PT1223799E - Plantas resistentes a herbicida não transgénicas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Plantas resistentes a herbicida não transgénicas"

1. CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se à produção de uma planta não transgénica resistente ou tolerante a um herbicida da família fosfonometilglicina, p.ex., glifosato. 0 presente invento refere-se também à utilização de uma oligonucleobase recombinogénica para produzir uma mutação desejada nas sequências cromossómicas ou epissómicas de uma planta no gene codificando para a 5-enol-piruvilchiquimato-3-fosfato-sintetase (EPSPS). A proteína mutada, que mantém substancialmente a actividade catalítica da proteína de tipo selvagem, permite maior resistência ou tolerância da planta a uma herbicida da família fosfonometilglicina, e permite o crescimento ou desenvolvimento substancialmente normal da planta, seus órgãos, tecidos ou células quando comparada com a planta de tipo selvagem independentemente da presença ou ausência do herbicida. 0 presente invento refere-se também a uma célula vegetal não transgénica em que o gene de EPSPS foi mutado, uma planta não transgénica regenerada a partir desta, bem como uma planta resultando de um cruzamento utilizando uma planta não transgénica regenerada possuindo um gene de EPSPS mutado.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO

2.1 HERBICIDAS DE FOSFONOMETILGLICINA

As plantas tolerantes a herbicidas podem reduzir a necessidade de lavoura para controlo de ervas daninhas reduzindo eficazmente deste modo a erosão do solo. Um herbicida que é objecto de muita investigação a este respeito é a N-fosfonometilglicina, comummente referido como glifosato. 0 glifosato inibe a via do ácido chiquímico que conduz à biossíntese de compostos aromáticos incluindo aminoácidos, hormonas e vitaminas. Especificamente, o glifosato restringe a conversão do ácido fosfoenolpirúvico (PEP) e ácido 3-fosfochiquímico em ácido 5-enolpiruvil-3-fosfochiquímico 2 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ através da inibição da enzima 5-enol-piruvilchiquimato-3-fosfato-sintetase (daqui em diante referida como EPSP-sintetase ou EPSPS). Para os fins do presente invento, o termo "glifosato" inclui qualquer forma eficaz como herbicida de N-fosfonometilglicina (incluindo qualquer sal desta), outras formas que resultem na produção do anião glifosato em plantas e quaisquer outros herbicidas da família fosfonometilglicina. A tolerância das plantas ao glifosato pode ser aumentada através da introdução de um gene mutante de EPSPS possuindo uma alteração na sequência de codificação de aminoácidos de EPSPS no genoma da planta. Exemplos de algumas das mutações no gene de EPSPS para indução de tolerância ao glifosato são descritos nas seguintes patentes: Patente U.S. N.° 5310667; Patente U.S. N.° 5866775; Patente U.S. N.° 5312910; Patente U.S. N.° 5145783. Estas mutações propostas têm tipicamente uma Ki mais elevada para o glifosato que a enzima EPSPS de tipo selvagem que confere o fenótipo tolerante a glifosato, mas estas variantes são também caracterizadas por uma Km elevada para PEP que torna a enzima cineticamente menos eficiente (Kishore et al., Ann. Rev. Biochem. 57: 627-663, 1988; Schulz et al., Arch. Microbiol. 137: 121-123, 1984; Sost et al., FEBS Lett. 173: 238-241, 1984; Kishore et al., Fed. Proc. 45: 1506, 1986; Sost e Amrhein, Arch. Biochem. Biophys. 282: 433-436, 1990) . Muitas mutações do gene de EPSPS são escolhidas de forma a produzir uma enzima EPSPS que seja resistente a herbicidas, mas infelizmente, a enzima EPSPS produzida através do gene de EPSPS mutado que tem uma actividade enzimática significativamente inferior que a EPSPS de tipo selvagem. Por exemplo, a Km aparente para PEP e a Ki aparente para o glifosato para a EPSPS de tipo selvagem de E. coli são 10 μΜ e 0,5 μΜ, enquanto que para um isolado tolerante ao glifosato possuindo uma única substituição de aminoácidos de glicina para alanina na posição 96, estes valores são 220 μΜ e 4,0 mM, respectivamente. Vários genes de EPSPS tolerantes ao glifosato foram construídos através de mutagénese. Novamente, a EPSPS tolerante ao glifosato teve uma eficiência catalítica inferior (Vmax/Km), tal como mostrado através de um aumento da Km para PEP, e uma ligeira redução da Vmax da enzima vegetal de tipo selvagem (Kishore et al., Ann. Rev. Biochem. 57: 627-663, 1988) . 3 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ

Uma vez que as constantes cinéticas das enzimas variantes são prejudicadas em relação a PEP, foi proposto que seriam necessários elevados niveis de sobre-produção da enzima variante, 40-80 vezes, para manter a actividade catalítica normal em plantas na presença de glifosato (Kishore et al., Ann. Rev. Biochem. 57: 627-663, 1988). Foi mostrado que plantas tolerantes a glifosato podem ser produzidas através de inserção no genoma da planta da capacidade para produzir um nivel elevado de EPSP-sintetase no cloroplasto da célula (Shah et al., Science 233: 478-481, 1986), enzima esta que é de preferência tolerante a glifosato (Kishore et al., Ann. Rev. Biochem. 57: 627-663, 1988). A introdução dos genes de EPSPS mutantes exógenos em plantas está bem documentada. Por exemplo, de acordo com a Patente U.S. N.° 4545060, para aumentar a resistência da planta ao glifosato, é introduzido no genoma da planta um gene codificando para uma variante de EPSPS possuindo pelo menos uma mutação que torna a enzima mais resistente ao seu inibidor competitivo, i.e., o glifosato. No entanto, muitas complicações e problemas estão associados a estes exemplos. Muitas dessas mutações resultam em baixa expressão do produto do gene de EPSPS mutado ou resultam num produto do gene de EPSPS com actividade enzimática significativamente inferior em comparação com o tipo selvagem. A baixa expressão ou baixa actividade enzimática da enzima mutada resulta em niveis anormalmente baixos de crescimento e desenvolvimento da planta.

Embora tais variantes nas EPSP-sintetases se tenham mostrado úteis na obtenção de plantas transgénicas tolerantes ao glifosato, seria muito mais benéfico obter um produto génico de EPSPS variante que fosse altamente tolerante ao glifosato mas ainda assim cineticamente eficiente para se poder obter melhor tolerância com o um nivel de expressão de tipo selvagem.

2.2 OLIGONUCLEOBASES RECOMBINOGÉNICAS

Oligonucleobases recombinogénicas e sua utilização para efectuar alterações genéticas em células eucarióticas são descritas na patente dos Estados Unidos N.° 5565350 para Kmiec 4 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ (Kmiec I). Kmiec I ensina um método para a introdução de alterações genéticas especificas num gene alvo. Kmiec I divulga, inter alia, oligonucleobases recombinogénicas possuindo duas cadeias, em que uma primeira cadeia contém dois segmentos com pelo menos 8 nucleótidos semelhantes a ARN que são separados por um terceiro segmento de 4 a cerca de 50 nucleótidos semelhantes a ADN, designados "segmentos de ADN interpostos". Os nucleótidos da primeira cadeia são emparelhados por bases com nucleótidos semelhantes a ADN de uma segunda cadeia. A primeira e a segunda cadeias são adicionalmente ligadas através de um segmento de nucleótidos de cadeia simples de modo que a primeira e a segunda cadeias são partes de uma única cadeia oligonucleotidica. Kmiec I ensina ainda um método para a introdução de alterações genéticas especificas num gene alvo. De acordo com Kmiec I, as sequências dos segmentos de ARN são seleccionadas para serem homólogas, i.e., idênticas, à sequência de um primeiro e um segundo segmentos do gene alvo. A sequência do segmento de ADN interposto é homóloga à sequência do gene alvo entre o primeiro e o segundo segmentos excepto quanto a uma região de diferença, designada "região heteróloga". A região heteróloga pode efectuar uma inserção ou deleção ou pode conter uma ou mais bases que estejam desemparelhadas com a sequência do gene alvo de modo a efectuar uma substituição. De acordo com Kmiec I, a sequência do gene alvo é alterada tal como indicado pela região heteróloga, de modo a que o gene alvo se torne homólogo com a sequência da oligonucleobase recombinogénica. Kmiec I ensina especificamente que nucleótidos contendo ribose e 2'-0-metilribose, i.e., 2'-metoxirribose, podem ser utilizados em oligonucleobases recombinogénicas e que nucleótidos contendo desoxirribose de ocorrência natural podem ser utilizados como nucleótidos semelhantes a ADN. A Patente U.S. N.° 5731181 para Kmiec (Kmiec II) divulga especificamente a utilização de oligonucleobases recombinogénicas para efectuar alterações genéticas em células vegetais e divulga mais exemplos de análogos e derivados de nucleótidos semelhantes a ARN e semelhantes a ADN que podem ser utilizados para efectuar alterações genéticas em genes alvo específicos. Outras patentes discutindo a utilização de oligonucleobases recombinogénicas incluem: Patentes U.S. N.os 5756325, 5871984, 5760012, 5888983, 5795972, 5780296, 5 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ 5945339, 6004804 e 6010907 e na Patente Internacional N.° PCT/US00/23457; e nas Publicações de Patente Internacional N.os WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/58723, WO 99/58702 e WO 99/40789. As oligonucleobases recombinogénicas incluem moléculas contendo oligonucleótidos e não nucleótidos, dúplex mistas ensinadas em Kmiec II e outras moléculas ensinadas nas patentes e publicações de patente acima observadas. A citação ou identificação de gualguer referência na Secção 2 ou qualquer secção deste pedido não deverá ser entendida como uma admissão de que tal referência esteja disponível como arte anterior ao presente invento.

3. SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento dirige-se a um método de produção de uma planta ou célula vegetal não transgénica possuindo uma ou mais mutações no gene de EPSPS, planta esta que tem maior resistência ou tolerância a um membro da família fosfonometilglicina e planta esta que exibe um crescimento ou desenvolvimento substancialmente normal da planta, seus órgãos, tecidos ou células quando comparada com a planta ou célula de tipo selvagem correspondente. O presente invento é também dirigido a um método de produção de uma planta não transgénica possuindo uma mutação no gene de EPSPS, planta esta que é resistente ou tem uma maior tolerância a um membro da família fosfonometilglicina, p.ex., glifosato, em que a proteína EPSPS mutada tem substancialmente a mesma actividade catalítica quando comparada com a proteína EPSPS de tipo selvagem. O presente invento é também dirigido a um método para a produção de uma planta não transgénica possuindo um gene de EPSPS mutado que mantém substancialmente a actividade catalítica da proteína de tipo selvagem independentemente da presença de um herbicida da família fosfonometilglicina. O método compreende a introdução numa célula vegetal de uma oligonucleobase recombinogénica com uma mutação direccionada no gene de EPSPS e a identificação de uma célula, semente ou planta possuindo um gene de EPSPS mutado. 6 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ

Exemplos ilustrativos de uma oligonucleobase recombinogénica verificam-se nas seguintes publicações de patente, que são incorporadas na sua totalidade por referência aqui: Patentes U.S. N.os 5565350, 5756325, 5871984, 5760012, 5731181, 5888983, 5795972, 5 780296, 5945339, 6004804 e 6010907 e na Patente Internacional N.° PCT/US00/23457 e nas Publicações de Patente Internacionais N.os WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/58723, WO 99/58702 e WO 99/40789. A planta pode ser de qualquer espécie de planta dicotiledónea, monocotiledónea ou gimnospérmica, incluindo qualquer espécie vegetal lenhosa que cresça como árvore ou arbusto, qualquer espécie herbácea, ou qualquer espécie que produza frutos, sementes ou legumes comestíveis, ou qualquer espécie que produza flores coloridas ou aromáticas. Por exemplo, a planta pode ser seleccionada a partir de uma espécie de planta do grupo que consiste em colza, girassol, tabaco, beterraba sacarina, algodão, milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, tomate, manga, pêssego, maçã, pêra, morango, banana, melão, batata, cenoura, alface, cebola, espécies de soja, cana-de-açúcar, ervilha, favinhas, choupo, uva, citrinos, alfalfa, centeio, aveia, turfa e ervas forrageiras, linho, couve-nabiça, pepino, glória-da-manhã, bálsamo, pimenta, beringela, tagetes, lótus, couve, margarida, cravo, túlipa, íris, lírio e plantas produtoras de nozes que ainda não tenham sido especificamente mencionadas. A oligonucleobase recombinogénica pode ser introduzida numa célula vegetal utilizando qualquer método comummente utilizado na arte, incluindo mas não se limitando a microtransportadores (distribuição biolística), microfibras, electroporação, micro-injecção. É também divulgado um método de controlo selectivo de ervas daninhas num campo, compreendendo o campo plantas com as alterações no gene de EPSPS divulgadas e ervas daninhas, compreendendo o método a aplicação no campo de um herbicida ao qual as referidas plantas foram tornadas resistentes. São também divulgadas novas mutações no gene de EPSPS que conferem resistência ou tolerância a um membro da família fosfonometilglicina, p.ex., glifosato, a uma planta ou em que 7 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ a EPSPS mutada tem substancialmente a mesma actividade enzimática quando comparada com a EPSPS de tipo selvagem.

3.1 DEFINIÇÕES 0 presente invento deve ser entendido de acordo com as seguintes definições.

Uma oligonucleobase é um polímero de nucleobases, polímero este que pode hibridar através de emparelhamento de bases de Watson-Crick com um ADN possuindo a sequência complementar.

As nucleobases compreendem uma base, que é uma purina, pirimidina ou um derivado ou análogo destas. As nucleobases incluem nucleobases peptídicas, as subunidades de ácidos nucleicos peptídicos e nucleobases de morfolino bem como nucleósidos e nucleótidos. Os nucleósidos são nucleobases que contêm uma porção pentosefuranosilo, p.ex., um ribósido ou 2'-desoxirribósido opcionalmente substituído. Os nucleósidos podem ser ligados através de uma de várias porções de ligação, que podem ou não conter um fósforo. Os nucleósidos que são ligados através de ligações fosfodiéster não substituídas são designados nucleótidos.

