PT1409467E

PT1409467E - Inibidor de n-acil-esfingosina-glucosiltransferase

Info

Publication number: PT1409467E
Application number: PT02750099T
Authority: PT
Inventors: Bradford H Hirth; Craig Siegel; James A Shayman; Carol Anne Nelson; David J Harris; Diane Copeland
Original assignee: Univ Michigan; Genzyme Corp
Priority date: 2001-07-16
Filing date: 2002-07-16
Publication date: 2012-10-24
Also published as: EP2067775B1; CA2453978C; JP6182254B2; ES2395463T3; DK1409467T3; EP1409467B1; PT2266968E; JP4708073B2; CY2015028I1; BR122015016313B1; ATE554082T1; FR15C0036I1; IL159905A0; US20210171507A1; DK2067775T3; EP2266968A3; BE2015C029I2; US9546161B2; JP2013136618A; ATE555102T1

Description

ΕΡ 1 409 467/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Inibidor de N-acil-esfingosina-glucosiltransferase"

Antecedentes do invento

Os glicosfingolípidos (GSLs) são uma classe de compostos de ocorrência natural que possuem uma multitude de funções biológicas, incluindo a capacidade de promover o crescimento celular, diferenciação celular, aderência entre células ou entre células e proteínas de matriz, ligação de microorganismos e vírus a células, e células de metástases tumorais. Os GSLs são derivados a partir de glucosilceramida (GlcCer), que é produzida a partir de ceramida e UDP-glucose pela enzima UDP-glucose: IV-acil-esf ingosina-glucosiltransf erase (GlcCer-sintase) . A estrutura da ceramida é mostrada em seguida:

O

OH

Ceramida A acumulação de GSLs foi ligada a um número de doenças, incluindo as doenças de Tay-Sachs, de Gaucher e de Fabry (ver, por exemplo, Patente U.S. No. 6051598) . Os GSLs foram também ligados a certos cancros. Por exemplo, constatou-se que certos GSLs ocorrem apenas em tumores ou a concentrações anormalmente elevadas em tumores; exercem marcadas acções estimuladoras ou inibidoras no crescimento de tumores quando adicionados a células tumorais em meios de cultura; e inibem o normal sistema imunitário do corpo quando extravasados por tumores para o fluido extracelular circundante. A composição de um GSL de tumor modifica-se à medida que os tumores se tornam crescentemente malignos e anticorpos para certos GSLs inibem o crescimento de tumores. 2 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ

Os compostos que inibem a GlcCer-sintase podem reduzir as concentrações de GSL e foi reportado que são úteis para o tratamento de um indivíduo com uma das doenças anteriormente mencionadas. Um número de inibidores potentes de GlcCer, aqui referidos como "compostos amino do tipo ceramida", são divulgados nas Patentes U.S. Nos. 6051598, 5952370, 5945442, 5916911 e 6030995. O termo "compostos do tipo ceramida" refere-se a análogos de ceramida em que: 1) o álcool primário é substituído por um grupo amino substituído; e 2) o grupo alcenilo é substituído por um grupo arilo, preferivelmente fenilo ou fenilo substituído. Os compostos N-desacilados correspondentes são referidos como "compostos do tipo esfingosina".

Infelizmente, os processos conhecidos para preparação de compostos amino do tipo ceramida são pouco adequados para o fabrico à escala industrial. Devido aos dois centros quirais, a maior parte das sínteses conhecidas gera quatro diastereoisómeros, o que resulta na necessidade de separar os diastereoisómeros por cromatografia e isolar o desejado enantiómero por cristalização após derivatização com reagente opticamente activos, e.g., isómeros de ácido dibenzoíl-tartárico (ver, por exemplo, Inokuchi e Radin, Journal of Lipid Research 28:565 (1987)). Nenhum dos processos é condutível em preparações em grande escala. A síntese enantiosselectiva de compostos amino do tipo ceramida utilizando reduções diastereosselectivas foi reportada (Mitchell, et al., J. Org. Chem. 63:8837 (1998) e Nishida, et al., SYNLETT 1998 :389 (1998)), mas requer mais de dez passos, alguns dos quais utilizam reagentes caros tais como hidreto de diisobutilalumínio (DIABAL) e aldeído de Garner ((R)-( + )-4-formil-2,2-dimetil-3-oxazolidinacarboxilato de tert-butilo). Assim, existe uma necessidade crítica de uma síntese enantiosselectiva de compostos amino do tipo ceramida que seja mais económica e eficiente, e envolva um menor número de passos do que as sínteses conhecidas.

Lee et al. (J. Biol. Chem., 247 (21), pp. 14662-14669 (1999)) divulgam inibidores específicos de glucosilceramida-sintase. Em particular, Lee et al. divulgam apenas compostos que possuem um grupo alcanoílo C16 (palmitoílo) no átomo de azoto da amida. 3 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ

Sumário do invento É aqui proporcionada uma síntese eficiente e altamente enantiosselectiva de compostos amino do tipo ceramida. Esta síntese de compostos amino do tipo ceramida envolve apenas cinco passos a partir de compostos conhecidos. Por exemplo, o composto comparativo do tipo ceramida designado como "Composto 5" na Figura 1 foi produzido num excesso enantiomérico de pelo menos 99,6% e com um rendimento global de 9% (ver Exemplo comparativos 1 e 2). São também divulgados novos intermediários preparados no decurso da síntese.

Num primeiro aspecto, o invento refere-se a um composto de acordo com a reivindicação 1. Uma concretização adicional do composto é apresentada na reivindicação 2. 0 invento, noutros aspectos, proporciona as utilizações dos compostos tal como apresentadas nas reivindicações 3 a 9.

Breve descrição das Figuras A Figura 1 é um esquema que mostra a síntese do Composto comparativo (5) do tipo ceramida, utilizando o processo aqui divulgado. A Figura 2 é um esquema que mostra a síntese do Composto comparativo (13) do tipo ceramida, utilizando os processos aqui divulgados. A Figura 3 mostra as estruturas dos Compostos (5)-(8).

Descrição detalhada do invento

Exemplos das condições específicas para realizar as reacções aqui descritas são proporcionados nos Exemplos comparativos 1 e 2. O termo "enantiómero", tal como aqui utilizado, e fórmulas estruturais que ilustram um enantiómero pretendem incluir o enantiómero "puro", isento do seu isómero óptico, assim como misturas do enantiómero e seu isómero óptico em que o enantiómero está presente num excesso enantiomérico, 4 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ e.g., de pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 98%, ou 99% de excesso enantiomérico.

Os compostos deste invento que possuem um grupo suficientemente acídico, suficientemente básico, ou ambos grupos funcionais, podem em conformidade reagir com qualquer um de um número de bases inorgânicas, e ácidos inorgânicos e orgânicos, para formar um sal. São proporcionados sais fisiologicamente aceitáveis. Os ácidos habitualmente empregues para formar sais de adição de ácido são ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromidrico, ácido iodídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, e ácidos orgânicos tais como ácido p-toluenossulfónico, ácido metanossulfónico, ácido oxálico, ácido p-bromofenilsulfónico, ácido carbónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzóico e ácido acético. Exemplos de tais sais incluem o sulfato, pirossulfato, bissulfato, sulfito, bissulfito, fosfato, mono-hidrogenofosfato, di-hidrogenofosfato, meta-fosfato, pirofosfato, cloreto, brometo, iodeto, acetato, propionato, decanoato, caprilato, acrilato, formato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, butino-1,4-dioato, hexino-1,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxi-benzoato, ftalato, sulfonato, xilenossulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, gama-hidroxibutirato, glicolato, tartarato, metanossulfonato, propanossulfonato, naftaleno-l-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato e mandelato.

Sais de adição de base incluem os derivados a partir de bases inorgânicas, tais como hidróxidos, carbonatos e bicarbonatos de amónio ou metais alcalinos ou alcalino-terrosos. Tais bases úteis na preparação dos sais deste invento incluem assim hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amónio e carbonato de potássio. 5 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ

Exemplificação

Exemplo comparativo 1 - Preparação em pequena escala de compostos do tipo ceramida

Intermediário 1 (l.R,35,55,8a5)-l,3-Bis-(2',3' -di-hidro-benzo [l,4]dioxin-6'-il)-5-fenil-tetra-hidro-oxazolo[4,3-c][1,4]oxazin-8-ona

A uma solução agitada de (5Sj-5-fenilmorfolin-2-ona (2,00 g, 11,3 mmol) (preparada tal como em Dellaria, J.F.; Santarsiero, B.D., J. Org. Chem., 1989, 54, 3916) e 1,4- benzodioxan-6-carboxaldeído (5,56 g, 33,9 mmol) em tolueno o (125 mL) adicionaram-se peneiros moleculares de 4A (aproximadamente 20 mL). A mistura foi aquecida a refluxo durante 72 horas, filtrada para ficar isenta de peneiros e concentrada. A goma âmbar resultante foi cromatografada instantaneamente sobre sílica (éter dietílico/hexano) para proporcionar um sólido amarelo pálido. Este material foi purificado adicionalmente por trituração com éter dietílico para proporcionar 1,89 g (34%) de produto como um sólido branco esponjoso: ΧΗ RMN (CDCI3) δ 7,31-7,17 (m, 5H) , 6,95- 6,79 (m, 5H), 5,32-5,27 (m, 2H), 4,43-4,28 (m, 2H), 4,24 (s, 4H), 4,18 (m, 4H), 4,16-4,08 (m, 2H) ppm.

Intermediário 2 (25, 3.R, 1" 5) -3 - (2' , 3' -Di-hidro-benzo [l,4]dioxin-6'-il)-3-hidroxi-2-(2"-hidroxi-l"-fenil-etilamino)-1-pirrolidin-l-il-propan-l-ona

6 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ A uma solução agitada do Intermediário 1 (1,80 g, 3,69 mmol) em clorofórmio (20 mL) adicionou-se pirrolidina (2,0 mL, 24 mmol). A solução foi agitada durante a noite e depois concentrada. A espuma incolor aderente resultante foi tomada em metanol (16 mL) e ácido cloridrico IN (4 mL) . A mistura foi levada a refluxo durante 1 hora, tratada com ácido cloridrico IN adicional (2 mL) e levada a refluxo durante outras 2 horas. A solução reaccional foi concentrada e o resíduo resultante repartido entre acetato de etilo e uma solução aquosa de bicarbonato de sódio. A camada orgânica foi seca (sulfato de sódio) e concentrada. A goma amarelo pálido resultante foi purificada por cromatografia instantânea sobre sílica gel (diclorometano/amoníaco metanólico 2N) para proporcionar 1,40 g (92%) de Intermediário 2 como um sólido espumoso incolor: XH RMN (CDCI3) δ 7,31-7,13 (m, 5H) , 6,93-6,70 (m, 3H), 4,47 (d, J= 8,5, 1H) , 4,18 (s, 4H) , 3,82 (t, J=5, 9, 1H) , 3,74 (d, J=6,0, 2H) , 3,06 (d, J= 8,5, 1H) , 3,06-2,97 (m, 1H), 2,92-2,83 (m, 1H), 1,97-1,87 (m, 1H), 1,45-1,15 (m, 4H) ppm.

Intermediário 3 (1-R, 2 R, 1"S) -1- (2' , 3' -Di-hidro-benzo [l,4]dioxin-6'-il)-2-(2"-hidroxi-l"-fenil-etilamino)-3-pirrolidin-l-il-propan-l-ol

A uma solução agitada do Intermediário 2 (1,38 g, 3,35 mmol) em tetra-hidrofurano (30 mL) adicionou-se hidreto de alumínio e lítio (0,26 g, 6,9 mmol). A suspensão espumosa foi agitada durante a noite e depois neutralizada com a adição (gota a gota até cessar a formação de espuma) de solução aquosa de hidróxido de sódio IN (13 mL) . A mistura foi diluída com água e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica foi seca (sulfato de sódio) e concentrada para proporcionar uma goma incolor. Cromatografia instantânea sobre sílica gel (diclorometano/amoníaco metanólico 2N) 7 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ proporcionou 0,94 g (70%) de produto como uma espuma aderente e incolor: XH RMN (CDCI3) δ 7,36-7, 17 (m, 5H) , 6,88- -6, 74 (m 3H), 4,42 (d, J=5, 4, 1H), 4,26 (s, , 4H), 3,79-3,69 (m, 1H) 3,64-3,56 (m, 1H), 3,55-3, 45 (m, 1H), 3,00-2,90 (m, 1H) 2,67-2,57 (m, 1H), 2,43-2,32 (m, 4H) , 2,25-2,15 (m, 1H) 1,75-1,65 (m, 4H) ppm.

Intermediário 4 (IR,2R)-2-Amino-l-{2',3'-di-hidro-benzo[1,4]dioxin-6'-il)-3-pirrolidin-l-il-propan-l-ol

Numa bomba reaccional de elevada pressão equipada com um agitador mecânico carregou-se uma solução do Intermediário 3 (0,91 g, 2,28 mmol) em metanol/água 10:1 (22 mL) , ácido trifluoroacético (0,18 mL, 2,3 mmol) e hidróxido de paládio a 20% sobre carbono (catalisador de Perlman; 0,91 g). O reactor foi evacuado e cheio com árgon três vezes e depois evacuado e cheio com hidrogénio (100 psi) . A mistura reaccional foi agitada durante 2 dias e depois evacuada e soprada com azoto. A solução reaccional foi filtrada através de Celite e concentrada. A goma cinzento-esverdeado resultante foi sujeita a cromatografia instantânea sobre sílica gel (diclorometano/amoníaco metanólico 2N) para proporcionar 0,165 g (26%) de produto como uma goma quase incolor: 1H RMN (CDC13) δ 6, 89-6, 76 (m, 3H) , 4,54 (d, J=3, 7, 1H) , 4,25 (s, 4H) , 3,43 (s, 1H), 3,14-3,07 (m, 1H) , 2,68-2,41 (m, 6H) , 1,82-1,71 (m, 4H) ppm.

Composto 5 [2 - (2',3'-di-hidrobenzo[1,4]dioxin-6'-il)-2-hidroxi-l-pirrolidin-l-ilmetiletil]amida de ácido (IR,2R)-hexadecanóico ΕΡ 1 409 467/ΡΤ

A uma solução agitada do Intermediário 4 (0,165 g, 0,593 mmol) em diclorometano (8 mL) juntou-se cloreto de palmitoílo (0,18 g, 0,59 mmol) seguido de N,N-diisopropiletilamina (0,11 mL, 0,65 mmol). A solução foi agitada durante 2 horas e depois concentrada. O resíduo foi repartido entre acetato de etilo e uma solução aquosa de bicarbonato de sódio. A camada orgânica foi seca (sulfato de sódio) e concentrada. O sólido esbranquiçado resultante foi sujeito a cromatografia instantânea sobre sílica gel (diclorometano/amoníaco metanólico 2N) para proporcionar 0,174 g (57%) de produto como um sólido branco. Comparações por espectroscopia de 1H RMN e HPLC quiral analítica (coluna: Chirex (S)-VAL e (R)-NE, 4,6x250 mm; eluente: ácido trifluoroacético a 0,5% em hexano/diclorometano/etanol 67:31:2; caudal: 1 mL/min;

detecção 280 nM) demonstraram que este material era idêntico a uma amostra do mesmo composto preparado pelo processo de Polt, et al. (J. Org. Chem., 1998, 63, 8837). O excesso enantiomérico foi determinado como sendo de 99,6%. A contaminação total a partir dos dois diastereoisómeros possíveis foi determinada como sendo de 0,2%. ΧΗ RMN (CDCI3) δ 6, 88-6, 73 (m, 3H) , 5,84 (d, J= 7,3, 1H) , 4,90 (d, J= 3,8, 1H) , 4,24 (s, 4H) , 4,22-4,15 (m, 1H) , 2, 86-2, 72 (m, 2H) , 2,72-2,55 (m, 4H) , 2,10 (t, J=1,5, 2H) , 1, 82-1, 74 (m, 4H) , 1,58-1,46 (m, 2H), 1,32-1,16 (m, 24H), 0,88 (t, J=6,7, 3H) ppm.

Exemplo comparativo 2 - Preparação em larga escala de compostos do tipo ceramida (5 S)-5-Fenilmorfolin-2-ona

Ph. o ^ nh2 l OPh

Ph. CHjCN -► ΌΗ

Br H 1

9 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ

Preparou-se uma solução de S-(+)-fenilglicinol (Aldrich, 10,17 g, 78,12 mmol) e diisopropiletilamina (Aldrich, 34 mL, 195 mmol, 2,5 equivalentes) em CH3CN (200 mL) . Esta solução foi adicionada a α-bromoacetato de fenilo (18,48 g, 85,9 mmol, 1,1 equivalentes) dissolvido em CH3CN (50 mL) sob azoto, gota a gota durante 2 horas. A solução resultante foi agitada sob azoto durante 16-20 horas. O solvente foi removido por roto-evaporação, mantendo a temperatura do banho inferior a 25°C. Ao óleo juntou-se acetato de etilo (120 mL) e a mistura foi agitada durante 15 minutos. O precipitado branco resultante foi removido por filtração e o sólido lavado com acetato de etilo (25 mL) . O filtrado foi roto-evaporado até ficar um óleo, mantendo a temperatura do banho inferior a 25°C. Após secagem sob vácuo durante 0,5 horas, o óleo foi dissolvido em CH2CI2 (17 mL) e carregado numa coluna de sílica gel (60 g cheia com acetato de etilo a 10%/hexanos). As manchas superiores de subprodutos foram eluidas com acetato de etilo a 10%/hexanos e o produto foi eluído com acetato de etilo a 50%/hexanos-100% de acetato de etilo. As fracções contendo o produto foram roto-evaporadas até ficar um óleo, mantendo a temperatura do banho inferior a 25°C. Este óleo foi dissolvido em acetato de etilo (12 mL) e juntaram-se hexanos (60 mL) lentamente num banho de gelo para precipitar o produto. 0 precipitado resultante foi filtrado. O sólido branco a amarelo foi seco sob vácuo. A (5S)-5-fenil-morfolin-2-ona obtida (7,4 g, 41,8 mmol, 53%) foi utilizada directamente no passo seguinte.

Intermediário 1 (1-R, 35, 55, 8a5) -1,3-Bis- (2' ,3' -di-hidrobenzo [l,4]dioxin-6'~ il)-5-feniltetra-hidro-oxazolo[4,3-c][1,4]oxazin-8-ona

Dissolveram-se (5 S)-5-fenilmorfolin-2-ona (7,4 g, 41,8 mmol) e benzodioxolano-6-carboxaldeído (Aldrich ou Alfa 10 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ

Aesar, 20,56 g, 125,2 mmol, 3,0 equivalentes) em tolueno (180 mL) . A solução foi colocada num aparelho extractor soxhlet cheio de peneiros moleculares de 4 À (cerca de 30 g) . A solução foi levada a refluxo sob azoto durante 2-3 dias. Após arrefecimento até temperatura ambiente, o solvente foi removido por roto-evaporação e o óleo foi dissolvido em acetato de etilo (200 mL). Juntou-se uma solução de bissulfito de sódio (Aldrich, 50 g) em água (100 mL) e a mistura de duas fases foi agitada a temperatura ambiente durante 1 hora. O sólido branco resultante foi removido por filtração e lavado com acetato de etilo. O filtrado foi colocado num funil de separação e as camadas separadas. A camada orgânica foi lavada com água (100 mL) e solução saturada de cloreto de sódio (100 mL) . A solução seca (Na2S04) foi filtrada e roto-evaporada até ficar um óleo espumoso amarelo-vermelho (23,11 g) . Após secagem sob vácuo durante 1 hora, juntou-se éter dietilico (350 ml) e a mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 16-20 horas. O sólido branco-amarelo resultante foi filtrado. O sólido foi seco sob vácuo. O cicloaducto foi obtido num rendimento de 46% (9,34 g) .

Intermediário 2 (2 5, 3.R, l"5)-3-(2',3' -Di-hidrobenzo [l,4]dioxin-6'-il)-3-hidroxi-2-(2"-hidroxi-l"-fenil-etilamino)-1-pirrolidin-l-il-propan-l-ona

Ao cicloaducto (Intermediário 1, 6,7 g, 13,74 mmol) dissolvido em diclorometano (40 mL) juntou-se pirrolidina (Aldrich, 5,7 mL, 68,7 mmol, 5 equivalentes). A solução foi agitada sob azoto a temperatura ambiente durante 16-18 horas. O solvente foi roto-evaporado para proporcionar um óleo espumoso amarelo que foi seco sob vácuo durante 0,5 horas. 0 produto bruto foi dissolvido em metanol (115 mL) e juntou-se uma solução aquosa de HC1 1M (115 mL). A solução foi levada a refluxo durante 4 horas. Após arrefecimento a temperatura 11 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ ambiente, ο metanol foi removido por roto-evaporação. Juntou-se acetato de etilo (60 mL) e o sistema de duas fases foi agitado a temperatura ambiente durante 5-15 minutos. As duas camadas foram separadas e a camada orgânica foi extraída com HC1 1M (30 mL) . As camadas aquosas combinadas foram lavadas com acetato de etilo (60, 30 mL) . Juntou-se lentamente uma solução saturada de bicarbonato de sódio (150 mL) à camada aquosa. O produto foi extraído três vezes com acetato de etilo (60 mL) a partir da camada aquosa básica (pH = 8-9). As camadas orgânicas combinadas contendo o produto foram lavadas com uma solução saturada de cloreto de sódio (30 mL) . Após secagem com Na2S04 a solução foi filtrada e roto-evaporada para proporcionar um sólido amarelo. O Intermediário 2 foi obtido num rendimento de 93% (5,26 g).

Intermediário 3 (IA, 2.R, l"5j-l-(2',3' -Di-hidrobenzo [l,4]dioxin-6'-il)-2-(2-hidroxi-l"-fenil-etilamino)-3-pirrolidin-l-il-propan-l-ol

O OH OH

OH OH A um frasco de 3 tubuladuras equipado com funil de adição e condensador juntaram-se LiAlH4 (Aldrich, 1,2 g, 31,7 mmol, 2,5 equivalentes) e THF anidro (20 mL) sob azoto. Adicionou-se gota a gota à reacção durante 15-30 minutos uma solução de Intermediário 2 (5,23 g, 12,68 mmol) em THF anidro (75 mL) . A reacção foi levada a refluxo sob azoto durante 9 horas. A reacção foi arrefecida num banho de gelo e juntou-se cuidadosamente gota a gota uma solução de NaOH 1M. Após agitação a temperatura ambiente durante 15 minutos, juntaram-se água (50 mL) e acetato de etilo (75 mL) . As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída duas vezes com acetato de etilo (75 mL) . As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com uma solução saturada de cloreto de sódio (25 mL) . Após secagem com Na2S04, a solução foi filtrada e roto-evaporada para proporcionar um óleo espumoso de incolor 12 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ a amarelo. Ο Intermediário 3 foi obtido num rendimento de 99% (5,3 g).

Intermediário 4 (1R,2R)-2-Amino-l-(2',3'-di-hidrobenzo[1,4]dioxin-6'-il)-3-pirrolidin-l-il-propan-l-ol

0 Intermediário 3 (5,3 g, 13,3 mmol) foi dissolvido em metanol (60 mL) . Adicionaram-se água (6 mL) e ácido trifluoroacético (2,05 mL, 26,6 mmol, 2 equivalentes). Após ter sido colocado sob azoto, juntou-se hidróxido de paládio a 20% sobre carbono (catalisador de Pearlman, Lancaster ou Aldrich, 5,3 g) . A mistura foi colocada num dispositivo de Reactor Pressurizado Parr com inserção de vidro. O dispositivo foi colocado sob azoto e depois sob uma pressão de hidrogénio de 110-120 psi. A mistura foi agitada durante 2-3 dias a temperatura ambiente sob pressão de hidrogénio de 100-120 psi. A mistura reaccional foi colocada sob azoto e filtrada através de uma almofada de celite. A almofada de celite foi lavada com metanol (100 mL) e água (100 mL) . 0 metanol foi removido por roto-evaporação. A camada aquosa foi lavada com acetato de etilo três vezes (100, 50, 50 mL) .

Juntou-se uma solução de NaOH 10M (10 mL) à camada aquosa (pH = 12-14). O produto foi extraído a partir da camada aquosa três vezes com diclorometano (100, 100, 50 mL) . As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2S04, filtradas e roto-evaporadas até ficar um óleo incolor. O óleo espumoso foi seco sob vácuo durante 2 h. O Intermediário 4 foi obtido num rendimento de 90% (3,34 g).

Composto 5 [2-(2',3'-Di-hidro-benzo[1,4]dioxin-6'-il)-2-hidroxi-l-pirrolidin-l-ilmetil-etil]amida de ácido (IR,2R)-hexadecanóico 13 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ

A uma solução de Intermediário 4 (3,34 g, 12,0 mmol) em diclorometano (50 mL) adicionou-se uma solução de N-hidroxi-succinimidoéster de ácido palmítico (Sigma, 4,24 g, 12,0 mmol) durante 15-30 minutos sob azoto a temperatura ambiente. A solução foi agitada a temperatura ambiente durante 18-20 horas. À reacção juntou-se diclorometano (50 mL) e uma solução de NaOH 1M (25 mL) . O sistema de duas fases foi agitado a temperatura ambiente durante 15-30 min. Juntou-se água (25 mL) e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída de novo com diclorometano (25 mL) . As camadas orgânicas combinadas foram lavadas duas vezes com água (25 mL) e uma vez com uma solução saturada de cloreto de sódio (25 mL) . A camada orgânica foi seca com Na2S04, filtrada e roto-evaporada até ficar um óleo amarelo claro. O produto bruto foi recristalizado em hexano (50 mL) . O sólido branco (5,46 g) obtido foi separado sobre sílica gel (300 g) com metanol a 2%:diclorometano - metanol a 4%:diclorometano - amónio 2M em metanol a 4%:diclorometano. O sólido branco obtido foi recristalizado em hexanos (70 mL) . O Composto 5 foi obtido num rendimento de 66% (4,18 g) . A HPLC quiral analítica (coluna: Chirex (S)-VAL e (R)-NE, 4,6x250 mm; eluente: ácido trifluoroacético a 0,5% em hexano/dicloro- metano/etanol 67:31:2; caudal: 1 mL/min; detecção: 280 nM) mostrou que este material era 98, 98% puro com 0,89% de um diastereoisómero e 0,14% do enantiómero.

Exemplo comparativo 3 - Preparação alternativa em larga escala de compostos do tipo ceramida

Sal de HC1 de (5S)-5-fenilmorfolin-2-ona

Uma solução de bromoacetato de fenilo (Aldrich, 862,17 g, 4,0 moles, 1,1 equivalentes) em acetonitrilo (qualidade de reagente, 1500 ml) foi arrefecida num banho de gelo (temperatura interna inferior a 5°C). A esta juntou-se uma 14 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ lama fria (temperatura interna inferior a 5°C) de S-(+)-2-fenilglicinol (Aldrich, 500 g, 3,65 moles, 1 equivalente) e diisopropiletilamina (DIPEA) (Aldrich, 1587 ml, 9,11 moles, 2,5 equivalentes) em acetonitrilo (2900 ml) em porções, enquanto a temperatura interna era mantida inferior a 10°C. A mistura foi agitada a esta temperatura durante 30 minutos antes do banho de gelo ser removido e a deixou-se a mistura sob agitação a temperatura ambiente adicionalmente durante 4 horas. O solvente foi removido sob vácuo, enquanto se manteve a temperatura do banho a 25°C. A mistura foi co-evaporada com acetato de etilo (2x500 ml) para produzir um óleo viscoso amarelo claro. A esta mistura reaccional juntou-se acetato de etilo (4500 ml) e o frasco foi imerso num banho de gelo com agitação. Deixou-se a mistura arrefecer abaixo de 8°C. O sólido foi filtrado e lavado com acetato de etilo (3x250 ml). A solução foi arrefecida abaixo de 5°C. Foi passado lentamente HC1 gás seco pela solução, enquanto se mantinha a temperatura interna inferior a 15°C, até o pH ser inferior a 2 (papel de pH húmido). Deixou-se a mistura sob agitação a esta temperatura e este pH durante 20 minutos adicionais antes do sólido ser filtrado por sucção. O sólido foi lavado com acetato de etilo (3x200 ml) e seco sob vácuo elevado durante cerca de 20 horas. O rendimento foi de 412 g (53%). O espectro de ΤΗ RMN foi consistente com o sal de HC1 de (5S)-5-fenilmorfolin-2-ona.

Intermediário 1 (1-R, 35,5S, 8a5)-l,3-Bis-(2',3' -di-hidro-benzo [ 1, 4] dioxin-6' -il)-5-feniltetra-hidro-oxazolo[4,3-c][1,4]oxazin-8-ona A uma suspensão agitada de sal de HC1 de (5S)-5-fenil-morfolin-2-ona (381 g, 1 equivalente) em acetato de etilo a 15% em tolueno (2270 ml) juntou-se uma solução de bicarbonato de sódio (1,1 equivalentes) em água (2000 ml). A solução bifásica resultante foi agitada a temperatura ambiente durante cerca de 1 hora. A camada orgânica foi transferida para um frasco contendo 1,4-benzodioxan-6-carboxaldeido. O frasco foi depois equipado com uma unidade Dean-Stark, um condensador e uma entrada para azoto. A mistura foi aquecida a refluxo com agitação, enquanto cerca de 650 ml de solvente (mistura de acetato de etilo e tolueno) eram recolhidos via unidade de Dean-Stark. A resultante solução amarelo-vermelho foi deixada 15 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ sob refluxo durante cerca de 64 horas sob azoto, enquanto a água formada durante a reacção foi recolhida na unidade Dean-Stark. A maior parte do solvente foi depois removida via destilação a pressão atmosférica através da unidade Dean-Stark. 0 solvente residual foi depois removido por co-evaporação com heptano (500 ml) e éter tert-butilmetílico (2x725 ml) para produzir um produto semi-sólido amarelo. O produto semi-sólido foi dissolvido em acetato de etilo (3400 ml). Adicionou-se uma solução de bissulfito de sódio (920 g) em água (1500 ml) e deixou-se a mistura sob agitação a temperatura ambiente durante cerca de 1 hora. O sólido que se formou foi removido por filtração e lavado com acetato de etilo (3x400 ml) . O filtrado foi lavado com água (1450 ml), solução de salmoura a 5% (1450 ml) e seco sobre MgS04 (100 g) . O solvente foi removido sob vácuo para proporcionar um sólido amarelo. A este juntou-se éter tert-butilmetilico (2900 ml) e a suspensão foi agitada a temperatura ambiente durante 20 a 22 horas. O sólido amarelo foi filtrado por sucção, lavado com éter tert-butil-metilico (2x600 ml) e seco sob vácuo elevado a temperatura ambiente durante cerca de 22 horas. O rendimento foi de 400,5 g (58%). Os valores de ΧΗ RMN e TLC eram consistentes com o Intermediário 1.

Intermediário 2 (25,3-R,l"5)-3-(2',3' -Di-hidro-benzo [1, 4]dioxin-6'-il)-3-hidroxi-2- (2"-hidroxi-l"-fenil-etilamino) -1-pirrolidin-l-il-propan-l-ona

Uma solução do Intermediário 1 (312 g, 0,64 moles), pirrolidina (267 ml, 3,2 moles, 5 equivalentes) e tetra-hidrofurano (1350 ml) foi aquecida a refluxo durante 4,5 horas sob atmosfera de azoto. O solvente e o excesso de pirrolidina foram removidas sob vácuo para produzir o Intermediário bruto como um óleo viscoso laranja. O óleo foi dissolvido em metanol (3000 ml) e uma solução de ácido clorídrico 1M (3000 ml). A solução resultante foi aquecida a refluxo durante cerca de 7 horas. O solvente foi depois removido sob vácuo para proporcionar uma mistura de um óleo e água. A esta juntou-se acetato de etilo (2000 ml) e a camada aquosa foi separada. A camada orgânica foi extraída com HC1 1M aquoso (1000 ml). As camadas aquosas foram combinadas e lavadas com acetato de etilo (2000 ml). A camada aquosa foi arrefecida num banho de 16 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ gelo. Ο ρΗ da camada aquosa foi ajustado a cerca de 9 (papel de pH) com NaOH aquoso 10M (525 ml) . A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (3000 ml) . A camada orgânica foi lavada com uma solução de salmoura a 5% (1000 ml) e seca (Na2S04). O solvente foi removido sob vácuo para produzir um óleo viscoso amarelo. O rendimento foi de 213,4 g, 81%. O espectro de ΤΗ RMN era consistente com o Intermediário 2.

Intermediário 3 IR,2R,1"5)-1-(2', 3'-Di-hidro-benzo[1,4]dioxin-6'-il)-2-(2"~ hidroxi-l"-fenil-etilamino)-3-pirrolidin-l-il-propan-l-ol

Adicionou-se a uma lama de LiAlH4 (50,7 g, 1,34 moles, 2,6 equivalentes) em tetra-hidrofurano (700 ml) uma solução de Intermediário 2 (213,34 g, 0,517 moles) em tetra-hidrofurano (2000 ml) lentamente com agitação a temperatura ambiente. A mistura foi levada a refluxo durante cerca de 4 horas. A análise por TLC (metanol a 10% em diclorometano, v/v) indicou o consumo do material de partida. A mistura reaccional foi arrefecida num banho de gelo (inferior a 5°C) e juntou-se água (135 ml) muito lentamente, enquanto era mantida a temperatura interna inferior ou igual a 10°C. A esta juntou-se depois uma solução aquosa de NaOH a 15% (70 ml) seguida de água (200 ml) . Deixou-se a mistura reaccional aquecer até temperatura ambiente enquanto era mantida a agitação. Adicionou-se então diclorometano (1000 ml) à mistura e os sais foram filtrados através de uma almofada de celite. Os sais foram lavados com diclorometano (2x500 ml). Os filtrados foram combinados e o solvente foi removido sob vácuo para produzir um óleo amarelo. O óleo foi dissolvido em HC1 aquoso 1M (1500 ml) e lavado com acetato de etilo (3x500 ml). A camada aquosa foi arrefecida num banho de gelo abaixo de 5°C e o pH da camada aquosa foi ajustado a 12 a 13 com uma solução aquosa de NaOH 10M (220 ml) mantendo a temperatura interna inferior ou igual a 10°C. Deixou-se a mistura aquecer até temperatura ambiente. A camada aquosa foi extraída com diclorometano (2x500 ml) . Combinaram-se as camadas orgânicas e lavaram-se com uma solução de salmoura (500 ml), secas (Na2S04) e o solvente foi removido sob vácuo para proporcionar um óleo amarelo viscoso. O rendimento foi de 186,4 g (88,5%) . O espectro de 2Η RMN era consistente com o Intermediário 3. 17 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ

Intermediário 4, sal dioxalato (IR,2R)-2-Amino-l-(2',3'-di-hidro-benzo[1,4]dioxin-6'-il)-3-pirrolidin-l-il-propan-l-ol, sal dioxalato

Uma suspensão de Intermediário 3 (358 g, 0,90 moles), etanol (1500 ml), solução de HC1 1M (1500 ml) e Pd(OH)2 a 10% (32 g, 20% em peso) foi hidrogenada a cerca de 50 psi durante cerca de 36 horas a temperatura ambiente. A mistura foi filtrada através de um filtro Cuono. O filtro Cuono foi lavado com etanol a 10% em água (500 ml). Os filtrados foram combinados e o etanol foi removido sob vácuo. A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (3x600 ml). A camada orgânica foi extraída com HC1 aquoso 1M (700 ml). As camadas aquosas foram combinadas e arrefecidas num banho de gelo (0 a cerca de 5°C). O pH da camada aquosa foi ajustado a cerca de 12 (papel de pH) com uma solução aquosa de NaOH 10M (490 ml) mantendo a temperatura interna inferior a 10°C. Deixou-se a camada aquosa aquecer até temperatura ambiente. A camada aquosa foi extraída com diclorometano (2x1500 ml, 1x750 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre MgS04 e o solvente foi removido sob vácuo para proporcionar um óleo amarelo viscoso. 0 peso bruto foi de 214,3 g (86%). O espectro de ΧΗ RMN era consistente com o Intermediário 4.

Uma solução de ácido oxálico (152,4 g, 1,693 moles, 2,2 equivalentes) em metilisobutilcetona (2300 ml) foi adicionada lentamente com agitação a uma solução de Intermediário 4 (214,3 g, 0,77 moles, 1 equivalente) em metilisobutilcetona (800 ml) a temperatura ambiente. A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente durante cerca de 2,5 horas. O sólido foi filtrado e triturado com acetona (2000 ml) a temperatura ambiente durante cerca de 16 horas. O sólido foi filtrado, lavado com acetona (3x100 ml) e seco sob vácuo elevado para produzir um sólido esbranquiçado. 0 rendimento foi de 312,5 g (89%) . O espectro de RMN era consistente com o sal dioxalato do Intermediário 4.

Composto 5 [2-(2',3'-di-hidrobenzo[1,4]dioxin-6'-il)-2-hidroxi-l-pirrolidin-l-ilmetil-etil]amida de ácido (IR,2R)-hexadecanóico A uma solução fria (cerca de 5°C) de sal dioxalato de Intermediário 4 (507 g, 1,11 moles) em água (10 L) juntou-se 18 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ uma solução aquosa de NaOH 10M (500 ml) com agitação, sendo mantida a temperatura interna inferior a 10°C. Deixou-se a solução aquecer até temperatura ambiente, enquanto o pH da solução era mantido a cerca de 14 (papel de pH) . A camada aquosa foi extraída com diclorometano (3x6000 ml). As camadas orgânicas foram combinadas, lavadas com água (2000 ml), secas (MgS04) e o solvente foi removido sob vácuo para proporcionar um óleo viscoso amarelo, Intermediário 4. O rendimento foi de 302 g (98%) . O espectro de ΧΗ RMN era consistente com o Intermediário 4.

Uma solução do NHS-éster de ácido palmítico (Sigma, 382,5 g, 1,01 equivalentes) em diclorometano (2500 ml) foi adicionada a uma solução de Intermediário 4 (302 g) em diclorometano (1500 ml) a temperatura ambiente durante um período de 1,25 horas sob atmosfera de azoto. Deixou-se a mistura sob agitação a temperatura ambiente durante cerca de 18 horas. Juntou-se uma solução aquosa de NaOH 1M (2425 ml) e a mistura foi agitada a temperatura ambiente durante cerca de 3 horas. A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extraída com diclorometano (800 ml). As camadas orgânicas foram combinadas, lavadas com uma solução de NaOH 1M (3x1500 ml) e água (1500 ml) . A camada orgânica foi seca sobre MgS04 e o solvente foi removido sob vácuo para proporcionar um produto semi-sólido. O semi-sólido foi co-evaporado com heptano (3x100 ml) . O produto bruto foi transferido para um frasco RB de 12 L e três tubuladuras e juntou-se heptano (7500 ml). A mistura foi aquecida a refluxo com agitação sob uma atmosfera de azoto. A solução foi lentamente arrefecida até cerca de 55°C (temperatura interna) e vertida noutro frasco. A solução foi agitada a temperatura ambiente durante 24 horas sob uma atmosfera de azoto. O sólido esbranquiçado foi filtrado, lavado com heptano (2x500 ml) e seco sob vácuo elevado durante 24 horas. O sólido (397 g) foi transferido para um frasco RB de 12 L e juntou-se acetato de etilo a 30% em heptano (8000 ml) . A mistura resultante foi aquecida a refluxo durante 30 minutos com agitação. A solução foi arrefecida a cerca de 55°C (temperatura interna) e vertida noutro frasco. A agitação foi mantida a temperatura ambiente sob uma atmosfera de azoto durante cerca de 24 horas. O sólido foi filtrado, lavado com heptano (2x100 ml) e seco sob vácuo elevado para proporcionar um sólido esbranquiçado. O 19 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ rendimento foi de 324 g (58%) . As análises de RMN e TLC foram consistentes com o Composto 5. P.f. 96,1°C. Análise de HPLC: pureza quiral 99,7%, pureza química 99,7%. Anál. calc. para C31H52N2O4: C, 72,05; H, 10,14; N, 5,42; Encontr. C, 72,03; H, 10,19; N, 5,42.

Exemplo 4 - Preparação de Compostos 6-8

Foram preparados ésteres de IV-hidroxi-succinimida de ácidos gordos por meio do processo de Lapidot, Y., Rappoport, S. e Wolman, Y., Journal of Lipid Research 8, 1967, ou como se descreve em seguida: Éster de IV-hidroxi-succinimida de ácido octanóico IV-hidroxi-succinimida (Aldrich, 20,0 g, 173 mmol) e trietilamina (29 mL, 208 mmol) foram dissolvidas em diclorometano num banho de gelo sob azoto. Adicionou-se cloreto de octanoílo (Aldrich, 35 mL, 205 mmol) gota a gota durante 0,5 horas. O banho de gelo foi removido e a solução com um sólido branco foi agitada durante 1 hora a temperatura ambiente. O sólido branco foi removido por filtração e o filtrado foi lavado com água (100 mL) e bicarbonato de sódio aquoso saturado (100 mL) . A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio, filtrada e juntou-se heptano (100 mL). A solução foi roto-evaporada para remover a maior parte do diclorometano e deixou um precipitado em heptano, incolor a branco, em flocos. O precipitado foi filtrado e lavado com heptano. Após secagem foi obtido o éster de N-hidroxi-succinimida de ácido octanóico em 84% de rendimento (35,4 g). ΧΗ RMN (CDCI3) 2,84 (br s, 4H) , 2,60 (t, J=7, 48 Hz, 2H) , 1,78- 1,71 (m, 2H), 1,42-1,26 (m, 8H), 0,88 (t, J=6,7 Hz, 3H) ppm.

Composto 6 [2-(2',3'-di-hidrobenzo[1,4]dioxin-6'-il)-2-hidroxi-l-pirrolidin-l-ilmetil-etil]amida de ácido (IR,2R)-octanóico 20 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ ΟΗ

CH2CI2 ΟΗ N-hidroxi-succinimido-éster de ácido octanóico >

(CH2)sCH3 Composto 6

Ao Intermediário 4 (22,36 g, 80,33 mmol) dissolvido em diclorometano anidro (300 mL) adicionou-se uma solução de éster de IV-hidroxi-succinimida de ácido octanóico (19,4 g, 80,39 mmol) dissolvido em diclorometano anidro (150 mL) durante 15-30 minutos sob azoto a temperatura ambiente. A solução foi agitada a temperatura ambiente durante 18-20 horas. À reacção foi adicionada uma solução aquosa de NaOH 1M (200 mL) . O sistema de duas fases foi agitado a temperatura ambiente durante 45 minutos. As camadas foram separadas e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas duas vezes com NaOH 1M (2x200 mL) e duas vezes com água (2x100 mL) . A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio, filtrada e roto-evaporada até ficar um óleo amarelo. A maior parte do material bruto foi dissolvida em acetato de etilo a 5% em heptano (1 L) a refluxo. Após arrefecimento a 40°C, a solução turva foi separada do óleo amarelo por decantação da solução para um novo frasco. 0 primeiro frasco foi enxaguado duas vezes com acetato de etilo a 5% em heptano (2x250 mL) através do mesmo processo (refluxo e arrefecimento a 40 °C e decantação da solução a partir do óleo). A solução combinada foi aquecida a refluxo e deixada arrefecer até temperatura ambiente ao longo de 4 horas. O sólido branco resultante foi filtrado e lavado com acetato de etilo a 5% em heptano (100 mL) e heptano (100 mL). O sólido branco (13,9 g) foi seco sob vácuo durante 16-24 horas. Este sólido foi na maior parte dissolvido em acetato de etilo a 5% em heptano (800 mL) a refluxo. Após arrefecimento a 50°C, a solução turva foi separada do óleo amarelo por decantação da solução para um novo frasco. 0 primeiro frasco foi enxaguado com acetato de etilo a 5% em heptano (100 mL) através do mesmo processo (refluxo e arrefecimento a 50°C e decantação da solução a partir do óleo). A solução combinada foi aquecida a refluxo e deixada arrefecer até temperatura ambiente ao longo de 4 horas. 0 sólido branco resultante foi filtrado e lavado com acetato de etilo a 5%/heptano (50 mL) e 21 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ heptano (50 mL). Após secagem a temperatura ambiente sob vácuo durante 2-3 dias, obteve-se o Composto 6 com 39% de rendimento (12,57 g) . Através de HPLC quiral analítica (coluna: Chirex (S)-VAL e (R)-NE, 4,6x250 mm) mostrou-se que este material era 99,9% o desejado isómero R, R. Por HPLC analítica mostrou-se que este material era 99,6% puro. P.f. 87-88°C. 2H RMN(CDC13) δ 6,86-6, 73 (m, 3H) , 5,84 (d, J=7,3 Hz, 1H), 4,91 (d, J=3,4 Hz, 1H), 4,25 (s, 4H), 4,24-4,18 (m, 1H), 2,85-2,75 (m, 2H), 2,69- 2,62 (m, 4H), 2,10 (t, J=7,3 Hz, 2H) , 1,55-1,45 (m, 2H), 1,70- 1,85 (m, 4H), 1,30-1,15 (m, 8H), 0,87 (t, J=6,9 Hz, 3H) ppm.

Composto comparativo 7 [2-(2' , 3' -di-hidro-benzo[1,4]dioxin-6'-il)-2-hidroxi-l-pirrolidin-l-ilmetil-etil]amida de ácido (IR,2R)-nonanóico

N-hidroxi-succinimido-éster de ácido nonanóico CH2CI2

OH

Composto 7

Este composto foi preparado por meio do processo descrito para o Composto 6, utilizando éster de N-hidroxi-succinimida de ácido nonanóico. Através de HPLC analítica mostrou-se que este material era 98,4% puro. P.f. 74-75°C. 1H RMN (CDC13) δ 6, 86-6, 76 (m, 3H) , 5,83 (d, J= 7,3 Hz, 1H) , 4,90 (d, J= 3,3 Hz, 1H) , 4,24 (s, 4H) , 4,24-4,18 (m, 1H) , 2, 85-2, 75 (m, 2H), 2,69-2,62 (m, 4H), 2,10 (t, J= 7,3 Hz, 2H), 1,55-1,45 (m, 2H) , 1, 70-1,85 (m, 4H) , 1,30-1,15 (m, 10H) , 0,87 (t, J= 6,9 Hz, 3H) ppm.

Composto comparativo 8 [2-(2',3'-di-hidro-benzo[1,4]dioxin-6'-il)-2-hidroxi-l-pirrolidin-l-ilmetil-etil]amida de ácido (IR,2R)-decanóico

Composto 8 22 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ

Este composto foi preparado por meio do processo descrito para o Composto 6, utilizando éster de N-hidroxi-succinimida de ácido decanóico. Através de HPLC analítica mostrou-se que este material era 99,3% puro. P.f. 97,5-98,5°C. ΤΗ RMN (CDC13) δ 6, 86-6, 76 (m, 3H) , 5,83 (d, J= 7,5 Hz, 1H) , 4,90 (d, J=3,4 Hz, 1H) , 4,24 (s, 4H) , 4,24-4,18 (m, 1H) , 2,85-2,75 (m, 2H), 2,69-2,62 (m, 4H), 2,10 (t, J=7,5 Hz, 2H), 1,55-1,45 (m, 2H) , 1, 70-1,85 (m, 4H) , 1,30-1,15 (m, 12H) , 0,87 (t, J=6,8 Hz, 3H) ppm.

Exemplo comparativo 5 - Preparação do Composto 13

Intermediário 9 (l-R,35,55,8a5)-l,3-Bis-( 4-benziloxi-f enil) -5-fenil-tetra-hidro-oxazolo[4,3-c][1,4]oxazin-8-ona

O sal de HC1 de (5S)-5-fenilmorfolin-2-ona (57, 45 g, 268, 9 mmol) foi agitado com acetato de etilo (500 mL) e bicarbonato de sódio aquoso saturado (250 mL) durante 30 minutos, até a solução bifásica se tornar límpida. As fases foram separadas, e a camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (2x250 mL). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com uma solução saturada de cloreto de sódio (250 mL) . A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio, filtrada, concentrada até se obter um óleo, e seca sob vácuo durante 60 minutos. A 5-(S)-fenilmorfolin-2-ona foi obtida num rendimento de 86% (40,98 g, 231,3 mmol). A 5-(S)-fenilmorfolin-2-ona (40,98 g, 231,3 mmol) e 4-benziloxibenzaldeído (Aldrich, 147,3 g, 694 mmol, 3,0 equivalentes) foram dissolvidos em tolueno (750 mL). A reacção foi equipada com um dispositivo de Dean Stark e um condensador de refluxo. A solução foi levada a refluxo sob azoto durante 2 dias. Após arrefecimento até temperatura ambiente, o solvente foi removido por roto-evaporação e o óleo foi dissolvido em acetato de etilo (500 mL). Adicionou-se uma solução de bissulfito de sódio (Aldrich, 125 g) 23 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ

dissolvido em água (250 mL) e a mistura de duas fases foi agitada a temperatura ambiente durante 3 horas. O sólido branco resultante foi removido por filtração e lavado com acetato de etilo. 0 filtrado foi colocado num funil de separação e as camadas separadas. A camada orgânica foi lavada com água (250 mL), solução aquosa saturada de cloreto de sódio (250 mL) , e depois seca (sulfato de sódio), filtrada e roto-evaporada até um óleo espumoso (144 g) . Após secagem sob vácuo durante 1 hora, juntou-se éter tert-butilmetilico (1450 mL) e a mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 5 horas. 0 sólido branco-amarelo resultante foi filtrado. O sólido foi seco sob vácuo. O Intermediário 9 foi obtido num rendimento de 27% (41,64 g, 71,46 mmol) . RMN (CDC13) δ 7,5-6,8 (m, 23H) , 5,0 e 5,1 (2s, 4H) , 4,5-4,3 (m, 2H), 4,2-4,1 (m, 2H) ppm.

Intermediário 10 (2S,3R,l"S)-3-( 4-Benziloxi-f enil) -3-hidroxi-2 - (2"-hidroxi-l"-fenil-etilamino)-1-pirrolidin-l-il-propan-l-ona

OH

Ao Intermediário 9 (45,1 g, 77,4 mmol) dissolvido em tetra-hidrofurano (250 mL) adicionou-se pirrolidina (Aldrich 33 mL, 395 mmol, 5,1 equivalentes). A solução foi agitada tapada sob azoto a temperatura ambiente durante 16-18 horas. O solvente foi roto-evaporado para proporcionar um óleo amarelo espumoso que foi seco sob vácuo durante 0,5 horas. O produto bruto foi dissolvido em metanol (220 mL) e juntou-se uma solução aquosa de HC1 1M (220 mL). A solução foi levada a refluxo durante 4 horas. Após arrefecimento a temperatura ambiente, o metanol foi removido por roto-evaporação. Ao óleo resultante foi adicionado lentamente NaOH aquoso 10M (22 mL para ajustar o pH a 14) . O produto foi extraído três vezes com diclorometano (300, 100, 100 mL) a partir da camada aquosa básica. Após secagem com sulfato de sódio, a camada orgânica combinada foi filtrada e roto-evaporada para proporcionar um sólido espumoso amarelo-laranja. Juntou-se 24 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ éter tert-butilmetílico (300 mL) e a mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 7 horas. O sólido branco-amarelo resultante foi filtrado, lavado com éter tert-butilmetilico (50 mL) e seco sob vácuo. O Intermediário 10 foi obtido com rendimento de 83% (29, 77 g) . ΤΗ RMN (CDC13) δ 7,4-7,2 (m, 12H), 6,9-6,8 (m, 2H), 5,05 (quarteto AB, 2H), 4,47 (d, J=8,5, 1H), 3,9-3,3 (m, 3H) , 3,05 (d, J=8,5, 1H) , 3,0-2,8 (m, 2H) , 2,3-2,2 (m, 1H), 1,85-1,7 (m, 1H) , 1,45-1,15 (m, 4H) ppm.

Intermediário 11 (lR,2R,l"S)-l-(4-Benziloxi-fenil)-2-(2"-hidroxi-l"-fenil-etilamino)-3-pirrolidin-l-il-propan-l-ol

Num frasco de 3 tubuladuras com funil de adição e condensador sob azoto, adicionou-se LiAlH4 (Aldrich, 6,3 g, 166 mmol, 2,57 equivalentes) e tetra-hidrofurano anidro (75 mL) . Juntou-se gota a gota uma solução de Intermediário 10 (29,7 g, 64,48 mmol) em tetra-hidrofurano anidro (300 mL) à reacção durante 15-30 minutos. A reacção foi levada a refluxo sob azoto durante 9 horas. Arrefeceu-se a reacção num banho de gelo e juntou-se água (7,0 mL) muito cuidadosamente e gota a gota (reacção exotérmica vigorosa, com libertação de hidrogénio). Adicionou-se uma solução aquosa de NaOH a 15% (7,0 mL) gota a gota, seguida de água (21 mL) . A meio da adição de água final formou-se uma grande quantidade de um sólido branco. Foi desfeita pela adição de diclorometano (250 mL). Após agitação a temperatura ambiente durante 15 minutos, a mistura foi filtrada através de uma almofada de celite (17 cm de diâmetro por 1 cm de altura). 0 precipitado foi lavado com diclorometano (2x250 mL) . O filtrado foi roto-evaporado até um óleo. O óleo foi dissolvido em HC1 aquoso 1M (300 mL). Esta camada aquosa foi lavada com éter tert-butilmetílico (2x200 mL). Após arrefecimento num banho de gelo, adicionou-se cuidadosamente NaOH aquoso 10M (35 mL) à camada aquosa (pH final = 14) . O produto foi extraído três vezes com 25 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ diclorometano (300 mL, 200 mL e 100 mL) . Após secagem com sulfato de sódio, a solução foi filtrada e roto-evaporada para gerar um sólido branco. Após secagem, o Intermediário 11 foi obtido com rendimento de 94% (26,9 g) . ΤΗ RMN (CDCI3) δ 7,46-7,115 (m, 12H), 6,98-6, 96 (m, 2H) , 5,08 (s, 2H) , 4,49 (d, J=4, 7, 1H), 3, 70-3,65 (m, 1H) , 3,60-3,55 (m, 1H), 3,54- 3,45 (m, 1H), 3,00-2,90 (m, 1H), 2,7-2,6 (m, 1H), 2,36 (br s, 4H), 2,15-2,05 (m, 1H), 1,70 (br s, 4H) ppm.

Intermediário 12 (IR,2R)-2-Amino-l-(4-benziloxi-fenil)-3-pirrolidin-l-il-propan-l-ol, sal de cloreto de hidrogénio

OH -Q.H

OH O Intermediário 11 (26,9 g, 60,24 mmol) foi dissolvido em metanol (400 mL) e juntou-se HC1 aquoso 1M (130 mL) . Após ter sido colocado sob azoto, adicionou-se hidróxido de paládio sobre carbono a 20% (catalisador de Pearlman, Aldrich, 10,8 g) . A reacção foi colocada sob azoto e depois sob hidrogénio por evacuação e enchimento de um balão. A mistura foi agitada durante 48 horas a temperatura ambiente sob um balão de hidrogénio. A mistura reaccional foi colocada sob azoto e filtrada através de uma almofada de celite. A almofada de celite foi lavada com água a 10% em metanol (250 mL) e água (50 mL) . O solvente foi removido por roto-evaporação e co-evaporação com tolueno (3x100 mL) . O sólido espumoso foi dissolvido em isopropanol (300 mL) a refluxo. A solução foi arrefecida até temperatura ambiente e adicionou-se éter tert-butilmetílico (550 mL). Após agitação a temperatura ambiente durante 2 horas, o sólido branco foi filtrado e lavado com éter tert-butilmetílico. Após secagem, foi obtido o Intermediário 12 com um rendimento de cerca de 99% (18 g). 1H RMN (DMSO-d6) δ 9,68 (br s, 1H) , 8,53 (br s, 2H) 7,24 (d, J= 8,55 Hz, 2H) , 6,80 (d, J= 8,55 Hz, 2H) , 4,72 (d, J=7, 0 Hz, 1H), 3,8-3,6 (m, 2H), 3,4-3,6 (m, 3H), 3,0-3,2 (m, 2H), 2,7-2,5 (br s, 1H), 2,0-1,7 (br s, 4H) ppm. 26 ΕΡ 1 409 467/ΡΤ

Composto 13 [2-( 4-benziloxi-f enil) -2-hidroxi-l-pirrolidin-l-ilmetil-etiljamida de ácido (IR,2R)-hexadecanóico

Ao Intermediário 12 (16,17 g, 49,36 mmol) suspenso em tetra-hidrofurano (500 mL) adicionou-se trietilamina (28 mL, 4 equivalentes). Adicionou-se uma solução de N-hidroxi-succinimidoéster de ácido palmítico (Sigma, 19,2 g, 54,29 mmol) dissolvido em tetra-hidrofurano (125 mL) durante 30 minutos sob azoto a temperatura ambiente. A solução foi agitada a temperatura ambiente durante 18-20 horas. O precipitado branco foi removido por filtração e o filtrado foi roto-evaporado até ser obtido um sólido esbranquiçado espumoso (35,5 g). 0 material bruto foi dissolvido em dicloro-metano (500 mL) e lavado com água (100 mL) e uma solução aquosa saturada de carbonato de sódio (100 mL). Após secagem com sulfato de sódio, a solução foi filtrada e roto-evaporada para gerar um sólido esbranquiçado espumoso (24, 75 g) . Este material foi recristalizado em acetato de etilo a 40% em heptano (500 mL, filtração a quente). O Composto 13 foi obtido com rendimento de 61% (14,45 g) . A HPLC quiral analítica mostrou que este material era 99,7% do desejado isómero R,R. A HPLC analítica mostrou que este material era 99,6% puro. P.f. 95-97°C. 1H RMN (CDC13) δ 7,15 (d, J=8,5Hz, 2H) , 6,70 (d, J= 8,5 Hz, 2H), 6,0 (d, J=7,3, 1H) , 4,96 (d, J=3,8, 1H) , 4,3-4,2 (m, 1H), 2,9-2,7 (m, 2H), 2,65-2,55 (m, 4H), 2,10 (t, J=7,5, 2H), 1,75 (br s, 4H), 1,58-1,46 (m, 2H), 1,32-1,16 (m, 24H) , 0,9 (t, J= 6,7, 3H) ppm.

Lisboa, 2012-07-06

Claims

ΕΡ 1 409 467/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Composto representado pela seguinte fórmula estrutural: OH

(CH2)5CH3 ou um seu sal fisiologicamente aceitável.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1 sob a forma do sal tartarato.
3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 para utilização em terapia.
4. Utilização do composto de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 para o fabrico de um medicamento para a inibição de GlcCer-sintase ou redução das concentrações de GSL num indivíduo com necessidade de tal tratamento.
5. Utilização do composto de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 para o fabrico de um medicamento para o tratamento da doença de Gaucher.
6. Utilização do composto de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 para o fabrico de um medicamento para o tratamento da doença de Fabry.
7. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 para utilização na inibição de GlcCer-sintase ou redução das concentrações de GSL num indivíduo com necessidade de um tal tratamento.
8. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 para utilização no tratamento da doença de Gaucher. ΕΡ 1 409 467/ΡΤ 2/2
9. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 para utilização no tratamento da doença de Fabry. Lisboa, 2012-07-06