DE69333632T2

DE69333632T2 - Substituierte aminoalkylverbindungen

Info

Publication number: DE69333632T2
Application number: DE69333632T
Authority: DE
Inventors: Peter J. Klein; E. Gail UNDERINER; J. Alistair LEIGH
Original assignee: Cell Therapeutics Inc
Current assignee: Cell Therapeutics Inc
Priority date: 1992-11-09
Filing date: 1993-11-09
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2013-11-10
Also published as: PT623133E; CA2117377A1; CA2117377C; JPH07503486A; ATE277049T1; WO1994011370A1; DE69333632D1; US5340813A; EP0623133A4; DK0623133T3; EP0623133B1; EP0623133A1; AU5551594A; ES2227522T3; EP1460074A1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die Erfindung stellt eine Klasse von substituierten Aminoalkylverbindungen bereit, die wirksame Mittel zum Inhibieren spezifischer zellulärer Signalvorgänge, die oft durch gesundheitsschädliche oder inflammatorische Stimuli induziert werden, sind oder direkt oder indirekt (Immunstimulation) antimikrobiotisch gegenüber Hefe- oder Pilzinfektionen sind. Insbesondere weisen die erfindungsgemäßen Verbindungen mindestens einen aminhaltigen Substituenten auf, der an eine Kerngruppe gebunden ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind geeignete Antagonisten zum Steuern von intrazellulären Mengen an spezifischen nicht arachidonylartigen sn-2 ungesättigten Phosphatidsäuren und entsprechenden Phosphatidsäure-abgeleiteten Diacylglycerinen, die in Reaktion auf zelluläre proliferative Stimuli auftreten.
Stand der Technik
Pentoxifyllin (1-(5-Oxohexyl)-3,7-dimethylxanthin), das als PTX abgekürzt wird und in US-PSen 3,422,307 und 3,737,433 beschrieben ist, ist ein Xanthin-Derivat, das eine weit verbreitete medizinische Verwendung für die Erhöhung des Blutflusses erfahren hat. Metabolite von PTX wurden in Davis et al., Applied Environment Microbial., 48: 327, 1984, zusammengefasst. Ein solcher Metabolit, 1-(5-Hydroxyhexyl)-3,7-dimethylxanthin, der als M1 bezeichnet wird und in den US-PSen 4,515,795 und 4,576,947 beschrieben ist, erhöht den zerebralen Blutfluss. Zusätzlich beschreiben die US-PSen 4,833,146 und 5,039,666 die Verwendung von tertiärer Alkohol-Analoga von Xanthin zum Verbessern des zerebralen Blutflusses. Die US-PS 4,558,051 beschreibt pharmazeutische Zusammensetzungen, die Xanthine und ein oder mehrere analgetische Mittel oder Xanthine oder ein antiinflammatorisches Mittel umfassen, und Verfahren zum Verwenden der Zusammensetzungen, um den Beginn einer analgetischen oder antiinflammatorischen Reaktion zu beschleunigen und eine analgetische oder antiinflammatorische Reaktion zu verbessern.
Die US-PS 4,636,507 beschreibt, dass PTX und M1 die Chemotaxis in polymorphnukleären Leukozyten in Reaktion auf einen Chemotaxisstimulator stimulieren. PTX und Verwandte mit einem tertiären Alkohol substituierte Xanthine inhibieren die Aktivität von bestimmten Cytokinen, um die Chemotaxis zu beeinflussen ( US-PS 4,965,271 und US-PS 5,096,906 ). Eine Verabreichung von PTX und GM-CSF vermindert Mengen an Tumornekrosefaktor (TNF) in Patienten, die eine allogene Knochenmarkstransplantation durchlaufen (Bianco et al., Blood 76: Supplement 1 (522A), 1990). Eine Verminderung hinsichtlich von mit Knochenmarkstransplantation verbundenen Komplikationen begleitete eine Verminderung von messbaren Mengen an TNF. Jedoch waren in normalen Freiwilligen die TNF-Mengen höher unter PTX-Empfängern. Folglich sind erhöhte Mengen an TNF nicht die Hauptursache solcher Komplikationen.
Folglich werden wirksame therapeutische Verbindungen, die sicher und für eine menschliche oder tierische Verabreichung wirksam sind und die eine zelluläre Homöostase im Hinblick auf eine Vielzahl von inflammatorischen Stimuli beibehalten können, benötigt. Die Erfindung ist ein Ergebnis einer Forschung, die auf der Suche nach solchen Verbindungen erfolgte.
Zusammenfassung der Erfindung
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind bei einer großen Vielzahl von therapeutischen Indikationen zum Behandeln oder Verhindern von Erkrankungen geeignet, die durch intrazelluläres Signalisieren über einen oder zwei spezifische intrazelluläre Signalwege vermittelt werden. Zusätzlich sind die erfindungsgemäßen Verbindungen Zusammensetzungen, die diese Verbindungen enthalten, für normale Wege einer therapeutischen Verabreichung (z. B. parenteral, oral, topisch, etc.) zum Bereitstellen von wirksamen Dosen geeignet.
Erfindungsgemäß werden Verbindungen der allgemeinen Formel: (R)j – (Kerngruppe) bereitgestellt, einschließlich von getrennten Enantiomeren, Diastereomeren, Hydraten, Salzen, Solvaten und Gemischen davon, wobei j eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, die Kerngruppe ein Xanthinrest ist und die Verbindungen die allgemeine Formel II:
aufweisen, R aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Wasserstoffatom, Halogenatomen (vorzugsweise Brom-, Chlor-, Fluor- und Iodatom), Hydroxyl-, Amino-, Benzyl-, Alkyl-(C_1-6, vorzugsweise Methyl-) oder Alkenylgruppen mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, wobei die Alkyl- oder Alkenylgruppen vorzugsweise durch eine Hydroxygruppe, ein Halogenatom oder eine Dimethylaminogruppe substituiert sind, und mindestens eine R-Gruppe die allgemeine Formel I:
aufweist, worin n eine ganze Zahl von 4 bis 18 ist, jede R'₁- und R'₂-Gruppe unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkyl-(C_1-4) oder Alkenylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ist, wobei die Alkyl- oder Alkenylgruppen vorzugsweise durch ein Sauerstoffatom unterbrochen sind, und jede R'₃- und R'₄-Gruppe unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe ist, mit der Maßgabe, dass R keine C₆-Alkylaminogruppe ist. Vorzugsweise ist n eine ganze Zahl von 4 bis 12 (mehr bevorzugt 6 bis 10), R'₁ und R'₂ sind unabhängig voneinander Wasserstoffatome oder Methylgruppen und R'₃ und R'₄ sind Wasserstoffatome. Vorzugsweise sind die R-Gruppen, die an die N₃- und an die N₇-Xanthin-Stickstoffatome gebunden sind, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einer Methylgruppe, Fluor-, Chloratomen und einer Aminogruppe.
Vorzugsweise können beispielhafte R-Substituenten, die nicht die Formel I aufweisen, Methyl-, Ethyl-, Isopropyl-, n-Propyl-, Isobutyl-, n-Butyl-, t-Butyl-, 2-Hydroxyethyl-, 3-Hydroxypropyl-, 3-Hydroxy-n-butyl-, 5-Hydroxyhexyl-, 2- Brompropyl-, 3-Dimethylaminobutyl-, 4-Chlorpentylgruppen und dergleichen umfassen. Besonders bevorzugte R-Substituenten sind Ethyl-, Methylgruppen oder Wasserstoffatome, am meisten bevorzugt Methylgruppen und Wasserstoffatome. Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind hierin veranschaulicht.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als enantiomere oder diastereomere Gemische oder in getrennten oder teilweise getrennten Formen bereitgestellt werden. Standardverfahren werden zum Auftrennen von optischen Isomeren verwendet. Unterschiedliche enantiomere Varianten (z. B. Stereoisomere und chirale Formen) der erfindungsgemäßen Verbindungen können unterschiedliche Arzneimittelaktivitäten aufweisen, basierend auf deren unterschiedliche Fähigkeit, PAPH und LPAAT zu inhibieren. Ein optisches Isomer, das im Wesentlichen frei von dem entsprechenden Enantiomer und/oder Diastereomeren ist, ist mindestens etwa 85% eines relevanten optischen Isomers, vorzugsweise mindestens etwa 95% des relevanten optischen Isomers und insbesondere mindestens etwa 99% oder mehr des relevanten optischen Isomers. Am meisten bevorzugt ist eine Menge anderer optischer Formen nicht nachweisbar.

Beispielhaft umfassen bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sowohl R- als auch S-Enantiomere und racemische Gemische der nachstehenden Verbindungen:

CT1520	1-(5-Aminohexyl)-3,7-dimethylxanthin
CT1520.1	Dimer von CT 1520
CT1548	1-(7-Aminooctyl)-3,7-dimethylxanthin
CT1557	1-(5-Methylaminohexyl)-3,7-dimethylxanthin
CT1558	1-(5-Dimethylaminohexyl)-3,7-dimethylxanthin
CT3506	1-[5-(Undecylamino)hexyl]-3,7-dimethylxanthin

Erfindungsgemäß werden auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die eine erfindungsgemäße Verbindung und ein pharmazeutisch verträgliches Exzipienz umfassen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können für eine orale, parenterale, okulare oder topische Verabreichung an einen Patienten formuliert werden.
Erfindungsgemäß werden ferner pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die eine erfindungsgemäße Verbindung und ein pharmazeutisch verträgliches Exzipienz umfassen, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung für eine orale, parenterale oder topische Verabreichung an einen Patienten formuliert ist. Eine pharmazeutische Zusammensetzung kann alternativ eine oder eine Vielzahl von erfindungsgemäßen Verbindungen und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Exzipienz umfassen. Eine Behandlung mit einer erfindungsgemäßen Verbindung oder pharmazeutischen Zusammensetzung kann ein In-Kontakt-Bringen mit der erfindungsgemäßen Verbindung einer in vitro-Kultur, in einer extrakorporalen Behandlung oder durch Verabreichen (oral, parenteral oder topisch) der erfindungsgemäßen Verbindung oder pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten, dessen Zellen behandelt werden sollen, umfassen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind wertvolle Arzneimittel zum Behandeln eines Individuums mit einer Vielzahl von Erkrankungen. Die Erkrankung ist dadurch charakterisiert oder kann dadurch behandelt werden, dass eine Immunreaktion oder eine zelluläre Reaktion auf externe oder in situ Hauptstimuli inhibiert wird, wobei die zelluläre Reaktion über einen spezifischen zweiten Botenstoff auf Phospholipidbasis vermittelt wird, der zu einer inneren Schicht einer Zellmembran benachbart ist. Der zweite Botenstoff-Weg wird in Reaktion auf verschiedene gesundheitsschädliche oder proliferative Stimuli, die charakteristisch für eine Vielzahl von Erkrankungsstadien sind, aktiviert. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zum Behandeln oder Verhindern von klinischen Symptomen verschiedener Erkrankungsstadien oder zum Vermindern der Toxizität anderer Behandlungen durch Inhibieren einer zellulären Signalgebung über einen zweiten Botenstoff-Weg geeignet, der eine Signalgebung über eine nicht arachidonylartige Phosphatidsäure-Zwischenverbindung beinhaltet.
