ES2227522T3 - Compuestos aminoalquilo sustituidos. - Google Patents
Compuestos aminoalquilo sustituidos.Info
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Abstract
Compuestos que presentan la fórmula general: **(Fórmula)** incluyendo enantiómeros separados, diastereómeros, hidratos, sales, solvatos y mezclas de los mismos, en la que j es lo un número entero de uno a tres, la parte central es un residuo xantina y los compuestos presentan la fórmula general II **(Fórmula)** en la que R se selecciona de entre el grupo constituido por hidrógeno, átomos halógenos y grupos hidroxilo, amino, benzilo, alquilo (C1-6) o alquenilo con hasta 6 átomos de carbono no sustituidos o sustituidos por un grupo hidroxi, un átomo halógeno o un grupo dimetilamino y al menos un R presenta la fórmula general I: **(Fórmula)** en la que n es un número entero de cuatro a dieciocho; R¿1 y R¿2 son, independientemente, un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (C1-4) o alquenilo con hasta 4 átomos de carbono, opcionalmente interrumpido por un átomo de oxígeno y R¿3 y R¿4 son, independientemente, un átomo de hidrógeno o un grupo metílico con la condición de que R no sea un alquilaminoC6.
Description
Compuestos aminoalquilo sustituidos.
La invención proporciona una clase de compuestos
aminoalquilo sustituidos que son agentes efectivos para la
inhibición de señales celulares específicas con frecuencia
inducidas por estímulos nocivos o inflamatorios o como agentes
directa o indirectamente (estimulación inmunitaria) antimicrobianos
en las infecciones por levaduras o fúngicas. Más específicamente,
los compuestos de la invención tienen al menos un sustituyente que
contiene amina unido a una parte central. Los compuestos de la
invención son útiles antagonistas para el control de las
concentraciones intracelulares de ácidos fosfatídicos no araquinodil
sn-2 insaturados y los correspondientes
diacilgliceroles derivados del ácido fosfatídico que se producen en
respuesta a los estímulos celulares proliferativos.
La pentoxifilina
(1-(5-oxohexil)-3,7-dimetilxantina),
abreviadamente PTX y expuesta en los documentos de las patentes U.S.
nº 3.422.307 y nº 3.737.433, es un derivado de la xantina de amplia
utilización médica para el incremento del flujo sanguíneo. Los
metabolitos de la PTX han sido resumidos por Davis et al.,
Applied Environment Microbial. 48:327, 1984. Un metabolito, la
1-(5-hidroxihexil)-3,7-dimetilxantina,
designada M1 y expuesta en las patentes U.S. nº 4.515.795 y nº
4.576.947, incrementa el flujo sanguíneo cerebral. Además, las
patentes U.S. nº 4.833.146 y nº 5.039.666 exponen el uso de
alcoholes terciarios análogos de xantina para aumentar el flujo
sanguíneo cerebral. La patente U.S. nº 4.558.051 describe
composiciones farmacéuticas que comprenden xantinas y uno o más
agentes analgésicos o xantinas y un agente antiinflamatorio y
métodos para el uso de dichas composiciones para acelerar el inicio
de una respuesta antiinflamatoria o analgésica y para aumentar la
respuesta antiinflamatoria o analgésica.
La patente U.S. nº 4.636.507 expone que la PTX y
la M1 estimulan la quimiotaxis en los leucocitos polimorfonucleares
en respuesta a un estimulador de la quimiotaxis. La PTX y xantinas
sustituidas con alcohol terciario relacionadas afectan a la
quimiotaxis por inhibición de la actividad de ciertas citocinas
(patentes U.S. nº 4.965.271 y nº 5.096.906). La administración de
PTX y GM-CSF disminuye las concentraciones de
factor de necrosis tumoral (TNF) en los pacientes sometidos a
trasplante alogénico de médula ósea (Bianco et al., Blood
76: Suplemento 1 (522A), 1990). La disminución de las complicaciones
relacionadas con el trasplante de médula ósea acompañó a la
reducción de las concentraciones analizadas de TNF. Sin embargo, en
voluntarios normales, las concentraciones de TNF fueron superiores
entre los receptores de PTX. Por lo tanto, las elevadas
concentraciones de TNF no son la causa primaria de dichas
complicaciones.
Por consiguiente, existe una necesidad de
disponer de compuestos terapéuticos efectivos que sean seguros y
eficaces para su administración a seres humanos y animales y que
sean capaces de mantener la homeostasia celular ante una serie de
distintos estímulos inflamatorios. La invención es el resultado de
la investigación realizada para la búsqueda de tales
compuestos.
Los compuestos de la presente invención son
útiles en una amplia variedad de indicaciones terapéuticas para el
tratamiento o prevención de enfermedades mediadas por señales
intracelulares, a través de una o dos vías específicas de
señalización intracelular. Además, los compuestos de la invención y
las composiciones que contienen dichos compuestos son apropiados
para proporcionar dosis efectivas tras su administración a través
de las rutas habituales de administración de fármacos (por ejemplo,
parenteral, oral, tópica, etc.).
La invención proporciona compuestos de fórmula
general:
(R)j -
parte
central,
incluyendo los enantiómeros
separados, diastereómeros, hidratos, sales, disolventes y mezclas
de los mismos en los que j es un número entero de uno a tres, la
parte central es un residuo xantina y los compuestos tienen la
fórmula general
II
Preferentemente R, unido a los nitrógenos N_{3}
y N_{7} de la xantina se selecciona independientemente de entre
el grupo constituido por un átomo de hidrógeno, un grupo metilo,
átomos de flúor o cloro y un grupo amino.
R, se selecciona de entre el grupo constituido
por un átomo de hidrógeno, átomos halógenos (preferiblemente, bromo,
cloro, flúor y yodo), grupos hidroxilo, amino, bencilo, alquilo
(C_{1-6}, preferiblemente metilo) o alquenilo con
hasta 6 átomos de carbono, preferiblemente grupos alquilo o
alquenilo sustituidos por un grupo hidroxi, un átomo halógeno o un
grupo dimetilamino y al menos un R tiene la fórmula general I:
en la que n es un número entero
entre cuatro y dieciocho; R'_{1} y R'_{2} son,
independientemente, un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo
(C_{1-4}) o alquenilo con hasta 4 átomos de
carbono, y en la que los grupos alquilo o alquenilo son
preferiblemente interrumpidos por un átomo de oxígeno; y R'_{3} y
R'_{4} son, independientemente, un átomo de hidrógeno o un grupo
metilo, con la condición de que R no sea una alquilamina C_{6}.
Preferiblemente, n es un número entero entre cuatro y doce (más
preferiblemente entre seis y diez), R'_{1} y R'_{2} son,
independientemente átomos de hidrógeno o grupos metilo y R'_{3} y
R'_{4} son átomos de
hidrógeno.
Preferiblemente, R, unido a los nitrógenos
N_{3} y N_{7} de la xantina se seleccionan independientemente
del grupo constituido por un átomo de hidrógeno, un grupo metilo,
átomos de flúor o cloro y un grupo amino.
Preferiblemente, los ejemplos de sustituyentes R
que no tienen la fórmula I pueden incluir grupos metilo, etilo,
isopropilo, n-propilo, isobutilo,
n-butilo, t-butilo,
2-hidroxietilo, 3-hidroxipropilo,
3-hidroxi-n-butilo,
5-hidroxihexilo, 2-bromopropilo,
3-dimetilaminobutilo, 4-cloropentilo
y similares. Son sustituyentes particularmente preferidos de R los
grupos etilo, metilo o átomos de hidrógeno, más preferiblemente
grupos metilo y átomos de hidrógeno. Se ejemplifican los compuestos
preferidos de la invención.
Los compuestos de la invención pueden ser
proporcionados como mezclas de enantiómeros o diastereómeros o en
formas separadas o parcialmente separadas. Para la separación de
los isómeros ópticos se han utilizado procedimientos estándar.
Diferentes variantes de enantiómeros (por ejemplo, estereoisómeros y
formas quirales) de los compuestos de la invención pueden tener
diferentes actividades farmacológicas, basada en su capacidad para
inhibir PAPH y LPAAT. Un isómero óptico, sustancialmente exento del
correspondiente enantiómero y/o diastómeros, es al menos
aproximadamente el 85% de un isómero óptico relevante,
preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de isómero óptico
relevante y especialmente al menos aproximadamente el 99% o más de
isómero óptico relevante. Más preferiblemente, no serán detectables
otras formas ópticas.
Como ejemplo, los compuestos preferidos de la
invención incluyen enantiómeros R y S y mezclas racémicas de los
siguientes compuestos:
| CT1520 | 1-(5-aminohexil)-3,7-dimetilxantina |
| CT1520.1 | dímero de CT1520 |
| CT1548 | 1-(7-aminooctil)-3,7-dimetilxantina |
| CT1557 | 1-(5-metilaminohexil)-3,7-dimetilxantina |
| CT1558 | 1-(5-dimetilaminohexil)-3,7-dimetilxantina |
| CT3506 | 1-[5-(undecilamino)hexil]-3,7-dimetilxantina |
La invención también proporciona composiciones
farmacéuticas que contienen un producto de la invención y un
excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones
farmacéuticas pueden ser formuladas para su administración al
paciente por vía oral, parenteral, ocular o tópica.
La invención proporciona además composiciones
farmacéuticas que comprenden un compuesto según la invención y un
excipiente farmacéuticamente aceptable, siendo las composiciones
farmacéuticas formuladas para su administración al paciente por vía
oral, parenteral o tópica. Una composición farmacéutica puede,
alternativamente, comprender uno o varios compuestos de la invención
y un vehículo o excipiente farmacológicamente aceptable. El
tratamiento con un compuesto o composición farmacéutica de la
invención puede incluir el contacto con el compuesto de la
invención en cultivo in vitro, el tratamiento extracorporal
o la administración (oral, parenteral o tópica) del compuesto o
composición farmacéutica de la invención a un sujeto cuyas células
requieren tratamiento.
