (0.42 mL, 2.42 mmol) a la mezcla anterior por medio de una jeringa. Luego de 15 minutos, se añadió bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo (0.989 g, 3.22 moles) en THF (2 mL). Se agitó la mezcla resultante durante 4 horas adicionales a -78°C. La base en exceso fue enfriada rápidamente a 0°C con NH4CI acuoso saturado (20 mL), y la solución resultante se extrajo con EtOAc (4 x 50 mL). Se lavó la capa orgánica combinada con salmuera saturada (2 x 50 mL), se secó sobre MgS04, se filtró, y se evaporó el filtrado hasta secar. Se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice eluido con hexanos/EtO Ac (4:1) para obtener el compuesto 53 (0.604 g, 67%) como una espuma blanca.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 54 Se añadió ácido trifluoroacético (10 mL) a una solución del compuesto 53 (0.557 g, 0.990 mmol) en CH2CI2 (10 mL). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se concentró in vacuo. Se disolvió el residuo el CH2CI2 (100 mL) y se lavó con NaHC03 saturado (3 x 20 mL). Se secó la capa orgánica sobre MgS0 , se filtró y el filtrado se concentró in vacuo. Se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna en gel de sílice usando MeOH al 5% en acetato de etilo como eluyente para obtener el compuesto 54 (0.349 g, 76%) como una espuma blanca.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 55 Se agitó una mezcla del compuesto 54 (0.30 g, 0.65 mmol) y Pd/C 10% (30 mg) en EtOAc/AcOH (1:1, 10 mL), bajo H2 (globo) durante 5 horas. Se filtró la mezcla en celite y se evaporó el filtrado hasta secar. Se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice eluido con EtOAc/MeOH (9:1) para obtener el compuesto 55 como un sólido blanco (0.195 g, 81%). Alternativamente, los compuestos de la invención pueden ser preparados mediante los métodos descritos en el Esquema de Reacción 6. En general, el tratamiento del compuesto 40 con complejo de azida de cinc/bis-piridina, trifenilfosfina y azodicarboxilato de diisopropilo en tolueno da la correspondiente azida 56. El compuesto 56 crudo se hidrogena luego en la presencia de Pd-C al 10% para dar el compuesto 57 en rendimiento de 76% sobre dos pasos. El paso de ciclización de lactama involucra una secuencia de reacción de tres pasos en un solo recipiente, empleando solvólisis de éster de tert-butilo con monohidrato de ácido p-toluenosulfónico, esterificación en metanol y ciclización de lactama bajo adición de trietilamina para proporcionar el compuesto 58 en un rendimiento de 96% sobre los tres pasos. La N-protección del compuesto 58 resultante con dicarbonato de di-tert-butilo y trietilamina en diclorometano proporciona el derivado de N-t-butoxicarbonilamida 59 en rendimiento de 84%. La alquilación del compuesto 59 con LDA y bromuro de 4-(benciloxi)-3- metoxibenciloproduce el compuesto 60 en rendimiento de 74%. El compuesto 60 es una mezcla diaestereomérica con una proporción R/S de 1:1. La eliminación del grupo protector N-BOC en el compuesto 60 con ácido trifluoroacético en diclorometano da el producto objetivo 61 en rendimiento de 74%. La hidrogenólisis del compuesto 61 usando Pd/C 10% como catalizador, proporciona el producto final 62 en rendimiento de 81%.
ESQUEMA DE REACCIÓN 6 61 62 La síntesis de los compuestos 56-62 en este esquema de reacción se describe específicamente más adelante .
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 56 Se añadió azodicarboxilato de diisopropilo (1.62 ml_, 8.24 mmol) a una suspensión del compuesto 40 (1.5 g, 4.12 mmol), ZnN6.2Py (0.95 g, 3.09 mmol) y Ph3P (2.16 g, 8.24 mmol) en tolueno anhidro (20 ml_). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 18 horas. Luego se concentró la mezcla, y se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice eluido con EtOAc al 15% en hexanos para obtener el compuesto 56 (1.59 g) como un aceite incoloro.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 57 Se agitó una mezcla de compuesto 56 crudo (1.59 g) y Pd/c 10% (80 mg) en EtOAc (20 mL) bajo H2 (globo) durante 20 horas. Se filtró la mezcla en celite y se evaporó el filtrado hasta secar. Se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice eluido con EtOAc/MeOH/Et3N (85:14:1) para obtener el compuesto 57 (1.14 g, 76% sobre dos pasos) como un aceite incoloro.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 58 Se disolvió el compuesto 57 en tolueno (18 ml_) y MeOH (2 ml_), y se trató con pTsOH H20 (0.472 g, 2.48 mmol) Se calentó la mezcla por reflujo durante 1.5 horas usando un aparato Dean-Stark. Luego se quitó el aparato Dean-Stark y se añadió Et3N (0.35 mL, 2.48 mmol) a la solución, la cual se calentó a reflujo durante 4 horas adicionales. Se evaporó el solvente, y se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice eluido con AcOH al 2% en EtOAc para proporcionar el compuesto 58 (0.228 g, 96%) como un sólido blanco.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 59 Se añadió dicarbonato de di-tert-butilo (0.935 g, 4.28 mmol) a una solución del compuesto 58 (0.62 g, 2.14 mmol), Et3N (0.60 mL, 4.28 mmol) y DMAP (0.060 g) en CH2CI2 (20 mL). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 5 horas. Se concentró la mezcla, y se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice eluido con hexanos/EtOAc (3:1) para obtener el compuesto 59 (0.696 g, 84%) como un sólido blanco.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 60 A una solución del compuesto 59 (0.60 g, 1.54 mmol) en THF seco (5 mL) bajo argón, se le añadió lentamente LDA [1.85 mmol, preparado a partir de nBuLi (0.74 mL, solución de 2.5 M en hexano, 1.85 mmol) y düsopropilamina (0.26 mL, 1.85 mmol) en THF (2 mL) a -78°C. Se agitó la mezcla a -78°C durante una hora, y luego se le añadió HMPA (0.40 mL, 2.30 mmol) a la mezcla anterior por medio de jeringa. Después de 15 minutos, se añadió bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo (0.71 g, 2.30 mmol) en THF (2 mL). Se agitó la mezcla resultante durante 4 horas adicionales a -78°C. La base en exceso se enfrió rápidamente a 0°C con NH CI acuoso saturado (20 mL), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 60 mL). Se lavó la capa orgánica combinada con salmuera saturada (2 x 50 mL), se secó sobre MgS04, se filtró, y se evaporó el filtrado hasta secar. Se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice eluido con hexanos/EtOAc (7:3) para dar el compuesto 60 (0.693 g, 74%) como una espuma blanca.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 61 Se añadió ácido trifluoroacético a una solución del compuesto 60 (0.63 g, 1.02 mmol) en CH2CI2 (3 mL). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 4 horas, se diluyó con tolueno (20 mL) y luego se concentró in vacuo. Se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice usando MeOH al 5% en acetato de etilo como eluyente, para obtener el compuesto 61 (0.39 g, 74%) como un sólido blanco.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 62 Se agitó una mezcla del compuesto 61 (0.28 g, 0.54 mmol) y Pd/C 10% (27 mg) en EtOAc/AcOH (1:1, 6 mL) bajo H2 (globo) durante 5 horas. Se filtró la mezcla sobre celite y se evaporó el filtrado hasta secar. Se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice eluído con EtOAc/MeOH (97:3) para obtener el compuesto 62 (0.20 g, 84%) como una espuma blanca. Alternativamente, los compuestos de la invención pueden ser preparados mediante métodos similares a los descritos más adelante en los Esquemas de Reacción 7 y 8. Por ejemplo, en el Esquema de Reacción 8, la protección del alcohol primario en el compuesto 40 se puede lograr usando bromuro de bencilo (BnBr) y carbonato de cesio en DMF para obtener el derivado de benciloxi 188. Luego, el compuesto 188 puede convertirse en su correspondiente ácido 189 haciendo reaccionar el compuesto 188 con ácido trifluoroacético.
ESQUEMA DE REACCIÓN 7 El compuesto 189 se puede usar luego para preparar compuestos de la invención tal como se expone más adelante en el Esquema de Reacción 8.
ESQUEMA DE REACCION 8 227 La síntesis de los compuestos 223-227 en este esquema de reacción se describe específicamente más adelante.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 223 A. Se prepararon independientemente las siguientes soluciones (Solución 1 y Solución 2). Solución 1: Se añadió trietilamina seguida por cloruro de trimetil-acetilo a una solución del compuesto 189 en THF a 0°C, y se agitó la mezcla durante una hora. Solución 2: se añadió N-butil-litio a una solución de (R)-(-)-4-bencil-2-oxazolidinona en HF seco a -78°C, y se agitó la mezcla durante una hora. B. Se añadió la solución 2 a la solución 1 por medio de una cánula. Se dejó calentar la mezcla resultante a 0° hasta temperatura ambiente. Después de agitar a temperatura ambiente durante 24 horas, se diluyó la mezcla con una solución de NaHC03 saturada, y se extrajo con CH2CI2. Se combinaron las capas orgánicas, se lavaron con H20, se secaron sobre MgS04, se filtraron, y se concentró el filtrado in vacuo. Se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice para obtener el derivado de (R)-(-)-4-bencil-2-oxazolidinona. C. Se añadió n-butil-litio lentamente a una solución de diisopropilamina en THF seco a -78°C. Se agitó la mezcla de reacción a -78°C bajo argón durante 1 hora. Se añadió el derivado de (R)-(-)-4-bencil-2-oxazolidinona en THF a -78°C y se agitó la mezcla de reacción durante una hora. Luego se añadió una solución de bromuro de 3-metilbencilo en THF en una porción, a la mezcla de reacción. Se calentó la mezcla resultante hasta 0°C con NH4CI acuoso saturado, y la solución resultante se extrajo con CH2CI2. Se combinaron las capas orgánicas, se lavaron sucesivamente con NaHC03 saturado y H20, se secaron sobre gS04, se filtraron, y se concentró el filtrado in vacuo. Se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice para obtener el compuesto 223.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 224 Se agitó el compuesto 223 y Pd/C 10% en EtOAc bajo H2 (globo) durante 24 horas. Se filtró la mezcla a través de celite y se concentró el filtrado in vacuo. Se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice para obtener el compuesto 224.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 225 Se añadió azodicarboxilato de diisopropilo a una suspensión del compuesto 224 en mezcla con ZnN6.2Py y Ph3P en tolueno anhidro. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 18 horas. Se concentró la mezcla in vacuo, y se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice para obtener el compuesto 225.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 226 Se añadió LiOH H20 (30% en H20) a una solución del compuesto 225 en THF/H20 (3:1) a 0°C. Se agitó la mezcla de reacción a 0°C durante 3 horas. Luego se le añadió una solución de Na2S03 en agua seguida por una solución de NaHC03 0.5 N. Se agitó la mezcla durante 2 horas, y luego se evaporó el THF in vacuo. Esta solución acuosa se diluyó con HCI 2N hasta obtener un pH = 2, y luego se extrajo con EtOAc. Los capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgS04, se filtraron y el filtrado se evaporó hasta secar. Se purificó el aceite resultante usando cromatografía de columna en gel de sílice para obtener el compuesto 226.