Ein Erkrankungszustand oder eine Behandlungs-induzierte Toxizität ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Tumorprogression, was eine Tumorstimulation einer Blutzufuhr (Angiogenese) durch Produktion von Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF), vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) oder von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF) beinhaltet, Tumorinvasion und Bildung von Metastasen über eine Bindung eines Adhäsionsmoleküls, das von vaskulären Endothelzellen exprimiert wird (VCAM und ICAM), Gewebsinvasion über eine Produktion von Tumormetalloprotease wie MMP-9, Autoimmunerkrankungen, die durch Dysregulation der T-Zell- oder B-Zell-Immunsysteme verursacht werden und durch Suppression der T-Zell- oder B-Zell-Reaktionen behandelbar sind, akute allergische Reaktionen einschließlich, in nicht begrenzender Weise, Asthma und chronischer inflammatorischer Erkrankungen, die durch proinflammatorische Cytokine, einschließlich Tumornekrosefaktor (TNF) und IL-1, vermittelt werden, und rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Multiple Sklerose oder Insulin-abhängiger Diabetes mellitus (IDDM), verbunden mit einer erhöhten Lokalisierung von inflammatorischen Zellen und Freisetzung von inflammatorischen Cytokinen und Metalloproteasen, Proliferation von glatten Muskelzellen, Endothelzellen, Fibroblasten und anderen Zelltypen in Reaktion auf Wachstumsfaktoren wie PDGF-AA, -BB, FGF, EGF, etc. (d. h. Atherosklerose, Restenose, Schlaganfall und koronare Arterienerkrankung), Aktivierung einer Infektion mit humanem Immunschwächevirus (AIDS und AIDS-verwandter Komplex), mit HIV-verbundene Demenz, Proliferation von Nierenmesangialzellen in Reaktion auf IL-1, MIP-1α, PDGF oder FGF, Entzündung, glomuläre oder tubuläre Nierentoxizität in Reaktion auf eine Behandlung mit Cyclosporin A oder Amphotericin B, Organtoxizität (z. B. gastrointestinal oder pulmonal epithelial) in Reaktion auf eine cytotoxische Therapie (z. B. cytotoxisches Arzneimittel oder Strahlung), Wirkungen von nicht alkylierenden Antitumormitteln, Entzündung in Reaktion auf inflammatorische Stimuli (z. B. TNF, IL-1 und dergleichen), die durch eine Produktion von Metalloproteasen oder durch Allergien aufgrund einer Degranulierung von Mastzellen und Basophilen in Reaktion auf IgE oder RANTES charakterisiert sind, Knochenerkrankungen, die durch Überproduktion von Osteoclasten-aktivierendem Faktor (OAF) durch Osteoclasten verursacht werden, ZNS-Erkrankungen, die auf eine Überstimulierung durch proinflammatorische Neurotransmitter wie Acetylcholin, Serotonin, Leu-Enkephalin oder Glutamat zurückzuführen sind, akute inflammatorische Erkrankungen wie septischer Schock, Schocklunge, Multiorganversagen, verbunden mit einer inflammatorischen Cytokinkaskade, und Kombinationen davon.
In vielen Zelltypen hängt eine Signalgebung von der Bildung einer großen Vielzahl von nicht arachidonylartigen PA-Spezies ab, von denen einige aus Lyso-PA durch das Enzym Lyso-PA-Acyltransferase (LPAAT) gebildet werden. Eine Bildung jeder dieser PA-Spezies (wobei die vorherrschenden Formen 1-Acyl- und 1-Alkyl-2-Linoleoyl-PA-Verbindungen sind, die durch LPAAT gebildet werden) dient dazu, sowohl eine proliferative als auch/oder inflammatorische Signalgebung bei die sen beschriebenen Erkrankungen und vorstehend beschriebenen Zellsystemen zu bewirken.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind zum Inhibieren einer IL-2-induzierten proliferativen Wirkung von besonderer Bedeutung. Eine Inhibierung der IL-2-Signalgebung ist möglicherweise bei der Behandlung von zahlreichen Erkrankungsstadien verwendbar, die eine T-Zell-Aktivierung und Hyperproliferation beinhalten. Beispielhafte Autoimmunerkrankungen sind Lupus, Sklerodermie, rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Glomerulonephritis, Insulin-abhängiger Diabetes mellitus (IDDM) als auch potentielle Malignitäten, einschließlich, in nicht begrenzender Weise, chronischer myeloischer Leukämie, als auch andere.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine gemischte Lymphocytenreaktion von PTX und drei erfindungsgemäßen Verbindungen CT1558 (racemisches N-(5-Dimethylaminohexyl)-3,7-dimethylxanthin), CT1557 (racemisches N-(5-Methylaminohexyl)-3,7-dimethylxanthin) und CT1548 (racemisches N-(7-Aminooctyl)-3,7-dimethylxanthin). Die gemischte Lymphocytenreaktion zeigt eine proliferative Reaktion von PBMC (periphere mononukleäre Blutzellen) auf eine allogene Stimulation, die in einer gemischten Zwei-Wege-Lymphocytenreaktion bestimmt wurde. Jede der getesteten erfindungsgemäßen Verbindungen war wirksamer als PTX in diesem immunmodulatorischen Aktivitätstestverfahren.
2 zeigt einen Vergleich von CT1558 und Cyclosporin A (CyA) bezüglich einer Reversibilität bei der gemischten Lymphozytenreaktion (MLR), was eine Fähigkeit jeder Verbindung zeigt, eine proliferative Reaktion auf einen Stimulus, wenn CT 1558 oder CyA mit der Zelle in Kontakt stand, zu inhibieren und eine Wiederaufnahme der proliferativen Reaktion, wenn das Arzneimittel entfernt wird, zu ermöglichen. Die in der 2 dargestellten Daten zeigen, dass sowohl CT1558 als auch CyA eine proliferative Reaktion von gemischten Lymphocytenzellen verminderten. Jedoch war nach einer Behandlung von mehr als 24 Stunden eine CyA-Inhibierung irreversibel, wohingegen eine CT1558-Inhibierung reversibel war.
3 zeigt eine Wirkung von CT1520 (ein Racemat von N-(5-Aminohexyl)-3,7-dimethylxanthin) und CT1548 zum Schützen von L929-Zellen vor einer Be handlung mit einer toxischen Menge an TNF (Tumornekrosefaktor, 300 ng/ml). Zum Vergleich sind die Ergebnisse mit PTX und einer weiteren Verbindung auch gezeigt. Die wirksamsten Ergebnisse wurden für CT1520 und CT1548 festgestellt. Dies ist ein in vitro-Prognosemodell für eine Behandlung und Verhinderung von septischem Schock.
4 zeigt die Wirkungen von CT1558 und CT1548 auf eine Proliferation, die durch PDGF (von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor) induziert wurde, in menschlichen Knochenmarksstromazellen. Hintergrundsauszählungen betrugen etwa 10% der Kontrollmengen.
5 zeigt die Wirkung von CT1558, eine Proliferation einer Ramos B-Zellen-Tumorlinie, nach Stimulation entweder auf einen Anti-mu-Antikörper oder PMA (Phorbolmyristinsäure) zu inhibieren. CT1558 inhibierte etwas der proliferativen Reaktion auf Anti-mu und PMA.
6 zeigt einen Thymocytenproliferationstest, wobei eine Thymocytenproliferation durch Con A und IL-1α stimuliert wird. Sowohl CT1521 als auch CT1558 inhibierten eine Proliferation in Thymocyten.
7 zeigt die Wirkungen von 1-[5-(Undecylamino)hexyl]-3,7-dimethylxanthin auf eine PDGF-induzierte Proliferation in menschlichen Knochenmarksstromazellen.
8 zeigt Inhibitionswirkungen der erfindungsgemäßen Verbindung 1-[5-(Undecylamino)hexyl]-3,7-dimethylxanthin auf eine gemischte Lymphocytenproliferations- und -aktivierungsreaktion, die mit Con A und IL-2 costimuliert wurde. Die getestete erfindungsgemäße Verbindung inhibiert eine Thymocytenproliferation und -aktivierung bei verschiedenen Konzentrationen der Verbindung.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird eine Gattung von Verbindungen bereitgestellt, die ein zelluläres Verhalten durch eine spezifische Phase eines zweiten Botenstoff-Wegsystems (Bursten et al., J. Biol. Chem. 266: 20732, 1991) steuern können. Die zweiten Botenstoffe sind Lipide oder Phospholipide und verwenden die nachstehenden Abkürzungen:
PE = Phosphatidylethanolamin
LPE = Lysophosphatidylethanolamin
PA = Phosphatidsäure
LPA = Lysophosphatidsäure
DAG = Diacylglycerin
LPLD = Lysophospholipase-D
LPAAT = Lysophosphatidsäureacyltransferase
PAPH = Phosphatidsäurephosphohydrolase
PLA2 = Phospholipase A-2
PLD = Phospholipase D
PAA = Phosphoarachidonsäure
PLA-2 = Phospholipase A2
PC = Phosphatidylcholin
"Umgeformte" PA, cyclischer Weg = PAA-, LPA-, PA- und DAG-Zwischenverbindungen, die mit 1-gesättigten-2-linoleoyl- oder 1,2-Dioleoyl-, Dioleoyl/1,2-sn-Dilinoleoylgruppen an den angegebenen sn-1- und sn-2-Positionen substituiert sind.
"Klassischer PI-Weg" = PI-, DAG-, PA-Zwischenverbindungen, die mit 1-Stearoyl-, 2-Arachidonoylfettacyl-Seitenketten substituiert sind.
"PLD-gebildete PA" = PE-, PC-, LPA-, PA- und DAG-Zwischenverbindungen, die mit z. B. 1,2-sn-Dioleoyl-, 1-Alkyl-2-linoleoyl- und 1-Alkyl-2-docosahexaenoyl-Seitenketten substituiert sind.
Die Lysophosphatidsäureacyltransferase (LPAAT) bewirkt die Synthese von Phosphatidsäure (PA) aus Lysophosphatidsäure (LPA) durch Einbau einer Acylgruppe aus Acyl-CoA. Eine Hydrolyse der Phosphatgruppe durch PA-Phosphohydrolase (PAPH) führt zu der Bildung von DAG. Diese Aspekte des Weges werden anscheinend sofort (innerhalb einer Minute) nach Stimulation durch einen ersten Stimulus (z. B. ein Cytokin wie IL-1, IL-2 oder TNF) aktiviert, der bei einem Rezeptor auf einer Zelloberfläche wirkt. Eine sofortige nachweisbare Wirkung ist eine Erhöhung der Mengen an PA und DAG. Eine Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen kehrt diese Erhöhung um.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen und pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen Inhibitoren von Subspezies von LPAAT- und PAPH-Enzymen mit einer Substratspezifität für Zwischenverbindungen mit 1,2-doppelt ungesättigten und 1-Alkyl-2-ungesättigten Subspezien. Ein Beispiel eines solchen Inhibitors, obwohl er nicht innerhalb der Gattung an erfindungsgemäßen Verbindungen liegt, ist PTX. PTX blockiert PAPH in einem spezifischen Aktivierungsweg, der nicht PI beinhaltet, sondern eher von einer PA abstammt, die größtenteils aus 1,2-doppelt ungesättigten und 1-Alkyl-2-ungesättigten Subspezien besteht. Dies wurde zum Beispiel durch die Darstellung gezeigt, dass humane Mesangialzellen, die mit TNF stimuliert wurden, DAG aus PI herstellen und PI mit und ohne PTX neu bilden. In dem letzteren System gibt es keinen Beweis für die Vermutung, dass PA oder DAG von Quellen abstammen, die von PI verschieden sind. Es sollte betont werden, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen diejenige Untergruppe von PAPH und LPAAT beeinflussen, die Substrate mit ungesättigten Fettsäuren, die von Arachidonat verschieden sind, in der sn-2-Position betreffen, und nicht die spezifischen Formen dieser Enzyme, die dem PI-Weg dienen.