Los compuestos de la invención son fármacos
valiosos para el tratamiento de diversas enfermedades. Las
enfermedades se caracterizan, o pueden ser tratadas, por inhibición
de la respuesta inmunitaria o de una respuesta celular a estímulos
primarios, externos o in situ, estando dicha respuesta
celular mediada por un segundo mensajero específico basado en
fosfolípido que actúa adyacente a la capa interna de la membrana
celular. La vía del segundo mensajero es activada en respuesta a
diversos estímulos nocivos o proliferativos, característicos de
diversas formas de patología. Más específicamente, los compuestos
de la invención son útiles para el tratamiento o prevención de los
síntomas clínicos de diferentes enfermedades o para reducir la
toxicidad de otros tratamientos mediante la inhibición de la
señalización celular a través de la vía de un segundo mensajero que
implica la señalización por un ácido fosfatídico intermediario no
araquidónico.
Una enfermedad o toxicidad inducida por un
tratamiento se selecciona de entre el grupo constituido por: la
progresión tumoral en la que existe estimulación del flujo
sanguíneo por el tumor (angiogénesis) por producción de factor de
crecimiento fibroblástico (FGF), factor de crecimiento del endotelio
vascular (VEGF) o factor de crecimiento derivado de las plaquetas
(PDGF); la invasión tumoral y formación de metástasis por unión a
moléculas de adhesión expresadas por las células endoteliales
vasculares (VCAM e ICAM); la invasión tisular mediante la
producción de metaloproteasa tumoral como la MMP-9;
las enfermedades autoinmunitarias causadas por desregulación de los
sistemas inmunitarios de las células T o B, tratables mediante
supresión de las respuestas de las células T o B; las reacciones
alérgicas agudas, incluyendo, aunque sin limitarse, el asma y las
enfermedades inflamatorias crónicas mediadas por citocinas
proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF) y la
IL-1, y la artritis reumatoide, osteoartritis,
esclerosis múltiple o diabetes mellitas insulinodependiente (IDDM)
asociadas al incremento localizado de células inflamatorias y
secreción de citocinas inflamatorias y metaloproteasas; la
proliferación de células musculares lisas, células endoteliales,
fibroblastos y otros tipos celulares en respuesta a factores de
crecimiento como PDGF-AA, -BB, FGF, EGF, etc. (por
ejemplo, aterosclerosis, reestenosis, ictus y cardiopatía
coronaria); la activación del virus de la inmunodeficiencia humana
(SIDA y complejo relacionado con el SIDA); la demencia asociada a
la infección por el VIH; la proliferación de células mesangiales en
el riñón en respuesta a la IL-1,
MIP-I\alpha, PDGF ó FGF; la inflamación; la
toxicidad renal, glomerular o tubular en respuesta al tratamiento
con ciclosporina A o anfotericina B; la toxicidad de otros órganos
(por ejemplo, de la mucosa digestiva o pulmonar) en respuesta al
tratamiento citotóxico (por ejemplo, fármacos citotóxicos o
radiaciones); los efectos de los agentes alquilantes antitumorales;
la inflamación en respuesta a estímulos inflamatorios (por ejemplo,
TNF, IL-1 y similares) caracterizada por producción
de metaloproteasas o las alergias debidas a desgranulación de las
células cebadas y los basófilos en respuesta a la IgE o RANTES; las
enfermedades óseas causadas por hiperproducción del factor
activador de los osteoclastos (OAF) por los osteoclastos; las
enfermedades del SNC causadas por sobreestimulación por
neurotransmisores proinflamatorios como la acetilcolina, serotonina,
leuencefalina o glutamato; las enfermedades inflamatorias agudas
como el shock séptico, el síndrome de distrés respiratorio del
adulto, la disfunción multiorgánica asociada con la cascada de
citocinas inflamatorias y combinaciones de dichos procesos.
En muchos tipos celulares, la señalización
depende de la generación de una amplia variedad de especies de PA
no araquidonil, algunas de las cuales son generadas a partir de
liso-PA por la enzima liso-PA
aciltransferasa (LPAAT). La generación de cada una de estas
especies de PA (cuyas formas predominantes son compuestos
1-acil y 1-alquil
2-linoleoil PA, generados por la LPAAT) sirve para
efectuar la señalización proliferativa y/o inflamatoria en las
enfermedades mencionadas en los sistemas celulares descritos más
arriba.
Los compuestos de la invención tienen una
significación particular para la inhibición de la respuesta
proliferativa inducida por la IL-2. La inhibición de
la señalización por IL-2 es potencialmente útil en
numerosos procesos patológicos en los que existe activación e
hiperproliferación de células T. Son ejemplos de enfermedades
autoinmunitarias el lupus, la esclerodermia, la artritis
reumatoide, la esclerosis múltiple, la glomerulonefritis, la
diabetes mellitas insulinodependiente (IDDM) y también algunos
tumores malignos, incluyendo, sin limitarse a la misma, la leucemia
mieloide crónica y otros.
La Figura 1 muestra una reacción linfocitaria
mixta de PTX y tres compuestos de la invención CT1558
(N-(5-dimetilaminohexil)-3,7-dimetilxantina
racémica), CT1557
(N-(5-metilaminohexil)-3,7-dimetilxantina
racémica) y CT1548
(N-(7-aminooctil)-3,7-dimetilxantina
racémica). La reacción linfocitaria mixta muestra una respuesta
proliferativa de las PBMC (células mononucleares de la sangre
periférica) a la estimulación alogénica determinada en la reacción
linfocitaria mixta de tipo bidireccional. Todos los compuestos de la
invención analizados fueron más efectivos que la PTX en este
procedimiento analítico de la actividad inmunomoduladora.
La Figura 2 muestra una comparación de CT1558 y
ciclosporina A (CyA) con respecto a la reversibilidad en la reacción
linfocitaria mixta (MLR) y demuestra la capacidad de cada
compuesto para inhibir la respuesta proliferativa cuando el CT1558
o la CyA entraban en contacto con la célula, y la recuperación de la
respuesta proliferativa al retirar el fármaco. Los datos
presentados en la Figura 2 muestran que tanto el CT1558 como la CyA
disminuyen la respuesta proliferativa del cultivo mixto de
linfocitos. Sin embargo, tras más de 24 horas de tratamiento, la
inhibición producida por la CyA era irreversible en tanto que la
producida por el compuesto CT1558 era reversible.
La Figura 3 muestra el efecto del CT1520
(racemato de
(N-(5-aminohexil)-3,7-dimetilxantina)
y CT1548 para la protección de células L929 frente al tratamiento
con una concentración tóxica de TNF (factor de necrosis tumoral,
300 ng/ml). Para comparación, también se muestran los resultados
con PTX y otro compuesto. Los resultados más potentes se observaron
con CT1520 y CT1548. Este es un modelo predictor in vitro del
tratamiento y prevención del shock séptico.
La Figura 4 muestra los efectos del CT1558 y
CT1548 sobre la proliferación inducida por PDGF (factor de
crecimiento derivado de las plaquetas) de las células del estroma
de la médula ósea. La actividad de fondo era aproximadamente el 10%
de los valores control.
La Figura 5 muestra el efecto de CT1558 para
inhibir la proliferación de la línea celular B Ramos tras la
estimulación con anticuerpos anti-mu o PMA acetato
de forbol miristato. El compuesto CT1558 inhibió parte de la
respuesta proliferativa a los anticuerpos anti mu y PMA.
La Figura 6 muestra un análisis de la
proliferación de timocitos cuando son estimulados por Con A e
IL-1\alpha. Tanto CT1521 como Ct1558 inhibieron la
proliferación de los timocitos.
La Figura 7 muestra los efectos de la
1-[5-(undecilamino)hexil]-3,7-dimetilxantina]
sobre la proliferación de las células del estroma de la médula ósea
inducida por el PDGF.
La figura 8 muestra los efectos inhibidores de la
proliferación y activación linfocitaria mixta coestimulada con Con A
e IL-2, por el compuesto de la invención
1-[5-(undecilamino)hexil]-3,7-dimetilxantina].
Diferentes concentraciones del compuesto de la invención analizado
inhiben la proliferación y activación de los timocitos.
La invención proporciona un tipo de compuestos
capaces de controlar el comportamiento de las células mediante una
fase particular de un sistema de segundo mensajero (Bursten et
al., J. Biol. Chem. 266:20732, 1991). Los segundos mensajeros
son lípidos o fosfolípidos y se denominan con las siguientes
abreviaturas:
PE = fosfatidiletanolamina
LPE = lisofosfatidiletanolamina
PA = ácido fosfatídico
LPA = ácido lisofosfatídico
DAG = diacilglicerol
LPLD = lisofosfolipasa D
LPAAT = ácido lisofosfatídico aciltransferasa
PAPH = ácido fosfatídico fosfohidrolasa
PLA2 = fosfolipasa A-2
PLD = fosfolipasa D
PAA = ácido fosfoarquidónico
PLA-2 = fosfolipasa A2
PC = fosfatidilcolina
Vía cíclica PA "remodelada" = intermediarios
PAA, LPA, PA y DAG sustituidos con 1-saturado,
2-linoleoil o
1,2-dioleoil/1,2-sn-dilinoleoil
en las posiciones indicadas sn-1 y
sn-2.
"Vía clásica PI" = intermediarios PI, DAG,
PA sustituidos con cadenas laterales acilo graso
1-estearoil, 2-araquidonoil.
"PA generado por PLD" = intermediarios PE,
PC, LPA, PA y DAG sustituidos con, por ejemplo, cadenas laterales de
1,2-sn-dioleoil,
1-alquil, 2-linoleoil y
1-alquil, 2-docosahaexenoil.
La transferasa del ácido lisofosfatidico (LPAAT)
realiza la síntesis del ácido fosfatídico (PA) a partir del ácido
lisofosfatídico (LPA) mediante la incorporación de un grupo acilo
de la acil CoA. La hidrólisis de la parte fosfato por la PA
fosfohidrolasa (PAPH) da lugar a la formación de DAG. Estos
aspectos de la vía parecen ser activados inmediatamente (en un
minuto) después de la estimulación por un estímulo primario (por
ejemplo, una citocina como la IL-1,
IL-2 o TNF) que actúa sobre el receptor de la
superficie celular. Un efecto detectable inmediatamente es una
elevación de las concentraciones de PA y DAG. La administración de
los compuestos de la invención revierte esta elevación.