SÍNTESIS DEL COMPUESTO 227 Se agitó el compuesto 226 y Pd/C 10% en EtOAc bajo H2 (globo) durante 20 horas. Se filtró la mezcla a través de celite y se evaporó el filtrado hasta secar. Se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice para obtener el compuesto ácido deseado. El compuesto ácido se disolvió en tolueno y MeOH y se trató con pTsOH H20. Se calentó la mezcla a reflujo durante 1.5 horas usando un aparato Dean-Stark. Luego se retiró el aparato Dean-Stark y se añadió Et3N a la solución, la cual se calentó a reflujo durante 4 horas adicionales. Se evaporó el solvente y se purificó el residuo mediante cromatografía de columna en gel de sílice para obtener el compuesto 227 deseado. Como se describió en secciones previas, los compuestos de la invención, o sus sales farmacéuticamente aceptables, pueden contener uno o más centros asimétricos, y por eso pueden dar lugar a enantiómeros, diaestereómeros, y otras formas estereoisoméricas que pueden ser definidas, en términos de estereoquímica absoluta, como (R)- o (S)- o, como (D)- o (L)- para aminoácidos. La presente invención implica incluir todos estos isómeros posibles, así como también sus formas racémica, enriquecida ópticamente y pura ópticamente. Los isómeros ópticamente activos ( + ) y (-), (R)- y (S)-, ° (D)- y (L)- pueden prepararse usando sintones quirales o reactivos quirales, o resueltos usando técnicas convencionales, tales como HPLC de fase reversa empleando una fase quiral estacionaria. Cuando los compuestos descritos en la presente solicitud contienen enlaces dobles olefínicos, u otros centros de asimetría geométrica, y a menos que se especifique de otra forma, se entiende que los compuestos incluyen isómeros geométricos E y Z. De esta forma, también se entiende que están incluidas todas las formas tautoméricas . Las siguientes tablas se proporcionan para definir las estructuras de los compuestos de la invención enumeradas en los ejemplos utilitarios. Todos los compuestos en estas tablas fueron preparados usando la metodología descrita en la presente o la metodología descrita para compuestos similares tal como se proporciona aquí. Las abreviaturas usadas en las tablas son las siguientes: Ac es acetilo, Bn es bencilo, Me es metilo, Et es et Bu es butilo, Hex es hexilo, Ph es fenilo, Pent es pentilo, Pr propilo, Hept es heptilo, 4-CIPh es 4-clorofenilo, BOC benciloxicarbonilo, cPent es ciclopentilo, /'Bu es isobutilo, e /Pr isopropilo.
Adicionalmente a los compuestos precedentes, se preparó el siguiente compuesto 261 con los materiales de inicio apropiados usando la metodología aquí descrita: EJEMPLOS UTILITARIOS Las pruebas biológicas in vitro e in vivo demostraron que los compuestos de la invención muestran un arreglo de potentes actividades biológicas contra objetivos relevantes para la artritis reumatoide, otras enfermedades inflamatorias y enfermedades no inflamatorias relacionadas como las descritas anteriormente. Como se usa en la presente solicitud, "inflamación tratada" se refiere tanto a la terapia para la inflamación, y a la prevención del desarrollo de la respuesta inflamatoria. Una cantidad efectiva de un compuesto o composición de la presente invención, se usa para tratar la inflamación en un animal de sangre caliente, tal como un ser humano. Los métodos para administrar cantidades efectivas de agentes anti-inflamatorios son bien conocidos en la técnica, e incluyen las formas de administración por inhalación, oral o parenteral. Estas formas de dosis incluyen, pero no están limitadas a, soluciones parenterales, tabletas, cápsulas, implantes de liberación prolongada y sistemas de suministro transdérmico; o sistemas de dosis por inhalación empleando inhaladores de polvo de llenado manual o dispositivos de inhalación presurizados de dosis múltiples. Generalmente, se prefiere la administración oral o tópica para el tratamiento de la inflamación. La cantidad y frecuencia de la dosis se seleccionan para crear un nivel efectivo del agente farmacéutico sin efectos dañinos. Generalmente abarca desde una dosis de aproximadamente 0.01 hasta 10 mg/kg/día en donde se administra por vía oral o intravenosa. También, la escala de dosis será típicamente desde aproximadamente 0.01 hasta 1 mg/kg/día en donde se administre por vía intranasal o mediante inhalación. La administración de los compuestos o composiciones de la presente invención, puede llevarse a cabo en combinación con la administración de otros agentes. Por ejemplo, puede desearse coadministrar un glucocorticoide por su efecto sobre la artritis.
GENERACIÓN DE ESPECIES REACTIVAS AL OXÍGENO MEDIANTE NEUTRÓFILOS ACTIVADOS Los neutrófilos contienen más de 90% del infiltrado leucocítico en el fluido sinovial de los pacientes con artritis reumatoide (RA) y se cree que contribuyen tanto a la fase aguda como a la fase crónica de esta y de muchas otras enfermedades inflamatorias mediante ia liberación de mediadores pro-inflamatorios, enzimas degradadoras de matriz y radicales de oxígeno tóxicos que dan como resultado daños en los tejidos. Un mecanismo patogénico propuesto es que las células son incapaces para realizar fagocitosis sobre sustancias pro-inflamatorias grandes, tales como complejos inmunes insolubles o endotelio dañado presente en la articulación. Consecuentemente, los gránulos neutrofílicos se fusionan con la membrana plasmática en el sitio de activación, con preferencia a hacerlo internamente con las vacuolas del fagocito, permitiendo la liberación extracelular de especies pro-inflamatorias reactivas al oxígeno (ROS, según siglas en inglés de Reactive Oxygen Species) y otras sustancias tóxicas. La activación neutrófila puede ser medida mediante cuantificación de ROS generadas in vitro. La medida de las ROS permite la cuantificación efectiva de una especie pro-inflamatoria y también es una medida general de la activación neutrófila. El método más sensible para medir la producción de ROS por medio de neutrófilos es la quimioluminescencia ampliada por luminol. El sistema de prueba usado para evaluar la habilidad de los compuestos para inhibir la generación de ROS en los neutrófilos es indicativo de la actividad anti-inflamatoria que puede ser eficaz en los estados de enfermedad, incluyendo artritis reumatoide y enfermedad intestinal inflamatoria, pero no limitándose a ellas.
Se incubaron neutrófilos humanos primarios recientemente aislados (5 x 106 células/mL) con las concentraciones requeridas del compuesto o vehículo durante 30 minutos a 37°C en regulador HBSS (pH 7.4) que contenía Ca2 + . Se usó Wortmanina (100 nM) como control positivo. Se transfirieron alícuotas de cada muestra a una placa de microtitulacion a la cual se le añadió luminol (1 µ?); obtenido de Sigma, número de catálogo A8511. La activación de los neutrófilos se inició inmediatamente mediante la adición de fMLP (1 µ?); obtenido de Sigma, número de catálogo F3506. Se grabó la luz emitida desde cada receptáculo durante 30 minutos en un luminómetro de microplaca. Se determinó la salida de luz total (integral del tiempo-curso) para cada receptáculo. Las actividades inhibidoras de los fármacos probados contra la generación de ROS neutrófila se expresan como un porcentaje de actividad con relación a un control sin fármaco (100% de activación o generación de ROS) con contenido de DIVISO al 25%. La concentración requerida del compuesto de prueba para inhibir la generación de ROS al 50% de los valores de control (lc50) se determinó a partir de las curvas de respuesta de concentración mediante análisis de regresión no lineal. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
TABLA 1 INHIBICIÓN DE DESGRANULACIÓN DE NEUTRÓFILOS POR LOS COMPUESTOS DE PRUEBA MEDIDA MEDIANTE LA PRODUCCIÓN DE ROS Número de Escala lc5o (µ ) compuesto <1 1-10 10-100 >100 54 X 61 62 X 55 Como se muestra en la Tabla 1, los compuestos representativos de la presente invención demostraron lc50 en la escala de 1-100 µ . Este resultado demuestra que estos compuestos bloquean potentemente la generación de especies pro-inflamatorias reactivas al oxígeno mediante los neutrófilos in vitro. Este resultado puede aparecer a partir de la inhibición de fosfodiesterasa y/o de depuración química. Esta propiedad es predictiva de actividad anti-inflamatoria in vivo debido al papel establecido del daño de tejidos mediado por ROS, por ejemplo, en la artritis reumatoide, desórdenes intestinales inflamatorios, y psoriasis.
DESGRANULACIÓN DE NEUTRÓFILOS (LIBERACIÓN DE MIELO PEROXID ASA) Los granulocitos neutrof ílicos contienen varios tipos de organelos conocidos como gránulos. Estos cuerpos sub-celulares contienen un arreglo diverso de agentes bactericidas, incluyendo proteasas y otras enzimas hidrolíticas que son esenciales para la respuesta inflamatoria normal pero que contribuyen al daño agudo del tejido cuando los neutrófilos están activados crónicamente, y/o activados inapropiadamente en la enfermedad. Una de las enzimas de gránulo características es la mieloperoxidasa (MPO), la cual cataliza la conversión de peróxido de hidrógeno en hipohaluro. La MPO se libera en el medio extracelular en simulación de desgranulación y es un índice confiable de activación neutrófila. El siguiente sistema de prueba se puede usar para evaluar la habilidad de un compuesto de la invención para inhibir la liberación de MPO desde los neutrófilos, lo que es indicativo de actividad a n t i -reumatoide así como también otras enfermedades en donde está implicada la activación de neutrófilos inapropiada. Se recolectan dos tubos de sangre humana (12 mL) en tubos anticoagulantes ACD (Fischer; número de catálogo 02-684-29). Se mezcla la sangre con 4 mL de dextran al 6% en salina. Se recolecta la mezcla de sangre en una jeringa de 60 ce. La jeringa se mantiene vertical en un tope de banco durante 30 minutos. La capa superior de suero se extiende sobre 4 mL de Histopaque (Sigma, número de catálogo 1077-1) en un tubo centrífugo de 15 mL. Se centrifuga el tubo durante 30 minutos a 2000 rpm. Se descarta el supernadante. Se mezcla el aglomerado en cada tubo con 3 mL de H20 fría destilada, seguida por 1 mL de NaCI 6N después de 30 segundos. Se centrifuga el tubo durante 5 minutos a 1100 rpm. Se combina el aglomerado en cada tubo y se lava dos veces con 10 mL de Balance de Solución Salina de Hank (HBSS, según siglas en inglés de Hank's Balance of Salt Solution) (Stem Cell Ltd.; número de catálogo LMC 75). Las células se cuentan y se diluyen hasta 2x106 células/mL. Se pipetean las células (0.3 mL) en tubos microcentrífugos marcados previamente. Se incuban las células con 5 µg/mL de citochalasina B, 10 nM de PGE2 y la concentración deseada del compuesto o vehículo de prueba (DMSO al 0.5%) durante 5 minutos a 37°C. Se usa Wortmanina o Rolipram como control positivo. Se añade 100 nM de fMLP en cada tubo, excepto en el control. Luego de 30 minutos de incubación, se colocan las células en hielo y se centrifugan a 13,000 rpm durante 3 minutos. Se pipetea 50 µ? de supernadante en los receptáculos apropiados de una placa de 96 receptáculos (triplicada). Se añade 100µ? de sustrato en cada receptáculo (0.53 mM de o-dianisidina; Sigma, número de catálogo D 3252, 0.47 mM de H202 en regulador fosfatado (pH 6.0). Se incuba la placa durante 30 minutos a 37°C. Se termina la reacción mediante la adición de 50 µ? de H2S04 4N en cada receptáculo. Para preparar una curva estándar, se pipetea 200 µL de 1, 0.1, 0.01 y 0.001 mg/mL de peroxidasa de rábano picante en los receptáculos (triplicado). Se lee la placa mediante un lector ELISA a 405 nm.
QUIMIOTAXIA DE NEUTRÓFILOS El proceso de la quimiotaxia (migración dirigida de leucocitos hasta un gradiente quimioquina) es esencial para la acumulación de altos números de neutrófilos asociados con manifestaciones patológicas de inflamación (por ejemplo, deterioro en la articulación reumatoide). La quimiotaxia es un mecanismo primario en donde los neutrófilos migran desde el lumen de los vasos sanguíneos hasta el sitio de la inflamación y en consecuencia es un proceso común asociado con el daño de tejidos mediado por neutrófilos en muchas enfermedades inflamatorias. La inhibición específica de la migración de neutrófilos hacia la articulación inflamada es un objetivo terapéutico válido en la artritis reumatoide y en muchas enfermedades inflamatorias. El siguiente sistema de prueba in vitro puede usarse para evaluar la habilidad de los compuestos de la invención para inhibir la quimiotaxia, lo que es indicativo de la actividad anti-reumatoide in vivo y de la actividad contra enfermedades inflamatorias en donde están implicados los neutrófilos en el daño a tejidos asociado. Se añade regulador de quimiotaxia que contiene el quimioatrayente fMLP (10µ?) a cada receptáculo de una placa de quimiotaxia y se inserta un filtro asegurando el contacto entre el filtro y el regulador de quimiotaxia en el receptáculo. Se usa una concentración de quimioatrayente por debajo del máximo . Para la determinación de migración celular espontánea, ciertos receptáculos no reciben quimioatrayente, sino que en su lugar reciben regulador solamente. Se incuban los neutrófilos (1 x 106) recientemente aislados con vehículo (DMSO al 0.125%) ± compuesto de prueba durante 1 hora a 37°C. Luego se resuspenden suavemente las suspensiones de células en tratamiento y control, y se añade 20 µ?_ de células al lado superior del filtro en cada receptáculo. Se incuba la placa durante 1.5 horas a 37°C bajo Co2 al 5%. Luego se sacan las células del lado superior del filtro mediante aspiración, y se centrifuga la placa completa. Se saca el filtro y se añaden concentraciones conocidas de células a los receptáculos sin usar para preparar una curva estándar. Se añade solución de ATT (Sigma, número de catálogo X 4251) y P S (Sigma, número de catálogo P 7626) preparada en regulador a cada receptáculo, y se incuban las células por 1-2 horas adicionales y se mide su absorbencia a 450 nm. Los valores de absorbencia se convierten en números de células usando la curva estándar. Los valores de IC50 son promedios de al menos tres experimentos separados con determinaciones triplicadas.