Jede Unterklasse von Membranphospholipiden (z. B. PA, PI, PE, PC und PS) erreicht einen stabilen Gehalt an charakteristischen Fettacylseitenketten aufgrund einer cyclischen Umgestaltung der Plasmamembran als auch einer biologischen Erneuerung für jede Unterklasse. PA ist oft stabil, aber in relativ kleinen Mengen vorhanden. PA in inaktiven Zellen besteht hauptsächlich aus gesättigten Acylketten, die gewöhnlich aus Myristat, Stearat und Palmitat bestehen. In inaktiven Zellen bestehen die PC-Acylseitenketten hauptsächlich aus Acylpalmitat in der sn-1-Position und Oleat in der sn-2-Position. PE und PI sind vorherrschend aus sn-1-Stearat und sn-2-Arachidonat aufgebaut.
Aufgrund dieses charakteristischen Gehalts an Acylgruppen in den sn-1- und sn-2-Positionen kann der Ursprung einer jeglichen PA-Spezies aus der chemischen Art seiner Acylgruppen in den sn-1- und sn-2-Positionen abgeleitet werden. Zum Beispiel, falls PA aus PC durch Einwirken des Enzyms PLD abstammt, wird die PA die charakteristischen Acylseitenketten des PC-Substrats, das den zweiten Botenstoff-Weg durchlaufen hat, enthalten. Ferner kann der Ursprung einer jeglichen 1,2-sn-Substratspezies bezüglich ihres Ursprungs differenziert werden. Jedoch ist es wichtig zu wissen, ob jede Phospholipid-Spezies eine PA-Form vor einer Hydrolyse zu DAG passiert oder nicht. Die Lyso-PA, die zu PA und daher zu DAG umgewandelt wird, kann nachgewiesen werden. Die Komplexizi täten dieses Weges des zweiten Botenstoffs kann durch geeignete Analysen mittels Fettacylseitenkettenchemie (d. h. durch Dünnschichtchromatographie, Gas-Flüssigkeitschromatographie oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie) von Zwischenverbindungen in Zellen an verschiedenen Zeitpunkten nach einer Stimulation des Weges des zweiten Botenstoffs in Klassen eingestuft werden.
In bestimmten Mesenchymzellen wie Neutrophilen und Mesangialzellen aus Ratte oder Mensch können mehrere Signalwege hintereinander, gleichzeitig oder beides aktiviert werden. Zum Beispiel stimuliert in Neutrophilen F-Met-Leu-Phe eine Bildung von PA über die Wirkung von PLD, zeitlich gefolgt von einer Bildung von DAG über die Wirkung von PAPH. Mehrere Minuten später wird DAG aus PI durch den klassischen Phosphoinositid-Weg gebildet. In vielen Zellen stammt DAG aus sowohl PA, die durch einen Zyklus umgestaltet wird, wobei PA an der sn-2-Position durch PLA-2 hydrolisiert wird, gefolgt von einer sn-2-Transacylierung durch LPAAT, als auch einem PLD-Weg aus PA ab, die aus entweder PE oder PC oder beiden Substraten durch PLD gebildet wird.
Der vorliegende Weg des zweiten Botenstoffs ist mit Substraten mit ungesättigten Fettsäuren in der sn-2-Position, die von Arachidonat verschieden sind, und denjenigen Subspezies von PAPH und LPAAT verbunden, die nicht an normalen zellulären Grundfunktionen beteiligt sind, die Teil des klassischen PI-Weges sind. Die PAPH- und LPAAT-Enzyme, die mit dem vorliegenden Weg des zweiten Botenstoffs verbunden sind, sind ausschließlich stereospezifisch für unterschiedliche Acylseitenketten und isomere Formen von Substraten. Folglich sind die erfindungsgemäßen Verbindungen vorzugsweise im Wesentlichen enantiomerenrein.
PTX (in vitro) blockiert eine Bildung von umgeformter PA über den PA/DAG-Weg bei hohen PTX-Konzentrationen (mehr als diejenigen, die in Patienten ohne dosisbegrenzende Nebenwirkungen erreicht werden könnten) mittels einer Blockierung der Bildung von PA-Subspezien bei LPAAT. Sogar in Gegenwart von PTX setzen die Zellen die Bildung von PA über die Wirkung von PLD fort und DAG wird auch über die Wirkung von Phospholipase C auf PC und PI gebildet. Der letztere Weg wird nicht durch die erfindungsgemäßen Verbindungen oder PTX inhibiert. In PTX-behandelten Zellen wird DAG, das von umgeformter und PLA-gebildeter PA abstammt, vermindert (z. B. 1,2-sn-Dioleoyl-DAG, 1-Alkyl-2-linoleoyl-DAG und 1-Alkyl-2-docosahexanolyl-DAG). Folglich inhibieren die erfin dungsgemäßen Verbindungen und PTX die Bildung lediglich einer bestimmten Spezies von PA und DAG durch selektive Inhibierung eines spezifischen Weges eines zweiten Botenstoffs, der lediglich in Zellen durch gesundheitsschädliche Stimuli aktiviert wird, aber nicht verwendet wird, um normale zelluläre Grundfunktionen zu signalisieren.
Therapeutische Verwendungen der erfindungsgemäßen Verbindungen
Die spezifische Aktivierungsinhibierung des Weges des zweiten Botenstoffes, der vorstehend beschrieben wurde und hauptsächlich durch verschiedene gesundheitsschädliche Stimuli aktiviert wird, legt nahe, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen beim Behandeln einer großen Vielzahl von klinischen Indikationen verwendbar sind. Außerdem stellen die hierin dargestellten in vitro- und in vivo-Daten voraussagende Daten bereit, dass eine große Vielzahl von klinischen Indikationen, die ähnliche Wirkungen auf den spezifischen Weg des zweiten Botenstoffs aufweisen, durch die erfindungsgemäßen Verbindungen behandelt werden können, die spezifisch den Weg inhibieren, der durch gesundheitsschädliche Stimuli aktiviert wird und über z. B. inflammatorische Cytokine vermittelt wird. Tatsächlich erklärt der Wirkmechanismus der erfindungsgemäßen Verbindungen, warum diese Verbindungen eine große Vielzahl von klinischen Indikationen aufweisen.
Eine Aktivierung des Weges des zweiten Botenstoffs stellt einen Hauptvermittler der Reaktion gegenüber gesundheitsschädlichen Stimuli dar und führt zu zellulären Signalen, die z. B. zu akuter und chronischer Entzündung, Immunantwort und Krebszellwachstum führen. Jedoch inhibieren nicht alle Inhibitoren alle Enzyme dieses Weges des zweiten Botenstoffs. Obwohl die erfindungsgemäßen Verbindungen wünschenswerterweise viele andere nicht beschriebene gesundheitsschädliche Stimuli inhibieren, vermitteln sie am wirksamsten die vorstehenden Bedingungen. Signale, die durch den vorliegenden Weg des zweiten Botenstoffs vermittelt werden, umfassen z. B. diese zellulären Reaktionen von LPS direkt, T-Zell-Aktivierung durch ein Antigen, B-Zell-Aktivierung durch ein Antigen, zelluläre Reaktionen auf IL-1, die über den IL-1-Rezeptor Typ 1 (aber nicht den IL-1-Rezeptor Typ 2), den TNF-Rezeptor Typ 1 vermittelt werden, Wachstum, das durch Transformationen stimuliert wird, einschließlich, in nicht begrenzender Weise, aktivierter Onkogene (z. B. ras, abl, her 2-neu und dergleichen), Proliferation der glatten Muskelzellen, die durch PDGF, bFGF und IL-1 stimuliert wird, T- Zell- und B-Zell-Wachstumsstimulation durch IL-2, IL-4 oder IL-7 bzw. IL-4 oder IL-6 und allgemeiner T-Zell-Rezeptor-Signalgebung.
In vitro (1) blockieren die erfindungsgemäßen Verbindungen eine IL-1-Signalweitergabe über den Typ 1-Rezeptor, wie gezeigt, z. B. dadurch, dass eine Induktion der Proliferation von glatten Muskel-, Endothel- und Mesangialnierenzellen durch IL-1 und IL-1 + PDGF (von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor) verhindert wird, (2) unterdrücken sie eine Hochregulierung von Adhäsionsmolekülen, wie gezeigt, z. B. durch Blockierung von VCAM in Endothelzellen, (3) inhibieren sie TNF-, LPS- und IL-1-induzierte Metalloproteasen (ein Entzündungsmodell), (4) blockieren sie eine LPS-, TNF- oder IL-1-induzierte Produktion von Metalloprotease und sekundärem Cytokin (zur Verhinderung und Behandlung von septischem Schock), (5) unterdrücken sie eine T-Zell- und B-Zell-Aktivierung durch ein Antigen, z. B. IL-2 und IL-4, (6) inhibieren sie eine Mastzellaktivierung durch IgE, (7) sind sie cytotoxisch für transformierte Zellen und Tumorzelllinien, jedoch nicht für normale Zellen und (8) blockieren sie eine Signalgebung durch IL-2, IL-4, IL-6 und IL-7 auf T- und B-Zellen.
Die vorstehenden in vitro-Wirkungen verursachen die nachstehenden biologischen in vivo-Wirkungen, einschließlich, in nicht begrenzender Weise, eines Schutzes und einer Behandlung von endotoxischem Schock und Sepsis, ausgelöst durch Gram-positive oder Gram-negative Bakterien, einer Inhibierung von Tumorzellwachstum, synergistischer Immunosuppression, die bei Autoimmunerkrankungen und beim Unterdrücken von Fremdimplantatreaktionen wirksam ist, und einer Stimulierung von Haarwachstum über eine Umkehr eines apoptotischen Prozesses. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind am wirksamsten, wenn sie zum Verhindern und Behandeln von septischem Schock, zum Behandeln einer akuten und chronischen inflammatorischen Erkrankung, zum Behandeln oder Verhindern einer Autoimmunerkrankung und zum Stimulieren von Haarwachstum (wenn sie topisch angewendet werden) verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch als ein Adjuvans verwendbar, um toxische Nebenwirkungen von Arzneimitteln zu inhibieren, deren Nebenwirkungen über den vorliegenden Weg des zweiten Botenstoffs vermittelt werden. Metalloproteasen vermitteln eine Gewebsschädigung wie glomeruläre Erkrankungen der Niere, Gelenkszerstörung bei Arthritis und Lungenzerstörung beim Emphysem und spielen eine Rolle bei Tumormetastasen. Drei Beispiele von Me talloproteasen umfassen eine Gelatinase Typ V mit einem Molekulargewicht von 92 kD, die durch TNF, IL-1 und PDGF plus bFGF induziert wird, eine Collagenase Typ IV mit einem Molekulargewicht von 72 kD, die gewöhnlich konstitutiv ist und durch TNF oder IL-1 induziert wird, und ein Stromelysin/PUMP-1, das durch TNF und IL-1 induziert wird. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können eine TNF- oder IL-1-Induktion der induzierbaren Metalloprotease Gelatinase Typ V mit einem Molekulargewicht von 92 kD inhibieren. Außerdem können die erfindungsgemäßen Verbindungen die Aktivität von PUMP-1, die durch 100 U/ml an IL-1 induziert wird, vermindern. Demzufolge verhindern die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Induktion von bestimmten Metalloproteasen, die durch IL-1 oder TNF induziert werden, und sind nicht bei konstitutiv produzierten Proteasen (z. B. Collagenase Typ IV mit einem Molekulargewicht von 72 kD) beteiligt, die bei einer normalen Gewebsumgestaltung beteiligt sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen inhibieren eine Signalweitergabe, die durch den IL-1-Rezeptor Typ I vermittelt wird, und werden daher als IL-1-Antagonisten angesehen. Ein neuer Übersichtsartikel mit dem Titel "The Role of Interleukin-1 in Disease" (Dinarello und Wolff, N. Engl. J. Med., 328, 106, 14. Januar 1993) beschrieb die Rolle von IL-1 als "einen wichtigen schnellen und direkten bestimmenden Faktor einer Erkrankung". "Beim septischen Schock wirkt z. B. IL-1 direkt auf die Blutgefäße, um eine Vasodilatation über die schnelle Herstellung des Blutplättchen-aktivierenden Faktors und Stickstoffmonoxid zu induzieren, wohingegen bei einer Autoimmunerkrankung es durch Stimulierung anderer Zellen wirkt, um Cytokine oder Enzyme herzustellen, die sodann auf das Zielgewebe einwirken." Der Artikel beschreibt eine Gruppe von Erkrankungen, die durch IL-1 vermittelt werden, einschließlich Sepsis-Syndrom, rheumatoider Arthritis, entzündlicher Darmerkrankung, akuter und myeloischer Leukämie, Insulin-abhängiger Diabetes mellitus, Atherosklerose und anderer Erkrankungen, einschließlich Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (GVHD), Schuppenflechte, Asthma, Osteoporose, Periodontalerkrankung, Autoimmunthyroiditis, alkoholischer Hepatitis, Frühgeburt, die sekundär zu einer Uterusinfektion ist, und sogar Schlaferkrankungen. Da die erfindungsgemäßen Verbindungen eine zelluläre Signalgebung über den IL-1-Rezeptor Typ I inhibieren und IL-1-Antagonisten sind, sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zum Behandeln aller vorstehend beschriebenen Erkrankungen geeignet.