Uma cadeia de oligonucleobases tem um único terminal 5' e 3', que são as últimas nucleobases do polímero. Uma determinada cadeia de oligonucleobases pode conter nucleobases de todos os tipos. Um composto de oligonucleobases é um composto compreendendo uma ou mais cadeias de oligonucleobases que são complementares e hibridáveis através de emparelhamento de bases de Watson-Crick. As nucleobases são de tipo "desoxirribo" ou de tipo "ribo". As nucleobases de tipo ribo são nucleobases contendo pentosefuranosilo em que o carbono 2' é um metileno substituído com um hidroxilo, alquiloxi ou halogéneo. As nucleobases de tipo desoxirribo são nucleobases diferente das nucleobases de tipo ribo e incluem todas as nucleobases que não contenham uma porção pentosefuranosilo.

Uma cadeia de oligonucleobases inclui genericamente tanto cadeias de oligonucleobases como segmentos ou regiões de cadeias de oligonucleobases. Uma cadeia de oligonucleobases 8 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ tem uma extremidade 3' e uma extremidade 5'. Quando uma cadeia de oligonucleobases é coextensiva com uma cadeia, as extremidades 3' e 5' da cadeia são também os terminais 3' e 5' da cadeia.

De acordo com o presente invento, o crescimento substancialmente normal de uma planta, órgão vegetal, tecido vegetal ou célula vegetal é definido como a velocidade de crescimento ou velocidade de divisão celular da planta, órgão vegetal, tecido vegetal ou célula vegetal que é pelo menos 35%, pelo menos 50%, pelo menos 60% ou pelo menos 75% da velocidade de crescimento ou da velocidade de divisão celular numa planta, órgão vegetal, tecido vegetal ou célula vegetal correspondente expressando a proteína EPSPS de tipo selvagem.

De acordo com o presente invento, o desenvolvimento substancialmente normal de uma planta, órgão vegetal, tecido vegetal ou célula vegetal é definido como a ocorrência de um ou mais eventos de desenvolvimento na planta, órgão vegetal, tecido vegetal ou célula vegetal que sejam substancialmente os mesmos que ocorrem numa planta, órgão vegetal, tecido vegetal ou célula vegetal correspondente expressando a proteína EPSPS de tipo selvagem.

De acordo com o presente invento os órgãos vegetais incluem, mas não se limitam a folhas, caules, raízes, bolbos vegetativos, botões florais, meristemas, embriões, cotilédones, endosperma, sépalas, pétalas, pistilos, carpelos, estames, anteras, micrósporos, pólen, tubos polínicos, óvulos, ovários e frutos, ou secções, fatias ou discos tirados destes. Os tecidos vegetais incluem, mas não se limitam a, tecidos calosos, tecidos primários, tecidos vasculares, tecidos de armazenamento, tecidos meristemáticos, tecidos foliares, tecidos caulinares, tecidos radiculares, tecidos de galhas, tecidos de tumores vegetais e tecidos reprodutivos. As células vegetais incluem, mas não se limitam a, células isoladas com paredes celulares, agregados de vários tamanhos destas e protoplastos.

As plantas são substancialmente "tolerantes" ao glifosato quando são sujeitas a ele e proporcionam uma curva de dose/resposta que é desviada para a direita quando comparada 9 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ com a proporcionada por uma planta equivalente não tolerante sujeita de forma semelhante. Tais curvas de dose/resposta têm a "dose" representada no eixo dos XX e a "percentagem de morte", "efeito herbicida", etc., representado no eixo dos YY. As plantas tolerantes requererão mais herbicida que plantas semelhantes não tolerantes para produzir um dado efeito herbicida. As plantas que são substancialmente "resistentes" ao glifosato exibem poucas ou nenhumas lesões necróticas, liticas, cloróticas ou outras quando sujeitas a glifosato nas concentrações e taxas que são tipicamente empregues pela comunidade agroquimica para matar ervas daninhas no campo. As plantas que são resistentes a um herbicida são também tolerantes ao herbicida. Os termos "resistente" e "tolerante" devem ser entendidos como "tolerante e/ou resistente" dentro do contexto do presente pedido.

4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. IA é a sequência de ADN do gene de EPSPS de

Arabidopsis thaliana (SEQ ID N0:1). Os resíduos nucleotidicos sublinhados e a cheio são os resíduos alvo. A FIG. 1B é a sequência de aminoácidos da proteína EPSPS de Arabidopsis thaliana (SEQ ID N0:2). Os resíduos de aminoácidos sublinhados e a cheio são os resíduos alvo. A FIG. 2 é uma lista das sequências nucleotídicas e de aminoácidos de Arabidopsis thaliana de EPSPS de tipo selvagem e mutantes na região dos aminoácidos 173 a 183; sequência nucleotídica de tipo selvagem (SEQ ID N0:1) e sequência de aminoácidos de tipo selvagem (SEQ ID NO:2), sequência nucleotídica (SEQ ID NO:3) e de aminoácidos (SEQ ID NO:4) do mutante Ai77; sequência nucleotídica (SEQ ID N0:5) e de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) do mutante Ii78; sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 7) e de aminoácidos (SEQ ID N0:8) do mutante Ai77In8; sequência nucleotídica (SEQ ID N0:9) e de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) do mutante li7sSi82; sequência nucleotídica (SEQ ID NO:11) e de aminoácidos (SEQ ID NO:12) do mutante Ai77Si82; sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 13) e de aminoácidos (SEQ ID NO: 14) do mutante Ai77Ii78Si82; sequência nucleotídica (SEQ ID NO:15) e de aminoácidos (SEQ ID NO:16) do mutante Vi77Si82; sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 17) e de 10 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ aminoácidos (SEQ id NO:18) do mutante Ln8Si82; sequência nucleotídica (SEQ id NO:19) e de aminoácidos (SEQ ID NO:20) do mutante A177V118; sequência nucleotidica (SEQ ID NO:21) e de aminoácidos (SEQ id NO:22) do mutante A177L182. A FIG. 3A-C é um alinhamento do ADN do gene de EPSPS de Arabidopsis thaliana efectuado através de DNAStar (LaserGene), (SEQ ID NO:l) com as sequências nucleotidicas do gene de EPSPS de Brassica napus (SEQ ID NO:23); Petunia hybrida (SEQ ID NO:24); e Zea mays (SEQ ID NO:25). As sequências são alinhadas utilizando o método de J. Hein com a tabela ponderada do peso dos residuos. A FIG. 4 é um alinhamento da sequência de aminoácidos de EPSPS de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:2) com as sequências de aminoácidos de Brassica napus (SEQ ID NO:26); Petunia hybrida (SEQ ID NO:27); e Zea mays (SEQ ID NO:28). As sequências são alinhadas utilizando o método de J. Hein com a tabela ponderada do peso dos residuos. A FIG. 5 é uma lista dos iniciadores de mutagénese utilizados, com os codões alvo em caracteres a cheio (iniciador mutante Ai77 (SEQ ID NO:29); iniciador mutante Ii78 (SEQ ID NO:30); iniciador mutante Ai77Ii78 (SEQ ID NO:31); iniciador mutante Ii78Si82 (SEQ ID NO:32); iniciador mutante Ai77Si82 (SEQ ID NO:34); iniciador mutante Ai77Ii78Si82 (SEQ ID NO:35); iniciador mutante Vi77Si82 (SEQ ID NO:35); iniciador mutante Li78Si82 (SEQ ID NO:36); iniciador mutante Ai77Vi78 (SEQ ID NO:37); e iniciador mutante Ai77Li82 (SEQ ID NO:38)). A FIG. 6 é o crescimento medido através de densidade óptica a 600 nm de clones de Arabidopsis na presença ( + ) e ausência (-) de glifosato 17 mM. A FIG. 7 (painel superior) é um western blot mostrando a expressão de proteínas EPSPS de tipo selvagem (WT) e mutantes (AS) de Bacillus e Arabidopsis marcadas com His isoladas a partir de lisados celulares (L) e eluatos (E) . Salmonella não transformada como controlo negativo não mostra expressão de EPSPS. O painel inferior é um gel em duplicado corado com prata. 11

ΕΡ 1 223 799/ΡΤ 5. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O presente invento é dirigido a um método de produção de uma planta ou célula vegetal não transgénica possuindo uma mutação no gene de EPSPS, planta esta que tem maior resistência ou tolerância a um membro da família fosfonometilglicina e planta esta que exibe crescimento ou desenvolvimento substancialmente normal da planta, seus órgãos, tecidos ou células quando comparada com a correspondente planta ou célula de tipo selvagem. 0 presente invento é também dirigido a uma planta não transgénica possuindo uma mutação no gene de EPSPS, planta esta que é resistente ou tem maior tolerância a um membro da família fosfonometilglicina, p.ex., glifosato, em que a proteína EPSPS mutada tem substancialmente a mesma actividade catalítica quando comparada com a proteína EPSPS de tipo selvagem. 0 presente invento é também dirigido a um método para produção de uma planta não transgénica possuindo um gene de EPSPS mutado que mantém substancialmente a actividade catalítica da proteína de tipo selvagem independentemente da presença ou ausência de um herbicida da família fosfonometilglicina. 0 método compreende a introdução numa célula vegetal de uma oligonucleobase recombinogénica com uma mutação apontada no gene de EPSPS e a identificação de uma célula, semente, ou planta possuindo um gene de EPSPS mutado.

Exemplos ilustrativos de uma oligonucleobase recombinogénica são verificados nas seguintes publicações de patente das Patentes U.S. N.os 5565350, 5756325, 5871984, 5760012, 5731181, 5888983, 5795972, 5 780296, 5945339, 6004804 e 6010907 e na Patente Internacional N.° PCT/US00/23457; e nas Publicações de Patente Internacional N.os WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/58723, WO 99/58702 e WO 99/40789. A planta pode ser de qualquer espécie de planta dicotiledónea, monocotiledónea ou gimnospérmica, incluindo qualquer espécie vegetal lenhosa que cresça como árvore ou arbusto, qualquer espécie herbácea, ou qualquer espécie que produza frutos, sementes ou legumes comestíveis, ou qualquer espécie que produza flores coloridas ou aromáticas. Por exemplo, a planta pode ser seleccionada a partir de uma 12 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ espécie de planta do grupo que consiste em colza, girassol, tabaco, beterraba sacarina, algodão, milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, tomate, manga, pêssego, maçã, pêra, morango, banana, melão, batata, cenoura, alface, cebola, espécies de soja, cana-de-açúcar, ervilha, favinhas, choupo, uva, citrinos, alfalfa, centeio, aveia, turfa e ervas forrageiras, linho, couve-nabiça, pepino, glória-da-manhã, bálsamo, pimenta, beringela, tagetes, lótus, couve, margarida, cravo, túlipa, iris, lírio e plantas produtoras de nozes que ainda não tenham sido especificamente mencionadas. A oligonucleobase recombinogénica pode ser introduzida num célula vegetal utilizando qualquer método comummente utilizado na arte, incluindo mas não se limitando a, microtransportadores (distribuição biolística), microfibras, electroporação, micro-injecção. É divulgado um método de controlo selectivo de ervas daninhas num campo, compreendendo o campo plantas com as alterações no gene de EPSPS divulgadas e ervas daninhas, compreendendo o método a aplicação no campo de um herbicida ao qual as referidas plantas foram tornadas resistentes. São também divulgadas novas mutações no gene de EPSPS que conferem resistência ou tolerância a um membro da família fosfonometilglicina, p.ex., glifosato, a uma planta ou em que a EPSPS mutada tem substancialmente a mesma actividade enzimática quando comparada com a EPSPS de tipo selvagem.