INHIBICIÓN DE PRODUCCIÓN DE TNF-cc EN LINFOCITOS-T CD4+ HUMANOS PRIMARIOS ESTIMULADOS CON CONCANAVALIN A-A Se sabe que los linfocitos T activados producen TNF-a y pueden constituir una fuente significativa de este mediador inflamatorio importante en regiones localizadas de inflamación tales como lesiones sinoviales reumatoides o psoriásicas. Se analizó el TNF-a de los supernadantes de CD4+ células T humanas primarias estimuladas con conA que han sido incubadas en la presencia o ausencia de un compuesto de prueba, usando un sistema ELISA (Pharingen; equipo de anticuerpo anti-TNF recomendado 18631-D y 18642-D). Se indujeron cantidades sustanciales de TNF-a en células T tratadas con el vehículo estimuladas con conA. Como se muestra en la Tabla 2, los compuestos representativos de la presente invención fueron capaces de inhibir potencialmente la producción de TNF-a derivada de células T. Este resultado contrasta con la baja potencia de estos compuestos en la inhibición de liberación de TNF-a inducida por LPS en la sangre humana completa. Esto puede ser debido a la sensibilidad diferente de los monocitos / macrófagos contra los linfocitos T a las elevaciones en la AMPc intracelular con respecto a vías reguladoras que impactan la producción de TNF-a, Este resultado sugiere que los compuestos de la invención se pueden usar en el tratamiento de enfermedades que involucran la producción de TNF-a.
TABLA 2 EFECTO DE LOS COMPUESTOS DE PRUEBA EN LA PRODUCCIÓN DE TNF-a EN CD4+ CÉLULA T HUMANAS ESTIMULADAS POR ConA ESCALA DE TNF-a ic50 (µ?) 2.0-20 >20 INHIBICION DE LA FUNCION AYUDANTE DEL LINFOCITO-T HUMANO INTRODUCCIÓN Y FUNDAMENTO Muchas enfermedades inflamatorias con una etiología auto inmune incluyendo artritis reumatoide y psoriasis, se caracterizan por un desbalance en la función de la célula ayudante T de los subconjuntos de linfocito T autoreactivo, dando como resultado la iniciación y mantenimiento de un estado pro- inflamatorio. Este desbalance con frecuencia se manifiesta como una expresión excesiva de un fenotipo Th1 y/o por la supresión de un fenotipo Th2. Las células T que secretan IL-2 e INF-? se designan como células Th1 o células tipo 1. Estas células están involucradas a través de la inmunidad directa mediada por célula por la activación de macrófagos vías celulares citotóxicas. Las células que producen IL-4, IL-5 e IL-10 se denominan células Th2 o células tipo 2 y regulan la respuesta inmune humoral. Los compuestos representativos de la presente invención inhibieron la función Th1 más potentemente que la función Th2 in vitro en las CD4+ célula T humanas primarias estimuladas por concanavalina A. Así, estos compuestos pueden tener valor terapéutico al ser capaces de suprimir selectivamente las células Th1 sin afectar las células Th2 en cualquier extensión significativa, resultando así en la corrección de un desbalance en la enfermedad inflamatoria auto inmune caracterizada por elevadas respuestas Th1. La prueba sobre las células T humanas primarias involucra su activación mediante concanavalina A (conA) (Sigma, número de catálogo C 5275), seguida por detección ELISA para citoquinas para cualquier perfil. En el caso de los perfiles de Th1, se usa IL-2 e INF-? como marcas comparativas mientras que IL-10 es el indicador para un perfil Th-2. Biológicamente, estos indicadores son útiles en que IL-2 es el mitógeno de célula R principal, mientras que IL-10 representa un agente inmunosupresor poderoso y selectivo.
MÉTODOS Se recolectó aproximadamente 60 ce de sangre humana completa en tubos vacutainer anticoagulantes ACD. Se distribuyó por alícuota Ficoll Paque 1077 en 6 tubos cónicos estériles de 50 mL. Una alícuota de sangre (10 mL) se colocó lentamente sobre la parte superior del Ficol Paque sosteniendo el tubo verticalmente y haciendo descansar la punta de la pipeta en el borde interior del tubo y dejando que la sangre corriera hacia abajo por el lado del tubo. Se hicieron girar los tubos a 1700 rpm durante 3 minutos a temperatura ambiente. La capa de plasma sobre la banda de leucocitos se aspiró y se usó una pipeta pasteur para retirar la banda de leucocitos y transferirla a un tubo cónico estéril de 50 mL. Las células de cada tubo gradiente de leucocitos fueron transferidas a un tubo cónico separado de 50 mL. Se añadió PBS estéril de pH 7.4 a cada tubo cónico de 50 mL que contenía células de la banda de leucocitos hasta un volumen de 50 mL: Se hicieron girar los tubos a 1100 rpm durante 10 minutos. Se aspiró el supernadante y se resuspendieron las células en 50 mL de PBS de pH 7.4. Se volvieron a centrifugar los tubos a 1100 rpm durante 10 minutos. Se aspiró el supernadante y se resuspendieron las células en medio apropiado en una densidad de 5 x 107 células/mL o 2 x 106 células/mL. Preparación de linfocito crudo: Se resuspendieron células de la preparación de leucocitos en medio BASAL (AcitCyte®) o ROMI 1640 con PBS ai 10% + 2 mM de glutamina a una densidad de 1 x 106 células/mL. Preparación de CD4+ célula T: Se resuspendieron células de la preparación de leucocitos en PBS estéril de pH 7.4 suplementada con Suero Fetal Bovino (FBS) de 2-6% en una densidad de 5 x 107 células/mL. Luego las células estuvieron listas para ser aisladas.
AISLAMIENTO DE CD4+ CELULA T (StemSep®): I) MARCADO IN UNOMAG ÉTICO Se añadió coctel de anticuerpos (100 µ?, Stem Cell Technologies, número de catálogo 14062) por cada mL de células y se mezcló bien. Después de 30 minutos de incubación en hielo, se añadió 60 µL· de coloide magnético por cada mL de células, y se mezcló bien. Después de una incubación final de 30 minutos en hielo, las células estuvieron listas para separación celular magnética.
II) PROCEDIMIENTO DE SEPARACIÓN (ALIMENTACIÓN POR GRAVEDAD!.
Se cargó una muestra en la parte superior de una columna. Se giró el grifo de cierre para permitir el flujo del medio hacia abajo a través de la columna, y se recolectó el medio en un tubo de recolección. Se añadió a la columna PBS suplementado con FBS de 2-6% hasta que se recolectaron tres volúmenes de columna (sin incluir el volumen de la muestra inicial). Se lavaron las células, se contaron y se resuspendieron en RPMI 1640 con FBS al 10% + 2 mM de L-glutamina en una densidad de 1 x 106 células/mL.
PROCEDIMIENTO DE PRUEBA PARA IL-2, IFN-?, TNF-a E IL-10 Se aislaron CD4+ células T como se describió anteriormente. Se suspendieron las células en medio RPMI 1640 (Stem Cell Technologies Inc.; número de catálogo 36750) con FBS al 10% + 2mM de L-glutamina a una densidad de 1 x 106 células/mL. Se mantuvieron las células en hielo mientras se preparaban los compuestos de prueba. Los compuestos de prueba se prepararon en una placa de ensayo de 96 receptáculos estéril a la concentración de prueba final deseada de 50X; todos los receptáculos contenían una cantidad igual de vehículo sulfóxido de dimetilo. Se añadieron CD4 + célula T (500 µ?_) a cada receptáculo de una placa de ensayo de 24 receptáculos. Se añadió a los receptáculos apropiados, una alícuota simple (10 µ?_) de cada solución trabajando como compuesto de prueba. Se dejaron dos receptáculos como controles estimulado y no estimulado. Se añadió concanavalina A (10 µ?) (concentración final de 50X) a 10 µg/mL a cada receptáculo con la excepción de los receptáculos de control no estimulados. Se incubaron las células a 37°C durante 48 horas. Luego se evaluó la cantidad de IL-2, IFN-?, TNF-a e IL-10 presente en los medios acondicionados, mediante ELISA.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las Tablas 3A, 3B y 3C representan una sinopsis de los datos a través de individuos con respecto a la potencia de los compuestos de la invención en su habilidad para inhibir las citoquinas que probablemente promueven o deprimen una respuesta Th1 o Th2. En las Tablas 3A, 3B y 3C, se ve el efecto de compuestos representativos de la presente invención sobre la producción de IL-2, IFN-?, e IL-10 en las CD4+ célula T humanas periféricas estimuladas con 10 µglmL de Concanavalina A durante 48 horas. Ic50 son los promedios de al menos tres experimentos separados realizados por triplicado. El aislamiento de las CD4 + célula T, las condiciones de incubación y la detección por ELISA de las linfoquinas se discuten en la sección de Métodos anterior. Algunos miembros de esta serie de compuestos (en particular aquellos que inhiben tanto PDE4 como PDE3) manifiestan un perfil de citoquina de las células T activadas que puede reparar el desbalance de células Th1 sobre células Th2 visto en la artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias tales como psoriasis. La tabla 3A muestra ejemplos de un miembro de esta serie que ha demostrado una inhibición selectiva de un perfil Th1 en las células CD4+ seleccionadas estimuladas con conA, en particular. Mientras que la potencia absoluta de los compuestos varía dependiendo del análogo usado, el efecto es claramente diferente del que muestra el Rolipram (Sigma, número de catálogo 6520). Se vio que Rolipram inhibe la síntesis tanto de IL-2 como de IL-10 en 48 horas. En contraste, la estimulación de IL no es inhibida por varios compuestos de la invención, en donde los mismos supernadantes muestran niveles reducidos de IL-2. La depresión de un perfil de citoquina Th1 necesita el aumento de las células Th2 en el sitio de la inflamación. El beneficio añadido de inhibir la producción de IL-2 puede, bajo las circunstancias correctas, producir células T reactivas anérgicas (es decir, células T que no pueden responder a su estímulo mitogénico usual por medio de TCR en el contexto de MHC II). Alternativamente, también podría causar apoptosis de las células T auto-reactivas. En consecuencia, esta propiedad inhibidora de Th1, sostenedora de Th2, de los compuestos de la invención, podría proporcionar el potencial para efectuar la mejora terapéutica en las enfermedades mediadas por Th-1 tales como artritis reumatoide, psoriasis y enfermedad inflamatoria intestinal, entre otras enfermedades.