Zum Beispiel scheint für das Sepsis-Syndrom der Mechanismus eines IL-1-induzierten Schocks die Fähigkeit von IL-1 zu sein, die Plasmakonzentrationen von kleinen Vermittlungsmolekülen wie Blutplättchen-aktivierendem Faktor, Prostaglandin und Stickstoffmonoxid zu erhöhen. Diese Substanzen sind wirksame Vasodilatatoren und induzieren Schock in Versuchstieren. Ein Blockieren der Wirkung von IL-1 verhindert die Synthese und die Freisetzung dieser Vermittlungssubstanzen. In Tieren vermindert eine einzige intravenöse Injektion von IL-1 den mittleren arteriellen Druck, erniedrigt den systemischen Gefäßwiderstand und induziert Leukopenie und Thrombocytenpenie. In Menschen vermindert die intravenöse Verabreichung von IL-1 auch schnell den Blutdruck und Dosen von 300 ng oder mehr pro kg Körpergewicht können eine schwere Hypotonie verursachen. Der therapeutische Vorteil einer Blockierung der Wirkung von IL-1 besteht in der Verhinderung seiner gesundheitsschädlichen biologischen Wirkungen, ohne störend in die Herstellung von Molekülen einzugreifen, die eine Rolle bei der Homöostase spielen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen gehen den durch Dinarello und Wolff identifizierten Bedarf dadurch an, dass eine zelluläre Signalgebung lediglich über den IL-1-Rezeptor Typ I und nicht über den IL-1-Rezeptor Typ II inhibiert wird.
Hinsichtlich rheumatoider Arthritis halten Dinarello und Wolff fest: "Interleukin-1 ist in der Synovialauskleidung und Synovialflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis vorhanden und Explantate von Synovialgewebe von solchen Patienten stellen IL-1 in vitro her. Intraartikuläre Injektionen von Interleukin-1 induzieren eine Leukocyteninfiltration, einen Knorpelabbau und eine periartikuläre Knochenumgestaltung in Tieren. In isoliertem Knorpel und Knochenzellen löst Interleukin-1 in vitro die Expression von Genen für Collagenasen als auch Phospholipasen und Cyclooxigenase aus und ein Blockieren seiner Wirkung vermindert eine Bakterienzellwand-induzierte Arthritis in Ratten." Folglich sind die erfindungsgemäßen Verbindungen als IL-1-Antagonisten zum Behandeln und Verhindern rheumatoider Arthritis geeignet.
Hinsichtlich entzündlicher Darmerkrankung sind Colitis ulcerosa und Morbus Crohn durch infiltrative Verletzungen des Darms charakterisiert, die aktivierte Neutrophile und Makrophagen enthalten. IL-1 kann eine Herstellung von inflammatorischen Eicosanoiden wie Prostaglandin E₂ (PGE₂) und Leukotrien B₄ (LTB₄) und IL-8, ein inflammatorisches Cytokin mit Neutrophil-chemoanziehenden und Neutrophil-stimulierenden Eigenschaften, stimulieren. Gewebskonzent rationen an PGE₂ und LTB₄ stehen mit der Schwere der Erkrankung in Patienten mit Colitis ulcerosa in Beziehung und Gewebskonzentrationen an IL-1 und IL-8 sind in Patienten mit entzündlicher Darmerkrankung hoch. Folglich würde ein IL-1-Antagonist wie die erfindungsgemäßen Verbindungen beim Behandeln von entzündlicher Darmerkrankung wirksam sein.
Hinsichtlich akuter und chronischer myeloischer Leukämie gibt es zunehmende Hinweise darauf, dass IL-1 als ein Wachstumsfaktor für solche Tumorzellen wirkt. Folglich sollten die erfindungsgemäßen Verbindungen beim Verhindern der Entwicklung einer Verschlechterung der Erkrankung für akute und chronische myeloische Leukämien wirksam sein.
Insulin-abhängiger Diabetes mellitus (IDDM) wird als eine Autoimmunerkrankung mit einer Zerstörung von β-Zellen in den Langerhansschen Inseln angesehen, die durch immunokompetente Zellen vermittelt wird. Inseln von Tieren mit spontan auftretendem IDDM (z. B. BB-Ratten oder NOD-Mäuse) weisen inflammatorische Zellen auf, die IL-1 enthalten. Folglich sollten die erfindungsgemäßen Verbindungen bei der Verhinderung und Behandlung von IDDM verwendbar seien.
IL-1 spielt auch bei der Entwicklung von Atherosklerose eine Rolle. Endothelzellen sind ein Ziel von IL-1. IL-1 stimuliert eine Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen. Schaumzellen, die aus arteriellen Fettplaques aus Kaninchen mit Hypercholesterinämie isoliert wurden, enthalten IL-1β und IL-1β-Boten-RNA. Die Aufnahme von peripheren Blutmonocyten führt zu dem Start einer IL-1-Herstellung durch diese Zellen. IL-1 stimuliert auch eine Herstellung von PDGF. Zusammengenommen spielt IL-1 eine Rolle bei der Entwicklung von atherosklerotischen Schädigungen. Folglich sollte ein IL-1-Antagonist wie die erfindungsgemäßen Verbindungen beim Verhindern und Behandeln von Atherosklerose verwendbar sein.
IL-1 aktiviert (über den IL-1-Rezeptor Typ I) eine Lyso-PA-Acyltransferase (LPAAT) und Phosphatidatphosphohydrolase innerhalb von 5 Sekunden nach einem Aussetzen von Zellen (z. B. menschliche Mesangialzellen, HMC) gegenüber diesem Cytokin. Eine Aktivierung beider Enzyme führt zur Herstellung von PA-Spezien mit ungesättigten sn-1- und sn-2-Acylgruppen, wobei der Hauptteil der sn-2-Acylketten mehrfach ungesättigt ist. Sowohl IL-1 als auch ein Produkt von LPAAT, 1,2-sn-Dilinoleoyl-PA, aktivieren einen Signalweg, der eine Hydrolyse von PE zu PA einschließt. Dieser Wirkung folgt eine Dephosphorylierung von PA, um sowohl 1,2-sn-Diacylglycerin- als auch 1-O-Alkyl- oder 1-O-Alkenylacylglycerin (AAG)-Spezies herzustellen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen üben ihre Wirkung über eine Inhibierung einer oder beider Enzyme an der inneren Schicht der Plasmamembran aus. Folglich bestehen geeignete in vitro-Modelle für eine Arzneimittelwirksamkeit darin, die Inhibierung einer Stimulation, die durch ein proinflammatorisches Cytokin oder ein anderes inflammatorisches zelluläres Signal verursacht wird, zu messen.
Die Bildung der sn-2-ungesättigten PA-Fraktion durch LPAAT dient einer Aktivierung von einerseits G-Proteinen oder wirkt direkt auf PLD über eine Veränderung ihrer Lipidmikroumgebung. Eine Aktivierung von LPAAT und eine Bildung der sn-2-ungesättigten PA-Spezien ist ein energieempfindlicher Weg von PLD. Dies stellt einen Mechanismus für ein Rezeptor-begrenztes System zum Amplifizieren eines Signals und zum Ausbilden einer zellulären Wirkung durch rasche Synthese von kleinen Mengen an PA bereit. Eine Aufnahme von doppelt ungesättigter PA, was etwa < 0,1% der gesamten Membranlipidmasse ausmacht, ist ausreichend, um die PLD-Aktivität zu aktivieren. Diese Menge an PA ist ähnlich zu derjenigen, die endogen durch LPAAT synthetisiert wird. Die PA-stimulierte PLD wirkt auf PE ein, das an der inneren Schicht der Zellmembran vorhanden sein sollte, die an PE relativ zu der äußeren Schicht angereichert ist. Folglich wird eine zelluläre inflammatorische Wirkung hinsichtlich IL-1 über den Weg: IL-1R→PA→(PAD)→PE vermittelt. Demgegenüber ist eine lokalisierte Gewebswirkung: Lyso-PA→PI→PKC→(PLD)→PC. Die PLD-Spezien sind wahrscheinlich unterschiedliche Isoenzyme. Der Weg des zweiten Botenstoffs, dessen Aktivierung durch die erfindungsgemäßen Verbindungen inhibiert wird, ist nicht ein von PIabstammender Weg und beinhaltet nicht PKC in den Zeitverläufen einer Inhibierung. PKC wird akut durch PI-abstammendes DAG aktiviert, aber eine chronische Aktivierung (d. h. > 30 Minuten) wird durch PC-abstammende PA, die durch PC-gerichtete PLD gebildet wird, beibehalten. Folglich ist der Weg, der durch die erfindungsgemäßen Verbindungen inhibiert wird, PE-gerichtet und nicht PC-gerichtet. Außerdem begünstigt die PE-gerichtete PLD Substrate mit einer Ungesättigtheit der sn-2-Langkette.
DAG und PA sind in önkogenetisch transformierten Zellen hochreguliert. Zum Beispiel führen aktivierende ras-Mutationen zu einer erhöhten Bildung von DAG bei Stimulierung mit Mitogenen, obwohl die Quellen an DAG zwischen den experimentellen Systemen sich unterschieden. In nicht transformierten Nierenmesangialzellen erhöhte eine IL-1β-Stimulierung eine PLA2- und LPAAT-Aktivierung, was zur Bildung von sn-2-ungesättigter PA und anschließender Hydrolyse zu DAG durch Phosphatidatphosphohydrolase führte. Die ras-Transformation in NIH/3T3-Zellen reguliert eine Serum-stimulierte Bildung von DAG und PA hoch. Die spezifische Spezies von DAG, die durch Serum stimuliert wird, ist die Dioleyl-Spezies und für PA sind es die Dilinoleoyl- und Dioleoyl-Spezien. Diese Hochregulierung tritt über 4 bis 12 Stunden auf und eine Vorbehandlung von Zellen mit einer erfindungsgemäßen Verbindung oder PTX blockiert eine Bildung dieser Phospholipid-zweiten Botenstoffe. Die Inhibierung tritt entweder durch eine Unterdrückung der Bildung von PA de novo aus Lyso-PA oder über eine Inhibierung einer oder beider Arme des Lands-Zyklus auf. Die Koordinatenzunahme an Lyso-PA bei der Einstellung einer verminderten PA/DAG-Herstellung legt eine Inhibierung einer Transacylierung eines Vorläuferlipids nahe. Folglich vermittelt die ras-Transformation eine Hochregulierung von PA über eine indirekte Stimulation einer PLA2- und/oder LPAAT-Aktivität. Die erfindungsgemäßen Verbindungen inhibieren die Umwandlung der hochregulierten Lyso-PA zu PA und anschließend blockieren sie die phenotypischen Veränderungen, die durch PA/DAG in der Membran induziert werden.