5.1 OLIGONUCLEOBASES RECOMBINOGÉNICAS 0 presente invento pode ser praticado com oligonucleobases recombinogénicas possuindo as conformações e quimicas descritas na Patente dos Estados Unidos N.° 5565350 para Kmiec (Kmiec I) e o gene da Patente U.S. N.° 5731181 (Kmiec II) . Kmiec I ensina um método para a introdução de alterações genéticas específicas num gene alvo. As oligonucleobases recombinogénicas em Kmiec I e/ou Kmiec II contêm duas cadeias complementares, uma das quais contém pelo menos um segmento de nucleótidos de tipo ARN (um "segmento de ARN") que são emparelhados em bases com nucleótidos de tipo ADN da outra cadeia. 13 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ

Kmiec II divulga que não nucleótidos contendo bases de purina e pirimidina podem substituir nucleótidos. As Patentes U.S. N.os 5756325; 5871984; 5760012; 5888983; 5795972; 5780296; 5945339; 6004804; e 6010907 e na Patente Internacional N.° PCT/US00/23457; e nas Publicações de Patente Internacional N.os WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; e WO 99/40789, divulgam moléculas recombinogénicas adicionais que podem ser utilizadas para o presente invento. O termo "oligonucleobase recombinogénica" é aqui utilizado para denotar as moléculas que podem ser utilizadas nos métodos do presente invento e inclui oligonucleótidos dúplex mistos, moléculas contendo não nucleótidos ensinadas em Kmiec II, oligodesoxinucleótidos de cadeia simples e outras moléculas recombinogénicas ensinadas nas patentes e publicações de patente acima observadas. A oligonucleobase recombinogénica é um oligonucleótido dúplex misto em que os nucleótidos de tipo ARN do oligonucleótido dúplex misto são tornados resistentes a ARNase através da substituição do 2'-hidroxilo com uma funcionalidade fluoro, cloro ou bromo ou através da substituição de um substituinte no 2'-O. Substituintes adequados incluem os substituintes ensinados pela Kmiec II. Substituintes alternativos incluem os substituintes ensinados pela Patente U.S. N.° 5334711 (Sproat) e os substituintes ensinados pelas publicações de patente ep 629387 e ep 679657 (colectivamente, os Pedidos de Martin). Tal como aqui utilizado, um derivado 2'-fluoro, cloro ou bromo de um ribonucleótido ou um ribonucleótido possuindo um 2'-OH substituído com um substituinte descrito nos Pedidos de Martin ou Sproat é designado um "Ribonucleótido 2'-Substituído". Tal como aqui utilizado o termo "nucleótido de tipo ARN" significa um Nucleótido 2'-hidroxilo ou 2'-Substituído que está ligado a outros nucleótidos de um oligonucleótido dúplex misto através de uma ligação fosfodiéster não substituída ou qualquer uma das ligações não naturais ensinadas por Kmiec I ou Kmiec II. Tal como aqui utilizado o termo "nucleótido de tipo desoxirribo" significa um nucleótido possuindo 2'-H, que pode ser ligado a outros nucleótidos de um MDON através de uma ligação fosfodiéster não substituída ou qualquer uma das ligações não naturais ensinadas por Kmiec I ou Kmiec II. 14 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ A oligonucleobase recombinogénica é um oligonucleótido dúplex misto que é ligado meramente através de ligações fosfodiéster não substituídas. Como alternativa, a ligação é através de fosfodiésteres substituídos, derivados de fosfodiéster e ligações não baseadas em fósforo tal como ensinado por Kmiec II. Alternativamente, cada nucleótido de tipo ARN no oligonucleótido dúplex misto é um Nucleótido 2'-Substituído. Os Ribonucleótidos 2'-Substituídos podem ser ribonucleótidos 2'-fluoro, 2'-metoxi, 2'-propiloxi, 2'-aliloxi, 2'-hidroxiletiloxi, 2 '-metoxietiloxi, 2'-fluoropropiloxi e 2'-trifluoropropiloxi substituídos. Ribonucleótidos 2'-Substituídos preferidos são nucleótidos 2'-fluoro, 2'-metoxi, 2'-metoxietiloxi, e 2'-aliloxi substituídos. Alternativamente o oligonucleótido dúplex misto está ligado através de ligações fosfodiéster não substituídas.

Embora o oligonucleótido dúplex misto possuindo apenas um único tipo de nucleótido de tipo ARN 2'-substituído seja mais convenientemente sintetizado, os métodos podem ser praticados com oligonucleótidos dúplex mistos possuindo um ou mais tipos de nucleótidos de tipo ARN. A função de um segmento de ARN pode não ser afectada por uma interrupção causada pela introdução de um desoxinucleótido entre dois trinucleótidos de tipo ARN, assim o termo segmento de ARN engloba um tal "segmento de ARN interrompido". Um segmento de ARN não interrompido é designado um segmento de ARN contíguo. Numa concretização alternativa um segmento de ARN pode conter nucleótidos 2'-OH alternados resistentes a ARNase e não substituídos. Os oligonucleótidos dúplex mistos têm de preferência menos de 100 nucleótidos e de preferência menos de 85 nucleótidos, mas mais de 50 nucleótidos. A primeira e segunda cadeias são emparelhadas por bases de Watson-Crick. As cadeias do oligonucleótido dúplex misto são covalentemente ligadas através de um ligante, tal como um hexanucleótido, pentanucleótido ou tetranucleótido de cadeia simples para que a primeira e segunda cadeias sejam segmentos de uma única cadeia oligonucleotídica possuindo uma única extremidade 3' e uma única extremidade 5'. As extremidades 3' e 5' podem ser protegidas através da adição de uma "coroa em alfinete" pela qual os nucleótidos 3' e 5' terminais são emparelhados por Watson-Crick com os nucleótidos adjacentes. Uma segunda coroa 15 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ em alfinete pode, adicionalmente, ser substituída na junção entre a primeira e a segunda cadeias distante das extremidades 3' e 5', para que o emparelhamento de Watson-Crick entre a primeira e a segunda cadeias seja estabilizado. A primeira e segunda cadeias contêm duas regiões que são homólogas a dois fragmentos do gene de EPSPS alvo, i.e., têm a mesma sequência que o gene alvo. Uma região homóloga contém os nucleótidos de um segmento de ARN e pode conter um ou mais nucleótidos de tipo ADN do segmento de ADN de ligação e pode também conter nucleótidos de tipo ADN que não estejam dentro do segmento de ADN interveniente. As duas regiões de homologia são separadas através de, e cada uma é adjacente a, uma região possuindo uma sequência que difere da sequência do gene alvo, designada uma "região heteróloga". A região heteróloga pode conter um, dois ou três nucleótidos mal emparelhados. Os nucleótidos mal emparelhados podem ser contíguos ou podem alternativamente ser separados por um ou dois nucleótidos que sejam homólogos ao gene alvo. Alternativamente, a região heteróloga pode também conter uma inserção ou um, dois, três ou cinco ou menos nucleótidos. Alternativamente, a sequência do oligonucleótido dúplex misto pode diferir da sequência do gene alvo apenas na deleção de um, dois, três, ou cinco ou menos nucleótidos do oligonucleótido dúplex misto. 0 comprimento e a posição da região heteróloga são, neste caso, considerados como sendo o comprimento da deleção, apesar de não haver nucleótidos do oligonucleótido dúplex misto dentro da região heteróloga. A distância entre os fragmentos do gene alvo que são complementares às duas regiões homólogas é de modo idêntico o comprimento da região heteróloga quando se pretende uma ou mais substituições. Quando a região heteróloga contém uma inserção, as regiões homólogas estão deste modo separadas no oligonucleótido dúplex misto mais longe do que os seus fragmentos homólogos complementares estão no gene, e o inverso é aplicável quando a região heteróloga codifica uma deleção.

Os segmentos de ARN dos oligonucleótidos dúplex mistos são cada um uma parte de uma região homóloga, i.e., uma região que é idêntica na sequência a um fragmento do gene alvo, segmentos estes que juntos contêm de preferência pelo menos 13 nucleótidos de tipo ARN e de preferência de 16 a 16 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ 25 nucleótidos de tipo ARN ou ainda de maior preferência 18-22 nucleótidos de tipo ARN ou ainda de preferência 20 nucleótidos. Numa concretização, os segmentos de ARN das regiões de homologia são separados por, e adjacentes a, i.e., "unidos por" um segmento de ADN interveniente. Numa concretização, cada nucleótido da região heteróloga é um nucleótido do segmento de ADN interveniente. Um segmento de ADN interveniente que contém a região heteróloga de um oligonucleótido duplex misto é designado um "segmento mutador". A alteração a introduzir no gene de EPSPS alvo é codificada pela região heteróloga. A alteração a introduzir no gene de EPSPS pode ser uma alteração numa ou mais bases da sequência do gene de EPSPS ou a adição ou deleção de uma ou mais bases.

Alternativamente, a oligonucleobase recombinogénica é um vector de mutação oligodesoxinucleotídico de cadeia simples ou SSOMV, que é divulgado no Pedido de Patente Internacional PCT/USOO/23457. A sequência do SSOMV baseia-se nos mesmos princípios que os vectores de mutação descritos nas Patentes U.S. N.os 5756325; 5871984; 5760012; 5888983; 5795972; 5780296; 5945339; 6004804; e 6010907 e nas Publicações Internacionais N.os WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; e WO 99/40789. A sequência do SSOMV contém duas regiões que são homólogas à sequência alvo separadas através de uma região que contém a alteração genética desejada designada região mutadora. A região mutadora pode ter uma sequência que tenha o mesmo comprimento que a sequência que separa as regiões homólogas na sequência alvo, mas possuindo uma sequência diferente. Uma tal região mutadora pode causar uma substituição. Alternativamente, as regiões homólogas no SSOMV podem ser contíguas umas às outras, ao mesmo tempo que as regiões no gene alvo possuindo a mesma sequência são separadas através de um, dois ou mais nucleótidos. Um tal SSOMV causa uma deleção no gene alvo dos nucleótidos que estão ausentes no SSOMV. Finalmente, a sequência do gene alvo que é idêntica às regiões homólogas pode ser adjacente no gene alvo mas separada por um, dois ou mais nucleótidos na sequência do SSOMV. Um tal SSOMV causa uma inserção na sequência do gene alvo. 17 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ

Os nucleótidos do SSOMV são desoxirribonucleótidos que são ligados através de ligações fosfodiéster não modificadas excepto que a ligação internucleótidos 3'-terminal e/ou 5'-terminal ou alternativamente as duas ligações internucleótidos 3'-terminal e/ou 5'-terminal podem ser um fosforotioato ou fosfoamidato. Tal como aqui utilizado uma ligação internucleótidos é a ligação entre nucleótidos do SSOMV e não inclui a ligação entre o nucleótido da extremidade 3' ou o nucleótido da extremidade 5' e um substituinte bloqueador, ver supra. 0 comprimento do SSOMV está entre 21 e 55 desoxinucleótidos e os comprimentos das regiões de homologia têm, assim, um comprimento total de pelo menos 20 desoxinucleótidos e pelo menos as duas regiões de homologia devem ter, cada uma, comprimentos de pelo menos 8 desoxinucleótidos. O SSOMV pode ser desenhado para ser complementar à cadeia de codificação ou não codificadora do gene alvo. Quando a mutação desejada é uma substituição de uma única base, é preferível que ambos os nucleótidos mutadores sejam uma pirimidina. Até ao ponto em que é consistente com alcançar o resultado funcional desejado é preferido que tanto o nucleótido mutador como o nucleótido alvo na cadeia complementar sejam pirimidinas. Particularmente preferidos são SSOMV que codificam mutações de transversão, i.e., um nucleótido mutador C ou T é mal emparelhado, respectivamente, com um nucleótido C ou T na cadeia complementar.

Para além do oligodesoxinucleótido, o SSOMV pode conter um substituinte de bloqueio a 5' que esteja unido aos carbonos 5' terminais através de um ligante. A química do ligante não é crítica para além do seu comprimento, que deverá ser de pelo menos 6 átomos de comprimento e o ligante deverá ser flexível. Pode ser utilizada uma variedade de substituintes não tóxicos tais como biotina, colesterol ou outros esteróides, ou um corante fluorescente catiónico não intercalante. Particularmente preferidos como reagentes para fazer SSOMV são os reagentes vendidos como Cy3™ e CyS™ por Glen Research, Sterling VA, que são fosforoamiditos bloqueados que após incorporação num oligonucleótido produzem corantes indomonocarbocianina e indodicarbocianina 3,3,3',3'- 18 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ tetrametil-N,N'-isopropil-substituídos, respectivamente. Cy3 é o mais preferido. Quando a indocarbocianina é N-oxialquil-substituída pode ser convenientemente ligada ao terminal 5' do oligodesoxinucleótido através de um fosfodiéster com um fosfato 5' terminal. A quimica do ligante corante entre o corante e o oligodesoxinucleótido não é critica e é escolhida por conveniência de sintese. Quando o fosforamidito Cy3 comercialmente disponível é utilizado como dirigido a modificação 5' resultante consiste num substituinte bloqueador e ligante juntos que são uma N-hidroxipropil-N'-fosfatidilpropil-3,3,3',3'-tetrametil-indomonocarbocianina. 0 corante indocarbocianina pode ser tetra-substituido nas posições 3 e 3' dos anéis indole. Sem limitação quanto à teoria estas substituições impedem o corante de ser um corante intercalante. A identidade dos substituintes nestas posições não é critica. 0 SSOMV pode adicionalmente ter um substituinte bloqueador a 3'. Novamente a quimica do substituinte bloqueador a 3' não é critica.

5.2 A LOCALIZAÇÃO E 0 TIPO DE MUTAÇÃO INTRODUZIDA NO GENE DE EPSPS

Numa concretização do presente invento, o gene de EPSPS de Arabidopsis thaliana (ver Figura IA) e a enzima EPSPS correspondente (ver Figura 1B) compreende uma mutação num ou mais resíduos de aminoácidos seleccionados de entre o grupo que consiste em Leui73, Glyi77, Thri78, Alai79í Met 180 λ Arg181, Proi82, Ser98, Ser 225 e LeUi98, ou num resíduo de aminoácido análogo num gene de EPSPS de outra espécie, e a mutação resulta numa ou mais das seguintes substituições de aminoácidos na enzima EPSPS em comparação com a sequência de tipo selvagem: (i) Leui73 - Phe (ii) Glyi77 - Ala ou Ile (iii) Thrne - He ou Vai ou Leu (iv) Alâi79 — Gly (v) Metiso - Cys (vi) Argisi - Leu ou Ser (vii) Proi82 - Leu ou Ser (viii) Ser98 - Asp (ix) Ser255 - Ala (x) Leuigs - Lys. 19 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ

Noutra concretização do presente invento, dentro do produto do gene de EPSPS, o residuo de aminoácido a mudar é Leu dentro da sequência contígua Leu-Tyr-Leu-Gly-Asn (SEQ id NO:29) e é mudado para Phe; ou o resíduo de aminoácido a mudar é Gly dentro da sequência contígua Asn-Ala-Gly-Thr-Ala (SEQ id NO:30) e é mudado para Ala ou Ile; ou o aminoácido a mudar é Thr dentro da sequência contígua Ala-Gly-Thr-Ala-Met (SEQ ID NO:31) e é mudado para Ile, vai ou Leu; ou o aminoácido a mudar é Ala dentro da sequência contígua Gly-Thr-Ala-Met-Arg (SEQ ID NO:32) e é mudado para Gly; ou o aminoácido a mudar é Met dentro da sequência contígua Thr-Ala-Met-Arg-Pro (SEQ ID NO:33) e é mudado para Cys; ou o aminoácido a mudar é Arg dentro da sequência contígua Ala-Met-Arg-Pro-Leu (SEQ id NO:34) e é mudado para Leu ou Ser; ou o aminoácido a mudar é Pro dentro da sequência contígua Met-Arg-Pro-Leu-Thr (SEQ ID NO:35) e é mudado para Leu ou Ser; ou o aminoácido a mudar é Ser dentro de uma sequência contígua Pro-Gly-Ser-Lys-Ser (SEQ ID NO:36) e é mudado para Asp; ou o aminoácido a mudar é Ser dentro da sequência contígua Ile-Ser-Ser-Gln-Tyr (SEQ ID NO:37) e é mudado para Ala; ou o aminoácido a mudar é Leu dentro da sequência contígua Tyr-Val-Leu-Asp-Gly (SEQ ID NO:38) e é mudado para Lys. Noutras concretizações, uma ou mais das mudanças anteriores podem ser feitas na sequência de aminoácidos de EPSPS.