TABLA 3A EFECTOS DE LOS COMPUESTOS DE PRUEBA EN LOS PERFILES DE Th1 EN CD4+ CÉLULAS T HUMANAS PRIMARIAS ESTIMULADAS CON CONCANAVALINA A ESCALA DE IL-2 IC50 (µ ) COMPUESTO 0.02-0.2 0.2-2.0 2.0-20 >20 54 X 55 X 62 X ROLIPRAM X ZARDA VERINA TABLA 3B EFECTOS DE LOS COMPUESTOS DE PRUEBA EN LOS PERFILES DE Th1 EN CD4+ CÉLULAS T HUMANAS PRIMARIAS ESTIMULADAS CON CONCANAVALIN A A ESCALA DE INF-GAMMA IC50 (µ?) COMPUESTO 0.02-0.2 0.2-2.0 2.0-20 >20 54 X 55 X 62 X ROLIPRAM X I ZARDAVERINA X TABLA 3C EFECTOS DE LOS COMPUESTOS DE PRUEBA EN LOS PERFILES DE Th2 EN CD4+ CÉLULAS T HUMANAS PRIMARIAS ESTIMULADAS CON CONCANAVALIN A A DE IL-10 IC50 (µ?) .0 2.0-20 >20 DEPURACIÓN DE RADICAL OXÍGENO Se cree que los oxidantes y radicales libres producidos por los neutrófilos y otras células contribuyen a la patogénesis de la artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias. Consistentes con este involucramiento, los compuestos capaces de inactivar radicales libres (antioxidantes) tienen actividades antiinflamatorias en la artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias. Los compuestos representativos de la presente invención inhibieron la formación de radicales libres en una prueba estándar in vitro usada para medir la actividad antioxidante de materiales biológicos. La base de la prueba (un equipo de prueba de RANDOX: Estado Anti-Oxidante Total) es la habilidad de los antioxidantes de una muestra para suprimir la formación de color debido al catión radical estable, ABTS*+. El cromogen ABTS (sulfonato de 2,2'-azino-di-[3-etilbenztiazolina] (Sigma, número de catálogo A 1888)) (610 µ ) se incuba con solución de sustrato (peroxidasa(metimoglobina) (6.1 µ?) y H202 (250 µ ) junto con un compuesto de la invención disuelto en DMSO durante exactamente 3 minutos a 37°C. La producción del catión radical ABTS*+ que tiene un color azul verdoso relativamente estable fue medida a 600 nM. La actividad antioxidante de 100 µ? del compuesto de prueba se determinó como se describió anteriormente. El control positivo usado fue un potente antioxidante biológico, Trolox® (ácido 6-hidroxi-2.5.7.8- tetrametilcroman-2-carboxílico). La inhibición de formación de color (actividad antioxidante) por los compuestos de prueba, se expresa con relación al control positivo, Trolox® (100% de inhibición). Los resultados se muestran en la Tabla 4. La supresión de color en esta prueba puede ser debido a la inhibición de la producción del radical ABTS*+ o a su enfriamiento rápido.
TABLA 4 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS NÚMERO DE ESCALA DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE COMPUESTO (% DEL CONTROL) 1-25 25-50 50-75 75-100 54 X 55 X Las características antioxidantes de estos compuestos podrían contribuir a las actividades anti-inflamatorias in vivo y ser de eficacia terapéutica en las enfermedades inflamatorias que involucran radicales de oxígeno. Así, la actividad antioxidantes de los compuestos de la invención podría constituir un mecanismo adicional de acción anti-inf lamatoria adicional a la inhibición de fosfodiesterasa AMPc.
INFLAMACIÓN AGUDA - EDEMA DE LA OREJA DE RATÓN INDUCIDA POR RESI NFERITOXI A Una de las características primarias de la inflamación es un aumento en la dilatación vascular y en la permeabilidad, que conduce a la extravasación de fluidos y su recolección en el intersitio, dando como resultado enrojecimiento e hinchazón. La artritis reumatoide en particular está caracterizada por edema pronunciado de las articulaciones afectadas, dando como resultado dolor y rigidez significativas. El modelo de inflamación en la oreja de ratón, es una prueba estándar in vivo para la inflamación que está basada en un aumento en el peso de la oreja, el cual se puede atribuir al edema inducido por los mediadores inflamatorios. La RTX (resiniferitoxina; Sigma; número de catálogo R 8756) es un diterpeno aislado de la planta Euphorbia poisonti, y es un análogo ultrapotente de la capsaicina. La RTX actúa estimulando selectivamente los terminales nerviosos nociceptivos sensibles a la temperatura en el tejido, que aparece por el edema neurogénico. Un compuesto representativo de la invención, cuando se administra oralmente, inhibe el desarrollo del edema inducido por aplicación tópica de RTX. El edema como se induce en este modelo es inhibido mediante los inhibidores de PDE4 y por eso es útil en sistemas ¡n vivo para diferenciación de la eficacia de los compuestos de prueba que poseen potencias in vitro comparables. Los ratones (CDI, Charles River Laboratories) fueron separados en grupos (n = 5-8) y marcados. Para administración oral (p.o.), se le suministró 10 mg/kg del compuesto de prueba en 100 µ?_ de PEG-200 a los animales, luego se indujo el edema usando 0.1 g/oreja de RTX después de un periodo de espera de 1.5 horas. Después de la inducción del edema, se sacrificaron los ratones, y se les quitó un disco de tejido de oreja estándar. Cada disco de tejido se pesó inmediatamente hasta la décima más cercana de un mg. Se analizaron los datos tomando la diferencia de cada oreja izquierda con respecto a la oreja derecha, calculando la media +/- SEM. Se probó la significancia estadística por medio de una prueba T de 2 muestras sobre las diferencias de peso de la oreja izquierda y derecha del grupo de control, contra las del grupo experimental.
TABLA 5 INHIBICIÓN DE EDEMA DE OREJA DE RATÓN INDUCIDA POR RESINIFERITOXINA MEDIANTE ADMINISTRACIÓN ORAL DEL COMPUESTO DE PRUEBA Número de compuesto % de inhibición de edema 62 30 INHIBICIÓN DE FOSFO DI ESTE RASAS NUCLEÓTIDAS CÍCLICAS INHIBICIÓN DE FOSFO DI ESTE RAS A 4 AMPc La elevación del AMPc en las células involucradas en la inflamación, tales como neutrófilos, células endoteliales, macrófagos, eosinófilos, basófilos, linfocitos T, etc., generalmente conduce a la regulación hacia abajo de un perfil inflamatorio de citoquina, así como la inhibición de expresión del factor de necrosis tumoral (TNF-a). La expresión de la citoquina anti-inflamatoria interleucina-10 (IL-10) es regulada positivamente por el AMPc en muchas células en un sitio de inflamación. Dado que la degradación del AMPc en la célula es efectuado por las fosfodiesterasas (PDE) AMPc, los inhibidores específicos de estas enzimas son de interés. Estos compuestos podrían tener el efecto de elevar el AMPc intracelular en las células que expresan las isoenzimas PDE que ellos inhiben específicamente. A pesar de que hay al menos nueve familias diferentes de nucleótidos de PDE cíclicos, la familia PDE4 es de interés particular. Esto es debido a que muchos de los tipos de células críticos que efectúan la respuesta inflamatoria expresan predominantemente PDE4 sobre los otros PDE. Los inhibidores de PDE4 tales como Rolipram han demostrado que elevan específicamente el AMPc en las células inflamatorias tales como neutrófilos y eosinófilos y matan su fenotipo inflamatorio. Un inhibidor de PDE-4 terapéuticamente efectivo deseablemente tiene mínimos efectos colaterales, incluyendo la inducción de secreción ácida gástrica, emesis y efectos en el SNC. Los inhibidores de PDE4 sin efectos colaterales dañinos mantienen gran promesa como una nueva generación de sustancias terapéuticas anti-inflamatorias para enfermedades que incluyen asma, enfermedad intestinal inflamatoria, artritis reumatoide, psoriasis y transplante alogénico, entre otras. Los compuestos de la invención fueron examinados en cuanto a su actividad contra 5 de las clases principales de fosfodiesterasa nucléotida cíclica de mamífero (denominada PDE1 hasta 5). Las PDE1 hasta 4 utilizan AMPc como sustrato, mientras que la PDE5 usa GMPc. La amplia especificidad del inhibidor PDE e-isobutil-metilxantina (IBMX; Sigma; número de catálogo 17018), se usó como un control positivo en todas las pruebas. Las PDE para varias pruebas fueron purificadas parcialmente a partir de las siguientes células y tejidos: PDE1 (corazón bovino), PDE2 (plaquetas humanas), PDE3 (plaquetas humanas), PDE4 ( células promonocíticas humanas U937) y PDE5 (plaquetas humanas). Se prepararon extractos citoplásmicos de U937 por sonicación de células U937 (ATCC: número de catálogo CRL-159) en lisis reguladora (20 mM de Tris Cl, 1 mM de EDTA, 5 mM de ß-mercaptoetanol, 1 µ? de pepstatina, 1 ng/mL de leupeptina, u mM de benzamidina y 0.1 mM de PMSF). Luego se centrifugaron los extractos de células sonicadas a 70,000 g durante 30 minutos y se removieron los supernadantes. Se añadió sacarosa hasta una concentración final de 0.25 M, se dividieron por alícuotas y se almacenaron a -80°C. Las reacciones de PDE se realizaron durante 30 minutos a 37°C en volúmenes de 30 µL· en 1 µ? de AMPc [3H] (Amersham sitio web http://www.apbiotech.com), 0.5 µL· de 5'nucleotidasa (Sigma), 50 mM de Tris Cl, 10 mM de MgCI, pH 7.5. Se añadió extracto de U937 de tal forma que menos de 10% del sustrato fue consumido. Se añadió el compuesto o vehículo de prueba hasta la concentración deseada. Típicamente, los compuestos fueron sometidos a prueba en seis diluciones de 10 veces alcanzando desde 100 µ? hasta 1 nM. Se realizaron las reacciones por duplicado. Se terminaron las reacciones mediante adición de 200 µ?_ de Dowex 1-8resina de intercambio de anión Cl en una proporción de 1resina:2 metano H20. Se mezclaron las muestras mediante inversión y luego se dejaron asentar durante 2-3 horas. Se sacó una alícuota de 65 µL·, se secó sobre una Lumaplate (Packard; número de catálogo 6005165) y se contó en un contador destellante Packard (TopCount®) durante 15 minutos. La Tabla 6 muestra la actividad inhibidora de los compuestos de la invención contra las PDE aisladas de una línea celular promonocítica humana, U937. Utilizando las condiciones de prueba para PDE4 descritas aquí, los inhibidores típicos de PDE4 tales como Rolipram y Ro-20-1724 (Calbiochem: número de catálogo 557502) se obtienen valores IC50 de acuerdo con los encontrados en la literatura (revisado en Schudt y coinvestigadores; 1996). Adicionalmente, el uso de IBMX (Sigma; número de catálogo 17018) el cual inhibe las PDE 1, 3 y 4 no muestra ninguna inhibición adicional (no se muestran los datos) consistente con el hallazgo de que la PDE predominante en las células U937 es PDE4. La inhibición de PDE4 (o más exactamente, las isoformas específicas de PDE4) con la subsiguiente elevación de AMPc intracelular y la activación de la proteina quinada A, es un objetivo terapéutico en las enfermedades inflamatorias o autoinmunes en donde las células causales o los tejidos involucrados expresan predominantemente esta isoforma de PDE. Con respecto a la artritis reumatoide, el inhibidor de PDE4 Rolipram ha demostrado ser activo en modelos animales de la enfermedad, tales como artritis inducida por colágeno en las ratas (Nyman y coinvestigadores, Clin. Exp. Immunol. 108 (3), 415-419, 1997).
TABLA 6 INHIBICIÓN DE FOSFODIESTERASA 4 AMPc DE CÉLULAS HUMANAS U937 Número de Escala IC5o Número de Escala IC50 compuesto (µ?) compuesto (µ?) 0.1-1 1-10 0.1-1 54 X 231 X 61 232 62 X 233 55 X 234 X 227 X 235 X 228 X 236 X 229 X 237 X 230 X 238 X IC5o ) INHIBICIÓN DE A Pc FOSFODI ESTERAS A 3 Se evaluó los compuestos de la invención en cuanto a su actividad inhibidora contra PE3 de plaqueta humana, para determinar si la inhibición de PDE4 y de PDE3 eran separables, y también el farmacóforo requerido para cada una. Los inhibidores de PDE3/4 combinados pueden ser especialmente eficaces como agentes terapéuticos en enfermedades en las que los tipos de células causantes/contribuyentes expresan tanto PDE4 como PDE3; por ejemplo, las células T en enfermedades inflamatorias, tales como artritis, enfermedad de intestino inflamado, psoriasis y trasplantes alógenos. En dichas enfermedades, los inhibidores combinados de PDE3/4 pueden tener ventajas con respecto a un inhibidor de PDE4 selectivo, tal como Rolipram. Se preparó extractos celulares de plaquetas como se describió más atrás para las células U937. Se llevó a cabo el análisis de PDE3 usando extracto celular de plaquetas como se describió más atrás para el análisis de PDE4. Las plaquetas contienen PDE2, 3 y 5. Sin embargo, PDE2 y 5 de preferencia utilizan cGMP, de modo que en un análisis con AMPc como substrato, no son detectados. Además, bajo las condiciones usadas en este análisis, Rolipram no tiene efecto y el inhibidor de PDE3 conocido trequinsin (Calbiochem; No. de catálogo 382425) es un potente inhibidor que confirme que el análisis es específico para PDE 3.