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen zum Inhibieren einer Bildung von ungesättigten Phospholipiden spiegelt sich durch die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen wider, eine Proliferation und Tumorgenese von ras-transformierten Zellen in vitro und in vivo zu inhibieren. PTX inhibiert ras-transformierte NIH/3T3-Zellen mehr als die Ausgangszellen. Diese Inhibierung ist reversibel und nicht mit einer signifikanten Cytotoxizität verbunden.
Eine überschießende oder nicht regulierte Produktion an TNF (Tumornekrosefaktor) ist beim Vermitteln oder Verschlechtern einer Reihe von Erkrankungen eingeschlossen, einschließlich rheumatoider Arthritis, Morbus Bechterew, Osteoarthritis, Gichtarthritis und anderer arthritischer Beschwerden, Sepsis, septischen Schocks, endotoxischen Schocks, Gram-negativer Sepsis, toxischen Schocksyndroms, Schocklunge, cerebraler Malaria, chronischer pulmonaler inflammatorischer Erkrankung, Silikose, pulmonaler Sarkoidose, Knochenresorptionserkrankungen, Reperfusionsverletzung, Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion, Fremdimplantatabstoßungen, Fieber, Myalgien aufgrund einer Infektion wie Grippe, Kachexie sekundär zu einer Infektion, AIDS oder Malignidität, AIDS, anderer viraler Infektionen (z. B. CMV, Grippe, Adenovirus, Herpes-Familie), Keloidbildung, Narbengewebebildung, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa oder Fieber. Die erfindungsgemäßen Verbindungen oder pharmazeutisch verträglichen Salze davon können bei der Herstellung eines Medikaments für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung eines jeglichen Erkrankungszustands in einem Menschen oder anderem Säugetier verwendet werden, der durch einen Signalweg auf Basis eines zellulären Phospholipid-zweiten Botenstoffs (wie hierin beschrieben) und durch eine überschüssige oder nicht regulierte Herstellung von inflammatorischen "ersten Botenstoff"-Cytokinen wie TNF oder IL-1 verschlechtert oder signalisiert wird. Hinsichtlich einer Signalgebung durch TNF als ersten Botenstoff gibt es mehrere Erkrankungszustände, in denen eine überschüssige oder nicht regulierte TNF-Produktion durch Monocyten/Makrophagen beim Verschlechtern oder Verursachen der Erkrankung eingeschlossen ist. Diese umfassen z. B. neurodegenerative Erkrankung wie Alzheimer-Krankheit, Endotoxemie oder toxisches Schock-Syndrom (Tracey et al., Nature 330: 662, 1987 und Hinshaw et al., Circ. Shock 30: 279, 1990), Kachexie (Dezube et al., Lancet 355: 662, 1990) und Schocklunge (Miller et al., Lancet 2 (8665): 712, 1989). Die erfindungsgemäßen Verbindungen können topisch bei der Behandlung für eine Prophylaxe von topischen Erkrankungszuständen verwendet werden, die durch überschüssiges TNF oder IL-1 vermittelt oder verschlechtert werden, wie virale Infektionen (Herpes oder virale Conjunctivitis), Schuppenflechte, Pilz- oder Hefeinfektionen (Tinea, Fußpilz, Vaginitis, Schuppen, etc.) oder andere dermatologische hyperproliferative Erkrankungen. Große Mengen an TNF wurden bei akuten Malariaattacken (Grau et al., N. Engl. J. Med. 320: 1585, 1989), chronisch pulmonalen inflammatorischen Erkrankungen wie Silikose und Asbestose (Piguet et al., Nature 344: 245, 1990 und Bissonnette et al., Inflammation 13: 329, 1989) und Reperfusionsverletzung (Vedder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2643, 1990) in Zusammenhang gebracht.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können ferner zum Beibehalten einer Homöostase in Zellen, die mit ersten Stimuli in Kontakt gebracht wurden, durch Abmildern der Wirkungen dieser ersten Stimuli auf die sekundären Signalwege, die innerhalb von Sekunden auf einen ersten Stimulus hervorgerufen werden, verwendet werden. Zum Beispiel stellt eine Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung in vivo oder ex vivo ein Verfahren zum Modifizieren eines zellulären Verhaltens bereit, wobei das Verfahren ein In-Kontakt-Bringen von Zellen (in vivo oder ex vivo), deren Verhalten modifiziert werden soll, mit einer wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung davon umfasst, um (1) eine Proliferation von Tumorzellen zu inhibieren, wobei die Menge ausreichend ist, um die Proliferation zu inhibieren, (2) eine Aktivierung von T-Zellen durch eine Antigen- oder IL-2-Stimulation zu unterdrücken, wobei die Menge ausreichend ist, um die Aktivierung zu fördern, (3) eine Aktivierung von Monocyten/Makrophagen-Zellen durch Endotoxin-, TNF-, IL-1- oder GM-CSF-Stimulation zu unterdrücken, wobei die Menge ausreichend ist, um die Aktivierung zu unterdrücken, (4) eine Antikörperherstellung von B-Zellen als Antwort auf einen Antigen-, IL-4- oder CD40-Liganden zu unterdrücken, wobei die Menge ausreichend ist, um die Antikörperherstellung zu unterdrücken, (5) die Proliferation von glatten Muskelzellen als Antwort auf Wachstumsfaktoren, die zur Stimulierung der Proliferation fähig sind, zu inhibieren, wobei die Menge ausreichend ist, um die Proliferation zu inhibieren, (6) die den systemischen Gefäßwiderstand, der durch Endothelzellen verliehen wird, zu vermindern, wobei die Menge ausreichend ist, um die Freisetzung von Hypertonie-induzierenden Substanzen zu vermindern, (7) den systemischen Gefäßwiderstand, der durch Endothelzellen induziert wird, zu vermindern, wobei die Menge ausreichend ist, um die Freisetzung von antihypertensiven Substanzen zu erhöhen, (8) die Expression von Adhäsionsmolekülen, die durch Verstärkungsmittel davon induziert werden, zu vermindern, wobei die Menge ausreichend ist, um die Expression zu vermindern, (9) die Aktivierung von T-Zellen und Makrophagen durch HIV zu unterdrücken, wobei die Menge ausreichend ist, um die Aktivierung zu unterdrücken und folglich eine virale Replikation zu inhibieren, (10) die Proliferation von Nierenmesangialzellen als Antwort auf eine Stimulation durch IL-1 und/oder MIP-1α und/oder PDGF und/oder FGF zu inhibieren, wobei die Menge ausreichend ist, um die Proliferation zu inhibieren, (11) die Resistenz von glomerulären oder tubulären Nierenzellen hinsichtlich Cyclosporin A oder Amphotericin B zu erhöhen, wobei die Menge ausreichend ist, um die Resistenz zu erhöhen, (12) die Freisetzung von MIP-1α durch IL-1-, TNF- oder Endotoxin-stimmulierte Monocyten und Makrophagen zu verhindern, (13) die Freisetzung von Blutplättchen-aktivierendem Faktor durch IL-1-, TNF- oder Endotoxin-behandelte Megakaryocyten, Fibroblastenzellen und Makrophagen zu verhindern, (14) die Herunterregulation von Rezeptoren für Cytokine in TNF-behandelten hämatopoetischen Vorläuferzellen zu verhindern, wobei die Menge ausreichend ist, um die Herunterregulation zu verhindern, (15) die Herstellung von Metalloproteasen in IL-1-stimulierten oder TNF-stimulierten glomerulären Epi thelzellen oder Synovialzellen zu unterdrücken, wobei die Menge ausreichend ist, um die Herstellung zu unterdrücken, (16) die Widerstandsfähigkeit von gastrointestinalen oder pulmonalen Epithelzellen gegenüber cytotoxischen Arzneimitteln oder Strahlung zu erhöhen, wobei die Menge ausreichend ist, um die Widerstandsfähigkeit zu erhöhen, (17) die Antitumorwirkung eines nicht alkylierenden Antitumormittels zu erhöhen, wobei die Menge ausreichend ist, um diese Wirkung zu erhöhen, (18) die Herstellung von Osteoclasten-aktivierendem Faktor als Antwort auf IL-1 zu inhibieren, wobei die Menge ausreichend ist, um die Herstellung zu inhibieren, (19) die Degranulierung als Antwort auf IgE zu inhibieren, wobei die Menge ausreichend ist, um die Degranulierung zu inhibieren, (20) die Freisetzung von adrenergen neuralen Transmittern Dopamin, Norepinephrin oder Epinephrin oder des Neurotransmitters Acetylcholin zu erhöhen, wobei die Menge ausreichend ist, um die Freisetzung zu erhöhen, (21) die postsynaptischen "Niedrigstrom"-Wirkungen der adrenergen Neurotransmitter Dopamin, Epinephrin oder Norepinephrin oder des Neurotransmitters Acetylcholin zu modulieren, wobei die Menge ausreichend ist, um solche niedrigen Ströme zu modulieren, (22) eine Signalgebung durch Neurotransmitter, einschließlich Acetylcholin, Leu-Enkephalin und Serotonin, zu unterdrücken oder (23) die Anfallsschwelle zu erhöhen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können bestimmte Wirkungen von VEGF (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor), FGF (Fibroblastenwachstumsfaktor) und PDGF (von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor) in vivo inhibieren, wie eine Inhibierung von Angiogenese oder Restenose. Zum Beispiel zeigten Ferns et al. (Science 253: 1129, 1991), dass eine neointimale glatte Muskelchemotaxis und Angioplastie in Ratten unter Verwendung eines neutralisierenden Antikörpers gegenüber PDGF inhibiert werden. Auch haben Jawien et al. (J. Clin. Invest. 89: 507, 1992) gezeigt, dass PDGF eine Migration der glatten Muskulatur und intimale Verdickung in einem Rattenmodell einer Ballonangioplastie fördert. Eine Inhibierung der PDGF-vermittelten Wirkungen nach einer Ballonangioplastie durch die erfindungsgemäßen Verbindungen ist die pharmakologische Begründung für eine Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen als therapeutische Mittel zur Verhinderung von Restenose. Die erfindungsgemäßen Verbindungen inhibieren auch Atherogenese, da erhöhte Mengen an PDGF, das von Makrophagen exprimiert wird, mit allen Phasen einer Atherogenese verbunden sind (Ross et al., Science 248: 1009, 1990). Ferner exprimieren viele menschliche Tumore erhöhte Mengen entweder an PDGF, FGF, Rezeptoren für FGF oder PDGF oder mutierte zelluläre Onkogene, die hochgradig homolog zu diesen Wachstumsfaktoren oder deren Rezeptoren sind. Zum Beispiel umfassen solche Tumorzelllinien Sarkomazelllinien (Leveen et al., Int. J. Cancer, 46: 1066, 1990), metastasierende Melanomzellen (Yamanishi et al., Cancer Res., 52: 5024, 1992) und gliäre Tumore (Fleming et al., Cancer Res., 52: 4550, 1992).