Los compuestos y composiciones farmacéuticas de
la invención incluyen inhibidores de subespecies de las enzimas
LPAAT y PAPH con especificidad de sustrato para los intermediarios
con subespecies 1,2-diinsaturadas, y
1-alquilo, 2-insaturadas. Un
ejemplo representativo de este tipo de inhibidor (aunque no del
tipo de los compuestos de la invención) es la PTX. La PTX bloquea la
PAPH en una vía específica de activación que no implica al PI sino
que deriva del PA y está en gran parte constituida por subespecies
1,2-diinsaturadas y 1-alquilo,
2-insaturadas. Esto ha sido demostrado, por ejemplo,
con la constatación de que las células mesangiales humanas
estimuladas con TNF producen DAG a partir de PI y generan PI en
ausencia y en presencia de PTX. En este último sistema no hay datos
para sugerir que el PA o el DAG deriven de fuentes distintas del PI.
Hay que subrayar que los compuestos de la invención afectan al
subgrupo de PAPH y LPAAT relacionado con sustratos con ácidos
grasos distintos de araquidonato en la posición
sn-2, no a las formas específicas de estas enzimas
de la vía del PI.
Cada subclase de fosfolípido de membrana (por
ejemplo, PA, PI, PE, PC y PS) alcanza un contenido estable de
cadenas laterales acilo graso debido a la remodelación cíclica de
la membrana plasmática así como al recambio de cada subclase. El PA
es con frecuencia estable pero está presente en cantidades
relativamente pequeñas. En las células en reposo el PA consta
principalmente de cadenas acilo saturadas, generalmente
constituidas por miristato, estearato y palmitato. En las células
en reposo, las cadenas acilo laterales del PC constan
principalmente de acil palmitato en la posición sn-1
y oleato en posición sn-2. PE y PI están
constituidos principalmente por sn-1 estearato y
sn-2 araquidonato.
Debido a este característico contenido en grupos
acilo en las posiciones sn-1 y
sn-2, el origen de cualquiera de las especies de PA
puede ser deducido de la naturaleza química de sus grupos acilo en
las posiciones sn-1 y sn-2. Por
ejemplo, si el PA deriva de la PC por la acción de la enzima PLD, el
PA contendrá las características cadenas laterales acilo graso del
sustrato PC pasado a través de la vía del segundo mensajero.
Además, el origen de cualquier especie de sustrato
1,2-sn puede ser diferenciado con respecto a su
origen. Sin embargo, es importante saber si la especie
fosfolipídica pasa por una forma PA antes de la hidrólisis a DAG.
Puede mostrarse el liso-PA es convertido en PA y
luego en DAG. La complejidad de la vía de este segundo mensajero
puede ser analizada mediante análisis adecuados de la química de las
cadenas laterales acilo (por ejemplo, cromatografía en capa fina,
cromatografía gas-líquido o cromatografía líquida
de alta presión) de los intermediarios en las células en diferentes
tiempos tras la estimulación de la vía del segundo mensajero.
En ciertas células mesenquimatosas, como los
neutrófilos y las células mesangiales de rata o humanas pueden
activarse varias vías de señalización, correlativamente,
simultáneamente, o de ambas formas. Por ejemplo, en los
neutrófilos, el
F-Met-Leu-Fe
estimula la formación de PA por la acción de la PLD, seguido de la
formación de DAG por la acción de la PAPH. Varios minutos después
se genera DAG a partir de PI por la vía clásica fosfoinositídica. En
muchas células, el DAG deriva del PA remodelado a través de un
ciclo en el que el PA es hidrolizado en sn-2 por la
PLA-2, seguido de la sn-2
transacetilación por la LPAAT, y mediante una vía de la PLD a
partir del PA generado de PE o PC, o de ambos sustratos por la
PLD.
La presente vía del segundo mensajero implica a
sustratos con ácidos grasos insaturados en la posición
sn-2 distintos del araquidonato y a las subespecies
de PAPH y LPAAT no implicadas en funciones celulares
"domésticas" normales que son parte de la vía PI clásica. Las
enzimas PAPH y LPAAT implicadas en la presente vía del segundo
mensajero son extremadamente estereoespecíficas de diferentes
cadenas laterales acilo y formas isoméricas de sustratos. Por lo
tanto, los compuestos de la invención son, preferible y
sustancialmente enantioméricamente puros.
La PTX bloquea (in vitro) la formación de
PA remodelado en la vía PA/DAG con altas concentraciones de PTX
(superiores a las que pueden alcanzarse en los pacientes son
efectos colaterales limitadores de la dosificación), mediante el
bloqueo de la formación de subespecies de PA por LPAAT. Incluso en
presencia de PTX, las células continúan formando PA por la acción
de PLD y también se forma DAG por la acción de la fosfolipasa C
sobre PC y PI. Las últimas vías no son inhibidas por los compuestos
de la invención ni por la PTX. En las células tratadas con PTX,
disminuye el DAG derivado del PA remodelado y generado por PLA (por
ejemplo, 1,2-sn-dioleoil DAG,
1-alquil, 2-linoleoil DAG y
1-alquil, 2-docosahexaneoil DAG).
Por lo tanto, los compuestos de la invención y la PTX inhiben la
formación sólo de ciertas especies de PA y DAG, inhibiendo
selectivamente una vía de segundo mensajero específica que sólo es
activada en las células por estímulos nocivos pero que no se
utiliza en las funciones celulares "domésticas" normales.
La inhibición específica de la activación de la
vía del segundo mensajero, tal como se ha descrito más arriba,
activada principalmente por diversos estímulos nocivos, sugiere que
los compuestos de la invención son de utilidad para el tratamiento
de una amplia variedad de indicaciones clínicas. Además, los datos
procedentes de estudios in vitro e in vivo aquí
presentados proporcionan datos predictores de la posibilidad de
tratamiento de una gran variedad de indicaciones clínicas con los
compuestos de la presente invención, que inhiben específicamente la
vía activada por estímulos nocivos y mediados, por ejemplo, por
citocinas inflamatorias, con efectos similares sobre la vía
específica del segundo mensajero. De hecho, el mecanismo de acción
de los compuestos de la invención explica porqué estos compuestos
tienen una amplia variedad de indicaciones clínicas.
La activación de la vía del segundo mensajero es
un importante mediador de la respuesta a estímulos nocivos y origina
señales celulares que dan lugar, por ejemplo, a inflamación aguda y
crónica, respuestas inmunitarias y al crecimiento de las células
tumorales. Sin embargo, no todos los inhibidores inhiben todas las
enzimas de esta vía de segundo mensajero. Aunque es deseable que los
compuestos de la invención puedan inhibir muchos otros estímulos
nocivos no mencionados, median de forma más efectiva las afecciones
anteriormente mencionadas. Las señales mediadas por la presente vía
de segundo mensajero comprenden, por ejemplo, las respuestas
celulares directamente al LPS, la activación de los linfocitos T
por antígenos, la activación de células B por antígenos, las
respuestas celulares a la IL-1 mediada a través del
receptor de IL-1 de tipo I (pero no del receptor de
IL-1 de tipo II), el receptor de TNF tipo I, el
crecimiento estimulado por transformaciones, incluyendo, aunque sin
limitarse a los mismos, los oncogenes activados (por ejemplo,
ras, abl, her 2-neu y
similares), la proliferación de las células musculares lisas por el
PDGF, b/FGF e IL-1; la estimulación de las células B
y T por IL-2, IL-4 o
IL-7 e IL-4 ó IL-6,
respectivamente y, de forma más general, la señalización por el
receptor de las células T.
In vitro, los compuestos de la invención:
(1) bloquean la transducción de señales IL-1 a
través del receptor de tipo I como se ha demostrado, por ejemplo,
por la inhibición de la inducción de la proliferación del músculo
liso, endotelios y células mesangiales renales estimuladas por
IL-1 e IL-1 más PDGF (factor de
crecimiento derivado de las plaquetas); (2) suprimen la regulación
por incremento de moléculas de adhesión, como se demuestra, por
ejemplo, por el bloqueo de la VCAM en las células endoteliales; (3)
inhibe las metaloproteasas inducidas por TNF, LPS e
IL-1 (un modelo de inflamación); (4) bloquea las
metaloproteasas inducidas por LPS, TNF o IL-1 y la
producción secundaria de citocinas (para la prevención y
tratamiento del shock séptico); (5) suprime la activación de las
células T y B por antígenos, por ejemplo, IL-2 e
IL-4; (6) inhibe la activación de las células
cebadas por la IgE; (7) son citotóxicos para las células
transformadas y líneas de células tumorales pero no para las células
normales; y (8) bloquean la señalización por IL-2,
IL-4, IL-6 e IL-7 en
las células B y T.
Los mencionados efectos in vitro dan lugar
a los siguientes efectos biológicos in vivo, incluyendo pero
sin limitarse, la protección y tratamiento del shock endotóxico y
la sepsis inducidos por las bacterias grampositivas o
gramnegativas, la inhibición del crecimiento tumoral, la
inmunodepresión sinérgica, la actividad en las enfermedades
autoinmunitarias y la supresión de las reacciones a los aloinjertos
y la estimulación del crecimiento del pelo mediante la reversión de
un proceso de apoptosis. Los compuestos de la invención son más
potentes cuando se utilizan como prevención y tratamiento del shock
séptico, en el tratamiento de las enfermedades inflamatorias agudas
y crónicas, en el tratamiento y prevención de las enfermedades
autoinmunitarias y para la estimulación del crecimiento del pelo
(en aplicación tópica).
Los compuestos de la invención también son útiles
como adyuvantes para la inhibición de los efectos colaterales
tóxicos de fármacos cuyos efectos colaterales están mediados por la
vía del presente segundo mensajero. Las metaloproteasas median
lesiones titulares como las enfermedades glomerulares del riñón, la
destrucción articular en la artritis y la destrucción del tejido
pulmonar en el enfisema e intervienen en las metástasis tumorales.
Tres ejemplos de metaloproteasas son una gelatinasa de tipo V de 92
kD inducida por TNF, IL-1 y PDGF más bFGF, una
colagenasa de tipo IV, de 72 kD que habitualmente es constitutiva e
inducida por TNF o IL-1 y una
estromelisina/PUMP-1 inducida por TNF e
IL-1. Los compuestos de la invención pueden inhibir
la inducción por el TNF o la IL-1 de la
metaloproteasa inducible por gelatinasa de tipo V de 92 kD. Además,
los compuestos de la invención pueden reducir la actividad de
PUMP-1 inducida por 100 U/ml de
IL-1. En consecuencia, los compuestos de la
invención previenen la inducción de ciertas metaloproteasas
inducidas por IL-1 ó TNF y no están implicados con
las proteasas producidas de forma constitutiva (por ejemplo, la
colagenasa de tipo IV de 72 kD) que intervienen en la remodelación
tisular normal.