La tabla 7 muestra las CI5o para los compuestos de la invención, para la inhibición de PDE3. Las actividades de PDE3 y PDE4 parecen ser separables y los compuestos exhiben una gran variedd de selectividades para PDE4 frente a PDE3. Algunos compuestos son específicos para PDE4; algunos compuestos son más potentes contra PDE4 que contra PDE3, y algunos compuestos son aproximadamente igual de potentes contra PDE4 que contra PDE3. Consecuentemente, se pueden seleccionar los compuestos de la invención en cuento a su selectividad PDE4/3, para permitir la máxima potencia contra diferentes tipos de células. TABLA 7 INHIBICIÓN DE AMPc FOSFODIESTERASA 3 DE PLAQUETAS HUMANAS Compuesto Escala de CI50 (µ?) número 1-10 10-100 >100 54 X 61 62 X 55 X 227 X 228 X 229 X 231 X 255 X 256 257 X 259 X 260 X ESPECIFICIDAD PARA PDE ISOZIMA Se pueden probar los compuestos de la invención en cuanto a su especificidad para la PDE isozima mediante el siguiente análisis. Se seleccionan los compuestos de prueba (a 100 µ?) por su actividad contra PDE1, 2 y 5, utilizando métodos bioquímicos comunes y corrientes. Se usa la especificidad amplia del inhibidor de PDE 3-isobutil-1 -metilxantina (IBMX) como un control positivo en todos los análisis. Las PDE para los diversos análisis son purificadas parcialmente a partir de las siguientes células/tejidos: PDE1 (corazón bovino), PDE2 (plaquetas humanas) y PDE5 (plaquetas humanas).
DESPLAZAMIENTO DE ROLIPRAM DE SU SITIO DE UNIÓN DE ALTA AFINIDAD ÍHARBS) SOBRE AMPc FOSFO DI ESTE RASA 4 Hay necesidad de inhibidores de fosfodiesterasa 4 que no tengan efectos colaterales indeseables, incluyendo náusea y vómito. Los modelos en animales han mostrado que esta actividad está correlacionada en gran medida con una capacidad del compuesto para desplazar (3H] Rolipram de un sitio de unión de gran afinidad de células dentro del cerebro y el sistema nervioso central (SNC) [Duplantier, 1996, Barnette, 1996]. Se usa un análisis de desplazamiento de Sitio de Unión de Rolipram de Gran Afinidad (HARBS) para predecir el potencial emético de un compuesto de la presente invención. Los compuestos representativos de la presente invención exhiben baja afinidad para el conformador HARBS de PDE4, lo que sugiere que estos compuestos probablemente no estén plagados por efectos colaterales asociados con el mecanismo, asociados con la primera generación de inhibidores de PDE4, como Rolipram. Se sacrificaron ratones hembras CD1 por medio de inyección intraperitoneal de 100 µ?_ de eutanol, y se homogeneizó el tejido cerebral en 5 mL de Tris-HCI enfriado con hielo, pH 8.00, suplementado con 1.2 mM de MgCI2, 1 mM de benzamidina (Sigma; No. de catálogo B 6506) y 0.1 mM de PMSF (Sigma; No. de catálogo P 7626). Se centrifugó I suspensión dos veces a 30,000 x G a 4°C, y se desechó el sobrenadante. Se volvió a suspender la pella en regulador y se ajustó a una concentración de proteína de 0.5 mg/mL. Se disolvieron los fármacos a probar en DMSO y se pasaron con pipeta, por triplicado, a microplacas de 96 receptáculos, a concentraciones que van desde 1 hasta 30,000 nM. Se suplementó la preparación de 10 mL de membrana con 100 pL de [3H-Rolipram 0.235 µ? en DMSO y se dispensó 100 pL en cada receptáculo de la microplaca. Se incubó la placa a 4°C durante una hora. Se aspiró los contenidos de la placa a través de una placa de filtro Whatman GF/C, y se enjuagó con 4 x 200 pL de regulador enfriado con hielo. Se secó la placa durante la noche, se añadió a cada receptáculo 30 pL de Microscint 20 (Packard; No. de catálogo 6013621), y se leyó la placa en un contador de destello, con un tiempo de muestreo de 2 minutos/receptáculo. Se restaron los valores que representan la unión no específica (definidos por las cuentas obtenidas usando 20 Rolipram 20 µ?) de todos los puntos de datos. Se llevó a cabo determinaciones por triplicado en cada concentración. Los resultados están mostrados en la tabla 8. PDE4:HARBS indica la proporción de la concentración Cl50 requerida para inhibir la actividad catalítica a la concentración requerida para desplazar el 50 por ciento del Rolipram del sitio de unión de gran afinidad. Bajo estas condiciones de análisis, Rolipram es capaz de desplazar 3H-Rolipram del sitio de unión de gran afinidad en cerebro de ratón, con una Cl50 de alrededor de 10 nM (datos no mostrados). Así pues, Rolipram se une con 20 a 40 veces mayor afinidad a su sitio de gran afinidad, que la concentración requerida para la inhibición media máxima de la actividad catalítica de PDE4. Esta afinidad preferencial para HARBS sobre el conformador catalítico, se ha correlacionado con los efectos colaterales negativos de la primera generación de inhibidores de PDE4, a saber, la emesis y los efectos sobre el SNC. Los datos mostrados en la tabla 8 indican que los compuestos probados son mucho menos potentes en la unión a este sitio, que Rolipram. Por ejemplo, Rolipram y el compuesto 234 tienen Cl50 muy similares contra la actividad catalítica de PDE4 (280 y 250 nM, respectivamente); sin embargo, sus actividades contra HARBS son 10 nM y 210 nM, respectivamente. Así pues, el compuesto 234 es aproximadamente 28 veces menos potente que Rolipram para la interacción con el conformador HARBS de PDE4. La proporción de las CI5o para PDE4ca,ai¡t¡ca a PDE4 HA BS para Rolipram y para el compeusto 234 es 28 y 1.2, respectivamente. Esta proporción para el compuesto 234 se compara muy favorablemente con los valores informados para los inhibidores de PDE4 de segunda generación, donde la actividad contra HARBS se ha reducido por medio de los esfuerzos de SAR. Por ejemplo, las proporciones informadas para SB 207499 (Ariflo) y RP 73401 (piclamilast), dos inhibidores de PDE4 específicos que han sido probados en ensayos de fase II para el asma, son 1 y 3, respectivamente. Así pues, los compuestos de la presente invención pueden exhibir efectos emetogénicos in vivo que son mucho menores que los de Rolipram, Ro 20-1724 u otros inhibidores de PDE4 de primera generación. TABLA 8 AFINIDAD DE LOS COMPUESTOS DE PRUEBA PARA EL SITIO DE UNIÓN DE ROLIPRAM DE GRAN AFINIDAD. DE PDE4 EN CEREBRO DE RATÓN BS n) TABLA 8 (continuación) POTENCIACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LUCIFERASA EN EL ELEMENTO DE ESPUESTA A AMPc INDUCIDA POR FORSKOLIN. EN CÉLULAS MONOCITICAS HUMANAS U937 A fin de demostrar la capacidad de los compuestos de la presente invención para elevar el AMPc en células intactas, se usó la transfección de células con un elemento de respuesta a AMPc (CRE) que contenía una construcción de plásmido en un promotor que impulsa la expresión de un gen informador de luciferasa (Stratagene; Path Detect™, No. de catálogo 219076) para permitir la vigilancia sensible de los niveles intracelulares de AMPc por medio de la detección del caudal luminoso en un luminómetro. El tratamiento farmacológico de las células transfectadas con un compuesto que provee una combinación de inhibidor de PDE y agonista de adenilil-ciclasa (receptor o activador intracelular) da por resultado niveles intracelulares elevados de AMPc detectables a partir de la salida luminosa incrementada. Se ha demostrado que PDE4 de AMPc es la actividad de fosfodiesterasa predominante del nucleótido cíclico en las células U937 y, por lo tanto, este tipo de células, transfectado con la construcción de CRE-luciferasa, puede servir como un análisis discriminatorio celular, conveniente, para compuestos con actividad inhibidora de PDE 4. Los compuestos de la presente invención, por lo tanto, demostraron proveer expresión potenciada de luciferasa en células U937 tratadas con forskolin, el activador de adenilil-ciclasa. Se mantuvieron las células humanas pro-monocíticas U937 en medio RPMI que contenía 10 por ciento de FCS y 2 mM de glutamato. Se transfectó transitoriamente las células U937 como se describió en Biotechniques, vol. 17(6); 1058, 1994. Brevemente, se desarrolló estas células en un medio que contenía suero a una densidad de 5 x 106 células/mL, y luego se volvió a suspender en medio que contenía suero a una densidad aproximada de 1 x 107 células/mL. Se transfirió 400 pL de células a una cubeta de electroporacion que contenía 10 pg del vector informador (pCRE-luc) en un volumen de 40 µ?_ de H20. Se preparó el ADN vector informador a partir de DH5a de E. coli usando un equipo libre de endonucleasa de ADN (Qiagen), de acuerdo con el instructivo del fabricante. Se electroporaron las células U937 a la temperatura ambiente usando un electroporador BIORAD. Se estableció la capacitancia a 1050 pF y el voltaje fue 280V. Se anotó la constante de tiempo después de cada electroporacion. A continuación se diluyó las células en 4 mL de medio y se aplicó 200 µ?_ de células por receptáculo. Se dejó que las células se recuperaran durante 16-18 horas. Se trató luego las células con un compuesto de prueba o con vehículo, en presencia o ausencia de 10 µ de forskolin durante 4 horas, a 37°C. Se llevó acabo el análisis de luciferasa de acuerdo con el instructivo del fabricante (Tropix). Brevemente se centrifugaron las células durante cuatro minutos a 1200 rpm y se eliminó el sobrenadante del medio. Se sometieron a lisis las pellas de células en 15 µ?_ de regulador de lisis (Tropix). Se llevó a cabo el análisis de luciferasa usando 10 pL de regulador A y 25 µ!_ de regulador B. Se obtuvo la actividad de luciferasa usando un luminómetro con un retardo de 5 segundos, seguido por un tiempo real de 10 segundos. Como se muestra en la tabla 9, los compuestos representativos de la invención potencian la inducción de la actividad de luciferasa en células U937 tratadas con 10 µ? de forskolin. Ninguno de los compuestos de prueba, por sí mismo, indujo suficiente actividad de luciferasa, lo que indica una actividad basal baja de adenilil-ciclasa. Este resultado demuestra que estos compuestos son capaces de elevar los niveles de AMPc en una línea de células que exprese predominantemente PDE4, consistente con las observaciones en los análisis enzimáticos. Hay una correlación amplia entre la actividad inhibidora de PDE4 in vitro y la potencia de la inducción de luciferasa en el CRE. El análisis de luciferasa en el CRE, o sus variantes (diferentes tipos de células o características de construcción) del mismo, sirven como un análisis de respaldo/validación de SAR celular, conveniente, para los análisis enzimáticos de PDE4 in vitro, para la optimización de la eficacia para los compuestos de la presente invención.
TABLA 9 POTENCIACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LUCIFERASA EN CRE.
MEDIANTE COMPUESTOS DE PRUEBA. EN CÉLULAS U937. COINCUBADAS CON FORSKOLIN. ACTIVADOR DE ADENILIL- CICLASA Com EFECTOS DE LOS COMPUESTOS DE LA INVENCION SOBRE EL DESARROLLO DE CÉLULAS TRANSFORMADAS - ACTIVIDADES ANTICANCEROSAS POTENCIALES INTRODUCCION La línea de células K562, derivada de leucemia mieloide humana transformada con BCR-ABL (ATCC, No. de catálogo CRL 243) puede ser usada para determinar cómo afectan los compuestos de la presente invención el crecimiento de las células. La elevación de la AMPc intracelular es una manera de provocar la detención en el ciclo celular, de la apoptosis, en muchas condiciones malignas, en particular ciertas clases de leucemias (por ejemplo, CLL). Se ha informado que dichos mecanismos intracelulares (o sea, AMPc) efectúan la diferenciación de los clones leucémicos no diferenciados. En particular, se ha demostrado que la elevación de la AMPc intracelular (usando un análogo de AMP cíclico) en células de leucemia mieloide, transformadas con p210 BCR-ABL, es anti-proliferante a través de la inhibición de la quinasa 4 dependiente de la ciclina, y la regulación descendente de c-myc subsiguiente. Así pues, se puede comparar la capacidad anti-proliferante de los compuestos de la presente invención en células K562 cultivadas, con diversos inhibidores de fosfodiesterasa comunes y corrientes, usando un análisis de absorción de 3H-timidina.