Folglich sind die erfindungsgemäßen Verbindungen auch zum Anheben der Anfallsschwelle, zum Stabilisieren von Synapsen gegenüber Neurotoxinen wie Strychnin, zur Steigerung der Wirkung von Anti-Parkinson-Arzneimitteln wie L-Dopa, zur Steigerung der Wirkungen von Schlafmitteln, zum Lindern von Bewegungserkrankungen, die durch eine Verabreichung von Tranquilizern verursacht werden, und zum Vermindern oder Verhindern einer Neuronenüberfeuerung, die mit einem fortschreitenden neuralen Tod nach cerebralen Gefäßvorgängen wie Schlaganfall verbunden sind, geeignet. Zusätzlich sind die erfindungsgemäßen Verbindungen bei der Behandlung von Norepinephrin-defizitärer Depression und Depressionen, die mit der Freisetzung von endogenen Glucocorticoiden verbunden sind, zum Verhindern der Toxizität gegenüber dem Zentralnervensystem von Dexamethason oder Methylprednisolon und zum Behandeln von chronischem Schmerz ohne Arzneimittelabhängigkeit geeignet. Ferner sind die erfindungsgemäßen Verbindungen bei der Behandlung von Kindern mit Lern- und Konzentrationsschwächen und allgemein zum Verbessern des Gedächtnisses in Patienten mit organischen Erkrankungen, einschließlich Alzheimer-Patienten, geeignet.
In vitro-Tests für physiologische und pharmakologische Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen
Verschiedene in vitro-Tests können verwendet werden, um die Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen, eine Immunaktivität zu modulieren und Antitumoraktivität unter Verwendung einer Vielzahl von zellulären Arten aufzuweisen, zu messen. Zum Beispiel stellt eine gemischte Lymphocytenreaktion (MLR) ein wertvolles Screeningwerkzeug dar, um eine biologische Aktivität jeder erfindungsgemäßen Verbindung zu bestimmen. Bei der MLR werden PBMCs (periphere mononukleäre Blutzellen) dadurch erhalten, dass Gesamtblut von gesunden Freiwilligen in einen heparinisierten Behälter eingezogen wird, und mit einem gleichen Volumen an Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) verdünnt wird. Dieses Gemisch wird auf einen Sucrosedichtegradienten wie einem Ficoll-Hypaque^®-Gradienten (spezifische Dichte von 1,08) gelegt und bei 1000 g 25 Mi nuten bei Raumtemperatur oder kühler zentrifugiert. Die PBMCs werden von einer Bande bei einer Plasma-Ficoll-Grenzfläche erhalten, abgetrennt und mindestens zweimal in einer Salzlösung wie HBSS gewaschen. Kontaminierende rote Blutzellen werden lysiert wie durch ACK-Lyse für 10 Minuten bei 37°C und die PBMCs werden zweimal in HBSS gewaschen. Das Pellet an aufgereinigten PBMCs wird wieder in Komplettmedium wie RPMI 1640 mit 20% humanem inaktiviertem Serum suspendiert. Eine proliferative Wirkung von PBMC auf eine allogene Stimulation wird in einer Zwei-Wege-MLR bestimmt, die in einer 96-Well-Mikrotiterplatte durchgeführt wird. Kurz gesagt, werden etwa 10⁵ aufgereinigte Test-PBMC-Zellen in 200 μl Komplettmedium mit etwa 10⁵ autologen (Kontrollkultur) oder allogenen (stimulierte Kultur) PBMC-Zellen cokultiviert, wobei die allogenen Zellen von Individuen mit einem anderen HLA-Typ stammen. Variierende Dosen an Verbindungen (Arzneimittel) werden zu dem Zeitpunkt einer Zugabe von Zellen zu der Mikrotiterplatte zugegeben. Die Kulturen werden sechs Tage bei 37°C in einer 5% CO₂-Atmosphäre inkubiert. Am Ende der Inkubation wird Tritium-Thymidin zugesetzt (1 μCi/Well von 40 bis 60 Ci/mmol) und die Proliferation wird durch Flüssigkeitsszintillationsauszählen bestimmt.
Ein weiterer Test zum Messen der Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen beinhaltet ein Bestimmen einer PDGF-, FGF- oder VEGF-proliferativen Reaktion unter Verwendung entweder von NIH-3T3 (Balb)-Zellen aus Mäusen oder Stromazellen aus Menschen. Menschliche Knochenmarksstromazellen werden in definiertem Medium (z. B. 69% McCoys, 12,5% fötales Kälberserum, 12,5% Pferdeserum, 1% Antibiotika, 1% Glutamin, 1% Vitaminzusatz, 0,8% essentielle Aminosäuren, 1% Natriumpyruvat, 1% Natriumbicarbonat, 0,4% nicht essentielle Aminosäuren und 0,36% Hydrocortison) ausplattiert (z. B. 2000 Zellen/Well). Zwei bis drei Tage später werden die Stromazellen in serumfreien Medium Mangelbedingungen ausgesetzt. 24 Stunden später werden die Zellen mit einem Stimulierungsmittel wie PDGF-AA, PDGF-BB oder basischem FGF (Fibroblastenwachstumsfaktor) mit oder ohne IL-1α oder TNF und Tritium-Thymidin behandelt. Eine Zellproliferation wird durch Flüssigkeitsszintillationsauszählen bestimmt.
Ein B-Zell-Proliferationstest bestimmt die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen hinsichtlich einer Inhibierung einer Proliferation von stimulierten B-Zellen, die durch einen Anti-mu-Antikörper (40 μg/ml), IL-4 oder PMA (2,5 nM) stimuliert wurden. Ramos-B-Zell-Tumorzellen oder Splenocyten aus Mäusen können mit einem Stimulierungsmittel, einer erfindungsgemäßen Verbindung und Tritium-Thymidin inkubiert werden, um eine Inhibierung einer durch das Stimulierungsmittel verursachten Zellproliferation zu messen.
Erfindungsgemäße Verbindungen
Wir haben erfindungsgemäße Verbindungen gefunden, die in einer großen Vielzahl an therapeutischen Indikationen zum Modulieren einer Erkrankung mittels intrazellulärer Signalgebung über einen oder zwei spezifische intrazelluläre Signalwege geeignet sind. Zusätzlich sind die erfindungsgemäßen Verbindungen und Zusammensetzungen für normale Wege einer therapeutischen Verabreichung (z. B. parenteral, oral, okular, topisch, etc.) zum Bereitstellen wirksamer Dosen geeignet.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind ferner fähig, erhöhte Mengen einer relevanten PA und DAG zu vermindern, die aus einer Stimulation von Synaptosomen mit Acetylcholin und/oder Epinephrin herrühren. Dies legt nahe, dass die Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen sowohl die Freisetzung von inhibitorischen neuralen Transmittern wie Dopamin erhöhen als auch die distalen "Niedrigstrom"-Wirkungen solcher Neurotransmitter modulieren.
Obwohl Dosiswerte variieren werden, wird eine therapeutische Wirksamkeit erreicht, wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen als eine wirksame orale, parenterale oder intravenöse subletale Dosis von etwa 50 mg bis etwa 5000 mg pro Tag, abhängig von dem Gewicht des Patienten, verabreicht werden. Ein besonders bevorzugter Dosisplan für eine Verwendung beim Behandeln von Leukämie beträgt 4 bis 50 mg pro kg Körpergewicht. Es soll jedoch verstanden werden, dass für jeden spezifischen Patienten spezifische Dosispläne an die Bedürfnisse des Individuums und an die professionelle Beurteilung der Person angepasst werden sollten, die die erfindungsgemäßen Verbindungen verabreicht oder deren Verabreichung überwacht.
Pharmazeutische Formulierungen
Eine geeignete Formulierung wird von der Art der zu behandelnden Erkrankung, der Art des gewählten Medikaments und der Beurteilung des betreuenden Arztes abhängen. Im Allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen entwe der für eine Injektion oder für eine orale Verabreichung formuliert, obwohl andere Verabreichungsarten wie transmukosale oder transdermale Wege verwendet werden können. Geeignete Formulierungen für diese Verbindungen können z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences (neueste Ausgabe), Mack Publishing Company, Easton, PA, gefunden werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen und deren pharmazeutisch verträgliche Salze können in einer großen Vielzahl von pharmazeutischen Formen verwendet werden. Die Herstellung eines pharmazeutisch verträglichen Salzes wird durch die chemische Art der Verbindung an sich bestimmt werden und kann durch herkömmliche Techniken, die leicht verfügbar sind, hergestellt werden. Folglich kann, falls ein fester Träger verwendet wird, die Zubereitung tablettiert, in eine Hartgelatinekapsel in Pulver- oder Pelletform oder in Form einer Pastille oder einem Trochiscus eingebracht werden. Die Menge an festem Träger wird stark variieren, wird aber vorzugsweise etwa 25 mg bis etwa 1 g betragen, wobei die Menge an erfindungsgemäßer Verbindung pro Dosis von etwa 25 mg bis etwa 1 g für einen Erwachsenen variieren wird. Wenn ein flüssiger Träger verwendet wird, wird die Zubereitung in der Form eines Sirups, einer Emulsion, einer Weichgelatinekapsel, einer sterilen injizierbaren Flüssigkeit wie einer Ampulle oder nicht wässrigen flüssigen Suspension vorliegen. Wenn die erfindungsgemäße Zusammensetzung in der Form einer Kapsel vorliegt, ist eine jegliche Routineeinkapselung geeignet, z. B. unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Träger in eine Hartgelatinekapselhülle. Wenn die Zusammensetzung in der Form einer Weichgelatinehüllkapsel vorliegt, kann ein jeglicher pharmazeutischer Träger, der routinemäßig zur Herstellung von Dispersionen oder Suspensionen verwendet wird, in Betracht gezogen werden, z. B. wässrige Gummis, Cellulosen, Silikate oder Öle, und werden in eine Weichgelatinekapselhülle eingebaut. Eine Sirupformulierung wird im Allgemeinen aus einer Suspension oder Lösung der Verbindung oder des Salzes davon in einem flüssigen Träger (z. B. Ethanol, Polyethylenglykol, Kokosnussöl, Glycerin oder Wasser) mit einem Geschmacks- oder Farbmittel bestehen.
Die Menge an erfindungsgemäßer Verbindung, die für die therapeutische Wirkung bei einer topischen Verabreichung benötigt wird, wird natürlich mit der ausgewählten Verbindung, der Art und Schwere der Erkrankung und der Entscheidung der behandelnden Person variieren. Parenteral umfasst eine intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intranasale, intrarektale, intravaginale oder intraperitoneale Verabreichung. Geeignete Dosisformen für eine solche Verabreichung können durch herkömmliche Techniken hergestellt werden. Eine typische parenterale Zusammensetzung besteht aus einer Lösung oder Suspension der erfindungsgemäßen Verbindung oder eines Salzes davon in einem sterilen oder nicht wässrigen Träger, der gegebenenfalls ein parenteral verträgliches Öl, zum Beispiel Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon, Lecithin, Erdnussöl oder Sesamöl, enthält. Die tägliche Dosis für eine Behandlung von Sepsis oder eines anderen schweren inflammatorischen Zustands mittels parenteraler Verabreichung beträgt geeigneterweise etwa 0,001 bis etwa 40 mg/kg, vorzugsweise etwa 0,01 bis etwa 20 mg/kg einer erfindungsgemäßen Verbindung oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, berechnet als die freie Base.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können oral verabreicht werden. Der tägliche Dosisplan für eine orale Verabreichung beträgt geeigneterweise etwa 0,1 bis etwa 1 000 mg/kg pro Tag. Für eine Verabreichung beträgt die Dosis geeigneterweise etwa 0,001 bis etwa 40 mg/kg der erfindungsgemäßen Verbindung oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, berechnet als die freie Base. Der wirksame Bestandteil kann 1- bis 6-Mal pro Tag verabreicht werden, was ausreicht, um eine Aktivität zu zeigen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch Inhalation (z. B. intranasal oder oral) verabreicht werden. Geeignete Dosisformen umfassen eine Aerosol oder einen Dosierinhalator, wie durch herkömmliche Techniken hergestellt. Die tägliche Dosis beträgt geeigneterweise etwa 0,001 bis etwa 40 mg/kg der erfindungsgemäßen Verbindung oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, berechnet als die freie Base. Typische Verbindungen zum Inhalieren liegen in der Form einer Lösung, Suspension oder Emulsion vor, die als ein trockenes Pulver oder in der Form eines Aerosols unter Verwendung eines herkömmlichen Treibmittels verabreicht werden kann.