Los compuestos de la invención inhiben la
transducción de señales mediadas por el receptor de
IL-1 de tipo I y, por lo tanto, se consideran
antagonistas de IL-1. Un artículo reciente de
revisión, titulado "The Role of Interleukin-1 in
Disease" (Dinarello and Wolff N. Engl. J. Med. 328, 106,
enero 14, 1993) describe el papel de la IL-1 como
"un determinante importante, rápido y directo de la
enfermedad". "Por ejemplo, en el shock séptico, la
IL-1 actúa directamente sobre los vasos sanguíneos
induciendo vasodilatación mediante la rápida producción de factor
activador de las plaquetas y óxido nítrico en tanto que en las
enfermedades autoinmunitarias actúa estimulando a otras células a
producir citocinas y enzimas que posteriormente actúan sobre el
tejido diana". El artículo describe un grupo de enfermedades
mediadas por la IL-1, incluyendo el síndrome
séptico, la artritis reumatoide, la enfermedad inflamatoria
intestinal, la leucemia mieloide aguda, la diabetes
insulinodependiente, la aterosclerosis y otras enfermedades como el
rechazo de los injertos, la enfermedad del injerto contra el
huésped (GVHD), la psoriasis, el asma, la osteoporosis, la
enfermedad periodontal, la tiroiditis autoinmunitaria, la hepatitis
alcohólica, el parto prematuro secundario a infecciones uterinas e
incluso trastornos del sueño. Como los compuestos de la invención
inhiben la señalización celular a través del receptor de
IL-1 de tipo I y son antagonistas de
IL-1, son útiles para el tratamiento de todos los
trastornos anteriormente mencionados.
Por ejemplo, en el síndrome séptico, el mecanismo
del shock inducido por la IL.1 parece ser la capacidad de la
IL-1 para incrementar las concentraciones
plasmáticas de pequeñas moléculas mediadoras como el factor
activador de las plaquetas, las prostaglandinas y el óxido nítrico.
Estas sustancias son potentes vasodilatadores e inducen shock
séptico en los animales de experimentación. El bloqueo de la acción
de la IL-1 previene la síntesis y secreción de estos
mediadores. En los animales, una inyección intravenosa única de
IL-1 disminuye la presión arterial, la resistencia
vascular periférica e induce leucopenia y trombocitopenia. En el
hombre, la administración intravenosa de IL-1
también disminuye rápidamente la presión arterial y las dosis de
300 ng, o superiores, por kilo de peso pueden causar intensa
hipotensión. La ventaja terapéutica del bloqueo de la acción de la
IL-1 reside en la prevención de sus deletéreos
efectos biológicos sin interferir con la producción de moléculas que
intervienen en la homeostasis. Los compuestos de la presente
invención están dirigidos a la necesidad identificada por Dinarello
y Wolf ya que inhiben la señalización celular sólo a través del
receptor de IL-I de tipo I y no a través del
receptor de IL-1 de tipo II.
Con respecto a la artritis reumatoide, Dinarello
y Wolff señalan "la interleucina-1 está presente
en el revestimiento y en el líquido sinovial de los pacientes con
artritis reumatoide y los explantes de tejido sinovial de los
pacientes producen IL-1 in vitro. Las
inyecciones intraarticulares de interleucina-1 a
los animales inducen infiltración leucocitaria, destrucción del
cartílago y remodelación ósea periarticular. En el cartílago y
células óseas aislados, la interleucina-1 induce
in vitro la expresión de genes de las colagenasas,
fosfolipasas y ciclooxigenasas y el bloqueo de esta acción reduce
la artritis inducida por las paredes celulares bacterianas en la
rata". Por lo tanto, los compuestos de la invención, como
antagonistas de la IL-1, son útiles para la
prevención y el tratamiento de la artritis reumatoide.
Con respecto a la enfermedad inflamatoria
intestinal, la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn se
caracterizan por lesiones infiltrativas del intestino que contienen
neutrófilos y macrófagos activados. La IL-1 puede
estimular la producción de eicosanoides inflamatorios como la
prostaglandina E_{2} (PGE_{2}) y leucotrieno B_{4}
(LTB_{4}) e IL-8, una citocina inflamatoria con
propiedades de quimioatracción y estimuladoras de los neutrófilos.
En los pacientes con colitis ulcerosa las concentraciones titulares
de PGE_{2} y LTB_{4} se correlacionan con la gravedad de la
enfermedad y las concentraciones titulares de IL-1
e IL-8 están elevadas en los pacientes con
enfermedad inflamatoria intestinal. Por consiguiente, un antagonista
de la IL-1, como los compuestos de la invención,
sería efectivo para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria
intestinal.
En cuanto a la leucemia mieloide aguda y crónica,
hay cada vez más datos de que la IL-1 actúa como
factor de crecimiento de dichas células tumorales. Por lo tanto,
los compuestos de la invención deben ser efectivos para prevenir el
agravamiento de la enfermedad en las leucemias agudas y
crónicas.
La diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM)
es considerada una enfermedad autoinmunitaria con destrucción de las
células beta de los islotes de Langerhans mediada por células
inmunocompetentes. Los islotes de los animales con IDDM espontánea
(por ejemplo, ratas BB o ratones NOD) contienen células
inflamatorias que contienen IL-1. Por lo tanto, los
compuestos de la invención deben ser útiles para la prevención y
tratamiento de la DMID.
La IL-1 también interviene en el
desarrollo de la aterosclerosis. Las células endoteliales son dianas
de la IL-1. La IL-1 estimula la
proliferación de las células musculares lisas de los vasos. Las
células espumosas aisladas de las placas grasas arteriales de los
conejos hipercolesterolémicos contienen IL-1\beta
y ARN mensajero de IL-1\beta. La captación de
monocitos de la sangre periférica da lugar a la iniciación de la
producción de IL-1 por dichas células. La
IL-1 también estimula la producción de PDGF. En
conjunto, estos datos indican que la IL-1
interviene en el desarrollo de las lesiones ateroscleróticas. Por lo
tanto, un antagonista de la IL-1, como los
compuestos de la invención, debe ser de utilidad para la prevención
y tratamiento de la aterosclerosis.
La IL-1 activa (a través del
receptor de IL-1 de tipo I) una
liso-PA aciltransferasa (LPAAT) y una fosfatidato
fosfohidrolasa dentro de los 5 segundos siguientes a la exposición
de las células (por ejemplo, células mesangiales humanas, HMC) a
esta citocina. La activación de ambas enzimas da lugar a la
producción de especies de PA con grupos acilo insaturados
sn-1 y sn-2, con la mayoría de
cadenas acilo sn-2 poliinsaturadas. Tanto la
IL-1 como un producto de la LPAAT, el
1,2-sn dilinoleoil PA, activan una vía de
señalización que implica la hidrólisis del PE a PA. Esta reacción se
sigue de desfosforilación del PA para producir especies
1,2-sn-diacilglicerol y
1-O-alquil o
1-O-alquenilacilglicerol (AAG). Los
compuestos de la invención ejercen su actividad mediante la
inhibición de una o ambas enzimas en la capa interna de la membrana
plasmática. Por lo tanto, el modelo in vitro apropiado para
medir la actividad del fármaco es medir la inhibición de la
estimulación causada por una citocina proinflamatoria u otra señal
inflamatoria celular.
La generación de la fracción PA
sn-2 insaturada por la LPAAT sirve para activar
proteínas G o actúa directamente sobre la PLD mediante la alteración
de su microambiente lipídico. La activación de la LPAAT y generación
de estas especies PA sn-insaturadas es una vía
sensible a la energía de la PLD. Esto proporciona un mecanismo
para un sistema limitado de receptores para amplificar la señal y
generar una respuesta celular mediante la rápida síntesis de
pequeñas cantidades de PA. La captación de PA diinsaturado, que es
aproximadamente <0,1% del total de la masa lipídica de la
membrana, es suficiente para activar la actividad de la PLD. La
cuantía de PA es similar a la sintetizada endógenamente por la
LPAAT. La PLD estimulada por el PA actúa sobre la PE, que debe
estar localizada en la capa interna de la membrana celular, que
está enriquecida en PE en comparación con la capa externa. Por lo
tanto, la respuesta inflamatoria a la IL-1 es
mediada por la vía: IL-1R \rightarrow PA
\rightarrow (PAD) \rightarrow PE. En tanto que la respuesta en
las localizaciones titulares es: lisoPA \rightarrow PI
\rightarrow PKC \rightarrow (PLD) \rightarrow PC. Las especies
de PLD suelen ser isoenzimas diferentes. La vía de segundo mensajero
cuya activación es inhibida por los compuestos de la invención no
es una vía derivada del PI y no implica a la PKC en el curso de la
inhibición. La PKC es activada de forma aguda por el DAG derivado
del PI pero la activación crónica (por ejemplo, > 30 minutos) es
mantenida por el PA derivado de la PC, generada por PLD dirigida a
PC. Por tanto, la vía inhibida por los compuestos de la invención
está dirigida a la PE y no a la PC. Además, la PLD dirigida a la PE
favorece a los sustratos con instauración de cadena larga
sn-2.
La DAG y el PA están incrementados en las células
transformadas oncogénicamente. Por ejemplo, las mutaciones
activadoras de ras dan lugar a incremento de la generación
de DAG tras la estimulación con mitógenos aunque las fuentes de DAG
son diferentes en distintos sistemas experimentales. En las células
mesangiales renales no transformadas, la estimulación por
IL-1\beta incrementa la activación de
PLA-2 y LPAAT, dando lugar a la generación de PA
sn-2 insaturado e hidrólisis posterior a DAG por la
fosfatidato fosfohidrolasa. La transformación ras de células
NIH/3T3 incrementa la generación de DAG y PA estimulada por el
suero. La especie específica de DAG que es estimulada por el suero
es dioleoil y para PA son dilinoleoil y dioleoil. Esta regulación
por incremento ocurre durante 4-12 horas y el
pretratamiento de las células con un compuesto de la invención o
PTX bloquea la generación de estos segundos mensajeros
fosfolípidos. La inhibición ocurre por supresión de la generación de
PA de novo, a partir de la lisoPA o por inhibición de una o
ambas rutas del ciclo de Lands. El incremento coordinado de lisoPA
en el contexto de disminución de la producción de PA/DAG sugiere
inhibición de la transacilación de un lípido precursor. Por lo
tanto, la transformación ras media la regulación por
incremento del PA mediante la estimulación indirecta de PLA2 y/o
LPAAT. Los compuestos de la invención inhiben la conversión de la
lisoPA incrementada a PA y subsiguientemente bloquean los cambios
fenotípicos inducidos por PA/DAG en la membrana.