LOS MÉTODOS Se siembran células K562 (células de leucemia mielógena crónica humanas) (90 pL) en placas estériles de análisis, de 96 receptáculos, a una densidad de 1 x 105 células/mL, en RPMI 1640, suplementado con 10 por ciento de FBS//2 mM de L-glutamina. Se preparan las muestras que se van a probar, en una placa de análisis estéril, de 96 receptáculos, a 10X la concentración final deseada. Todas las diluciones de muestra contienen cantidades iguales de DMSO para compensar el % de DMSO en la concenetración de muestra más alta usada. Se examinan nueve concentraciones del compuesto de prueba para los efectos sobre el crecimiento a una concentración máxima de 100 µ?. Se añade a las células de la alícuota 10 µ?_ de las muestras y controles (DMSO/control de crecimiento normal). Se incuban las células a 37°C/5 por ciento de C02 durante 48 horas. Después de la incubación durante 48 horas se añade 20 µ?_ de 3H-timidina a cada receptáculo, para una concentración final de 1 µ?/?t??_. Se incuban entonces las células a 37°C / 5 por ciento de C02 durante 4 a 6 horas. Después de pulsar con timidina durante cuatro a seis horas, se envuelven en plástico las placas y se congelan en un congelador libre de escarcha, a -20°C durante la noche. Se cosechan las células y se determinan las cuentas de 3H-timidina. A fin de distinguir entre la citotoxicidad y la actividad citostática, se preparan curvas de desarrollo, donde se gráfica el valor CPM promedio de la densidad de siembra de las células, en la misma curva que el valor CPM promedio para la proliferación máxima alcanzada después de 48 horas (células de control desarrolladas en DMSO). Se diluyen las células 1:2 para una escala de concentración de 7.8 x 103 células/mL a 2 x 106 células/mL. Se siembra 90 µ?_ de cada dilución de células en piadas de análisis estériles, de 96 receptáculos, y se deja que se equilibren durante aproximadamente cuatro horas a 37°C / 5 por ciento de C02, antes del pulso con 3H-timidina. Se siembran las células K562 en placas de 96 receptáculos a 1 x 105 células/mL en RPMI 1640 suplementado con FBS al 10 por ciento/2 mM de L-glutamina. Se añaden diversas concentraciones del compuesto de prueba o vehículo (DMSO) a las células, y se incuban a 37°C / 5 por ciento de C02 durante 48 horas. Luego se pulsan las células a 37°C / 5 por ciento de C02 durante 4 a 6 horas con 1 pC/mL de 3 + H-timidina. Se determina la radiactividad incorporada en el ADN después de cosechar sobre filtros de fibra de vidrio y conteo de destello.
ENFERMEDAD DE INTESTINO INFLAMABLE (MAL DE CROHN) La enfermedad de intestino inflamable (IBD) es un eufemismo para las enfermedades inflamatorias actualmente incurables, crónicas, fluctuantes, del tracto gastrointestinal, incluyendo el mal de Crohn y la colitis ulcerante. Los síntomas de estos trastornos incluyen dolor abdominal (usualmente en el lado derecho inferior del abdomen) y diarrea, con sangrado rectal, pérdida de peso y fiebre conforme avanza la condición. Se desconoce a etiología de la IBD; sin embargo, los estudios epidemiológicos sugieren una asociación entre la enfermedad y la infección viral (en particular el sarampión) en el útero o al inicio de la vida. La Fundación Estadounidense para el Mal de Crohn y la Colitis (CCFA) estima que uno a dos millones de personas en los Estados Unidos sufren del mal de Crohn y de IBD relacionadas, y que en los países europeos hay un riesgo mayor. Las tasas de incidencia han aumentado de manera importante en los últimos 60 años, desde que se describió por primera vez el mal de Crohn. Solamente en los Estados Unidos los costos económicos de estas enfermedades se estiman en 1.8 a 2.6 miles de millones de dólares anuales. Un tratamiento común para la IBD consiste en la adminitración oral o intracolónica de ácido 5-aminosalicílico (5-ASA), un derivado NSAID que se descompone a ASA (el fármaco activo en el tracto gastrointestinal inferior. Otros tratamientos de mantenimiento para IBD incluyen corticoesteroides e inmunosupresores (por ejemplo, 6-mercaptopurina o azatioprina), o combinaciones de ellos. Recientemente se aprobó una terapia anti-FNT-a para el tratamiento del mal de Crohn severo, que es resistente a las terapias convencionales. Esta aproximación terapéutica valida la importancia del factor de necrosis tumoral en la IBD. Aun con las aproximaciones anti-FNT-a, queda mucho por hacer para mejorar las modalidades de tratamiento actuales, tanto desde el punto de vista de los efectos colaterales, como desde el punto de vista de la eficacia. Se pueden probar los compuestos de la presente invención en el modelo de colitis inducida por ácido trinitrobencensulfónico (TNBS) en ratas (Morris y coautores, Gastroenterology 96:795-803, 1989; Kim, H.-S y Berstad, A., Scandinavian Journal of Gastroenterology, 27:529-537, 1992; Ward, Lancet / :903-905, 1977; y Shorter y coautores, Am. J. Dig. Dis., 17:1024-1032, 1972)). Las ventajas de este modelo de IBD particular incluyen: (a) el desarrollo de la enfermedad en las ratas está mediado inmunológicamente con células T de Th1, que juegan un papel importante, como se cree que sucede en la enfermedad humana; (b) una sola instilación de TNBS induce la enfermedad de severidad consistente y de persistencia consistente; (c) el modelo es de bajo costo; (d) la duración prolongada de la inflamación (hasta 8 semanas); (e) una variante del modelo, en el cual se reactiva la colitis, imita la naturaleza relapsante/remitente de la enfermedad humana; (f) las lesiones son histopatológicamente similares a las de los humanos; (g) la patología clínica se parece a enfermedades humanas, tales como necrosis, formación de úlceras, infiltración granulocítica, edema del intestino, diarrea y adherencias; y (h) muchos fármacos usados para tratar IBD humana son activos en el modelo de TNBS. El modelo de TNBS en ratas, de la inflamación gastrointestinal es un modelo preclínico aceptado para IBD humana. Las manifestaciones clínicas e histopatológicas de la enfermedad muestran buena similitud con la enfermedad humana y muchos fármacos actualmente usados para el tratamiento de IBD en humanos son eficaces en este modelo. La eficacia de un compuesto de la invención en este modelo implicaría que el compuesto puede ser usado en terapia de enfermedad inflamatoria humana, incluyendo el mal de Crohn y la colitis ulcerante, entre otras.
ARTRITIS REUMATOIDE INTRODUCCIÓN Y DESARROLLO El modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) en ratones es un modelo adecuado para evaluar los fármacos potenciales activos en la artritis reumatoide humana (Trentham, D. E., Arthritis Rheum., 25:911-916 1982; Brahn, E., Clin. Orthop., 265: 42-53, 1991; Hohndahl, R. y coautores, Arthritis Rheum., 29:106, 1986). Comparte muchos de los cambios moleculares, celulaes e histopatológicos identificados como señales de la efermedad humana; éstas incluyen: (a) proliferación pronunciada de las células que comprenden la membrana sinovial de la articulación, (b) formación de un tejido invasor, parecido a paño; (c) infiltración de macrófagos, granulocitos y linfocitos; y (d) destrucción de hueso y cartílago. Como la artritis reumatoide, los animales con CIA exhiben niveles elevados de complejos de inmunoglobulina en el suero, tales como el factor reumatoide (RF) y los anticuerpos anti-colágeno y las citocinas inflamatorias en la membrana sinovial, tales como el factor de necrosis tumoral (TNF-a). Adicionalmente, se ha demostrado la implicación de la activación celular/expansión clonal de células de auxiliar T, restringida por II de la clase MHC en la membrana sinovial. Las radiografías de las articulaciones afectadas frecuentemente muestran cambios erosivos similares a los que se ven en la RA humana y frecuentemente la artritis progresiva da por resultado la deformidad de la articulación y la disfunción de la articulación, como la RA. Además, muchos compuestos que reducen los síntomas de la enfermedad humana, tales como los productos biológicos anti-FNT, los corticoesteroides y los DMARDS son eficaces en este modelo animal. El desarrollo/progreso de la enfermedad en el modelo CIA ocurre tanto en una fase inmune (temprana) como en una fase inflamatoria, permitiendo de esa manera la determinación de una amplia gama de fármacos, con diversos modos de acción farmacológica.
RECHAZO AL TRASPLANTE PRUEBA IN VITRO: ACTIVACIÓN. DIFERENCIACIÓN Y FUNCIÓN DE CD4 + CÉLULA T MÉTODOS Se usa ratones transgénicos AND-TCR (Kaye J. y coautores, Nature 341: 746-749, 1989) para proveer una fuente de CD4 + células T específicas para el antígeno simple. El receptor de antígeno de AND-célula T reconoce un péptido derivado del citocromo C de paloma (pee) en el contexto de la molécula MHC de clase l-Ek. Para examinar el papel de un compuesto de prueba en activación y proliferación de CD4 + célula T simple, se cultivan 1 x 105 células T del nodo linfático de AND, con 1 x 106 células de bazo B10.BR irradiadas, en presencia de concentraciones variables del péptido pee (0-10 µ ) en placas de 96 receptáculos. Se determina la proliferación mediante incorporación de 3H-t¡midina. Todas las condiciones del análisis se llevan a cabo por triplicado. Se determina el fenotipo de activación de la superficie de la célula, en las células T, mediante análisis citométrico de flujo. La diferenciación de CD4 + células T simples hacia los linajes Th1 y Th2 se efectúa de la siguiente manera: Se cultivan 1 x 105 células T de nodo linfático de AND, con 107 células de bazo irradiadas B10.BR en 2 mL de medio de cultivo, con los siguientes suplementos: para la diferenciación de la célula Th1, 100 U/mL de IFN-Y, 25 U/mL de IL-2 y 10 pg/mL de anti-IL-4; para la diferenciación de las células Th2, 150 U/mL de IL-4, 25 U/mL de IL-2 y 10 g/mL de anti-IFN-a. Después de 3 a 4 días se dividen las receptáculos 1:4 con las mismas adiciones. Después de siete días, se cosechan las células y se lavan tres veces para eliminar las citocinas en los sobrenadantes. Se vuelven a estimular las células cultivadas (1 x 105) con 5 x 105 células de bazo B10BR irradiadas en presencia de 5 µ? de péptido pee en 250 µ? de medio de cultivo, sin ninguna citocina añadida. Se cosechan los sobrenadantes después de 40 horas y se determinan para IL-2, IL-4 y para IFN-?, por medio de ELISA. Se añaden los compuestos de prueba durante toda la diferenciación del cultivo. Se prueban células Th1 y Th2 cultivadas, generadas en ausencia de ios compuestos de prueba, para proliferación y para actividad de citocina, como se describió más arriba, durante la estimulación del antígeno en presencia de un compuesto.
PRUEBA IN VITRO: ACTIVACIÓN, DIFERENCIACIÓN Y FUNCIÓN DE CD8 + CÉLULA T MÉTODOS Se usan ratones transgénicos 2C-TCR (Sha W. C. y coautores, Nature 335:271-274, 1988) para proveer una fuente de CD8+células T específicas para el antígeno simple. El receptor de antígeno de las células 2C-T reconoce el péptido 2C derivado de la enzima deshidrogenasa de alfa-cetoglutarato mitocondrial, en el contexto de la molécula MHC de Db, clase I. Para probar la eficacia de un compuesto de prueba en la activación y proliferación de CD8 + célula T simple, se aislan suspensiones de una sola célula de células T del nodo linfático 2C (LN), de ratones transgénicos 2C-TCR. Se estimulan las células 2C-T con TAP-/-H-2d esplenocitos o línea de células TAP-/- T2 transfectadas con Ld, en presencia de concentraciones variables del péptido 2C (0-10 µ?). Se determina la proliferación mediante la incorporación de 3H-timidina. Se efectúa el fenotipo de activacióin de la superficie de la célula en células T, mediante análisis citométrico de flujo. Se generan células T citotóxicas mediante la activación de células 2C-T con esplenocitos H-22 irradiados. Se cultivan las células durante 7 a 10 días en presencia de 25 U/mL de IL-2. Se prueba la actividad mortal citotóxica de las células de cultivo con un análisis de liberación de Cr5 , usando células de blanco T2-Ld, en presencia de concentraciones variables de péptido 2C. Se determina el efecto de los compuestos de prueba sobre la diferenciación de CD8 + células T simples en células asesinas citotóxicas, añadiendo los compuestos de prueba durante la activación primaria y el periodo de cultivo. El efecto de los compuestos de prueba en la activación de CD8 + célula T citotóxica y su función efectora, se miden usando el análisis de liberación de Cr51 y el análisis de incorporación de 3H timidina, en presencia de las concentraciones señaladas del compuesto.