Die nachstehenden Beispiele, die nicht als begrenzend in einer jeglichen Weise angesehen werden sollen, veranschaulichen die Erfindung. In diesen Beispielen bedeutet PTX Pentoxifyllin.
Beispiel 1
Dieses Beispiel veranschaulicht ein Syntheseverfahren von 1-(5-Aminohexyl)-3,7-dimethylxanthin (CT1520). Das Verfahren, das in Koziara und Zwierzak, Tetrahedron Letters 28: 6513–6516, 1987, beschrieben wurde, wurde befolgt, um CT1520 herzustellen. Kurz gesagt, wurde Bortrifluoridetherat (0,06 mol) tropfenweise bei 10 bis 30°C zu einer gerührten Lösung aus 1-(5-Hydroxyhexyl)-3,7-dimethylxanthin (0,05 mol) und Trimethylsilylazid (0,06 mol) in Pentan (50 ml) gegeben. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Gemisch in 100 ml Wasser geschüttet. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit einer 10%igen Lösung an Natriumbicarbonat gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung des Azids in Pentan wurde bei 25 bis 30°C gerührt und 0,05 mol an Triethylphosphit wurden zugegeben. Ein Rühren wurde 6 Stunden fortgesetzt und die Lösung wurde bei dieser Temperatur 72 Stunden gehalten. Lösungsmittel wurde verdampft und das Iminophosphoran wurde in Ethanol (15 ml) gelöst und mit para-Toluolsulfonsäuremonohydrat (0,05 mol) und Wasser (0,05 mol) behandelt. Das Gemisch wurde 8 Stunden refluxiert, verdampft und der Rückstand wurde mit 100 ml Ether verdünnt. Das Tosylsalz des Amins wurde präzipitiert und durch Filtration wiedergewonnen. Sodann wurde eine 30%ige wässrige Ammoniumhydroxidlösung (20 ml) zu den Kristallen gegeben und das freie Amin wurde in Dichlormethan (3 × 15 ml) extrahiert, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde verdampft, um das freie Amin als ein viskoses Öl, 0,7 g bei einer 50%igen Ausbeute, zu ergeben.
Ein weiteres Verfahren zum Synthetisieren von CT1520 beginnt mit einer Lösung von PTX (Sigma, 1,39 g, 5,0 mmol) in Methanol (50 ml). Ammoniumacetat (3,85 g, 50 mmol) wurde zugegeben und 5 Minuten gerührt. Natriumcyanoborhydrid (0,64 g, 10 mmol) wurde zu dieser Lösung gegeben, gefolgt von 3 Å-Molekularsieben (5 g), und dieses Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, um Feststoffe zu entfernen. Die Feststoffe wurden mit Dichlormethan (50 ml) gewaschen und das Filtrat wurde mit Wasser (50 ml) gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit gesättigter Ammoniumchloridlösung (25 ml) behandelt, 15 Minuten gerührt und sodann wurde eine 30%ige wässrige Ammoniumhydroxidlösung zugegeben (20 ml), um die wässrige Phase basisch zu machen. Die basische wässrige Phase wurde mit 25% Ethanol/Dichlormethan (3 × 35 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck ver dampft, um das Produkt als ein viskoses Öl (0,95 g, 3,41 mmol, 68% Ausbeute) bereitzustellen.
Beispiel 2
Dieses Beispiel veranschaulicht ein Syntheseverfahren von 1-(7'-Aminooctyl)-3,7-dimethylxanthin (CT1548). 8-Brom-2-octanon wurde verwendet, um die N1-Position von Theobromin, wie in Beispiel 1 beschrieben, zu alkylieren. Das sich ergebende 1-(2-Octanon)-3,7-dimethylxanthin (5 mmol) wurde in 50 ml Methanol gelöst. Ammoniumacetat (50 mmol) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 5 Minuten gerührt, und in einem Abzug entlüftet. Natriumcyanoborhydrid (10 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von 3 Å-Molekularsieben (3 Löffel). Nach 24-stündigem Rühren wurde das Gemisch mittels Schwerkraft filtriert und die Feststoffe wurden mit 50 ml Dichlormethan gespült. Die vereinigten Filtrate wurden mit 50 ml Wasser gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde mit 5%igem wässrigem Chlorwasserstoff (25 ml) behandelt und sodann mit Ether (2 × 20 ml) extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit gesättigter wässriger Ammoniumchloridlösung (20 ml) behandelt und 15 Minuten gerührt. Sodann wurde 30%iges wässriges Ammoniumhydroxid (30 ml) zugegeben und die Lösung wurde mit 25% Ethanol/Dichlormethan (3 × 35 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck verdampft, was 1,02 g, 3,4 mmol, 68% Ausbeute, an einem viskosen Öl ergab.
Ein weiteres Verfahren zum Synthetisieren von CT1548 beginnt mit einer Suspension an NaH (580 mg, 24,2 mmol) in DMSO (100 ml) und zugegebenem Theobromin (3,96 g, 22,0 mmol). Nach 30 Minuten wurde 8-Brom-1-octen (3,96 g, 22 mmol) zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 16 Stunden bei 25°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 200 ml Wasser geschüttet und mit Dichlormethan (3 × 50 ml) extrahiert. Die organischen Anteile wurden vereinigt, mit Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen, getrocknet (Natriumsulfat) und verdampft, um 1-(7'-Octenyl)-3,7-methylxanthin als ein dickes weißes Öl bereitzustellen, was sich beim Stehenlassen verfestigte (6,22 g, 97%). Zwei Gramm (6,89 mmol) an 1-(7'-Octenyl)-3,7-methylxanthin wurden in 5 ml Wasser/6 ml Schwefelsäure 16 Stunden gerührt. Wasser (100 ml) wurde zu dem Gemisch gegeben und es wurde mit Dichlormethan (3 × 50 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt, getrocknet (MgSO₄) und verdampft, um 1-(7'-Hydroxyoctyl)-3,7-dimethylxanthin als ein Öl zu ergeben, das sich beim Stehenlassen verfestigte (1,80 g, 85% Ausbeute). 1-(7'-Hydroxyoctyl)-3,7-dimethylxanthin (1,92 g, 6,22 mmol) in 10 ml Dichlormethan wurde zu einer Lösung aus 2,2'-Bipyridiniumchlorochromat (2,73 g, 9,34 mM in Dichlormethan (60 ml)) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 16 Stunden gerührt und Celite^® (1 g) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde durch ein Kissen aus Celite filtriert und das Filtrat wurde zu einem Rückstand verdampft. Der Rückstand wurde wieder in Dichlormethan/Ether kristallisiert, um 1,52 g an (7'-Oxooctyl)-3,7-dimethylxanthin als einen leicht gelben Feststoff in einer 80%igen Ausbeute zu ergeben. 7'-Oxooctyl-3,7-dimethylxanthin (192 mg, 0,63 mmol), Ammoniumacetat (438 mg, 6,3 mmol) und 4 Å-Molekularsiebe (1 g) wurden 5 Minuten gerührt und NaBH₃CN (79 mg, 1,26 mmol) wurde zugegeben. Dieses Reaktionsgemisch wurde 16 Stunden gerührt und wurde sodann filtriert, um die Molekularsiebe abzutrennen. Die Reaktion wurde mit Dichlormethan gewaschen, um jegliche Nebenprodukte zu entfernen. Die wässrige Phase wurde mit gesättigtem wässrigem NH₄Cl (25 ml) und konzentriertem NH₄OH (10 ml) behandelt. Das Gemisch wurde mit 25% Ethanol/Dichlormethan (3 × 20 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt, getrocknet (MgSO₄) und verdampft, um CT 1548 (racemisches Gemisch) als ein purpurfarbenes Öl zu ergeben, das sich langsam beim Stehenlassen verfestigte (80 mg, 42% Ausbeute).
Beispiel 3
Dieses Beispiel veranschaulicht ein Syntheseverfahren von 1-(5-Methylaminohexyl)-3,7-dimethylxanthin (CT1557). Eine Lösung an PTX (2,0 g, 7,2 mmol) in Methanol (50 ml) wurde zu Methylaminhydrochlorid (4,85 g, 72 mmol) gegeben und 5 Minuten gerührt. Natriumcyanoborhydrid (0,9 g, 14,4 mmol) wurde zugegeben und diese Lösung wurde 48 Stunden gerührt. Diese Lösung wurde mit einer gesättigten Ammoniumchloridlösung (70 ml) behandelt, eine Minute gerührt und sodann wurde eine 28%ige wässrige Ammoniumhydroxidlösung (100 ml) zugegeben. Die Lösung wurde mit Dichlormethan (3 × 50 ml) extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden getrocknet (Magnesiumsulfat). Das Lösungsmittel wurde verdampft, um das Produkt als ein viskoses Öl (2,08 g, 7,10 mmol, 98% Ausbeute) zu ergeben.
Beispiel 4
Dieses Beispiel veranschaulicht ein Syntheseverfahren von 1-(5-Dimethylaminohexyl)-3,7-dimethylxanthin (CT1558). Eine Lösung an PTX (2,0 g, 7,2 mmol) in Methanol (50 ml) wurde zu Dimethylaminhydrochlorid (5,86 g, 72 mmol) gegeben und 5 Minuten gerührt. Natriumcyanoborhydrid (0,9 g, 14,4 mmol) wurde zugegeben und diese Lösung wurde 42 Stunden gerührt. Diese Lösung wurde mit einer gesättigten Ammoniumchloridlösung (70 ml) behandelt, eine Minute gerührt und sodann wurde eine 28%ige wässrige Ammoniumhydroxidlösung (50 ml) zugegeben. Die Lösung wurde mit Dichlormethan (3 × 40 ml) extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser (30 ml) gewaschen und getrocknet (Magnesiumsulfat). Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft, um das Produkt als ein viskoses Öl (2,20 g, 7,10 mmol, 99% Ausbeute) zu ergeben.
Beispiel 5
Dieses Beispiel veranschaulicht Wirkungen von CT1558, CT1557 und CT1548 auf eine proliferative Reaktion von PBMCs auf eine allogene Stimulation, bestimmt in einer Zwei-Wege-Reaktion von gemischten Lymphocyten. Das Verfahren einer Zwei-Wege-Reaktion mit gemischten Lymphocyten ist hierin beschrieben. Kurz gesagt, wurden 10⁵-Reaktions-PBMCs in 200 μl Komplettmedium mit 10⁵ allogenen Zellen cokultiviert. Autologe Kontrollkulturen erzeugten Auszählwerte von weniger als 1000. Ein Arzneimittel wurde gleichzeitig mit den Zellen zugegeben. Die Kulturen wurden 6 Tage inkubiert und mit Tritium-Thymidin markiert, um die Zellproliferation zu messen. Jede der erfindungsgemäßen Verbindungen war wirksamer als PTX beim Modulieren einer Immunaktivität in diesem Test (1).