La capacidad de los compuestos de la invención
para inhibir la generación de fosfolípidos saturados e insaturados
se refleja por la capacidad de los mismos para inhibir la
proliferación y tumorigenicidad de las células con transformación
ras, in vitro e in vivo. La PTX inhibe a las
células NIH/3T3 con transformación ras más que a las células
parentales. Esta inhibición es reversible y no se asocia a una
significativa toxicidad.
La producción excesiva o no regulada de TNF
(factor de necrosis tumoral) está implicada en la mediación o
exacerbación de ciertas enfermedades como la artritis reumatoide,
la espondilitis reumatoide, la osteoartritis, la artritis gotosa y
otras afecciones artríticas; en la sepsis, el shock séptico, el
shock endotóxico, las sepsis por gramnegativos, el síndrome de
shock tóxico, el distrés respiratorio del adulto, la malaria
cerebral, la enfermedad pulmonar inflamatoria crónica, la
silicosis, la sarcoidosis pulmonar, las enfermedades con
reabsorción ósea, las lesiones por reperfusión, la reacción de
injerto contra huésped, el rechazo de los injertos, la fiebre, las
mialgias debidas a infecciones como la influenza, la caquexia
secundaria a las infecciones, el SIDA o los tumores malignos, el
SIDA, otras infecciones víricas (por ejemplo, por CMV, influenza,
adenovirus, la familia de los herpes), la formación de queloides,
la formación del tejido cicatricial, la enfermedad de Crohn, la
colitis ulcerosa o la fiebre. Los compuestos de la invención o sus
sales farmacéuticamente aceptables pueden utilizarse para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o
terapéutico de cualquier enfermedad humana o de otros mamíferos,
exacerbada o señalada por la vía de un segundo mensajero basado en
fosfolípidos celulares (como se ha expuesto aquí) y por una
producción excesiva, o regulada por incremento, de citocinas
inflamatorias "primer mensajero", tales como el TNF ó la
IL-1. Con respecto a la señalización por el TNF
como primer mensajero, hay diversas enfermedades en las que la
producción excesiva, o regulada por incremento, del TNF por los
monocitos/macrófagos está implicada en la exacerbación o causalidad
de las mismas. Entre estas enfermedades están las enfermedades
neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la endotoxemia
o síndrome de shock tóxico (Tracey et al., Nature 330:662,
1987 y Hinshaw et al., Circ. Shock 30:279, 1990); la
caquexia (Dezube et al., Lancet 355:662, 1990) y el síndrome
de distrés respiratorio del adulto (Miller et al., Lancet
2(8665):712, 1989). Los compuestos de la invención pueden
utilizarse tópicamente para las profilaxis de las enfermedades
tópicas mediadas o exacerbadas por la producción excesiva de TNF o
IL-1, como las infecciones víricas (herpes o
conjuntivitis víricas), la psoriasis, las infecciones por hongos o
levaduras (tiña, pie de atleta, vaginitis, caspa, etc.) y otras
alteraciones hiperproliferativas cutáneas. Las concentraciones
elevadas de TNF han sido implicadas en los ataques agudos de la
malaria (Grau et al., N. Engl. J. Med. 320:1585, 1989), en
las enfermedades pulmonares inflamatorias crónicas, como la
silicosis y la asbestosis (Piguet et al., Nature 344:245,
1990 y Bissonnette et al., Inflammation 13:329, 1989) y en
las lesiones de reperfusión (Vedder et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87:2643, 1990).
Además, los compuestos de la invención pueden
utilizarse para el mantenimiento de la homeostasis en las células
que han contactado con el estímulo primario, para mitigar los
efectos de estos estímulos primarios sobre las vías de señalización
secundarias, invocados en unos segundos tras un estímulo primario.
Por ejemplo, la administración de un compuesto de la invención in
vivo o ex vivo proporciona un método para modificar el
comportamiento celular que comprende el contacto de las células
(in vivo o ex vivo) cuyo comportamiento ha de ser
modificado con una cantidad efectiva de un compuesto de la
invención o de una composición farmacéutica que lo contenga para:
(1) inhibir la proliferación de las células tumorales si la cuantía
es suficiente para inhibir dicha proliferación; (2) inhibir la
activación de las células T, por antígenos o por
IL-2, si la cuantía es suficiente para promover
inhibir dicha activación; inhibir la activación de los
monocitos/macrófagos por endotoxinas, TNF, IL-1 o
GM-CSF si la cuantía es suficiente para inhibir
dicha activación; (4) inhibir la producción de anticuerpos por las
células B en respuesta a un antígeno, IL-4 o
ligando CD40, si la cuantía es suficiente para inhibir dicha
producción de anticuerpos; (5) inhibir la proliferación de las
células musculares lisas en respuesta a factores de crecimiento
capaces de estimular dicha proliferación; (6) disminuir la
resistencia vascular periférica conferida por las células
endoteliales si la cuantía es suficiente para reducir la secreción
de sustancias inductoras de hipertensión; (7) disminuir la
resistencia vascular periférica conferida por las células
endoteliales si la cuantía es suficiente para incrementar la
secreción de sustancias antihipertensoras; (8) disminuir la
expresión de moléculas de adhesión inducida por estimuladores de
las mismas si la cuantía es suficiente para inhibir dicha expresión;
(9) inhibir la activación de las células T y macrófagos por el VIH
si la cuantía es suficiente para inhibir dicha activación,
inhibiendo así la replicación vírica; (10) inhibir la proliferación
de las células mesangiales renales en respuesta a la estimulación
por IL-1 y/o MIP-1\alpha y/o PDGF
y/o FGF si la cuantía es suficiente para inhibir dicha
proliferación; (11) aumentar la resistencia de las células
glomerulares o tubulares a la ciclosporina A o a la anfotericina B
si la cuantía es suficiente para aumentar dicha resistencia; (12)
prevenir la secreción de MIP-1\alpha por los
monocitos y macrófagos estimulados por IL-1, TNF o
endotoxina; (13) prevenir la secreción de factor activador de las
plaquetas por los megacariocitos, células fibroblásticas y
macrófagos tratados con IL-1, TNF o endotoxina;
(14) prevenir la regulación por disminución de los receptores de
citocinas TNF en las células progenitoras hematopoyéticas si la
cuantía es suficiente para prevenir la mencionada regulación por
disminución; (15) inhibir la producción de metaloproteasas por las
células epiteliales glomerulares o las células sinoviales
estimuladas por IL-1 o TNF si la cuantía es
suficiente para disminuir incrementar dicha producción; (16)
incrementar la resistencia de las células epiteliales pulmonares o
del tubo digestivo frente a los fármacos citotóxicos si la cuantía
es suficiente para incrementar dicha resistencia; (17) incrementar
el efecto antitumoral de los agentes antitumorales no alquilantes
si la cuantía es suficiente para incrementar dicho efecto; (18)
inhibir la producción de factor activador de los osteoclastos en
respuesta a la IL-1 si la cuantía es suficiente
para inhibir dicha producción; (19) inhibir la desgranulación en
respuesta a la IgE si la cuantía es suficiente para inhibir dicha
desgranulación; (20) incrementar la secreción de los
neurotransmisores adrenérgicos dopamina, norepinefrina o epinefrina
o el neurotransmisor acetilcolina si la cuantía es suficiente para
incrementar dicha secreción; (21) modular los efectos de
"corriente lenta" postsináptica de los neurotransmisores
adrenérgicos dopamina, epinefrina o norepinefrina o del
neurotransmisor acetilcolina si la cuantía es suficiente para
modular dichas corrientes lentas; (22) inhibir la señalización por
neurotransmisores incluyendo la acetilcolina, la leuencefalina y la
serotonina; o (23) incrementar el umbral para las convulsiones.
Los compuestos de la invención pueden inhibir
in vivo ciertos efectos del VEGF (factor de crecimiento
endotelial vascular), FGF (factor de crecimiento fibroblástico) y
PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas), tales como
la inhibición de la angiogénesis y las reestenosis. Por ejemplo,
Ferns et al., (Science 253:1129, 1991) han mostrado
inhibición de la quimiotaxis y angioplastia del músculo liso de la
neoíntima en ratas usando un anticuerpo neutralizante anti PDGF.
Además, Jawien et al., (J. Clin. Invest. 89:507, 1992) han
demostrado que el PDGF promueve la migración del músculo liso y el
engrosamiento de la íntima en un modelo de angioplastia con balón en
ratas. La inhibición por los compuestos de la invención de los
efectos mediados por PDGF tras la angioplastia con balón es el
fundamento farmacológico para usar los compuestos de la invención
como agentes terapéuticos para prevenir la reestenosis. Los
compuestos de la invención también inhiben la aterogénesis porque
los elevados valores de PDGF expresados por los macrófagos se
asocian con todas las fases de la aterogénesis (Ross et al.,
Science 248:1009, 1990). Además, muchos tumores humanos
expresan valores elevados de PDGF, FGF, receptores de FGF o PDGF u
oncogenes celulares mutados con gran homología con estos factores
de crecimiento o sus receptores. Por ejemplo, dichas líneas
celulares tumorales incluyen líneas de células de sarcoma (Leveen
et al., Int. J. Cancer 46:1066, 1990), células de melanoma
metastático (Yamanishi et al., Cancer Res. 52:5024, 1992) y
tumores gliales (Fleming et al., Cancer Res. 52:4550,
1992).