PRUEBA IN VIVO: MODELO DE TRANSPLANTE DE ALOINJERTO DE PIEL DE LA COLA DE MÚRIDOS Se evaluó el compuesto 54 en el siguiente modelo de trasplante in vivo.
MÉTODOS: Se trasplantó piel de la cola de ratones donadores H-2bC57BL/6, a hembras receptoras de ratones H-2d BALB/c (Lagodzinski, Z y coautores, Immunology, 71: 148-150 (1990)). Se incluyó cinco ratones por grupo. Siete grupos de ratones, que consistían de cuatro grupos de prueba tratados con compuesto de prueba y tres controles que incluían sin tratar, tratado con vehículo solo y tratado con ciclosporina A (CsA; Sigma, No. de catálogo C 3662), fueron incluidos en el estudio. El compuesto de prueba y CsA fueron administrados dos veces al día intraperitonealmente, a una dosis de 10 mg/kg, comenzando un día antes del trasplante y durante 15 días después del trasplante, incluyendo el día del trasplante. Se vigilaron los ratones y se marcaron diariamente durante 15 días posteriores al trasplante, en cuanto al rechazo del injerto.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN El rechazo de aloinjerto de piel es mediado primariamente por linfocitos T, con poca evidencia de un papel de importancia para los anticuerpos, bajo la mayoría de las circunstancias. El rechazo de aloinjerto de piel requiere la activación de las poblaciones de células T auxiliares y efectores citotóxicos. Se determinó el rechazo de injerto vigilando la necrosis del aloinjerto. Debido a que la piel de la cola es visiblemente distinta de la piel de tronco circundante, del ratón, se puede vigilar fácilmente el curso del rechazo. Se marcó los injertos totalmente intactos como 100 por ciento. Se definió el rechazo completo del injerto como una necrosis del injerto de más del 90 por ciento. El rechazo agudo del injerto generalmente procede a través de una serie de eventos visualmente obvios, comenzando con inflamación y eritema del injerto. Estos eventos son seguidos por desecación del injerto y formación de costra sobre la mayor parte o la totalidad del injerto, lo que es signo de pérdida del tejido de injerto viable. La formación de costra va seguida después por encogimiento y formación de cicatriz. Un compuesto representativo de la invención, el compuesto 54, demostró un incremento significativo en la sobrevivencia del injerto, cuando se compara con el grupo decontrol (portador únicamente, ß-ciclodextrina; Sigma, No. de catálogo C4767). (Tabla 10).
TABLA 10 EFECTO DE LOS COMPUESTOS SOBRE EL RECHAZO DE INJERTO EN UN MODELO DE TRASPLANTE DE ALOIN JERTO DE PIEL DE LA COLA DE MÚRIDO Compuesto Sobrevivencia promedio Tasa de sobrevivencia Núm. de injertos que de injerto (días) de aloinjerto(%a9días sobreviven más de 16 después del trasplante) días después del trasplante Sin tratar 8±1 0 0 Vehículo 8.5 ±1 0 0 Rolipram 11.5 ±3.7 50 1 Ciclosporina 13.5±3.3 75 54 11.5±3.3 75 0 El grupo de control promedió una sobrevivencia de 8.5 días de los aloinjertos de piel, mientras que los grupos tratados con el compuesto 54,promediaron 11.5 días de sobrevivencia. En comparación con la ciclosporina A, los compuestos de la invención, de los cuales es representativo el compuesto 54, también están disponibles para uso en todas las indicaciones en las que se usa ciclosporina A. Las actividades diferenciales de estos compuestos, así como su selectividad en las citocinas inhibió ios argumentos de un mecanismo que no daba por resultado la inmunosupresión, sino más bien la inmunomodulación. La capacidad del compuesto 54 para suprimir el rechazo de aloinjerto en este modelo implica que puede ser de utilidad terapéutica en enfermedades tales como esclerosis múltiple, enfermedad de intestino inflamable, artritis reumatoide, psoriasis, trasplantes de órganos y todos los trastornos autoinmunológicos. Por ejemplo, se usan muchos fármacos para el tratamiento de la psoriasis en trasplante de órganos, o han demostrado eficacia en este uso. Así pues, la eficacia de los fármacos inmunomoduladores o inmunosupresores, en el trasplante de órganos parece predecir la eficacia en la psoriasis, llamando bien a esta serie de compuestos compuestos terapéuticos para la psoriasis. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta descripción quedan incorporadas aquí por medio de esta referencia, en toda su extensión, como si cada publicación, patente o solicitud de patente individualmente fuera incorporada de manera específica e individual, por referencia. De lo anterior se apreciará que, si bien se han descrito modalidades específicas de la invención con el propósito de ilustrar, pueden hacerse varias modificaciones sin salirse del espíritu y el alcance de la invención. Consecuentemente, la invención no debe estar limitada por los ejemplos específicos provistos aquí.

Claims (42)

  1. REIVINDICACIONES compuesto de la fórmula en la que cada uno de los átomos de carbono en las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18 y 19, así como el nitrógeno de la posición 1, están sustituidos independientemente en cada ocurrencia, con H, -W o -R7(W)n; donde: W está seleccionado de -NH2, -CONH3, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -N02, -SH, -COX, -NHR8, -NR8R8, -CONHR8, -COOR8, -COR8, -OCOR8, -OR8, -BH2, -BHR8, -BR8R8, -B02H2, -B02R8R8, -PH2l -PHR8, -PR8R8, -POR8, -P02R8, -P03R8, -SR8, -SOR8, -S02R8, -SONH2, -SONHR8, -SONR8R8, -S02NH2, -S02NHR8 y -S02NR8R8; cada R7 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono; donde n de los átomos de hidrógeno o átomos de halógeno de R7 están sustituidos por un número igual de grupos W, seleccionados independientemente en cada ubicación; o dos grupos R7 adyacentes, junto con los carbonos de las posiciones 12 y 13 o de las posiciones 11 y 13, a las que están fijados, forman un grupo heterociclilo; cada R8 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono; n está seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y X está seleccionado de -Br, -Cl, -F e -I; o su sal o su solvato aceptables para uso farmacéutico, como un solo estereoisómero o como una mezcla de ellos.
  2. 2. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las posiciones 4 y 6 están sustituidas exclusivamente con hidrógeno.
  3. 3. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la posición 19 está sustituida con -W.
  4. 4. - El compuesto de conformidad con la reivindicción 1, caracterizado además porque la posición 19 está sustituida con -CN, -X, -OH, -N07, -SH o -OR8.
  5. 5. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque un carbono en las posiciones 17 y 18 está sustituido con hidrógeno.
  6. 6.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque por lo menos un carbono en las posiciones 17 y 18 está sustituido con -W.
  7. 7.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque por lo menos un carbono en las posiciones 17 y 18 está sustituido con -NH2, -CONH2, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -N02, -SH, -COX, - HR , -NR R , -CONHR , -CONR8R8, -COOR8, -COR8, -OCOR3 o -OR8.
  8. 8. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque por lo menos un átomo de carbono en las posiciones 17 y 18 está sustituido con -CN, -X, -OH, -N02, -SH o -OR8.
  9. 9. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque únicamente uno de los carbonos en las posiciones 17, 18 y 19 está sustituido con hidrógeno.
  10. 10.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el carbono en la posición 7 está sustituido exclusivamente con hidrógeno.
  11. 11. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el carbono en la posición 3 está sustituido con hidrógeno, R8 o X.
  12. 12. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque los carbonos en las posicioens 9 y 10 están sustituidos con hidrógeno. 13. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque los carbonos en las posiciones 11, 12 y
  13. 13 están sustituidos independientemente con hidrógeno y -W.
  14. 14. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque únicamente uno de los carbonos en las posiciones 11 y 12 está sustituido con hidrógeno.
  15. 15.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque un carbono, seleccionado de las posiciones 11 y 12, está sustituido con -CN, -X, -OH, -N02, -SH o -OR8.
  16. 16. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque por lo menos un carbono de las posiciones 11, 12 y 13 está sustituido con -R7(W)n.
  17. 17. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque por lo menos un carbono de las posiciones 11, 12 y 13 está sustituido con hidrocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono, halocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono o hidrohalocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono.
  18. 18. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque exactamente dos de los carbonos en las posiciones 11, 12 y 13 están sustituidos con hidrógeno.
  19. 19.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque W está seleccionado de -OCHO, -OH, -OCOR8 y -OR8.
  20. 20. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque W está seleccionado de -NH2, -CN, -X, -OH, -N02, -SH, -NHR8, -NR8R8, -OR8 y -SR8.
  21. 21. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque W es -OR8.
  22. 22. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque R? es un grupo hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono, donde n de los átomos de hidrógeno o de halógeno de R7 están sustituidos con un número igual de grupos W, seleccionados independientemente en cada ubicación.
  23. 23. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque R7 está seleccionado de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquiio, alquilarilo, arilo sustituido con alquenilo, alquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con alquinilo, alquinilo sustituido con arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, bicicloalq uilo, bicicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquenilcicloalquilo, alquinilcicloalquilo, cicloalquilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquilo, cicloalquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquenilo, cicloalquilo fundido con arilo y policicloalquilo.
  24. 24. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque R8 es un grupo hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono.
  25. 25. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque R8 es un grupo ciclohidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono.
  26. 26. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque R8 está seleccionado de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquiio, alquilarilo, arilo sustituido con alquenilo, alquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con alquinilo, alquinilo sustituido con arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, bicicloalquilo, bicicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquenilcicloalquilo, alquinilcicloalquilo, cicloalquilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquilo, cicloalquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquenilo, cicloalquilo fundido con arilo y policicloalquilo.
  27. 27. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque n es 0.
  28. 28. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la posición 1 está sustituida con hidrógeno.
  29. 29. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque tiene la configuración S en el átomo de carbono 3.
  30. 30. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque tiene la configuración R en el átomo de carbono 3.
  31. 31.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque tiene la configuración S en el átomo de carbono 5.
  32. 32. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque tiene la configuración R en el átomo de carbono 5.
  33. 33. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las posiciones 3, 4, 6, 7, 9 y 10 están sustituidas con hidrógeno; una de las posiciones 11 y 12 está sustituida con hidrógeno, y una de las posiciones 17 y 18 está sustituida con hidrógeno.
  34. 34. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque por lo menos un carbono de las posiciones 11, 12 y 13 está sustituido con hidrocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono, halocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono o hidrohalocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono; y donde exactamente dos de los carbonos en las posiciones 11, 12 y 13 están sustituidos con hidrógeno.
  35. 35. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la posición 19 está sustituida con -CN, -X, -OH, -N02, -SH o -OR8; un carbono en las posiciones 17 y 18 está sustituido con hidrógeno; y por lo menos un carbono en las posiciones 17 y 18 está sustituido con -CN, -, -OH, -N02, -SH o -OR8.
  36. 36. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las posiciones 3, 4, 6, 7, 9 y 10 están sustituidas con hidrógeno; exactamente dos de los carbonos en las posiciones 11, 12 y 13 están sustituidas con hidrógeno; por lo menos un carbono de las posiciones 11, 12 y 13 está sustituido con hidrocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono; halocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono o hidrohalocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono; una de las posiciones 17 y 18 está sustituida con hidrógeno; la posición 19 está sustituida con -CN, -X, -OH, -N02, -SH o -OR8; y por lo menos un carbono en las posiciones 17 y 18 está sustituido con -CN, -X, -OH, -N02, -SH o -OR8.
  37. 37.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las posiciones 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11 y 18 están sustituidas con hidrógeno; las posiciones 17 y 19 están sustituidas con OR8, donde R8 es un grupo hidrocarbilo de 1 a 10 átomos de carbono; y la posición 12 está sustituida con hidrocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono, halocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono o hidrohalocarbilo de 1 a 6 átomos de carbono.
  38. 38. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las posiciones 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 15, 16 y 18 están sustituidas con hidrógeno; la posición 12 está sustituida con hidrocarbilo de 1 átomo de carbono, la posición 7 está sustituida con -O-ciclopentilo, y la posición 19 está sustituida con -O-metilo.