Beispiel 6
Dieses Beispiel veranschaulicht die reversiblen Wirkungen von CT1558 und Cyclosporin A (CyA) in einem reversiblen gemischten Lymphocytentest. Dieser Test vergleicht die Fähigkeit jedes Arzneimittels, die proliferative Reaktion zu inhibieren, wenn das Arzneimittel mit Zellen in Kontakt steht und zu erlauben, dass die proliferative Reaktion nach einer Arzneimittelentfernung sich fortsetzt. Die Kulturen wurden mit 350 μg CT1558 oder 3,3 μg/ml Cyclosporin A kontinu ierlich für 6 Tage vor einem Pulsen mit Tritium-Thymidin behandelt. Alternativ dazu wurden die Kulturen mit dem Arzneimittel 24, 48, 72 oder 96 Stunden vor einem Waschen und Wiedersuspendieren in arzneimittelfreiem Medium behandelt und sodann mit Tritium-Thymidin gepulst. Die Ergebnisse in 2 zeigen, dass CT1558 und CyA die proliferative Reaktion vermindern. Jedoch ist die CyA-Inhibierung irreversibel, wohingegen die CT1558-Inhibierung reversibel ist.
Beispiel 7
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkungen von CT1520, CT1548, CT1521 und PTX beim Schützen von L929-Zellen aus Maus vor cytotoxischen Wirkungen von TNF. Dieses Verfahren ist ein in vitro-Modell für septischen Schock. L929-Zellen (10⁵/Well) wurden mit 300 ng/ml an menschlichem TNF mit oder ohne Arzneimittel (das eine Stunde vor der TNF-Zugabe zugegeben wurde) bei den in 3 gezeigten Konzentrationen behandelt. Einen Tag später wurden die Zellen hinsichtlich der Lebensfähigkeit unter Verwendung von BCECF angefärbt und die Fluoreszenz wurde hinsichtlich der Lebensfähigkeit unter Verwendung eines Millipore-Fluoreszenzplattenauslesegeräts analysiert. Die in 3 gezeigten Ergebnisse veranschaulichen, dass die wirksamsten cytoprotektiven Wirkungen mit CT1520 und CT1548 festgestellt wurden.
Beispiel 8
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkungen von CT1548 und CT1558 auf eine Inhibierung einer PDGF-induzierten Proliferation in menschlichen Knochenmarksstromazellen. Menschliche Knochenmarksstromazellen wurden in serumfreiem Medium 24 Stunden Mangelbedingungen ausgesetzt. hungern gelassen und sodann mit 50 ng/ml PDGF-BB stimuliert. Die Arzneimittel wurden bei verschiedenen Konzentrationen eine Stunde vor der PDGF-Stimulation zugegeben. Tritium-Thymidin wurde an dem Zeitpunkt einer PDGF-Stimulation zugegeben und den Zellen wurde ermöglicht, es 24 Stunden einzubauen. Zellen wurden geerntet und die Zellproliferation gemessen (4). Hintergrundsauszählungen (d. h. Zellen unter Mangelbedingungen) betrugen etwa 10% der Kontrollmengen.
Beispiel 9
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkungen von CT1558 (250 μmol), eine B-Zell-Proliferation zu inhibieren. Ramos B-Zell-Tumorzellen wurden mit CT1558 eine Stunde vor einer Stimulation mit Anti-mu-Antikörper oder PMA (5 nM) behandelt. Einen Tag später wurde den Zellen erlaubt, Tritium-Thymidin einzubauen, und die Proliferation wurde bestimmt (5). CT1558 inhibierte die Proliferationsreaktion.
Beispiel 10
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkungen von CT1521 und CT1558 auf eine Thymocytenproliferation, die durch IL-1 oder ConA stimuliert wurde. Die Daten sind in 6 gezeigt. Arzneimittel wurden zwei Stunden vor einer Stimulation zugegeben. Beide Arzneimittel inhibierten die Proliferation von Thymocyten.
Beispiel 11
Dieses Beispiel veranschaulicht ein Syntheseverfahren von 1-[5-(Undecylamino)hexyl]-3,7-dimethylxanthin. Ein Gemisch aus Theobromin (1,0 g, 5,5 mmol, von Sigma) und 50% Natriumhydrid in Öl (264 mg, 5,5 mmol) und Dimethylsulfoxid (20 ml) wurde 50 Minuten gerührt, wonach 6-Brom-1-hexanol (1,0 g, 5,5 mmol, von Aldrich) zugegeben wurde. Nach 18-stündigem Rühren wurde die Lösung mit Wasser (50 ml) behandelt und sodann mit zwei 25 ml-Aliquots an Hexan extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit 25% Ethanol/Dichlormethan (3 × 35 ml) extrahiert und die vereinigten Ethanol-Dichlormethan-Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck verdampft. Das verbleibende Dimethylsulfoxid wurde durch Destillation unter vermindertem Druck von 1 Torr (1 mm Hg) entfernt, um 1,4 g 1-(6-Hydroxyhexyl)-3,7-dimethylxanthin (91% Ausbeute) als ein weißes Pulver zu ergeben.
Dimethylsulfoxid (156 ml, 172 mg, 2,2 mmol) wurde langsam zu einer Lösung aus Oxalylchlorid (103 ml, 150 mg, 1,2 mmol) in Dichlormethan (5 ml) bei –78°C gegeben. Eine Lösung aus 1-(6-Hydroxyhexyl)-3,7-dimethylxanthin (300 mg, 1,1 mmol) in Methylenchlorid (5 ml) wurde zugegeben, gefolgt von 15-minütigem Rühren. Das Kühlbad wurde nach Zugabe von Triethylamin (765 ml, 555 mg, 5,5 mmol) entfernt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur zu 20 ml Wasser gegeben und mit Methylenchlorid (3 × 50 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt und mit 1%iger wässriger Chlorwasserstoffsäure-Lösung (20 ml), gesättigtem Natriumbicarbonat (20 ml) und Kochsalzlösung (20 ml) gewaschen und sodann über Natriumsulfat getrocknet. Eine Verdampfung des Lösungsmittels und eine Rekristallisierung des Rückstands in Chloroform/Petrolether ergibt 267 mg an 1-(6-Oxohexyl)-3,7-dimethylxanthin (87% Ausbeute).
Natriumcyanoborhydrid (63 mg, 1,0 mmol) wurde zu einem Gemisch aus 1-(6-Oxohexyl)-3,7-dimethylxanthin (150 mg, 0,5 mmol), Undecylamin (0,43 ml, 2,5 mmol), 38%iger wässriger Chlorwasserstoffsäure-Lösung (0,2 ml, 2,5 mmol), Methanol (5 ml) und Tetrahydrofuran (5 ml) gegeben. Das sich ergebende Gemisch wurde 48 Stunden gerührt. Eine gesättigte wässrige Ammoniumchloridlösung (20 ml) wurde zu dem gerührten Gemisch gegeben, gefolgt von zusätzlichen 20-minütigem Rühren und Zugabe einer 30%igen wässrigen Ammoniumhydroxidlösung (30 ml). Das Gemisch wurde mit 25% Methanol/Dichlormethan (3 × 35 ml) extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck verdampft, was 190 mg an 1-[5-(Undecylamino)hexyl]-3,7-dimethylxanthin (86% Ausbeute) ergab.
Beispiel 12
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkungen von 1-[5-(Undecylamino)hexyl]-3,7-dimethylxanthin auf eine PDGF-induzierte Proliferation in menschlichen Knochenmarksstromazellen. Wie in Beispiel 9 wurden menschliche Knochenmarksstromazellen in serumfreiem Medium 24 Stunden Mangelbedingungen ausgesetzt und sodann mit 50 ng/ml PDGF-BB stimuliert. Die Arzneimittel wurden bei verschiedenen Konzentrationen eine Stunde vor einer PDGF-Stimulation zugegeben. Tritium-Thymidin wurde zu dem Zeitpunkt einer PDGF-Stimulation zugegeben und den Zellen wurde ermöglicht, es 24 Stunden einzubauen. Zellen wurden geerntet und die Zellproliferation wurde mit Hintergrundsauszählungen (d. h. Zellen unter Mangelbedingungen) bei etwa 10% an Kontrollmengen gemessen. Die 7 veranschaulicht die Inhibierung der erfindungsgemäßen Verbindung einer PDGF-induzierten Proliferation bei verschiedenen Konzentrationen (μM).
Beispiel 13
Dieses Beispiel zeigt eine inhibitorische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung 1-[5-(Undecylamino)hexyl]-3,7-dimethylxanthin auf eine Thymocytenproliferation und -aktivierung bei verschiedenen Konzentrationen der Verbindungen (IC50) für eine Proliferation von Thymocyten aus Mäusen, die durch Concanavalin A (Con A) und Interleukin-2 alpha (IL-2) costimuliert wurden. Con A, das zum Aktivieren von CD3 verwendet wird, zusammen mit einer IL-2-Costimulation induziert eine T-Zell-Proliferation und -differenzierung.
Thymusdrüsen, die von normalen weiblichen Balb/C-Mäusen erhalten wurden, wurden aufgebrochen und in 96-Well-Platten bei einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/Well ausplattiert. Con A (0,25 mg/ml) und IL-2 (15 U/ml) wurden zu den Wells gegeben. Die Zellen wurden 4 Tage bei 37°C inkubiert. Am Tag 4 wurde den Zellen ermöglicht, Tritium-Thymidin einzubauen, und sie wurden zusätzliche 4 Stunden inkubiert. Eingebautes Tritium-Thymidin von geernteten Zellen wurde in einem Flüssigkeitsszintillationszähler bestimmt. Arzneimitteldosen (in 8 gezeigt, μM) wurden zwei Stunden vor der Con A- und IL-2-Aktivierung zugegeben. Hintergrundsauszählungen betrugen weniger als 200 cpm. Die getesteten erfindungsgemäßen Verbindungen inhibieren eine Thymocytenproliferation und -aktivierung bei relativ niedrigen Konzentrationen mit einem IC50-Wert von 2,3 μM.

Claims

Verbindungen der allgemeinen Formel: (R)_j-(Kerngruppe), einschließlich von getrennten Enantiomeren, Diastereomeren, Hydraten, Salzen, Solvaten und Gemischen davon, wobei j eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, die Kerngruppe ein Xanthinrest ist und die Verbindungen die allgemeine Formel II:
aufweisen, R aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Wasserstoffatom, Halogenatomen und Hydroxyl-, Amino- oder Benzyl-, Alkyl(C_1-6)- oder Alkenylgruppen mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, die unsubstituiert oder durch eine Hydroxygruppe, ein Halogenatom oder eine Dimethylaminogruppe substituiert sind, und mindestens eine R-Gruppe die allgemeine Formel I:
aufweist, worin n eine ganze Zahl von 4 bis 18 ist, jede R'₁- und R'₂-Gruppe unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Alkyl(C_1-4)- oder Alkenylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls durch ein Sauerstoffatom unterbrochen, ist und jede R'₃- und R'₄-Gruppe unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe ist, mit der Maßgabe, dass R keine C₆-Alkylaminogruppe ist.
Verbindungen nach Anspruch 1, wobei die R'₁- und R'₂-Alkyl- oder -Alkenylgruppe durch ein Sauerstoffatom unterbrochen ist.
Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, wobei n eine ganze Zahl von 4 bis 12 ist.
Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, wobei die R'₁- und R'₂-Gruppen unabhängig voneinander Wasserstoffatome oder Methylgruppen sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienz.