ES2226422T3 - Delta-lactonas sustituidas en gamma con fenilo y sus analogos y usos relacionados con ellas. - Google Patents

Delta-lactonas sustituidas en gamma con fenilo y sus analogos y usos relacionados con ellas.

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ES2226422T3 ES99941351T ES99941351T ES2226422T3 ES 2226422 T3 ES2226422 T3 ES 2226422T3 ES 99941351 T ES99941351 T ES 99941351T ES 99941351 T ES99941351 T ES 99941351T ES 2226422 T3 ES2226422 T3 ES 2226422T3
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David L. Burgoyne
Ronald W. Lauener
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Abstract

Una composición que comprende un compuesto según la fórmula (1) y sus sales, solvatos, estereoisómeros aislados, y mezclas, y un vehículo, diluyente, o excipiente, farmacéuticamente aceptable, **(Fórmula)** donde cada uno de los hidrógenos Ha, Hb, Hc, Hd, He, Hf y Hg puede estar independientemente reemplazado con un grupo seleccionado entre -W y -R7(W)n, y M1 representa -W o -R7(W)n, donde W se selecciona entre -NH2, -CONH2, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO2, -SH, -COX, -NHR8, -NR8R8, -CONHR8, -CONR8R8, -COOR8, -COR8, -OCOR8, -OR8, -BH2, -BHR8, -BR8R8, -BO2H2, -BO2R8R8, -PH2, -PHR8, -PR8R8, -PO2R8R8, -PO3R8R8, -SR8; -SOR8, -SO2R8, -SONH2, -SONHR8, -SONR8R8, -SO2NH2, -SO2NHR8 y -SO2NR8R8; R7 es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C1-C30, donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R7 están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición; R8 es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C1-C30; n se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y X se selecciona entre -Br, -Cl, -F, -I.

Description

\Delta-lactonas sustituidas en \gamma con fenilo y sus análogos y usos relacionados con ellas.
Campo técnico
Esta invención se refiere a los compuestos de \Delta-lactona y sus análogos tales como las lactamas, y en particular a la \Delta-lactona sustituida en \gamma con fenilo y sus análogos, y a los usos terapéuticos relacionados con ellos.
Antecedentes de la invención La respuesta inflamatoria (inflamación)
La inflamación es una respuesta del hospedante localizada esencial frente a los microorganismos invasores o frente a las lesiones de los tejidos, que implica a las células del sistema inmunitario. Los signos clásicos de la inflamación incluyen enrojecimiento (eritema), hinchazón (edema), dolor y aumento de la producción de calor (pirema) en el sitio de la lesión. La respuesta inflamatoria permite que el cuerpo reconozca específicamente y elimine un organismo invasor y/o repare las lesiones de los tejidos. Muchos de los cambios agudos en el sitio de la inflamación son directa o indirectamente atribuibles a la afluencia masiva de leucocitos (por ejemplo, neutrófilos, eosinófilos, linfocitos, monocitos) que es intrínseca a esta respuesta. La infiltración y acumulación de leucocitos en los tejidos da como resultado su activación y la subsiguiente liberación de los mediadores inflamatorios tales como LTB_{4}, prostaglandinas, TNF-\alpha, IL-1\beta, IL-8, IL-5, IL-6, histamina, proteasas y especies reactivas al oxígeno, por ejemplo.
La inflamación normal es un proceso altamente regulado que está estrechamente controlado en varios niveles para cada uno de los tipos de células implicados en la respuesta. Por ejemplo, la expresión de la citoquina pro-inflamatoria TNF-\alpha, está controlada en el nivel de la expresión génica, traducción, modificación post-traduccional y liberación de la forma madura desde la membrana celular. Muchas de las proteínas que están reguladas por incremento durante inflamación, están controladas por el factor de transcripción, NF-\kappaB. Las respuestas pro-inflamatorias normalmente están contrarrestadas por mecanismos anti-inflamatorios endógenos tales como la generación de IL-10 o IL-4. Una característica de una respuesta inflamatoria normal es que es de naturaleza temporal y va seguida por una fase de resolución que lleva el estado del tejido de nuevo a su condición anterior. La fase de resolución se cree que implica la regulación por incremento de los mecanismos anti-inflamatorios, tales como IL-10, así como la regulación por disminución de los procesos pro-inflamatorios.
Enfermedades inflamatorias
La enfermedad inflamatoria aparece cuando se inicia una respuesta inflamatoria que es inapropiada y/o no se resuelve una respuesta inflamatoria de la manera normal sino que más bien persiste y acaba en un estado inflamatorio crónico. La enfermedad inflamatoria puede ser sistémica (por ejemplo, lupus) o localizada en tejidos u órganos particulares y representa una enorme carga personal y económica sobre la sociedad. Ejemplos de algunas de las enfermedades inflamatorias más comunes y problemáticas, son la artritis reumatoide, la enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis, asma, enfisema, colitis y lesiones por isquemia-reperfusión.
Un tema subyacente común en la enfermedad inflamatoria es una perturbación de la respuesta inmunitaria celular que produce el reconocimiento de las proteínas del hospedante (antígenos) como extrañas. De este modo, la respuesta inflamatoria resulta dirigida erróneamente hacia los tejidos del hospedante con células efectoras que tienen como objetivos órganos o tejidos específicos produciendo a menudo un daño irreversible. El aspecto del propio reconocimiento de la enfermedad auto-inmune se refleja a menudo por la expansión clonal de los subgrupos de células T caracterizados por un subtipo particular de receptores de células T (TCR) en la enfermedad. Frecuentemente, la enfermedad inflamatoria se caracteriza también por un desequilibrio en los niveles de los subgrupos de células T ayudadoras (Th) (esto es, células Th1 frente a células Th2).
Las estrategias terapéuticas dirigidas a curar las enfermedades inflamatorias usualmente pertenecen a una de estas dos categorías; (a) modulación por disminución de los procesos que son regulados por incremento en la enfermedad o (b) regulación por incremento de las rutas anti-inflamatorias en las células o tejidos afectados. La mayor parte de los regímenes actualmente empleados en la clínica caen dentro de la primera categoría. Algunos ejemplos de ellos son los corticosteroides y los fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (los NSAID).
Muchos de los tejidos, procesos celulares y bioquímicos que son perturbados en la enfermedad inflamatoria han sido aclarados y esto ha permitido el desarrollo de modelos experimentales o ensayos que imitan la enfermedad. Estos ensayos in vitro permiten la selección y el cribado de compuestos con una alta probabilidad de eficacia terapéutica en la enfermedad inflamatoria pertinente. De este modo, los ensayos actualmente empleados usados para modelar la importancia de los leucocitos activados en el desarrollo de la inflamación aguda y en el mantenimiento del estado inflamatorio crónico son los ensayos que monitorizan la quimiotaxis de los leucocitos y la desgranulación celular y la síntesis de citoquinas y ensayos de producción in vitro de las especies reactivas al oxígeno (ROS). Puesto que un resultado de la activación de los neutrófilos aguda o crónica es la liberación de ROS con el daño resultante para el tejido, un ensayo de los captadores de ROS permite la detección de compuestos con potencial eficacia terapéutica. Los ensayos celulares para detectar los inhibidores de la liberación de TNF-\alpha a partir de los macrófagos o células monocíticas estimuladas, son un componente importante de un modelo de inflamación in vitro ya que esta citoquina está regulada por incremento y se ha demostrado que contribuye a la patología de muchas enfermedades inflamatorias. Puesto que se ha demostrado que el cAMP elevado en las células afectadas modula o apaga la respuesta inflamatoria, la monitorización de los niveles de AMP cíclico celular (cAMP), y la actividad de las rutas que controlan los niveles de cAMP permite la detección de potenciales compuestos anti-inflamatorios. Los ensayos pueden incluir la monitorización del nivel del propio cAMP, la actividad de la fosfodiesterasa, o los cambios en la actividad del elemento de respuesta de cAMP (CRE), la luciferasa.
Artritis reumatoide
La artritis reumatoide (RA), la forma más común de artritis inflamatoria, es un trastorno auto-inmune de etiología desconocida que afecta al 1% de la población adulta y se caracteriza por la sinovitis (inflamación del revestimiento sinovial de la articulación) simétrica, crónica, erosiva y con frecuente implicación de multisistemas. De modo interesante, es de 3-6 veces más prevalente en mujeres que en hombres. La mayoría de los pacientes presentan un desarrollo crónico y fluctuante de la enfermedad que, si se deja sin tratar, produce la destrucción progresiva de la articulación, deformidad, discapacidad, y muerte prematura. Los síntomas indicativos de RA incluyen dolor e hinchazón de las articulaciones (usualmente simétrico), entumecimiento matinal de las articulaciones y músculos, debilidad/fatiga general y fiebre y pérdida de peso. La RA ocasiona más de 9 millones de visitas al médico y más de 250.000 hospitalizaciones al año en los Estados Unidos cada año. Afecta frecuentemente a los pacientes en sus años más productivos, y por ello, la discapacidad produce importantes pérdidas económicas.
Los recientes conocimientos han establecido que los antecedentes genéticos, especialmente la estructura de los genes del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II, desempeña un papel crítico en la susceptibilidad de un individuo y en la gravedad de la enfermedad. El conocimiento actual de las relaciones entre citoquina, quimioquinas, factores de crecimiento y moléculas de adhesión han llevado a la apreciación de que las rutas dependientes de las células T y las independientes de las células contribuyen a la iniciación y perpetuación de la artritis reumatoide. Además, se ha aprendido mucho acerca de los acontecimientos específicos celulares y bioquímicos responsables de la destrucción del hueso y del cartílago que caracteriza este trastorno. A nivel de los tejidos, la RA se caracteriza por hiperplasia sinovial, hipertrofia, angiogénesis y unión e invasión de los fibroblastos sinoviales dentro del cartílago y hueso adyacentes. En la RA activa están aumentados los niveles de las citoquinas pro-inflamatorias TNF-\alpha, IL-1 y IL-6 con relación a las citoquinas anti-inflamatorias en las articulaciones afectadas.
Tratamientos actuales de la artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias
Actualmente no hay ni curación ni prevención (profilaxis) disponible para la artritis reumatoide, solamente regímenes que tratan los síntomas tales como el dolor y el entumecimiento. Las cinco principales modalidades de tratamiento para esta enfermedad incluyen medicación (farmacológica), tratamiento físico (ejercicio), protección de las articulaciones y cambios en el estilo de vida y cirugía.
Los compuestos terapéuticos para la artritis reumatoide se pueden dividir en tres grupos: fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (los NSAID), fármacos antirreumáticos que modifican la enfermedad (los DMARD) conocidos también como agentes de segunda línea y los corticosteroides.
Los NSAID reducen el dolor a dosis bajas y alivian alguno de los síntomas inflamatorios (hinchazón y entumecimiento) a dosis más altas a través de la inhibición de la síntesis de las prostaglandinas. Ejemplos de NSAID que no requieren receta médica, incluyen ácido acetilsalicílico (ASA®, Aspirin®, Anacin®, etc.) e ibuprofeno (Motrin®, Advil®, etc.). Ejemplos de NSAID que requieren receta médica incluyen Naprosin®, Relafen®, Indocid®, Voltaren®, Feldene® y Clinoril®. Aunque estos medicamentos se ocupan de modo efectivo del componente inflamatorio agudo de la artritis reumatoide, sólo tratan los síntomas y no cambian el progreso de la enfermedad subyacente. Los efectos secundarios perjudiciales de los NSAID pueden ser serios con la administración prolongada y son principalmente gastrointestinales (ardor de estómago, hemorragias o úlceras).
Los DMARD se prescriben a menudo si la inflamación persiste durante más de 6 semanas o cuando la artritis afecta a muchas articulaciones simultáneamente. Se administran usualmente en adición a un NSAID o un esteroide. Muchos DMARD actúan deprimiendo las células inmunitarias implicadas en la respuesta inflamatoria haciendo de este modo más lenta la progresión de la enfermedad. Sin embargo, son incapaces de invertir los daños permanentes de la articulación. Los fármacos más comunes de esta clase son las sales de oro, metotrexato, azatioprina, sulfasalazina, hidroxicloroquina, penicilamina y cloroquina. Los DMARD necesitan a menudo varias semanas para que se vean los efectos beneficiosos y en muchos casos se desconoce el modo exacto de eficacia en la artritis reumatoide. Los efectos secundarios son numerosos incluyendo úlceras bucales, erupciones cutáneas, diarrea y náuseas. Los efectos secundarios más serios que necesitan una cuidadosa monitorización a través de análisis regulares de sangre y orina incluyen daños al hígado y riñón, reducción excesiva del recuento de glóbulos blancos (inmunodepresión) y del recuento de plaquetas (coagulación sanguínea).
Los corticosteroides se prescriben frecuentemente a los pacientes de RA con inflamación extrema acompañada por dolor severo, hinchazón y entumecimiento de las articulaciones. Se usan también para tratar la artritis reumatoide sistémica que puede afectar al revestimiento de los pulmones y de los vasos sanguíneos. La vía de administración es usualmente oral (esto es, prednisona) pero también se puede inyectar el fármaco directamente en la articulación afectada, vena, músculo o sitio alternativo de inflamación. Los efectos secundarios por el uso a largo plazo de esteroides en la artritis reumatoide son serios e incluyen cataratas, hipertensión, pérdida muscular, contusiones, adelgazamiento de piel y huesos, ganancia de peso, diabetes y susceptibilidad a la infección.
El documento US-A-4616089 describe composiciones anti-inflamatorias que contienen compuestos con lactonas insaturadas de 5 miembros. Los documentos DE- A-19604377, DE-A-4207301, US-A-3607885 y Tetrahidron Asymmetry, Vol. 6, page 893-900, describen todos ellos, lactonas de 6 miembros sustituidas en la posición 4 con grupos fenilo.
Aunque sólo el 5% de los pacientes diagnosticados con artritis reumatoide desarrollará la enfermedad más grave (que implica debilitamiento y daños irreversibles de la articulación) aquellos que la desarrollan, ciertamente no disponen de un conjunto ideal de compuestos terapéuticos disponibles para tratar satisfactoriamente y/o curar la enfermedad. Los NSAID actualmente disponibles (incluso los inhibidores selectivos de la COX-2) pueden mejorar satisfactoriamente los síntomas agudos de la artritis reumatoide tales como hinchazón, dolor y entumecimiento de las articulaciones. Sin embargo no afectan ni a la progresión de la destrucción de la articulación ni efectúan ninguna inversión de la erosión articular o ósea. Los fármacos de la segunda línea tales como los DMARD o los corticosteroides pueden hacer más lenta la progresión de la enfermedad temporalmente y reducir los síntomas, pero usualmente adolecen de un perfil inaceptable de efectos secundarios o de una respuesta variable del paciente y no pueden invertir el daño existente en las articulaciones. Existe la necesidad importante de agentes terapéuticos que paren o inviertan de manera efectiva la progresión de la enfermedad en la artritis reumatoide.
Sumario de la invención
En un aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un compuesto según la fórmula (1) y sus sales, solvatos, estereoisómeros aislados, y mezclas, y un vehículo, diluyente, o excipiente, farmacéuticamente aceptable,
1
donde cada uno de los hidrógenos H_{a}, H_{b}, H_{c}, H_{d}, H_{e}, H_{f} y H_{g} puede estar independientemente reemplazado con un grupo seleccionado entre -W y - R^{7}(W)_{n}, y M_{1} representa -W o -R^{7}(W)_{n}, donde
W se selecciona entre -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, -OR^{8}, -BH_{2}, -BHR^{8}, -BR^{8}R^{8}, -BO_{2}H_{2}, -BO_{2}R^{8}R^{8}, -PH_{2}, -PHR^{8}, -PR^{8}R^{8}, -POR^{8}, -PO_{2}R^{8}, -PO_{3}R^{8}, -SR^{8}; -SOR^{8}, -SO_{2}R^{8}, -SONH_{2}, -SONHR^{8}, -SONR^{8}R^{8}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NHR^{8} y -SO_{2}NR^{8}R^{8};
R^{7} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30},donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R^{7} están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición;
R^{8} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30};
n se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y
X se selecciona entre -Br, -Cl, -F, -I.
En otros aspectos de la composición que comprende un compuesto de la fórmula (1): H_{a} y H_{b} son hidrógeno; H_{a} es hidrógeno y H_{b} es -W; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -W y el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración S; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -W, y el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración R; H_{a} es hidrógeno y H_{b} es -R^{7}(W)_{n}; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -R^{7}(W)_{n}, y el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración S; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -R^{7}(W)_{n}, y el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración R; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -R^{7}(W)_{n}, H_{b} es -CH_{2}-fenilo, y el fenilo tiene 0, 1 o 2 sustituciones W; H_{c} es W; H_{d} y H_{e} son ambos hidrógeno; H_{f}es W; H_{f} se selecciona entre -OH y -OR^{8}; H_{f} se selecciona entre metoxi, etoxi, propoxi, ciclopentiloxi, ciclohexiloxi, y benciloxi; H_{f} se selecciona entre -NH_{2}, -NHR^{8}, y -NR^{8}R^{8}; H_{g} es -R^{7}(W)_{n}; M_{1} es -W; M_{1} se selecciona entre metoxi, etoxi, propoxi, ciclopentiloxi, ciclohexiloxi, y benciloxi; M_{1} se selecciona entre -NH_{2}, -NHR^{8}, y -NR^{8}R^{8}; M_{1} se selecciona entre -OH y -OR^{8}; y/o M_{1} es -R^{7}(W)_{n}. En una realización, ninguno de H_{a}, H_{b}, H_{c}, H_{d}, H_{e}, H_{f} o H_{g} es un anillo heterocíclico.
El compuesto de la fórmula (1) puede tener la estereoquímica de la fórmula (1a)
2
El compuesto de la fórmula (1) puede tener la estereoquímica de la fórmula (1b)
3
En esta memoria, una referencia a los compuestos de la fórmula (1) incluye los compuestos de las fórmulas (1a) y (1b).
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un compuesto según la fórmula (2) y sus sales, solvatos, estereoisómeros aislados, y mezclas, y un vehículo, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable,
4
donde cada uno de los hidrógenos H_{a}, H_{b}, H_{c}, H_{d}, H_{e}, H_{f} y H_{g} puede estar independientemente reemplazado con un grupo seleccionado entre -W y -R^{7}(W)_{n}, y M_{2} representa -W, donde
W se selecciona entre -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OR, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, -OR^{8}, -BH_{2}, -BHR^{8}, -BR^{8}R^{8}, -BO_{2}H_{2}, -BO_{2}R^{8}R^{8}, -PH_{2}, -PHR^{8}, -PR^{8}R^{8}, -POR^{8}, -PO_{2}R^{8}, -PO_{3}R^{8}, -SR^{8}; -SOR^{8}, -SO_{2}R^{8}, -SONH_{2}, -SONHR^{8}, -SONR^{8}R^{8}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NHR^{8} y -SO_{2}NR^{8}R^{8};
R^{7} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30}, donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R^{7} están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición;
R^{8} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30};
n se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y
X se selecciona entre -Br, -Cl, -F, -I.
En otros aspectos de las composiciones que comprenden un compuesto de la fórmula (2): H_{a} y H_{b} son hidrógeno; H_{a} es hidrógeno y H_{b} es -W; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -W, y el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración S; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -W, y el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración R; H_{a} es hidrógeno y H_{b} es -R^{7}(W)_{n}; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -R^{7}(W)_{n}, y el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración S; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -R^{7}(W)_{n}, y el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración R; H_{a} es hidrógeno, y H_{b} es -CH_{2}-fenilo, donde el fenilo tiene 0, 1 ó 2 sustituciones W; H_{c} es W; H_{d} y H_{e} son ambos hidrógeno; H_{f} es hidrógeno y H_{g} es W; H_{g} se selecciona entre -OH y -OR^{8}; H_{g} se selecciona entre metoxi, etoxi, propoxi, ciclopentiloxi, ciclohexiloxi, y benciloxi; H_{g} se selecciona entre -NH_{2}, -NHR^{8}, y -NR^{8}R^{8}; H_{f} es hidrógeno y H_{g} es -R^{7}(W)_{n}; M_{2} se selecciona entre -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8},
-COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, y -OR^{8}; y/o M_{2} se selecciona entre -NH_{2}, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -OH, y -OR^{8}. En una realización preferida, ninguno de H_{a}, H_{b}, H_{c}, H_{d}, H_{e}, H_{f} o H_{g} puede estar reemplazado con un sistema de anillos heterocíclicos.
El compuesto de la fórmula (2) puede tener la estereoquímica de la fórmula (2a)
5
El compuesto de la fórmula (2) puede tener la estereoquímica de la fórmula (2b)
6
En esta memoria, una referencia a los compuestos de la fórmula (2) incluye la referencia a los compuestos de las fórmulas (2a) y (2b).
En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto según la fórmula (3) y sus sales, solvatos, estereoisómeros aislados, y mezclas,
7
donde cada uno de los hidrógenos H_{a}, H_{c}, H_{d}, H_{e}, H_{f} y H_{g} puede estar independientemente reemplazado con un grupo seleccionado entre -W y -R^{7}(W)_{n}, y H_{b} puede estar reemplazado con -W, donde
W se selecciona entre -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, -OR^{8}, -BH_{2}, -BHR^{8}, -BR^{8}R^{8}, -BO_{2}H_{2}, -BO_{2}R^{8}R^{8}, -PH_{2}, -PHR^{8}, -PR^{8}R^{8}, -POR^{8}, -PO_{2}R^{8}, -PO_{3}R^{8}, -SR^{8}; -SOR^{8}, -SO_{2}R^{8}, -SONH_{2}, -SONHR^{8}, -SONR^{8}R^{8}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NHR^{8} y -SO_{2}NR^{8}R^{8};
R^{7} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30}, donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R^{7} están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición;
R^{8} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30};
n se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y
X se selecciona entre -Br, -Cl, -F, -I.
En una realización preferida, al menos dos de H_{c}, H_{f}, y H_{g} no son hidrógeno. En otra realización preferida, Hg no es R^{7}(W)_{n}. En otra realización preferida, H_{g} no es ni hidrógeno ni R^{7}(W)_{n}. En otra realización preferida, ninguno de H_{a}, H_{b}, H_{c}, H_{d}, H_{e}, H_{f} o H_{g} es un anillo heterocíclico.
En otros aspectos, en el compuesto de la fórmula (3): H_{a} es hidrógeno; H_{a} no es hidrógeno, y el carbono al que está unido H_{a} tiene una configuración S; H_{a} no es hidrógeno y el carbono al que está unido H_{a} tiene una configuración R; H_{a} es -W; H_{a} es -R^{7}(W)_{n}; H_{a} es -CH_{2}-fenilo, y el fenilo tiene 0, 1 ó 2 sustituciones W; H_{b} es W; H_{b} es -CN; H_{c} y H_{d} son ambos hidrógeno; H_{e} es hidrógeno; H_{e} es hidrógeno y H_{f} es W; H_{e} es hidrógeno y H_{f} se selecciona entre -OH y -OR^{8}; H_{e} es hidrógeno y H_{f} se selecciona entre metoxi, etoxi, propoxi, ciclopentiloxi, ciclohexiloxi, y benciloxi; H_{e} es hidrógeno y H_{f} se selecciona entre -NH_{2}, -NHR^{8}, y -NR^{8}R^{8}; H_{g} es hidrógeno; H_{g} es -W; H_{g} se selecciona entre -OH y -OR^{8}; H_{g} se selecciona entre metoxi, etoxi, propoxi, ciclopentiloxi, ciclohexiloxi, y benciloxi; donde H_{g} se selecciona entre -NH_{2}, -NHR^{8}, y -NR^{8}R^{8}; H_{g} es -R^{7}(W)_{n}; y/o H_{g} es alquilo C_{1}-C_{30} y n = 0.
El compuesto de la fórmula (3) puede tener la estereoquímica de la fórmula (3a)
8
El compuesto de la fórmula (3) puede tener la estereoquímica de la fórmula (3b)
9
En esta memoria, una referencia a los compuestos de la fórmula (3) incluye la referencia a los compuestos de las fórmulas (3a) y (3b).
En otro aspecto, la presente invención proporciona compuestos de la fórmula (4)
10
donde, Q representa un átomo multivalente distinto de carbono; y
cada uno de los carbonos de las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, y 19 en la fórmula (4), así como Q en la medida en que pueda estar sustituido, está independientemente sustituido en cada caso con H, -W o -R^{7}(W)_{n}, donde
W se selecciona entre -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, -OR^{8}, -BH_{2}, -BHR^{8}, -BR^{8}R^{8}, -BO_{2}H_{2}, -BO_{2}R^{8}R^{8}, -PH_{2}, -PHR^{8}, -PR^{8}R^{8}, -POR^{8}, -PO_{2}R^{8}, -PO_{3}R^{8}, -SR^{8}; -SOR^{8}, -SO_{2}R^{8}, -SONH_{2}, -SONHR^{8}, -SONR^{8}R^{8}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NHR^{8} y -SO_{2}NR^{8}R^{8};
R^{7} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30}, donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R^{7} están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición;
R^{8} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30};
n se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y
X se selecciona entre -Br, -Cl, -F, -I.
En un aspecto, el compuesto de la fórmula (4) tiene la configuración S en el carbono 3. En otro aspecto, el compuesto de la fórmula (4) tiene la configuración R en el carbono 3. En otro aspecto, el compuesto de la fórmula (4) tiene la configuración S en el carbono 5. En otro aspecto, el compuesto de la fórmula (4) tiene la configuración R en el carbono 5. En otro aspecto, ninguno de los carbonos de las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, o 19 de la fórmula (4) está sustituido con un resto heterocíclico.
En otros aspectos, en el compuesto de la fórmula (4), así como en las composiciones que comprenden el compuesto de la fórmula (4) y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable: Q es O; Q es S; Q es NH; y/o Q es N(R^{7}(W)_{n}). En otros aspectos, el carbono o carbonos de la posición 4, o 6, y preferiblemente en ambas posiciones 4 y 6, están sustituidos exclusivamente con hidrógeno; el carbono de la posición 19 está sustituido con -W; el carbono de la posición 19 está sustituido con -NH_{2}, -NHR^{8}, o -NR^{8}R^{8}; el carbono de la posición 19 está sustituido con -CN, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, o -OR^{8}; un carbono de las posiciones 17 y 18 está sustituido con hidrógeno; al menos un carbono de las posiciones 17 y 18 está sustituido con -W; al menos un carbono de las posiciones 17 y 18 está sustituido con -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, o -OR^{8}; al menos un carbono de las posiciones 17 y 18 está sustituido con -NH_{2}, -NHR^{8}, o -NR^{8}R^{8}; y/o al menos un carbono de las posiciones 17 y 18 está sustituido con -CN, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, o -OR^{8}. En otro aspecto, solamente uno de los carbonos de las posiciones 17, 18 y 19 está sustituido con hidrógeno. En otro aspecto, exactamente dos de los carbonos de las posiciones 17, 18 y 19 están sustituidos con hidrógeno. En otro aspecto, ninguno de los carbonos de las posiciones 17, 18 y 19 está sustituido con hidrógeno. En otro aspecto, no más de uno de los carbonos de las posiciones 17, 18 y 19 están sustituidos con hidrógeno.
En otros aspectos, en el compuesto de la fórmula (4), así como en las composiciones que comprenden el compuesto de la fórmula (4) y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable: el carbono de la posición 7 está sustituido exclusivamente con hidrógeno; el carbono de la posición 3 está sustituido con hidrógeno; el carbono de la posición 3 está sustituido con -W; el carbono de la posición 3 está sustituido con halógeno; el carbono de la posición 3 está sustituido con -R^{7}(W)_{n}; el carbono de la posición 3 está sustituido con hidrocarbilo C_{1}-C_{6}; los carbonos de las posiciones 9 y 10 están sustituidos con hidrógeno; los carbonos de las posiciones 11, 12, y 13 están independientemente sustituidos con hidrógeno y -W; solamente uno de los carbonos de las posiciones 11 y 12 está sustituido con hidrógeno; el carbono de la posición 11 y/o 12 está sustituido con -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, - CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, o -OR^{8}; el carbono de la posición 11 y/o 12 está sustituido con -NH_{2}, -NHR^{8}, o -NR^{8}R^{8}; el carbono de la posición 11 y/o 12 está sustituido con -CN, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, o -OR^{8}; el carbono de la posición 13 está sustituido con -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, o -OR^{8}; el carbono de la posición 13 está sustituido con -NH_{2}, -NHR^{8}, o -NR^{8}R^{8}; el carbono de la posición 13 está sustituido con -CN, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, o -OR^{8}; al menos un carbono de las posiciones 11, 12, y 13 está sustituido con -R^{7}(W)_{n}; y/o al menos un carbono de las posiciones 11, 12, y 13 está sustituido con hidrocarbilo C_{1}-C_{6} o halocarbilo C_{1}-C_{6} o hidrohalocarbilo C_{1}-C_{6}.
En otro aspecto, solamente uno de los carbonos de las posiciones 11, 12, y 13 está sustituido con hidrógeno. En otro aspecto, exactamente dos de los carbonos de las posiciones 11, 12, y 13 están sustituidos con hidrógeno. En otro aspecto, ninguno de los carbonos de las posiciones 11, 12, y 13 está sustituido con hidrógeno. En otro aspecto, no más de uno de los carbonos de las posiciones 11, 12, y 13 están sustituidos con hidrógeno.
En los compuestos de la fórmula (4), y en las composiciones que comprenden uno o más compuestos de la fórmula (4) y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, el carbono de la posición 6 preferiblemente no está sustituido ni con =O ni con =S; el carbono de la posición 4 preferiblemente no está sustituido con =O; el anillo fenilo unido al carbono de la posición 5 está preferiblemente sustituido con no más de 4 átomos de hidrógeno; el anillo fenilo unido al carbono de la posición 5 está preferiblemente sustituido con no más de 4 grupos R^{7}(W)_{n}, y/o los compuestos de la fórmula (4) preferiblemente excluyen la massonianalactona.
Por tanto, en un compuesto preferido de la fórmula (4), Q es O o NH, el carbono de la posición 6 no está sustituido ni con =O ni con =S; el carbono de la posición 4 no está sustituido con =O; el anillo fenilo unido directamente al carbono 5 está directamente sustituido en al menos una posición con un átomo distinto de carbono o hidrógeno; y la massonianalactona está excluida. La massonianalactona, que tiene el No. de Registro de CAS 150270-05-6, es conocida también como tetrahidro-3-hidroxi -5-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-3-[(4-hidroxi-3-metoxifenil)metil]-2H-piran-2-ona (3R-trans).
En una realización preferida, en los compuestos de la fórmula (4), y en las composiciones que comprenden un compuesto de la fórmula (4), Q es NH, y ambas posiciones 17 y 18 no están sustituidas con hidrógeno.
Los compuestos descritos aquí de las fórmulas 1, 2, 3 ó 4 (esto es, los compuestos de las fórmulas (1-4), o los compuestos de la presente invención), o las composiciones que comprenden uno o más de estos compuestos y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, se pueden usar en un método para tratar o prevenir una condición o enfermedad inflamatoria en un paciente, cuyo método comprende administrar al paciente que lo necesite una cantidad de un compuesto o composición según la presente invención, cuya cantidad es eficaz para tratar o prevenir la condición o enfermedad inflamatoria del paciente.
La condición o enfermedad inflamatoria puede ser una condición o enfermedad autoinmune; la condición o enfermedad inflamatoria puede incluir la inflamación aguda o crónica de los compartimentos de huesos y/o cartílago de las articulaciones; la condición o enfermedad inflamatoria puede ser una artritis seleccionada entre artritis reumatoide, artritis gotosa o artritis reumatoide juvenil; la condición o enfermedad inflamatoria puede ser asma; la condición o enfermedad puede estar asociada con la disrregulación de las células T; la condición o enfermedad puede estar asociada con niveles elevados de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, donde la citoquina inflamatoria es IL-2, o donde la citoquina inflamatoria es IFN-\gamma, o donde la citoquina inflamatoria es TNF-\alpha); la condición o enfermedad inflamatoria puede ser esclerosis múltiple; la condición o enfermedad inflamatoria puede ser sarcoidosis pulmonar; la condición o enfermedad inflamatoria puede ser inflamación ocular o alergia; la condición o enfermedad inflamatoria puede ser una enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, la enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa); y la condición o enfermedad inflamatoria puede ser una enfermedad inflamatoria cutánea (por ejemplo, psoriasis o dermatitis).
Además, la presente invención proporciona un método para modular los niveles intracelulares de adenosina-5'-monofosfato cíclico en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad de un compuesto o composición según la presente invención, cuya cantidad es eficaz para modular los niveles intracelulares de adenosina-5'-monofosfato cíclico del paciente. El paciente puede tener una condición o enfermedad inflamatoria.
Además, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o condición en un paciente, cuya enfermedad o condición está asociada con condiciones patológicas que se modulan inhibiendo las enzimas asociadas con mensajeros celulares secundarios, comprendiendo el método administrar a un paciente que lo necesite una cantidad de un compuesto o composición de la presente invención, cuya cantidad es eficaz para tratar o prevenir una enfermedad o condición asociada con condiciones patológicas que se modulan inhibiendo las enzimas asociadas con mensajeros celulares secundarios. La enzima puede ser una fosfodiesterasa de AMP-cíclico; o la enzima puede ser una fosfodiesterasa 4; o la enzima puede ser una fosfodiesterasa 3; o las enzimas pueden ser ambas, fosfodiesterasa 4 y fosfodiesterasa 3; o la enzima puede ser una fosfodiesterasa de GMP-cíclico.
Además, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir el rechazo de un trasplante en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad de un compuesto o composición de la presente invención, cuya cantidad es eficaz para tratar o prevenir el rechazo del trasplante en el paciente. El rechazo puede ser debido a la enfermedad del injerto frente al hospedante.
Además, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir la proliferación celular incontrolada en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad de un compuesto o composición según la presente invención, cuya cantidad es eficaz para tratar o prevenir la proliferación celular incontrolada en el paciente. La proliferación celular incontrolada puede ser causada por un cáncer seleccionado entre la leucemia y los tumores sólidos.
Además, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir enfermedades asociadas con el sistema nervioso central (CNS) en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad de un compuesto o composición según la presente invención, cuya cantidad es eficaz para tratar o prevenir las enfermedades asociadas con el sistema nervioso central (CNS) en el paciente. La enfermedad asociada con el sistema nervioso central (CNS) puede ser la depresión.
En un método de la presente invención, un compuesto de las fórmulas (1-4), o una composición que comprende uno o más compuestos de las fórmulas (1-4) y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, puede, aunque no es necesario, alcanzar uno o más de los siguientes resultados deseados en el sujeto al que se ha administrado un compuesto de las fórmulas (1-4) como se ha definido antes, o una composición que contiene uno de estos compuestos y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable:
1. Inhibición de la generación de especies reactivas al oxígeno a partir de los neutrófilos primarios;
2. Inhibición de la quimiotaxis de los neutrófilos;
3. Inhibición de la producción de TNF-\alpha;
4. Inhibición de edemas;
5. Captación de radicales de oxígeno;
6. Inhibición de las AMP-cíclico-fosfodiesterasas 1, 3 y/o 4, y las PDE relacionadas tales como PDE7;
7. Potenciar la inducción de la actividad de transcripción mediada por el CRE en las células monocíticas humanas;
8. Inhibición de PDE, preferiblemente PDE4, PDE3, o PDE3 y PDE4;
9. Inhibición de la producción de citoquina por los subgrupos de células T activadas;
10. Inhibición de la liberación de mieloperoxidasa de los neutrófilos;
11. Disminución de la relación de IC_{50}PDE4(cat):IC_{50}PDE4(HARBS);
12. Inhibición del rechazo de injertos;
13. Inhibición de los parámetros clínicos e histopatológicos de la enfermedad en la enfermedad inflamatoria del intestino; y
14. Inhibición de los parámetros clínicos e histopatológicos de la artritis en un modelo murino de artritis inducida por colágeno.
Estos y otros aspectos y realizaciones de la presente invención se aclararán con referencia a la siguiente descripción detallada. A este fin, se indican aquí diferentes referencias que describen en más detalle ciertos procedimientos, compuestos y/o composiciones, y que se incorporan aquí como referencia en su totalidad.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona compuestos, composiciones y métodos útiles en el tratamiento y/o prevención de diferentes enfermedades. Por ejemplo, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar y/o prevenir una enfermedad inflamatoria. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, o una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene un compuesto de las fórmulas o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, de cualquiera de los compuestos de las fórmulas (1-4) como se definen aquí.
En un aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un compuesto según la fórmula (1) y sus sales, solvatos, estereoisómeros aislados, y mezclas, y un vehículo, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable,
11
donde cada uno de los hidrógenos H_{a}, H_{b}, H_{c}, H_{d}, H_{e}, H_{f} y H_{g} puede estar independientemente reemplazado con un grupo seleccionado entre -W y -R^{7}(W)_{n}, y M_{1} representa -W o -R^{7}(W)_{n}, donde
W se selecciona entre -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, -OR^{8}, -BH_{2}, -BHR^{8}, -BR^{8}R^{8}, -BO_{2}H_{2}, -BO_{2}R^{8}R^{8}, -PH_{2}, -PHR^{8}, -PR^{8}R^{8}, -POR^{8}, -PO_{2}R^{8}, -PO_{3}R^{8}, -SR^{8}; -SOR^{8}, -SO_{2}R^{8}, -SONH_{2}, -SONHR^{8}, -SONR^{8}R^{8}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NHR^{8} y -SO_{2}NR^{8}R^{8};
R^{7} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30}, donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R^{7} están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición;
R^{8} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30};
n se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y
X se selecciona entre -Br, -Cl, -F, -I.
En otros aspectos de la composición que comprende un compuesto de la fórmula (1): H_{a} y H_{b} son hidrógeno; H_{a} es hidrógeno y H_{b} es -W; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -W y el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración S; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -W, y el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración R; H_{a} es hidrógeno y H_{b} es -R^{7}(W)_{n}; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -R^{7}(W)_{n}, y el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración S; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -R^{7}(W)_{n}, y el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración R; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -R^{7}(W)_{n}, H_{b} es -CH_{2}-fenilo, y el fenilo tiene 0, 1 ó 2 sustituciones W; H_{c} es W; H_{d} y H_{e} son ambos hidrógeno; H_{f} es W; H_{f} se selecciona entre -OH y -OR^{8}; H_{f} se selecciona entre metoxi, etoxi, propoxi, ciclopentiloxi, ciclohexiloxi, y benciloxi; H_{f} se selecciona entre -NH_{2}, -NHR^{8}, y -NR^{8}R^{8}; H_{g} es -R^{7}(W)_{n}; M_{1} es -W; M_{1} se selecciona entre metoxi, etoxi, propoxi, ciclopentiloxi, ciclohexiloxi, y benciloxi; M_{1} se selecciona entre -NH_{2}, -NHR^{8}, y -NR^{8}R^{8}; M_{1} se selecciona entre -OH y -OR^{8}; y/o M_{1} es -R^{7}(W)_{n}. En una realización, ninguno de H_{a}, H_{b}, H_{c}, H_{d}, H_{e}, H_{f} o H_{g} es un anillo heterocíclico.
El compuesto de la fórmula (1) puede tener la estereoquímica de la fórmula (1a)
12
El compuesto de la fórmula (1) puede tener la estereoquímica de la fórmula (1b)
13
En esta memoria una referencia a los compuestos de la fórmula (1) incluye los compuestos de las fórmulas (1a) y (1b).
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un compuesto según la fórmula (2) y sus sales, solvatos, estereoisómeros aislados, y mezclas, y un vehículo, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable,
14
donde cada uno de los hidrógenos H_{a}, H_{b}, H_{c}, H_{d}, H_{e}, H_{f} y H_{g} puede estar independientemente reemplazado con un grupo seleccionado entre -W y -R^{7}(W)_{n}, y M_{2} representa -W, donde
W se selecciona entre -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, -OR^{8}, -BH_{2}, -BHR^{8}, -BR^{8}R^{8}, -BO_{2}H_{2}, -BO_{2}R^{8}R^{8}, -PH_{2}, -PHR^{8}, -PR^{8}R^{8}, -POR^{8}, -PO_{2}R^{8}, -PO_{3}R^{8}, -SR^{8}; -SOR^{8}, -SO_{2}R^{8}, -SONH_{2}, -SONHR^{8}, -SONR^{8}R^{8}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NHR^{8} y -SO_{2}NR^{8}R^{8};
R^{7} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30}, donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R^{7} están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición;
R^{8} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30};
n se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y
X se selecciona entre -Br, -Cl, -F, -I.
En otros aspectos de las composiciones que comprenden un compuesto de la fórmula (2): H_{a} y H_{b} son hidrógeno; H_{a} es hidrógeno y H_{b} es -W; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -W, y el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración S; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -W, y el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración R; H_{a} es hidrógeno y H_{b} es -R^{7}(W)_{n}; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -R^{7}(W)_{n}, y el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración S; H_{a} es hidrógeno, H_{b} es -R^{7}(W)_{n}, y el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración R; H_{a} es hidrógeno, y H_{b} es -CH_{2}-fenilo, donde el fenilo tiene 0, 1 ó 2 sustituciones W; H_{c} es W; H_{d} y H_{e} son ambos hidrógeno; H_{f} es hidrógeno y H_{g} es W; H_{g} se selecciona entre -OH y -OR^{8}; H_{g} se selecciona entre metoxi, etoxi, propoxi, ciclopentiloxi, ciclohexiloxi, y benciloxi; H_{g} se selecciona entre -NH_{2}, -NHR^{8}, y -NR^{8}R^{8}; H_{f} es hidrógeno y H_{g} es -R^{7}(W)_{n}; M_{2} se selecciona entre -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8},
-COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, y -OR^{8}; y/o M_{2} se selecciona entre -NH_{2}, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -OH, y -OR^{8}. En una realización preferida, ninguno de H_{a}, H_{b}, H_{c}, H_{d}, H_{e}, H_{f} o H_{g} puede estar reemplazado con un sistema de anillos heterocíclicos.
El compuesto de la fórmula (2) puede tener la estereoquímica de la fórmula (2a)
15
El compuesto de la fórmula (2) puede tener la estereoquímica de la fórmula (2b)
16
En esta memoria, una referencia a los compuestos de la fórmula (2) incluye la referencia a los compuestos de las fórmulas (2a) y (2b).
En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto según la fórmula (3) y sus sales, solvatos, estereoisómeros aislados, y mezclas,
17
donde cada uno de los hidrógenos H_{a}, H_{c}, H_{d}, H_{e}, H_{f} y H_{g} puede estar independientemente reemplazado con un grupo seleccionado entre -W y -R^{7}(W)_{n}, y H_{b} puede estar reemplazado con -W, donde
W se selecciona entre -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, -OR^{8}, -BH_{2}, -BHR^{8}, -BR^{8}R^{8}, -BO_{2}H_{2}, -BO_{2}R^{8}R^{8}, -PH_{2}, -PHR^{8}, -PR^{8}R^{8}, -POR^{8}, -PO_{2}R^{8}, -PO_{3}R^{8}, -SR^{8}; -SOR^{8}, -SO_{2}R^{8}, -SONH_{2}, -SONHR^{8}, -SONR^{8}R^{8}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NHR^{8} y -SO_{2}NR^{8}R^{8};
R^{7} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30}, donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R^{7} están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición;
R^{8} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30};
n se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y
X se selecciona entre -Br, -Cl, -F, -I.
En una realización preferida, al menos dos de H_{c}, H_{f}, y H_{g} no son hidrógeno. En otra realización preferida, Hg no es R^{7}(W)_{n}. En otra realización preferida, H_{g} no es ni hidrógeno ni R^{7}(W)_{n}. En otra realización preferida, ninguno de H_{a}, H_{b}, H_{c}, H_{d}, H_{e}, H_{f} o H_{g} es un anillo heterocíclico.
En otros aspectos, en el compuesto de la fórmula (3): H_{a} es hidrógeno; H_{a} no es hidrógeno, y el carbono al que está unido H_{a} tiene una configuración S; H_{a} no es hidrógeno y el carbono al que está unido H_{a} tiene una configuración R; H_{a} es -W; H_{a} es -R^{7}(W)_{n}; H_{a} es -CH_{2}-fenilo, y el fenilo tiene 0, 1 ó 2 sustituciones W; H_{b} es W; H_{b} es -CN; H_{c} y H_{d} son ambos hidrógeno; H_{e} es hidrógeno; H_{e} es hidrógeno y H_{f} es W; H_{e} es hidrógeno y H_{f} se selecciona entre -OH y -OR^{8}; H_{e} es hidrógeno y H_{f} se selecciona entre metoxi, etoxi, propoxi, ciclopentiloxi, ciclohexiloxi, y benciloxi; H_{e} es hidrógeno y H_{f} se selecciona entre -NH_{2}, -NHR^{8}, y -NR^{8}R^{8}; H_{g} es hidrógeno; H_{g} es -W; H_{g} se selecciona entre -OH y -OR^{8}; H_{g} se selecciona entre metoxi, etoxi, propoxi, ciclopentiloxi, ciclohexiloxi, y benciloxi; donde H_{g} se selecciona entre -NH_{2}, -NHR^{8}, y -NR^{8}R^{8}; H_{g} es -R^{7}(W)_{n}; y/o H_{g} es alquilo C_{1}-C_{30} y n = 0.
El compuesto de la fórmula (3) puede tener la estereoquímica de la fórmula (3a)
18
El compuesto de la fórmula (3) puede tener la estereoquímica de la fórmula (3b)
19
En esta memoria, una referencia a los compuestos de la fórmula (3) incluye la referencia a los compuestos de las fórmulas (3a) y (3b).
En otro aspecto, la presente invención proporciona compuestos de la fórmula (4)
20
donde, Q representa un átomo multivalente distinto de carbono; y cada uno de los carbonos de las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, y 19 en la fórmula (4), así como Q en la medida en que pueda estar sustituido, está independientemente sustituido en cada caso con H, -W o -R^{7}(W)_{n}, donde
W se selecciona entre -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, -OR^{8}, -BH_{2}, -BHR^{8}, -BR^{8}R^{8}, -BO_{2}H_{2}, -BO_{2}R^{8}R^{8}, -PH_{2}, -PHR^{8}, -PR^{8}R^{8}, -POR^{8}, -PO_{2}R^{8}, -PO_{3}R^{8}, -SR^{8}; -SOR^{8}, -SO_{2}R^{8}, -SONH_{2}, -SONHR^{8}, -SONR^{8}R^{8}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NHR^{8} y -SO_{2}NR^{8}R^{8};
R^{7} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30}, donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R^{7} están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición;
R^{8} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30};
n se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y
X se selecciona entre -Br, -Cl, -F, -I.
En un aspecto, el compuesto de la fórmula (4) tiene la configuración S en el carbono 3. En otro aspecto, el compuesto de la fórmula (4) tiene la configuración R en el carbono 3. En otro aspecto, el compuesto de la fórmula (4) tiene la configuración S en el carbono 5. En otro aspecto, el compuesto de la fórmula (4) tiene la configuración R en el carbono 5. En otro aspecto, ninguno de los carbonos de las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, o 19 de la fórmula (4) está sustituido con un resto heterocíclico.
En otros aspectos, en el compuesto de la fórmula (4), así como en las composiciones que comprenden el compuesto de la fórmula (4) y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable: Q es O; Q es S; Q es NH; y/o Q es N(R^{7}(W)_{n}). En otros aspectos, el carbono o carbonos de la posición 4, o 6, y preferiblemente en ambas posiciones 4 y 6, están sustituidos exclusivamente con hidrógeno; el carbono de la posición 19 está sustituido con -W; el carbono de la posición 19 está sustituido con -NH_{2}, -NHR^{8}, o -NR^{8}R^{8}; el carbono de la posición 19 está sustituido con -CN, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, o -OR^{8}; un carbono de las posiciones 17 y 18 está sustituido con hidrógeno; al menos un carbono de las posiciones 17 y 18 está sustituido con -W; al menos un carbono de las posiciones 17 y 18 está sustituido con -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, o -OR^{8}; al menos un carbono de las posiciones 17 y 18 está sustituido con -NH_{2}, -NHR^{8}, o -NR^{8}R^{8}; y/o al menos un carbono de las posiciones 17 y 18 está sustituido con -CN, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, o -OR^{8}. En otro aspecto, solamente uno de los carbonos de las posiciones 17, 18 y 19 está sustituido con hidrógeno. En otro aspecto, exactamente dos de los carbonos de las posiciones 17, 18 y 19 están sustituidos con hidrógeno. En otro aspecto, ninguno de los carbonos de las posiciones 17, 18 y 19 está sustituido con hidrógeno. En otro aspecto, no más de uno de los carbonos de las posiciones 17, 18 y 19 están sustituidos con hidrógeno.
En otros aspectos, en el compuesto de la fórmula (4), así como en las composiciones que comprenden el compuesto de la fórmula (4) y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable: el carbono de la posición 7 está sustituido exclusivamente con hidrógeno; el carbono de la posición 3 está sustituido con hidrógeno; el carbono de la posición 3 está sustituido con -W; el carbono de la posición 3 está sustituido con halógeno; el carbono de la posición 3 está sustituido con -R^{7}(W)_{n}; el carbono de la posición 3 está sustituido con hidrocarbilo C_{1}-C_{6}; los carbonos de las posiciones 9 y 10 están sustituidos con hidrógeno; los carbonos de las posiciones 11, 12, y 13 están independientemente sustituidos con hidrógeno y -W; solamente uno de los carbonos de las posiciones 11 y 12 está sustituido con hidrógeno; el carbono de la posición 11 y/o 12 está sustituido con -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, o -OR^{8}; el carbono de la posición 11 y/o 12 está sustituido con -NH_{2}, -NHR^{8}, o -NR^{8}R^{8}; el carbono de la posición 11 y/o 12 está sustituido con -CN, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, o -OR^{8}; el carbono de la posición 13 está sustituido con -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, o -OR^{8}; el carbono de la posición 13 está sustituido con -NH_{2}, -NHR^{8}, o -NR^{8}R^{8}; el carbono de la posición 13 está sustituido con -CN, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, o -OR^{8}; al menos un carbono de las posiciones 11, 12, y 13 está sustituido con -R^{7}(W)n;
En otro aspecto, solamente uno de los carbonos de las posiciones 11, 12, y 13 está sustituido con hidrógeno. En otro aspecto, exactamente dos de los carbonos de las posiciones 11, 12, y 13 están sustituidos con hidrógeno. En otro aspecto, ninguno de los carbonos de las posiciones 11, 12, y 13 está sustituido con hidrógeno. En otro aspecto, no más de uno de los carbonos de las posiciones 11, 12, y 13 están sustituidos con hidrógeno.
En los compuestos de la fórmula (4), y en las composiciones que comprenden uno o más compuestos de la fórmula (4) y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, el carbono de la posición 6 preferiblemente no está sustituido ni con =O ni con =S; el carbono de la posición 4 preferiblemente no está sustituido con =O; el anillo fenilo unido al carbono de la posición 5 está preferiblemente sustituido con no más de 4 átomos de hidrógeno; el anillo fenilo unido al carbono de la posición 5 está preferiblemente sustituido con no más de 4 grupos R^{7}(W)_{n}, y/o los compuestos de la fórmula (4) preferiblemente excluyen la massonianalactona.
Por tanto, en un compuesto preferido de la fórmula (4), Q es O o NH, el carbono de la posición 6 no está sustituido ni con =O ni con =S; el carbono de la posición 4 no está sustituido con =O; el anillo fenilo unido directamente al carbono 5 está directamente sustituido en al menos una posición con un átomo distinto de carbono o hidrógeno; y la massonianalactona está excluida. La massonianalactona, que tiene el No. de Registro de CAS 150270-05-6, es conocida también como tetrahidro-3-hidroxi-5-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-3-[(4-hidroxi-3-metoxifenil)metil]-2H-piran-2-ona (3R-trans).
En los compuestos de las fórmulas (1-4):
W se selecciona entre -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, -OR^{8}, -BH_{2}, -BHR^{8}, -BR^{8}R^{8}, -BO_{2}H_{2}, -BO_{2}R^{8}R^{8}, -PH_{2}, -PHR^{8}, -PR^{8}R^{8}, -POR^{8}, -PO_{2}R^{8}, -PO_{3}R^{8}, -SR^{8}; -SOR^{8}, -SO_{2}R^{8}, -SONH_{2}, -SONHR^{8}, -SONR^{8}R^{8}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NHR^{8} y -SO_{2}NR^{8}R^{8};
R^{7} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30}, donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R^{7} están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición;
R^{8} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30};
n se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y
X se selecciona entre -Br, -Cl, -F, -I.
En las realizaciones preferidas: W se selecciona entre -NH_{2}, -NHR^{8} y -NR^{8}R^{8}; W se selecciona entre -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -COX, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}; W se selecciona entre -OCHO, -OR, -OCOR^{8} y -OR^{8}; W se selecciona entre -BH_{2}, -BHR^{8}, -BR^{8}R^{8}, -BO_{2}H_{2}, -BO_{2}R^{8}R^{8}, -PH_{2}, -PHR^{8}, -PR^{8}R^{8}, -POR^{8}, -PO_{2}R^{8}, -PO_{3}R^{8}, -SR^{8}; -SOR^{8}, -SO_{2}R^{8}, -SONH_{2}, -SONHR^{8}, -SONR^{8}R^{8}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NHR^{8} y -SO_{2}NR^{8}R^{8}; W se selecciona entre -NH_{2}, -CN, -X, -OR, -NO_{2}, -SH, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -OR^{8}, y -SR^{8}; y W es -OR^{8}.
En las realizaciones preferidas: R^{7} es un grupo hidrocarbilo C_{1}-C_{30}, donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R^{7} están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición; R^{7} es un grupo hidrocarbilo C_{1}-C_{10}, donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R^{7} están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición; y/o R^{7} se selecciona entre alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo sustituido con alquenilo, alquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con alquinilo, alquinilo sustituido con arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, bicicloalquilo, bicicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquenilcicloalquilo, alquinilcicloalquilo, cicloalquilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquilo, cicloalquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquenilo, cicloalquilo condensado con arilo y policicloalquilo.
En las realizaciones preferidas: R^{8} es un grupo hidrocarbilo C_{1}-C_{30}; R^{8} es un grupo hidrocarbilo C_{1}-C_{10}; y/o R^{8} se selecciona entre alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo sustituido con alquenilo, alquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con alquinilo, alquinilo sustituido con arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, bicicloalquilo, bicicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquenilcicloalquilo, alquinilcicloalquilo, cicloalquilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquilo, cicloalquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquenilo, cicloalquilo condensado con arilo y policicloalquilo.
En las realizaciones preferidas: n es 0; n es 1; n es 2; n es 3; n es 4; n es 5; n es mayor que 0; n es 1 ó 2; y n es 1 ó 2 ó 3.
En las realizaciones preferidas, ninguno de los H_{a} a H_{g} es un anillo heterocíclico.
En los compuestos anteriores, una sal farmacéuticamente aceptable incluye las sales de adición de ácido y las sales de adición de base.
Las sales de adición de ácido incluyen las sales formadas a partir de los compuestos de las fórmulas (1-4) y ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y/o ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico y similares.
Las sales de adición de base incluyen las sales formadas a partir de los compuestos de las fórmulas (1-4) y bases inorgánicas tales como las sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, cinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Las sales adecuadas incluyen las sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio derivadas de bases orgánicas no tóxicas farmacéuticamente aceptables que incluyen las sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas incluyendo las aminas sustituidas naturales, aminas cíclicas y resinas básicas de cambio iónico, tales como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, trimetamina, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaínas, hidrabamina, colina, betaína, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, y similares.
En los compuestos y composiciones anteriores, un grupo hidrocarbilo está formado exclusivamente de carbono e hidrógeno, e incluye por ejemplo, cualquiera entre alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, alquilarilo, arilo sustituido con alquenilo, alquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con alquinilo, alquinilo sustituido con arilo, biarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, bicicloalquilo, bicicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquenilcicloalquilo, alquinilcicloalquilo, cicloalquilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquilo, cicloalquenilo sustituido con arilo, arilo sustituido con cicloalquenilo, cicloalquilo condensado con arilo y policicloalquilo. Un grupo halocarbilo está formado exclusivamente de carbono y halógeno, e incluye los grupos hidrocarbilos identificados antes en los que cada hidrógeno está reemplazado con un halógeno seleccionado entre flúor, cloro, bromo y yodo, preferiblemente flúor y cloro. Un grupo hidrohalocarbilo, que también puede ser denominado halohidrocarbilo, está formado exclusivamente de carbono, hidrógeno y halógeno, e incluye los grupos hidrocarbilos específicos identificados antes en los que algunos pero no todos los átomos de hidrógeno están reemplazados con átomos de halógeno seleccionados entre flúor, cloro, bromo y yodo, preferiblemente flúor y/o cloro. Las definiciones representativas de estos grupos hidrocarbilos (que pueden estar sustituidos con átomos de halógeno para proporcionar sus derivados halocarbilo e hidrohalocarbilo) se dan a continuación.
"Alquilo" se refiere a una cadena acíclica de átomos de carbono que puede ser ramificada o no ramificada (lineal). El metilo, etilo, propilo (incluyendo n-propilo e iso-propilo), butilo (incluyendo n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, y t-butilo), pentilo (incluyendo numerosos isómeros) y hexilo (incluyendo numerosos isómeros), son grupos alquilos que tienen de 1 a 6 átomos de carbono (denominados comúnmente grupos alquilos inferiores), y son ejemplos de los grupos alquilos de la invención.
"Alquenilo" se refiere a un grupo alifático insaturado que tiene al menos un doble enlace.
"Alquinilo" se refiere a un grupo hidrocarburo insaturado que puede tener cadena lineal o ramificada y que tiene uno o más triples enlaces. Los grupos preferidos no tienen más de aproximadamente 12 átomos de carbono y pueden ser etilo, propinilo, 4-metilpentinilo y otros, y sus isómeros estructurales.
"Aralquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido con un radical arilo. Por ejemplo, bencilo.
"Aralquinilo" se refiere a un grupo alquinilo sustituido con un anillo arilo. Por ejemplo, ArC\equivC-, ArCH_{2}CH_{2}CH_{2}
C\equivC-, y otros.
"Cicloalquilo" se refiere a un ordenamiento cíclico de átomos de carbono, donde ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo son grupos cicloalquilo de la invención que tienen 3-6 átomos de carbono. Grupos adicionales dentro del alcance de "cicloalquilo" como se define aquí, son los grupos policicloalquilos, definidos más adelante.
"Cicloalquenilo" se refiere a un grupo alquenilo cíclico. Los grupos cicloalquenilo adecuados incluyen, por ejemplo, ciclopentenilo y ciclohexenilo.
Un grupo policicloalquilo es un ordenamiento de átomos de carbono, en el que al menos un átomo de carbono es una parte de al menos dos anillos identificables por separado. El grupo policicloalquilo puede contener un puente entre dos átomos de carbono, de los que son ejemplos representativos, biciclo[1.1.0]butilo, biciclo[3.2.1]octilo, biciclo[5.2.0]nonilo, triciclo[2.2.1.0^{1}]heptilo, norbornilo y pinanilo. El grupo policicloalquilo puede contener uno o más sistemas de anillos condensados, de los que el decalinilo (radical de decalino) y el perhidroantracenilo son ejemplos representativos. El grupo policicloalquilo puede contener una unión espiro, en la que un sólo átomo es el único miembro común de los dos anillos. Son ejemplos representativos, espiro[3.4]octilo, espiro[3.3]heptilo y espiro[4.5]decilo.
"Halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo y yodo.
Como se usan aquí, las siguientes abreviaturas tienen el significado que se indica:
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Cuando aparece alguna variable más de una vez en cualquier constituyente o en los compuestos de las fórmulas (1-4), su definición en cada caso es independiente de su definición en todos los otros casos. Las combinaciones de sustituyentes y/o variables son permisibles solamente si tales combinaciones dan como resultado compuestos estables. Los compuestos útiles en los métodos y composiciones de la presente invención, así como los compuestos de la presente invención, pueden tener centros asimétricos y presentarse como racematos, mezclas racémicas y como diastereoisómeros individuales, o enantiómeros, estando incluidas en la presente invención todas las formas isoméricas. Un racemato o mezcla racémica no implica una mezcla 50:50 de estereoisómeros.
En otra realización, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de las fórmulas (1-4) como se ha indicado antes, en combinación con un vehículo, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones se pueden usar para el tratamiento de la inflamación u otras condiciones como las descritas aquí. Estas composiciones pueden constituir también un medicamento, que se puede usar para el tratamiento, por ejemplo, de la inflamación.
Estas composiciones son útiles por ejemplo, como estándares de ensayo, medios convenientes para preparar envíos a granel, o composiciones farmacéuticas. Una cantidad analizable de un compuesto de la invención es una cantidad que es fácilmente medible por procedimientos y métodos de ensayo estándares que son bien conocidos y apreciados por los expertos en la técnica. Las cantidades analizables de un compuesto de la invención generalmente variarán desde aproximadamente 0,001% en peso hasta aproximadamente 80% en peso del peso total de la composición. Los vehículos inertes incluyen cualquier material que no se degrada o que no reacciona covalentemente de otro modo con un compuesto de las fórmulas (1-4). Ejemplos de vehículos inertes adecuados son agua; tampones acuosos, tales como los que se usan generalmente en el análisis por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC); disolventes orgánicos tales como acetonitrilo, acetato de etilo, hexano y similares; y los vehículos farmacéuticamente aceptables.
Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y están descritos por ejemplo en Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Go. (A.R. Gennaro edit. 1985). Por ejemplo, se pueden usar solución salina estéril y solución salina tamponada con fosfato a pH fisiológico. En la composición farmacéutica se pueden incluir conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso agentes aromatizantes. Por ejemplo, se pueden añadir benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres del ácido p-hidroxibenzoico como conservantes. Id. en 1449. Además, se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión. Id.
Por tanto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica o veterinaria (de aquí en adelante, denominada sencillamente composición farmacéutica) que contiene un compuesto de las fórmulas (1-4) como se ha descrito antes, en mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención proporciona además una composición, preferiblemente una composición farmacéutica, que contiene una cantidad eficaz de un compuesto de las fórmulas (1-4) como se ha descrito antes, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden estar en cualquier forma que permita que la composición sea administrada a un paciente. Por ejemplo, la composición puede estar en forma de un sólido, líquido o gas (aerosol). Las vías de administración típicas incluyen, sin limitación, las vías oral, tópica, parenteral, sublingual, rectal, vaginal, e intranasal. El término parenteral como se usa aquí incluye las inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intraesternal o las técnicas de perfusión. Las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan de tal modo que permita que los ingredientes activos contenidos en ellas sean biodisponibles después de la administración de la composición a un paciente. Las composiciones que serán administradas a un paciente toman la forma de una o más dosis unitarias, en las que, por ejemplo, un comprimido puede ser una sola dosis unitaria, y un recipiente de un compuesto de las fórmulas (1-4) en forma de aerosol puede contener una pluralidad de dosis unitarias.
Los materiales usados para preparar las composiciones farmacéuticas deben ser farmacéuticamente puros y no tóxicos en las cantidades usadas. Debe ser claro para los expertos normales en la técnica que la dosis óptima del ingrediente o ingredientes activos en la composición farmacéutica dependerá de una variedad de factores. Los factores relevantes incluyen, sin limitación, el tipo de sujeto (por ejemplo, un ser humano), la forma particular del ingrediente activo, el modo de administración y la composición empleada.
En general, la composición farmacéutica incluye un (donde, "un" significa aquí y a lo largo de esta memoria, uno o más) compuesto activo de las fórmulas (1-4), como se describe aquí, en mezcla con uno o más vehículos. Los vehículos pueden estar en forma de partículas, de modo que las composiciones están por ejemplo, en la forma de comprimidos o polvo. Los vehículos pueden ser líquidos, siendo las composiciones por ejemplo, un jarabe oral o un líquido inyectable. Además, los vehículos pueden ser gaseosos, con el fin de proporcionar una composición en aerosol útil, por ejemplo, para la administración por inhalación.
Cuando se destina a la administración oral, la composición está preferiblemente o en forma sólida o en forma líquida, donde las formas semisólidas, semilíquidas, suspensiones y geles están incluidas dentro de las formas consideradas aquí como sólidas o como líquidas.
Como una composición sólida para administración oral, la composición puede ser formulada en un polvo, gránulo, comprimido, píldora, cápsula, goma de mascar, sellos o similares. Una composición sólida de este tipo contendrá típicamente uno o más diluyentes inertes o vehículos comestibles. Además, pueden estar presentes uno o más de los siguientes adyuvantes: aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina, o gelatina; excipientes tales como almidón, lactosa o dextrinas, agentes desintegrantes tales como ácido algínico, alginato de sodio, Primogel, almidón de maíz y similares; lubrificantes tales como estearato de magnesio o Sterotex; deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal, agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina, un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o esencia de naranja, y un agente colorante.
Cuando la composición está en la forma de una cápsula, por ejemplo, una cápsula de gelatina, puede contener, en adición a los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido tal como polietilenglicol, ciclodextrina o un aceite graso.
La composición puede estar en la forma de un líquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, solución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser para administración oral o para ser administrado por inyección, como dos ejemplos. Cuando se destina para administración oral, la composición preferida contiene, en adición a los presentes compuestos, uno o más de un agente edulcorante, conservantes, colorantes y mejoradores del sabor. En una composición que se destina a ser administrada por inyección, se pueden incluir uno o más de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, tampón, estabilizante y agente isotónico.
Las composiciones farmacéuticas líquidas de la invención, ya sean soluciones, suspensiones u otras formas similares, pueden incluir uno o más de los siguientes adyuvantes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferiblemente solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijos tales como monoglicéridos o diglicéridos sintéticos que pueden servir como el disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, ciclodextrina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral puede ser envasada en ampollas, jeringas de un solo uso, o viales de multidosis hechos de vidrio o plástico. La solución salina fisiológica es un adyuvante preferido. Una composición farmacéutica inyectable es preferiblemente estéril.
Una composición líquida destinada para administración parenteral u oral debe contener una cantidad de un compuesto de las fórmulas (1-4) de tal modo que se obtenga una dosis adecuada. Típicamente, esta cantidad es al menos 0,01% de un compuesto de la invención en la composición. Cuando se destina para administración oral, esta cantidad puede variar para estar entre 0,1% y aproximadamente 70% del peso de la composición. Las composiciones orales preferidas contienen entre aproximadamente 4% y aproximadamente 50% del compuesto activo de las fórmulas (1-4). Las composiciones y preparaciones preferidas según la presente invención se preparan de tal forma que una dosis unitaria parenteral contiene entre 0,01% a 1% en peso del compuesto activo.
La composición farmacéutica puede ser destinada para administración tópica, en cuyo caso el vehículo puede comprender adecuadamente una base de solución, emulsión, pomada o gel. La base, por ejemplo, puede comprender uno o más de los siguientes: vaselina, lanolina, polietilenglicoles, cera de abejas, aceite mineral, diluyentes tales como agua y alcohol, y emulsificantes y estabilizantes. En una composición farmacéutica para administración tópica pueden estar presentes agentes espesantes. Si se destina para administración transdérmica, la composición puede incluir un parche transdérmico o un dispositivo de iontoforesis. Las formulaciones tópicas pueden contener una concentración del compuesto de las fórmulas (1-4) desde aproximadamente 0,1% hasta aproximadamente 10% p/v (peso por unidad de volumen).
La composición puede ser destinada para administración rectal, por ejemplo en la forma de un supositorio que fundirá en el recto y liberará el fármaco. La composición para administración rectal puede contener una base oleaginosa como un excipiente adecuado no irritante. Tales bases incluyen, sin limitación, lanolina, manteca de cacao o polietilenglicol.
La composición puede incluir diferentes materiales que modifican la forma física de una unidad de dosis sólida o líquida. Por ejemplo, la composición puede incluir materiales que forman una capa de recubrimiento alrededor de los ingredientes activos. Los materiales que forman la capa de recubrimiento son típicamente inertes, y se pueden seleccionar, por ejemplo, entre azúcar, shellac, y otros agentes de recubrimiento entérico. Alternativamente, los ingredientes activos pueden estar incluidos en una cápsula de gelatina.
La composición en forma sólida o líquida puede incluir un agente que se une al componente activo o componentes activos y de este modo ayuda en la liberación de los componentes activos. Los agentes adecuados que pueden actuar en esta capacidad incluyen un anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína o un liposoma.
La composición farmacéutica de la presente invención puede constar de unidades de dosis gaseosas, por ejemplo puede estar en la forma de un aerosol. El término aerosol se usa para indicar una variedad de sistemas que van desde aquellos de naturaleza coloidal hasta sistemas que constan de envases presurizados. La administración puede ser mediante un gas licuado o comprimido o mediante un sistema de bombeo adecuado que dispensa los ingredientes activos. Los aerosoles de los compuestos de la invención se pueden liberar en sistemas de una única fase, bifásicos o trifásicos con el fin de liberar los ingredientes activos. La administración del aerosol incluye el recipiente necesario, activadores, válvulas, sub-recipientes, espaciadores y similares, que juntos pueden formar un kit. Los aerosoles preferidos pueden ser determinados por un experto en la técnica sin excesiva experimentación.
Ya esté en forma sólida, líquida o gaseosa, la composición farmacéutica de la presente invención puede contener uno o más agentes farmacológicos conocidos usados en el tratamiento de la inflamación (incluyendo artritis).
Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar por metodología bien conocida en la técnica farmacéutica.
Una composición destinada a ser administrada por inyección se puede preparar combinando el compuesto de las fórmulas (1-4) con agua para formar así una solución. Se puede añadir un tensioactivo para facilitar la formación de una solución o suspensión homogénea. Los tensioactivos son compuestos que interactúan de forma no covalente con el compuesto de las fórmulas (1-4) para facilitar así la disolución o suspensión homogénea del compuesto activo en el sistema de administración acuoso.
Los compuestos descritos aquí de las fórmulas 1, 2, 3 ó 4 (esto es los compuestos de las fórmulas (1-4) o los compuestos de la invención), o las composiciones que comprenden uno o más de estos compuestos y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, se pueden usar en un método para tratar o prevenir una condición o enfermedad inflamatoria en un paciente, cuyo método comprende administrar al paciente que lo necesite una cantidad de un compuesto o composición según la presente invención, cuya cantidad es eficaz para tratar o prevenir la condición o enfermedad inflamatoria del paciente.
La condición o enfermedad inflamatoria puede ser una condición o enfermedad autoinmune; la condición o enfermedad inflamatoria puede incluir la inflamación aguda o crónica de los compartimentos de huesos y/o cartílago de las articulaciones; la condición o enfermedad inflamatoria puede ser una artritis seleccionada entre artritis reumatoide, artritis gotosa o artritis reumatoide juvenil; la condición o enfermedad inflamatoria puede ser asma; la condición o enfermedad puede estar asociada con la disrregulación de las células T; la condición o enfermedad puede estar asociada con niveles elevados de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, donde la citoquina inflamatoria es IL-2, o donde la citoquina inflamatoria es IFN-\gamma, o donde la citoquina inflamatoria es TNF-\alpha); la condición o enfermedad inflamatoria puede ser esclerosis múltiple; la condición o enfermedad inflamatoria puede ser sarcoidosis pulmonar; la condición o enfermedad inflamatoria puede ser inflamación ocular o alergia; la condición o enfermedad inflamatoria puede ser una enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, la enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa); y la condición o enfermedad inflamatoria puede ser una enfermedad inflamatoria cutánea (por ejemplo, psoriasis o dermatitis).
Además, la presente invención proporciona un método para modular los niveles intracelulares de adenosina-5'-monofosfato cíclico en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad de un compuesto o composición según la presente invención, cuya cantidad es eficaz para modular los niveles intracelulares de adenosina-5'-monofosfato cíclico del paciente. El paciente puede tener una condición o enfermedad inflamatoria.
Además, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o condición en un paciente, cuya enfermedad o condición está asociada con condiciones patológicas que se modulan inhibiendo las enzimas asociadas con mensajeros celulares secundarios, comprendiendo el método administrar a un paciente que lo necesite una cantidad de un compuesto o composición de la presente invención, cuya cantidad es eficaz para tratar o prevenir una enfermedad o condición asociada con condiciones patológicas que se modulan inhibiendo las enzimas asociadas con mensajeros celulares secundarios. La enzima puede ser una fosfodiesterasa de AMP-cíclico; o la enzima puede ser una fosfodiesterasa 4; o la enzima puede ser una fosfodiesterasa 3; o las enzimas pueden ser ambas, fosfodiesterasa 4 y fosfodiesterasa 3; o la enzima puede ser una fosfodiesterasa de GMP-cíclico.
Además, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir el rechazo de un trasplante en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad de un compuesto o composición de la presente invención, cuya cantidad es eficaz para tratar o prevenir el rechazo del trasplante en el paciente. El rechazo puede ser debido a la enfermedad del injerto frente al hospedante.
Además, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir la proliferación celular incontrolada en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad de un compuesto o composición según la presente invención, cuya cantidad es eficaz para tratar o prevenir la proliferación celular incontrolada en el paciente. La proliferación celular incontrolada puede ser causada por un cáncer seleccionado entre la leucemia y los tumores sólidos.
Además, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir enfermedades asociadas con el sistema nervioso central (CNS) en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad de un compuesto o composición según la presente invención, cuya cantidad es eficaz para tratar o prevenir las enfermedades asociadas con el sistema nervioso central (CNS) en el paciente. La enfermedad asociada con el sistema nervioso central (CNS) puede ser la depresión.
En un método de la presente invención, un compuesto de las fórmulas (1-4), o una composición que comprende uno o más compuestos de las fórmulas (1-4) y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, puede, aunque no es necesario, alcanzar uno o más de los siguientes resultados deseados en el sujeto al que se ha administrado un compuesto de las fórmulas (1-4) como se ha definido antes, o una composición que contiene uno de estos compuestos y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable:
1. Inhibición de la generación de especies reactivas al oxígeno a partir de los neutrófilos primarios;
2. Inhibición de la quimiotaxis de los neutrófilos;
3. Inhibición de la producción de TNF-\alpha;
4. Inhibición de edemas;
5. Captación de radicales de oxígeno;
6. Inhibición de las AMP-cíclico-fosfodiesterasas 1, 3 y/o 4, y las PDE relacionadas, tales como PDE7;
7. Potenciar la inducción de la actividad de transcripción mediada por el CRE en las células monocíticas humanas;
8. Inhibición de PDE, preferiblemente PDE4, PDE3, o PDE3 y PDE4;
9. Inhibición de la producción de citoquina por los subgrupos de células T activadas;
10. Inhibición de la liberación de mieloperoxidasa de los neutrófilos;
11. Disminución de la relación de IC_{50}PDE4(cat):IC_{50}PDE4(HARBS);
12. Inhibición del rechazo de injertos;
13. Inhibición de los parámetros clínicos e histopatológicos de la enfermedad en la enfermedad inflamatoria del intestino; y
14. Inhibición de los parámetros clínicos e histopatológicos de la artritis en un modelo murino de artritis inducida por colágeno.
Por tanto, el método de la invención se puede usar para tratar la inflamación, incluyendo tanto la inflamación aguda como la inflamación crónica así como ciertos trastornos proliferativos (cánceres). Como se usa aquí, la inflamación incluye, sin limitación, espondilitis anquilosante, artritis (donde este término engloba más de 100 tipos de enfermedades reumáticas), asma, enfermedad de Crohn, síndrome de fibromialgia, gota, inflamaciones del cerebro (incluyendo esclerosis múltiple, demencia por SIDA, encefalopatía Lyme, encefalitis por herpes, enfermedad de Creutzfeld-Jakob, y toxoplasmosis cerebral), enfisema, enfermedad inflamatoria del intestino, síndrome del intestino irritable, lesiones por isquemia-reperfusión, sarcoidosis pulmonar eritematosa juvenil, enfermedad de Kawasaki, osteoartritis, enfermedad inflamatoria pélvica, artritis psoriásica (psoriasis), artritis reumatoide, psoriasis, trasplante de tejido/órgano, escleroderma, espondiloartropatías, lupus eritematoso sistémico, sarcoidosis pulmonar, y colitis ulcerosa. Como se usan aquí, los trastornos proliferativos incluyen, sin limitación, todas las leucemias y tumores sólidos que son susceptibles de sufrir diferenciación o apoptosis después de la interrupción de sus ciclos celulares.
El método de la invención proporciona para administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de las fórmulas (1-4), incluyendo, sus sales, composiciones, etc. Como se usa aquí, la cantidad real incluida en el término "cantidad terapéuticamente eficaz" dependerá de la vía de administración, del tipo de animal de sangre caliente que está siendo tratado, y de las características físicas del específico animal de sangre caliente en consideración. Estos factores y sus relaciones para determinar esta cantidad son bien conocidos por los expertos en la técnica médica. Esta cantidad y el método de administración pueden ser adaptados para alcanzar una eficacia óptima pero dependerá de factores tales como el peso, dieta, medicación concurrente y otros factores que los expertos en la técnica médica reconocerán.
Una cantidad eficaz de un compuesto o composición de la presente invención será suficiente para tratar la inflamación en un animal de sangre caliente tal como un ser humano. Los métodos para administrar cantidades eficaces de agentes antiinflamatorios son bien conocidos en la técnica e incluyen la administración de formas de inhalación, formas orales o parenterales. Tales formas farmacéuticas incluyen, pero sin limitarse a ellas, soluciones parenterales, comprimidos, cápsulas, implantes de liberación sostenida y sistemas de administración transdérmica; o sistemas de dosificación para inhalación que emplean inhaladores de polvos secos o dispositivos de inhalación de multidosis presurizados.
La cantidad y frecuencia de la dosis se seleccionan para crear un nivel eficaz del agente sin efectos perjudiciales. Generalmente variará desde una dosis de aproximadamente 0,01 hasta 100 mg/kg/día, y típicamente desde aproximadamente 0,1 hasta 10 mg/kg/día cuando se administra oral o intravenosamente. También el intervalo de dosis puede ser típicamente desde aproximadamente 0,01 hasta 1 mg/kg/día cuando se administra intranasalmente o por inhalación.
Los compuestos de las fórmulas (1-4) incluyendo los compuestos usados en los métodos y composiciones indicados antes, se pueden preparar de acuerdo con los esquemas indicados en los siguientes ejemplos. Los siguientes ejemplos se presentan a modo de ilustración pero no a modo de limitación.
A menos que se indique otra cosa, la cromatografía rápida y la cromatografía en columna se pueden llevar a cabo usando gel de sílice 60 Merck (230-400 mallas). La cromatografía rápida se puede realizar según el procedimiento indicado en: "Purification of Laboratory Chemicals", 3rd. Edition, Butterworth-Heinemann Ltd., Oxford (1988), Eds. D. D. Perrin and W. L. F. Amarego, page 23. La cromatografía en columna se refiere al procedimiento en el que el caudal del eluyente a través del material empaquetado en la columna se determina por gravedad. En todos los casos se pueden usar de modo intercambiable la cromatografía rápida y la cromatografía radial. La cromatografía radial se lleva a cabo usando gel de sílice sobre un Chromatotron Model # 7924T (Harrison Research, Palo Alto, California). A menos que se indique otra cosa, los valores de Rf citados se han obtenido por cromatografía en capa fina usando gel de sílice 60 F_{254} (Merck KGaA, 64271, Darmstadt, Germany).
También, a menos que se indique otra cosa, los reactantes y reactivos químicos se obtuvieron de proveedores químicos estándar, tales como Aldrich (Milwaukee, WI; www.aldrich.slal.com); EM Industries, Inc. (Hawthorne, NY; www.emscience.com); Fisher Scientific Co. (Hampton, NH; www.fischer1.com); and Lancaster Synthesis, Inc. (Windham, NH; www.lancaster.co.uk). Los gases se obtuvieron de Praxair (Vancouver, B.C.). Las líneas celulares, a menos que se indique otra cosa, se obtuvieron de fuentes públicas o comerciales, por ejemplo, American Tissue Culture Collection (ATCC, Rockville, MD).
Ejemplos
El compuesto 12, un compuesto representativo de la invención, se prepara según los esquemas 1 y 2. Muchos compuestos relacionados con el compuesto 12 se pueden producir usando metodología similar pero empezando con diferentes ácidos cinámicos. El compuesto 12 tiene la configuración S en el carbono 3 (C3) que está dirigida por la configuración del auxiliar quiral (que tiene la configuración S) en el compuesto 4. Alternativamente, la configuración R en C3 en el compuesto 12 se genera usando el auxiliar quiral con la configuración opuesta (R). En los compuestos generados usando la metodología de los esquemas 1 y 2, los productos tienen una mezcla isomérica en C5. Alternativamente, los compuestos con configuraciones fijas en este centro (C5) se generan según los esquemas 3 y 4. De este modo todos los diastereoisómeros se pueden preparar usando la metodología apropiada descrita en los cuatro esquemas siguientes.
Enfocándose sobre el compuesto 12, la hidrogenación del doble enlace en el material de partida comercialmente disponible ácido para-hidroxi-meta-metoxi-cinámico (1) se consigue usando H_{2} en presencia del catalizador Pd al 10%/C. La protección de la función para-hidroxi en el compuesto 2, va seguida por la adición del resto (S)-(-)-4-bencil-2-oxazolidinona para formar el compuesto 4. El uso de este auxiliar quiral para dirigir la estereoquímica en las posiciones \alpha para los carbonilos ha sido bien documentado. La alquilación del compuesto 4 con un bromuro de arilo sustituido preparado según el Esquema 2 proporciona estereoselectivamente el compuesto 5. La reducción por hidruro de litio y aluminio del compuesto 5 da el compuesto 6 que contiene el alcohol primario. La protección del alcohol primario como el silil-éter va seguida por la hidroboración del doble enlace para obtener el compuesto 8. La bencilación y después des-sililación da el compuesto 10 que se oxida usando las condiciones de Jones para dar el ácido carboxílico 11. La hidrogenación en ácido acético proporciona el deseado producto 12 ciclado.
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Esquema 1
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Esquema 2
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Síntesis del compuesto 2
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante 14 horas una mezcla del compuesto 1 (3,0 g, 0,0155 moles) y Pd al 10%/C (150 mg) en AcOH/EtOAc (30 ml, 2:1). Después de filtrar a través de un lecho de celita, se evaporó el disolvente a presión reducida para obtener el compuesto 2 (2,98 g, 98%) como un sólido blanco que se utilizó sin purificación adicional.
Síntesis del compuesto 3
Se disolvió el compuesto 2 (2,71 g, 13,8 mmol) en DMF seca (25 ml) y se enfrió la solución a 0ºC. Se añadió NaH (2,21 g, al 60% en aceite mineral, 55,2 mmol). Después de una hora, se añadió bromuro de bencilo (BnBr) (8,21 ml, 69,0 mmol) y se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante otras 16 horas. Se diluyó la mezcla con éter dietílico (200 ml) y se lavó con solución saturada de NaHCO_{3} (2 x 75 ml), después con H_{2}O (2 x 75 ml). Se secó la fase orgánica con MgSO_{4} y se evaporó el disolvente a sequedad para obtener el compuesto éter bencílico crudo. Esta mezcla cruda, que contenía una cantidad del correspondiente éster bencílico se disolvió en THF/MeOH/H_{2}O (50 ml, 2.1:1). Se añadió LiOH.H_{2}O (1,74 g, 41,4 mmol) y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 20 horas. Después de evaporación del disolvente hasta un pequeño volumen, se extrajo la mezcla con CH_{2}Cl_{2} (3 x 100 ml). La capa orgánica reunida se lavó con H_{2}O (2 x 75 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 2:1) para obtener el compuesto 3 (3,2 g, 81%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 4
Solución 1
Se añadió trietilamina (2,9 ml, 21,0 mmol) seguida por cloruro de trimetil-acetilo (2,4 ml, 19,3 mmol) a una solución del compuesto 3 (5,0 g, 17,5 mmol) en THF (40 ml) a 0ºC. Se agitó la mezcla a 0ºC durante una hora.
Solución 2
En un segundo frasco, se añadió n-butil-litio (7,7 ml, 19,3 mmol) a una solución de (S)-(-)-4-bencil-2-oxazolidinona (3,4 g, 19,3 mmol) en THF seco (25 ml) a -78ºC. Se agitó esta mezcla durante una hora y después se añadió al anhídrido anterior (solución 1) por medio de una cánula. Se calentó la mezcla desde 0ºC hasta temperatura ambiente y después se agitó durante 24 horas. Se diluyó la solución con solución saturada de NaHCO_{3} (150 ml) y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (4 x 100 ml). La capa orgánica reunida se lavó con H_{2}O (2 x 100 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 4:1) para obtener el compuesto 4 (7,05 g, 91%) como un sólido blanco cristalino.
Síntesis del compuesto 5
Se disolvió el compuesto 4 (3,0 g, 6,73 mmol) en THF seco (25 ml), se enfrió a -78ºC y se añadió lentamente LDA 2,0 M (en THF, 3,5 ml, 7,0 mmol). Después de una hora, se añadió a la solución de reacción, en una porción, una solución del compuesto 15 (3,2 g, 13,5 mmol) en THF (10 ml) y se calentó la mezcla resultante a 0ºC y se agitó durante 2 horas más. Se sofocó el exceso de base a 0ºC con solución acuosa saturada de NaCl (100 ml) y se extrajo la solución resultante con CH_{2}Cl_{2} (3 x 100 ml). La capa orgánica reunida se lavó con solución saturada de NaHCO_{3} (2 x 100 ml), H_{2}O (2 x 100 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 3:1) para obtener el compuesto 5 (2,63 g, 63%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 6
Se añadió el compuesto 5 (2,4 g, 3,86 mmol) en THF (5 ml) a una suspensión de LiAlH_{4} (154,2 mg, 3,86 mmol) en THF (15 ml) a 0ºC. Se agitó la mezcla durante 2 horas a 0ºC y se sofocó con solución saturada de NaHCO_{3} (1 ml) y NaOH al 10% (1 ml). Se filtró la mezcla resultante, se diluyó el filtrado con éter dietílico (150 ml) y se lavó con solución saturada de NaCl (2 x 50 ml). La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el producto crudo por cromatografía rápida en columna, se eluyó con hexano/EtOAc, 2:1, para obtener el compuesto 6 (1,47 g, 85%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 7
Se agitó el compuesto 6 (1,50 g, 3,34 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (25 ml), después seañadió Et_{3}N (0,56 ml, 4,01 mmol) seguido por TBDMSCl (554,6 mg, 3,68 mmol). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 6 horas, se diluyó con EtOAc (200 ml) y se lavó con solución saturada de NaHCO_{3} (2 x 75 ml) y solución saturada de NaCl (2 x 75 ml). La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 5:1) para dar el compuesto 7 (1,74 g, 93%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 8
Se disolvió el compuesto 7 (560,0 mg, 0,995 mmol) en THF (5 ml) y se enfrió a 0ºC. Se añadió gota a gota BH_{3}-THF (1,0 M en THF, 1,0 ml, 1,0 mmol). Después, se agitó la mezcla a 0ºC durante 5 horas, se añadió NaOH 10 N (1 ml) seguido por H_{2}O_{2} al 30% (1 ml) y se agitó la mezcla durante otras 16 horas a temperatura ambiente. Se evaporó el THF, se diluyó la mezcla con EtOAc (120 ml) y se lavó con solución saturada de NaCl (2 x 30 ml). La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 2:1) para obtener el compuesto 8 (435,5 mg, 75%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 9
Se disolvió el compuesto 8 (900,4 mg, 1,72 mmol) en DMF (10 ml) y se enfrió a 0ºC, y se añadió NaH (137,7 mg, al 60% en aceite mineral, 3,44 mmol). Después de una hora, se añadió bromuro de bencilo (BnBr) (0,41 ml, 3,44 mmol) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante otras 16 horas. Se diluyó la mezcla con éter dietílico (150 ml) y se lavó con H_{2}O (2 x 30 ml). La fase orgánica se secó después con MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 10:1) para obtener el compuesto 9 (915,1 mg, 88%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 10
Se disolvió el compuesto 9 (899,8 mg, 1,34 mmol) en THF (10 ml), se añadió fluoruro de tetrabutilamonio 1,0 M (en THF, 2,7 ml, 2,7 mmol) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas. Se evaporó el disolvente, después se disolvió la mezcla en EtOAc (100 ml) y se lavó con H_{2}O (2 x 40 ml). Se secó la fase orgánica con MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 2:1) para obtener el compuesto 10 (731,6 mg, 98%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 11
Se disolvió el compuesto 10 (570,7 mg, 1,03 mmol) en acetona (12 ml) y se enfrió a 0ºC. Se añadió lentamente a lo largo de 5 minutos reactivo de Jones (CrO_{3} 1N acuoso en H_{2}SO_{4} al 25%, 2,06 ml, 2,06 mmol). La mezcla de color verde oscuro resultante se agitó durante 40 minutos a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc (150 ml) y se lavó con HCl al 5% (2 x 40 ml) y H_{2}O (2 x 40 ml). Se secó entonces la capa orgánica sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado para dar el compuesto 11 crudo (547,0 mg) que se usó sin purificación adicional.
Síntesis del compuesto 12
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante 48 horas una mezcla del compuesto 11 (547,0 mg, 0,946 moles) y Pd al 10%/C (78,0 mg) en AcOH (10 ml). Después de filtrar a través de un lecho de celita, y evaporar el filtrado a sequedad, se purificó la mezcla por HPLC de fase inversa (columna: Nova Pak HK C18, M4063102 (Waters), 6 \mu, 19 x 300 mm) usando MeOH al 55% en agua para obtener el compuesto 12 (183,7 mg, 48% en dos etapas) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 14
Se añadió terc-butóxido de potasio (9,80 g, 0,0833 moles) a una suspensión de MePPh_{3}Br (29,8 g, 0,0833 moles) en tolueno seco (180 ml) bajo argón. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadió 3',4'-dimetoxiacetofenona 13 (10,0 g, 0,0555 moles) como un sólido y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante otras 16 horas. Se añadió lentamente agua (10 ml) y se diluyó la mezcla con EtOAc (200 ml), se lavó con solución saturada de NaHCO_{3} (2 x 100 ml), y después con H_{2}O (2 x 100 ml). Después de secar sobre MgSO_{4}, se filtró la solución y se concentró el filtrado en vacío. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 19:1) para dar el compuesto 14 (9,31 g, 93%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 15
Se añadieron N-bromosuccinimida (4,93 g, 27,38 mmol) y peróxido de bencilo (80,0 mg, 0,330 mmol) a una solución del compuesto 14 (4,88 g, 27,38 mmol) en CHCl_{3} (60 ml). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se diluyó entonces la mezcla con EtOAc (200 ml), se lavó con solución saturada de cloruro de sodio (100 ml), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró el filtrado en vacío. Se purificó el residuo resultante usando cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 97:3) para dar el compuesto 15 (2,44 g, 37%) como un aceite amarillo claro.
Los compuestos que definen la estereoquímica en C5 se puede sintetizar según el Esquema 3. Por tanto, el anhídrido mixto, obtenido a partir del ácido (3,4-dimetoxifenil)acético 16 comercialmente disponible (Aldrich) y cloruro de trimetilacetilo, se hace reaccionar con el anión litio de (S)-(-)-4-bencil-2-oxazolidinona para obtener el compuesto 17. La adición enantioselectiva de Michael del enolato de titanio de la oxazolidinona quiral 17 al acrilato de terc-butilo proporcionó el compuesto 18 que tiene la función carboxilato con un grupo protector adecuado. La hidrólisis del auxiliar quiral con hidróxido de litio y peróxido de hidrógeno da el ácido carboxílico 19. La reducción selectiva del compuesto 19 que con BH_{3}-THF da el compuesto 20 que contiene el alcohol primario. La separación de la unión del éster t-butílico con pTsOH.H_{2}O en tolueno da el correspondiente hidroxi-ácido que se lactoniza espontáneamente para producir el compuesto 21. La alquilación del anión litio del compuesto 21 con bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo da el compuesto 22 como una mezcla de diastereoisómeros (\sim 1.1). La hidrogenación del compuesto 22 da el producto 23 deseado. Por tanto, se pueden usar muchos bromuros de bencilo sustituidos para preparar compuestos relacionados con el compuesto 23 con diferentes modelos de sustitución sobre el anillo bencilo.
Síntesis del compuesto 17
Solución 1
Se añadió trietilamina (12,8 ml, 91,7 mmol) seguida por cloruro de trimetil-acetilo (10,4 ml, 84,2 mmol) a una solución de ácido (3,4-dimetoxifenil)acético 16 (15,0 g, 76,5 mmol) en THF (120 ml) a 0ºC y se agitó la mezcla durante una hora.
Solución 2
En un segundo frasco, se añadió n-butil-litio (2,5 M en hexano, 33,7 ml, 84,2 mmol) a una solución de (S)-(-)-4-bencil-2-oxazolidinona (14,9 g, 84,2 mmol) en THF seco (75 ml) a -78ºC. Se agitó esta solución durante una hora y después se añadió a la solución 1 a 0ºC por medio de una cánula. Se calentó la mezcla resultante desde 0ºC hasta temperatura ambiente, se agitó durante 24 horas, después se diluyó con solución saturada de NaHCO_{3} (300 ml) y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3 x 200 ml). La capa orgánica reunida se lavó con solución saturada de NaCl (2 x 150 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se concentró el filtrado a presión reducida. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 4:1) para obtener el compuesto 17 (19,04 g, 70%) como un sólido blanco.
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(Esquema pasa a página siguiente)
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Esquema 3
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27
Síntesis del compuesto 19
Se añadió lentamente isopropóxido de titanio (0,42 ml, 1,41 mmol) a una solución de tetracloruro de titanio (0,50 ml, 4,50 mmol) en diclorometano seco (10 ml) a 0ºC. Se agitó la mezcla resultante a 0ºC durante 5 minutos y después se añadió diisopropiletilamina (1,04 ml, 5,91 mmol). Después de 15 minutos, se añadió una solución del compuesto 17 (2,0 g, 6,63 mmol) en diclorometano (10 ml). Se agitó la mezcla durante 90 minutos a 0ºC, y después se añadió acrilato de terc-butilo (1,24 ml, 8,45 mmol). Se calentó la mezcla de reacción a temperatura ambiente y se agitó durante 36 horas y después se diluyó con cloruro de amonio saturado (50 ml). Se extrajo la capa acuosa con diclorometano (3 x 75 ml) y las capas orgánicas reunidas se lavaron con HCl 1 N (2 x 75), agua (2 x 75 ml) y NaCl saturado (2 x 75 ml). Después de secar sobre MgSO_{4}, por filtración y evaporación del filtrado en vacío, se obtuvo el compuesto 18 crudo (2,69 g) que se usó sin purificación adicional.
Se disolvió el compuesto 18 crudo (2,69 g) en una mezcla de THF/agua 3:1 (85 ml) y se enfrió a 0ºC. Se añadieron hidróxido de litio monohidratado (466,6 mg, 11,12 mmol) y peróxido de hidrógeno al 30% (2,5 ml, 22,25 mmol) y se agitó la mezcla a 0ºC durante 3 horas. Se añadió una solución de sulfito de sodio (3,06 g, 24,46 mmol) seguida por bicarbonato de sodio 0,5 N (41 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas y después se concentró en vacío. Se diluyó la fase acuosa con HCl al 5% a pH =2 y después se extrajo con EtOAc (3 x 75 ml). Las capas orgánicas reunidas se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y se concentró el filtrado en vacío. Se purificó el producto crudo por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando ácido acético al 0,2% en acetato de etilo al 20% en hexano para obtener el compuesto 19 (1,09 g, 60% en dos etapas) como un aceite amarillo
claro.
Síntesis del compuesto 20
Se añadió gota a gota BH_{3}-THF (solución 1,0 M en THF, 37,6 ml, 0,0376 moles) a lo largo de 20 minutos a una solución del compuesto 19 (12,18 g, 0,0376 moles) en THF seco (50 ml) a -18ºC. Se separó entonces el baño de enfriamiento, y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 16 horas. Se añadió solución saturada de NaHCO_{3} (50 ml), y se extrajo la fase acuosa con EtOAc (3 x 75 ml). La fase orgánica reunida se lavó con solución saturada de NaCl (2 x 75 ml). Se secó la fase orgánica sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado en vacío. Se purificó el residuo por cromatografía en columna eluyendo con EtOAc al 50% en hexano para obtener el compuesto 20 (10,52 mg, 91%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 21
Se calentó a 80ºC durante 30 minutos una solución del compuesto 20 (482,1 mg, 1,57 mmol) y ácido p-tolueno-
sulfónico (44,9 mg, 0,236 mmol) en tolueno (20 ml). Se diluyó la mezcla de reacción con EtOAc (100 ml) y se lavó con solución saturada de NaHCO_{3} (2 x 40 ml). Después de secar con MgSO_{4}, se filtró la mezcla y se concentró el filtrado para dar el compuesto 21 (342,1 mg, 92%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 22
Preparación de bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo: A una solución de alcohol 4-(benciloxi)-3-metoxibencílico (9,0 g, 36,84 mmol) en éter dietílico anhidro (150 ml), se añadió lentamente PBr_{3} (4,99 g, 18,42 mmol) por medio de una jeringa, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Se diluyó la mezcla con éter dietílico (100 ml) y se lavó con solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (2 x 75 ml) y salmuera (2 x 75 ml). Se secó la fase orgánica sobre MgSO_{4} anhidro, y se separó el disolvente a presión reducida para obtener el bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo (10,9 g, 96%) como un sólido blanco.
A una solución de diisopropilamina (0,15 ml en THF seco (10 ml) a -78ºC, se añadió n-butillitio (solución 2,5 M en hexano, 0,42 ml, 1,06 mmol). Se agitó la mezcla a -78ºC durante 1 hora, después se añadió una solución del compuesto 21 (226,8 mg, 0,96 mmol) en THF (5 ml). Después de 1 hora, se añadió a la reacción, en una porción, una solución de bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo (248,5 mg, 0,80 mmol, preparada según los procedimientos de la bibliografía encontrados en J. Org. Chem. 1996, 61, 9146-9155) en THF (1 ml) y se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante 4 horas más. Se sofocó el exceso de base a 0ºC con solución acuosa saturada de NaCl (10 ml) y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 20 ml). La capa orgánica reunida se lavó con solución saturada de NaCl (2 x 30 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 2:1) para obtener el compuesto 22 (152,1 mg, 41%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 23
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante 2 horas una mezcla del compuesto 22 (150,0 mg, 0,324 moles) y Pd al 10%/C (22,5 mg) en EtOAc/AcOH (4:1, 5 ml). Se filtró después la mezcla a través de un lecho de celita y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 3:2) para dar el compuesto 23 (106,3 mg, 88%) como un jarabe incoloro.
Ciertos compuestos de la presente invención contienen dos átomos de carbono asimétrico y por tanto hay cuatro posibles diastereoisómeros para estos compuestos. Un ejemplo de secuencia sintética para preparar un estereoisómero específico se resume en el Esquema 4 que sigue. Así, la protección del alcohol primario en el compuesto 20 (Esquema 3) se consigue usando bromuro de bencilo (BnBr) e hidruro de sodio en DMF para dar el derivado benciloxi 24. El compuesto 24 se convierte después en su correspondiente ácido 25 haciendo reaccionar el compuesto 24 con TFA. La síntesis del derivado de N-aciloxazolidinona 26 a partir del compuesto 25 se lleva a cabo usando el mismo tipo de reacción descrita en las secciones previas. Con la alquilación estereoselectiva del compuesto 26 con bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo se obtiene el compuesto 27. La hidrólisis del auxiliar quiral con hidróxido de litio y peróxido de hidrógeno da el ácido carboxílico 28. La hidrogenación del compuesto 28 en ácido acético y lactonización con pTsOH.H_{2}O en tolueno da el producto 29 ciclado deseado que tiene la configuración 3R,5S. Por tanto, los otros tres diastereoisómeros se pueden sintetizar similarmente pero empezando con diferentes oxazolidinonas quirales. Por ejemplo, el compuesto 30 que tiene la configuración 3R,5S, se sintetiza usando el intermedio análogo al compuesto 26 con la oxazolidinona que contiene la configuración opuesta (R).
Esquema 4
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28
Síntesis del compuesto 24
Se disolvió el compuesto 20 (9,45 g, 30,45 mmol) en DMF (100 ml) y se enfrió a 0ºC. Se añadió NaH (2,43 g, al 60% en aceite mineral, 50,90 mmol). Después de una hora, se añadió lentamente BnBr (7,2 ml, 60,90 mmol) y se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante otras 16 horas. Se diluyó la mezcla con éter dietílico (600 ml) y se lavó con H_{2}O (2 x 200 ml). Se secó la fase orgánica sobre MgSO_{4}, se filtró y se concentró el filtrado en vacío. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice para obtener el compuesto 24 (10,73 g, 88%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 25
Se añadió ácido trifluoroacético (TFA) (25 ml) a una solución del compuesto 24 (10,0 g, 29,00 mmol) en diclorometano (100 ml) a temperatura ambiente. Se agitó esta mezcla durante 16 horas y después se concentró en vacío. El aceite resultante se purificó usando cromatografía en columna con gel de sílice eluyendo con hexano-EtOAc-AcOH (75:23:2) para obtener el compuesto 25 (8,49 g, 85%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 26
Solución 1
Se añadió trietilamina (0,98 ml, 6,82 mmol) seguida por cloruro de trimetil-acetilo (0,78 ml, 6,38 mmol) a una solución del compuesto 25 (2,00 g, 5,80 mmol) en THF (20 ml) a 0ºC, y se agitó la mezcla durante una hora.
Solución 2
En un segundo frasco, se añadió n-butil-litio (2,6 ml, 6,38 mmol) a una solución de (S)-(-)-4-bencil-2-oxazolidinona (1,13 g, 6,38 mmol) en THF seco (15 ml) a -78ºC. Se agitó esta solución durante una hora y después se añadió a la mezcla del anhídrido mixto anterior (solución 1) por medio de una cánula. Se dejó que la mezcla resultante a 0ºC se calentara hasta temperatura ambiente. Después de agitar a temperatura ambiente durante 24 horas, se diluyó la mezcla con una solución saturada de NaHCO_{3} (150 ml) y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (4 x 60 ml). La capa orgánica reunida se lavó con H_{2}O (2 x 50 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se concentró el filtrado en vacío. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 4:1) para obtener el compuesto 26 (2,38 g, 81%) como un aceite amarillo pálido.
Síntesis del compuesto 27
Se añadió lentamente n-BuLi (2,84 ml, solución 2,5 M en hexano, 7,10 mmol) a una solución de diisopropilamina (1,08 ml, 7,70 mmol) en THF seco (55 ml) a -78ºC. Se agitó la mezcla de reacción a -78ºC bajo argón durante 1 hora a -78ºC. Se añadió el compuesto 26 en THF (35 ml) a -78ºC y se agitó la mezcla de reacción durante 1 hora. Se añadió después en una porción a la reacción una solución de bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo (2,73 g, 8,88 mmol) en THF (10 ml). La mezcla resultante se calentó a 0ºC y se agitó durante 2 horas más. El exceso de la base se sofocó a 0ºC con NH_{4}Cl acuoso saturado (100 ml), y la solución resultante se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3 x 100 ml). La capa orgánica reunida se lavó con NaHCO_{3} saturado (2 x 50 ml), H_{2}O (2 x 50 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 3:1) para dar el compuesto 27 (3,30 g, 76%) como una espuma blanca.
Síntesis del compuesto 28
Se añadieron LiOH.H_{2}O (0,404 g, 9,60 mmol) y H_{2}O_{2} (al 30% en H_{2}O, 2,2 ml, 19,20 mmol) a una solución del compuesto 27 (3,50 g, 4,80 mmol) en THF/H_{2}O (3:1, 67 ml) a 0ºC. Se agitó la mezcla de reacción a 0ºC durante 3 horas. Se añadió después una solución de Na_{2}SO_{3} (2,66 g, 21,1 mmol, en agua (30 ml)) seguida por una solución de NaHCO_{3} 0,5 N (40 ml). Se agitó la mezcla durante 2 horas, y después se evaporó el THF en vacío. Esta solución acuosa se diluyó con HCl 2 N a pH = 2 y después se extrajo con EtOAc (3 x 250 ml). Las capas orgánicas reunidas se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el aceite resultante usando cromatografía en columna con gel de sílice eluyendo con hexano-EtOAc-AcOH (75:23:2) para obtener el compuesto 28 (2,23 g, 84%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 29
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante 16 horas una mezcla del compuesto 28 (1,86 g, 3,37 moles) y Pd al 10%/C (180 mg) en AcOH (150 ml). Se separó el catalizador filtrando la mezcla de reacción través de un lecho de celita. Se evaporó el filtrado a sequedad y se agitó el residuo con pTsOH.H_{2}O (200 mg) en tolueno (100 ml) a 80ºC durante 30 minutos. Se separó el tolueno en vacío y se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 1:1) para obtener el compuesto 29 (1,06 g, 85%) como una espuma blanca.
Los compuestos con diferentes grupos alcoxi sobre el anillo fenilo se pueden sintetizar según el Esquema 5. Por ejemplo, el compuesto 43 se puede sintetizar como sigue. El alcohol 3-hidroxi-4-metoxibencilo 31 comercialmente disponible se protege selectivamente como el derivado benciloxi 32 por tratamiento de 31 con bromuro de bencilo y carbonato de potasio en tolueno a reflujo para obtener 89% del producto deseado después de cristalización. Se hace reaccionar después el compuesto 32 con cloruro de metanosulfonilo en presencia de trietilamina y CH_{2}Cl_{2} para obtener el compuesto 33, que se usa sin purificación adicional. El producto crudo 33 se toma después en DMF y se trata con cianuro de potasio en presencia de 18-corona-6. Después de tratamiento y purificación, se aísla el nitrilo 34 con 91% de rendimiento en dos etapas. La hidrólisis del nitrilo 34 con hidróxido de potasio se lleva a cabo entonces para obtener el ácido carboxílico 35 deseado con 95% de rendimiento. El tratamiento del compuesto 35 con cloruro de trimetilacetilo da un anhídrido mixto que se hace reaccionar con el anión litio de (S)-(-)-4-bencil-2-oxazolidinona para dar el compuesto 36 con 75% de rendimiento. La adición enantioselectiva de Michael del enolato de titanio de la oxazolidinona quiral 36 al acrilato de terc-butilo proporciona el compuesto 37 que tiene la función carboxilato con un grupo protector adecuado. La hidrogenación del compuesto 37 da el alcohol con rendimiento cuantitativo, que se convierte en el derivado ciclopentiloxi 38 con 64% de rendimiento por tratamiento con bromuro de ciclopentilo, carbonato de potasio y yoduro de potasio en DMF. Por tanto, se pueden preparar muchos derivados alcoxi sobre el anillo fenilo usando el correspondiente bromuro de alquilo o bromuro de alquilo funcionalizado. La hidrólisis del auxiliar quiral con hidróxido de litio y peróxido de hidrógeno da el ácido carboxílico 39 con 91% de rendimiento. Por reducción selectiva del compuesto 39 con BH_{3}-THF se obtiene el compuesto 40 (89% de rendimiento) que contiene el alcohol primario. La lactona 41 se obtiene con 94% de rendimiento por tratamiento del compuesto 40 con pTsOH.H_{2}O en tolueno. Por alquilación del compuesto 41 con bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo se obtiene el compuesto 42 con 70% de rendimiento. La hidrogenación del compuesto 42 en ácido acético da el producto 43 deseado con 83% de rendimiento.
Esquema 5
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29 
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Síntesis del compuesto 32
A una suspensión, con agitación rápida, de alcohol 3-hidroxi-4-metoxibencílico 31 (30,0 g, 195 mmol) carbonato de potasio (62,2 g. 450 mmol), y 18-corona-6 (0,40 g. 1 mol%) en tolueno (350 ml), se añadió una solución de bromuro de bencilo (25,6 g. 150 mmol) en tolueno (150 ml) a lo largo de 20 minutos. La mezcla de reacción se mantuvo a reflujo durante 16 horas, tras lo cual se diluyó la mezcla con éter dietílico (400 ml) y se lavó sucesivamente con NaOH (1 N, 2 x 250 ml), NaHCO_{3} acuoso saturado (2 x 250 ml), y salmuera (2 x 300 ml). La capa de éter dietílico se secó sobre MgSO_{4} anhidro, y se separó el disolvente para proporcionar un sólido amarillo pálido (42,1 g) que se cristalizó con EtOAc y hexano para dar el compuesto 32 (32,7 g, 89%) como un sólido blanco cristalino.
Síntesis del compuesto 33
Se disolvió el compuesto 32 (30,0 g, 122,8 mmol) en diclorometano (300 ml) y se enfrió a 0ºC, y después se añadieron Et_{3}N (20,4 ml, 147,36 mmol) y cloruro de metanosulfonilo (11,40 ml, 147,36 mmol). Se separó el baño de hielo, y se agitó la solución a temperatura ambiente durante 2 horas. Se diluyó después la mezcla con diclorometano (700 ml), se lavó sucesivamente con NaHCO_{3} acuoso saturado (2 x 300 ml) y H_{2}O (2 X 300 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se concentró el filtrado para obtener el compuesto 33 (33,08 g) como un sólido amarillo pálido que se usó para la siguiente etapa sin purificación adicional.
Síntesis del compuesto 34
A una solución del compuesto 33 crudo (33,08 g) en DMF seca (200 ml) se añadieron KCN (15,99 g, 245,6 mmol) y 18-corona-6 (5,19 g, 19,65 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 18 horas, después se vertió sobre agua (1,5 litros). Se recogió el precipitado y se disolvió en EtOAc (600 ml), se lavó con H_{2}O (2 x 200 ml) y salmuera (2 x 200 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se concentró el filtrado para obtener el compuesto 34 (28,5 g, 91% de rendimiento en dos etapas) como un sólido casi blanco.
Síntesis del compuesto 35
Una mezcla del compuesto 34 (28,0 g, 110,5 mmol) y KOH (94,0 g, 167,5 mmol) en H_{2}O (170 ml) se calentó a reflujo durante 12 horas. Después se enfrió la mezcla de reacción a temperatura ambiente, se diluyó con H_{2}O (1,6 litros) y se acidificó con HCl 12 N a pH=2. Se recogió el precipitado resultante y se secó sobre P_{2}O_{5} para dar el compuesto 35 (28,8 g, 95%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 36
Solución 1
Se añadió trietilamina (17,7 ml, 126,92 mmol) seguida por cloruro de trimetil-acetilo (14,3 ml, 116,35 mmol) a una solución del compuesto 35 (28,8 g, 105,77 mmol) en THF (250 ml) a 0ºC, y se agitó la mezcla durante una hora.
Solución 2
En un segundo frasco, se añadió n-butil-litio (2,5 M en hexano, 46,5 ml, 116,35 mmol) a una solución de (S)-(-)-4-bencil-2-oxazolidinona (20,6 g, 116,35 mmol) en THF seco (145 ml) a -78ºC. Se agitó esta solución durante una hora y después se añadió a la solución 1 a 0ºC. Se calentó la mezcla resultante desde 0ºC hasta temperatura ambiente, se agitó durante 24 horas, después se diluyó con solución saturada de NaHCO_{3} (400 ml), y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (4 x 300 ml). La capa orgánica reunida se lavó con salmuera (200 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se concentró el filtrado a presión reducida. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 4:1) para obtener el material de partida (15,93 g) y el compuesto 36 (15,30 g, 75% basado en la recuperación del material de partida) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 37
Se añadió lentamente isopropóxido de titanio (2,6 ml, 8,69 mmol) a una solución de tetracloruro de titanio (3,1 ml, 27,8 mmol) en diclorometano seco (100 ml) a 0ºC. La mezcla resultante se agitó a 0ºC durante 5 minutos y después se añadió diisopropiletilamina (6,7 ml, 38,24 mmol). Después de 15 minutos, se añadió una solución del compuesto 36 (15 g, 34,76 mmol) en diclorometano (100 ml). Se agitó la mezcla durante 90 minutos a 0ºC, y después se añadió acrilato de terc-butilo (15,3 ml, 104,28 mmol). Se agitó la mezcla de reacción durante 3 días a 0ºC y después se diluyó con cloruro de amonio saturado (300 ml). Se extrajo la capa acuosa con diclorometano (3 x 300 ml) y las capas orgánicas reunidas se lavaron con HCl al 5% (2 x 400 ml), agua (2 x 300 ml) y NaCl saturado (400 ml). Después de secar sobre MgSO_{4}, por filtración y evaporación del filtrado en vacío se obtuvo el compuesto 37 crudo (21,0 g). Se purificó una porción del compuesto 37 crudo (2,1 g) por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc/Hexano (1:2) para dar el compuesto 37 puro (1,55 g) como un jarabe.
Síntesis del compuesto 38
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante 18 horas, una mezcla del compuesto 37 (1,55 g, 2,77 mmol) y Pd al 10%/C (150 mg) en EtOAc/AcOH (5:1, 60 ml). Se filtró la mezcla sobre celita y se evaporó el filtrado a sequedad para proporcionar el compuesto fenólico intermedio (1,30 g, 100%).
Una suspensión del compuesto fenólico (0,30 g, 0,639 mmol), K_{2}CO_{3} anhidro (0,132 g, 0,958 mmol), y KI (5 mg) en DMF seca (1,5 ml) se agitó y se calentó a 65ºC, y después se añadió gota a gota bromuro de ciclopentilo (0,10 ml, 0,958 mmol). La mezcla en agitación se calentó a 65ºC durante 21 horas más. Después de enfriar a temperatura ambiente, se diluyó la mezcla de reacción con Et_{2}O (50 ml) y se lavó con H_{2}O (2 x 25 ml). La capa orgánica se secó con MgSO_{4} y se evaporó el disolvente. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice con hexano/EtOAc (4:1) como eluyente para obtener el compuesto 38 (0,22 g, 64%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 39
Se disolvió el compuesto 38 (3,5 g, 6,61 mmol) en THF/H_{2}O (3:1, 60 ml) y se enfrió a 0ºC. Se añadieron hidróxido de litio monohidratado (0,546 g, 13,02 mmol) y peróxido de hidrógeno al 30% (2,98 ml, 26,04 mmol) y se agitó la mezcla a 0ºC durante 3 horas. Se añadió una solución de sulfito de sodio (3,61 g, 28,64 mmol) en agua (19 ml), seguido por bicarbonato de sodio 0,5 N (35 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas y después se concentró en vacío. Se diluyó la fase acuosa con HCl al 5% a pH = 2 y después se extrajo con EtOAc (3 x 75 ml). Las capas orgánicas reunidas se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y se concentró el filtrado en vacío. El producto crudo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando ácido acético al 0,2% en acetato de etilo/hexano (1:4) como eluyente para obtener el compuesto 39 (2,24 g, 91%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 40
Se añadió gota a gota a lo largo de 40 minutos BH_{3}-THF (solución 1,0 M en THF, 2,70 ml, 2,70 mmol) a una solución del compuesto 39 (223 g, 2,64 mmol) en THF seco (15 ml) a -18ºC. Se retiró después el baño de enfriamiento, y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 18 horas. Se añadió solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (15 ml), y se extrajo la fase acuosa con EtOAc (3 x 50 ml). La fase orgánica reunida se lavó con NaCl saturado (2 x 50 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado en vacío. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc al 25% en hexano para obtener el compuesto 40 (1,91 g, 89%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 41
Se calentó a 85ºC durante 30 minutos una solución del compuesto 40 (0,39 g, 1,07 mmol) y ácido p-toluenosulfó-
nico monohidratado (29 mg) en tolueno (25 ml). Se separó el tolueno en vacío, y se disolvió el residuo en diclorometano (60 ml) y se lavó sucesivamente con NaHCO_{3} acuoso saturado (20 ml) y salmuera (20 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se concentró el filtrado para dar el compuesto 41 (0,293 g, 94%) como un sólido blanco
Síntesis del compuesto 42
A una solución del compuesto 41 (0,29 g, 1,0 mmol) en THF seco (5 ml), bajo argón, se añadió lentamente LDA [1,20 mmol, preparado a partir de n-BuLi (0,48 ml, solución 2,5 M en hexano, 1,20 mmol) y diisopropilamina (0,17 ml, 1,20 mmol)] en THF (2,5 ml) a -78ºC. Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió a la mezcla anterior con una jeringa HMPA (0,26 ml, 1,5 mmol). Después de 15 minutos, se añadió bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo (0,614 g, 2,00 moles) en THF (1 ml). Se calentó lentamente la mezcla resultante hasta 0ºC y se agitó durante 2 horas más. El exceso de la base se sofocó a 0ºC con NH_{4}Cl acuoso saturado (15 ml), y la solución resultante se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3 X 50 ml). La capa orgánica reunida se lavó con salmuera (2 x 50 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 3:1) para dar el compuesto 42 (0,362 g, 70%) como una espuma blanca.
Síntesis del compuesto 43
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante 18 horas una mezcla del compuesto 42 (0,30 g, 0,581 mmol) y Pd al 10%/C (30 mg) en EtOAc/AcOH (4:1, 10 ml). Se filtró la mezcla sobre celita y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con hexano/EtOAc (4:1) para obtener el compuesto 43 (0,205 g, 83%) como una espuma blanca.
Síntesis de los compuestos lactámicos 51 y análogos relacionados
Las \delta-lactamas análogas a las \delta-lactonas se pueden sintetizar según el Esquema 6. Por ejemplo, la conversión del compuesto 20 en el intermedio clave 46 se consiguió en una secuencia de cinco etapas como sigue. El tratamiento del compuesto 20 con complejo de azida de cinc y bis-piridina, trifenilfosfina y azodicarboxilato de diisopropilo en tolueno lleva suavemente a la correspondiente azida 44 con 91% de rendimiento. Después se hidrogena el compuesto 44 en presencia de Pd al 10%-C y la amina 45 resultante se convierte en el compuesto 46 (63% en dos etapas) por tratamiento con NaOH en DMF.
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Esquema 6
30
Para la síntesis del compuesto 51, el primer método está detallado en el Esquema 7. En este método, el compuesto 46 se trata con NaH y bromuro de bencilo en DMF para obtener el compuesto 47 con 80% de rendimiento. Después se pone el compuesto 47 en THF y se alquila con bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo para dar los deseados productos de acoplamiento 48 y 49 en una relación de 7,2:1, con 86% de rendimiento. Estos dos isómeros se pueden separar por cromatografía en columna con gel de sílice. La des-O-bencilación del compuesto 49 usando Pd al 10%-C como catalizador se realiza fácilmente y se aísla el fenol 50 con 98% de rendimiento. La posterior hidrogenolisis a alta presión puede producir después el compuesto 51.
Esquema 7
31
Para proteger el nitrógeno lactámico se pueden usar también métodos alternativos como se detallan en el Esquema 8. Por ejemplo, la N-protección del compuesto 46 como la N-t-butoxicarbonilamida se puede conseguir usando dicarbonato de di-terc-butilo y trietilamina en diclorometano para dar el derivado 52 con 95% de rendimiento. Por alquilación del compuesto 52 con bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo se obtiene el compuesto 53 con 67% de rendimiento. El compuesto 53 es un mezcla de diastereoisómeros. La separación del grupo protector N-BOC en el compuesto 53 con ácido trifluoroacético en diclorometano da el producto 54 con 74% de rendimiento. La hidrogenolisis del compuesto 54 usando Pd al 10%/C como catalizador proporciona la mezcla diastereoisómera 55 con 81% de rendimiento.
Esquema 8
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Síntesis de los compuestos lactámicos 61 y 62
En otro ejemplo de preparación de lactamas, la síntesis de los compuestos 61 y 62 se lleva a cabo por el procedimiento detallado en el Esquema 9. El tratamiento del compuesto 40 con complejo de azida de cinc y bis-piridina, trifenilfosfina y azodicarboxilato de diisopropilo en tolueno produce la correspondiente azida 56. El compuesto crudo 56 se hidrogena después en presencia de Pd al 10%-C para dar el compuesto 57 con 76% de rendimiento en dos etapas. La etapa de la ciclación lactámica implica una secuencia de reacción de tres etapas en un solo recipiente empleando la solvolisis del éster terc-butílico con ácido p-toluenosulfónico monohidratado, esterificación en metanol, y ciclación lactámica tras la adición de trietilamina para proporcionar el compuesto 58 con un rendimiento del 96% en las tres etapas. La N-protección del compuesto 58 resultante con dicarbonato de di-terc-butilo y trietilamina en diclorometano proporciona el derivado N-t-butoxicarbonilamida 59 con 84% de rendimiento. Por alquilación del compuesto 59 con LDA y bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo se obtiene el compuesto 60 con 74% de rendimiento. El compuesto 60 es un mezcla de diastereoisómeros con una relación R/S de 1:1. La separación del grupo protector N-BOC en el compuesto 60 con ácido trifluoroacético en diclorometano da el producto 61 deseado con 74% de rendimiento. La hidrogenolisis del compuesto 61 usando Pd al 10%/C como catalizador proporciona el producto final 82 con 81% de rendimiento.
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Esquema 9
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33
Síntesis del compuesto 44
Preparación del complejo ZnN_{6}.2Py: A una solución en agitación de Zn(NO_{3})_{2}.6H_{2}O (3,57 g, 12,0 mmol) en H_{2}O (6 ml), se añadió gota a gota una solución de NaN_{3} (1,56 g, 24,0 mmol) en H_{2}O (12 ml). La suspensión blanca se llevó hasta 50ºC en un baño de aceite, después se añadió gota a gota piridina (2,0 ml, 24,7 mmol) formando un denso precipitado blanco. Se continuó agitando mientras se enfriaba la mezcla lentamente a temperatura ambiente. Se filtró la sal, se lavó con agua enfriada con hielo y se secó en vacío para dar ZnN_{6}.2Py (2,99 g, 81%) como un sólido blanco.
Se añadió azodicarboxilato de diisopropilo (1,30 ml, 6,59 mmol) a una suspensión del compuesto 20 (1,0 g, 3,30 mmol), ZnN_{6}.2Py (0,76 g, 2,47 mmol) y Ph_{3}P (1,73 g, 6,59 mmol) en tolueno anhidro (20 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 18 horas. Se concentró la mezcla, y se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con hexano/EtOAc (9:1) para obtener el compuesto 44 (1,01 g, 91%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 45
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante 18 horas una mezcla del compuesto 44 (1,00 g, 2,98 mmol) y Pd al 10%/C (100 mg) en EtOAc (30 ml). Se filtró la mezcla sobre celita y se evaporó el filtrado a sequedad para dar el compuesto 45 (0,923 g, 100%) como un jarabe incoloro.
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Síntesis del compuesto 46
Se añadió hidróxido de sodio (5 N, 0,14 ml, 0,70 mmol) a una solución del compuesto 45 (0,21 g, 0,68 mmol) en THF (1 ml) y MeOH (1 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 18 horas. Se concentró la mezcla, y se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con hexano/EtOAc (9:1) para obtener el compuesto 46 (0,091 g, 63%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 47
Se disolvió el compuesto 46 (0,184 g, 0,782 mmol) en DMF (5 ml) y se enfrió a 0ºC, y se añadió NaH (0,0344 g, al 60% en aceite mineral, 0,860 mmol). Después de dos horas, se añadió lentamente bromuro de bencilo (0,14 ml, 1,173 mmol) y se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante otras 18 horas. Se evaporó el disolvente y se purificó el residuo resultante por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc para obtener el compuesto 47 (0,203 g, 80%) como un sólido blanco.
Síntesis de los compuestos 48, 49
A una solución del compuesto 47 (0,23 g, 0,707 mmol) en THF seco (4 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA [0,85 mmol, preparado a partir de n-BuLi (0,34 ml, solución 2,5 M en hexano, 0,85 mmol) y diisopropilamina (0,12 ml, 0,85 mmol)] en THF (2 ml) a -78ºC. Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora y después se añadió a la mezcla anterior HMPA (0,18 ml, 1,06 mmol) mediante una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo (0,434 g, 1,41 mmol) en THF (1 ml). Se agitó la mezcla resultante durante otras 2 horas a -78ºC. El exceso de la base se sofocó a 0ºC con NH_{4}Cl acuoso saturado (10 ml), y la solución resultante se extrajo con EtOAc (3 x 30 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (2 x 40 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con hexano/EtOAc (3:2) para dar los compuestos 49 (0,295 g, 75,6%) y 48 (0,041 mg, 10,5%) como espumas blancas.
Síntesis del compuesto 50
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante 48 horas una mezcla del compuesto 49 (0,25 g, 0,453 mmol) y Pd al 10%/C (50 mg) en EtOAc (20 ml). Se filtró la mezcla sobre celita y se evaporó el filtrado a sequedad para dar el compuesto 50 (0,204 g, 98%) como una espuma blanca.
Síntesis del compuesto 52
Se añadió dicarbonato de di-terc-butilo (0,724 g, 3,32 mmol) a una solución del compuesto 46 (0,39 g, 1,66 mmol), Et_{3}N (0,46 ml, 3,22 mmol) y DMAP (0,040 g) en CH_{2}Cl_{2} (12 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 4 horas. Se concentró la mezcla, y el residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con hexano/EtOAc (2:1) para obtener el compuesto 52 (0,543 g, 98%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 53
A una solución del compuesto 52 (0,54 g, 1,61 mmol) en THF seco (7 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA [1,93 mmol, preparado a partir de n-BuLi (0,77 ml, solución 2,5 M en hexano, 1,93 mmol) y diisopropilamina (0,27 ml, 1,93 mmol)] en THF (4 ml) a -78ºC. Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora y después se añadió a la mezcla anterior HMPA (0,42 ml, 2,42 mmol) mediante una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo (0,989 g, 3,22 moles) en THF (2 ml). Se agitó la mezcla resultante durante otras 4 horas a -78ºC. El exceso de la base se sofocó a 0ºC con NH_{4}Cl acuoso saturado (20 ml), y la solución resultante se extrajo con EtOAc (4 x 50 ml). La capa orgánica reunida se lavó con salmuera saturada (2 x 50 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con hexano/EtOAc (4:1) para dar el compuesto 53 (0,604 g, 67%) como una espuma blanca.
Síntesis del compuesto 54
Se añadió ácido trifluoroacético (10 ml) a una solución del compuesto 53 (0,557 g. 0,990 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (10 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas y después se concentró en vacío. El residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (100 ml) y se lavó con NaHCO_{3} saturado (3 x 20 ml). La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y el filtrado se concentró en vacío. El producto crudo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando MeOH al 5% en acetato de etilo como eluyente para obtener el compuesto 54 (0,349 g, 76%) como una espuma blanca.
Síntesis del compuesto 55
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante 5 horas una mezcla del compuesto 54 (0,30 g, 0,65 mmol) y Pd al 10%/C (30 mg) en EtOAc/AcOH (1:1, 10 ml). Se filtró la mezcla sobre celita y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc/MeOH (9:1) para obtener el compuesto 55 (0,195 g, 81%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 56
Se añadió azodicarboxilato de diisopropilo (1,62 ml, 8,24 mmol) a una suspensión del compuesto 40 (1,5 g, 4,12 mmol), ZnN_{6}.2Py (0,95 g. 3,09 mmol) y Ph_{3}P (2,16 g, 8,24 mmol) en tolueno anhidro (20 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 18 horas. Se concentró después la mezcla, y se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc al 15% en hexano para obtener el compuesto 56 (1,59 g) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 57
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante 20 horas una mezcla del compuesto 56 (1,59 g) y Pd al 10%/C (80 mg) en EtOAc (20 ml). Se filtró la mezcla sobre celita y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc/MeOH/Et_{3}N (85:14: 1) para obtener el compuesto 57 (1,14 g, 76% en dos etapas) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 58
Se disolvió el compuesto 57 (0,301 g, 0,825 mmol) en tolueno (18 ml) y MeOH (2 ml) y se trató con pTsOH.H_{2}O (0,472 g, 2,48 mmol). Se calentó la solución a reflujo durante 1,5 horas usando un aparato de Dean-Stark. Se separó después el aparato de Dean-5tark y se añadió Et_{3}N (0,35 ml, 2,48 mmol) a la solución, que se calentó a reflujo durante 4 horas más. Se evaporó el disolvente y se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con AcOH al 2% en EtOAc para obtener el compuesto 58 (0,228 g, 96%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 59
Se añadió dicarbonato de di-terc-butilo (0,935 g, 4,28 mmol) a una solución del compuesto 58 (0,62 g, 2,14 mmol), Et_{3}N (0,60 ml, 4,28 mmol) y DMAP (0,060 g) en CH_{2}Cl_{2} (20 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 5 horas. Se concentró la mezcla, y se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con hexano/EtOAc (3:1) para obtener el compuesto 59 (0,696 g, 84%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 60
A una solución del compuesto 59 (0,60 g, 1,54 mmol) en THF seco (5 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA [1,85 mmol, preparado a partir de n-BuLi (0,74 ml, solución 2,5 M en hexano, 1,85 mmol) y diisopropilamina (0,26 ml, 1,85 mmol)] en THF (2 ml) a -78ºC. Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora y después se añadió a la mezcla anterior HMPA (0,40 ml, 2,30 mmol) mediante una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo (0,71 g, 2,30 mmol) en THF (2 ml). Se agitó la mezcla resultante durante otras 4 horas a -78ºC. El exceso de la base se sofocó a 0ºC con NH_{4}Cl acuoso saturado (20 ml), y la solución resultante se extrajo con EtOAc (3 x 60 ml). La capa orgánica reunida se lavó con salmuera saturada (2 x 50 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con hexano/EtOAc (7:3) para dar el compuesto 60 (0,693 g, 74%) como una espuma blanca.
Síntesis del compuesto 61
Se añadió ácido trifluoroacético (3 ml) a una solución del compuesto 60 (0,63 g. 1,02 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (3 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 4 horas, se diluyó con tolueno (20 ml) y después se concentró en vacío. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando MeOH al 5% en acetato de etilo como eluyente para obtener el compuesto 61 (0,39 g, 74%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 62
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante 5 horas una mezcla del compuesto 61 (0,28 g, 0,54 mmol) y Pd al 10%/C (27 mg) en EtOAc/AcOH (1:1, 6 ml). Se filtró la mezcla sobre celita y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc/MeOH (97:3) para obtener el compuesto 62 (0,20 g, 84%) como una espuma blanca.
Preparación de bromuros de bencilo sustituidos; intermedios de fenil-\delta-lactona sustituidos; y productos finales
El Esquema 10 representa la metodología sintética general que se puede usar para la síntesis de las \delta-lactonas C. Ejemplos de la metodología sintética para proporcionar los compuestos A, B, y C se dan a continuación.
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Esquema 10
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Se pueden usar muchos haluros de bencilo sustituidos para generar un producto final de estructura C con diferentes patrones de sustitución sobre el anillo bencílico. Los bromuros de bencilo sustituidos están comercialmente disponibles o se pueden generar a partir del correspondiente alcohol bencílico, benzaldehído, ácido benzoico o éster benzoico, sustituido.
Por ejemplo, se pueden preparar bromuros de bencilo sustituidos como se detalla en el Esquema 11. Se pueden producir muchos compuestos relacionados con el compuesto 63 usando metodología similar pero partiendo de un alcohol bencílico sustituido diferente. De este modo, el tratamiento del material de partida compuesto 31, comercialmente disponible, con bromuro de bencilo y carbonato de potasio en tolueno da el correspondiente derivado benciloxi 32, que se trata, sin purificación, con PBr_{3} en éter dietílico para dar el deseado bromuro, compuesto 63 con rendimiento cuantitativo.
Esquema 11
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Síntesis del compuesto 63
A una solución del alcohol 32 (3,20 g, 13,1 mmol) en éter dietílico anhidro (15 ml), se añadió PBr_{3} (1,77 g, 6,55 mmol) en una porción, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Se diluyó la mezcla con éter dietílico (40 ml) y se lavó con H_{2}O (2 x 30 ml), NaHCO_{3} saturado (2 x 30 ml), y salmuera (2 x 30 ml). Se secó la capa etérea sobre MgSO_{4} anhidro, y se separó el disolvente a presión reducida para obtener el compuesto 63 (4,02 g, 100%) como un sólido amarillo claro.
Los compuestos de bromuro de bencilo sustituido se pueden preparar también a partir de benzaldehídos, ácidos y ésteres benzoicos, sustituidos, comercialmente disponibles convirtiendo en primer lugar estos compuestos en el correspondiente alcohol. Más adelante se describen ejemplos de metodología sintética para proporcionar bromuros de bencilo sustituidos a partir de aldehído bencílico. Por ejemplo, como se ilustra en el Esquema 12, el tratamiento del 4-hidroxi-3-nitro-benzaldehído 73 con bromuro de bencilo en presencia de K_{2}CO_{3} en DMF a 65ºC da el 4-benciloxi-3-nitro-benzaldehído 74. Por reducción del compuesto 74 en metanol con NaBH_{4} se obtiene el alcohol 75 y la subsiguiente bromación usando PBr_{3} en éter dietílico proporciona el bromuro deseado, compuesto 76.
El Esquema 12 muestra también cómo se pueden preparar otros compuestos de bromuro de bencilo representativos.
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Esquema 12
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Síntesis del compuesto 74
A una suspensión de 4-hidroxi-3-nitrobenzaldehído 73 (3,00 g, 17,95 mmol), carbonato de potasio (3,73 g, 26,93 mmol) en DMF (300 ml), se añadió lentamente bromuro de bencilo (2,85 ml, 23,96 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a 65ºC durante 18 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, se diluyó la mezcla con agua (140 ml) y se extrajo con éter dietílico (3 x 150 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con agua (150 ml) y salmuera (160 ml). Después de secar sobre MgSO_{4} anhidro, por filtración y evaporación del filtrado en vacío se obtuvo el compuesto crudo 74 (4,393 g, 95%) que se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.
Síntesis del compuesto 75
Se disolvió el compuesto 74 (4,30 g, 16,72 mmol) en EtOH/CH_{2}Cl_{2} (1:1, 50 ml) y se enfrió a 0ºC. Se añadió en porciones NaBH_{4} (0,63 g, 16,72 mmol). Una vez que se hubo completado la adición, se separó el baño de hielo-agua y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadió agua (40 ml) y se extrajo la mezcla con CH_{2}Cl_{2} (3 x 60 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (50 ml) y se secaron sobre MgSO_{4} anhidro. La separación del disolvente dio un sólido amarillo pálido que se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 1:1) para dar el compuesto 75 (4,31 g, 99%) como un sólido amarillo pálido.
Síntesis del compuesto 76
A una solución del compuesto 75 (4,30 g, 16,59 mmol) en éter dietílico anhidro (40 ml), se añadió lentamente PBr_{3} (0,79 ml, 8,30 mmol) con una jeringa, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Se diluyó la mezcla con EtOAc (100 ml) y se lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado (2 x 50 ml) y salmuera (2 x 50 ml). La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4} anhidro y el disolvente se separó a presión reducida para obtener el compuesto 76 (5,07 g, 95%) como un sólido amarillo pálido.
La alquilación usando diferentes compuestos haluro para proporcionar los productos deseados 77, 80, 89, 92, 94, 95 y 96 se detalla en los esquemas 13, 14, 15, 16, 17, 18 y 19, respectivamente. En el Esquema 13, se alquila el compuesto 21 con bromuro de 3,4-difluorobencilo comercialmente disponible para dar el compuesto 77 deseado con 59% de rendimiento.
Esquema 13
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Síntesis del compuesto 77
Se añadió n-butil-litio (solución 2,5 M en hexano, 0,56 ml, 1,40 mmol) a una solución de diisopropilamina (0,20 ml) en THF seco (10 ml) a -78ºC. Se agitó la mezcla a -78ºC durante 1 hora, después se añadió HMPA (0,33 ml, 1,91 mmol), seguido por la adición de una solución del compuesto 21 (0,30 g, 1,27 mmol) en THF (3 ml). Después de 1 hora, se añadió a la reacción, en una porción, una solución de bromuro de 3,4-difluorobencilo (comprado de Aldrich Chemical Company, Inc., 0,32 ml, 2,54 mmol), y la mezcla resultante se agitó a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (10 ml), y la solución resultante se extrajo con EtOAc (3 x 20 ml). La capa orgánica reunida se lavó con NaCl saturado (2 x 30 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 2:1) para dar el compuesto 77 (0,27 g, 59%) como un sólido blanco.
En el Esquema 14, el compuesto 21 se alquila con bromuro de 3,4-dibenciloxi-bencilo (preparado por tratamiento del correspondiente alcohol con PBr_{3}), seguido por hidrogenación usando Pd al 10%/C como catalizador para dar el compuesto 80 deseado con buen rendimiento.
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Esquema 14
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41 
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Síntesis del compuesto 78
A una solución de alcohol 3,4-dibenciloxibencílico (1,35 g, 4,21 mmol) en éter dietílico anhidro (25 ml), se añadió PBr_{3} (0,20 ml, 2,11 mmol) en una porción, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Se diluyó la mezcla con éter dietílico (50 ml) y se lavó con H_{2}O (2 x 30 ml), NaHCO_{3} saturado (2 x 30 ml) y salmuera (2 x 30 ml). Se secó la capa etérea sobre MgSO_{4} anhidro y el disolvente se separó a presión reducida para obtener el compuesto 78 (1,47 g, 91%) como un aceite amarillo claro.
Síntesis del compuesto 79
Se añadió n-butil-litio (solución 2,5 M en hexano, 0,38 ml, 0,931 mmol) a una solución de diisopropilamina (0,14 ml 0,999 mmol) en THF seco (3 ml) a -78ºC. Se agitó la mezcla a -78ºC durante 1 hora, después se añadió HMPA (0,22 ml, 1,27 mmol), seguido por la adición de una solución del compuesto 21 (200,0 mg, 0,846 mmol) en THF (3 ml). Después de 1 hora, se añadió a la reacción, en una porción, una solución de bromuro de 3,4-dibenciloxibencilo (compuesto 78, 248,5 mg, 0,80 mmol) en THF (1 ml) y la mezcla resultante se agitó a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (10 ml), y la solución resultante se extrajo con EtOAc (3 x 20 ml). La capa orgánica reunida se lavó con NaCl saturado (2 x 30 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 2:1) para dar el compuesto 79 (0,31 g, 67%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 80
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante 2 horas una mezcla del compuesto 79 (0,20 g, 0,37 mmol) y Pd al 10%/C (25 mg) en EtOAc/AcOH (4:1, 5 ml). Se filtró después la mezcla sobre lecho de celita y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 3:2) para dar el compuesto 80 (0,093 mg, 70%) como un jarabe incoloro.
Los esquemas 15 y 16 ilustran la preparación de los compuestos 89 y 92, dos compuestos representativos de los intermedios de fenil-\delta-lactona sustituidos, usando una metodología sintética similar a la descrita en los ejemplos previos pero usando el apropiado alcohol bencílico para generar los compuestos 89 y 92 (por ejemplo, la síntesis del compuesto 41 en el Esquema 5).
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Esquema 15
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Esquema 16
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Síntesis del compuesto 90
Se añadieron hidróxido de litio monohidratado (3,21 g, 76,5 mmol) y H_{2}O_{2} (al 30% en H_{2}O, 17,5 ml, 152,8 mmol) a una solución del compuesto 37 (21,4 g, 38,2 mmol) en THF/H_{2}O (3:1, 350 ml) a 0ºC. Se agitó la mezcla de reacción a 0ºC durante 3 horas. Se añadió después una solución de sulfito de sodio (21,2 g, 168,1 mmol) en agua (100 ml), seguido por una solución de bicarbonato de sodio 0,5 N (200 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas y después se concentró en vacío. Se diluyó la fase acuosa con HCl al 10% a pH = 2 y se extrajo después con EtOAc (3 x 700 ml). Las capas orgánicas reunidas se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y se concentró el filtrado en vacío. El aceite resultante se purificó usando cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con ácido acético al 0,2% en acetato de etilo-hexano (1:3) para obtener el compuesto 90 (12,6 g, 82%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 91
Se añadió gota a gota a lo largo de 20 minutos BH_{3}-THF (solución 1,0 M en THF, 13,8 ml, 13,8 mmol) a una solución del compuesto 90 (5,53 g, 13,8 mmol) en THF seco (40 ml) a -15ºC. Se separó después el baño de enfriamiento, y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 4 horas. Se añadió solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (20 ml), y se extrajo la fase acuosa con EtOAc (3 x 20 ml). La fase orgánica reunida se lavó con NaCl saturado (2 x 40 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y el filtrado se evaporó en vacío. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc/hexano (1:2) para obtener el compuesto 91 (5,22 g, 98%) como una cera incolora.
Síntesis del compuesto 92
Una solución del compuesto 91 (1,5 g, 3,88 mmol) y ácido p-toluenosulfónico monohidratado (86,0 mg) en tolueno (30 ml), se calentó a 80ºC durante 30 minutos. Se separó el tolueno en vacío, y el residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc/hexano (1:1) para obtener el compuesto 92 (1,11 g, 91%) como un aceite incoloro.
En el Esquema 17, el compuesto 41 se alquila con el compuesto 76 y por la subsiguiente hidrogenación catalítica del compuesto 93 resultante se obtiene el compuesto 94 deseado con buen rendimiento.
Esquema 17
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Síntesis del compuesto 93
A una solución del compuesto 41 (0,20 g, 0,688 mmol) en THF seco (4 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (1,16 ml, 0,826 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,20 ml, 1,03 mmol) a la mezcla con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió el compuesto 76 (0,332 g, 1,03 mmol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante otras 4 horas. Después se sofocó la reacción con NH_{4}Cl acuoso saturado (10 ml), y la solución resultante se extrajo con EtOAc (3 x 20 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (30 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 95:5) para obtener el compuesto 93 (0,264 g, 72%) como una espuma blanca.
Síntesis del compuesto 94
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante la noche una mezcla del compuesto 93 (0,20 g, 0,376 mmol) y Pd al 10%/C (30 mg) en EtOAc (7 ml). Se separó el catalizador por filtración y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 7:3) para obtener el compuesto 94 (0,111 g, 72%) como un sólido amarillo pálido (El gel de sílice fue tratado previamente con trietilamina al 1%).
Similarmente, en el Esquema 18 y en el Esquema 19, el compuesto 41 se alquila con comercialmente disponible yoduro de metilo y yoduro de alilo respectivamente, comercialmente disponibles, para proporcionar los deseados compuesto 95 y compuesto 96.
Esquema 18
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Síntesis del compuesto 95
A una solución del compuesto 41 (0,20 g, 0,688 mmol) en THF seco (3 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (1,16 ml, 0,826 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,2 ml, 1,03 mmol) a la mezcla anterior con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió yoduro de metilo (0,064 ml, 1,03 mmol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante otras 4 horas. Después se sofocó la reacción con NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 95:5) para obtener el compuesto 95 (0,168 g, 80%) como un sólido blanco.
Esquema 19
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Síntesis del compuesto 96
A una del solución compuesto 41 (0,40 g, 1,38 mmol) en THF seco (4 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (2,32 ml, 1,66 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,4 ml, 2,07 mmol) a la mezcla con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió yoduro de alilo (0,19 ml, 2,07 mmol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante otras 4 horas. Después se sofocó la reacción con NH_{4}Cl acuoso saturado (10 ml), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 30 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (30 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 95:5) para obtener el compuesto 96 (0,33 g, 72%) como un sólido blanco.
Se han preparado los compuestos de las fórmulas (1-4) con cadenas alquiloxi con alto número de carbonos unidas a un anillo fenilo, y particularmente el anillo fenilo en la posición 5 de la lactona o anillo análogo. Por ejemplo, el compuesto 101 se puede producir en 5 etapas a partir del compuesto 91, como se ilustra en el Esquema 20. Se debe reconocer que se puede aplicar la misma o análoga metodología sintética para proporcionar la sustitución con hidrocarbiloxi sobre un anillo fenilo para cualquiera de los compuestos de las fórmulas (1-4) o relacionados.
Por tanto, la desprotección del compuesto 91 usando H_{2} y paladio al 10% sobre carbono da el correspondiente derivado fenol 97. El tratamiento del compuesto 97 con 1-bromobutano, carbonato de potasio y yoduro de potasio en DMF da el derivado butiloxi 98. La separación de la unión del éster t-butílico en el compuesto 98 con ácido p-toluenosulfónico monohidratado en tolueno produce el correspondiente hidroxi-ácido, que se lactoniza espontáneamente para producir el compuesto 99. La alquilación del anion litio del compuesto 99 con el compuesto 76 da el compuesto 100. La hidrogenación del compuesto 100 proporciona el compuesto 101 deseado.
Esquema 20
48
Síntesis del compuesto 97
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante la noche una mezcla del compuesto 91 (3,0 g, 7,76 mmol) y Pd al 10%/C (0,30 mg) en EtOAc/AcOH (1,1, 40 ml). Se separó el catalizador por filtración y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 3:2) para obtener el compuesto 97 (1,82 g, 79%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 98
A una suspensión del compuesto 97 (0,80 g, 2,70 mmol), carbonato de potasio (0,746 g, 5,40 mmol) y KI (30 mg) en DMF anhidra (7 ml), se añadió 1-bromobutano (0,58 ml, 5,40 mmol) con una jeringa. Después, se agitó la mezcla de reacción a 65ºC durante la noche. Después de enfriar, se diluyó la mezcla con agua (30 ml) y se extrajo con éter dietílico (3 x 50 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (2 x 50 ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna con gel de sílice (hexano/EtOAc, 7:3) para obtener el compuesto 98 (0,834 g, 88%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 99
Se calentó a 75ºC durante 30 minutos una mezcla del compuesto 98 (0,834 g, 2,37 mmol) y ácido p-toluenosulfó-
nico monohidratado (80,0 mg) en tolueno (20,0 ml). Se separó el tolueno en vacío, y se purificó el residuo por cromatografía en columna con gel de sílice (hexano/EtOAc, 7:3) para obtener el compuesto 99 (0,422 g, 64%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 100
A una solución de la lactona 99 (0,30 g. 1,08 mmol) en THF seco (4 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (0,58 ml, 0,412 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,18 ml, 1,30 mmol) a la mezcla con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió el compuesto 76 (0,52 g, 1,62 mmol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante otras 4 horas. Después se sofocó la reacción con NH_{4}Cl acuoso saturado (10 ml), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 20 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 95:5) para obtener el compuesto 100 (0,443 g, 79%) como un sólido amarillo claro.
Síntesis del compuesto 101
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante la noche una mezcla del compuesto 100 (0,40 g, 0,77 mmol) y Pd al 10%/C (40 mg) en EtOAc (5 ml). Se separó el catalizador por filtración y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 3:2) para obtener el compuesto 101 (0,215 g, 70%) como una espuma de color amarillo pálido.
Los compuestos de las fórmulas (1-4) que contienen sustituciones de hidrocarbiloxicarbonilo en un anillo fenilo, y particularmente en el anillo fenilo en el C5 de la lactona o anillo análogo, se pueden preparar según el Esquema 21. Por ejemplo, el compuesto 103 se puede sintetizar como sigue. La lactonización del compuesto 97 usando ácido p-toluenosulfónico monohidratado en tolueno da el compuesto 102. La reacción del compuesto 102 con cloruro de acetilo y trietilamina en diclorometano proporciona el compuesto 103 con la unión éster sobre el anillo fenilo.
Esquema 21
49
Síntesis del compuesto 102
Se calentó a 75ºC durante 30 minutos una mezcla del compuesto 97 (1,01 g, 3,41 mmol) y ácido p-toluenosulfónico monohidratado (100 mg) en tolueno (30 ml). Se separó el tolueno en vacío, y se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (CH_{2}Cl_{2}/EtOAc, 70:30) para dar el compuesto 102 (0,71 g, 94%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 103
A una solución del compuesto 102 (0,100 g, 0,45 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (2 ml) a 0ºC, se añadieron trietilamina (0,125 ml, 0,9 mmol) y cloruro de acetilo (0,048 ml, 0,675 mmol). Se calentó la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente y se agitó durante 4 horas y después se sofocó con agua (5 ml). Se extrajo la mezcla con acetato de etilo (3 x 10 ml), y las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (15 ml) y se secaron sobre MgSO_{4}. Se separó el disolvente y el residuo resultante se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 95:5) para dar el compuesto 103 (0,103 g, 87%) como un jarabe incoloro.
Los compuestos de las fórmulas (1-4) que contienen sustituciones del grupo hidrocarbilo en un anillo fenilo, y particularmente en el anillo fenilo en el C5 de la lactona o anillo análogo, se pueden sintetizar según la secuencia de reacción detallada en el Esquema 22. Se puede aplicar la misma o análoga metodología sintética para proporcionar sustituciones con hidrocarburo sobre un anillo fenilo para cualquiera de los compuestos de las fórmulas (1-4) o relacionados.
Como se detalla en el Esquema 22, la protección del grupo hidroxilo en el compuesto 91 se consigue usando cloruro de t-butildimetilsililo e imidazol en N,N-dimetilformamida para dar el compuesto 104. La separación del grupo protector de bencilo usando hidrógeno y paladio sobre carbono en acetato de etilo da el compuesto 105. Después el compuesto 105 se convierte en su correspondiente triflato de arilo 106 haciendo reaccionar el compuesto 105 con anhídrido trifluorometanosulfónico en piridina. Por el acoplamiento cruzado, catalizado por paladio, del compuesto 106 con ácido fenil-borónico se obtiene el compuesto 107. La lactonización seguida por alquilación proporciona el compuesto 109. Finalmente, la hidrogenación catalítica proporciona el compuesto 110.
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Esquema 22
50
Síntesis del compuesto 104
Se disolvió el compuesto 91 (2,50 g, 6,50 mmol) en DMF seca (20 ml) y después se añadió imidazol (0,664 g, 9,75 mmol) seguido por TBDMSCl (1,47 g, 9,75 mmol). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas, se diluyó con éter dietílico (150 ml) y se lavó con solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (2 x 50 ml) y agua (2 x 50 ml). Se secó la capa orgánica sobre MgSO_{4}, se filtró, y se evaporó el filtrado a sequedad para dar el compuesto 104 (3,43 g) como un aceite incoloro que se usó sin purificación adicional.
Síntesis del compuesto 105
A una solución del compuesto 104 (3,43 g) en acetato de etilo (20 ml), se añadió Pd al 10% sobre carbón activado (0,172 g). Se hizo pasar una corriente de hidrógeno por el frasco y se agitó vigorosamente la mezcla en una atmósfera de hidrógeno durante un periodo de 16 horas. Se filtró la mezcla y se evaporó el disolvente. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/acetato de etilo, 3:1) para obtener el compuesto 105 (2,72 g, 85% en dos etapas) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 106
A una solución del compuesto 105 (0,509, 1,22 mmol) en piridina anhidra (5 ml) a 0ºC, se añadió lentamente anhídrido trifluorometanosulfónico (0,23 ml, 1,34 mmol) con una jeringa, y se agitó la mezcla resultante a 0ºC durante 1 hora. Se diluyó la mezcla con EtOAc (100 ml) y se lavó con salmuera acuosa saturada (2 x 50 ml). La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4} anhidro y se separó el disolvente a presión reducida para obtener el compuesto 106 (0,623 g, 94%) como un aceite amarillo pálido.
Síntesis del compuesto 107
A una mezcla de una solución de ácido fenilborónico (0,0247 g, 0,202 mmol), compuesto 106 (0,10 g, 0,184 mmol), K_{3}PO_{4} (0,0586 g, 0,276 mmol), y 1,4-dioxano seco (2 ml) en un frasco seco que se ha barrido con Ar, se añadió Pd(PPh_{3})_{4} (5,3 mg, 0,00461 mmol). Se agitó la mezcla y se calentó en un baño de aceite a 80ºC durante un periodo de 16 horas. Se diluyó la mezcla enfriada con acetato de etilo (75 ml) y se lavó con salmuera (2 x 25 ml). Después, la capa orgánica se secó con MgSO_{4}, se filtró y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc. 30:1) para dar el compuesto 107 (0,0666 g, 87%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 108
Se agitó una solución del compuesto 107 (0,060 g, 0,128 mmol) y ácido p-toluenosulfónico monohidratado (12,2 mg, 0,064 mmol) en tolueno seco (1 ml) en una atmósfera de argón seco y se calentó a 80ºC durante 2 horas. Se filtró la solución enfriada a través de una columna de gel de sílice y se lavó la columna con hexano/acetato de etilo (2:1, 150 ml). Por evaporación del disolvente se obtuvo el compuesto 108 (32,7 mg, 91%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 109
A una solución del compuesto 108 en THF seco bajo argón, se añadió lentamente LDA. Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA a la mezcla con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió el compuesto 76. Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante otras 4 horas. Se sofocó la reacción con NH_{4}Cl acuoso saturado y se extrajo la solución resultante con EtOAc. Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice para obtener el compuesto 109.
Síntesis del compuesto 110
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante la noche una mezcla del compuesto 109 y Pd al 10%/C en EtOAc. Se separó el catalizador por filtración y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice para dar el compuesto 110.
La síntesis del compuesto 114 se lleva a cabo por el procedimiento detallado en el Esquema 23. La metodología sintética es similar a la síntesis del compuesto 110. El acoplamiento cruzado, catalizado por paladio, del compuesto 106 con B-bencil-9-BBN comercialmente disponible (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) proporciona el compuesto 111. La lactonización del compuesto 111 usando ácido p-toluenosulfónico monohidratado en tolueno proporciona el compuesto 112. La alquilación seguida por hidrogenación catalítica da el compuesto 114 deseado.
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(Esquema pasa a página siguiente)
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Esquema 23
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51 
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Síntesis del compuesto 111
A una mezcla de una solución de B-bencil-9-BBN (0,5 M, 1,32 mmol), compuesto 106 (0,650 g, 1,20 mmol), K_{3}PO_{4} (0,382 g, 1,80 mmol), y 1,4-dioxano seco (4 ml) en un frasco seco que se ha barrido con Ar, se añadió cloruro de (difenilfosfino-ferroceno)-paladio(II). Se agitó la mezcla y se calentó en un baño de aceite a 80ºC durante un periodo de 18 horas. Se diluyó la mezcla enfriada con acetato de etilo (20 ml), se trató con KOH al 10% (acuoso) y H_{2}O_{2} al 30% (acuosa, 1,0 ml cada uno) y se dejó agitando durante 2 horas. Se separaron las capas y la fase orgánica se lavó con salmuera (2 x 20 ml) antes de ser secada (MgSO_{4}). Se filtró la solución y se evaporó para dar el producto crudo. Se separó este material por cromatografía en columna (hexano/acetato de etilo, 30:1, 35 g de gel de sílice rápido, columna de 2,5 cm). Se aisló la fracción que contiene la mancha a Rf = 0,35 (hexano/acetato de etilo, 19:1, uv 254 nm, ácido fosfomolíbdico, calor). Por evaporación del disolvente se obtuvo el compuesto 111 (0,295 g, 52%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 112
Se agitó una solución del compuesto 111 (0,285 g, 0,603 mmol) y ácido p-toluenosulfónico monohidratado (40,0 mg, 0,211 mmol) en tolueno seco (5 ml) bajo una atmósfera de Ar seco y se calentó a 80ºC durante 3 horas. Se filtró la solución enfriada a través de una columna de gel de sílice rápido (10 g en una columna de 2 cm) y se lavó la columna con hexano/acetato de etilo (1:1, 150 ml). Por evaporación del disolvente se obtuvo el compuesto 112 (0,105 g, 59%) como un aceite incoloro que solidificó lentamente en reposo.
Síntesis del compuesto 113
A una solución de diisopropilamina (56 \mul, 0,40 mmol) en THF seco (6 ml) en un frasco seco que se ha barrido con Ar, a -78ºC, se añadió una solución de terc-butil-litio (1,7 M, 0,40 mmol). Se agitó la solución durante 15 min y después se añadieron por medio de una cánula el compuesto 112 (0,100 g, 0,337 mmol) y THF seco (3 ml). Se agitó la mezcla de reacción durante 1 h y después se calentó brevemente en un baño de hielo-agua. Se añadió HMPA seca (88 \mul, 0,51 mmol) y se enfrió la solución a -78ºC. Se añadió el compuesto 76 (0,163 g, 0,506 mmol) y se dejó agitando la mezcla a -78ºC durante un periodo de 3 h. Se calentó la mezcla a temperatura ambiente y después se abrió al aire. Se evaporó el disolvente e inmediatamente se purificó el producto crudo por cromatografía en columna (hexano/acetato de etilo 2:1, 20 g de gel de sílice rápido, columna de 2 cm). Se aisló la fracción que contiene la mancha a un Rf = 0,65 (hexano/acetato de etilo 1:1, uv 254 nm, ácido fosfomolíbdico, calor). Por evaporación del disolvente se obtuvo el compuesto 113 (0,103 g, 57%) como un aceite incoloro.
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Síntesis del compuesto 114
A una solución del compuesto 113 (0,100 g, 0,186 mmol) en metanol/acetato de etilo 4:1 (5 ml), se añadió Pd al 10% sobre carbón activado (25 mg, 0,023 mmol). Se pasó una corriente de hidrógeno por el frasco y se agitó vigorosamente la mezcla en una atmósfera de hidrógeno durante un periodo de 48 horas. Se filtró la mezcla y se evaporó el disolvente. Se purificó el residuo por cromatografía en columna (hexano/acetato de etilo, 1:1, 15 g de gel de sílice rápido, columna de 2 cm). Se aisló la fracción que contiene la mancha a un Rf = 0,35 (hexano/acetato de etilo 1:1, uv 254 nm, ácido fosfomolíbdico, calor) Por evaporación del disolvente se obtuvo el compuesto 114 (24,9 mg, 32%) como una espuma sólida casi blanca.
Los compuestos de las fórmulas (1-4) pueden tener sustituyentes de boro sobre un anillo fenilo, y particularmente en el anillo fenilo que está unido a la posición 5 de la lactona o anillo análogo. Más adelante se dan ejemplos de la metodología sintética para proporcionar la sustitución con boro. Se debe reconocer que se puede aplicar la misma o análoga metodología sintética para proporcionar la misma o análoga sustitución sobre un anillo fenilo para cualquiera de los compuestos de las fórmulas (1-4) o relacionados.
Por ejemplo, la introducción de un grupo funcional de boro sobre un anillo fenilo de los compuestos de las fórmulas (1-4), y particularmente sobre un anillo fenilo en la posición 5 de la lactona o análogo de las fórmulas (1-4), se puede llevar a cabo como se detalla en el Esquema 24. Así, el compuesto 115 se puede producir por acoplamiento cruzado, catalizado por paladio, del compuesto 106 con bis-(pinacolato)diboro usando [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio(II) [PdCl_{2}(dppf)] como catalizador y 1-1'-bis(difenilfosfino)ferroceno (dppf) como ligando. La lactonización del compuesto 115 usando ácido p-toluenosulfónico monohidratado en tolueno puede proporcionar el compuesto 116. La alquilación del compuesto 116 con el compuesto 76 puede proporcionar el compuesto 117. La hidrogenación catalítica del compuesto 117 usando hidrógeno y paladio sobre carbono puede proporcionar el compuesto 118 deseado.
Esquema 24
52
Los compuestos de las fórmulas (1-4) pueden tener sustituciones de nitrógeno sobre un anillo fenilo, y particularmente sobre un anillo fenilo en la posición 5 de la lactona o anillo análogo. Más adelante se dan ejemplos de la metodología sintética para proporcionar la sustitución con nitrógeno. Se debe reconocer que se puede aplicar la misma o análoga metodología sintética para proporcionar la misma o análoga sustitución sobre un anillo fenilo para cualquiera de los compuestos de las fórmulas (1-4) o relacionados.
Por ejemplo, el compuesto 122 se puede preparar en una síntesis de multietapas a partir del compuesto 106, como se detalla en el Esquema 25. Así, la aminación,catalizada por paladio, del compuesto 106 usando pirrolidína, acetato de paladio o paladio-dibencilidenacetona, bis(difenilfosfono)binaftilo y terc-butóxido de sodio en tolueno puede dar el compuesto 119. La lactonización del compuesto 119 usando ácido p-toluenosulfónico monohidratado en tolueno puede proporcionar el compuesto 120. La alquilación del compuesto 120 con el compuesto 76 puede proporcionar el compuesto 121. La hidrogenación catalítica del compuesto 121 usando hidrógeno y paladio sobre carbono puede proporcionar el compuesto 122 deseado.
Esquema 25
53
Los compuestos de las fórmulas (1-4) pueden tener sustituciones con azufre sobre un anillo fenilo, y particularmente sobre el anillo fenilo en la posición 5 de la lactona o anillo análogo. Más adelante se dan ejemplos de la metodología sintética para proporcionar las sustituciones con azufre en un anillo fenilo. Se debe reconocer que se puede aplicar la misma o análoga metodología sintética para proporcionar la misma o análoga sustitución en un anillo fenilo de otros compuestos de las fórmulas (1- 4).
La colocación de un grupo que contiene azufre sobre un anillo fenilo se puede conseguir como se detalla en el Esquema 26.
Así, se puede hacer reaccionar un triflato de arilo, tal como el compuesto 106, con 1-butanotiol, acetato de paladio o paladio-dibencilidenacetona, bis(difenilfosfono)binaftilo y terc-butóxido de sodio en tolueno para proporcionar un compuesto, tal como el compuesto 123, con un enlace carbono-azufre. La lactonización se puede conseguir usando ácido p-toluenosulfónico monohidratado en tolueno para obtener el correspondiente compuesto 124. La alquilación del compuesto 124 se puede conseguir entonces por tratamiento del compuesto 124 con LDA y el compuesto 76 en THF. La subsiguiente hidrogenación catalítica del compuesto 125 resultante usando hidrógeno y paladio sobre carbono puede proporcionar el compuesto 126 deseado.
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Esquema 26
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54
Los compuestos de las fórmulas (1-4) pueden tener sustituciones con fósforo sobre un anillo fenilo, y particularmente sobre el anillo fenilo en el carbono número 5 de la lactona o anillo análogo. Más adelante se dan ejemplos de la metodología sintética para proporcionar la sustitución con fósforo en un anillo fenilo. Se debe reconocer que se puede aplicar la misma o análoga metodología sintética para proporcionar la misma o análoga sustitución en un anillo fenilo para cualquiera de los compuestos de las fórmulas (1-4) o relacionados.
El sustituyente de fósforo en el anillo fenilo puede ser introducido según la ruta detallada en el Esquema 27 que sigue. Así, la conversión del compuesto 106 en el compuesto 127 se puede conseguir por tratamiento del compuesto 106 con PdCl_{2}(PPh_{3})_{2}, dietilfosflna, 1,3-bis(difenilfosfino)propano (dppp) y diisopropiletilamina en DMF. La lactonización del compuesto 127 usando ácido p-toluenosulfónico monohidratado en tolueno puede proporcionar después el compuesto 128 deseado.
Esquema 27
55
Como se ha descrito en las secciones anteriores, los compuestos de la presente invención contienen dos átomos de carbono asimétricos y por tanto hay cuatro posibles diastereoisómeros para estos compuestos. Dos ejemplos de secuencias sintéticas para preparar estereoisómeros específicos se detallan en los Esquemas 28 y 29, respectivamente, usando la metodología descrita en los ejemplos anteriores.
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Esquema 28
56
En el Esquema 28, la protección del alcohol primario en el compuesto 40 se puede conseguir usando bromuro de bencilo (BnBr) y carbonato de cesio en DMF para dar el derivado benciloxi 188. El compuesto 188 se puede convertir entonces en su correspondiente ácido 189 haciendo reaccionar el compuesto 188 con ácido trifluoroacético. La síntesis del derivado N-aciloxazolidinona 190 a partir del compuesto 189 se puede llevar a cabo usando el mismo tipo de reacción descrita en las secciones anteriores (por ejemplo, Esquema 4). La alquilación estereoselectiva del compuesto 190 con bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo puede dar el compuesto 191. La hidrólisis del auxiliar quiral con hidróxido de litio y peróxido de hidrógeno puede dar el ácido carboxílico 192. La hidrogenación del compuesto 192 en ácido acético y la lactonización con ácido p-toluenosulfónico monohidratado en tolueno puede dar el producto ciclado 193 deseado que tiene una configuración 3R,5S.
Similarmente, en el Esquema 29, la alquilación estereoselectiva del compuesto 26 con bromuro de 4-(ciclopen-
tiloxi)-3-metoxibencilo (la preparación del compuesto 199 está descrita en el Esquema 30) puede dar el compuesto 194. La hidrólisis del auxiliar quiral con hidróxido de litio y peróxido de hidrógeno puede dar el ácido carboxílico 195. La hidrogenación del compuesto 195 en ácido acético y la lactonización con ácido p-toluenosulfónico monohidratado en tolueno puede dar el producto ciclado deseado 196 que tiene una configuración 3R,5S. Por tanto, los otros tres diastereoisómeros relacionados con el compuesto 193 o con el compuesto 196 se pueden sintetizar de forma similar pero partiendo de diferentes oxazolidinonas quirales. Por ejemplo, los compuestos que contienen una configuración 3S,5S se pueden sintetizar usando el intermedio análogo al compuesto 26 o al compuesto 190 con la oxazolidinona que contiene la configuración opuesta (R).
Esquema 29
57
Los esquemas 30 y 31 ilustran la preparación de los compuestos 199 y 203, dos intermedios que se usan para generar los compuestos 134, 136 y 194.
Así, en el Esquema 30, el tratamiento del compuesto 197 con bromuro de ciclopentilo, yoduro de potasio y carbonato de potasio en DMF da el correspondiente derivado ciclopentiloxi 198, que se trata con PBr_{3} en éter dietílico para dar el deseado bromuro, compuesto 199.
Esquema 30
58
Síntesis del compuesto 198
A una suspensión de alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico 197 (1,00 g, 6,49 mmol), carbonato de potasio (1,79 g, 12,98 mmol) y yoduro de potasio (29,1 mg, 0,175 mmol) en DMF (10 ml), se añadió lentamente bromuro de ciclopentilo (0,91 ml, 8,44 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a 65ºC durante 24 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, se diluyó la mezcla con éter dietílico (50 ml) y se lavó con agua (2 x 25 ml). Después de secar sobre MgSO_{4} anhidro, por filtración y evaporación del filtrado en vacío se obtuvo un sólido amarillo crudo que se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 3:1) para dar el compuesto 198 (0,502 g, 35%) como un sólido amarillo pálido.
Síntesis del compuesto 199
A una solución del compuesto 198 (0,48 g, 2,17 mmol) en éter dietílico anhidro (8 ml), se añadió lentamente PBr_{3} (0,10 ml, 1,09 mmol) con una jeringa, y se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 2 horas. Se diluyó la mezcla con éter dietílico (50 ml) y se lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado (2 x 25 ml) y salmuera (2 x 25 ml). La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4} anhidro, y se separó el disolvente a presión reducida para obtener el compuesto 199 (0,577 g, 93%) como un sólido blanco
En el Esquema 31, el tratamiento del compuesto 200 con bromuro de ciclopentilo, yoduro de potasio y carbonato de potasio en DMF da el correspondiente derivado ciclopentiloxi 201. La reducción del compuesto 201 con NaBH_{4} proporciona el alcohol 202 y la subsiguiente bromación usando PBr_{3} en éter dietílico proporciona el deseado bromuro, compuesto 203.
Esquema 31
59
Síntesis del compuesto 201
A una suspensión de 3-hidroxi-4-metoxibenzaldehído 200 (2,00 g, 13,2 mmol), carbonato de potasio (2,74 g, 19,8 mmol) y yoduro de potasio (60,0 mg, 0,361 mmol) en DMF (13 ml), se añadió lentamente bromuro de ciclopentilo (1,84 ml, 17,2 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a 65ºC durante 21 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, se diluyó la mezcla con tolueno (100 ml), y la fase orgánica se lavó con NaOH 1 N (2 x 30 ml) y agua (2 x 30 ml). Después de secar sobre MgSO_{4} anhidro, por filtración y evaporación del filtrado en vacío se obtuvo el compuesto 201 crudo (2,70 g) que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Síntesis del compuesto 202
Se disolvió el compuesto 201 (2,7 g) en MeOH/CH_{2}Cl_{2} (2:1, 15 ml) y se enfrió a 0ºC. Se añadió en porciones NaBH_{4} (0,464 g, 12,26 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a 0ºC durante 30 minutos. Se añadió agua (100 ml) y se extrajo la mezcla con CH_{2}Cl_{2} (3 x 30 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (50 ml) y se secaron sobre MgSO_{4} anhidro. La separación del disolvente dio un sólido amarillo pálido que se purificó por cromatografía en columna con gel de sílice (hexano/EtOAc, 1:1) para dar el compuesto 202 (2,65 g, 91% en dos etapas) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 203
A una solución del compuesto 202 (0,50 g, 2,26 mmol) en éter dietílico anhidro (9 ml), se añadió lentamente PBr_{3} (0,11 ml, 1,13 mmol) con una jeringa, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Se diluyó la mezcla con éter dietílico (50 ml) y se lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado (2 x 25 ml) y salmuera (2 x 25 ml). La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4} anhidro, y se separó el disolvente a presión reducida para obtener el compuesto 203 (0,604 g, 94%) como un aceite amarillo claro.
Sustitución en la posición para sobre el anillo fenilo
Los compuestos con diferentes grupos alcoxi sustituidos en la posición para sobre el anillo fenilo pueden ser sintetizados según el Esquema 32 usando una metodología análoga a la descrita en las secciones anteriores. Por ejemplo, el compuesto 216 se pueden sintetizar como sigue. El alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico 204 comercialmente disponible (Aldrich, Milwaukee, WI) se puede proteger selectivamente como el derivado benciloxi 205 por tratamiento de 204 con bromuro de bencilo y carbonato de potasio en tolueno a reflujo. Después se puede hacer reaccionar el compuesto 205 con cloruro de metanosulfonilo en presencia de trietilamina y CH_{2}Cl_{2} para obtener el compuesto 206. El compuesto 206 se puede poner entonces en DMF y se puede tratar con cianuro de potasio en presencia de 18-corona-6 para dar el nitrilo 207. Se puede usar después la hidrólisis del nitrilo 207 con hidróxido de potasio 1 N acuoso para obtener el ácido carboxílico deseado 208. El tratamiento del compuesto 208 con cloruro de trimetilacetilo puede dar un anhídrido mixto, que se puede hacer reaccionar con el anion litio de la (S)-{-)-4-bencil-2-oxazolidinona para proporcionar el compuesto 209. La adición enantioselectiva de Michael del enolato de titanio de la oxazolidinona quiral 209 al acrilato de terc-butilo puede proporcionar el compuesto 210 que tiene la función carboxilato con un adecuado grupo protector. La hidrogenación del compuesto 210 puede dar el grupo fenólico, que se puede proteger como el derivado ciclopentiloxi 211 por tratamiento con bromuro de ciclopentilo, carbonato de potasio y yoduro de potasio en DMF. La hidrólisis del auxiliar quiral con hidróxido de litio y peróxido de hidrógeno puede dar el ácido carboxílico 212. La reducción selectiva del compuesto 212 con BH_{3}-THF puede dar el compuesto 213 que contiene el alcohol primario. La lactona 214 se puede obtener por tratamiento del compuesto 213 con pTsOH en tolueno. La alquilación del compuesto 214 con bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo se puede usar para obtener el compuesto 215. La hidrogenación del compuesto 215 en ácido acético se puede usar para dar el producto 216 deseado.
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(Esquema pasa a página siguiente)
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Esquema 32
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60
El Esquema 33 ilustra la preparación del compuesto 218, usando una metodología sintética similar a la descrita en el Esquema 16.
Esquema 33
61
El compuesto 218 es un intermedio clave que se puede usar para generar compuestos que contienen sustituciones de alquiloxi con alto número de carbonos, sustituciones de hidrocarbiloxicarbonilo, sustituciones de hidrocarbilo, sustituciones de boro, sustituciones de nitrógeno, sustituciones de azufre y sustituciones de fósforo en la posición para del anillo fenilo usando la metodología sintética similar a la descrita en los esquemas 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, y 27 para la funcionalización de la posición meta del mismo anillo fenilo.
Síntesis del compuesto 142
Se añadió n-butil-litio (solución 2,5 M en hexano, 0,38 ml, 0,931 mmol) a una solución de diisopropilamina (0,14 ml, 0,999 mmol) en THF seco (3 ml) a -78ºC. Se agitó la mezcla a -78ºC durante 1 hora, después se añadió HMPA (0,22 ml, 1,27 mmol), seguido por la adición de una solución del compuesto 21 (0,20 g, 0,846 mmol) en THF (3 ml). Después de 1 hora, se añadió a la reacción, en una porción, una solución de bromuro de 3-benciloxibencilo (0,469 g, 1,69 mmol) en THF (1 ml) y la mezcla resultante se agitó a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (10 ml), y la solución resultante se extrajo con EtOAc (3 x 20 ml). La capa orgánica reunida se lavó con NaCl saturado (2 x 30 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 2:1) para dar el compuesto 142 (0,284 g, 78%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 131
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante 2 horas una mezcla del compuesto 142 (0,190 mg, 0,439 mmol) y Pd al 10%/C (0,025 g) en EtOAc/AcOH (4:1, 5 ml). Se filtró después la mezcla sobre un lecho de celita y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 3:2) para dar el compuesto 131 (0,133 g, 89%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 132
Se añadió n-butil-litio (solución 2,5 M en hexano, 0,38 ml, 0,931 mmol) a una solución de diisopropilamina (0,14 ml, 0,999 mmol) en THF seco (3 ml) a -78ºC. Se agitó la mezcla a -78ºC durante 1 hora, después se añadió HMPA (0,22 ml, 1,27 mmol), seguido por la adición de una solución del compuesto 21 (0,20 g, 0,846 mmol) en THF (3 ml). Después de 1 hora, se añadió a la reacción, en una porción, una solución de bromuro de 4-metoxibencilo (0,34 g, 1,69 mmol) en THF (1 ml) y la mezcla resultante se agitó a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (10 ml), y la solución resultante se extrajo con EtOAc (3 x 20 ml). La capa orgánica reunida se lavó con NaCl saturado (2 x 30 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 2:1) para dar el compuesto 132 (0,221 g, 73%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 138
Se añadió n-butil-litio (solución 2,5 M en hexano, 0,38 ml, 0,931 mmol) a una solución de diisopropilamina (0,14 ml, 0,999 mmol) en THF seco (3 ml) a -78ºC. Se agitó la mezcla a -78ºC durante 1 hora, después se añadió HMPA (0,22 ml, 1,27 mmol), seguido por la adición de una solución del compuesto 21 (0,20 g, 0,846 mmol) en THF (3 ml). Después de 1 hora, se añadió a la reacción, en una porción, una solución de bromuro de 4-benciloxibencilo (0,469 g, 1,692 mmol) en THF (1 ml), y la mezcla resultante se agitó a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (10 ml), y la solución resultante se extrajo con EtOAc (3 x 20 ml). La capa orgánica reunida se lavó con NaCl saturado (2 x 30 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 2:1) para dar el compuesto 138 (0,29 g, 79%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 133
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante 2 horas una mezcla del compuesto 138 (190,0 mg, 0,324 mmol) y Pd al 10%/C (25,0 mg) en EtOAc/AcOH (4:1, 5 ml). Se filtró después la mezcla sobre un lecho de celita y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 3:2) para dar el compuesto 133 (139,1 mg, 92%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 134
Se añadió n-butil-litio (solución 2,5 M en hexano, 0,42 ml, 1,06 mmol) a una solución de diisopropilamina (0,15 ml, 1,07 mmol) en THF seco (10 ml) a -78ºC. Se agitó la mezcla a -78ºC durante 1 hora, después se añadió HMPA (0,22 ml, 1,27 mmol), seguido por la adición de una solución del compuesto 21 (226,8 mg, 0,96 mmol) en THF (5 ml). Después de 1 hora, se añadió a la reacción, en una porción, una solución de bromuro de 3-(ciclopentiloxi)-4-metoxibencilo (0,48 g,1,68 mmol) en THF (1 ml), y la mezcla resultante se agitó a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (10 ml), y la solución resultante se extrajo con EtOAc (3 x 20 ml). La capa orgánica reunida se lavó con NaCl saturado (2 x 30 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 2:1) para dar el compuesto 134 (0,224 g, 60%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 135
Se añadió n-butil-litio (solución 2,5 M en hexano, 4,47 ml, 11,18 mmol) a una solución de diisopropilamina (1,57 ml, 11,18 mmol) en THF seco (28 ml) a -78ºC. Se agitó la mezcla a -78ºC durante 1 hora, después se añadió HMPA (1,32 ml, 7,62 mmol), seguido por la adición de una solución del compuesto 21 (1,20 g, 5,08 mmol) en THF (27 ml). Después de 1 hora, se añadió a la reacción, en una porción, una solución de bromuro de 3-(benciloxi)-4-metoxibencilo (63) (3,12 g, 10,16 mmol) en THF (5 ml), y la mezcla resultante se agitó a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (100 ml), y la solución resultante se extrajo con EtOAc (3 x 200 ml). La capa orgánica reunida se lavó con NaCl saturado (2 x 200 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 2:1) para dar el compuesto 135 (1,16 g, 73%) como una espuma blanca.
Síntesis del compuesto 136
Se añadió n-butil-litio (solución 2,5 M en hexano, 0,38 ml, 0,931 mmol) a una solución de diisopropilamina (0,14 ml, 0,999 mmol) en THF seco (3 ml) a -78ºC. Se agitó la mezcla a -78ºC durante 1 hora, después se añadió HMPA (0,22 ml, 1,27 mmol), seguido por la adición de una solución del compuesto 21 (0,20 mg, 0,846 mmol) en THF (3 ml). Después de 1 hora, se añadió a la reacción, en una porción, una solución de bromuro de 4-(ciclopentiloxi)-3-metoxibencilo (199) (0,507 g, 1,78 mmol) en THF (1 ml), y la mezcla resultante se agitó a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (10 ml), y la solución resultante se extrajo con EtOAc (3 x 20 ml). La capa orgánica reunida se lavó con NaCl saturado (2 x 30 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 2:1) para dar el compuesto 136 (0,206 g, 55%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 137
Preparación de bromuro de 4-(propiloxi)-3-metoxibencilo: A una suspensión de vainillina (2,00 g, 13,2 mmol), carbonato de potasio (2,74 g, 19,8 mmol) y yoduro de potasio (60,0 mg, 0,361 mmol) en DMF (15 ml), se añadió lentamente 1-bromopropano (1,56 ml, 17,2 mmol) con una jeringa. Se agitó la mezcla de reacción a 65ºC durante 5 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, se diluyó la mezcla con éter dietílico (100 ml), y la fase orgánica se lavó con agua (2 x 50 ml). Después de secar sobre MgSO_{4} anhidro, la filtración y evaporación del filtrado en vacío dio el 4-(propiloxi)-3-metoxibenzaldehído crudo (2,55 g) que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Se disolvió el 4-(propiloxi)-3-metoxibenzaldehído crudo (2,55 g) en EtOH (30 ml) y se enfrió a 0ºC. Se añadió NaBH_{4} (0,499 g, 13,2 mmol) en porciones. Una vez que se hubo completado la adición, se separó el baño de hielo-agua y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadió agua (50 ml) y la mezcla resultante se extrajo con éter dietílico (3 x 100 ml). Las capas orgánicas reunidas se secaron sobre MgSO_{4} anhidro. La separación del disolvente dio un aceite amarillo pálido que se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 4:1) para dar el alcohol 4-(propiloxi)-3-metoxibencílico (2,38 g, 92% en dos etapas) como un aceite incoloro.
A una solución del alcohol 4-(propiloxi)-3-metoxibencílico (228 g, 11,62 mmol) en éter dietílico anhidro (30 ml), se añadió lentamente PBr_{3} (0,55 ml, 5,81 mmol) con una jeringa, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Se diluyó la mezcla con éter dietílico (150 ml) y se lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado (2 x 75 ml) y salmuera (2 x 75 ml). La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4} anhidro y el disolvente se separó a presión reducida para obtener el bromuro de 4-(propiloxi)-3-metoxibencilo (2,94 g, 98%) como un sólido blanco.
Se añadió n-butil-litio (solución 2,5 M en hexano, 0,56 ml, 1,40 mmol) a una solución de diisopropilamina (0,20 ml, 1,42 mmol) en THF seco (4 ml) a -78ºC. Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, después se añadió HMPA (0,33 ml, 1,91 mmol), seguido por la adición de una solución del compuesto 21 (0,30 g, 1,27 mmol) en THF (3 ml). Después de 1 hora, se añadió a la reacción, en una porción, una solución de bromuro de 4-(propiloxi)-3-metoxibencilo (0,658 g, 2,54 mmol) en THF (3 ml), y la mezcla resultante se agitó a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (15 ml), y la solución resultante se extrajo con EtOAc (3 x 25 ml). La capa orgánica reunida se lavó con NaCl saturado (2 x 30 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 2:1) para dar el compuesto 137 (0,302 g, 57%) como una espuma blanca.
Síntesis del compuesto 139
Se añadió n-butil-litio (solución 2,5 M en hexano, 0,38 ml, 0,931 mmol) a una solución de diisopropilamina (0,14 ml, 0,999 mmol) en THF seco (3 ml) a -78ºC. Se agitó la mezcla a -78ºC durante 1 hora, después se añadió HMPA (0,22 ml, 1,27 mmol), seguido por la adición de una solución del compuesto 21 (0,200 g, 0,846 mmol) en THF (3 ml). Después de 1 hora, se añadió a la reacción, en una porción, una solución de bromuro de bencilo (0,10 ml, 0,846 mmol), y la mezcla resultante se agitó a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (10 ml), y la solución resultante se extrajo con EtOAc (3 x 20 ml). La capa orgánica reunida se lavó con NaCl saturado (2 x 30 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 2:1) para dar el compuesto 139 (53 mg, 38%) como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 140
Preparación de bromuro de 3-(propiloxi)-4-metoxibencilo: A una suspensión de 3-hidroxi-4-metoxibenzaldehído (2,00 g, 132 mmol), carbonato de potasio (2,74 g, 19,8 mmol) y yoduro de potasio (60,0 mg, 0,361 mmol) en DMF (15 ml), se añadió lentamente 1-bromopropano (1,58 ml, 17,2 mmol) con una jeringa. Se agitó la mezcla de reacción a 65ºC durante 5 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, se diluyó la mezcla con éter dietílico (100 ml), y la fase orgánica se lavó con agua (2 x 50 ml). Después de secar sobre MgSO_{4} anhidro, la filtración y evaporación del filtrado en vacío dio 3-(propiloxi)-4-metoxibenzaldehído crudo (2,60 g) que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Se disolvió el 3-(propiloxi)-4-metoxibenzaldehído crudo (2,60 g) en EtOH (30 ml) y se enfrió a 0ºC. Se añadió NaBH_{4} (0,499 g, 13,2 mmol) en porciones. Una vez que se hubo completado la adición, se separó el baño de hielo-agua y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadió agua (50 ml) y la mezcla resultante se extrajo con éter dietílico (3 x 100 ml). Las capas orgánicas reunidas se secaron sobre MgSO_{4} anhidro. La separación del disolvente dio un aceite amarillo pálido que se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 4:1) para dar el alcohol 3-(propiloxi)-4-metoxibencílico (2,29 g, 89% en dos etapas) como un aceite incoloro.
A una solución del alcohol 3-(propiloxi)-4-metoxibencílico (2,28 g, 11,62 mmol) en éter dietílico anhidro (30 ml), se añadió lentamente PBr_{3} (0,55 ml, 5,81 mmol) con una jeringa, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Se diluyó la mezcla con éter dietílico (150 ml) y se lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado (2 x 75 ml) y salmuera (2 x 75 ml). La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4} anhidro y el disolvente se separó a presión reducida para obtener el bromuro de 3-(propiloxi)-4-metoxibencilo (2,92 g, 97%) como un sólido blanco.
Se añadió n-butil-litio (solución 2,5 M en hexano, 0,56 ml, 1,40 mmol) a una solución de diisopropilamina (0,20 ml, 1,42 mmol) en THF seco (4 ml) a -78ºC. Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, después se añadió HMPA (0,33 ml, 1,91 mmol), seguido por la adición de una solución del compuesto 21 (0,30 g, 1,27 mmol) en THF (3 ml). Después de 1 hora, se añadió a la reacción, en una porción, una solución de bromuro de 3-(propiloxi)-4-metoxibencilo (0,658 g, 2,54 mmol) en THF (3 ml), y la mezcla resultante se agitó a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (15 ml), y la solución resultante se extrajo con EtOAc (3 x 25 ml). La capa orgánica reunida se lavó con NaCl saturado (2 x 30 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 2:1) para dar el compuesto 140 (0,310 g, 59%) como una espuma blanca.
Síntesis del compuesto 141
Se añadió n-butil-litio (solución 2,5 M en hexano, 0,56 ml, 1,40 mmol) a una solución de diisopropilamina (0,20 ml, 1,42 mmol) en THF seco (4 ml) a -78ºC. Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, después se añadió HMPA (0,33 ml, 1,91 mmol), seguido por la adición de una solución del compuesto 21 (0,30 g, 1,27 mmol) en THF (3 ml). Después de 1 hora, se añadió a la reacción, en una porción, una solución de bromuro de 4-fluorobencilo (0,32 ml, 2,54 mmol), y la mezcla resultante se agitó a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (15 ml), y la solución resultante se extrajo con EtOAc (3 x 25 ml). La capa orgánica reunida se lavó con NaCl saturado (2 x 30 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 2:1) para dar el compuesto 141 (0,267 g, 61%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 143
A una suspensión del compuesto 97 (0,120 g, 0,41 mmol) y carbonato de potasio (0,085 g, 0,615 mmol) en DMF anhidra (2 ml), se añadió 1-yodoetano (0,049 ml, 0,615 mmol) con una jeringa. Se agitó la mezcla de reacción a 65ºC durante la noche. Después de enfriar, se diluyó la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con éter dietílico (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna con gel de sílice (hexano/EtOAc, 7:3) para obtener el compuesto 143 (0,096 g, 72%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 144
A una suspensión del compuesto 97 (0,21 g, 0,71 mmol), carbonato de potasio (0,147 g, 1,06 mmol) y KI (0,02 g) en DMF anhidra (2 ml), se añadió 1-bromopropano (0,077 ml, 0,85 mmol) con una jeringa. Después, se agitó la mezcla de reacción a 65ºC durante la noche. Después de enfriar, se diluyó la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con éter dietílico (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna con gel de sílice (hexano/EtOAc, 7:3) para obtener el compuesto 144 (0,185 g, 77%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 145
A una suspensión del compuesto 97 (0,15 g. 0,51 mmol) y carbonato de potasio (0,105 g, 0,76 mmol) en DMF anhidra (2 ml), se añadió 2-yodopropano (0,18 ml, 1,02 mmol) con una jeringa. Después, se agitó la mezcla de reacción a 65ºC durante la noche. Después de enfriar, se diluyó la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con éter dietílico (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna con gel de sílice (hexano/EtOAc, 7:3) para obtener el compuesto 145 (0,18 g, 86%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 146
A una suspensión del compuesto 97 (0,15 g. 0,51 mmol) y carbonato de potasio (0,105 g, 0,76 mmol) en DMF anhidra (2 ml), se añadió 3-bromo-2-metilpropeno (0,077 ml, 0,76 mmol) con una jeringa. Después, se agitó la mezcla de reacción a 65ºC durante la noche. Después de enfriar, se diluyó la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con éter dietílico (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna con gel de sílice (hexano/EtOAc, 7:3) para obtener el compuesto 146 (0,118 g, 66%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 147
A una suspensión del compuesto 97 (0,15 g, 0,51 mmol), carbonato de potasio (0,105 g, 0,76 mmol) y KI (5,0 mg) en DMF anhidra (2 ml), se añadió (bromometil)ciclobutano (0,085 ml, 0,76 mmol) con una jeringa. Después, se agitó la mezcla de reacción a 65ºC durante la noche. Después de enfriar, se diluyó la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con éter dietílico (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna con gel de sílice (hexano/EtOAc, 7:3) para obtener el compuesto 147 (0,132 g, 71%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 148
A una suspensión del compuesto 97 (0,15 g, 0,51 mmol), carbonato de potasio (0,105 g, 0,76 mmol) y KI (10 mg, cat.) en DMF anhidra (2 ml), se añadió (bromometil)ciclohexano (0,077 ml, 0,76 mmol) con una jeringa. Después, se agitó la mezcla de reacción a 65ºC durante la noche. Después de enfriar, se diluyó la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con éter dietílico (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna con gel de sílice (hexano/EtOAc, 7:3) para obtener el compuesto 148 (0,124 g, 62%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 149
A una suspensión del compuesto 97 (0,15 g. 0,51 mmol) y carbonato de potasio (0,105 g, 0,76 mmol) en DMF anhidra (2 ml), se añadió 1-yodopentano (0,099 ml, 0,76 mmol) con una jeringa. Después, se agitó la mezcla de reacción a 65ºC durante la noche. Después de enfriar, se diluyó la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con éter dietílico (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna con gel de sílice (hexano/EtOAc, 7:3) para obtener el compuesto 149 (0,143 g, 11%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 150
A una suspensión del compuesto 97 (0,15 g. 0,51 mmol) y carbonato de potasio (0,105 g, 0,76 mmol) en DMF anhidra (2 ml), se añadió 1-yodohexano (0,11 ml, 0,76 mmol) con una jeringa. Después, se agitó la mezcla de reacción a 65ºC durante la noche. Después de enfriar, se diluyó la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con éter dietílico (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna con gel de sílice (hexano/EtOAc, 7:3) para obtener el compuesto 150 (0,148 g, 77%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 151
A una suspensión del compuesto 97 (0,15 g. 0,51 mmol) y carbonato de potasio (0,105 g, 0,76 mmol) en DMF anhidra (2 ml), se añadió 1-yodoheptano (0,13 ml, 0,76 mmol) con una jeringa. Después, se agitó la mezcla de reacción a 65ºC durante la noche. Después de enfriar, se diluyó la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con éter dietílico (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna con gel de sílice (hexano/EtOAc, 7:3) para obtener el compuesto 151 (0,160 g, 80%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 152
A una suspensión del compuesto 97 (0,15 g. 0,51 mmol) y carbonato de potasio (0,105 g, 0,76 mmol) en DMF anhidra (2 ml), se añadió 1-yodooctano (0,18 ml, 1,02 mmol) con una jeringa. Después, se agitó la mezcla de reacción a 65ºC durante la noche. Después de enfriar, se diluyó la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con éter dietílico (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se concentraron a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna con gel de sílice (hexano/EtOAc, 7:3) para obtener el compuesto 152 (0,18 g, 86%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 153
Una mezcla del compuesto 143 (0,096 g, 0,38 mmol) y ácido p-toluenosulfónico monohidratado (10 mg, cat.) en tolueno (5 ml), se calentó a 75ºC durante 30 minutos. Se separó el tolueno en vacío, y el residuo se purificó por cromatografía en columna con gel de sílice (hexano/EtOAc, 65:35) para dar el compuesto 153 (0,060 g, 63%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 154
Una mezcla del compuesto 144 (0,179 g, 0,53 mmol) y ácido p-toluenosulfónico monohidratado (20 mg, cat.) en tolueno (5 ml), se calentó a 75ºC durante 30 minutos. Se separó el tolueno en vacío, y el residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 65:35) para dar el compuesto 154 (0,086 g, 61%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 155
Una mezcla del compuesto 145 (0,094 g, 0,278 mmol) y ácido p-toluenosulfónico monohidratado (9 mg, cat.) en tolueno (5 ml), se calentó a 75ºC durante 30 minutos. Se separó el tolueno en vacío, y el residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 65:35) para dar el compuesto 155 (0,069 g, 94%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 156
Una mezcla del compuesto 146 (118 mg, 0,337 mmol) y ácido p-toluenosulfónico monohidratado (10 mg, cat.) en tolueno (5 ml), se calentó a 75ºC durante 30 minutos. Se separó el tolueno en vacío, y el residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 65:35) para dar el compuesto 156 (0,092 g, 100%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 157
Una mezcla del compuesto 147 (0,132 g, 0,362 mmol) y ácido p-toluenosulfónico monohidratado (15 mg, cat.) en tolueno (5 ml), se calentó a 75ºC durante 30 minutos. Se separó el tolueno en vacío, y el residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 65:35) para dar el compuesto 157 (0,101 g, 96%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 158
Una mezcla del compuesto 148 (0,124 g, 0,389 mmol) y ácido p-toluenosulfónico monohidratado (15 mg, cat.) en tolueno (5 ml), se calentó a 75ºC durante 30 minutos. Se separó el tolueno en vacío, y el residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 65:35) para dar el compuesto 158 (0,09 g, 73%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 159
Una mezcla del compuesto 149 (0,143 g, 0,39 mmol) y ácido p-toluenosulfónico monohidratado (20 mg, cat.) en tolueno (5 ml), se calentó a 75ºC durante 30 minutos. Se separó el tolueno en vacío, y el residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 65:35) para dar el compuesto 159 (0,112 g. 98%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 160
Una mezcla del compuesto 150 (0,148 g, 0,389 mmol) y ácido p-toluenosulfónico monohidratado (20 mg, cat.) en tolueno (5 ml), se calentó a 75ºC durante 30 minutos. Se separó el tolueno en vacío, y el residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 65:35) para dar el compuesto 160 (0,112 g. 94%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 161
Una mezcla del compuesto 151 (0,148 g, 0,389 mmol) y ácido p-toluenosulfónico monohidratado (30 mg, cat.) en tolueno (5 ml), se calentó a 75ºC durante 30 minutos. Se separó el tolueno en vacío, y el residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 65:35) para dar el compuesto 161 (0,12 g, 100%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 162
Una mezcla del compuesto 152 (0,180 g. 0,44 mmol) y ácido p-toluenosulfónico monohidratado (30 mg, cat.) en tolueno (5 ml), se calentó a 75ºC durante 30 minutos. Se separó el tolueno en vacío, y el residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 65:35) para dar el compuesto 162 (0,13 g, 88%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 163
A una solución del compuesto 99 (0,11 g, 0,40 mmol) en THF seco (2 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (0,67 ml, 0,48 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,1 ml, 0,60 mmol) a la mezcla con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió bromuro de 4-(benciloxi)-3-metoxibencilo (0,184 g, 0,60 mmol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 95:5) para obtener el compuesto 163 (0,136 g, 67%) como un jarabe
incoloro.
Síntesis del compuesto 164
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante la noche una mezcla del compuesto 163 (0,136 g, 0,27 mmol) y Pd al 10%/C (15 mg) en EtOAc (3 ml). Se separó el catalizador por filtración y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 19:1) para obtener el compuesto 164 (0,082 g, 73%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 165
A una solución del compuesto 99 (0,30 g, 1,08 mmol) en THF seco (4 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (1,8 ml, 1,3 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,28 ml, 1,62 mmol) con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió el compuesto 76 (0,52 g, 1,62 mmol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 95:5) para obtener el compuesto 165 (0,443 g, 79%) como un sólido amarillo brillante.
Síntesis del compuesto 166
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante la noche una mezcla del compuesto 165 (0,136 g, 0,27 mmol) y Pd al 10%/C (15 mg) en EtOAc (3 ml). Se separó el catalizador por filtración y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 3:2) para obtener el compuesto 166 (0,215 g, 70%) como una espuma de color amarillo pálido.
Síntesis del compuesto 167
Preparación de bromuro de (3,4-dibenciloxi)bencilo: A una solución de alcohol (3,4-dibenciloxi)bencílico (1,35 g, 4,21 mmol) en éter dietílico anhidro (25 ml), se añadió PBr_{3} (0,20 ml, 2,11 mmol) en una porción, y se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 3 horas. Se diluyó la mezcla con éter dietílico (50 ml) y se lavó con H_{2}O (2 x 30 ml), NaHCO_{3} saturado (2 x 30 ml), y salmuera (2 x 30 ml). Se secó la capa etérea sobre MgSO_{4} anhidro, y se separó el disolvente a presión reducida para obtener bromuro de (3,4-dibenciloxi)bencilo (1,47 g, 91%) como un sólido blanco.
A una solución del compuesto 41 (0,10 g, 0,344 mmol) en THF seco (2 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (0,53 ml, 0,379 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,09 ml, 0,517 mmol) con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió bromuro de (3,4-dibenciloxi)bencilo (0,198 g, 0,517 mmol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante dos horas y después se dejó calentar hasta temperatura ambiente a lo largo de un periodo de dos horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 95:5) para obtener el compuesto 167 (0,061 g, 30%) como jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 168
A una solución del compuesto 41 (0,10 g, 0,344 mmol) en THF seco (2 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (0,53 ml, 0,379 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,09 ml, 0,517 mmol) con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió bromuro de bencilo (0,062 ml, 0,517 mmol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante dos horas y después se dejó calentar hasta temperatura ambiente a lo largo de un periodo de dos horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 95:5) para obtener el compuesto 168 (0,051 g, 39%) como jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 169
A una solución del compuesto 41 (0,10 g, 0,344 mmol) en THF seco (2 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (0,53 ml, 0,379 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,09 ml, 0,517 mmol) con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió bromuro de (3-trifluorometil)bencilo comercialmente disponible (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, 0,079 ml, 0,517 mmol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 95:5) para obtener el compuesto 169 (0,126 g, 82%) como jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 170
A una solución del compuesto 41 (0,283 g, 0,975 mmol) en THF seco (2 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (1,64 ml, 1,17 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,254 ml, 1,46 mmol) con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió el compuesto 63 (0,45 g, 1,46 mmol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 4:1) para obtener el compuesto 170 (0,211 g) que contiene una pequeña cantidad de producto disustituido, como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 171
Preparación de bromuro de piperonilo: A una solución de alcohol piperonílico (5,0 g, 32,86 mmol) en éter dietílico anhidro (80 ml), se añadió PBr_{3} (1,56 ml, 16,43 mmol) en una porción, y se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 3 horas. Se diluyó la mezcla con éter dietílico (100 ml) y se lavó con H_{2}O (2 x 50 ml), NaHCO_{3} saturado (2 x 50 ml), y salmuera (2 x 50 ml). Se secó la capa etérea sobre MgSO_{4} anhidro, y se separó el disolvente a presión reducida para obtener bromuro de piperonilo (6,43 g, 91%) como un sólido gris amarillento.
A una solución del compuesto 41 (0,154 g, 0,53 mmol) en THF seco (2 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (0,89 ml, 0,636 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,14 ml, 0,795 mmol) con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió bromuro de piperonilo (0,22 g, 1,02 mmol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante otras 5 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 4:1) para obtener el compuesto 171 (0,101 g, 45%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 172
Preparación de bromuro de (3-benciloxi)bencilo: A una solución de alcohol (3-benciloxi)bencílico (3,0 g, 14,0 mmol) en éter dietílico anhidro (50 ml), se añadió PBr_{3} (0,66 ml, 7,0 mmol) en una porción, y se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 3 horas. Se diluyó la mezcla con éter dietílico (60 ml) y se lavó con H_{2}O (2 x 40 ml), NaHCO_{3} saturado (2 x 40 ml), y salmuera (2 x 40 ml). Se secó la capa etérea sobre MgSO_{4} anhidro, y se separó el disolvente a presión reducida para obtener bromuro de (3-benciloxi)bencilo (3,76 g, 97%) como un sólido amarillo pálido.
A una solución del compuesto 41 (0,10 g, 0,344 mmol) en THF seco (2 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (0,53 ml, 0,379 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,09 ml, 0,517 mmol) con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió bromuro de (3-benciloxi)bencilo (0,143 g, 0,517 mmol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante dos horas y después se dejó calentar hasta temperatura ambiente a lo largo de un periodo de dos horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 95:5) para obtener el compuesto 172 (0,054 g, 32%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 173
Preparación de bromuro de (4-benciloxi)bencilo: A una solución de alcohol (4-benciloxi)bencílico (1,00 g, 4,67 mmol) en éter dietílico anhidro (20 ml), se añadió PBr_{3} (0,22 ml, 2,34 mmol) en una porción, y se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 3 horas. Se diluyó la mezcla con éter dietílico (30 ml) y se lavó con H_{2}O (2 x 20 ml), NaHCO_{3} saturado (2 x 20 ml), y salmuera (2 x 20 ml). Se secó la capa etérea sobre MgSO_{4} anhidro, y se separó el disolvente a presión reducida para obtener bromuro de (4-benciloxi)bencilo (1,10 g, 85%) como un sólido blanco.
A una solución del compuesto 41 (0,276 g, 0,95 mmol) en THF seco (2 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (1,6 ml, 1,14 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,25 ml, 1,425 mmol) con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió bromuro de (4-benciloxi)bencilo (0,306 g, 1,10 mmol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 4:1) para obtener el compuesto 173 (0,121 g, 26%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 174
A una solución del compuesto 41 (0,10 g, 0,344 mmol) en THF seco (2 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (0,58 ml, 0,412 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,1 ml, 0,516 mmol) con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió bromuro de 2-nitrobencilo (0,112 g, 0,516 mmol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 95:5) para obtener el compuesto 174 (0,126 g, 86%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 175
A una solución del compuesto 41 (0,10 g, 0,344 mmol) en THF seco (2 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (0,58 ml, 0,412 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,1 ml, 0,516 mmol) con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió bromuro de 3-nitrobencilo (0,112 g, 0,516 mmol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 95:5) para obtener el compuesto 175 (0,118 g, 81%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 176
A una solución del compuesto 41 (0,10 g, 0,344 mmol) en THF seco (2 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (0,58 ml, 0,412 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,1 ml, 0,516 mmol) con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió cloruro de 4-metil-3-nitrobencilo (96 g, 0,516 mmol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 95:5) para obtener el compuesto 176 (0,049 g, 32%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 177
A una solución del compuesto 41 (0,10 g, 0,344 mmol) en THF seco (2 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (0,58 ml, 0,412 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,1 ml, 0,516 mmol) con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió bromuro de 4-nitrobencilo (0,112 g, 0,516 mmol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 95:5) para obtener el compuesto 177 (0,0107 g, 73%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 178
A una solución del compuesto 41 (0,15 g, 0,516 mmol) en THF seco (3 ml) bajo argón, se añadió lentamente LDA (0,72 ml, 0,62 mmol, recientemente preparado a partir de n-BuLi y diisopropilamina en THF a -78ºC). Se agitó la mezcla a -78ºC durante una hora, y después se añadió HMPA (0,15 ml, 0,77 mmol) con una jeringa. Después de 15 minutos, se añadió bromuro de 2-metoxi-5-nitrobencilo (0,19 g, 0,77 mol). Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante otras 4 horas. El exceso de la base se sofocó con NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml), y se extrajo la solución resultante con EtOAc (3 x 15 ml). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con salmuera (15 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se filtraron, y el filtrado se evaporó a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (benceno/EtOAc, 95:5) para obtener el compuesto 178 (0,191 g, 81%) como una espuma blanca.
Síntesis del compuesto 179
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante la noche una mezcla del compuesto 167 (0,055 g, 0,084 mmol) y Pd al 10%/C (55 mg) en HOAc/EtOAc (1:1, 4 ml). Se separó el catalizador por filtración y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 3:2) para obtener el compuesto 179 (0,033 g, 95%) como un jarabe amarillo pálido..
Síntesis de los compuestos 180 y 181
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante la noche una mezcla del compuesto 170 (0,16 g, \sim0,31 mmol) que contiene una pequeña cantidad de producto disustituido procedente de la reacción anterior, y Pd al 10%/C (20 mg) en HOAc/EtOAc (1:1, 6 ml). Se separó el catalizador por filtración y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 2:3) para obtener los compuestos 180 (0,084 g) y 181 (0,020 g) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 182
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante la noche una mezcla del compuesto 172 (0,04 g, 0,082 mmol) y Pd al 10%/C (5 mg) en HOAc/EtOAc (1:1, 4 ml). Se separó el catalizador por filtración y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 7:3) para obtener el compuesto 182 (0,021 g, 65%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 183
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante la noche una mezcla del compuesto 173 (0,095 g, 0,195 mmol) y Pd al 10%/C (15 mg) en HOAc/EtOAc (1:1, 4 ml). Se separó el catalizador por filtración y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 3:2) para obtener el compuesto 183 (0,069 g, 89%) como un jarabe incoloro.
Síntesis del compuesto 184
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante la noche una mezcla del compuesto 175 (0,098 g, 0,23 mmol) y Pd al 10%/C (15 mg) en EtOAc (3 ml). Se separó el catalizador por filtración y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 3:7) para obtener el compuesto 184 (0,074 g, 81%) como un sólido blanco.
Síntesis del compuesto 185
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante la noche una mezcla del compuesto 177 (0,087 g. 0,205 mmol) y Pd al 10%/C (10 mg) en EtOAc (3 ml). Se separó el catalizador por filtración y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 3:7) para obtener el compuesto 185 (0,073 g, 84%) como un jarabe amarillo pálido.
Síntesis del compuesto 186
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante la noche una mezcla del compuesto 178 (0,161 g, 0,353 mmol) y Pd al 10%/C (20 mg) en EtOAc (4 ml). Se separó el catalizador por filtración y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 3:7) para obtener el compuesto 186 (0,084 g, 56%) como una espuma blanca.
Síntesis del compuesto 187
Se agitó bajo H_{2} (un balón) durante la noche una mezcla del compuesto 176 (0,043 g, 0,098 mmol) y Pd al 10%/C (10 mg) en EtOAc (2 ml). Se separó el catalizador por filtración y se evaporó el filtrado a sequedad. Se purificó el residuo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 3:7) para obtener el compuesto 187 (0,017 g, 42%) como un jarabe de color rojo claro.
Se proporcionan las siguientes tablas para definir las estructuras de los compuestos listados en los ejemplos de utilidad. Todos los compuestos de estas tablas fueron preparados utilizando la metodología descrita aquí o la metodología descrita para compuestos similares como los proporcionados aquí.
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Ejemplos de utilidad
Los ensayos biológicos in vitro e in vivo demostraron que los componentes lactónicos y lactámicos de la presente invención presentan un conjunto de potentes actividades biológicas frente a objetivos relevantes para la artritis reumatoide, otras enfermedades inflamatorias y enfermedades no inflamatorias relacionadas como se describe más adelante.
Como se usa aquí, "tratamiento de la inflamación" se refiere tanto a la terapia para la inflamación como a la prevención del desarrollo de la respuesta inflamatoria. Para tratar la inflamación en un animal de sangre caliente tal como un ser humano se usa una cantidad eficaz de un compuesto o composición de la presente invención. Los métodos de administración de cantidades eficaces de agentes antiinflamatorios son bien conocidos en la técnica e incluyen la administración de formas de inhalación, formas orales o parenterales. Tales formas farmacéuticas incluyen, pero sin limitarse a ellas, soluciones parenterales, comprimidos, cápsulas, implantes de liberación sostenida y sistemas de administración transdérmica; o sistemas de dosificación para inhalación que emplean inhaladores de polvo seco o dispositivos de inhalación multidosis presurizados. Generalmente, se prefiere la administración oral o tópica para el tratamiento de la inflamación. Se seleccionan la cantidad y frecuencia de la dosis para crear un nivel eficaz del agente sin efectos perjudiciales. Generalmente variará desde una dosis de aproximadamente 0,01 a 10 mg/kg/día cuando se administra oral o intravenosamente. También el intervalo de dosis puede ser típicamente desde aproximadamente 0,01 hasta 1 mg/kg/día cuando se administra intranasalmente o por inhalación.
La administración de compuestos o composiciones de la presente invención se puede realizar en combinación con la administración de otros agentes. Por ejemplo, puede ser deseable co-administrar un glucocorticoide para su efecto sobre la artritis.
Generación de especies reactivas al oxígeno por los neutrófilos activados
Los neutrófilos comprenden más del 90% del infiltrado leucocítico en el fluido sinovial de los pacientes de artritis reumatoide (RA) y se cree que contribuyen tanto a las fases agudas como a las fases crónicas de esta y muchas otras enfermedades inflamatorias a través de la liberación de mediadores pro-inflamatorios, enzimas degradadoras de la matriz y radicales de oxígeno tóxicos que dan como resultado la lesión de los tejidos. Un mecanismo patógeno propuesto es que las células son incapaces de fagocitar grandes sustancias pro-inflamatorias tales como los complejos inmunitarios insolubles o el endotelio dañado presentes en la articulación. Consecuentemente, los gránulos neutrófilos se fusionan con la membrana plasmática en el sitio de la activación, en lugar de hacerlo internamente con las vacuolas fagocíticas, permitiendo la liberación extracelular de especies reactivas al oxígeno (ROS) pro-inflamatorias y otras sustancias tóxicas.
La activación de los neutrófilos se puede medir por la cuantificación de las ROS generadas in vitro. La medida de ROS permite la cuantificación específica de una especie pro-inflamatoria y es también una medida general de la activación de los neutrófilos. El método más sensible para medir la producción de ROS por los neutrófilos es la quimioluminiscencia potenciada por luminol. Los compuestos y composiciones de la presente invención inhiben la generación de ROS. El sistema de ensayo usado para evaluar la capacidad de los compuestos para inhibir la generación de ROS en los neutrófilos es indicativo de la actividad anti-inflamatoria que puede ser eficaz en las enfermedades que incluyen, pero sin limitarse a ellas, la artritis reumatoide y la enfermedad inflamatoria del intestino.
Se incubaron neutrófilos humanos primarios recientemente aislados (5 x 10^{6} células/ml) con las concentraciones requeridas del compuesto o vehículo durante 30 minutos a 37ºC en tampón HBSS (pH 7,4) que contiene Ca^{2+}. Se usó wortmanina 100 nM como control positivo. Se transfirieron alícuotas de cada muestra a una placa de microtitulación a la que se añade luminol (1 \muM) obtenido de Sigma, No. de catálogo A8511. Se inició inmediatamente la activación de los neutrófilos por la adición de fMLP (1 \muM) obtenida de Sigma, No. de catálogo F3506. La emisión de luz en cada pocillo se registró durante 30 minutos en un luminómetro de microplacas. La emisión total de luz (integral a lo largo del tiempo) se determinó para cada pocillo. Las actividades inhibidoras de los fármacos de ensayo frente a la generación de ROS por los neutrófilos se expresan como porcentaje de actividad en relación a un testigo sin fármaco (100% de activación o generación de ROS) que contiene DMSO al 0,25%. La concentración del compuesto de ensayo requerida para inhibir la generación de ROS al 50% de los valores de control (IC_{50}) se determinó a partir de las curvas concentración-respuesta mediante análisis de regresión no lineal. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
TABLA 1
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Como se ve en la Tabla 1, numerosos compuestos de la presente invención demuestran unas IC_{50} en el intervalo de 0,1-1 \muM. Este resultado muestra que estos compuestos bloquean de forma potente la generación de especies reactivas al oxígeno pro-inflamatorias, por los neutrófilos in vitro. Este resultado puede surgir de la inhibición de la fosfodiasterasa y/o de la captación química. Esta propiedad es predictiva de la actividad anti-inflamatoria in vivo debido al papel establecido de las lesiones de los tejidos mediadas por ROS, por ejemplo, en la artritis reumatoide, trastornos inflamatorios del intestino, y psoriasis.
Desgranulación de los neutrófilos (liberación de mieloperoxidasa)
Los granulocitos neutrófilos contienen varios tipos de organelas conocidas como gránulos. Estos cuerpos subcelulares contienen un conjunto variado de agentes bactericidas que incluyen proteasas y otras enzimas hidrolíticas que son esenciales para la respuesta inflamatoria normal pero que contribuyen a la lesión aguda de los tejidos cuando los neutrófilos son activados crónicamente y/o inapropiadamente en la enfermedad. Una de las enzimas características de los gránulos es la mieloperoxidasa (MPO) que cataliza la conversión del peróxido de hidrógeno en hipohaluro. La MPO se libera en el medio extracelular con la estimulación de la desgranulación y es un índice fiable de la activación de los neutrófilos. Los compuestos de la presente invención inhiben la liberación de la mieloperoxidasa por los neutrófilos a partir de neutrófilos humanos primarios estimulados con fMLP 100 \muM. El sistema de ensayo usado para evaluar la capacidad de un compuesto para inhibir la liberación de la MPO desde los neutrófilos es indicativo de la actividad anti-reumatoide así como de otras enfermedades en las que está implicada la activación inapropiada de los neutrófilos.
Se recogieron dos tubos de sangre humana (12 ml) en tubos con anticoagulante ACD (Fisher, No. de catálogo 02-684-29). Se mezcló la sangre con 4 ml de dextrano al 6% en solución salina. Se recogió la mezcla de sangre en una jeringa de 60 cc. Se mantuvo en sentido vertical sobre la mesa del laboratorio durante 30 minutos. La capa superior de suero se extendió sobre 4 ml de Histopaque (Sigma, No. de catálogo 1077-1) en un tubo de centrífuga de 15 ml. Se centrifugó el tubo durante 30 minutos a 2000 rpm. Se despreció el sobrenadante. Se mezcló el sedimento con 3 ml de H_{2}O destilada fría, seguido por 1 ml de NaCl 6 N después de 30 segundos. Se centrifugó el tubo durante 5 minutos a 1100 rpm. Se juntaron los sedimentos de cada tubo y se lavaron dos veces con 10 ml de HBSS (solución salina equilibrada de Hank (Stem Cell Ltd., No. de catálogo LMC 75)). Se contaron las células y se diluyeron a 2 x 10^{6} células/ml.
Se pipetearon las células (0,3 ml) a tubos de microcentrífuga previamente etiquetados. Se incubaron las células con 5 \mug/ml de citocalasina B, PGE_{2} 10 nM y la concentración deseada del compuesto de ensayo o vehículo (DMSO al 5%) durante 5 minutos a 37ºC. Como control positivo se usaron wortmanina o rolipram. Se añadió fMLP 100 nM a cada tubo excepto al control. Después de 30 minutos de incubación, se pusieron las células sobre hielo y se centrifugaron a 13.000 rpm durante 3 minutos. Se pipetearon 50 \mul del sobrenadante a pocillos apropiados de una placa de 96 pocillos (por triplicado). Se añadieron 100 \mul del sustrato a cada pocillo (o-dianisidina 0,53 mM, Sigma, No. de catálogo D 3252, H_{2}O_{2} 0,147 mM en tampón de fosfato de pH 6,0). Se incubó la placa durante 30 minutos a 37ºC. Se terminó la reacción por la adición de 50 \mul de H_{2}SO_{4} 4 N a cada pocillo. Para preparar una curva estándar, se pipetearon a los pocillos (por triplicado) 200 \mul de 1, 0,1, 0,01, y 0,001 mg/ml de peroxidasa de rábano. Se leyó la placa mediante un lector ELISA a 405 nm. La inhibición máxima de mieloperoxidasa observada rutinariamente para los compuestos estándar con mecanismos de acción similares a los compuestos de la invención (inhibidor de la PDE de cAMP) fue aproximadamente 30-35%. Por tanto las potencias inhibidoras procedentes de los estudios de concentración-respuesta se dan como valores IC_{15} determinados en al menos tres experimentos separados usando determinaciones por triplicado.
Como se muestra en la tabla 2, los compuestos de la invención inhibieron de forma potente la liberación de MPO a partir de los neutrófilos humanos estimulados con valores IC_{15} que varían de 0,1 a 1 \muM. Estos compuestos presentaron una inhibición máxima de la liberación de MPO desde los neutrófilos de aproximadamente 40%, consistente con los efectos de los inhibidores de la PDE4 conocidos tales como rolipram (no se muestran datos). Este resultado muestra que estos compuestos son capaces de inhibir de forma dependiente de la concentración la respuesta de desgranulación de los neutrófilos humanos estimulados con fMLP. Puesto que la desgranulación de los neutrófilos es considerada un efecto mayor de la lesión de los tejidos mediada por este tipo de células en muchas enfermedades inflamatorias (por ejemplo, psoriasis, artritis reumatoide), la inhibición de esta respuesta por estos compuestos indica la utilidad clínica de los compuestos para estas y otras enfermedades relacionadas.
TABLA 2
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Quimiotaxis de los neutrófilos
El proceso de quimiotaxis (migración directa de los leucocitos hasta un gradiente de quimioquina) es esencial para la acumulación de grandes cantidades de neutrófilos asociada con las manifestaciones patológicas de la inflamación (por ejemplo, deterioro de la articulación reumática). La quimiotaxis es un mecanismo primario en el que los neutrófilos migran desde el lumen de los vasos sanguíneos hasta el sitio de la inflamación y por tanto es un proceso común asociado con la lesión de los tejidos, mediada por los neutrófilos, en muchas enfermedades inflamatorias. Dentro de la presente invención, se ha descubierto que los compuestos de ensayo inhiben de forma dependiente de la concentración la quimiotaxis de los neutrófilos primarios humanos en respuesta a fMLP. Estos compuestos inhiben también la quimiotaxis mediada por la interleuquina 8 (IL-8) (no se muestran datos). La inhibición específica de la migración de los neutrófilos a la articulación inflamada es un objetivo terapéutico válido en la artritis reumatoide y en muchas enfermedades inflamatorias. Este sistema de ensayo in vitro usado para evaluar la capacidad de los compuestos para inhibir la quimiotaxis es indicativo de la actividad anti-reumática in vivo y de la actividad frente a las enfermedades inflamatorias en las que están implicados los neutrófilos en las lesiones de tejidos asociadas.
Se añadió el tampón de quimiotaxis que contiene el quimioatrayente fMLP (10 \muM) a cada pocillo de una placa de quimiotaxis y se insertó un filtro asegurando el contacto entre el filtro y el tampón de quimiotaxis en el pocillo. Se usó una concentración submáxima de quimioatrayente que había sido determinada en experimentos previos. Para la determinación de la migración espontánea de las células, ciertas células no recibieron quimioatrayente sino que en su lugar recibieron solamente tampón. Se incubaron los neutrófilos recientemente aislados (1 x 10^{6}) con vehículo (DMSO al 0,125%) \pm el compuesto de ensayo durante 1 hora a 37ºC. Las suspensiones de células de tratamiento y control se resuspendieron entonces suavemente y se añadieron 20 \mul de célula al lado superior del filtro en cada pocillo. Se incubó la placa durante 1,5 horas a 37ºC bajo CO_{2} al 5%. Se separaron entonces las células del lado superior del filtro por aspiración y se centrifugó la placa completa. Se separó el filtro y se añadieron concentraciones conocidas de células a los pocillos sin usar para preparar una curva estándar. Se añadió a cada pocillo solución XTT (Sigma, No. de catálogo X 4251) / PMS (Sigma, No. de catálogo P 7626) preparada en tampón y después se incubaron adicionalmente las células 1-2 horas y se midió la absorbancia a 450 nm. Los valores de absorbancia se convirtieron en cantidad de células usando la curva estándar. Los valores de IC_{50} son las medias de al menos tres experimentos separados con determinaciones por triplicado.
La Tabla 3 muestra la potencia inhibidora de los compuestos de la presente invención frente a la quimiotaxis inducida por fMLP 10 nM. Varios de los compuestos presentan IC_{50} menores que 10 \muM en este sistema de ensayo. El inhibidor de la fosfodiesterasa IV, rolipram, usado como un control positivo, inhibió la quimiotaxis de los neutrófilos en un 85% a 12,5 M en estas condiciones de ensayo (no se muestran datos). En los experimentos de control se encontró que los compuestos no afectaron significativamente a la motilidad general de los neutrófilos (en ausencia de quimioatrayente). Por tanto, los compuestos son eficaces para inhibir la migración dirigida de los neutrófilos humanos en respuesta al péptido producido bacterialmente, fMLP.
TABLA 3
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Inhibición de la producción de TNF-\alpha en los linfocitos T CD4+ humanos primarios estimulados con concanavalina-A
Se sabe que los linfocitos T activados producen TNF-\alpha y pueden constituir una fuente significativa de este importante mediador inflamatorio en las regiones localizadas de inflamación tales como el sinovio reumático o las lesiones psoriásicas. Los sobrenadantes procedentes de las células T CD4+ humanas primarias estimuladas con concanavalina-A (conA) que han sido incubadas en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo, se analizaron en cuanto a TNF-\alpha usando un sistema ELISA. (Pharingen; el set recomendado de anticuerpos anti-TNF 18631-D y 18642-D). En las células T estimuladas con conA tratadas con el vehículo, fueron inducidas cantidades sustanciales de TNF-\alpha. Como se muestra en la Tabla 4, los compuestos de la presente invención fueron capaces de inhibir de forma potente la producción de TNF-\alpha derivado de las células T. Este resultado contrasta con la menor potencia de estos compuestos en la inhibición de la liberación de TNF-\alpha inducida por LPS en la sangre humana entera. Esto puede ser debido a la diferente sensibilidad de los monocitos/macrófagos en comparación a los linfocitos T frente a las elevaciones de cAMP intracelular con respecto a las rutas reguladoras que impactan a la producción de TNF-\alpha. Este resultado da a entender que los compuestos de la invención se pueden usar en el tratamiento de enfermedades que implican la producción de TNF-\alpha.
TABLA 4
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Inhibición de la función de los linfocitos T ayudadores humanos Introducción y fundamento
Muchas enfermedades inflamatorias con una etiología autoinmune incluyendo la artritis reumatoide y la psoriasis se caracterizan por un desequilibrio en la función de las células T ayudadoras de los subconjuntos de linfocitos T autorreactivos dando como resultado la iniciación y mantenimiento de un estado pro-inflamatorio. Este desequilibrio se manifiesta a menudo como la expresión excesiva de un fenotipo Th1 y/o la supresión de un fenotipo Th2. Las células T que segregan IL-2 y INF-\gamma se denominan células Th1 o tipo 1. Estas células están implicadas en la inmunidad directa mediada por las células mediante la activación de los macrófagos y las rutas celulares citotóxicas. Las células que producen IL-4, IL-5 e IL-10 se denominan células Th2 o tipo 2 y regulan la respuesta inmunitaria humoral. Varios compuestos de la presente invención inhibieron la función Th1 más potentemente que la función Th2 in vitro en las células T CD4+ humanas primarias estimuladas con concanavalina A. Por tanto, estos compuestos pueden tener valor terapéutico al ser capaces de deprimir selectivamente las células Th1 sin afectar a las células Th2 hasta cierto punto significativo produciendo así la corrección de un desequilibrio de la enfermedad inflamatoria autoinmune caracterizado por las elevadas respuestas Th1.
El ensayo sobre las células T humanas primarias implica su activación por la concanavalina A (conA); (Sigma, No. de catálogo C 5275), seguido por la detección por ELISA de las citoquinas para cualquiera de los perfiles. En el caso de los perfiles de Th1, se usaron como indicadores IL-2 y INF-\gamma mientras que para un perfil de Th2, el indicador es IL-10. Biológicamente, estos indicadores son útiles porque IL-2 es el mayor mitógeno de las células T mientras que IL-10 representa un agente inmunodepresor potente pero selectivo.
Métodos
Se recogieron aproximadamente 60 cc de sangre humana entera en tubos al vacío (vacutainer) con anticoagulante ACD. Se pasaron alícuotas de 15 ml de Ficoll Paque 1077 a 6 tubos cónicos estériles de 50 ml. Se dispusieron lentamente 10 ml de sangre en capas sobre la superficie del Ficoll Paque manteniendo el tubo vertical y apoyando la punta de la pipeta en el borde interior del tubo y dejando que la sangre se deslizara lentamente hacia abajo por el lado del tubo. Los tubos se hicieron rotar a 1700 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se separó por aspiración la capa de plasma por encima de los leucocitos en banda y se usó una pipeta Pasteur para levantar los leucocitos en banda y se transfirieron estos a un tubo estéril cónico de 50 ml. Se transfirieron las células de cada tubo inclinado de leucocitos a un tubo separado cónico de 50 ml. Se añadió PBS pH 7,4 estéril a cada tubo cónico de 50 ml que contiene las células procedentes de los leucocitos en banda, hasta un volumen de 50 ml. Se hicieron rotar los tubos a 1100 rpm durante 10 minutos. Se separó el sobrenadante por aspiración y se resuspendieron las células en 50 ml de PBS pH 7,4. Se volvieron a centrifugar los tubos a 1100 rpm durante 10 minutos. Se separó el sobrenadante por aspiración y se resuspendieron las células en un medio apropiado a una densidad de 5 x 10^{7} células/ml, o 2 x 10^{6} células/ml.
Preparación de los linfocitos crudos: Las células procedentes de la preparación de leucocitos se resuspendieron en medio BASAL (AcitCyte™) o RPMI 1640 con FBS al 10% + glutamina 2 mM a una densidad de 1 x 10^{6} células/ml.
Preparación de las células T CD4+: Las células procedentes de la preparación de leucocitos se resuspendieron en PBS estéril pH 7,4 suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 2-6% a una densidad de 5 x 10^{7} células/ml. Entonces las células estuvieron preparadas para su aislamiento.
Aislamiento de las células T CD4+ (StemSep™) I) Marcado inmunomagnético
Se añadieron 100 \mul de cocktail de anticuerpos (Stem Cell Technologies, No. de catálogo 14062) por cada ml de células y se mezclaron bien. Se incubaron las células + cocktail Ab sobre hielo durante 30 minutos. Después de 30 minutos de incubación, se añadieron 60 \mul de coloide magnético por cada ml de células y se mezclaron bien. Se incubaron las células + cocktail Ab + coloide magnético sobre hielo durante 30 minutos. Después de una incubación final de 30 minutos las células estuvieron preparadas para una separación magnética de las células.
II) Procedimiento de separación (alimentación por gravedad)
Se cargó la muestra en la parte superior de una columna. Se giró la llave de paso para permitir el flujo del medio a través de la columna y se recogió el medio en un tubo de recogida. Se añadió a la columna PBS suplementado con FBS al 2-6% hasta que se recogieron tres volúmenes de columna (sin incluir el volumen de la muestra de comienzo). Las células se lavaron, se contaron, y se resuspendieron en RPMI 1640 con FBS al 10% + glutamina 2 mM a una densidad de 1 x 10^{6} células/ml.
Procedimiento de ensayo de IL-2, IFN-\gamma, TNF-\alpha y IL-10
Se aislaron las células T CD4+ como se ha descrito antes. Se suspendieron las células en medio RPMI 1640 (Stem Cell Technologies, No. de catálogo 36750) con FBS al 10% + glutamina 2 mM a una densidad de 1 x 10^{6} células/ml. Se mantuvieron las células sobre hielo mientras se prepararon los compuestos de ensayo. Se prepararon los compuestos de ensayo en una placa de ensayo estéril de 96 pocillos a 10X la concentración final deseada del ensayo, y todos los pocillos contenían una cantidad igual de vehículo dimetilsulfóxido. Se añadieron 500 \mul de células T CD4+ a cada pocillo de una placa de ensayo de 24 pocillos. Se añadieron 10 \mul de cada solución de trabajo del compuesto de ensayo a los pocillos apropiados; se dejaron dos pocillos como controles estimulados y no estimulados. Se añadieron 10 \mul de concanavalina A (50X la concentración final) a 10 \mug/ml a cada pocillo con la excepción de los pocillos controles no estimulados. Se incubaron las células a 37ºC durante 48 horas. Se evaluó después el medio acondicionado mediante el ensayo ELISA para determinar la cantidad presente de IL-2, IFN-\gamma, TNF-\alpha y IL-10.
Resultados y discusión
Las tablas 5A, 5B y 5C representan una sinopsis de datos individuales con respecto a la potencia de los compuestos de la invención en cuanto a su capacidad para inhibir las citoquinas que probablemente promocionan o deprimen una respuesta Th1 o Th2. En las tablas 5A, 5B y 5C se ve el efecto de los componentes de la presente invención sobre la producción de IL-2, IFN-gamma y IL-10 en células T CD4+ humanas periféricas estimuladas con 10 \mug/ml de concanavalina A durante 48 horas. Las IC_{50} son las medias de al menos tres experimentos separados realizados por triplicado. Las condiciones de aislamiento e incubación de las células T CD4+ y la detección por ELISA de las linfoquinas se discuten en la sección de Métodos anterior.
Muchos miembros de esta serie de compuestos (en particular los que inhiben tanto a la PDE4 como a la PDE3) producen un perfil de citoquinas de las células T activadas que potencialmente pueden corregir el desequilibrio de las células Th1 frente a las Th2 en la artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias tales como la psoriasis. La Tabla 5A muestra ejemplos de algunos miembros de esta serie que han demostrado una inhibición selectiva de un perfil de Th1 de células CD4+ seleccionadas estimuladas con conA; en particular estos compuestos son los de los números 136, 54 y 30.
Aunque la potencia absoluta de estos compuestos varía dependiendo del análogo usado, el efecto es claramente diferente del mostrado por rolipram (Sigma, No. de catálogo R 6520). Se ha visto que el rolipram inhibe la síntesis tanto de IL-2 como de IL-10 durante 48 horas. Por contraste, la estimulación con con-A de la IL-10 no es inhibida por varios compuestos de la invención mientras que los mismos sobrenadantes muestran niveles reducidos de IL-2. La depresión de un perfil de citoquina Th1 necesitará el aumento de células Th2 en el sitio de la inflamación. El beneficio añadido de inhibir la producción de IL-2 puede, en circunstancias adecuadas, convertir en reactivas las células T anérgicas (esto es, las células T que no pueden responder a sus usuales estímulos mitógenos a través del TCR en el contexto de MHC II). Alternativamente, podría causar también la apoptosis de las células T autorreactivas. Por tanto, esta propiedad de los compuestos de la invención de inhibir Th1 manteniendo Th2, proporcionará el potencial para efectuar una mejora terapéutica en las enfermedades mediadas por Th1 tales como artritis reumatoide, psoriasis y enfermedad inflamatoria del intestino, entre otras enfermedades.
TABLA 5A
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TABLA 5B
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TABLA 5C
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Captación de radicales de oxígeno
Se cree que los oxidantes y radicales libres producidos por los neutrófilos y otras células contribuyen a la patogénesis de la artritis reumatoide y de otras enfermedades inflamatorias. Consecuentes con esta implicación, los compuestos capaces de inactivar los radicales libres (antioxidantes) tienen actividades antiinflamatorias en la artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias.
Los compuestos de la presente invención inhibieron la formación de radicales libres en un ensayo in vitro estándar usado para medir la actividad antioxidante de materiales biológicos. La base del ensayo (un kit de ensayo de RANDOX: Total Anti-Oxidant status) es la capacidad de los antioxidantes de una muestra de suprimir la formación de color debida al radical catiónico estable ABTS^{*}+. Se incuba el cromógeno ABTS (2,2'-azino-di-[3-etilbenzotiazolin-sulfonato) (Sigma, No. de catálogo A 1888)) (610 \muM) con solución sustrato (peroxidasa (metamioglobina) (6,1 \muM) y H_{2}O_{2} (250 \muM)) junto con un compuesto de la invención disuelto en DMSO durante exactamente 3 minutos a 37ºC. La producción del radical catiónico ABTS^{*}+ que tiene un color verde azulado relativamente estable se midió a 600 nM. La actividad antioxidante del compuesto de ensayo 100 \muM se determinó como se ha descrito antes. El control positivo usado fue un potente antioxidante biológico, Trolox® (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico). La inhibición de la formación del color (actividad antioxidante) por los compuestos de ensayo se expresa con relación al control positivo Trolox® (100% de inhibición). Los resultados se muestran en la Tabla 6. La supresión del color en este ensayo puede ser debida a la inhibición de la producción del radical ABTS^{*}+ o al sofocamiento del mismo.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 6
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Las características antioxidantes de estos compuestos podrían contribuir a las actividades antiinflamatorias in vivo y tener eficacia terapéutica en las enfermedades inflamatorias que implican radicales de oxígeno. Por tanto, la actividad antioxidante de los compuestos de la invención podría constituir un mecanismo adicional de acción antiinflamatoria en adición a la inhibición de la cAMP-fosfodiesterasa.
Inflamación aguda-edema de la oreja del ratón inducido por resiniferitoxina
Una de las características principales de la inflamación es un aumento de la dilatación y permeabilidad vascular que lleva al extravasado y acumulación de fluidos en el intersticio, produciendo enrojecimiento e hinchazón. La artritis reumatoide en particular se caracteriza por un edema pronunciado de las articulaciones afectadas que produce dolor pronunciado y entumecimiento. El modelo de inflamación de la oreja del ratón es un ensayo estándar in vivo para la inflamación, que se basa en un aumento en el peso de la oreja que es atribuible al edema inducido por los mediadores inflamatorios. La RTX (resiniferitoxina; Sigma, No. de catálogo R 8766) es un diterpeno aislado de la planta Euphorbia poisonii y es un análogo ultrapotente de la capsaicina. La RTX actúa estimulando selectivamente las terminaciones nerviosas nociceptivas y termal-sensitivas del tejido, produciendo un edema neurógeno. Los compuestos de la presente invención, ya se administren tópicamente, intraperitonealmente u oralmente inhibieron el desarrollo del edema inducido por la aplicación tópica de RTX. El edema como se induce en este modelo, es inhibido por los inhibidores de la PDE4 y es por tanto un sistema útil in vivo para diferenciar la eficacia de los compuestos de ensayo que poseen potencias comparables in vitro.
Se separaron los ratones (CD1, Charles River Laboratories) en grupos (n=5-8) y se marcaron. A los ratones testigos se les aplicó tópicamente RTX (0,1 \mug/oreja) en los lados interno y externo de la oreja izquierda y se les aplicó vehículo a la oreja derecha como control. Para la administración tópica, los ratones experimentales/de tratamiento recibieron RTX + la solución del compuesto de ensayo (50 \mug/oreja) en la oreja izquierda y acetona en la oreja derecha. Para la administración intraperitoneal (i.p.), se inyectaron 100 mg/kg del compuesto de ensayo disueltos en 100 \mul de PEG 200:solución salina (1:1) seguido por un periodo de espera de 30 minutos y entonces se indujo el edema estándar por RTX en 30 minutos. Para la administración oral (p.o.), se dieron a los animales 10 mg/kg del compuesto de ensayo en 100 \mul de PEG 200, después se indujo el edema usando 0,1 \mug/oreja de RTX después de un periodo de espera de 1,5 horas. Después de la inducción del edema, se sacrificaron los ratones, y se separó un disco estándar del tejido de la oreja. Cada disco de tejido se pesó inmediatamente hasta la cifra más próxima a 1/10 parte de un mg. Se analizaron los datos tomando la diferencia de cada oreja izquierda con la oreja derecha, calculando la media \pm SEM. La significancia estadística se ensayó por una prueba t de 2 muestras sobre las diferencias de los pesos de las orejas izquierda/derecha del grupo testigo frente al grupo experimental
Las tablas 7, 8 y 9 muestran la eficacia de los compuestos de la invención en el modelo de edema de la oreja del ratón inducido por RTX cuando se administran por las vías de administración tópica, intraperitoneal u oral. Queda claro por estos datos que los compuestos inhiben de forma efectiva la inflamación (edema) mediada por RTX en el ratón cuando se administran a través de cualquiera de las vías ensayadas. La eficacia de la administración por vía tópica es la mayor, seguida por la intraperitoneal y después la sonda oral. Las diferencias de eficacia entre las diferentes vías de administración no son sorprendentes ya que los procesos de absorción y metabolismo gastrointestinales son importantes para la administración i.p. y oral del compuesto.
TABLA 7
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TABLA 8
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TABLA 9
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Inhibición de las fosfodiesterasas de los nucleótidos cíclicos Inhibición de la cAMP-fosfodiesterasa 4
La elevación de cAMP en las células implicadas en la inflamación tales como neutrófilos, células endoteliales, macrófagos, eosinófilos, basófilos, linfocitos T etc., generalmente lleva a la regulación por disminución del perfil de una citoquina inflamatoria tal como la inhibición de la expresión del factor de la necrosis tumoral (TNF-\alpha). La expresión de la citoquina antiinflamatoria interleuquina 10 (IL-10) se regula positivamente por cAMP en muchas células en un sitio de inflamación. Puesto que la degradación de cAMP en la célula se ve afectada por las cAMP-fosfodiesterasas (las PDE), son de interés los inhibidores específicos de estas enzimas. Tales compuestos tendrían el efecto de elevar el cAMP intracelular en las células que expresan las isoenzimas PDE que ellos inhiben específicamente. Aunque hay al menos nueve familias diferentes de PDE de los nucleótidos cíclicos, la familia PDE4 es de particular interés. Esto es porque muchos de los tipos de células críticas que efectúan la respuesta inflamatoria expresan predominantemente PDE4 sobre las otras PDE. Los inhibidores de PDE4 tales como rolipram han demostrado que elevan específicamente el cAMP en las células inflamatorias tales como neutrófilos y eosinófilos y sofocan sus fenotipos inflamatorios. Un inhibidor de la PDE4 terapéuticamente eficaz, deseablemente tiene mínimos efectos secundarios, incluyendo la inducción de la secreción gástrica, la emesis y los efectos sobre el CNS. Los inhibidores de la PDE4 sin efectos secundarios perjudiciales representan una gran promesa como una nueva generación de agentes terapéuticos antiinflamatorios para enfermedades que incluyen asma, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, psoriasis y trasplantes alogénicos, entre otros.
El compuesto 12 fue estudiado en cuanto a su actividad frente a 5 de las mayores clases de las fosfodiesterasas de los nucleótidos cíclicos de los mamíferos (denominadas PDE de 1 a 5). Las PDE de la 1 a la 4, utilizan cAMP como sustrato mientras que la PDE5 usa cGMP. El inhibidor de las PDE de amplia especificidad, 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX, Sigma, No. de catálogo 17018) se usó como un control positivo en todos los ensayos. Las PDE para los diferentes ensayos fueron parcialmente purificadas a partir de los siguientes células/tejidos: PDE1 (corazón bovino), PDE2 (plaquetas humanas), PDE3 (plaquetas humanas), PDE4 (células U937 promonocíticas humanas) y PDE5 (plaquetas humanas).
Se ha encontrado que el compuesto 12 inhibe las PDE 1, 3 y 4 con unas IC_{50} de 85, 45 y 5,9 \muM respectivamente. No hubo efectos inhibidores significativos sobre las PDE 2 y 5. Por tanto, el compuesto 12 presenta una actividad y selectividad significativas hacia PDE4, la cAMP-fosfodiesterasa predominante en las células inflamatorias. Los compuestos de la invención pueden proporcionar utilidad terapéutica en las enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias o cualquier enfermedad cuya elevación de cAMP intracelular en las células inflamatorias que expresan la PDE, que participan en la enfermedad lleva a la regulación por disminución del fenotipo inflamatorio.
Los extractos citoplásmicos U937 se prepararon sonicando las células U937 (ATCC, No. de catálogo, CRL-159) en tampón de lisis (Tris Cl 20 mM, EDTA 1 mM, \beta-mercaptoetanol 5 mM, pepstatina 1 \muM, 1 \mug/ml de leupeptina, benzamidina 1 mM y PMSF 0,1 mM). Los extractos celulares sonicados se centrifugaron entonces a 70.000 g durante 30 minutos y se separaron los sobrenadantes. Se añadió sacarosa hasta una concentración final de 0,25 M, se dividió en alícuotas y se conservó a -80ºC.
Las reacciones de PDE se llevaron a cabo durante 30 minutos a 37ºC en volúmenes de 20 \mul en [^{3}H]cAMP 1 \muM (Amersham website http://apbiotech.com), 0,5 U/ml de 5'-nucleotidasa (Sigma), Tris Cl 50 mM, MgCl 10 mM pH 7,5. Se añadió el extracto U937 de tal modo que se consumió menos del 10% del sustrato. Se añadió el compuesto de ensayo o el vehículo a la concentración deseada. Típicamente, los compuestos se ensayaron en seis diluciones al décimo variando desde 100 \muM hasta 1 nM. Se llevaron a cabo las reacciones por duplicado. Se terminaron las reacciones por la adición de 200 \mul de la resina de cambio aniónico Dowex 1-8 400 Cl^{-}, en una proporción de 1 resina:2 metanol:1 H_{2}O. Se mezclaron las muestras por inversión y después se dejaron sedimentar durante 2-3 horas. Se separó un alícuota de 65 \mul, se secó sobre una Lumaplate (Packard, No. de catálogo 6005165) y se contó sobre un contador de centelleo Packard (TopCount™) durante 1,5 minutos, para proporcionar los datos de la Tabla 10.
TABLA 10
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La Tabla 10 muestra la actividad inhibidora de los compuestos de la invención frente a la PDE4 aislada de una línea celular promonocítica humana, U937. Utilizando las condiciones de ensayo de la PDE4 descritas aquí, los inhibidores de la PDE4 típicos tales como rolipram y Ro-20-1724 (Calbiochem, No. de catálogo 5575502) dan los valores IC_{50} de acuerdo con los encontrados en la bibliografía (revisados en Schudt et al., 1996). Además, el uso de IBMX (Sigma, No. de catálogo 17018) que inhibe las PDE 1, 3 y 4 no muestra ninguna inhibición adicional (no se muestran datos), nuevamente de acuerdo con el hallazgo de que la PDE predominante en las células U937 es la PDE4.
La inhibición de la PDE4 (o más exactamente, de las específicas isoformas de la PDE4) con el subsiguiente aumento de cAMP intracelular y activación de la proteína-quinasa A es un objetivo terapéutico en las enfermedades inflamatorias o autoinmunes en las que las células o tejidos causales implicados expresan de forma predominante esta isoforma de PDE. Con respecto a la artritis reumatoide, se ha demostrado que el inhibidor de la PDE4, rolipram, es activo en modelos animales de la enfermedad tales como la artritis inducida por colágeno en la rata (Nyman et al., Clin. Exp. Immunol. 108(3), 415-419, 1997).
Inhibición de la cAMP-fosfodiesterasa 3
Se evaluaron los compuestos de la invención en cuanto a la actividad inhibidora frente a la PDE3 de las plaquetas humanas para averiguar si la inhibición de la PDE4 y la inhibición de la PDE3 eran o no separables y también el farmacóforo requerido para cada una. Los inhibidores combinados de PDE4/3 pueden ser especialmente eficaces como agentes terapéuticos en enfermedades en las que los tipos de células causantes o contribuidores expresan tanto la PDE4 como la PDE3, por ejemplo, las células T en las enfermedades inflamatorias tales como artritis, enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis y trasplantes alogénicos. En tales enfermedades los inhibidores combinados de PDE3/4 pueden tener ventajas sobre un inhibidor selectivo de la PDE4 tal como el rolipram.
Se prepararon los extractos de células plaquetarias como se ha descrito antes para las células U937. El ensayo de PDE3 se realizó usando extracto de células plaquetarias como se ha descrito antes para el ensayo de PDE4. Las plaquetas contienen PDE 2, 3 y 5. Sin embargo, las PDE 2 y 5 utilizan preferiblemente cGMP, de modo que en un ensayo con cAMP como sustrato, no son detectadas. Además, en las condiciones usadas en este ensayo, el rolipram no tiene efecto y el conocido inhibidor de la PDE3, trequinsina (Calbiochem, No. de catálogo 382425) es un potente inhibidor que confirma que el ensayo es específico para la PDE3.
La Tabla 11 muestra las IC_{50} para los compuestos de la invención para la inhibición de la PDE3. Las actividades de las PDE3 y PDE4 parece que son separables y los compuestos presentan un amplio intervalo de selectividad para la PDE4 frente a la PDE3. Algunos compuestos son específicos para la PDE4, algunos compuestos son más potentes frente a la PDE4 que frente a la PDE3, y algunos compuestos son aproximadamente equipotentes frente a PDE4 y PDE3. Por tanto, se pueden seleccionar los compuestos de la invención en cuanto a su selectividad para PDE4/3 para conseguir la potencia máxima frente a diferentes tipos de células.
TABLA 11
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Especificidad sobre las isoenzimas PDE
Se ha procedido en esta invención a demostrar que la especificidad sobre la isoenzima PDE es una característica de la clase de compuestos.
Se hizo un cribado de los compuestos de ensayo (a 100 \muM) en cuanto a la actividad frente a las PDE 1, 2 y 5, usando métodos bioquímicos estándar realizados en MDS Panlabs (Bothell, WA, USA). En todos los ensayos se utilizó como control positivo el inhibidor de las PDE de amplia especificidad, 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX). Las PDE para los diferentes ensayos fueron parcialmente purificadas a partir de los siguientes células/tejidos: PDE1 (corazón bovino), PDE2 (plaquetas humanas), y PDE5 (plaquetas humanas). Los resultados se muestran en la Tabla 12. Con fines de comparación, los efectos sobre la PDE3 (plaquetas humanas) y la PDE4 (línea de células monocíticas humanas, U937) descritos antes, se presentan de nuevo en la Tabla 12.
TABLA 12
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Desplazamiento de rolipram desde su sitio de unión de alta afinidad (HARBS) sobre la cAMP-fosfodiesterasa 4
Existe la necesidad de inhibidores de la fosfodiesterasa 4 que no tengan efectos secundarios indeseables incluyendo náuseas y vómitos. Los modelos animales han demostrado que esta actividad está altamente correlacionada con la capacidad de un compuesto de desplazar el [^{3}H]-rolipram de un sitio de unión de alta afinidad de las células dentro del cerebro y sistema nervioso central (CNS) [Duplantier 1996, Barnette 1996]. Se ha usado un ensayo de desplazamiento del rolipram del sitio de unión de alta afinidad (HARBS) para predecir el potencial emético de un compuesto de la presente invención. Los compuestos de la presente invención presentaron una baja afinidad para el confórmero HARBS de PDE4 lo que sugiere que estos compuestos no están afectados por los efectos secundarios asociados al mecanismo, atribuidos a la primera generación de inhibidores de la PDE4 tales como el rolipram.
Se sacrificaron ratones hembras CD1 por medio de una inyección intraperitoneal de 100 \mul de etanol y el tejido cerebral se homogeneizó en 5 ml de Tris-HCl pH 8,00 enfriado en hielo, suplementado con MgCl_{2} 1,2 mM, benzamidina 1 mM (Sigma, No. de catálogo B 6506) y PMSF 0,1 mM (Sigma, No. de catálogo P 7626). Se centrifugó la suspensión dos veces a 30.000 x G a 4ºC y se desechó el sobrenadante. Se resuspendió el sedimento en tampón, y se ajustó a una concentración proteínica de 0,5 mg/ml. Se disolvieron los fármacos a ser ensayados en DMSO y se pipetearon por triplicado a una microplaca de 96 pocillos a concentraciones variables de 1 a 30.000 nM. Se suplementaron 10 ml de la preparación de la membrana con 100 \mul de [^{3}H]-rolipram 0,235 \muM en DMSO, y se dispensaron 100 \mul a cada pocillo de la microplaca. Se incubó la placa a 4ºC durante 1 hora. Los contenidos de la placa se aspiraron a través de una placa filtrante Whatman GF/C, y se lavaron con 4 x 200 \mul de tampón enfriado en hielo. Se secó la placa durante la noche, se añadieron 30 \mul de Microscint 20 (Packard, No. de catálogo 6013621) a cada pocillo y se leyó la placa en el contador de centelleo con un tiempo de muestreo de 2 minutos/pocillo. Los valores que representan la unión no específica (definida por las cuentas obtenidas usando rolipram 20 \muM) se restaron de todos los puntos de datos. Se realizaron determinaciones por triplicado en cada concentración. Los resultados se muestran en la Tabla 13. PDE4:HARBS indica la relación de la concentración IC_{50} requerida para inhibir la actividad catalítica a la concentración requerida para desplazar el 50% de rolipram desde el sitio de unión de alta afinidad.
En estas condiciones de ensayo el rolipram es capaz de desplazar el [^{3}H]-rolipram desde un sitio de unión de alta afinidad en el cerebro del ratón con una IC_{50} de aproximadamente 10 nM (no se muestran datos). Por tanto, el rolipram se une con una afinidad 20-40 veces mayor a su sitio de alta afinidad que la concentración requerida para la inhibición semi-máxima de la actividad catalítica de la PDE4. Esta afinidad preferencial para HARBS sobre el confórmero catalítico ha sido correlacionada con los efectos secundarios negativos de la primera generación de los inhibidores de la PDE4; es decir la emesis y los efectos sobre el CNS.
Los datos mostrados en la Tabla 13 indican que los compuestos de ensayo son mucho menos potentes para unirse a este sitio que el rolipram. Por ejemplo, rolipram y el compuesto 43 tienen unas IC_{50} muy similares frente a la actividad catalítica de la PDE4 (280 y 260 nM respectivamente), sin embargo, sus actividades HARBS son 10 nM y 250 nM respectivamente. Por tanto el compuesto 43 es aproximadamente 28 veces menos potente que el rolipram para la interacción con el confórmero HARBS de PDE4. La relación de las IC_{50} para PDE4_{\text{catalítica}} a PDE4_{HARBS} para el rolipram y el compuesto 43 es 28 y 1,04 respectivamente. Esta relación para el compuesto 43 se compara muy favorablemente con los valores registrados para los inhibidores de la PDE4 de segunda generación en los que la actividad HARBS ha sido reducida a través de los esfuerzos de la relación actividad-estructura (SAR). Por ejemplo, las relaciones registradas para SB 207499 (Ariflo) y RP 73401 (piclamilast), dos específicos inhibidores de la PDE4 que han sido ensayados en ensayos clínicos de fase II para el asma son 1 y 3 respectivamente. Por tanto, los compuestos de la presente invención pueden presentar efectos emetógenos in vivo que son mucho menores que los de rolipram, Ro 20-174 u otros inhibidores de la PDE4 de primera generación.
TABLA 13
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Potenciación de la actividad de luciferasa del elemento de respuesta al cAMP inducido por forskolina en las células monocíticas U937 humanas
Para demostrar la capacidad de los compuestos de la presente invención para aumentar el cAMP en las células intactas, se usó la transfección de las células con una estructura artificial de un plásmido que contiene un elemento de respuesta al cAMP (CRE) en un promotor que dirige la expresión de un gen indicador de luciferasa (Stratagene; Path Detect™: No. de catálogo 219076) para permitir la monitorización sensible de los niveles de cAMP intracelular por medio de la detección de la emisión de luz en un luminómetro. El tratamiento farmacológico de las células transfectadas con un compuesto que proporciona una combinación de un inhibidor de PDE y un agonista de la adenilil-ciclasa (receptor o activador intracelular) produce niveles elevados de cAMP intracelular detectables por el aumento de emisión de luz. Se ha demostrado que la cAMP-PDE4 es la actividad predominante de la fosfodiesterasa de los nucleótidos cíclicos en las células U937, y por tanto este tipo de células transfectadas con la estructura artificial CRE-luciferasa puede servir como un ensayo conveniente de cribado celular para los compuestos con actividad inhibidora de la PDE4. Se demostró por tanto que los compuestos de la presente invención proporcionan el aumento de la expresión de luciferasa en las células U937 tratadas con el activador de la adenilil-ciclasa, forskolina.
Las células promonocíticas humanas U937 se mantuvieron en medio RPMI que contiene FCS al 10% y glutamato 2 mM. Las células U937 fueron transfectadas transitoriamente como se describe en Biotechniques Vol. 17(6): 1058, 1994. Brevemente, se cultivaron las células en medio que contiene suero a una densidad de 5 x 10^{6} células/ml y después se resuspendieron en un medio que contiene suero a una densidad de aproximadamente 1 x 10^{7} células/ml. Se transfirieron 400 \mul de células en la cubeta de electroporación que contiene 10 \mug del vector indicador (pCRE-luc) en un volumen de 40 \mul de H_{2}O. El DNA del vector indicador se preparó a partir de DH5-\alpha de E. coli usando el kit de DNA-endonucleasa libre (Qiagen) según las instrucciones de los fabricantes. Las células se sometieron a electroporación a temperatura ambiente usando un electroporador BIORAD. Se fijó la capacitancia a 1050 \muF y el voltaje fue 280 V. La constante de tiempo se anotó después de cada electroporación. Después se diluyeron las células en 4 ml de medio y suero y se pusieron 200 \mul de células por pocillo. Se dejó entonces que se recuperaran las células durante 16-18 horas. Se trataron después las células con un compuesto de ensayo o vehículo en presencia o ausencia de forskolina 10 \muM durante 4 horas a 37ºC.
El ensayo de la luciferasa se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante (Tropix). Brevemente, se centrifugaron las células durante 4 minutos a 1200 rpm y se separó el medio sobrenadante. Los sedimentos de las células se lisaron en 15 \mul de tampón de lisis (Tropix). El ensayo de la luciferasa se realizó usando 10 \mul de lisado de células con 10 \mul de tampón A y 25 \mul de tampón B. Se obtuvo la actividad de luciferasa usando un luminómetro con un retraso de 5 segundos seguido por un tiempo de lectura de 10 segundos.
Como se muestra en la Tabla 14, los compuestos de la invención potencian la inducción de la actividad de luciferasa en las células U937 tratadas con forskolina 10 \muM. Once compuestos dentro de la serie inducen la CRE-luciferasa a concentraciones entre 0,1 y 1 \muM. Ninguno de los compuestos de ensayo por sí mismos indujo una actividad significativa de luciferasa que indica una baja actividad basal de adenilil-ciclasa en estas células. Este resultado demuestra que estos compuestos son capaces de aumentar los niveles de cAMP en una línea celular que predominantemente expresa PDE4, consistente con las observaciones de los ensayos enzimáticos.
Hay una amplia correlación entre la actividad inhibidora de PDE4 in vitro y la potencia de inducción de CRE-luciferasa.
El ensayo de CRE-luciferasa o variantes (diferentes tipos de células o características de la estructura artificial) del mismo sirven como un ensayo soporte de SAR/validación celular para los ensayos enzimáticos de PDE4 in vitro para la optimización de la eficacia para los compuestos de la presente invención.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 14
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Efectos de los compuestos de la invención sobre el crecimiento de las células transformadas- potenciales actividades anti-cáncer Introducción
La línea celular derivada de la leucemia mielógena humana transformada por BCR-ABL, K-562 (ATCC, No. de catálogo CRL 243) se usó para determinar cómo los compuestos de la presente invención afectan al crecimiento de las células transformadas. La elevación del cAMP intracelular es un modo de causar la interrupción del ciclo celular o apoptosis en muchos tumores malignos, en particular ciertas clases de leucemias (por ejemplo CLL). Tales mecanismos intracelulares (esto es, cAMP) han sido descritos para lograr la diferenciación de los clones leucémicos no diferenciados. En particular, se ha demostrado que el aumento de cAMP intracelular (usando un análogo de AMP cíclico) en las células de leucemia mielógena transformadas por p210 BCR-ABL es antiproliferativo a través de la inhibición de la quinasa 4 dependiente de la ciclina y la subsiguiente regulación por disminución de c-myc. Por tanto, la capacidad antiproliferativa de los compuestos de la presente invención en las células cultivadas K-562 se comparó con varios inhibidores estándar de la fosfodiesterasa usando un ensayo de absorción de la 3H-timidina.
Métodos
Se sembraron 90 \mul de células K562 (células de leucemia mielógena humana crónica) en placas de ensayo estériles de 96 pocillos a una densidad de 1 x 10^{5} células/ml, en RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% y L-glutamina 2 mM. Se prepararon las muestras a ensayar en una placa de ensayo estéril de 96 pocillos a 10X la concentración final deseada. Todas las diluciones de la muestra contenían cantidades iguales de DMSO para compensar el % de DMSO usado en la concentración más alta de la muestra. Se examinaron nueve concentraciones del compuesto de ensayo para ver los efectos sobre el crecimiento hasta una concentración máxima 100 \muM. Se añadieron a las células separadas en alícuotas, 10 \mul de las muestras y controles (DMSO/ control de crecimiento normal). Se incubaron las células a 37ºC/CO_{2} al 5% durante 48 horas. Después de 48 horas de incubación, se añadieron 20 \mul de ^{3}H-timidina a cada pocillo para una concentración final de 1 \muCi/ml. Se incubaron después las células a 37ºC/CO_{2} al 5% durante 4 a 6 horas. Después de 4-6 horas de pulso con timidina, se envolvieron las placas en plástico y se congelaron durante la noche en un congelador a -20ºC libre de escarcha. Se recogieron las células y se determinaron las cuentas de ^{3}H-timidina. Para distinguir entre citotoxicidad y actividad citostática, se prepararon curvas de crecimiento en las que el valor medio CPM de la densidad de siembra de las células se representó sobre la misma curva que el valor medio CPM para la proliferación máxima alcanzada después de 48 horas (células de control de crecimiento en DMSO). Se diluyeron las células 1:2 para un intervalo de concentración de 7,8 x 10^{3} células/ml a 2 x 10^{6} células/ml. Se sembraron 90 \mul de cada dilución de células en placas de ensayo estériles de 96 pocillos y se dejaron equilibrar durante aproximadamente 4 horas a 37ºC/CO_{2} al 5% antes del pulso con ^{3}H-timidina. Los datos de la Tabla 15 se obtuvieron como se ha descrito antes, y más específicamente se sembraron las células K562 en placas de 96 pocillos a 1 x 10^{5} células/ml en RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% y L-glutamina 2 mM. Se añadieron diferentes concentraciones del compuesto de ensayo o el vehículo (DMSO) y se incubaron las células a 37ºC/CO_{2} al 5% durante 48 horas. Se pulsaron después las células a 37ºC/CO_{2} al 5% durante 4 a 6 horas con 1 \muCi/ml de ^{3}H-timidina. Se determinó la radiactividad incorporada al DNA después de la recogida sobre filtros de fibra de vidrio y contaje por centelleo.
Resultados y discusión
Los datos de la Tabla 15 demuestran que los compuestos de la presente invención son capaces de causar la interrupción del ciclo celular (por ejemplo, el compuesto 179) y probablemente, por tanto, de promover la diferenciación celular y/o apoptosis. Por contraste, los inhibidores conocidos de PDE (rolipram, un inhibidor de la PDE4 y zadavarina, un inhibidor de PDE4/3) fallaron en tener algún efecto sobre la capacidad proliferativa de las células K-562. Aunque ambos, los compuestos ensayados de la invención y los inhibidores conocidos de PDE, en este caso todos tienen como objetivo la PDE4, solamente los compuestos de la invención muestran un efecto notable sobre las propiedades de crecimiento de las células K-562. Esto puede indicar una nueva clase de enzimas PDE4 reconocidas por estos compuestos que no son afectadas ni por el rolipram ni por la zadavarina. La capacidad del compuesto 179 para inducir la interrupción del ciclo celular en la línea celular K-562 mientras que los inhibidores estándares de PDE4 o PDE4/3, rolipram y zadavarina, son incapaces de hacer lo mismo, da a entender que los compuestos de la invención pueden ser usados en el tratamiento de los trastornos mieloproliferativos y linfoproliferativos tales como CML y CLL y potencialmente otros tumores malignos.
TABLA 15
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Eficacia en modelos animales específicos de enfermedades inflamatorias y de autoinmunidad
Se realizaron pruebas de estudios de concepto en modelos de enfermedades específicas en animales para demostrar adicionalmente la actividad enzimática, celular y anti-inflamatoria general de los compuestos lactónicos y lactámicos de la presente invención. Los estudios de la bibliografía han demostrado que el aumento del cAMP intracelular a través de la administración de inhibidores de la fosfodiesterasa, activadores de la adenilil-ciclasa, o ambos, puede reducir la enfermedad establecida y/o prevenir el desarrollo de la enfermedad en diferentes modelos animales de enfermedades inflamatorias. La eficacia de los compuestos de la invención se demostró en modelos animales de la enfermedad de Crohn, artritis reumatoide y rechazo de trasplantes. Con respecto a la enfermedad de Crohn se usó un modelo pre-clínico establecido: colitis inducida por ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) en la rata. Para la artritis reumatoide, se empleó artritis inducida por colágeno (CIA) en el ratón. Para imitar el rechazo de trasplante humano, se usó un modelo murino de trasplante de aloinjerto de la piel de la cola.
Enfermedad inflamatoria del intestino (enfermedad de Crohn)
Enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) es un término global para enfermedades inflamatorias fluctuantes, crónicas, actualmente incurables, del tracto gastrointestinal que incluyen la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Los síntomas de estos trastornos incluyen dolor abdominal (usualmente en el lado derecho inferior del abdomen) y diarrea con hemorragia rectal, pérdida de peso y fiebre cuando la enfermedad progresa. La etiología de IBD es desconocida, sin embargo los estudios epidemiológicos sugieren una asociación entre la enfermedad y una infección vírica (particularmente sarampión) en el útero o en los primeros años de la vida. The Crohn's and Colitis Foundation of America (CCFA) estima que 1-2 millones de personas en Estados Unidos padecen la enfermedad de Crohn e IBD relacionadas, siendo los descendientes de europeos los de mayor riesgo. Las tasas de incidencia han aumentado significativamente desde los años 60 cuando (la enfermedad de Crohn) fue descrita por primera vez. Sólo en los Estados Unidos, los costes económicos de estas enfermedades se estiman en 1,8-2,6 billones de dólares al año.
Un tratamiento común para las IBD consiste en la administración oral o intracolónica de ácido aminosalicílico (5-ASA), un derivado NSAID que se escinde hasta ASA (el fármaco activo) en el tracto gastrointestinal inferior. Otros tratamientos de mayor soporte de las IBD incluyen corticosteroides e inmunodepresores (por ejemplo, 6-mercaptopurina o azatioprina) o sus combinaciones. Recientemente, ha sido aprobada una terapia anti-TNF-\alpha para el tratamiento de la enfermedad de Crohn grave que es resistente a las terapias convencionales. Este método terapéutico valida la importancia del factor de necrosis tumoral en la IBD. Incluso con los métodos anti-TNF-\alpha hay mucho espacio para la mejora de las modalidades de tratamiento actuales tanto desde el punto de vista de los efectos secundarios como de la eficacia.
Los compuestos de la presente invención se ensayaron en el modelo de la colitis inducida por ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) en la rata (Morris et al., Gastroenterology 96: 795-803, 1989; Kim, H. S. and Berstad, A., Scandinavian Journal of Gastroenterology 27: 529-537, 1992; Ward, Lancet II: 903-905, 1977; y Shorter et al., Am. J. Dig. Dis. 17: 1024-1032, 1972). Las ventajas de este particular modelo de IBD incluyen (a) el desarrollo de la enfermedad en la rata está mediado inmunitariamente, desempeñando las células T Th1 un importante papel ya que se piensa que son la causa de la enfermedad humana, (b) la instilación única de TNBS induce una enfermedad de gravedad y persistencia consistentes, (c) el modelo no es costoso, (d) la larga duración de la inflamación (hasta 8 semanas), (e) una variante del modelo en la que se reactiva la colitis, imita la naturaleza de recaída/remisión de la enfermedad humana, (f) las lesiones son histopatológicamente similares a las humanas, (g) la patología clínica imita la enfermedad humana incluyendo necrosis, formación de úlceras, infiltración granulocítica, edema del intestino, diarrea y adhesiones y (h) muchos fármacos usados para tratar la IBD humana son activos en el modelo TNBS.
El compuesto 43 se evaluó en cuanto a su capacidad para atenuar la gravedad del daño del colon y la inflamación usando el modelo TNBS. Para comparación, se trataron grupos separados de ratas con colitis con ácido 5-aminosalicílico, un fármaco usado comúnmente para tratar la enfermedad inflamatoria del intestino en humanos, y NCX-456, un nuevo derivado del ácido 5-aminosalicílico del que recientemente se ha demostrado que tiene una actividad antiinflamatoria muy aumentada (Wallace et al., Gastroenterology 117: en imprenta, 1999).
Métodos
Se indujo la colitis por instilación intracolónica del hapteno TNBS (60 mg/ml) en 0,5 ml de etanol al 50%. Grupos de 8 ratas Wistar, machos, con un peso de 175-225 g recibieron el compuesto 43 (10 mg/kg), ácido 5-aminosalicílico a 100 mg/kg, NCX-456 (100 mg/kg), o vehículo (carboximetilcelulosa al 1%) intracolónicamente 1 hora antes de la inducción de la colitis, 1 hora después de la inducción de la colitis y después a intervalos de 12 horas durante una semana. Un grupo adicional de ratas recibió solución salina intracolónicamente en lugar de TNBS/etanol y fue tratado con vehículo a los mismos tiempos que se han indicado antes. Se registraron los pesos corporales al comienzo del estudio y los días 2 y 7.
Se sacrificaron las ratas el 7º día después de la inducción de la colitis y se evaluó la extensión del daño y la inflamación. Una vez que fueron sacrificadas las ratas, se separó el colon distal y se sujetó con alfileres sobre una plataforma de cera. Se observó la presencia o ausencia de diarrea, así como la presencia y gravedad de las adhesiones entre el colon y otros órganos, y la gravedad y extensión del daño del colon. El orden de sacrificio de las ratas fue aleatorio, y la persona que puntuó las lesiones no conocía el tratamiento que habían recibido las ratas. Después de la puntuación, se escindió una muestra de tejido del colon para medir la actividad de la mieloperoxidasa como un índice de la infiltración de granulocitos (véase Wallace et al., Gastroenterology 117: en imprenta, 1999; y Morris et al., Gastroenterology 96: 795-803, 1989). Esta muestra de tejido tenía 1 cm de largo (a lo largo del eje del colon) y 5 mm de ancho y fue tomada de una región con daño macroscópicamente visible (o la correspondiente región en las ratas en las que no hubo ningún daño). El resto del tejido fue fijado en formalina tamponada neutra y tratado por los métodos rutinarios para la subsiguiente evaluación por microscopía óptica. En un modo ciego, se examinó la muestra del tejido del colon de cada rata para buscar indicios de ulceración e inflamación mucosal. Se calculó el porcentaje de la superficie luminal de la sección en la que había ulceración.
Resultados
Una rata del grupo tratado con el vehículo fue excluida del análisis por que el TNBS fue excretado rápidamente después de su instilación en el colon (esto es, no se desarrolló colitis). Una rata tratada con vehículo murió el día 7 y una rata tratada con NCX-456 murió el día 6. En cada caso, se observó durante la necropsia la perforación del colon distal. Los diferentes criterios de valoración de este estudio se resumen en la Tabla 16. En las ratas tratadas con vehículo, la administración de TNBS produjo una extensa ulceración del colon distal, diarrea y adhesiones entre el colon y otros tejidos viscerales. El espesor de la pared intestinal fue más del doble que el de las ratas sanas. La puntuación global de la colitis en el grupo tratado con el vehículo fue 12 \pm 1. La actividad de la mieloperoxidasa del colon aumentó aproximadamente 10 veces sobre los niveles de las ratas testigo sanas. Histológicamente, la infiltración masiva de neutrófilos fue evidente alrededor de los sitios de ulceración de la mucosa. En las ratas tratadas con vehículo, casi todo el segmento de 1 cm de tejido presentaba ulceración mucosal que se extendía hasta el fondo de la muscularis propria. Las ratas tratadas con vehículo presentaron una pérdida importante de peso corporal (\sim 12%) en un periodo de una semana después de la administración de TNBS (Tabla 16).
112
El tratamiento con 5-ASA a lo largo de una semana no afectó de forma significativa a la incidencia o gravedad de las adhesiones, puntuación del daño del colon, espesor de la pared intestinal, actividad de mieloperoxidasa o puntuación histológica (Tabla 16). Sin embargo, el 5-ASA redujo significativamente la incidencia de la diarrea con relación al grupo tratado con el vehículo. Las ratas tratadas con 5-ASA presentaron pérdidas de peso corporal (\sim20%) similares a las del grupo tratado con el vehículo a lo largo de una semana de estudio (Tabla 16).
El tratamiento durante una semana con el derivado de 5-ASA que libera óxido nítrico, NCX-456, produjo una reducción significativa (\sim50%) en la puntuación del daño del colon y una reducción similar en la puntuación histológica (Tabla 16). En el último caso, esto refleja una reducción de la extensión de la ulceración de la muestra de 1 cm que había sido fijada y preparada para examen por microscopía óptica. El NCX-456 redujo también significativamente la incidencia de adhesiones con relación al grupo tratado con el vehículo. Los pesos corporales medios de las ratas tratadas con NCX-456 no se diferenciaron de forma significativa de los del grupo tratado con el vehículo (Tabla 16).
El compuesto 43 redujo significativamente la incidencia de adhesiones (36% del vehículo), la puntuación del daño del colon (49% del vehículo), el espesor de la pared intestinal (30% del vehículo), y la puntuación histológica (52% del testigo), dando como resultado una reducción total de la puntuación global de la colitis del 51% comparada con los animales tratados con el vehículo (Tabla 16). El compuesto 43 redujo también la incidencia de diarrea en comparación a los animales tratados con el vehículo aunque el efecto no fue estadísticamente significativo. El compuesto 43 fue el único de los diferentes compuestos de ensayo que evitó la reducción del peso corporal causada por la administración de TNBS (Tabla 16). Los aumentos de la actividad de la mieloperoxidasa (MPO) en los tejidos, un marcador de la infiltración de los neutrófilos en el tejido, en el colon, no fueron evitados por ninguno de los compuestos de ensayo incluyendo el compuesto 43.
Discusión
Estos estudios demuestran la eficacia del compuesto 43 en el modelo TNBS de colitis en ratas. El compuesto 43 redujo notablemente el daño del colon, como se evaluó tanto macroscópicamente como histológicamente, redujo el espesor de la pared intestinal, evitó la pérdida de peso corporal normalmente observada después de la administración de TNBS y redujo la incidencia de las adhesiones entre el colon y otros órganos viscerales. Se encontró que el 5-ASA, un fármaco comúnmente usado para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino en humanos, era ineficaz para reducir las lesiones del colon, las adhesiones, los cambios en el peso corporal y el espesor de la pared intestinal. El 5-ASA es efectivo sólo en aproximadamente 50% de los ensayos que incluyen este modelo. Por otro lado, el NCX-456, que es un derivado del 5-ASA que libera óxido nítrico (Wallace et al., Gastroenterology 117: en imprenta, 1999), presentó acciones en el modelo TNBS que fueron comparables a las del compuesto 43. Sin embargo, aunque el NCX-456 redujo significativamente el daño del colon y la incidencia de adhesiones, en contraste al compuesto 43, no afectó de forma significativa a los cambios en el peso corporal después de la administración de TNBS, ni redujo de forma significativa el espesor de la pared intestinal. Es importante observar que los efectos del compuesto 43 detallados aquí corresponden a un nivel de dosis de 10 mg/kg. El 5-ASA y el NCX-456 fueron administrados a 100 mg/kg. Se ha demostrado también que los efectos terapéuticos de NCX-456 se pierden cuando se reduce la dosis a 50 mg/kg.
Ninguno de los compuestos ensayados afectaron de forma significativa a la actividad de la mieloperoxidasa en el tejido colónico. La MPO es una enzima encontrada principalmente en los gránulos azurófilos de los neutrófilos, que sirve de este modo como un índice bioquímico de la infiltración de los neutrófilos. La carencia de efecto de cualquiera de los compuestos ensayados sobre la actividad MPO, a pesar de las reducciones significativas en la gravedad y extensión del daño colónico, puede haber sido una consecuencia del método de muestreo del tejido. Las muestras de tejido para determinación de MPO se tomaron de regiones con daños macroscópicamente visibles. La evaluación histológica reveló que las áreas dañadas estuvieron asociadas siempre con la infiltración masiva de neutrófilos. Las grandes concentraciones de los neutrófilos alrededor de los sitios dañados pueden, por tanto, haber "enmascarado" cualquier reducción en la afluencia total de neutrófilos que hubiera tenido lugar en los tejidos cuando se redujo el daño por tratamiento con los fármacos de ensayo.
El modelo de inflamación gastrointestinal TNBS en la rata es un modelo preclínico aceptado para la IBD humana. Las manifestaciones clínicas e histopatológicas de la enfermedad muestran una buena similitud con la enfermedad humana y muchos fármacos usados actualmente en el tratamiento de IBD en humanos tienen eficacia en este modelo. La eficacia del compuesto 43 en este modelo implica que éste y otros compuestos de la invención pueden ser usados en la terapia de las enfermedades inflamatorias humanas incluyendo la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa entre otras.
Artritis reumatoide Introducción y fundamento
El modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) en ratones es un modelo adecuado para evaluar los fármacos potenciales activos en la artritis reumatoide humana (Trentham, D.E., Arthritis Rheum. 25: 911-916, 1982; Brahn, E., Clin. Orthop. 265: 52-53, 1991; Holmdahl, R et al., Arthritis Rheum. 29: 106, 1996). Este modelo comparte muchos de los cambios moleculares, celulares e histopatológicos identificados como indicadores de la enfermedad humana; estos incluyen (a) proliferación pronunciada de las células que comprende la membrana sinovial de la articulación, (b) formación de un tejido invasivo como el pannus (c) infiltración de macrófagos, granulocitos y linfocitos, y (d) destrucción de huesos y cartílagos. Como en la artritis reumatoide, los animales con CIA presentan elevación de los niveles séricos de los complejos de inmunoglobulina tales como el factor reumatoide (RF) y anticuerpos anticolágeno y citoquinas inflamatorias en el sinovio tales como el factor de la necrosis tumoral (TNF-\alpha). Además, se ha demostrado en el sinovio la implicación de la activación y expansión clonal de las células T ayudadoras restringidas por la MHC clase II. Las radiografías de las articulaciones afectadas presentan a menudo cambios erosivos similares a los que se ven en la RA humana y la artritis progresiva a menudo produce una deformidad y disfunción de las articulaciones como la RA. Además, muchos compuestos que reducen los síntomas de la enfermedad humana tales como los compuestos biológicos anti-TNF, los corticosteroides y los DMARDS son eficaces en este modelo animal. El desarrollo/progresión de la enfermedad en el modelo CIA tiene lugar tanto en la fase inmune (temprana) como en la fase inflamatoria permitiendo de este modo la evaluación de un amplio intervalo de fármacos con diversos modos de acción farmacológica.
Se evaluó el compuesto 43 en cuanto a su capacidad para afectar al desarrollo o gravedad de la artritis en el modelo murino de CIA cuando se administra intraperitonealmente (10 mg/kg, dos veces al día) en un régimen profiláctico durante el desarrollo de la enfermedad. Los efectos de este tratamiento sobre la gravedad de la enfermedad se evaluaron por puntuaciones cualitativas de la enfermedad, determinación cuantitativa del edema de la pata y examen histopatológico detallado de las articulaciones afectadas. Como control positivo, se usó en este estudio dexametasona, un potente corticosteroide.
Métodos
Se inmunizaron ratones DBA/1J machos (7-8 semanas de edad) por medio de una inyección subcutánea de 0,1 ml de una emulsión de colágeno-adyuvante (0,1 mg de colágeno tipo II de polluelo en adyuvante completo de Freund) en la base de la cola. Se asignaron los ratones aleatoriamente a los grupos de tratamiento o de control de la siguiente manera: Compuesto 43 (n=10); 2-hidroxipropilbetaciclodextrina al 45% en solución salina al 0,9%, control con vehículo (n=10); control sin tratar (n=5) y control positivo con dexametasona (n=5). Después de tres semanas, se sometieron los animales a un refuerzo con una segunda inyección de colágeno tipo II de polluelo emulsionado a 1,0 mg/ml en adyuvante incompleto de Freund. Se requiere esta segunda inyección para la inducción reproducible de la enfermedad. En los animales testigos, los signos clínicos de artritis manifestados como eritema y edema de las patas y de las articulaciones tarsal/metatarsal usualmente aparecen dentro de 1-2 semanas después de la segunda inmunización. Se evaluaron los compuestos en cuanto a su capacidad para retrasar la aparición de la artritis o reducir el desarrollo de la misma (régimen profiláctico). El vehículo, el control positivo de dexametasona (0,075 mg/kg) y el compuesto 43 (10 mg/kg) se administraron dos veces al día (50 microlitros por inyección) mediante inyección i.p. empezando el día de la segunda inyección de colágeno. Los ratones continuaron recibiendo dosis hasta que el último animal del grupo control con vehículo alcanzó el séptimo día de haber sido establecida la enfermedad. En este caso particular, éste necesitó tratamiento durante 25 días incluyendo el día de la inyección de refuerzo.
Se hizo seguimiento del desarrollo de la artritis clínica (progresión de la enfermedad) diariamente después de la segunda inyección de colágeno. Se evaluaron clínicamente las cuatro extremidades por un observador entrenado no familiar (ciego) con la identidad del grupo de tratamiento, y se puntuó sobre una escala de 0-4 la gravedad de la enfermedad (enrojecimiento e hinchazón) según los siguientes criterios.
Puntuación Condición
0 Normal
1 Algunas articulaciones hinchadas y enrojecidas, pero no todas
2 Todas las articulaciones hinchadas
3 Inflamación total de la pata
4 Máxima inflamación, sin posterior hinchazón posible
La inflamación se definió como cualquier enrojecimiento o hinchazón (aumento) de cualquier parte de cualquier pata. La enfermedad establecida se definió como una puntuación cualitativa de la inflamación de la pata de 2 o mayor, que persiste durante al menos 24 horas. Además, se midieron las anchuras de las patas para las cuatro extremidades por un observador "ciego" diariamente usando calibradores de precisión, de presión constante.
Al final del estudio se sacrificó cada animal mediante una sobredosis de anestesia con halotano. Las articulaciones tanto la distal a la rodilla como la que incluye la rodilla fueron diseccionadas y analizadas histológicamente. Las articulaciones de las extremidades se fijaron en tampón de formalina al 10% y se descalcificaron en ácido fórmico al 10% durante 48 horas, y después se trataron para inclusión en parafina. Se tiñeron secciones seriadas (con un espesor de 5-7 micrómetros) con hematoxilina y eosina (H & E). Las alteraciones histopatológicas de las articulaciones tarsal y metatarsal fueron graduadas en "ciego" por un patólogo oficial y se les asignó una puntuación basada en un sistema de clasificación.
Resultados y discusión
Aproximadamente 14-16 días después de la administración de la inyección de refuerzo de colágeno en adyuvante incompleto de Freund, tanto los ratones de los grupos no tratados como los de los grupos tratados con vehículo empezaron a presentar signos manifiestos de artritis clínica. Los signos clínicos de artritis incluyeron hinchazón, enrojecimiento y deformación de las patas. La enfermedad clínica se registró cuantitativamente (usando calibradores de precisión para medir el edema de la pata) y cualitativamente (se asignaron puntuaciones a la enfermedad, basadas en la gravedad de la inflamación de la pata) diariamente una vez que los signos fueron evidentes. Cuando la enfermedad clínica progresó (los últimos 10 días del estudio) en los grupos de ratones no tratados y en los grupos tratados con vehículo, aparecieron indicios de que en los ratones tratados con 10 mg/kg del compuesto 43 (i.p., bid) la velocidad de progresión de la enfermedad, tal como se evaluó por la puntuación de la pata, se redujo significativamente (no se muestran datos).
Se sacrificaron los ratones el día número 25 después de la segunda inyección de colágeno que corresponde aproximadamente al día número 10 después de establecida la enfermedad. Se separaron las cuatro patas de cada animal del estudio, se fijaron y se prepararon para examen hispatológico ciego por un veterinario patólogo oficial (ACVP). La patología de la articulación de cada pata se clasificó en una escala de 0 a 4, siendo 0 normal y 4 la más gravemente afectada. Se asignaron grados a las lesiones basados en la lesión más grave presente en la pata según la siguiente escala:
Puntuación histopatológica Descripción
0 Articulación normal
1 Hiperplasia sinovial
2 Hiperplasia sinovial e infiltración leucocítica con formación de pannus
3 Grado 2 con reabsorción de hueso subcondral
4 Pérdida de la integridad articular con infiltración leucocítica masiva
Las puntuaciones de las patas individuales se deben sumar para obtener un total para cada animal, siendo 16 la puntuación máxima posible para un animal. Se obtuvieron los valores del grupo haciendo la media de las puntuaciones individuales de los animales.
La Tabla 17 muestra los valores medios del grupo con respecto al edema de la pata, puntuación de la artritis clínica y puntuación histopatológica de las articulaciones para los animales tratados con el compuesto 43 en comparación con los ratones tratados con vehículo, tratados con dexametasona y sin tratar, el día 25 después del refuerzo con colágeno.
TABLA 17
113
Los datos de la Tabla 17 muestran que el vehículo empleado en este estudio, 2-hidroxipropil-betaciclodextrina, no afecta al desarrollo de la enfermedad tanto si se evalúa clínicamente como histopatológicamente. Estos datos muestran también que el último día del estudio (día 25), la gravedad de la enfermedad (ya se evalúe clínica o histopatológicamente) se redujo en los ratones tratados con el compuesto 43 en comparación al grupo del vehículo. Como se muestra en la tabla, el edema de la pata, la puntuación de la artritis y la puntuación histopatológica se redujeron en un 42%, 35% y 29% respectivamente en el grupo tratado con el compuesto 43 en comparación con el grupo del vehículo. Un análisis de los datos por ANOVA de 2 vías a partir de los últimos 10 días del estudio reveló que las puntuaciones de la artritis de los animales tratados con el compuesto 43 fueron significativamente más bajas que las de los animales tratados con el vehículo (no se muestran los datos).
A partir del examen de la evolución en el tiempo de las puntuaciones del edema y de la artritis, es claro que los efectos del compuesto 43 se pusieron de manifiesto más profundamente cuando progresa la enfermedad. Esto sugiere en gran medida que los efectos del compuesto a este nivel de dosis serían estadísticamente significativos en todas las categorías de la enfermedad si el estudio hubiera continuado durante otra semana. Adicionalmente, estos resultados sostienen que el compuesto 43 y otros compuestos de la invención pueden ser más eficaces en el tratamiento de la enfermedad existente (régimen terapéutico) que profilácticamente. Los efectos modestos del compuesto 43 en la mejora de la CIA detallados aquí, pueden indicar que la dosis empleada está en la cúspide de la eficacia y que dosis más altas darían como resultado una mayor inhibición. Es posible también que los parámetros de biodisponibilidad y metabolismo desempeñan importantes papeles en los resultados vistos.
La reducción en la progresión de la artritis inducida por colágeno en ratones mediante el compuesto 43 detallada aquí demuestra que se puede usar el compuesto 43 en el tratamiento de la artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias relacionadas. Estos resultados (en particular las puntuaciones histopatológicas) indican también que estos compuestos pueden ser usados en el tratamiento de enfermedades que implican perturbaciones en los compartimentos del hueso y cartílago de las articulaciones, incluyendo osteoartritis y osteopenia. La actividad del compuesto 43 en este modelo apoya los datos in vitro registrados aquí que demuestran los efectos inhibidores de este compuesto y otros compuestos de la invención sobre la activación de los neutrófilos, la activación de monocitos/macrófagos y las respuestas Th1 de las células T.
Rechazo de trasplantes Ensayo in vitro: activación, diferenciación y función de las células T CD4 Métodos
Se usaron ratones transgénicos AND-TCR (Kaye J. et al., Nature 341: 746-749, 1989) para proporcionar una fuente de células T CD4+ específicas del antígeno natural. El receptor del antígeno de las células T AND reconoce un péptido derivado del citocromo C de paloma (pcc) en el contexto de la molécula MHC clase II I-E^{K}.
Para examinar el papel de un compuesto de ensayo en la activación y proliferación de las células T CD4 naturales, se cultivaron 1 x 10^{5} células T AND de los nódulos linfáticos con 1 x 10^{6} células del bazo B10.BR irradiadas en presencia de concentraciones variables de péptido pcc (0-10 \muM) en placas de 96 pocillos. Se evaluó la proliferación por la incorporación de ^{3}H-timidina. Todas las condiciones de ensayo se realizaron por triplicado. El fenotipo de activación en la superficie celular de las células T se evaluó por análisis de citometría de flujo.
La diferenciación de las células T CD4 naturales hasta las líneas Th1 y Th2 se realizó como sigue: se cultivaron 1 x 10^{5} células T AND de los nódulos linfáticos con 10^{7} células del bazo B10.BR irradiadas en 2 ml de medio de cultivo con los siguientes suplementos: para la diferenciación de células Th1, 100 U/ml de IFN-\gamma, 25 U/ml de IL-2 y 10 \mug/ml de anti-IL-4; para la diferenciación de células Th2, 150 U/ml de IL-4, 25 U/ml de IL-2 y 10 \mug/ml de anti-IFN-\gamma. Después de 3-4 días se dividieron los pocillos 1:4 con las mismas adiciones. Después de 7 días se recogieron las células y se lavaron 3 veces para separar las citoquinas en los sobrenadantes. Se reestimularon 1 x 10^{5} células cultivadas con 5 x 10^{5} células del bazo B10.BR irradiadas + péptido pcc 5 \muM en 250 \mul de medio de cultivo sin ninguna citoquina añadida. Se recogieron los sobrenadantes después de 40 horas y se evaluaron en cuanto a IL-2, IL-4 y IFN-\gamma por ELISA. Se añadieron los compuestos de ensayo a lo largo de la diferenciación del cultivo.
Las células Th1 y Th2 cultivadas generadas en ausencia de los compuestos de ensayo se analizaron en cuanto a la proliferación y actividad de citoquina como se ha descrito antes durante la estimulación del antígeno en presencia del compuesto.
Ensayo in vitro: activación, diferenciación y función de las células T CD8 Métodos
Se usaron ratones transgénicos 2C-TCR (Sha W.C. et al., Nature 335: 221-274, 1988) para proporcionar una fuente de células naturales T CD8+ específicas del antígeno. El receptor del antígeno de las células 2C-T reconoce el péptido 2C derivado de la enzima mitocondrial alfa-cetoglutarato-deshidrogenasa en el contexto de la molécula MHC clase I Db.
Para ensayar la eficacia de un compuesto de ensayo en la activación y proliferación de las células T CD8 naturales, se aislaron suspensiones celulares individuales de células T 2C de los nódulos linfáticos (LN) de los ratones transgénicos 2C-TCR. Se estimularon las células 2C-T con esplenocitos irradiados TAP-/-H-2^{d} o con la línea celular TAP-/-T2 transfectada con L^{d} en presencia de concentraciones variables de péptido 2C (0-10 \muM). Se evaluó la proliferación por la incorporación de ^{3}H-timidina. El fenotipo de activación en la superficie celular de las células T se evaluó por análisis de citometría de flujo.
Las células T citotóxicas se generaron por activación de las células 2C-T con esplenocitos H-2^{d} irradiados. Se cultivaron las células durante 7-10 días en presencia de 25 U/ml de IL-2. La actividad agresora citotóxica de las células en cultivo se analizó con un ensayo de liberación de Cr^{51} usando células objetivo T2-L^{d} en presencia de concentraciones variables del péptido 2C. El efecto de los compuestos de ensayo sobre la diferenciación de las células T CD8 naturales hasta las células agresoras citotóxicas se evaluó por la adición de los compuestos de ensayo durante la activación primaria y el periodo de cultivo. El efecto de los compuestos de ensayo en la activación y función efectora de las células T CD8 citotóxicas se midió usando el ensayo de liberación de Cr^{51} y el ensayo de incorporación de ^{3}H-timidina en presencia de las concentraciones establecidas del compuesto.
Resultados y discusión
El ensayo de los compuestos 43 y 136 tanto en la reacción mixta de linfocitos (MLR) de una vía como en la de dos vías demostró la eficacia de ambos compuestos (aproximadamente 50% o más de inhibición de la proliferación a 20 \muM). Globalmente el mejor efecto se demostró para el compuesto 136 con casi 70% de inhibición usando cualquiera de los regímenes experimentales.
La inhibición de la proliferación de células T CD8+ se demostró también por estos compuestos con el efecto más fuerte una vez más para el compuesto 136 (aproximadamente 40% de inhibición a 5 \muM). Ambos compuestos fueron equipotentes (esto es aproximadamente 50% de inhibición a 5 \muM), en la inhibición de la función de célula agresora citotóxica de las mismas células T CD8+.
La proliferación de las células T CD8+ naturales se inhibió fuertemente por ambos compuestos 43 y 136 (más del 70% de inhibición a 5 \muM), mientras que las células T CD8+ que estaban ya diferenciadas en un fenotipo Th1 o Th2 demostraron menor inhibición en presencia de estos compuestos. Ambos compuestos demostraron sin embargo una inhibición más fuerte de las células Th1 (aproximadamente 30%) que de las Th2 (0 a 8%). Esto se reflejó también de algún modo en la extensión de la inhibición de la citoquina Th1 (IFN\gamma) frente a la citoquina Th2 (IL-4). Probablemente esto producirá a largo plazo la modulación a la baja o depresión de las citoquinas/fenotipo Th1 in vivo debido a su regulación por las citoquinas Th2. Este resultado por tanto prueba adicionalmente el hallazgo de esta invención de una depresión preferencial del fenotipo Th1 de las citoquinas sobre el fenotipo Th2 de las citoquinas cuando los compuestos de la invención (por ejemplo el compuesto 136 y el compuesto 43) se usan para medir la activación de las células CD4+ humanas primarias.
Los resultados de los estudios ex vivo discutidos antes indican: (a) el compuesto 136 y el compuesto 43 inhiben preferiblemente las células T CD4+ sobre las células T CD8+; (b) de las células T CD4+, las células T naturales fueron fuertemente inhibidas (>=80%) mientras que las células T comprometidas (Th1/Th2) no fueron impactadas tan fuertemente; (c) alguno de los compuestos, sin embargo, especialmente el compuesto 136, demostró una inhibición preferencial de la población comprometida Th1 sobre la población comprometida Th2 de las células T; (d) también mientras que la inhibición de las células T CD8+ no fue profunda, se observó la inhibición de su actividad "agresora" funcional para aquellos compuestos con actividad dual PDE 4/3; y (e) el inhibidor estándar de la fosfodiesterasa IV, rolipram, fue un inhibidor uniforme de todas las poblaciones de células T con poca o ninguna actividad diferencial.
Ensayo in vivo: modelo murino de trasplante con aloinjerto de la piel de la cola
Se evaluaron tres compuestos en un modelo de trasplante in vivo, a saber los compuestos 54, 41 y 136.
Métodos
La piel de la cola de los ratones donantes C57BL/6 H-2^{b} se trasplantó a ratones receptores hembras BALB/c H-2^{d} (Lagodzinski, Z. Et al., Immunology 71: 148-150 (1990)). Se incluyeron cinco ratones por grupo. Se incluyeron en el estudio siete grupos de ratones constituidos por cuatro grupos de ensayo tratados con los compuestos de ensayo y tres controles que incluyeron los grupos sin tratar, tratados con vehículo solo y tratados con ciclosporina A (CsA; Sigma, No. de catálogo C 3662). Los compuestos de ensayo y CsA se administraron dos veces al día intraperitonealmente a una dosis de 10 mg/kg empezando un día antes del trasplante y durante 15 días después del trasplante, incluyendo el día del trasplante. Los ratones fueron monitorizados y puntuados diariamente durante 15 días post-trasplante en cuanto al rechazo del injerto.
Resultados y discusión
El rechazo del aloinjerto de piel está mediado principalmente por los linfocitos T con pocos indicios de un mayor papel de los anticuerpos en la mayoría de las circunstancias. El rechazo del aloinjerto de piel requiere la activación de las poblaciones de células T ayudadoras y efectoras citotóxicas. El rechazo del injerto fue evaluado monitorizando la necrosis del aloinjerto. Debido a que la piel de la cola es visiblemente distinta de la piel que rodea el tronco del ratón, se puede monitorizar fácilmente el curso del rechazo. Los injertos completamente intactos se puntuaron como 100%. El rechazo completo del injerto se definió como > 90% de necrosis del injerto. El rechazo agudo del injerto generalmente tiene lugar por medio de una serie de sucesos visualmente obvios empezando con hinchazón y eritema del injerto. Estos sucesos van seguidos por la desecación del injerto y formación de costras sobre la mayor parte o todo el injerto, que señalan la pérdida del tejido viable del injerto. La formación de costras va seguida subsiguientemente por contracciones y formación de cicatrices.
Todos los compuestos ensayados de la presente invención demostraron una mejora significativa de la supervivencia del injerto en comparación con el grupo control (vehículo solo; \beta-ciclodextrina; Sigma, No. de catálogo C 4767) (Tabla 18)
TABLA 18
114
El grupo control tuvo una media de 8,5 días de supervivencia de los aloinjertos de piel mientras que los grupos tratados con los compuestos 54 y 41 tuvieron una media de 11 a 12 días de supervivencia. El compuesto 136 prolongó la supervivencia del injerto durante una media de 15,4 días y con ello excedió la capacidad del control positivo ciclosporina A (13,5 días). Además, la calidad global (% de rechazo de los injertos individuales) de los injertos supervivientes fue similar, si no mejor, que la de los obtenidos usando ciclosporina A.
Por comparación a la ciclosporina A, los compuestos de la invención son también adecuados para uso en todas las indicaciones en las que se usa la ciclosporina A. Las actividades diferenciales de estos compuestos así como sus selectividades en las citoquinas inhibidas aboga por un mecanismo que no dará como resultado la inmunodepresión sino en su lugar la inmunomodulación. La capacidad de estos compuestos para suprimir el rechazo del aloinjerto en este modelo implica que pueden ser de utilidad terapéutica en enfermedades tales como la esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, psoriasis, trasplante de órganos, y todos los trastornos autoinmunes. Por ejemplo, muchos fármacos para el tratamiento de la psoriasis se usan en el trasplante de órganos o han demostrado eficacia en este entorno. Por tanto, la eficacia de los fármacos inmunomoduladores o inmunodepresores en el trasplante de órganos parece predictiva de la eficacia en la psoriasis, siendo de buen pronóstico para esta serie de compuestos como un agente terapéutico para la psoriasis.
Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patentes mencionadas en esta memoria descriptiva se incorporan aquí como referencia, en la misma medida como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual fuera específica e individualmente incorporada como referencia.
De todo lo anterior, se podrá apreciar que aunque se han descrito aquí realizaciones específicas de la invención con fines de ilustración, se pueden hacer diferentes modificaciones.
Por tanto, la invención no está limitada por los ejemplos específicos proporcionados aquí.

Claims (38)

1. Una composición que comprende un compuesto según la fórmula (1) y sus sales, solvatos, estereoisómeros aislados, y mezclas, y un vehículo, diluyente, o excipiente, farmacéuticamente aceptable,
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donde cada uno de los hidrógenos H_{a}, H_{b}, H_{c}, H_{d}, H_{e}, H_{f} y H_{g} puede estar independientemente reemplazado con un grupo seleccionado entre -W y -R^{7}(W)_{n}, y M_{1} representa -W o -R^{7}(W)_{n}, donde
W se selecciona entre -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8},
-NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, -OR^{8}, -BH_{2}, -BHR^{8}, -BR^{8}R^{8}, -BO_{2}H_{2}, -BO_{2}R^{8}R^{8}, -PH_{2}, -PHR^{8}, -PR^{8}R^{8}, -PO_{2}R^{8}R^{8}, -PO_{3}R^{8}R^{8}, -SR^{8}; -SOR^{8}, -SO_{2}R^{8}, -SONH_{2}, -SONHR^{8}, -SONR^{8}R^{8}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NHR^{8} y -SO_{2}NR^{8}R^{8};
R^{7} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30}, donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R^{7} están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición;
R^{8} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30};
n se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y
X se selecciona entre -Br, -Cl, -F, -I.
2. Una composición según la reivindicación 1, en la que H_{a} y H_{b} son hidrógeno.
3. Una composición según la reivindicación 1, en la que H_{a} es hidrógeno y H_{b} es -W.
4. Una composición según la reivindicación 1, en la que H_{a} es hidrógeno y H_{b} es -R^{7}(W)_{n}.
5. Una composición según las reivindicaciones 3 ó 4, en la que el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración S.
6. Una composición según las reivindicaciones 3 ó 4, en la que el carbono al que está unido H_{b} tiene una configuración R.
7. Una composición según la reivindicación 4, en la que H_{b} es -CH_{2}-fenilo, y el fenilo tiene 0, 1, o 2 sustituciones W.
8. Una composición según la reivindicación 1, en la que H_{c} es W.
9. Una composición según la reivindicación 1, en la que H_{d} y H_{e} son ambos hidrógeno.
10. Una composición según la reivindicación 1, en la que H_{f} es W.
11. Una composición según la reivindicación 10, en la que H_{f} se selecciona entre -OH y -OR^{8}.
12. Una composición según la reivindicación 10, en la que H_{f} se selecciona entre metoxi, etoxi, propoxi, ciclopentiloxi, ciclohexiloxi, benciloxi, -NH_{2}, -NHR^{8}, y -NR^{8}R^{8}.
13. Una composición según la reivindicación 1, en la que H_{g} es -R^{7}(W)_{n}.
14. Una composición según la reivindicación 1, en la que M_{1} es -W.
15. Una composición según la reivindicación 14, en la que M_{1} es metoxi, etoxi, propoxi, ciclopentiloxi, ciclohexiloxi, benciloxi, -NH_{2}, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -OR o -OR^{8}.
16. Una composición según la reivindicación 1, en la que M_{1} es -R^{7}(W)_{n}.
17. Una composición según la reivindicación 1, en la que el compuesto de la fórmula (1) tiene la estereoquímica de la fórmula (1a)
116
o la estereoquímica de la fórmula (1b)
117
18. Una composición que comprende un compuesto según la fórmula (2) y sus sales, solvatos, estereoisómeros aislados, y mezclas, y un vehículo, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable,
118
donde cada uno de los hidrógenos H_{a}, H_{b}, H_{c}, H_{d}, H_{e}, H_{f} y H_{g} puede estar independientemente reemplazado con un grupo seleccionado entre -W y - R^{7}(W)_{n}, y M_{2} representa -W, donde
W se selecciona entre -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, -OR^{8}, -PH_{2}, -PHR^{8}, -PR^{8}R^{8}, -PO_{2}R^{8}R^{8}, -PO_{3}R^{8}R^{8}, -SR^{8}; -SOR^{8}, -SO_{2}R^{8}, -SONH_{2}, -SONHR^{8}, -SONR^{8}R^{8}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NHR^{8} y -SO_{2}NR^{8}R^{8};
R^{7} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30}, donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R^{7} están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición;
n se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y
X se selecciona entre -Br, -Cl, -F, -I.
19. Un compuesto según la fórmula (3) y sus sales, solvatos, estereoisómeros aislados, y mezclas,
119
donde cada uno de los hidrógenos H_{a}, H_{c}, H_{d}, H_{e}, H_{f} y H_{g} puede estar independientemente reemplazado con un grupo seleccionado entre -W y -R^{7}(W)_{n}, y H_{b} puede estar reemplazado con -W, donde
W se selecciona entre -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, -OR^{8}, -BH_{2}, -BHR^{8}, -BR^{8}R^{8}, -BO_{2}H_{2}, -BO_{2}R^{8}R^{8}, -PH_{2}, -PHR^{8}, -PR^{8}R^{8}, -POR^{8}, -PO_{2}R^{8}, -PO_{3}R^{8}, -SR^{8}; -SOR^{8}, -SO_{2}R^{8}, -SONH_{2}, -SONHR^{8}, -SONR^{8}R^{8}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NHR^{8} y -SO_{2}NR^{8}R^{8};
R^{7} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30}, donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R^{7} están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición;
R^{8} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30};
n se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y
X se selecciona entre -Br, -Cl, -F, -I;
con la condición de que al menos dos de H_{e}, H_{f}, y H_{g} no son hidrógeno.
20. Un compuesto según la fórmula (3) y sus sales, solvatos, estereoisómeros aislados, y mezclas,
120
donde cada uno de los hidrógenos H_{a}, H_{c}, H_{d}, H_{e}, H_{f} y H_{g} puede estar independientemente reemplazado con un grupo seleccionado entre -W y -R^{7}(W)_{n}, y H_{b} puede estar reemplazado con -W, donde
W se selecciona entre -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, -OR^{8}, -BH_{2}, -BHR^{8}, -BR^{8}R^{8}, -BO_{2}H_{2}, -BO_{2}R^{8}R^{8}, -PH_{2}, -PHR^{8}, -PR^{8}R^{8}, -POR^{8}, -PO_{2}R^{8}, -PO_{3}R^{8}, -SR^{8}; -SOR^{8}, -SO_{2}R^{8}, -SONH_{2}, -SONHR^{8}, -SONR^{8}R^{8}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NHR^{8} y -SO_{2}NR^{8}R^{8};
R^{7} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30}, donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R^{7} están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición;
R^{8} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30};
n se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y
X se selecciona entre -Br, -Cl, -F, -I;
con la condición de que H_{g} no es R^{7}(W)_{n}.
21. Un compuesto según la fórmula (3) y sus sales, solvatos, estereoisómeros aislados, y mezclas,
121
donde cada uno de los hidrógenos H_{a}, H_{c}, H_{d}, H_{e}, H_{f} y H_{g} puede estar independientemente reemplazado con un grupo seleccionado entre -W y -R^{7}(W)_{n}, y H_{b} puede estar reemplazado con -W, donde
W se selecciona entre -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, -OR^{8}, -BH_{2}, -BHR^{8}, -BR^{8}R^{8}, -BO_{2}H_{2}, -BO_{2}R^{8}R^{8}, -PH_{2}, -PHR^{8}, -PR^{8}R^{8}, -POR^{8}, -PO_{2}R^{8}, -PO_{3}R^{8}, -SR^{8}; -SOR^{8}, -SO_{2}R^{8}, -SONH_{2}, -SONHR^{8}, -SONR^{8}R^{8}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NHR^{8} y -SO_{2}NR^{8}R^{8};
R^{7} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30}, donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R^{7} están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición;
R^{8} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30};
n se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y
X se selecciona entre -Br, -Cl, -F, -I;
con la condición de que H_{g} no es ni hidrógeno ni R^{7}(W)_{n}.
22. Un compuesto según la fórmula (4) y sus sales, solvatos, estereoisómeros aislados, y mezclas,
122
donde, Q se selecciona entre O, S, NH y NR^{8}; y
cada uno de los carbonos de las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, y 19 en la fórmula (4), está independientemente sustituido en cada caso con H, -W o -R^{7}(W)_{n}, donde
W se selecciona entre -NH_{2}, -CONH_{2}, -COOH, -CN, -CHO, -OCHO, -X, -OH, -NO_{2}, -SH, -COX, -NHR^{8}, -NR^{8}R^{8}, -CONHR^{8}, -CONR^{8}R^{8}, -COOR^{8}, -COR^{8}, -OCOR^{8}, -OR^{8}, -BH_{2}, -BHR^{8}, -BR^{8}R^{8}, -BO_{2}H_{2}, -BO_{2}R^{8}R^{8}, -PH_{2}, -PHR^{8}, -PR^{8}R^{8}, -POR^{8}, -PO_{2}R^{8}, -PO_{3}R^{8}, -SR^{8}; -SOR^{8}, -SO_{2}R^{8}, -SONH_{2}, -SONHR^{8}, -SONR^{8}R^{8}, -SO_{2}NH_{2}, -SO_{2}NHR^{8} y -SO_{2}NR^{8}R^{8};
R^{7} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30}, donde n de los átomos de hidrógeno o halógeno de R^{7} están sustituidos con un número igual de grupos W independientemente seleccionados en cada posición;
R^{8} es un grupo hidrocarbilo, halocarbilo o hidrohalocarbilo, de C_{1}-C_{30};
n se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4 y 5; y
X se selecciona entre -Br, -Cl, -F, -I,
con la condición de que Q es NH y las posiciones 17 y 18 no están ambas sustituidas con hidrógeno.
23. Una composición que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, y un vehículo, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable.
24. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y 23, o un compuesto según las reivindicaciones 19-22, para uso en un método para tratar o prevenir una condición o enfermedad inflamatoria en un paciente, que comprende administrar al paciente que lo necesite una cantidad de dicha composición o compuesto, cuya cantidad es eficaz para tratar o prevenir la condición o enfermedad inflamatoria del paciente.
25. Una composición o compuesto según la reivindicación 24, donde la condición o enfermedad inflamatoria es una condición o enfermedad autoinmune o incluye la inflamación aguda o crónica de los compartimentos de huesos y/o cartílago de las articulaciones, o es una artritis seleccionada entre artritis reumatoide, artritis gotosa o artritis reumatoide juvenil, o es asma, o está asociada con la disrregulación de las células T, o está asociada con niveles elevados de citoquinas inflamatorias, o es esclerosis múltiple o es sarcoidosis pulmonar o es inflamación ocular o alergia o es una enfermedad inflamatoria del intestino o es una enfermedad inflamatoria cutánea.
26. Una composición o compuesto según la reivindicación 25, donde la citoquina inflamatoria es IL-2 o IFN-\gamma o es TNF-\alpha.
27. Una composición o compuesto según la reivindicación 25, donde la enfermedad inflamatoria del intestino es la enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa.
28. Una composición o compuesto según la reivindicación 25, donde la enfermedad inflamatoria cutánea es psoriasis o dermatitis.
29. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y 23, o un compuesto según las reivindicaciones 19-22, para uso en un método para modular los niveles intracelulares de adenosina-5'-monofosfato cíclico en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad de dicha composición o compuesto, cuya cantidad es eficaz para modular los niveles intracelulares de adenosina-5'-monofosfato cíclico del paciente.
30. Un compuesto o composición según la reivindicación 29, donde el paciente tiene una condición o enfermedad inflamatoria.
31. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y 23, o un compuesto según las reivindicaciones 19-22, para uso en un método para tratar o prevenir una enfermedad o condición en un paciente, cuya enfermedad o condición está asociada con condiciones patológicas que se modulan inhibiendo las enzimas asociadas con mensajeros celulares secundarios, comprendiendo el método administrar a un paciente que lo necesite una cantidad de dicha composición o compuesto, cuya cantidad es eficaz para tratar o prevenir una enfermedad o condición asociada con condiciones patológicas que se modulan inhibiendo las enzimas asociadas con mensajeros celulares secundarios.
32. Una composición o compuesto según la reivindicación 31, donde la enzima es una fosfodiesterasa o fosfodiesterasa 4 o fosfodiesterasa 3 de AMP-cíclico, o donde la enzima es una fosfodiesterasa de GMP-cíclico.
33. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y 23, o un compuesto según las reivindicaciones 19-22, para uso en un método para tratar o prevenir el rechazo de un trasplante en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad de dicha composición o compuesto, cuya cantidad es eficaz para tratar o prevenir el rechazo del trasplante en el paciente.
34. Una composición o compuesto según la reivindicación 33, donde el rechazo es debido a la enfermedad del injerto frente al hospedante.
35. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y 23, o un compuesto según las reivindicaciones 19-22, para uso en un método para tratar o prevenir la proliferación celular incontrolada en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad de dicha composición o compuesto, cuya cantidad es eficaz para tratar o prevenir la proliferación celular incontrolada en el paciente.
36. Una composición o compuesto según la reivindicación 35, donde la proliferación celular incontrolada es causada por un cáncer seleccionado entre la leucemia y los tumores sólidos.
37. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y 23, o un compuesto según las reivindicaciones 19-22, para uso en un método para tratar o prevenir enfermedades asociadas con el sistema nervioso central (CNS) en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad de dicha composición o compuesto, cuya cantidad es eficaz para tratar o prevenir las enfermedades asociadas con el sistema nervioso central (CNS) en el paciente.
38. Una composición o compuesto según la reivindicación 37, donde la enfermedad asociada con el sistema nervioso central (CNS) es depresión.
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