  39. 39. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque las posiciones 3 y 5 tienen ambas la estereoquímica S.
  40. 40. - La sal o solvato del compuesto de la reivindicación 1, aceptables para uso farmacéutico.
  41. 41. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque tiene la fórmula: o su sal o solvato aceptables para uso farmacéutico, como un estereoisómero o como una mezcla de ellos.
  42. 42.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque tiene la fórmula: o su sal o solvato aceptables para uso farmacéutico, estereoisómero o como una mezcla de ellos. compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque tiene la fórmula: o su sal o soivato aceptables para uso farmacéutico, como un solo estereoisómero o como una mezcla de ellos. 44.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque tiene la fórmula: o su sal o soivato aceptables para uso farmacéutico, como un solo estereoisómero o como una mezcla de ellos. 45.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque tiene la fórmula: o su sal o solvato aceptables para uso farmacéutico, como un solo estereoisómero o como una mezcla de ellos. 46.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque tiene la fórmula: o su sal o solvato aceptables para uso farmacéutico, como un solo estereoisómero o como una mezcla de ellos. 47.- Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un compuesto de la fórmula: en la que: cada uno de los átomos de carbono en las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18 y 19, así como el nitrógeno de la posición 1, están sustituidos independientemente en cada ocurrencia, con H, -W o -R7(W)n; donde: W está seleccionado de -NH2, -CONH3, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -N02, -SH, -COX, -NHR3, -NR8R8, -CON HR8, -COOR8, -COR8, -OCOR8, -OR8, -BH2, -BHR8. -BR8R8, -B02H2, -B02R8R8, -PH2, -PHR8, -PR8R8, -POR8, -P02R8, -P03R8, -SR8, -SOR8, -S02R8, -SONH2, -SONHR8, -SONReR8, -S02NH2, -S02NHR8 y -S02NReR8; cada R7 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono; donde n de los átomos de hidrógeno o átomos de halógeno de R7 están sustituidos por un número igual de grupos W, seleccionados independientemente en cada ubicación; o dos grupos R7 adyacentes, junto con los carbonos de las posiciones 12 y 13 o de las posiciones 11 y 13, a las que están fijados, forman un grupo heterociclilo; cada R es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono; n está seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y X está seleccionado de -Br, -Cl, -F e -I; o su sal o su solvato aceptables para uso farmacéutico, como un solo estereoisómero o como una mezcla de ellos; y un portador, un diluyente o un excipiente aceptables para uso farmacéutico. 48. - La composición de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque el compuesto es un compuesto en el que las posiciones 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 15, 16 y 18 están sustituidas con hidrógeno; la posición 12 está sustituida con hidrocarbilo de 1 átomo de carbono; la posición 17 está sustituida con -O-ciclopentilo, y la posición 19 está sustituida con -O-metilo. 49. - Un método para tratar o prevenir una condicióin inflamatoria o una enfermedad en un paciente; caracterizado el método porque comprende administrar al paciente que tiene necesidad de ello, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula: 19 en la que: cada uno de los átomos de carbono en las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18 y 19, así como el nitrógeno de la posición 1, están sustituidos independientemente en cada ocurrencia, con H, -W o -R7(W)n; donde: W está seleccionado de -NH2, -CONH3, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -N02, -SH, -COX, -NHR8, -NR8R8, -CONHR8, -COOR8, -COR8, -OCOR8, -OR8, -BH2, -BHR8, -BR8R8, -B02H2, -B02R8R8, -PH2, -PHR8, -PR8R8, -POR8, -P02R8, -P03R8, -SR8, -SOR8, -S02R8, -SONH2, -SONHR8, -SONR8R8, -S02NH2, -S02NHR8 y -S02NR8R8; cada R7 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono; donde n de los átomos de hidrógeno o átomos de halógeno de R7 están sustituidos por un número igual de grupos W, seleccionados independientemente en cada ubicación; o dos grupos R7 adyacentes, junto con los carbonos de las posiciones 12 y 13 o de las posiciones 11 y 13, a las que están fijados, forman un grupo heterociclilo; cada R8 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono; n está seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y X está seleccionado de -Br, -Cl, -F e -I; o su sal o su solvato aceptables para uso farmacéutico, como un solo estereoisómero o como una mezcla de ellos; donde la cantidad es efectiva para tratar o prevenir la condicióin inflamatoria o la enfermedad del paciente. 50.- Un método para modular los niveles intracelulares cíclicos de 5'-monofosfato de adenosina en un paciente, caracterizado el método porque comprende administrar a un paciente que tenga necesidad de ello, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula: en la que: cada uno de los átomos de carbono en las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18 y 19, así como el nitrógeno de la posición 1, están sustituidos independientemente en cada ocurrencia, con H, -W o -R7(W)n; donde: W está seleccionado de -NH2, -CONH3, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -N02, -SH, -COX, -NHR8, -NR8R8, -CONHR8, -COOR8, -COR8, -OCOR8, -OR8, -BH2, -BHR8, -BR8R8, -B02H2, -B02R8R8, -PH2, -PHR8, -PR8Re, -POR8, -P02R8, -P03R8, -SR8, -SOR8, -S02R8, -SONH2, -SONHR8, -SONR8R8, -S02NH2) -S02NHR8 y -S02NR8R8; cada R7 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono; donde n de los átomos de hidrógeno o átomos de halógeno de R7 están sustituidos por un número igual de grupos W, seleccionados independientemente en cada ubicación; o dos grupos R7 adyacentes, junto con los carbonos de las posiciones 12 y 13 o de las posiciones 11 y 13, a las que están fijados, forman un grupo heterociclilo; cada R8 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono; n está seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y X está seleccionado de -Br, -Cl, -F e -I; o su sal o su solvato aceptables para uso farmacéutico, como un solo estereoisómero o como una mezcla de ellos; donde la cantidad es efectiva para modular los niveles intracelulares cíclicos del 5'-monofosfato de adenosina. 51.- Un método para tratar o prevenir una enfermedad o una condición en un paciente, donde la enfermedad o la condición están asociadas con condiciones patológicas que son moduladas por enzimas inhibidoras asociadas con mensajeros celulares secundarios; caracterizado dicho método porque comprende administrar a un paciente que tenga necesidad de ello, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula: en la que: cada uno de los átomos de carbono en las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18 y 19, así como el nitrógeno de la posición 1, están sustituidos independientemente en cada ocurrencia, con H, -W o -R7(W)n; donde: W está seleccionado de -NH2, -CONH3, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -N02, -SH, -COX, -NHR8, -NR8R8, -CONHR8, -COOR8, -COR8, -OCOR8, -OR8, -BH2> -BHR8, -BR8R8, -B02H2, -B02R8R8, -PH2> -PHR8, -PR8R8, -POR8, -P02R8, -P03R8, -SR8, -SOR8, -S02R8, -SONH2, -SONHR8, -SONR8RB, -S02NH2> -S02NHR8 y -S02NR8R8; cada R7 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono; donde n de los átomos de hidrógeno o átomos de halógeno de R7 están sustituidos por un número igual de grupos W, seleccionados independientemente en cada ubicación; o dos grupos R7 adyacentes, junto con los carbonos de las posiciones 12 y 13 o de las posiciones 11 y 13, a las que están fijados, forman un grupo heterociclilo; cada R8 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono; n está seleccionado de 0, 1 , 2, 3, 4 y 5; y X está seleccionado de -Br, -Cl, -F e -I; o su sal o su solvato aceptables para uso farmacéutico, como un solo estereoisómero o como una mezcla de ellos; donde la cantidad es efectiva para tratar o prevenir una enfermedad o una condición asociadas con condiciones patológicas que son moduladas por enzimas inhibidoras, asociadas con mensajeros celulares secundarios. 52.- Un método para tratar o prevenir el rechazo a los trasplantes en un paciente; caracterizado dicho método porque comprende administrar a un paciente que tenga necesidad de ello, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula: en la que: cada uno de los átomos de carbono en las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18 y 19, así como el nitrógeno de la posición 1, están sustituidos independientemente en cada ocurrencia, con H, -W o -R7(W)n; donde: W está seleccionado de -NH2, -CONH3, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -N02, -SH, -COX, -NHR8, -N R8R8, -CONHR8, -COOR8, -COR8, -OCOR8, -OR8, -BH2, -BHR8, -BR8R8, -B02H2, -B02R8R8, -PH2, -PHR8, -PR8R8, -POR8, -P02R8, -P03R8, -SR8, -SOR8, -S02R8, -SONH2, -SONHR8, -SONR8R8, -S02NH2, -S02NHR8 y -S02NR8R8; cada R7 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono; donde n de los átomos de hidrógeno o átomos de halógeno de R7 están sustituidos por un número igual de grupos W, seleccionados independientemente en cada ubicación; o dos grupos R7 adyacentes, junto con los carbonos de las posiciones 12 y 13 o de las posiciones 11 y 13, a las que están fijados, forman un grupo heterociclilo; cada R8 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono; n está seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y X está seleccionado de -Br, -Cl, -F e -I; o su sal o su solvato aceptables para uso farmacéutico, como un solo estereoisómero o como una mezcla de ellos; donde la cantidad es efectiva para tratar o prevenir el rechazo al trasplante en el paciente. 53.- Un método para tratar o prevenir la proliferación celular incontrolada en un paciente, caracterizado dicho método porque comprende administrar a un paciente que tenga necesidad de ello, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula: en la que: cada uno de los átomos de carbono en las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18 y 19, así como el nitrógeno de la posición 1, están sustituidos independientemente en cada ocurrencia, con H, -W o - 7(W)n; donde: W está seleccionado de -NH2, -CONH3, -CN. -CHO, -OCHO, -X, -OH, -N02, -SH, -COX, -NHR8, -NR8R8, -CONHR8, -COOR8, -COR8, -OCOR8, -OR8, -BH2, -BHR8, -BR8R8, -B02H2, -B02R8R8, -PH2, -PHR8, -PR8R8, -POR8, -P02R8, -P03R8, -SR8, -SOR8, -S02R8, -SONH2, -SONHR8, -SONR8R8, -S02NH2, -S02NHR8 y -S02NR8R8; cada R7 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono; donde n de los átomos de hidrógeno o átomos de halógeno de R7 están sustituidos por un número igual de grupos W, seleccionados independientemente en cada ubicación; o dos grupos R7 adyacentes, junto con los carbonos de las posiciones 12 y 13 o de las posiciones 11 y 13, a las que están fijados, forman un grupo heterociclilo; cada R8 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo de 1 a 30 átomos de carbono; n está seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y X está seleccionado de -Br, -Cl, -F e -I; o su sal o su solvato aceptables para uso farmacéutico, como un solo estereoisómero o como una mezcla de ellos; donde la cantidad es efectiva para tratar o prevenir la proliferación celular incontrolada en el paciente. 54.- Un método para tratar o prevenir condiciones asociadas con el sistema nervioso central (SNC) en un paciente, caracterizado dicho método porque comprende administrar a un paciente que tenga necesidad de ello, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula: en la que: cada uno de los átomos de carbono en las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18 y 19, así como el nitrógeno de la posición 1, están sustituidos independientemente en cada ocurrencia, con H, -W o -R7(W)n; donde: W está seleccionado de -NH2, -CONH3, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -N02, -SH, -COX, -NHR3, -NR8R8, -CONHR8, -COOR8, -COR8, -OCOR8, -OR8, -BH2, -BHR8, -BR8R8, -B02H2, -B02R8R8, -PH2l -PHR8, -PR8R8, -POR8, -P02R8, -PO3R8, -SR8, -SOR8, -S02R8, -SONH2> -SONHR8, -SONR8R8, -S02NH2, -S02NHR8 y -S02NR8R8; cada R7 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbiio de 1 a 30 átomos de carbono; donde n de los átomos de hidrógeno o átomos de halógeno de R7 están sustituidos por un número igual de grupos W, seleccionados independientemente en cada ubicación; o dos grupos R7 adyacentes, junto con los carbonos de las posiciones 12 y 13 o de las posiciones 11 y 13, a las que están fijados, forman un grupo heterociclilo; cada R8 es independientemente un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbiio de 1 a 30 átomos de carbono; n está seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y X está seleccionado de -Br, -C I , -F e -I; o su sal o su solvato aceptables para uso farmacéutico, como un solo estereoisómero o como una mezcla de ellos; donde la cantidad es efectiva para tratar o prevenir condiciones asociadas con el sistema nervioso central (SNC) en el paciente.
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