Alternativamente e/ou adicionalmente, a mutação pode resultar na substituição de qualquer aminoácido nas posições correspondentes a 256, 284-288 e 353-356 em relação à proteína EPSPS representada na Figura 1B (SEQ ID NO:2).

Alternativamente, o gene de EPSPS é mutado na posição de aminoácido 177 em que Gly é substituído por Ala. Alternativamente, é a substituição de Thr na posição de aminoácido 178 por Ile. Alternativamente, uma mutação na posição de aminoácido 177 em que Gly é substituído por Ala, mais a substituição adicional de Thr na posição de aminoácido 178 por Ile. Alternativamente, mutações na posição de aminoácido 178, em que Thr é substituído por Ile, mais a mutação adicional na posição 182, em que Pro é substituído por Ser. Alternativamente, inclui a substituição de Gly na posição de aminoácido 177 por Ala, mais a mutação adicional na posição de aminoácido 182, em que Pro é substituído por Ser. Outras 20 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ sequências de EPSPS mutadas compreendem a substituição de Gly na posição 177 por Ala, mais a substituição na posição 178, em que Thr é substituído por Ile, mais a substituição adicional de Pro na posição de aminoácido 182 por Ser. Alternativamente, a substituição de Thr na posição de aminoácido 178 por Vai e a mutação adicional na posição de aminoácido 182, em que Pro é substituído por Ser. Alternativamente, a substituição de Thr na posição 178 por Leu é incluida mais a mutação na posição de aminoácido 182, em que Pro é substituído por Ser. Outra concretização inclui a substituição na posição de aminoácido 177 em que Gly é substituído por Ala, mais a substituição de Thr na posição 178 por Vai. A substituição na posição de aminoácido 177 em que Gly é substituído por Ala, mais a substituição de Thr na posição de aminoácido 178 por Leu (ver Figura 2).

As mutações anteriores no gene de EPSPS foram descritas utilizando o gene de EPSPS (SEQ ID NO:l) e a proteína (SEQ ID NO: 2) de Arabidopsis thaliana. O presente invento engloba também genes de EPSPS mutantes de outras espécies. No entanto, devido a variações nos genes de EPSPS de diferentes espécies, o número de resíduos de aminoácidos a mudar numa espécie pode ser diferente noutra espécie. Contudo, a posição análoga é facilmente identificada por um perito na arte através de homologia de sequência. Por exemplo, a Figura 3A-C mostra as sequências nucleotídicas alinhadas e a Figura 4 mostra as sequências de aminoácidos alinhadas de quatro genes de EPSPS de Arabidopsis thaliana, Zea mays, Petunia hybrida e Brassica napus. Assim, as posições análogas em Zea mays são Leug7, Glyioi/ Thrio2r Alaio3j Metio4/ Argios^ Proio6/ Ser23f Ser^g e Leui22· Assim, a sequência de aminoácidos de EPSPS de Zea mays é mutada numa ou mais das seguintes posições de aminoácidos e resulta numa ou mais das seguintes substituições: (i) Leug7 - Phe (ii) Glyioi, - Ala ou Ile (iii) Thrio2 - He ou Vai ou Leu (iv) Alaios - Gly (v) Metnn, - Cys (vi) Argios - Leu ou Ser (vii) Proio6 - Leu ou Ser (viii) Ser23 - Asp (ix) Serigg - Ala (x) Leui22 - Lys. 21 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ

Dentro do produto do gene de EPSPS de Zea mays o resíduo da sequência de aminoácidos a mudar é Leu dentro da sequência contígua Leu-Phe-Leu-Gly-Asn (SEQ ID NO:39) e é mudado para Phe; ou o resíduo de aminoácido a mudar é Gly dentro da sequência contígua Asn-Ala-Gly-Thr-Ala (SEQ ID NO:30) e é mudado para Ala ou Ile; ou o aminoácido a mudar é Thr dentro da sequência contígua Ala-Gly-Thr-Ala-Met (SEQ ID NO:31) e é mudado para Ile, Vai ou Leu; ou o aminoácido a mudar é Ala dentro da sequência contígua Gly-Thr-Ala-Met-Arg (SEQ ID NO:32) e é mudado para Gly; ou o aminoácido a mudar é Met

dentro da sequência contígua Thr-Ala-Met-Arg-Pro (SEQ ID NO:33) e é mudado para Cys; ou o aminoácido a mudar é Arg

dentro da sequência contígua Ala-Met-Arg-Pro-Leu (SEQ ID

NO:34) e é mudado para Leu ou Ser; ou o aminoácido a mudar é Pro dentro da sequência contígua Met-Arg-Pro-Leu-Thr (SEQ ID NO:35) e é mudado para Leu ou Ser; ou o aminoácido a mudar é Ser dentro de uma sequência contígua Pro-Gly-Ser-Lys-Ser (SEQ ID NO:36) e é mudado para Asp; ou o aminoácido a mudar é Ser dentro da sequência contígua Ile-Ser-Ser-Gln-Tyr (SEQ ID NO:37) e é mudado para Ala; ou o aminoácido a mudar é Leu

dentro da sequência contígua Tyr-Val-Leu-Asp-Gly (SEQ ID NO:38) e é mudado para Lys. Alternativamente, uma ou mais das alterações anteriores podem ser feitas na sequência de aminoácidos de EPSPS.

Em Brassica napus, as posições de aminoácidos análogas são Leui69/ Glyi73, Thri74, Alai75, Meti76, Argi77, Proi78, Ser94, Ser25i e Leui94. Assim, a sequência de aminoácidos de EPSPS de Brassica napus é mutada numa ou mais das seguintes posições de aminoácidos e resulta numa ou mais das seguintes substituições: (i) Leui69 - Phe (ii) Glyi73 - Ala ou Ile (iii) Thri74 - Ile ou Vai ou Leu (iv) Alans - Gly (v) Metne - Cys (vi) Argi?? - Leu ou Ser (vii) Prons - Leu ou Ser (viii) Serg4 - Asp (ix) Ser25i - Ala (x) Leui94 - Lys 22 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ

Dentro do produto do gene de EPSPS de Brassica napus o resíduo de aminoácido a mudar é Leu dentro da sequência contígua Leu-Tyr-Leu-Gly-Asn (SEQ id NO:29) e é mudado para Phe; ou o resíduo de aminoácido a mudar é Gly dentro da sequência contígua Asn-Ala-Gly-Thr-Ala (SEQ id NO:30) e é mudado para Ala ou Ile; ou o aminoácido a mudar é Thr dentro da sequência contígua Ala-Gly-Thr-Ala-Met (SEQ ID N0:31) e é mudado para Ile, Vai ou Leu; ou o aminoácido a mudar é Ala dentro da sequência contígua Gly-Thr-Ala-Met-Arg (SEQ ID NO:32) e é mudado para Gly; ou o aminoácido a mudar é Met

dentro da sequência contígua Thr-Ala-Met-Arg-Pro (SEQ ID NO:33) e é mudado para Cys; ou o aminoácido a mudar é Arg dentro da sequência contígua Ala-Met-Arg-Pro-Leu (SEQ id

NO:34) e é mudado para Leu ou Ser; ou o aminoácido a mudar é Pro dentro da sequência contígua Met-Arg-Pro-Leu-Thr (SEQ ID NO:35) e é mudado para Leu ou Ser; ou o aminoácido a mudar é Ser dentro de uma sequência contígua Pro-Gly-Ser-Lys-Ser (SEQ ID NO:36) e é mudado para Asp; ou o aminoácido a mudar é Ser dentro da sequência contígua Ile-Ser-Ser-Gln-Tyr (SEQ ID NO:37) e é mudado para Ala; ou o aminoácido a mudar é Leu

dentro da sequência contígua Tyr-Val-Leu-Asp-Gly (SEQ ID NO:38) e é mudado para Lys. Alternativamente, uma ou mais das alterações anteriores podem ser feitas na sequência de aminoácidos de EPSPS.

Em Petunia hybrida as posições análogas são Leu469 , Glyi73, Thri74, Alai75, Meti76, Argi77, Proi78 Ser94, Ser254 e Leu494 . Assim, a sequência de aminoácidos de EPSPS de Petunia hybrida ê mutada numa ou mais das seguintes posições de aminoácidos e resulta numa ou mais das seguintes substituições: (i) Leui69 - Phe (ii) Glyi73 - Ala ou Ile (iii) Thri74 - lie ou Vai ou Leu (iv) Alai75 - Gly (v) Meti76 - Cys (vi) Arg477- Leu ou Ser (vii) Pro478 - Leu ou Ser (viii) Ser94 - Asp (ix) Ser25i - Ala (x) Leui94 - Lys 23 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ

Dentro do produto do gene de EPSPS de Petunia hybrida o resíduo de aminoácido a mudar é Leu dentro da sequência contígua Leu-Phe-Leu-Gly-Asn (SEQ id NO:39) e é mudado para Phe; ou o resíduo de aminoácido a mudar é Gly dentro da sequência contígua Asn-Ala-Gly-Thr-Ala (SEQ ID NO:30) e é mudado para Ala ou Ile; ou o aminoácido a mudar é Thr dentro da sequência contígua Ala-Gly-Thr-Ala-Met (SEQ ID NO:31) e é mudado para ile, Vai ou Leu; ou o aminoácido a mudar é Ala dentro da sequência contígua Gly-Thr-Ala-Met-Arg (SEQ ID NO:32) e é mudado para Gly; ou o aminoácido a mudar é Met

dentro da sequência contígua Thr-Ala-Met-Arg-Pro (SEQ ID NO:33) e é mudado para Cys; ou o aminoácido a mudar é Arg

dentro da sequência contígua Ala-Met-Arg-Pro-Leu (SEQ ID

NO:34) e é mudado para Leu ou Ser; ou o aminoácido a mudar é Pro dentro da sequência contígua Met-Arg-Pro-Leu-Thr (SEQ ID NO:35) e é mudado para Leu ou Ser; ou o aminoácido a mudar é Ser dentro de uma sequência contígua Pro-Gly-Ser-Lys-Ser (SEQ ID NO:36) e é mudado para Asp; ou o aminoácido a mudar é Ser dentro da sequência contígua Ile-Ser-Ser-Gln-Tyr (SEQ ID NO:37) e é mudado para Ala; ou o aminoácido a mudar é Leu

dentro da sequência contígua Tyr-Val-Leu-Asp-Gly (SEQ ID NO:38) e é mudado para Lys. Alternativamente, uma ou mais das alterações anteriores podem ser feitas na sequência de aminoácidos de EPSPS.

5.3 A DISTRIBUIÇÃO DE OLIGONUCLEOBASES RECOMBINOGÉNICAS EM CÉLULAS VEGETAIS

Qualquer método vulgarmente conhecido pode ser utilizado nos métodos do presente invento para transformar uma célula vegetal com uma oligonucleobase recombinogénica. Métodos ilustrativos são listados acima.

5.3.1 MICROTRANSPORTADORES E MICROFIBRAS A utilização de microtransportadores metálicos (microesferas) para introdução de grandes fragmentos de ADN em células vegetais possuindo paredes celulares celulósicas através da penetração de projécteis é bem conhecida dos peritos na arte relevante (em diante distribuição biolística). As Patentes dos Estados Unidos Nos 4945050; 5100792 e 5204253 24 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ descrevem técnicas gerais para selecção de microtransportadores e dispositivos para os projectar.

Condições especificas para utilizar microtransportadores nos métodos do presente invento são descritas na Publicação Internacional WO 99/07865. Numa técnica ilustrativa, microtransportadores gelados (60 mg/ml), oligonucleótido dúplex misto (60 mg/ml), CaCl2 2,5 M e espermidina 0,1 M são adicionados por essa ordem; a mistura é suavemente agitada, p.ex., através de vórtice, durante 10 minutos e deixada assentar à temperatura ambiente durante 10 minutos, após o que os microtransportadores são diluídos em 5 volumes de etanol, centrifugados e ressuspensos em etanol a 100%. Podem-se obter bons resultados com uma concentração na solução de adesão de 8-10 pg/pl de microtransportadores, 14-17 pg/ml de oligonucleótido dúplex misto, CaCÍ2 1,1-1,4 M e espermidina 18-22 mM. Os resultados óptimos foram observados sob as condições de 8 pg/pl de microtransportadores, 16,5 pg/ml de oligonucleótido dúplex misto, CaCl2 1,3 M e espermidina 21 mM.

As oligonucleobases recombinogénicas podem também ser introduzidas em células vegetais para a prática do presente invento utilizando microfibras para penetrar na parede celular e na membrana celular. A Patente U.S. N.° 5302523 para Coffee et al. descreve a utilização de fibras de carboneto de silício de 30x0,5 pm e 10x0,3 pm para facilitar a transformação de culturas de milho em suspensão de Black Mexican Sweet. Qualquer técnica mecânica que possa ser utilizada para introduzir ADN numa célula vegetal utilizando microfibras pode ser utilizada para distribuir oligonucleobases recombinogénicas para transmutação.

Uma técnica ilustrativa para distribuição de microfibras de uma oligonucleobase recombinogénica é como se segue: Microfibras estéreis (2 pg) são suspensas em 150 pl de meio de cultura de plantas contendo cerca de 10 pg de um oligonucleótido dúplex misto. Uma cultura em suspensão é deixada assentar e volumes iguais de células empacotadas e da suspensão de fibras/nucleótidos estéril são sujeitos a vórtice durante 10 minutos e plaqueados. Meios selectivos são aplicados imediatamente ou com um atraso de até cerca de 120 horas conforme apropriado para a característica em particular. 25 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ

5.3.2 ELECTROPORAÇÃO DE PROTOPLASTOS

Numa concretização alternativa, as oligonucleobases recombinogénicas podem ser distribuídas à célula vegetal através de electroporação de um protoplasto derivado de uma parte da planta. Os protoplastos são formados através de tratamento enzimático de uma parte da planta, particularmente uma folha, de acordo com técnicas bem conhecidas dos peritos na arte. Ver, p.ex., Gallois et al., 1996, em "Methods in Molecular Biology" 55: 89-107, Humana Press, Totowa, N.J.; Kipp et al., 1999, em "Methods in Molecular Biology" 133: 213-221, Humana Press, Totowa, N.J. Os protoplastos não necessitam de ser cultivados em meio de crescimento antes da electroporação. Condições ilustrativas para electroporação são 3χ105 protoplastos num volume total de 0,3 ml com uma concentração de oligonucleobase recombinogénica de entre 0,6 a 4 pg/mL.

5.3.3 FILAMENTOS E MICRO-INJECÇAO

Ainda noutra concretização alternativa, a oligonucleobase recombinogénica pode ser distribuída à célula vegetal através de filamentos ou micro-injecção da célula vegetal. A designada técnica de filamentos é efectuada essencialmente tal como descrito em Frame et al., Plant J. 6: 941-948, 1994. A oligonucleobase recombinogénica é adicionada aos filamentos e utilizada para transformar as células vegetais. A oligonucleobase recombinogénica pode ser co-incubada com plasmídeos compreendendo sequências codificando proteínas capazes de formar complexos de recombinase em células vegetais de modo a que a recombinação seja catalisada entre o oligonucleótido e a sequência alvo no gene de EPSPS.

5.4 SELECÇÃO DE PLANTAS RESISTENTES AO GLIFOSATO

As plantas ou células vegetais podem ser testadas quanto à resistência ou tolerância a um herbicida utilizando métodos vulgarmente conhecidos na arte, p.ex., cultivando a planta ou célula vegetal na presença de um herbicida e medindo a velocidade de crescimento em comparação com a velocidade de crescimento na ausência do herbicida. 26 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ

6. EXEMPLO

As seguintes experiências demonstram a produção de genes mutantes de EPSPS de Arabidopsis thaliana que são resistentes ao herbicida glifosato e que permitem que as células vegetais mantenham a velocidade de crescimento.

6.1 MATERIAL E MÉTODOS

6.1.1 ISOLAMENTO DE ADNC DE EPSPS DE ARABIDOPSIS THALIANA

Um fragmento de ADN de 1,3 kb foi amplificado por PCR a partir de uma biblioteca de ADNc de Arabidopsis utilizando os iniciadores AtEXPEXPMl e AtEXPEXP2CM-2. Os dois iniciadores foram desenhados para amplificar o ADNc do péptido maduro até ao codão de terminação. 0 iniciador 5' AtEXPEXPMl contém um local Xbal (sublinhado) e o iniciador 3' AtEXPEXP2CM-2 contém um local BglII (sublinhado), locais que serão úteis para clonagem do fragmento no vector de expressão.

AtEXPEXPMl 5'-GCTCTAGAGAAAGCGTCGGAGATTGTACTT-3' (SEQ ID NO:40) AtEXPEXP2CM-2 5'-GCAGATCTGAGCTCTTAGTGCTTTGTGATTCTTTCAAGTAC-3' (SEQ ID NO:41) A banda de PCR foi excisada do gel de agarose e purificada (GeneClean, Biol). A sua sequência foi então confirmada como a sequência do péptido maduro do gene de EPSPS de Arabidopsis thaliana.

6.1.2 PREPARAÇÃO DO VECTOR DE EXPRESSÃO A região de codificação de EPSPS do gene AroE de Bacillus subtilis foi obtida por PCR utilizando os seguintes iniciadores:

BsAroE5'Xba

5'-GCGTCTAGAAAAACGAGATAAGGTGCAG-3' (SEQ ID NO:42) e BsAroE3'BamHI 5'-GCGGATCCTCAGGATTTTTTCGAAAGCTTATTTAAATG-3' (SEQ ID NO:43). 27 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ Ο fragmento de PCR, sem um codão de iniciação (ATG), foi clonado enquadrado no vector pACLacIMH6RecA através da substituição do ORF de RecA através de digestão com Xbal e BamHI. PACLacIMH6RecA continha a região iacl de Pet21 nas posições 1440 a 3176, o MH6 RecA nas posições 3809 a 5188, o gene de resistência a cloranfenicol nas posições 5445-218 (5446 a 5885 ela 218), e a origem de replicação pl5A nas posições 581 e 1424. A região de codificação do gene RecA foi clonada a partir de E. coli enquadrada com o codão de inicio e o ligante de 6 histidinas (MH6) por trás do promotor LacZ de pUC19.

6.1.3 CLONAGEM DO GENE DE EPSPS DE ARABIDOPSIS NO VECTOR DE EXPRESSÃO BACTERIANO O fragmento de PCR de 1,3 kb de Arabidopsis foi digerido com Xbal e BamHI (compatível com BglII) e clonado no plasmídeo pACYCLaciMH6EPSPS, em vez do gene de Bacillus.

Os clones obtidos (seleccionados em cloranfenicol) foram então sequenciados e confirmou-se serem positivos. Um dos clones confirmados (pAtEPS-12) foi seleccionado e as junções entre o ADNc e o plasmídeo de clonagem foram também confirmadas serem idênticas às sequências esperadas.

6.1.4 NOVAS MUTAÇÕES PONTUAIS NO GENE DE EPSPS

Foram desenhados dez mutantes diferentes do gene de EPSPS de Arabidopsis thaliana (ver Figura 2). Para as experiências de mutagénese, iniciadores de PCR foram desenhados com uma, duas ou três mutações. As reacções de PCR foram efectuadas utilizando um iniciador flanqueador normal (5'ATEPS-198: 5' -GAAAGCGTCGGAGATTGTAC-3' (SEQ ID NO :44)) e um dos iniciadores portadores de mutação (ver Figura 5).

Os fragmentos de PCR de 353 pb obtidos foram purificados (estojo de Purificação de PCR Qiagen) e a sua sequência foi confirmada. Os fragmentos foram então digeridos com PstI (sublinhado nas sequências iniciadoras) e BamHI e ligados ao vector pAtEPS-12, que tinha sido ele próprio anteriormente digerido com PstI e BamHI. Células competentes JM 109 28 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ (Promega) foram utilizadas para a transformação e plaqueadas sobre placas de LB contendo cloranfenicol. Os clones de cada experiência de mutagénese foram então isolados e a sua sequência confirmada.

6.1.5 ENSAIOS DE RESISTÊNCIA AO GLIFOSATO Células electrocompetentes de SA4247, uma estirpe LacZ-de Salmonella typhi, foram preparadas de acordo com procedimentos bem conhecidos (ver "Current Protocols in Molecular Biology", (Wiley and Sons, Inc.)). 30 μΐ de células competentes SA4247 foram electroporados com 20 ng de cada ADN plasmidico codificando proteínas EPSPS de tipo selvagem e mutantes de Arabidopsis, EPSPS de tipo selvagem de Bacillus, juntamente com uma falsa transfecção como um controlo. As definições para electroporação foram 25 pF, 2,5 KV e 200 ohms. Após electroporação, as células foram transferidas para tubos de cultura de 15 ml e suplementadas com 970 μΐ de meio SOC. As culturas foram incubadas durante 1½ hora a 37°C a 225 rpm. 50 μΐ de cada cultura foram plaqueados em placas de LB contendo 17 pg/ml de cloranfenicol (em duplicados) e incubou-se de um dia para o outro a 37°C. No dia seguinte, 5 colónias de cada placa foram apanhadas e transferidas para placas de M9 e incubou-se de um dia para o outro a 37°C.

As colónias da incubação de um dia para o outro em M9 sólido foram inoculadas em 4 ml de meio M9 líquido e criadas de um dia para o outro a 37°C. No dia seguinte, 25 ml de meio M9 líquido contendo cloranfenicol, IPTG e Glifosato 17 mM ou 0 mM (Aldrich, 33775-7) foram inoculados com 1-2 ml de cada cultura de véspera (em duplicados), a DO de partida (a 600 nm) foi medida e todas as culturas foram normalizadas para começar à mesma DO. Foi tomada uma medição da DO hora a hora durante sete horas. Como controlo do crescimento bacteriano, foi também inoculada uma cultura de Salmonella não transformada em meio LB simples. Em duas experiências independentes, os clones Ai77I 178, Ai77Vi78 Ai77l178 e I177 não cresceram em meio M9, por essa razão os ensaios de resistência ao glifosato não puderam ser efectuados nestes. 29 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ

6.1.7 ISOLAMENTO Ε PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA EXPRESSA A PARTIR DE CLONES BACTERIANOS

Um mililitro de cultura de véspera de cada um dos clones bacterianos é inoculado em 100 ml de meio LB liquido contendo cloranfenicol. As células foram deixadas a crescer a 37°C até alcançarem uma DO de 0,5-0,7 (aproximadamente 3½ horas). Foi então adicionado IPTG às culturas a uma concentração de 1,0 mM. As células foram criadas mais 5 horas. Foram então sedimentadas a 4000 rpm durante 20 minutos a 4°C. O isolamento e a purificação das proteínas marcadas com His foram efectuados seguindo o Sistema de Purificação de Proteínas Ni-NTA de Qiagen. Os lisados celulares e eluatos foram corridos em duplicado em géis de acrilamida a 12,5%. Um dos géis foi corado com prata para visualização imediata, o segundo gel foi transferido para membrana Millipore Immobilon-P, e bloqueado de um dia para o outro em leite a 5% em TBS-T. A membrana foi então exposta a solução de anticorpo primário Anti-His (Amersham Pharmacia biotech, cat# 37-4710), seguido de exposição a solução de anticorpo secundário Anti-IgG de Ratinho (NIF825, do sistema de análise de Western blotting ECL de Amersham Pharmacia biotech, cat# RPN2108). As lavagens e reacções de detecção foram efectuadas de acordo com as instruções do fabricante. Autorradiogramas foram revelados após 5 minutos de exposição.

6.2 RESULTADOS

As células contendo uma mutação no gene de EPSPS produziram células que eram resistentes ao herbicida glifosato e que tinham uma velocidade de crescimento substancialmente semelhante na ausência ou presença de glifosato, quando comparadas com as células de tipo selvagem, independentemente da presença de glifosato (ver Figura 6).

Foi também demonstrado que os clones de Arabidopsis contendo um gene de EPSPS mutante expressavam a proteína mutante substancialmente ao mesmo nivel que a proteína de tipo selvagem (ver Figura 7). 30 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> VALIGEN(US), INC.

<120> PLANTAS RESISTENTES A HERBICIDAS NÃO TRANSGÉNICAS <130> 7991-086-228 <150> 60/158, 027 <151> 1999-10-07 <150> 60/173,564 <151> 1999-12-30 <160> 44 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 < 210 > 1 <211> 2763

< 212 > ADN <213> Arabidopsis thaliana < 4 0 0 > 1 cccttcatgt ctctcgtaga aaccccaCCa tccctcccag ggcccaattg aaaacccaca 60 ttttctttca cctaacccac caaagccttg cacatgttga cgtgaacacc aaactaacac 120 gtgtcàtact gccagtggtt atgataaatg ctcataccat accagagtca tagagttttt 180 ggttggtgaa agatttgacg gatgccttct tctcatttct caccaactcc ctccaaaccc 240 aacaaaatgt tcatattagc aaagccgcca aagcgtaaac gaaagtttat aaaetecatt 300 C^g^atcL· tacgtaattg gaggaagatc aaaattttca atccccattc ttcgattgct .360 tcaattgaag tCtctccgat ggcgcaagtt agcagaaCct gcaatggtgt gcagaaccca 420 tctcttatct ccaatctctc gaaatccagt caacgcaaat ctcccttatc ggtttctctg 480 aagacgcagc agcatccacg agcttatccg atttcgtcgt cgtggggatc gaagaagagt 540 gggatgacgt taattggctc tgagcttcgt cctcttaagg Ccatgtcttc tgtttccacg 600 gcggagaaag cgtcggagac tgtacttcaa cccattagag aaatctccgg tcttattaag 660 ctccceggct ccaagtctcc atcaaatcgg atcctgcttc tcgctgctcc gtccgaggta 720 tacatcactt cgtttcgtcc ttctctgtaa tctgaactca gattataaag attgatactt 780 taccattttg ctgtggtttt atagggaaca actgtagtgg acaacttgtt gaatagcgat 84Ô gacatcaatt acatgcttga tgcgttgaag agattgggac ttaatgtgga aactgacagt 900 gaaaataatc gtgctgtagt tgaaggatgt ggcgggatat tcccagcttc catagattca 960 aagagtgata tcgaacttta cctcggtaat gcaggaacag caatgcgtcc acttaccgct 1020 gcggtcaccg ctgcaggcgg aaacgcaagg cagattgaag gagttgatgc ttcttggeat 1080 ttgatgttta aggaatggag ctttcgttga tgctttatga tccatttatt ccagttatgt 1140 gcttgatggg gtgcctcgta tgagagaaag accCataggg gatttggttg ttggtcttaa 1200 gcagcttggt gctgatgttg aatgtactct tggaactaac tgccctcctg ttcgtgtcaa 1260 cgctaatggt ggccttcccg gtggaaaggt tagatcttgc aaatggcatg tgaatatgta 1320 atctcgttcc ttactctatg aacacttgca gaaatgtgtg ttcatcatag ccttagcttg 1380 acaagatttc agtttttaat ctactctcaa cggatggatc ctaaaataga atcggatttg 1440 gtgactggtc ttcgttctcg attaccgttt tcgttgtatg atttcttgat taacaattag 1500 gagacacgtt atgcatttgc aggtgaagct ttctggatca attagtagtc agtacttgac 1560 tgctctgctc atgtctgctc ccttagctct tggagacgtc gagatcgaga ttgtcgataa 1620 attaatttct gttccatatg ttgaaacgac attgaagttg atggaacgtt tcggggttag 1680 tgtcgagcat agtgatagct gggatcgttt ctttgtcaag ggcgggcaaa aatacaagta 1740 ggagttattc ttttcttcct tttctgaaat cacatccctt agcttgacaa tataatgact 1800 aaaaggtgaa tgattcaggt ctccgggtaa tgcgtatgta gaaggtgatg cttctagtgc 1860 atgttatttc ttggctggtg ctgccattac cggtgaaact gtcacagtcg aaggttgtgg 1920 aactaccagc ttgcaggtaa tatttgtaca ctgaatcatc gacgaggctg ttaagtttat 1980 31 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ caeattcgca 2040 gccgaggtcc 2100 acaggaccac 2160 aaeaaaatgc 2220 accaccatta 2280 atgatcactc 2340 aggatgattg 2400 gtctcttgac 2460 Cgggagctac 2520 aaacggcaga 2580 cttgtgctga 2640 accacttcca 2700 ctgatccaag 2760 2763 agtgaaattc gtctaggtca aagtttcatc ctctgacaag tcgtacataa agattctaag ctcaactctt gtgatgaatc tctagggaga tgcaaaattc ttgagaaaat gggatgtaaa gtgccctgga cagagaacag tgtgactgtg ctagagatgc ttttggaatg agacacttgc gggcCattga tgccaacatg ctgatgtagc catgaccctt gccgtcgttg ctctctttgc tgacggccca gagatggtaa gtaaaaagct ctctcttata attaaggttt ctcaatattc aattctgttt ggCtaataCa gtggctagct ggagagtaaa ggagacagaa ccatcegcac agagcttaga aaagtaagag attctcatct ctctctttct agcgctcatt ctaagtaatt agctcataaa tttgtgtgtt tgtgtccagc agtggaagaa ggttcagatt attgtgtgac aactccgccc aaaaaggtga gattgataca tatgatgatc acagaatggc aatggcattc tctcttgcag tgttccaatc accatcaacg actctggttg caccaggaaa accttccccg agtacttgaa agaatcacaa agcactaaac aataaactct gttttttctt ctt

