CN114586676B - 一种高效选育高亚麻酸甘蓝型油菜细胞质雄性不育系的方法 - Google Patents

一种高效选育高亚麻酸甘蓝型油菜细胞质雄性不育系的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种选育甘蓝型油菜高亚麻酸细胞质雄性不育系的方法，属于作物遗传育种与农业应用技术领域。本发明建立了选育甘蓝型油菜高亚麻酸CMS的筛选方法和标准；采用育性和农艺性状相结合，在筛选亚麻酸含量的同时对育性、结实性、品质性状进行筛选，有效提高了油菜高亚麻酸CMS的综合性状和育种价值，为开展油菜高亚麻酸杂交育种奠定了基础。本发明可为油菜高亚麻酸杂交育种提供技术支持和物质基础，也可为其他作物的高亚麻酸CMS杂交选育提供有益参考。本发明的方法易行，操作简便。

Description

一种高效选育高亚麻酸甘蓝型油菜细胞质雄性不育系的方法
技术领域
本发明属于作物遗传育种与农业应用技术领域，具体涉及一种高效选育高亚麻酸甘蓝型油菜细胞质雄性不育系的方法。
背景技术
亚麻酸(ALA)是人体必需(ω-3)脂肪酸，在人体内可转化为EPA、DHA，一旦缺乏或失调会引起脂质代谢紊乱、免疫力降低、动脉粥样硬化等病症或亚健康问题。亚麻酸主要依赖膳食提供，由于日常膳食中亚麻酸含量普遍较低，中国人群亚麻酸的摄入量远低于世界卫生组织的推荐量。亚麻酸缺乏已成为亚健康、慢性疾病(心脑血管疾病)发病率上升的重要原因之一。
人体摄入脂肪酸的50％以上来自于食用油，通过改良食用油的脂肪酸构成来提高亚麻酸的摄入是一条可行途径。菜籽油是中国居民的重要食用油源也是富含亚麻酸的3种常用植物油之一。因此，提高菜籽(油)的亚麻酸含量对提高国民健康水平及提升菜籽油的营养、经济价值都具有重要意义。
练景龙等通过种内杂交和定向选择，刘冬梅、陈文杰、陈碧云、余顺波等通过对种质资源的品质筛选，刘平武通过人工合成甘蓝型油菜，石充广通过EMS诱变均已获得高亚麻酸含量大于15％的甘蓝型油菜高亚麻酸种质。现有技术已创建了油菜高高亚麻酸种质的筛选方法，例如，中国专利CN202010447954.2公开了一种高效筛选甘蓝型油菜高亚麻酸种质的方法，并利用该方法建立的油菜高亚麻酸种质的综合评价指标体系和方法对高油菜种质进行数量化精准评价，已获得一批亚麻酸含量大于15％(最高含量达21.6％)的甘蓝型油菜非转基因种质，筛选出一批具有较高育种价值的高亚麻酸育种核心种质。
杂种优势利用已被证明是提高油菜产量和品质的重要途径。CMS(细胞质雄性不育)途径因具有保持、恢复源广泛，易配制出优势组合等特点是油菜杂种优势利用理想的授粉控制系统之一。性状优良的CMS是选育油菜杂交种的基础；但是，若利用传统的育种手段进行油菜高亚麻酸CMS筛选时难以兼顾其他农艺性状，会导致筛选出的油菜高亚麻酸CMS的综合性状和育种价值降低；需要5～6年甚至更长时间的选育才能获得遗传稳定的油菜CMS不育系；历经5-6代的连续自交会造成保持系的品质、农艺性状退化，导致选出的油菜CMS、保持系在生产中难以利用；传统方法在转育CMS时需完成整枝、剥蕾、取粉、授粉、套袋、固定、松袋、拆袋等8道工序，造作繁琐，工作量大；同时，在此造作过程中易造成CMS的成角率、角粒数较低。生长环境条件不同会造成不同世代的CMS的品质和农艺性状发生变化，且同一单株上内来自主花序、分枝不同部位角果的种子的亚麻酸含量也会有差异，因而会造成CMS的不同世代、及同一世代单株间亚麻酸含量的出现较大差异，难以相互比较；在油菜高亚麻酸CMS的选育过程中需要对育性和结实率进行协调和平衡。以上造成现有传统的方法不符合油菜高亚麻酸育种实际需求。
因而，亟需建立一种选育综合性状和育种价值较高的甘蓝型油菜高亚麻酸CMS的方法，以加速油菜高亚麻酸杂交育种进程。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种选育高亚麻酸甘蓝型油菜细胞质雄性不育系的方法，本发明的方法能够有效提高油菜高亚麻酸CMS的综合性状和育种价值。
本发明提供了一种选育甘蓝型油菜高亚麻酸细胞质雄性不育系的方法，包括以下步骤：
1)以已知的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系为母本，以高亚麻酸的甘蓝型油菜种质为父本，所述父本和母本按照1：1隔行种植，行间距为25～30cm，株间距为8～10cm；在盛花期套袋杂交，F1代自然成熟；在成熟前根据每个F1代单株的成角数、角粒数计算出结实性系数；收获后化验每株F1代品质，按照F1代的筛选指标，筛选得到目标F1代；