Por tanto, los compuestos de la invención también
son útiles para elevar el umbral de las convulsiones, para
estabilizar las sinapsis frente a las neurotoxinas como la
estricnina, para potenciar el efecto de los fármacos
antiparkinsonianos, como la L-dopa, para potenciar
los efectos de los compuestos para el sueño, para aliviar los
trastornos de la motilidad resultantes de la administración de
tranquilizantes y para disminuir o prevenir la hiperexcitabilidad
asociada a la muerte neural progresiva tras accidentes vasculares
cerebrales como el ictus. Además, los compuestos de la invención son
útiles en el tratamiento de la depresión con déficit de
norepinefrina y en las depresiones asociadas a la secreción de
glucocorticoides endógenos, para prevenir la toxicidad del sistema
nervioso central de la dexametasona o metilprednisolona y para el
tratamiento del dolor crónico sin adición al fármaco. También son
útiles los compuestos de la invención para el tratamiento de los
niños con déficit de atención y del aprendizaje y generalmente
mejoran la memoria de los sujetos con déficit orgánicos, incluyendo
a los pacientes con enfermedad de Alzheimer.
Para medir los efectos de los compuestos de la
invención en la modulación de la actividad inmunitaria y su
actividad antitumoral se pueden utilizar diversos análisis in
vitro usando distintos tipos celulares. Por ejemplo, una
reacción linfocitaria mixta (MLR) proporciona una útil herramienta
de detección para determinar la actividad biológica de cada uno de
los compuestos de la invención. En la MLR, se obtienen
mononucleares de la sangre periférica (PBMC) extrayendo sangre a
voluntarios sanos en un envase heparinizado y se diluye con un
volumen igual de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Esta
mezcla se deposita en un gradiente de densidad de sacarosa, como el
gradiente de Ficoll-Hypaque® (densidad 1,08) y se
centrifuga a 1.000 g durante 25 minutos, a la temperatura ambiente
o inferior. Los PBMC forman una banda en la interfase
plasma-Ficoll; se separan y se lavan al menos dos
veces con una solución salina como HBSS. Los hematíes que puedan
contaminar se lisan, por ejemplo con ACK durante 10 minutos a 37ºC y
se lavan dos veces en HBSS los PBMC. El "pellet" de PBMC
purificados se resuspende en un medio completo como RPMI 1640
adicionado con suero humano inactivado al 20%. La respuesta
proliferativa de los PBMC a la estimulación alogénica se determina
en una MLR bidireccional que se realiza en una placa de
microtitulación de 96 pocillos. Brevemente, se cultivan
aproximadamente 10^{5} células PBMC purificadas en 200 \mul de
medio completo, conjuntamente con aproximadamente 10^{5} PBMC
autólogos (cultivo control) o alogénicos (cultivo estimulado),
procediendo las células alogénicas de individuos HLA diferentes. Se
añaden dosis diversas de los compuestos (fármacos) al poner las
células en los pocillos de la placa de microtitulación. Se incuban
los cultivos durante 6 días a 37ºC en atmósfera con CO_{2} al 5%.
Al concluir la incubación se añade timidina tritiada (por ejemplo,
1\muCi/pocillo de 40 a 60 Ci/mmol) y se determina la proliferación
mediante contador de centelleo líquido.
Otro método para medir la actividad de los
compuestos de la invención implica la determinación de la respuesta
proliferativa a PDGF, FGF o VEGF usando células de ratón
NIH-3T3 Balb o células derivadas del estroma humano.
Las células del estroma de la médula ósea humana se siembran (por
ejemplo, aproximadamente 2.000 células por pocillo) en un medio
definido (por ejemplo 69% de McCoy, 12,5% de suero de ternera
fetal, 12,5% de suero de caballo, 1% de antibióticos, 1% de
glutamina, 1% de suplemento vitamínico, 0,8% de aminoácidos
esenciales, 1% de piruvato sódico, 1% de bicarbonato sódico, 0,4%
de aminoácidos no esenciales y 0,36% de hidrocortisona). De dos a
tres días después se recolectan las células en un medio exento de
suero. Veinticuatro horas después se tratan las células con un
agente estimulante como PDGF-AA,
PDGF-BB o FGF básico (factor de crecimiento
fibroblástico), con o sin IL-1\alpha o TNF, y
timidina tritiada. La proliferación celular se determina en un
contador de centelleo líquido.
El análisis de la proliferación de las células B
determina el efecto de los compuestos de la invención sobre la
inhibición de la proliferación de las células B estimuladas por un
anticuerpo anti mu (40 \mug/ml), IL-4 o PMA (2,5
nM). Para medir la inhibición de la proliferación celular causada
por el agente estimulador se incuban las células tumorales B Ramos
o los esplenocitos murinos con un agente estimulador, un compuesto
de la invención y timidina tritiada.
Hemos visto que los compuestos de la invención
son útiles en una amplia variedad de indicaciones terapéuticas para
modular las enfermedades por señalización intracelular a través de
una o dos vías de señalización intracelular específicas. Además,
los compuestos y composiciones de la invención son adecuados por
las vías normales de administración de agentes terapéuticos (por
ejemplo, parenteral, oral, ocular, tópica, etc.).
Los compuestos de la invención también pueden
disminuir los valores elevados relevantes de PA y DAG resultantes de
la estimulación de los sinaptosomas con acetilcolina y/o epinefrina.
Esto sugiere que los efectos de los compuestos de la invención
aumentan la secreción de los neurotransmisores inhibidores como la
dopamina y modulan los efectos de "corriente lenta" distal de
tales neurotransmisores.
Aunque las dosis son variables, la eficacia
terapéutica se logra cuando los compuestos de la invención se
administran en dosis efectivas subletales, orales, parenterales o
intravenosas, de unos 50 a 5.000 mg al día, aproximadamente,
dependiendo del peso del paciente. Un régimen particularmente
preferido para el tratamiento de la leucemia consiste en
4-50 mg/kg de peso corporal. Sin embargo, hay que
entender, que en cualquier individuo en particular, el régimen
específico debe ajustarse a las necesidades del individuo y al
juicio profesional de la persona que administra o supervisa la
administración de los compuestos de la invención.
La formulación farmacéutica adecuada dependerá de
la naturaleza de la afección a tratar, de la naturaleza del
medicamento elegido y del juicio del médico que atiende al
paciente. En general, los compuestos de la invención están
formulados para su administración en inyectables o por vía oral,
aunque pueden emplearse otras formas de administración, como las
vías transmucosa o transdérmica. Se pueden encontrar formulaciones
adecuadas de estos compuestos, por ejemplo, en Remington's
Pharmaceutical Sciences (última edición), Mack Publishing
Company, Easton, PA.
Los compuestos de la invención y sus sales
farmacéuticamente aceptables pueden ser utilizados en una amplia
variedad de formas farmacéuticas. La preparación de una sal
farmacéuticamente aceptable está determinada por la naturaleza
química del propio compuesto y puede ser preparada mediante las
técnicas convencionales disponibles. Así pues, si se utiliza un
vehículo sólido, la preparación puede ser tableteada, colocada en
cápsulas de gelatina dura, en polvo, o "pellet" o en forma de
pastillas para chupar. La cantidad de vehículo sólido variará
ampliamente pero preferiblemente oscilará entre 25 mg y 1 gramo, en
el que la cantidad del compuesto de la invención por dosis puede
variar entre aproximadamente 25 g a aproximadamente 1 gramo para un
adulto. Cuando se utiliza un vehículo líquido, la preparación puede
ser en forma de jarabe, emulsión, cápsula de gelatina blanda,
líquido estéril inyectable, como en ampollas o suspensiones líquidas
no acuosas. Cuando la composición está en forma de cápsula, es
apropiada cualquier forma rutinaria de encapsulación, por ejemplo,
usando los vehículos anteriormente mencionados con una cápsula de
gelatina dura. Cuando la composición está en forma de gelatina
blanda, puede considerarse cualquier vehículo farmacéutico
utilizado rutinariamente para preparar suspensiones o dispersiones,
por ejemplo, gomas acuosas, celulosas, silicatos o aceites que se
introducen en cápsulas de gelatina dura. La formulación en jarabe
generalmente consiste en una suspensión o solución del compuesto, o
de una de sus sales, en un vehículo líquido (por ejemplo, etanol,
polietilenglicol (macrogol), aceite de coco, glicerina o agua) con
un agente saborizante o colorante.
La cantidad requerida del compuesto de la
invención para obtener un efecto terapéutico en administración
tópica dependerá, lógicamente, del compuesto elegido, de la
naturaleza y gravedad de la enfermedad y del juicio del médico. La
vía parenteral comprende la administración intravenosa,
intramuscular, subcutánea, intranasal, rectal, intravaginal o
intraperitoneal. Las formas de dosificación apropiadas para dicha
administración pueden preparase mediante las técnicas
convencionales. Una composición parenteral típica consiste en una
solución o suspensión del compuesto de la invención, o de una de sus
sales, en un vehículo estéril o no acuoso que contenga
opcionalmente un aceite aceptable para la vía parenteral, por
ejemplo macrogol, pilivinilpirrolidona, lecitina, aceite de
cacahuete o aceite de sésamo. La dosificación diaria por vía
parenteral, adecuada para el tratamiento de la sepsis u otras
afecciones inflamatorias graves oscila entre 0,001 mg/kg y 40 mg/kg,
aproximadamente, preferiblemente entre 0,01 mg/kg y 20 mg/kg,
aproximadamente, de un compuesto de la invención o de una de sus
sales farmacéuticamente aceptables, calculada como base libre.
Los compuestos de la invención pueden ser
administrados por vía oral. El régimen de dosificación diaria
adecuado para la administración oral oscila entre 0,1 mg/kg y 1.000
mg/kg, aproximadamente. Para la administración, la dosificación
adecuada oscila entre 0,001 mg/kg a 40 mg/kg, aproximadamente, del
compuesto de la invención o de una de sus sales farmacéuticamente
aceptable, calculado como base libre. El ingrediente activo puede
ser administrado de 1 a 6 veces al día, suficiente para mostrar
actividad.
Los compuestos de la invención pueden ser
administrados mediante inhalaciones (por ejemplo, por vía nasal u
oral). Las formas de dosificación adecuadas comprenden los
aerosoles o los inhaladores dosificados, preparados según las
técnicas convencionales. La dosis diaria adecuada oscila entre 0,001
mg/kg y 40 mg/kg, aproximadamente, del compuesto de la invención o
de una de sus sales farmacéuticamente aceptables, calculado como
base libre. Los compuestos típicos para inhalación están en forma
de solución, suspensión o emulsión que pueden ser administrados como
polvo seco o como aerosol, usando un propulsor convencional.
Ilustran la invención los siguientes ejemplos,
que en modo alguno deben ser considerados como limitadores. En estos
ejemplos PTX significa pentoxifilina.
Este ejemplo ilustra un método de síntesis de
1-(5-aminohexil)-3,7-dimetilxantina
(CT1520). Para preparar CT1520 se siguió el método descrito en
Koziara and Zwierzak, Tetrahedron Letters
28:6513-6516, 1097. Resumiendo, se añadió gota a
gota eterato de trifluoruro bórico (0,06 mol), a
10-30ºC a una solución agitada de
1-(5-hidroxihexil)-3,7-
dimetilxantina (0,05 mol) y trimetilsililazida (0,06 mol) en pentano
(50 ml). Tras 24 horas a la temperatura ambiente, se volcó la
mezcla en 100 ml de agua. Se separó la fase orgánica, se lavó con
una solución de bicarbonato de sodio al 10% y se secó sobre sulfato
de sodio. La solución de la azida en el pentano se agitó a
25-30ºC y se añadieron 0,05 moles de fosfito
trietílico. Se continuó la agitación durante 6 horas y se mantuvo
la solución a esta temperatura durante 72 horas. Se evaporó el
disolvente, se disolvió el iminofosforano en etanol (15 ml) y se
trató con ácido paratoluensulfónico monohidrato (0,05 moles) y agua
(0,05 moles). Se llevó la mezcla a reflujo durante ocho horas, se
evaporó y se diluyó el residuo con 100 ml de éter. La sal tosilato
de la amina se precipitó y se recuperó mediante filtración. A
continuación, se añadió hidróxido amónico acuoso al 30% (20 ml) a
los cristales y se extrajo la amina libre en diclorometano (3 x 15
ml), se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó el disolvente para
obtener la amina libre como un aceite viscoso, 0,7 g, con un
rendimiento del 50%.
Otro método para síntetizar CT1520 comienza con
una solución de PTX (Sigma, 1,39 g, 5,0 mmoles) en metanol (50 ml).
Se añadió acetato de amonio (3,85 g, 50 mmoles) y se agitó durante
cinco minutos. Se añadió cianoborohidruro de sodio (0,64 g, 10
mmoles) a esta solución, seguido de tamiz molecular de 3\ring{A}
(5 g) y se agitó esta mezcla durante 24 horas. Se filtró la mezcla
de reacción para separar los sólidos. Se lavaron los sólidos con
diclorometano (50 ml) y se lavó el filtrado con agua (50 ml). La
fase acuosa se trató con una solución saturada de cloruro amónico
(25 ml), se agitó durante 15 minutos y se añadió luego una solución
de hidróxido amónico al 30% (20 ml) para hacer básica la fase
acuosa. Se extrajo la fase acuosa básica con etanol/diclorometano al
25% (3 x 35 ml). Los extractos combinados se secaron con sulfato
magnésico. Se evaporó el disolvente bajo presión reducida para
obtener el producto en forma de un aceite viscoso (0,95 g, 3,41
mmoles, 68% de rendimiento).
Este ejemplo ilustra un método para la síntesis
de
1-(7'-aminooctil)-3,7-dimetilxantina
(CT1548). Se utilizó
8-bromo-2-octanona
para alquilar la posición N_{1} de la teobromina, como se describe
en el Ejemplo 1. La
1-(2-octanona)-3,7-dimetilxantina
resultante (5 mmol) se disolvió en 50 ml de metanol. Se añadió
acetato de amonio (50 mmoles) y se agitó la mezcla durante 5
minutos, aireando en una campana. Se añadió cianoborohidruro de
sodio (10 mmoles), seguido de tamiz molecular de 3 \ring{A} (3
cucharadas). Tras 24 horas de agitación, se filtró la mezcla por
gravedad y se lavaron los sólidos con 50 ml de diclorometano. Los
filtrados combinados se lavaron con 50 ml de agua, se secaron con
sulfato sódico y se evaporó el disolvente bajo presión reducida. Se
trató el residuo con clorhídrico al 5% (25 ml) y se extrajo con
éter (2 x 20 ml). Se trató la capa acuosa con una solución saturada
de cloruro amónico (20 ml) y se agitó durante 15 minutos. A
continuación se añadió hidróxido amónico acuoso al 30% (30 ml) y se
extrajo la solución con etanol/diclorometano al 25% (3 x 35 ml). Se
secaron sobre sulfato magnésico los extractos combinados y los
disolventes se evaporaron bajo presión reducida, obteniéndose 1,02
g, 3,4 mmoles, con 68% de rendimiento de un aceite viscoso.
Otro método para sintetizar CT1548 comienza con
una suspensión de NaH (580 mg, 24,2 mmoles) en DMSO (100 ml) y
añadiendo teobromina (3,96 g, 22,0 mmoles). Al cabo de 30 minutos
se añadió
8-bromo-1-octeno
(3,96 g, 22,0 mmoles) y se agitó la mezcla de reacción durante 16
horas a 25ºC. Se volcó la mezcla de reacción sobre 200 ml de agua y
se extrajo con diclorometano (3 x 50 ml). Se combinaron las partes
orgánicas, se lavó con solución salina (50 ml), se secaron
(sulfato de sodio) y se evaporó para obtener
1-(7'-octenil)-3,7-metilxantina
como un aceite blanco y espeso que se solidificó al reposar (6,22
g, 97%). Se agitaron en 5 ml de agua/6 ml de ácido sulfúrico durante
16 horas dos gramos (6,89 mmoles) de
1-(7'-octenil)-3,7-metilxantina.
Se añadió agua a la mezcla (100 ml) y se realizó una extracción con
diclorometano (3 x 50 ml). Se combinaron las fases orgánicas, se
secaron (MgSO_{4}) y se evaporaron obteniéndose
1-(7'-hidroxioctil)-3,7-dimetilxantina
en forma de un aceite que se solidificó al reposar (1,80 g, 85% de
rendimiento). Se añadió
1-(7'-hidroxioctil)-3,7-dimetilxantina
(1,92 g, 6,22 mmoles) en 10 ml de diclorometano a una solución de
2,2'-clorocromato de bipiridinio (2,73 g, 9,34 mM)
en diclorometano (60 ml)). Se agitó la mezcla de reacción durante
16 horas y se añadió Celite® (1 g). Se filtró la mezcla de reacción
a través de un filtro de Celite y se evaporó el filtrado hasta
obtener un residuo. Se recristalizó el residuo en
diclorometano/éter para obtener 1,52 g de
(7'-oxooctil)-3,7-dimetilxantina
como un producto sólido ligeramente amarillento, con un rendimiento
del 80%. Se agitaron durante 5 minutos la
7'-oxooctil)-3,7-dimetilxantina
(192 mg, 0,63 mmoles), acetato de amonio (438 mg, 6,3 mmoles) y
tamiz molecular de 4 \ring{A} (1 g) y se añadió N_{2}BH_{3}CN
(79 mg, 1,26 mmoles). Se agitó la mezcla de reacción durante 16
horas y se filtró para separar el tamiz molecular. Se lavó la mezcla
de reacción con diclorometano para eliminar todos los subproductos.
Se trató la capa acuosa con NH_{4}Cl acuoso saturado (25 ml) y
NH_{4}OH concentrado (10 ml). Se extrajo la mezcla con
etanol/diclorometano al 25% (3 x 20 ml). Se combinaron las fases
orgánicas, se secaron (MgSO_{4}) y se evaporaron, obteniéndose
CT1548 (mezcla racémica) como un aceite purpúreo que se solidificó
lentamente al reposar (80 mg, 42% de rendimiento).
Este ejemplo ilustra un método para la síntesis
de
1-(5-metilaminohexil)-3,7-dimetilxantina
(CT1557). Se añadió una solución de PTX (2,0 g, 7,2 mmoles) en
metanol (50 ml) a clorhidrato de metilamina (4,85 g, 72 mmoles) y
se agitó durante 5 minutos. Se añadió cianobromohidruro de sodio
(0,9 g, 14,4 mmoles) y esta solución y se agitó durante 48 horas.
Se trató la solución con una solución saturada de cloruro de amonio
(70 ml), se agitó durante 1 minuto y se añadió una solución acuosa
de hidróxido amónico al 28% (100 ml). Se extrajo la solución con
diclorometano (3 x 50 ml) y se secaron (sulfato magnésico) los
extractos combinados. Se evaporó el disolvente obteniéndose el
producto como un aceite viscoso (2,08 g, 7,10 mmoles), 98% de
rendimiento).
Este ejemplo ilustra un método para la síntesis
de
1-(5-dimetilaminohexil)-3,7-dimetilxantina
(CT1558). Se añadió una solución de PTX (2,0 g, 7,2 mmoles) en
metanol (50 ml) a clorhidrato de dimetilamina (5,86 g, 72 mmoles) y
se agitó durante 5 minutos. Se añadió cianobromohidruro de sodio
(0,9 g, 14,4 mmoles) a esta solución y se agitó durante 42 horas. Se
trató la solución con una solución saturada de cloruro de amonio
(70 ml), se agitó durante 1 minuto y se añadió una solución acuosa
de hidróxido amónico al 28% (50 ml). Se extrajo la solución con
diclorometano (3 x 40 ml), se lavaron los extractos combinados con
agua (30 ml) y se secaron (sulfato magnésico). Se evaporó el
disolvente bajo presión reducida obteniéndose el producto como un
aceite viscoso (2,20 g, 7,10 mmoles), 99% de rendimiento).
Este ejemplo ilustra los efectos de CT1558,
CT1557 y CT1548 sobre la respuesta proliferativa de las PBMC a la
estimulación alogénica, determinada en una reacción linfocitaria
mixta bidireccional. A continuación se describe el procedimiento de
la reacción linfocitaria mixta bidireccional. Resumiendo, se
cocultivan en 200 \mul de medio completo 10^{5} PBMC con
10^{5} células alogénicas. Los cultivos de control autólogos
producen recuentos inferiores a 1.000. El fármaco se añade al mismo
tiempo que las células. Se incuban los cultivos durante 6 días y se
marcan con timidina tritiada para medir la proliferación celular. En
este análisis, todos los compuestos de la invención fueron más
eficientes que la PTX en la modulación de la actividad inmunitaria
(Figura 1).
Este ejemplo ilustra los efectos reversibles del
producto CT1558 y la ciclosporina A (CyA) en un cultivo mixto de
linfocitos reversible. Este análisis compara la capacidad de cada
fármaco para inhibir la respuesta proliferativa cuando el fármaco
entra en contacto con las células y la reanudación de la respuesta
proliferativa tras la retirada del fármaco. Los cultivos fueron
tratados con 350 \mug de CT1558 ó 3,3 \mug/ml de ciclosporina A,
continuamente, durante 6 días antes de pulsar con timidina
tritiada. Alternativamente, los cultivos fueron tratados con el
fármaco durante 24, 48, 72 ó 96 horas antes del lavado y
resuspensión en un medio exento de fármaco y luego pulsados con
timidina tritiada. Los resultados de la Figura 2 indican que el
CT1558 y la CyA disminuyen la respuesta proliferativa. Sin embargo,
la inhibición llevada a cabo por la CyA es irreversible en tanto
que la producida por el CT1558 es reversible.
Este ejemplo ilustra los efectos protectores de
CT1520, CT1548, CT1521 y PTX sobre las células L929 de ratón de los
efectos citotóxicos del TNF. Este procedimiento es un modelo in
vitro de shock séptico. Las células LA929 (10^{5}/pocillo)
fueron tratadas con 300 ng/ml de TNF humano, con o sin el fármaco
(añadido una hora antes que el TNF) en las concentraciones mostradas
en la Figura 3. Un día después se tiñeron las células para analizar
su viabilidad, usando BCECF y fluorescencia, con un lector de
fluorescencia de placas Millipore. Los resultados mostrados en la
Figura 3 ilustran los efectos citoprotectores más potentes
observados con CT1520 y CT1548.
Este ejemplo ilustra los efectos de CT1548,
CT1558 sobre la inhibición de la proliferación de las células del
estroma de la médula ósea humana inducida por PDGF. Las células del
estroma de la médula ósea humana se mantuvieron en medio exento de
suero durante 24 horas y a continuación fueron estimuladas con 50
ng/ml de PDGF-BB. Se añadieron diversas
concentraciones de los fármacos una hora antes de la estimulación
con el PDGF. Se añadió timidina tritiada en el momento de la
estimulación con el PDGF y se esperó a su incorporación por las
células durante 24 horas. Se recolectaron las células y se midió la
proliferación celular (Figura 4). Las cuentas del fondo (células en
medio de cultivo exento de suero) fueron aproximadamente el 10% de
los valores control.
Este ejemplo ilustra los efectos inhibidores del
CT1558 (250 \mumoles) sobre la proliferación de células B. Se
trataron células B Ramos con CT1558 durante una hora antes de su
estimulación con anticuerpo anti mu o PMA (5 nM). Un día después se
marcaron las células con timidina tritiada y se determinó la
proliferación (Figura 5). El CT1558 inhibía la respuesta
proliferativa.
Este ejemplo ilustra los efectos del CT1521 y el
CT1558 sobre la proliferación de los timocitos estimulados por
IL-1 o Con A. Los datos se muestran en la Figura 6.
Los fármacos se añadieron 2 horas antes de la estimulación. Ambos
fármacos inhibieron la proliferación de los timocitos.
Este ejemplo ilustra un método para la síntesis
de 1-[5-(undecilamino)hexil]dimetilxantina. Se
agitaron durante 50 minutos una mezcla de teobromina (1,0 g, 5,5
nmoles), de Sigma) e hidruro de sodio en aceite al 50% (264 mg, 5,5
mmoles) y dimetilsulfóxido (20 ml), tras lo cual se añadió
6-bromo-1-hexanol
(1,0 g, 5,5 mmoles, de Aldrich). Tras agitar durante 18 horas, se
trató la solución con agua (50 ml) y posteriormente se realizó una
extracción con dos alícuotas de 25 ml de hexano. Se extrajo la fase
acuosa con etanol/diclorometano al 25% (3 x 35 ml) y los extractos
en etanol/diclorometano combinados se secaron sobre sulfato de
magnesio. Se evaporaron los disolventes bajo presión reducida. El
dimetilsulfóxido restante se eliminó por destilación bajo un vacío
de 1 Torr (1 mmHg) para obtener así 1,4 g de
1-(6-hidroxihexil)-3,7-dimetilxantina
(91% de rendimiento) en forma de polvo blanco.
Se añadió lentamente dimetilsulfóxido (156 ml,
172 mg, 2,2 mmoles) a una solución de cloruro de oxalilo (103 ml,
150 mg, 1,2 mmoles) en diclorometano (5 ml) a -78ºC. Se añadió una
solución de
1-(6-hidroxihexil)-3,7-dimetilxantina
(300 mg, 1,1 mmoles) en cloruro de metileno (5 ml), seguido de
agitación durante 15 minutos. Se retiró el baño frío tras la
adición de trietilenamina (765 ml, 555 mg, 5,5 mmoles). A la
temperatura ambiente se añadió la reacción a 20 ml de agua y se
extrajo con cloruro de metileno (3 x 50 ml). Se combinaron las capas
orgánicas y se lavó con solución acuosa de ácido clorhídrico al 1%
(20 ml), bicarbonato de sodio saturado (20 ml) y solución salina
(20 ml) y a continuación se secó sobre sulfato de sodio. La
evaporación del disolvente y recristalización del residuo en
cloroformo/éter de petróleo proporcionó 267 mg de
1-(6-oxohexil)-3,7-dimetilxantina
(87% de rendimiento).
Se añadió cianoborohidruro de sodio (63 mg, 1,0
mmoles) a una mezcla de
1-(6-oxohexil)-3,7-dimetilxantina
(150 mg, 0,5 mmoles), undecilamina (0,43 ml, 2,5 mmoles), solución
acuosa de ácido clorhídrico al 38% (0,2 ml, 2,5 mmoles), metanol (5
ml) y tetrahidrofurano (5 ml). La mezcla resultante se agitó durante
48 horas. Se añadió solución acuosa saturada de cloruro amónico (20
ml) a la mezcla agitada, seguido de agitación adicional durante 20
minutos y adición de solución acuosa de hidróxido amónico al 30%
(30 ml). Se extrajo la mezcla con metanol/diclorometano al 25% (3 x
35 ml) y se secaron los extractos combinados sobre sulfato de
sodio. Se evaporaron los disolventes bajo presión reducida,
obteniéndose 190 mg de
1-[5-undecilamino)hexil]-3,7-dimetilxantina
(86% de rendimiento).
Este ejemplo muestra los efectos de la
1-[5(-undecilamino)hexil]-3,7-dimetilxantina
sobre la proliferación inducida por PDGF de las células del estroma
de la médula ósea. Como en el ejemplo 9, las células del estroma de
la médula ósea se mantuvieron en un medio carente de suero durante
24 horas y a continuación fueron estimuladas con 50 ng/ml de
PDGF-BB. Se añadieron diferentes concentraciones de
los fármacos una hora antes de la estimulación con el PDGF. La
timidina tritiada se añadió al tiempo de la estimulación con el PDGF
y se permitió la incorporación por las células durante 24 horas. Se
recolectaron las células y se midió la proliferación celular con un
fondo de cuentas (es decir, el de las células del medio de cultivo
carente de suero) aproximadamente del 10% de los valores control.
La Figura 7 ilustra la inhibición de la proliferación inducida por
el PDGF por diferentes concentraciones (\muM) de los compuestos
de la invención.
Este ejemplo muestra el efecto inhibidor de
diferentes concentraciones (IC50) del compuesto de la invención
1-[5-(undecilamino)hexil]-3,7-dimetilxantina
sobre la activación y proliferación de timocitos murinos
coestimulados con concanavalina A (Con A) e
interleucina-2 alfa (IL-2). La Con
A, usada para activar los linfocitos CD3, junto a la coestimulación
con IL-2 induce la proliferación y diferenciación
de las células T.
Las glándulas tímicas obtenidas de ratones Balb/C
normales se fragmentaron y se sembraron en placas de 96 pocillos con
una densidad de 2 x 10^{5} células por pocillo. Se añadió a los
pocillos Con A (0,25 mg/ml) e IL-2 (15 U/ml). Se
incubaron las células durante 4 días a 37ºC. El día 4 se incorporó
la timidina tritiada y se incubó durante 4 horas adicionales. La
timidina tritiada incorporada se determinó en un contador de
centelleo líquido. Las dosis de los fármacos se añadieron dos horas
antes de la activación con Con A e IL-2 (mostrado
en la Figura 8, \muM). Las cuentas del fondo fueron inferiores a
200 cpm. Los compuestos de la invención analizados inhibieron la
activación y proliferación de los timocitos en concentraciones
relativamente bajas, con un valor de IC50 de 2,3 \muM.
Claims (5)
1. Compuestos que presentan la fórmula
general:
(R)_{j}-(parte
central),
incluyendo enantiómeros separados,
diastereómeros, hidratos, sales, solvatos y mezclas de los mismos,
en la que j es un número entero de uno a tres, la parte central es
un residuo xantina y los compuestos presentan la fórmula general
II
en la que R se selecciona de entre
el grupo constituido por hidrógeno, átomos halógenos y grupos
hidroxilo, amino, benzilo, alquilo (C_{1-6}) o
alquenilo con hasta 6 átomos de carbono no sustituidos o
sustituidos por un grupo hidroxi, un átomo halógeno o un grupo
dimetilamino y al menos un R presenta la fórmula general
I:
en la que n es un número entero de
cuatro a dieciocho; R'_{1} y R'_{2} son, independientemente, un
átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (C_{1-4}) o
alquenilo con hasta 4 átomos de carbono, opcionalmente interrumpido
por un átomo de oxígeno y R'_{3} y R'_{4} son,
independientemente, un átomo de hidrógeno o un grupo
metílico
con la condición de que R no sea un
alquilamino
C_{6}.
2. Compuestos según la reivindicación 1, en los
que el grupo alquilo o alquenilo R'_{1} y R'_{2} está
interrumpido por un átomo de oxígeno.
3. Compuestos según las reivindicaciones 1 ó 2,
en los que n es un número entero comprendido entre cuatro y
doce.
4. Compuestos según las reivindicaciones 1 ó 2,
en los que R'_{1} y R'_{2} son, independientemente, átomos de
hidrógeno o grupos metilo.
5. Composición farmacéutica que contiene un
compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un
vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
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