<210> 2 <211> 520 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2

Met Ala Gin Vai Ser Arg Ile Cys Asn Gly Vai Gin Asn Pro Ser Leu 1 5 10 15 Ile Ser Asn Leu Ser Lys Ser Ser Gin Arg Lys Ser Pro Leu Ser Vai 20 25 30 Ser Leu Lys Thr Gin Gin Hls Pro Arg Ala Tyr Pro Ile Ser Ser Ser 35 40 45 Trp Gly Leu Lys Lys Ser Gly Met Thr Leu Ile Gly Ser Glu Leu Arg 50 55 60 Pro Leu Lys Vai Met Ser Ser Vai Ser Thr Ala Glu Lys Ala Ser Glu 65 70 7S B0 Ile Vai Leu Gin Pro Ile Arg Glu Ile Ser Gly Leu Ile Lys Leu Pro 85 90 95 Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser 100 105 110 Glu Gly Thr Thr Vai Vai Asp Asn Leu Leu Asn Ser Asp Asp Ile Asn 115 120 125 Tyr Met Leu Asp Ala Leu Lys Arg Leu Gly Leu Asn Vai Glu Thr Asp 130 135 140 Ser Glu Asn Asn Arg Ala Vai Vai Glu Gly Cys Gly Gly Ile Phe Pro 145 150 155 160 Ala Ser Ile Asp Ser Lys Ser Asp Ile Glu Leu Tyr Leu Gly Asn Ala 165 170 175 Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Vai Thr Ala Ala Gly Gly 180 185 190 Asn Ala Ser Tyr Vai Leu Asp Gly Vai Pro Arg Met Arg Glu Arg Pro 195 200 205 Ile Gly Asp Leu Vai Vai Gly Leu Lys Gin Leu Gly Ala Asp Vai Glu 210 215 220 Cys Thr Leu Gly Thr Asn Cys Pro Pro Vai Arg Vai Asn Ala Asn Gly 225 230 235 240 Gly Leu Pro Gly Gly Lys Vai Lys Leu Ser Gly Ser Ile Ser Ser Gin 245 250 255 Tyr Leu Thr Ala Leu Leu Met Ser Ala Pro Leu Ala Leu Gly Asp Vai 260 265 270 Glu Ile Glu lie Vai Asp Lys Leu Ile Ser Vai Pro Tyr Vai Glu Met 27 5 280 285 32 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ

Thr Leu Lys Leu Met Glu Arg Phe Gly Vai Ser Vai Glu His Ser Asp 290 295 300 Ser Trp Asp Arg Phe Phe Vai Lys Gly Gly Gin Lys Tyr Lys Ser Pro 305 310 315 320 Gly Asn Ala Tyr Vai Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Cys Tyr Phe Leu 325 330 335 Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Glu Thr Vai Thr Val Glu Gly Cys Gly 340 345 350 Thr Thr Ser Leu Gin Gly Asp Vai Lys Phe Ala Glu Val Leu Glu Lys 355 360 365 Met Gly Cys Lys Vai Ser Trp Thr Glu Asn Ser Val Thr Val Thr Gly 370 375 380 Pro Pro Arg Asp Ala Phe Gly Met Arg His Leu Arg Ala Ile Asp Val 385 390 395 400 Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Vai Ala Met Thr Leu Ala Val Val Ala 405 410 415 Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Thr Ile Arg Asp Val Ala Ser Trp Arg 420 425 430 Vai Lys Glu Thr Glu Arg Met Ile Ala Ile Cys Thr Glu Leu Arg Lys 435 440 445 Leu Gly Ala Thr Vai Glu Glu Gly Ser Asp Tyr Cys Val Ile Thr Pro 450 455 460 Pro Lys Lys Vai Lys Thr Ala Glu Ile Asp Thr Tyr Asp Asp His Arg 465 470 475 480 Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Asp Val Pro Ile Thr 4S5 490 495 Ile Asn Asp Ser Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro ASp Tyr Phe Gin 500 505 510 Vai Leu Glu Arg Ile Thr Lys His 515 520 < 210 > 3 < 211 > 33 <212> ADN <213> Arabidopsis thalíana < 2 2 0 > < 2 21 > CDS <222> (D . . . (33) <400> 3 ctc ggt aat gca gca aca gca atg cgt cca ctt Leu Gly Asn Ala Ala Thr Ala Met Arg Pro Leu 15 10

<210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Arabidopsis thalíana <400> 4

Leu Gly Asn Ala Ala Thr Ala Mec Arg Pro Leu 15 10

<210> 5 <211> 33 <212> ADN <213> Arabidopsis thalíana <220>

<221> CDS <222> (1) ... (33) 33 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ < 4 0 0 > 5 ctc ggt aat gca gga ata gca atg cgt cca ctt Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Pro Leu 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana < 4 0 0 > 6 Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Pro Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 33 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana < 2 2 0 > <221> CDS <222> (D ... (33) < 4 0 0 > 7 ctc ggt aat gca gca ata gca atg cgt cca ctt Leu Gly Asn Ala Ala Ile Ala Met Arg Pro Leu 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana < 4 0 0 > 8 Leu Gly Asn Ala Ala Ile Ala Met Arg Pro Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 33 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <22 0> <221> CDS <222> (D · · · (33) < 4 0 0 > 9 ctc ggt aat gca gga ata gca atg cgt tca ctt Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana 34 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ < 4 0 0 > 10 Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 33 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana < 2 2 0 > <221> CDS <222> (D . . . (33) < 4 0 0 > 11 CtC ( ggt aat gca gca aca gca atg cgt tca ctt Leu ( 31y Asn Ala Ala Thr Ala Met Arg Ser Leu 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana < 4 0 0 > 12 Leu Gly Asn Ala Ala Thr Ala Met Arg Ser Leu 1 5 10 <210> 13 <211> 33 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (D ... (331 1 < 4 0 0 > 13 ctc ggt aat gca gca ata gca atg cgt tca ctt Leu Gly Asn Ala Ala Ile Ala Met Arg Ser Leu 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana < 4 0 0 > 14 Leu Gly Asn Ala Ala Ile Ala Met Arg Ser Leu 1 5 10 <210> 15 <211> 33 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana 33 35 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ <22 0> <221> CDS <222> (1)...(33) < 4 Ο Ο > 15 ctc ggt aat gca gga gta Leu Gly Asn Ala Gly Vai gca atg cgt tca ctt Ala Met Arg Ser Leu 1 5 10

<210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana < 4 0 0 > 16

Leu Gly Asn Ala Gly Vai Ala Met Arg Ser Leu 15 10

<210> 17 <211> 33 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana < 2 2 0 >

<221> CDS <222> (1) ... (33) <400> 17 ctc ggt aat gca gga tta gca atg cgt tca ctt 33

Leu Gly Asn Ala Gly Leu Ala Met Arg Ser Leu 1 5 10

<210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana < 4 0 0 > 18

Leu Gly Asn Ala Gly Leu Ala Met Arg Ser Leu 15 10

<210> 19 <211> 33 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana < 2 2 0 > <221> CDS <222> (1)...(33) < 4 0 0 > 19 ctc ggt aat gca gca gta gca atg cgt cca ctt Leu Gly Asn Ala Ala Vai Ala Met Arg Pro Leu 15 10 33 36 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ

<210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 20 Leu Gly Asn Ala Ala Vai Ala Met Arg Pro 1 s 10 <210> 21 <211> 33 <212> ADN < 213 > Arabidopsis thaliana < 2 2 0 > < 2 21 > CDS < 2 2 2 > (1) ... (33 ) < 4 0 0 > 21 ctc ggt aat gca gca tta gca atg cgt cca Leu Gly Asn Ala Ala Leu Ala Met Arg Pro 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana < 4 0 0 > 22 Leu Gly Asn Ala Ala : Leu Ala Met Arg Pro 1 5 10 <210> 23 <211> 3831 <212> ADN 33 <213> Brassisca napus <220> <221> modified_base <222> 1...3831 <223> n=a, c, g, ou t <400> 23 agaccttaaa ggctctttte cagtctcacc taccaaaact ataagaaaat ccacttgctg 60 tctgaaacag ccgacgtgga taaagtactt aagacgtggc acattattat tggctactag 120 aaaaaaaact catacaccaC cgtaggagct ggggttggtg aagaatttga tgggtgcctc 180 tccccccccc actcaccaaa ctcatgttct ttgtaaagcc gtcactacaa caacaaagga 240 gacgacagtt ctatagaaaa gctttcaaat tcaatcaatg gcgcaatcta gcagaatctg 300 ccatggcgtg cagaacccat gtgttatcat ctccaatctc cccaaatcca accaaaacaa 360 atcacctttc tccgtctcct tgaagacgca tcagcctcga gcttcttcgt ggggattgaa 420 gaagagtgga acgatgctaa acggttctgt aattcgcccg gttaaggtaa cagcttctgt 480 ttccacgtcc gagaaagctt cagagattgt gcttcaacca atcagagaaa tctcgggtct 540 37 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ catcaagcta cccggatcca aatctcCctc caatcggatc ctccttcttg ccgctctatc 600 tgaggtacat atacttgccc agtgttaggc ctttgctgtg agattttggg aactatagac 660 aattcagtaa gaatttatat ataatttttt taaaaaaaat cagaagccta tatatattta 720 aatttttcca aaatttttgg aggttatagg cccacgttac accattctag tctgcatctt 780 tcggtttgag actgaagaat tttatttctt aaaaaatcac tacagggaac tactgtagcg 840 gacaacttgt cgaacagtga tgacatcaac tacatgcctg atgcgttgaa gaagctgggg 900 cttaacgtgg aacgcgacag Cgtaaacaac cgtgcggttg tcgaaggatg cggtggaata 960 ttcccagctt cctcagatcc caagagtgat attgagttgt accttgggaa tgcaggaaca 1020 gccatgcgtc cactcaccgc Cgcagttaca gctgcaggtg gcaacgcgag gtaaggttaa 1080 cgagtttttt gttattgtca agaaattgac cttgtgtttg atgcttttag tttggttcgt 1140 tttctagtta cgtacttgat ggggtgccta gaatgaggga aagacctata ggagatttgg 1200 ttgttggtct caagcagctt ggtgctgatg ttgagtgtac tcttggcact aactgtcctc 1260 ctgttcgtgt caatgctaat ggtggccttc ccggtggaaa ggtgatcttc acatttactc 1320 tatgaattgt ttgcagcagt ctttgttcat cacagccttt gcttcacatt atttcatctt 1380 ttagtttgtt gttatattac ttgacggatc tttaaaaagg aattgggtcc ggtgtgaaag 1440 tgattagcaa tctttctcga ttccttgcag ggccgtgggc attactaagt gaaacattag 1500 cctattaacc cccaaaatct ttgaaaaaaa tttagtatac ggccccaaaa tagtttttta 1560 aaaaattaga aaaactctta ataaatcgtc tacagtcccn naaaCcCtag agccggccct 1620 gcttgcatgg tttctcgatt gatatattag actatgttcc gaatctccag gtgaagcttt 1680 ctggatcgat cagtagtcag tacttgactg ccctcctcat ggcagctcct ttagctcttg 1740 gagacgtgga gattgagatc attgataaac tgatatctgt tccatatgCC gaaatgacat 1800 tgaagttgat ggagcgtctc ggtgtcagcg ccgagcatag tgacagctgg gatcgcttct 1860 ttgtcaaggg cggtcagaaa tacaagtaat gagttcttct aagttgagag ttagattgaa 1920 gaatgaatga ctgattaacc aaatggcaaa actgattcag gtcgcctggt aatgcttatg 1960 tagaaggtga tgcttctagt gctagctatt tcttggctgg tgctgccatt actggtgaaa 2040 ctgttactgt cgaaggttgt ggaacaacta gcctccaggt agCttatcca ctctgaatca 2100 tcaaatatta ttctccctcc gttttatgtt aagtgtcatt agcttttaaa ttttgtttca 2160 ttaaaagcgt cattttacat tttcaatgca tatattaaat aaattttcca gtttttacta 2220 atccattaat tagcaaaacc aaacaaaaat tatattaaat aatgtaaaat tcgtaatttg 2280 tgtgcaaata ccttaaacct tatgaaacgg aaaccttatg aaacagaggg agtactaatt 2340 ttataataaa atttgattag ttcaaagttg tgtataacat gttttgtaag aatctaagct 2400 cattctcttt ttattttttg tgatgaatcc aaagggagat gtgaaattcg cagaggttct 2460 tgagaaaatg ggatgtaaag tgtcatggac agagaacagt gtgactgtga ctggaccatc 2520 aagagatgct tttggaatga ggcacttgcg tgctgttgat gtcaacatga acaaaatgcc 2580 tgatgtagcc atgactctag ccgttgttgc tctctttgcc gatggtccaa ccaccatcag 2640 agatggtaaa gcaaaaccct ctctttgaat cagcgtgttt taaaagattc atggttgctt 2700 aaactctatt tggtcaatgt agtggctagc tggagagtta aggagacaga gaggatgatt 2760 gccatttgca cagagcttag aaaggtaagt ttccttttct ctcatgctct ctcattcgaa 2820 gttaatcgtt gcataacttt ttgcggtttt tttttttgcg ttcagcttgg agctacagtg 2880 gaagaaggtt cagattattg tgtgataact ccaccagcaa aggtgaaacc ggcggagatt 2940 gatacgtatg atgatcatag aatggcgatg gcgttctcgc ttgcagcttg tgctgatgtt 3000 ccagtcacca tcaaggaccc tggctgcacc aggaagactt tccctgacta cttccaagtc 3060 cttgaaagta tcacaaagca ttaaaagacc ctttcctctg atccaaatgt gagaatctgt 3120 tgctttctct ttgttgccac tgtaacattt attagaagaa caaagtgtgt gtgttaagag 3180 tgtgtttgct tgtaatgaac tgagtgagat gcaatcgttg aatcagtttt gggccttaat 3240 aaagggttta ggaagctgca gcgagatgat tgtttttgat cgatcatctt tgaaaatgtg 3300 tttgtttgag taatttttct agggttgagt tgattacact aagaaacact ttttgatttt 3360 ctattacacc tatagacact tcttacatgt gacacacttt gttgttggca agcaacagat 3420 tgtggacaat tttgccttta atggaaagaa cacagttgtg gatgggtgat ttgtggacga 3480 ttccatgtgt ggttagggtg atttgtggac ggatgatgtg tagatgagtg atgagtaatg 3540 tgtgaatatg tgatgttaat gtgtttatag tagataagtg gacaaactct ctgttttgat 3600 tccataaaac tatacaacaa tacgtggaca tggactcatg ttactaaaat tataccgtaa 3660 aacgtggaca cggactctgt atctccaata caaacacttg gcttcttcag ctcaattgat 3720 aaattatctg cagttaaact tcaatcaaga tgagaaagag atgatattgt gaatatgagc 3780 ggagagagaa atcgaagaag cgtttacctt ttgtcggaga gtaatagatc t 3831

<210> 24 <211> 1944 <212> ADN <213> Petunia hybridã 38 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ < 4 Ο Ο > 24

gaattccctc aatctttact ttcaagaatg gcacaaatta acaacatggc tcaagggata SO caaaccctta atcccaattc caatttccat aaaccccaag ttcctaaatc ttcaagcttt 120 cttgtttttg gatctaaaaa accgaaaaaC ccagcaaatt ctatgttggt CCCgaaaaaa 180 gattcaattt ttatgcaaaa gctttgttcc tttaggattt cagcatcagt ggctacagca 240 cagaagcctt ctgagatagt gttgcaaccc attaaagaga tttcaggcac tgttaaattg 300 cctggctcta aatcattatc taatagaatt ctccttcttg ctgcctcatc tgaaggaaca 360 actgtggttg acaatttact aagtagtgat gatattcatt acatgcttgg tgccttgaaa 420 acacttggac tgcatgtaga agaagatagc gcaaaccaac gagctgttgt tgaaggttgt 480 ggtgggcttt tccctgttgg taaagagtcc aaggaagaaa ttcaactgtt ccttggaaat 540 gcaggaacag caatgcggcc actaacagca gcagttactg tagctggtgg aaattcaagg 600 tatgtacttg atggagttcc tcgaatgaga gagagaccaa ttagtgattt ggttgaCggC 660 cttaaacagc ttggtgcaga ggttgattgt ttccttggta cgaaatgtcc tcctgttcga 720 attgtcagca agggaggtct tcctggaggg aaggtcaagc tctctggatc cattagcagc 7B0 caatacttga ctgctctgct catggctgcc ccactggctt caggagatgt ggagattgaa 840 atcactgaca aactaattag tgtaccttat gtcgagatga cattgaagtt gatggagcga 900 tttggtattt ctgtggagca cagtagtagc tgggacaggt tctttgtccg aggaggtcag 960 aaatacaagt ctcctggaaa agcttttgtc gaaggtgatg cttcaagtgc tagctacttc 1020

ttggctggtg cagcagtcac aggtggaact atcactgttg aaggttgtgg gacaaacagt ÍOBO ttacaggggg atgtcaaatt tgctgaggta cttgaaaaaa tgggagctga agttacgCgg 1140 acagagaaca gtgtcacagt caaaggacct ccaaggagtt cttctgggag gaagcatttg 1200 cgtgccattg atgtgaacat gaataaaatg cctgatgttg ccatgacact tgctgttgtt 1260 gcactttacg ctgatggtcc cacagctata agagatgttg ctagctggag agtcaaggaa 1320 actgagcgca tgatcgccat atgcacagaa cttaggaagt taggagcaac cgttgaagaa 1380 ggaccagact actgcataat caccccaccg gagaaactaa atgtgaccga tattgataca 1440 tacgatgatc acaggatggc catggctCCt cctcttgctg cctgtgcaga tgttcccgtc 1500 accatcaatg accctggctg cacgcggaaa accttcccta actactttga tgtacttcag 1560 cagtactcca agcattgaac cgcttcccta Cattgcagaa tgtaagtaag aatatgtgaa 1620 gagtttagtt cttgtacaag acaggctacg actgcctggt atcagaacca caatgggttc 1680 catttcagtt cagaagggca ttccaaggct tcgaactctt tacttatttg cgagtgatga 1740 aatgtatttg ttagagttga gcttcttttt gtctttaagg aatgtacact aatagagtta 1800 agaattacta gtatgggcca gtgtaaggag tactattact ctttgcttat tttattgact 1860 gagtttcgcc aaggatctgg ctttgtcaag aattactggt taattttatt gacaatctca 1920 tgtgtctaaa tgaaattgtt tgat 1944 <210> 25 <211> 1335 <212> ADN <213> Zea mays <400> 25 gcgggtgccg aggagatcgt gctgcagccc atcaaggaga tctccggcac cgtcaagctg 60 ccggggtcca agtcgctttc caaccggatc ctcctactcg ccgccctgtc cgaggggaca 120 acagtggttg ataacctgct gaacagtgag gatgtccact acatgctcgg ggccttgagg 180 actcttggtc tctctgtcga agcggacaaa gctgccaaaa gagccgcagt tgteggctgt 240 ggtggaaagt tcccagttga ggatgctaaa gaggaagtgc agctcttctt ggggaatgct 300 ggaactgcaa tgcggccatt gacagcagct gttactgctg ctggtggaaa tgcaacttac 360 gtgcttgatg gagtaccaag aatgagggag agacccattg gcgacttggt tgtcggattg 420 aagcagcttg gtgcagatgt tgattgtttc cttggcactg actgcccacc tgttcgtgtc 480 aatggaatcg gagggctacc tggtggcaag gtcaagctgt ctggctccat cagcagtcag 540 tacttgagtg ccttgctgat ggctgctcct ttggctcttg gggatgtgga gattgaaatc 600 aCCgataaat taatctccat tccgtacgtc gaaatgacat tgagattgat ggagcgtttt 660 ggtgtgaaag cagagcattc tgatagctgg gacagattct acattaaggg aggtcaaaaa 720 tacaagtccc ctaaaaatgc ctatgttgaa ggtgatgcct caagcgcaag ccacttcctg 780 gctggtgctg caattactgg agggactgtg actgtggaag gttgtggcac caccagtttg 840 cagggegatg tgaagtttgc tgaggtactg gagatgatgg gagcgaaggt tacatggacc 900 gagactagcg taactgttac tggcccaccg cgggagccat ttgggaggaa acacctcaag 960 gcgactgatg tcaacatgaa caagatgcct gatgtcgcca tgactcttgc tgtggttgcc 1020 ctctttgccg atggcccgac agccatcaga gacgtggcct cctggagagt aaaggagacc 1080 gagaggatgg ttgcgatccg gacggagcta accaagctgg gagcatctgt tgaggaaggg 1140 ccggactact gcaccatcac gccgccggag aagccgaacg tgacggcgac cgacacgtac 1200 gacgaccaca ggatggccat ggccttctcc cttgccgcct gtgccgaggt ccccgtcacc 1260 atccgggacc ctgggtgcac ccggaagacc ttccccgact acttcgatgt gctgagcact 1320 ttcgtcaaga attaa 1335 39 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ <210> 26 <211> 516 <212> PRT < 213 > Brassisca napus < 4 0 0 > 26

Met Ala Gin Ser Ser Arg Ile Cys His Gly Vai Gin Asn Pro Cys Vai 1 5 10 15 Ile Ile Ser Asn Leu Ser Lys Ser Asn Gin Asn Lys Ser Pro Phe Ser 20 25 30 Vai Ser Leu Lys Thr His Gin Pro Arg Ala Ser Ser Trp Gly Leu Lys 35 40 45 Lys Ser Gly Thr Met Leu Asn Gly Ser Vai Ile Arg Pro Vai Lys vai 50 55 60 Thr Ala Ser Vai Ser Thr Ser Glu Lys Ala Ser Glu Ile Vai Leu Gin 65 70 75 80 Pro Ile Arg Glu Ile Ser Gly Leu Ile Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser 85 90 95 Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr 100 105 110 Vai Vai Asp Asn Leu Leu Asn Ser Asp Asp Ile Asn Tyr Met Leu Asp 115 120 125 Ala Leu Lys Lys Leu Gly Leu Asn Vai Glu Arg Asp Ser Vai Asn Asn 130 135 140 Arg Ala Vai Vai Glu Gly Cys Gly Gly Ile Phe Pro Ala Ser Leu Asp 145 150 155 160 Ser Lys Ser Asp Ile Glu Leu Tyr Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met 16S 170 175 Arg Pro Leu Thr Ala Ala Vai Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Ser Tyr 180 185 190 Vai Leu Asp Gly Vai Pro Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu 195 200 205 Vai Vai Gly Leu Lys Gin Leu Gly Ala Asp Vai Glu Cys Thr Leu Gly 210 215 220 Thr Asn Cys Pro Pro Vai Arg Vai Asn Ala Asn Gly Gly Leu Pro Gly 225 230 235 240 Gly Lys Vai Lys Leu Ser Gly Ser Ile ser Ser Gin Tyr Leu Thr Ala 245 250 255 Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala Leu Gly Asp Vai Glu Ile Glu Ile 260 265 270 Ile Asp Lys Leu Ile Ser Vai Pro Tyr Vai Glu Met Thr Leu Lys Leu 275 280 285 Met Glu Arg Phe Gly Vai Ser Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg 290 295 300 Phe Phe Vai Lys Gly Gly Gin Lys Tyr Lys Ser Pro Gly Asn Ala Tyr 305 310 315 320 Vai Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala 325 330 335 40 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ

Ile Thr Gly Glu Thr Val Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu 340 345 350 Gin Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu Val Leu Glu Lys Met Gly Cys Lys 355 360 365 Vai Ser Trp Thr Glu Asn Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Ser Arg Asp 370 375 380 Ala Phe Gly Met Arg His Leu Arg Ala Val Asp Val Asn Met Asn Lys 385 390 395 400 Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp 405 410 415 Gly Pro Thr Thr Ile Arg Asp Val Ala Ser Trp Arg val Lys Glu Thr 420 425 430 Glu Arg Met Ile Ala Ile Cys Thr Glu Leu Arg Lys Leu Gly Ala Thr 435 440 445 val Glu Glu Gly Ser Asp Tyr Cys Val Ile Thr Pro Pro Ala Lys Val 4S0 455 460 Lys Pro Ala Glu Ile Asp Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala 465 470 475 480 Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Asp Val Pro Val Thr Ile Lys Asp Pro 485 490 495 Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro Asp Tyr Phe Gin Val Leu Glu Ser 500 505 510 Ile Thr Lys Hls 515

<210> 27 <211> 516 < 212 > PRT <213> Petunia hybrida < 4 0 0 >

Met Ala Gin Ile Asn Asn Met Ala Gin Gly Ile Gin Thr Leu Asn Pro 1 5 10 15 Asn Ser Asn Phe His Lys Pro Gin Val Pro Lys Ser Ser Ser Phe Leu 20 25 30 Val Phe Gly Ser Lys Lys Leu Lys Asn Ser Ala Asn Ser Met Leu Val 35 40 45 Leu Lys Lys Asp Ser Ile Phe Met Gin Lys Phe Cys Ser Phe Arg Ile 50 55 60 Ser Ala Ser Val Ala Thr Ala Gin Lys Pro Ser Glu Ile Val Leu Gin 65 70 75 80 Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser 85 90 95 Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr 100 105 110 Val Val Asp Asn Leu Leu Ser Ser Asp Asp Ile His Tyr Met Leu Gly 115 120 125 Ala Leu Lys Thr Leu Gly Leu His Val Glu Glu Asp Ser Ala Asn Gin 130 135 140 Arg Ala Val Val Glu Gly Cys Gly Gly Leu Phe Pro Val Gly Lys Glu 145 150 155 160 Ser Lys Glu Glu Ile Gin Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met 165 170 175 Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr Val Ala Gly Gly Asn Ser Arg Tyr 180 185 190 Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Ser Asp Leu 195 200 205 41 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ

Vai Asp Gly Leu Lys Gin Leu Gly Ala Glu Val Asp Cys Phe Leu Gly 210 215 220 Thr Lys Cys Pro Pro Vai Arg Ile Vai Ser Lys Gly Gly Leu Pro Gly 225 230 235 240 Gly Lys Vai Lys Leu Ser Gly Ser Ile Ser Ser Gin Tyr Leu Thr Ala 245 250 255 Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile 260 265 270 Ile Asp Lys Leu Ile Ser Vai Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Lys Leu 275 2B0 285 Met Glu Arg Phe Gly Ile Ser Vai Glu His ser Ser Ser Trp Asp Arg 290 295 300 Phe Phe vai Arg Gly Gly Gin Lys Tyr Lys Ser Pro Gly Lys Ala Phe 305 310 315 320 Vai Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala 325 330 335 Vai Thr Gly Gly Thr Ile Thr Vai Glu Gly Cys Gly Thr Asn ser Leu 340 345 350 Gin Gly Asp Vai Lys Phe Ala Glu val Leu Glu Lys Met Gly Ala Glu 355 360 365 Vai Thr Trp Thr Glu Asn Ser Vai Thr Val Lys Gly Pro Pro Arg Ser 370 375 380 Ser Ser Gly Arg Lys His Leu Arg Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys 385 390 3 95 400 Met Pro Asp Vai Ala Met Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Tyr Ala Asp 405 410 415 Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Vai Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr 420 425 430 Glu Arg Met Ile Ala Ile Cys Thr Glu Leu Arg Lys Leu Gly Ala Thr 435 440 445 Vai Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu 450 455 460 Asn Vai Thr Asp Ile Asp Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala 465 470 475 480 Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Asp Val Pro Val Thr Ile Asn Asp Pro 485 490 495 Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro Asn Tyr Phe Asp Val Leu Gin Gin 500 505 510 Tyr Ser Lys His 515 :210> 28 :211> 444 : 212 > PRT :213> Zea mays :400> 28 Ala Gly Ala Glu Glu Ile vai Leu Gin Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly 1 5 10 15 Thr Vai Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu 20 25 30 Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn 35 40 45 Ser Glu Asp Vai His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu 50 55 60 Ser Vai Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys 65 70 75 80 42 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ

Gly Gly Lys Phe Pro Vai Glu Asp Ala Lys Glu Glu Vai Gin Leu Phe 85 90 95 Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Vai Thr 100 105 110 Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Vai Leu Asp Gly Vai Pro Arg Met 115 120 125 Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Vai Vai Gly Leu Lys Gin Leu Gly 130 135 140 Ala Asp Vai Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Vai Arg Vai 145 150 155 160 Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Vai Lys Leu Ser Gly Ser 165 170 175 Ile Ser Ser Gin Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala 1B0 185 190 Leu Gly Asp Vai Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile ser Ile Pro 195 200 205 Tyr Vai Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly vai Lys Ala 210 215 220 Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gin Lys 225 230 235 240 Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Vai Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala 245 250 255 Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Vai Thr Val 260 265 270 Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gin Gly Asp Vai Lys Phe Ala Glu 275 280 285 Vai Leu Glu Met Met Gly Ala Lys vai Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val 290 295 300 Thr Vai Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys 305 310 315 320 Ala Ile Asp Vai Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Vai Ala Met Thr Leu 325 330 335 Ala Vai Vai Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val 340 345 350 Ala Ser Trp Arg Vai Lys Glu Thr Glu Arg Met Vai Ala Ile Arg Thr 355 360 365 Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Vai Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys 370 375 380 Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Vai Thr Ala Ile Asp Thr Tyr 385 390 395 400 Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala GlU 405 410 415 Vai Pro Vai Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro 420 425 430 Asp Tyr Phe Asp Vai Leu Ser Thr Phe Vai Lys Asn 435 440 < 210 > 29 <211> 64 < 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador mutante <400> 29 cgtttccacc tgcagcagtg accgcagcgg taagtggacg cattgctgtt gctgcattac 60 cgag 64

<210> 30 <211> 64 <212> ADN <213> Sequência Artificial 43 ΕΡ 1 223 799/PT <220> <223> Iniciador mutante <400> 30 cgtttccacc tgcagcagtg accgcagcgg taagtggacg cattgctatt gctgcattac cgag

<210> 31 <211> 64 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador mutante <400> 31 cgtttccacc tgcagcagtg accgcagcgg taagtgaacg cattgctatt cctgcattac cgag

<210> 32 <211> 64 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador mutante <400> 32 cgtttccacc tgcagcagtg accgcagcgg taagtgaacg cattgctgtt gctgcattac cgag

<210> 33 <211> 64 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador mutante <400> 33 cgtttccacc tgcagcagtg accgcagcgg taagtgaacg cattgctatt gctgcattac cgag

<210> 34 <211> 64 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador mutante <400> 34 cgtttccacc tgcagcagtg accgcagcgg taagtggacg cattgctgtt attgcattac 64 cgag 44

ΕΡ 1 223 799/PT <210> 35 <211> 64

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 Ο > <223> Iniciador mutante <400> 35 cgtttccacc tgcagcagtg accgcagcgg taagtgaacg cattgctact cctgcattac 60 cgag 64

<210> 36 <211> 64 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador mutante <400> 36 cgtttccacc tgcagcagtg accgcagcgg taagtgaacg cattgctaat cctgcattac 60 cgag 64 <210> 37 <211> 64

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador mutante <400> 37 cgtttccacc tgcagcagtg accgcagcgg taagtggacg cattgctact gctgcattac 60 cgag 64

<210> 38 <211> 64 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador mutante <400> 38 cgtttccacc tgcagcagtg accgcagcgg taagtggacg cattgctaat gctgcattac 60 cgag 64

<210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> Petunia hybrida 45 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ < 4 Ο Ο > 39

Leu Phe Leu Gly Asn 1 5 <210> 40 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador < 4 0 0 > 40 gctctagaga aagcgtcgga gattgtactt 30 <210> 41 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador < 4 0 0 > 41 gcagatctga gctcttagtg ctttgtgatt ctttcaagta c 41 <210> 42 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador < 4 0 0 > 42 gcgtctagaa aaacgagata aggtgcag 28 <210> 43 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador < 4 0 0 > 43 gcggatcctc aggatttttt cgaaagctta tttaaatg 38 <210> 44 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 O > <223> Iniciador 46 ΕΡ 1 223 799/PT < 4 Ο Ο > 44 gaaagcgtcg gagattgtac 20

Lisboa, 2010-03-01

Claims (16)

1. ΕΡ 1 223 799/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Método para produção de uma planta não transgénica que é resistente ou tolerante a um herbicida da família da fosfonometilglicina compreendendo: a) a introdução em células vegetais de uma oligonucleobase recombinogénica com uma mutação direccionada no gene de EPSPS para produzir células vegetais com um gene de EPSPS mutante que expressa uma proteína EPSPS que é mutada numa ou mais posições de aminoácidos, sendo as referidas posições seleccionadas de entre o grupo que consiste em Leui73, Alai79, Metiso, Argm, Ser98, Ser255 e Leui98 na proteína EPSPS de Arabidopsis ou num resíduo de aminoácido análogo num gene de EPSPS de outra espécie; b) a identificação de uma célula vegetal possuindo crescimento normal quando comparada com uma célula vegetal de tipo selvagem correspondente, na presença de glifosato; e c) a regeneração de uma planta não transgénica resistente ou tolerante a um herbicida possuindo o referido gene de EPSPS mutado a partir da referida célula vegetal; em que a planta não transgénica, tolerante ou resistente a um herbicida, exibe crescimento e desenvolvimento normais quando comparados com os das plantas de tipo selvagem correspondentes, e em que a enzima EPSPS mutada tem a mesma actividade catalítica quando comparada com a da enzima de tipo selvagem.
2. 2. Método para produção de uma planta não transgénica que é resistente ou tolerante a um herbicida da família da fosfonometilglicina, compreendendo: a) a introdução em células vegetais de uma oligonucleobase recombinogénica com uma mutação direccionada no gene de EPSPS para produzir células vegetais com um gene de EPSPS mutante que expressa uma proteína EPSPS mutante que é mutada numa ou mais posições de aminoácidos, sendo as referidas posições seleccionadas de entre o grupo que consiste em Leum, Alam, Metiso, Argm, Ser98, Ser2ss e Leui98 na proteína EPSPS de Arabidopsis ou num resíduo de aminoácido análogo num gene de EPSPS de outra espécie; 2/4 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ b) a identificação de uma célula vegetal possuindo uma proteina EPSPS mutante que tem a mesma actividade catalítica quando comparada com a proteina EPSPS de tipo selvagem correspondente, na presença de glifosato; e c) a regeneração de uma planta não transgénica tolerante ou resistente a um herbicida possuindo o referido gene de EPSPS mutado, a partir da referida célula vegetal; em que a planta não transgénica, tolerante ou resistente a herbicida, exibe crescimento e desenvolvimento normais quando comparados com os das plantas de tipo selvagem correspondentes, e em que a enzima EPSPS mutada tem a mesma actividade catalítica quando comparada com a da enzima de tipo selvagem.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que a oligonucleobase recombinogénica é um nucleótido dúplex misto ou um vector de mutação oligodesoxinucleotidico de cadeia simples (SSMOV).
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3 em que o nucleótido dúplex misto contém uma primeira região homóloga que possui uma sequência idêntica à sequência de pelo menos 6 pares de bases do primeiro fragmento do gene de EPSPS alvo e uma segunda região homóloga que possui uma sequência idêntica à sequência de pelo menos 6 pares de bases de um segundo fragmento do gene de EPSPS alvo, e uma região interveniente que contém pelo menos uma nucleobase heteróloga ao gene de EPSPS alvo, região interveniente esta que liga a primeira e a segunda regiões homólogas.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que a oligonucleobase recombinogénica é introduzida através de electroporação.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1 em que as posições de aminoácidos são seleccionadas de entre o grupo que consiste em Leu97, Alai03, Metio4e Argios, Ser23, Seri79 e Leui22 no gene de EPSPS de Zea mays.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1 em que as posições de aminoácidos são seleccionadas de entre o grupo que 3/4 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ consiste em Leui69, Ala^s, Meti76, Argi77, Ser94, Ser25i e Leui94 no gene de EPSPS de uma espécie de Brassica.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1 em que as posições de aminoácidos são seleccionadas de entre o grupo que consiste em Leui69, Ala^s, Meti76, Argi77, Ser94, Ser25i e Leu94 no gene de EPSPS de Petunía hybrida.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que as células vegetais são seleccionadas de entre o grupo que consiste em milho, trigo, arroz, cevada, soja, algodão, beterraba sacarina, couve-nabiça, canola, linho, girassol, batata, tabaco, tomate, alfalfa, choupo, pinheiro, eucalipto, maçã, alface, ervilhas, lentilhas, uva, turfa e espécies de Brassica.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 2 em que as posições de aminoácidos são seleccionadas de entre o grupo que consiste em Leu97, Alam, Metm, Argm, Ser23, Seri79 e Leui22 no gene de EPSPS de Zea mays.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 2 em que as posições de aminoácidos são seleccionadas de entre o grupo que consiste em Leui69, Alam, Meltm, Argm, Ser94, Ser25i e Leui94 no gene de EPSPS de uma espécie de Brassica.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 2 em que as posições de aminoácidos são seleccionadas de entre o grupo que consiste em Leum, Alam, Metm, Arg277, Ser94, Ser25i e Leui94 no gene de EPSPS de Petunia hybrida.
13. 13. Método para produção de uma planta não transgénica que é resistente ou tolerante a um herbicida da família da fosfonometilglicina compreendendo: a) a introdução em células vegetais de uma oligonucleobase recombinogénica com uma mutação direccionada no gene de EPSPS para produzir células vegetais com um gene de EPSPS mutante que expressa uma proteína EPSPS que é mutada em duas posições de aminoácidos, sendo as referidas posições seleccionadas de entre o grupo que consiste em Thrm e Proi82, na proteína EPSPS de Arabidopsis ou num resíduo de aminoácido análogo num gene de EPSPS de outra espécie em 4/4 ΕΡ 1 223 799/ΡΤ que Thri78 é mudado para Vai ou Leu e Proi82 é mudado para Ser; b) a identificação de uma célula vegetal possuindo crescimento normal quando comparada com uma célula vegetal de tipo selvagem correspondente, na presença de glifosato; e c) a regeneração de uma planta não transgénica resistente ou tolerante a um herbicida possuindo o referido gene de EPSPS mutado a partir da referida célula vegetal; em que a planta não transgénica, tolerante ou resistente a um herbicida exibe crescimento e desenvolvimento normais quando comparados com os das plantas de tipo selvagem correspondentes, e em que a enzima EPSPS mutada tem a mesma actividade catalítica quando comparada com a da enzima de tipo selvagem.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13 em que as posições de aminoácidos são Thri02 e Proi06 no gene de EPSPS de Zea mays.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 13 em que as posições de aminoácidos são Thri74 e Proi78 no gene de EPSPS de uma espécie de Brassica.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 13 em que as posições de aminoácidos são Thri74 e Proi78 no gene de EPSPS de Pet unia hybrida. Lisboa, 2010-03-01