所述父本的性状包括：亚麻酸含量＞15％；
所述目标F1代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞99％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本相比，含油量＞90％，亚麻酸含量＞65％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞17.4；
2)将目标F1代的种子与父本的自交单株按照1：1隔行种植，行间距为25～30cm，株间距为8～10cm；在盛花期套袋杂交，F2代自然成熟；在成熟前根据每个F2代单株的成角数、角粒数计算出结实性系数；收获后化验每株F2代品质，按照F2代的筛选指标，筛选得到目标F2代；
所述目标F2代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞98％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本相比，含油量＞93％、亚麻酸含量＞75％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞17.4；
3)重复步骤2)，获得F5或F6代高亚麻酸甘蓝型油菜细胞质雄性不育系。
优选的，步骤1)中所述在盛花期套袋杂交包括：在盛花期对所述母本和父本套袋后进行人工授粉，在所述的母本终花后解除套袋；
步骤2)中所述在盛花期套袋杂交包括：在盛花期对所述目标F1代和父本套袋后进行人工授粉，在所述目标F2代终花后去除父本，在所述F2代终花后解除套袋。
优选的，所述方法中的两个相邻世代在不同菜区种植；所述菜区包括春油菜区、冬油菜区或温室。
优选的，在步骤3)的选育过程中，
目标F3代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞99％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本相比，含油量＞95％、亚麻酸含量＞80％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞18.0；
目标F4代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞99％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本相比，含油量＞97％、亚麻酸含量＞85％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞18.4；
目标F5代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞99％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本相比，含油量＞98％、亚麻酸含量＞90％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞18.4；
目标F6代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞98％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本相比，含油量＞98％、亚麻酸含量＞95％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞18.4。
优选的，所述方法中，目标F1代的筛选环境为春油菜区，目标F2代的筛选环境为冬油菜区，目标F3代的筛选环境为温室，目标F4代的筛选环境为春油菜区，目标F5代的筛选环境为温室，目标F6代的筛选环境为春油菜区、冬油菜区。
优选的，步骤1)中对所述母本和父本套袋包括：采用自交袋将母、父本的主花序、倒1分枝、倒2分枝套在一起；
步骤2)中对所述目标F1代和父本套袋包括：采用自交袋将F1代、父本的主花序、倒1分枝、倒2分枝套在一起；
优选的，所述方法中，从F1代开始，对不同世代的细胞质雄性不育系进行固定部位种子的单株间的育性、品质和结实性的比较筛选。
优选的，步骤1)中所述高亚麻酸含量的甘蓝型油菜保持系经过筛选获得；
所述高亚麻酸含量的甘蓝型油菜保持系的筛选方法包括：以已知的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系为母本，以待筛选的甘蓝型油菜高亚麻酸种质为父本进行测交，根据F1和F2代的育性结合步骤1)中所述对父本的品质、产量性状的遗传稳定性指标筛选出3～5个单株，将选出的单株选择进行混和繁殖；
所述待筛选的甘蓝型油菜保持系的亚麻酸含量＞15％。遗传变异的筛选指标包括：亚麻酸含量年际间＜4.3、环境间＜3.6，含油量年际间＜3.7、环境间＜3.6，单株产量年际间＜2.5、环境间＜2.9，单株亚麻酸含量年际间＜4.1、环境间＜4.8；
优选的，所述已知的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系包括陕2A。
优选的，所述高亚麻酸种质为亚麻酸含量＞15％的甘蓝型油菜种质。
本发明提供了一种选育高亚麻酸甘蓝型油菜细胞质雄性不育系的方法。本发明建立了选育甘蓝型油菜高亚麻酸CMS的筛选方法和标准，采用育性和农艺性状相结合，在筛选亚麻酸(ALA)含量的同时对育性、结实性、品质性状进行筛选，有效提高了油菜高亚麻酸CMS的综合性状和育种价值，为开展油菜高亚麻酸杂交育种奠定基础。本发明可为加速油菜高亚麻酸杂交育种提供技术支持和物质基础，也可为其他作物的高亚麻酸CMS杂交选育提供有益参考。本发明的方法易行，操作简便。
附图说明
图1是本发明实施例1中在不同环境、不同世代制定的筛选流程；
图2是本发明实施例2中的流程示意图；
图3是实施例2中对不同世代CMS亚麻酸含量的筛选效果图；
图4是实施例2中对不同世代CMS含油量的筛选效果图；
图5是实施例2中对不同世代CMS单株亚麻酸(ALA)产量的筛选效果图。
具体实施方式
本发明提供了一种选育高亚麻酸甘蓝型油菜细胞质雄性不育系的方法，包括以下步骤：
1)以已知的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系为母本，以高亚麻酸含量的甘蓝型油菜种质为父本，所述父本和母本按照1：1隔行种植，行间距为25～30cm，株间距为8～10cm，在盛花期套袋杂交，F1代自然成熟，在成熟前统计出每个F1代单株的成角数、角粒数并计算出结实性系数；收获后化验每株F1代品质，按照F1代的筛选指标，筛选得到目标F1代；
所述父本的性状包括：亚麻酸含量＞15％；
所述目标F1代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞99％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本相比，含油量＞90％，亚麻酸含量＞65％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞17.4；
2)将目标F1代的种子与父本的自交单株按照1：1隔行种植，行间距为25～30cm，株间距为8～10cm，在盛花期套袋杂交，F2代自然成熟，在成熟前统计出每个F2代的成角数、角粒数并计算出结实性系数；收获后化验每株F2代品质，按照F2代的筛选指标筛选得到目标F2代；
所述目标F2代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞98％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本相比，含油量＞93％、亚麻酸含量＞75％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞17.4；
3)重复步骤2)，获得F5或F6代高亚麻酸甘蓝型油菜细胞质雄性不育系。
本发明首先以已知的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系为母本，以高亚麻酸含量的甘蓝型油菜种质为父本，所述父本和母本按照1：1隔行种植，行间距为25～30cm，株间距为8～10cm；在盛花期套袋杂交，F1代自然成熟；在成熟前统计出每个F1代单株的成角数、角粒数并计算出结实性系数；收获后化验每株F1代品质，按照F1代的筛选指标，筛选得到目标F1代；所述父本的性状包括：亚麻酸含量＞15％；所述父本的遗传变异的指标包括：亚麻酸含量年际间＜4.3、环境间＜3.6，含油量年际间＜3.7、环境间＜3.6，单株产量年际间＜2.5、环境间＜2.9，单株亚麻酸含量年际间＜4.1、环境间＜4.8；所述目标F1代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞99％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本(高亚麻酸含量的甘蓝型油菜种质)相比，含油量＞90％，亚麻酸含量＞65％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞17.4。
在本发明中，所述高亚麻酸含量的甘蓝型油菜保持系经过筛选获得；所述高亚麻酸含量的甘蓝型油菜保持系的筛选方法优选的包括：以已知的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系为母本，以待筛选的甘蓝型油菜的高亚麻酸种质为父本进行测交，根据F1和F2代的育性并结合步骤1)中所述父本的性状和遗传稳定性筛选出高亚麻酸含量的甘蓝型油菜保持系单株。在本发明中，所述待筛选的甘蓝型油菜保持系的亚麻酸含量优选的＞15％。
在本发明中，根据F1和F2代的育性结合步骤1)中所述父本的性状筛选出3～5个符合目标性状的单株；将选出单株进行混合繁殖，筛选符合步骤1)中所述父本的遗传稳定性的株系，具体如表1所示。针对传统方法中因连续5～6代自交造成保持系的品质、农艺性状发生退化导致最终选育出的(CMS)保持系在生产中难以利用的问题，本发明采用对初步筛选出的3～5株进行混繁，从F3代开始不再繁殖保持系的方法，不但有效解决了保持系(品质、农艺)性状退化的问题而且减少了工作量。
在本发明中，所述已知的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系优选的包括陕6A或陕2A。陕2A不育胞质是李殿荣先生1976年发现油菜细胞质雄性不育胞质，1980年育成不育系陕2A和保持系陕2B，1983年利用陕2A不育系育成杂交种“秦油2号”。此后，全国多个育种单位利用陕2A不育胞质育成一批CMS不育系、杂交种；目前陕2A是被广泛利用的油菜细胞质雄性不育胞质。陕6A是利用陕2A转育成的双低(低硫苷、低芥酸)不育系，应用该不育系育成“鸿油88”登记号为GPD油菜(2018)610341。
在本发明中，所述高亚麻酸含量的甘蓝型油菜保持系优选为亚麻酸含量大于15％的高亚麻酸种质。
在本发明中，对所述母本和父本套袋优选的包括：采用自交袋将母、父本的主花序、倒1分枝和倒2分枝套在一起。在本发明中，所述人工授粉的起始时间优选为套袋后第2d；所述人工授粉持续进行，所述人工授粉的时间优选为3～5d。在本发明中，所述解除套袋的时间优选为所述母本终花后3d。
针对传统法的工作环节较多、费时费工，结实差等问题，本发明采用对父、母本间单株套袋杂交代替传统对不育株的剥蕾后授粉，省去了传统方法的取粉、授粉、套袋、固定、松袋等工序，造作简单有效提高了工作效率；且不受外界环境(风的有无、大小)限制；同时，采用的自交袋的空间较大有效提高了不育株的成角率、角粒数进而可获得用于单株间的化验分析和比较筛选的种子量。
针对CMS的不同世代的品质(含油量、亚麻酸含量)的较大差异，难以比较的问题，本发明采用对从F1代开始与父本的品质指标的比值进行单株间的比较筛选。
针对需要对CMS的育性和结实率进行的协调和平衡的问题，本发明采用在转育时对不育株进行自交结实系数、异交结实系数的筛选的方法予以解决。
得到目标F1代后，本发明将目标F1代的种子与父本的自交单株按照1：1隔行种植，行间距为25～30cm，株间距为8～10cm；在盛花期套袋杂交，F2代自然成熟；在成熟前统计出每个F2代的成角数、角粒数并计算出结实性系数；收获后化验每株F2代品质，按照F2代的筛选指标，筛选得到目标F2代；所述目标F2代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞98％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本(高亚麻酸含量的甘蓝型油菜种质)相比，含油量＞93％、亚麻酸含量＞75％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞17.4。
在本发明中，在盛花期对所述目标F1代和父本套袋后人工授粉，在所述目标F1代终花后去除父本，解除母本的套袋。在本发明中，对所述目标F1代和父本套袋优选的包括：采用自交袋将目标F1代、父本的主花序、倒1分枝和倒2分枝套在一起。在本发明中，所述人工授粉的起始时间优选为套袋后第2d；所述人工授粉持续进行，所述人工授粉的时间优选为3～5d。在本发明中，所述解除套袋的时间优选为所述母本终花后3d。
针对不同世代、同一世代不同单株及同一单株内来自(主花序、分枝)不同部位角果的种子的亚麻酸含量差异较大，难以比较的问题，本发明采用从F1代开始，对不同世代的CMS进行固定部位种子的单株间的育性、结实率、品质(含油量、ALA含量)的定量比较筛选，避免了因受影响因素多，油菜CMS的品质(含油量、ALA含量)在地区、年(季)间、不同部位测定结果数据的变化差异，结果准确可靠。
得到目标F2代后，本发明重复从目标F1代选育出目标F2代的过程，获得F5或F6代高亚麻酸甘蓝型油菜细胞质雄性不育系。本发明依据F5、F6代的数据对油菜高亚麻酸CMS进行育性、品质、结实性的遗传稳定性分析结果确立油菜高亚麻酸CMS。
在本发明中，目标F3代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞99％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本(高亚麻酸含量的甘蓝型油菜种质)相比，含油量＞95％、亚麻酸含量＞80％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞18.0；目标F4代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞99％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本(高亚麻酸含量的甘蓝型油菜种质)相比，含油量＞97％、亚麻酸含量＞85％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞18.4；目标F5代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞99％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本(高亚麻酸含量的甘蓝型油菜种质)相比，含油量＞98％、亚麻酸含量＞90％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞18.4；目标F6代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞98％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本(高亚麻酸含量的甘蓝型油菜种质)相比，含油量＞98％、亚麻酸含量＞95％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞18.4。
在本发明中，所述方法中，目标F1代的筛选环境为春油菜区，目标F2代的筛选环境为冬油菜区，目标F3代的筛选环境为温室、目标F4代的筛选环境为春油菜区、目标F5代的筛选环境为温室、目标F6代的筛选环境为春油菜区或冬油菜区，具体如图2所示。针对油菜的ALA的遗传复杂、对不同世代CMS种子的ALA含量的监控难度较大的问题，本发明采用依据筛选目标，制定出的不同环境、世代的育性、结实性、品质筛选目标(表2)；对不同世代的CMS进行单株间比较筛选，即可保证油菜CMS亚麻酸含量的提高也可获得具有目标性状(育性、结实性)的高亚麻酸CMS。在转育中仅对F2代以后不同世代的CMS比较筛选，减轻了工作量。采用不同世代的CMS的品质指标(含油量、亚麻酸含量)与父本(高亚麻酸含量的甘蓝型油菜种质)相比的比值进行单株间的比较筛选，成功解决了不同世代CMS的品质性状难以比较的问题。
在本发明中，两个相邻世代在不同菜区种植；所述菜区包括春油菜区、冬油菜区或温室。针对传统法选育稳定遗传的CMS的至少5～6年周期较长的问题，本发明利用大田(冬、春)、温室等条件交互选育，使选育周期从最少5～6年缩短为3～4年。此外，本发明利用在冬、春油菜区的交互选择成功选育出适应冬、春油菜区的甘蓝型油菜高亚麻酸CMS。
在本发明所述方法中，从F1代开始，对不同世代的细胞质雄性不育系进行固定部位种子的单株间的育性和品质比较筛选。
在本发明所述方法中，从F1代开始与父本(高亚麻酸含量的甘蓝型油菜种质)相比的品质指标的比值进行单株间比较筛选。
本发明采用育性和农艺性状相结合，在筛选亚麻酸(ALA)含量的同时对育性、结实性、品质性状进行筛选，有效提高了油菜高亚麻酸CMS的综合性状和育种价值，为开展油菜高亚麻酸杂交育种奠定基础。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
1、高亚麻酸CMS保持系的筛选流程
1.1确定保持系利用已获得的高亚麻酸种质与现有的CMS不育系(陕2A不育胞质)进行8～10株的广泛测交，根据F2代的育性，品质分析结果初步确立保持系。
1.2保持系的筛选、混繁根据对初步确立保持系进行产量、品质及遗传稳定性分析结果，依据筛选指标(表1)，筛选出3～5株符合目标性状的保持系单株进行混合繁殖。
表1保持系的遗传变异(CV％)的筛选指标
ALA含量 含油量 单株产量 单株ALA产量
年季间 ＜4.3 ＜3.7 ＜2.5 ＜4.1
环境间 ＜3.6 ＜4.2 ＜2.9 ＜4.8
2、根据建立的筛选流程和筛选指标进行油菜高亚麻酸CMS的转育
2.1建立筛选流程和筛选指标根据筛选目标，建立依据在不同环境、不同世代制定的筛选流程(图1)和育性、品质、结实性筛选指标(表2)。
表2不同世代油菜高亚麻酸CMS的筛选指标
Figure BDA0003545113730000101
Figure BDA0003545113730000111
注：品质指标指不同世代CMS的化验值与保持系数值的比较值。
2.2.油菜高亚麻酸CMS的转育
2.2.1广泛测恢在春油菜区将已有的油菜CMS(陕2A不育胞质)和与高亚麻酸种质按照1:1隔行种植，行间距为25-30cm,株间距为8-10cm。在盛花期，每个材料分别选择8～10株，去除主花序和倒1、2分枝的底部已开放的花蕾和上部的较小花蕾，仅保留将在2-3d内可开放的花蕾，并对花蕾数进行统计，然后用自交袋将CMS和对应父本套在一起；从第2d开始在上午9:00～11:00、下午15:00～17:00进行人工摇摆自交袋辅助授粉，连续进行3～5d；在袋中的CMS终花3d后拆掉自交袋；让F1代和父本自然成熟；成熟前统计出每个F1代、父本单株的成角数、角粒数并计算出结实性系数；收获后按单株化验F1代、父本的品质。
2.2.2对F1代进行筛选与转育将收获的F1代种子与对应父本的自交单株按照2.2.1的方法种植于冬油菜区。根据筛选指标在盛花期选择3个F1代与对应的父本进行套袋杂交，具体做法同2.2.1，在F1终花后用剪刀剪掉父本，3d后拆掉自交袋；让F2代自然成熟。在成熟前统计出每个F2代的单株的成角率、角粒数计算出结实性系数；收获后按单株化验F2代的品质。
2.2.3对F2代进行筛选与转育根据筛选指标选择3个F2代与保持系按照2.2.1的方法于冬油菜区。将F2代与及保持系移入温室加代，行间距为25-30cm,株间距为5-8cm,根据筛选指标在盛花期选择3个F2代与对应的父本进行套袋杂交，具体操作同2.2.2。
2.2.4对F3代进行筛选与转育根据筛选指标选择3个F3代与保持系按照2.2.1的方法于春油菜区。根据筛选指标在盛花期选择2个F3代与对应的父本进行套袋杂交，具体操作同2.2.2。
2.2.5对F4代进行筛选与转育根据筛选指标选择2个F4代与保持系按照2.2.1的方法于冬油菜区。将2个F4代保持系移入温室加代，根据筛选指标在盛花期选择1个F4代与对应的父本进行套袋杂交，具体操作同2.2.2。
2.2.6对F5代进行筛选与转育将F5代单株种子与保持系按照2.2.1的方法种植于春油菜区，冬油菜区。根据筛选指标在盛花期选择个F5代与保持系进行套袋杂交，具体操作同2.2.2。
2.3油菜高亚麻酸CMS的确立依据F5、F6代的数据对油菜高亚麻酸CMS进行育性、品质、结实性的遗传稳定性分析结果确立油菜高亚麻酸CMS。
实施例2：油菜高亚麻酸CMS“YM-1A”和保持系“YM-1B”的选育过程
选育过程如图2所示。
1、油菜高亚麻酸保持系(YM-1B)的筛选流程
1.1初步确定保持系2017年7月在春油菜区：用陕6A(陕2A不育细胞质)与高亚麻酸种质17gh69(组合为“春陕2B/9905”)的8个单株进行测恢；2017年9月对收获的17gh69的8个自交单株进行单株品质化验；将8个自交单株及对应8个F1代隔行种植冬油菜区，田间编号为17GH115-130。根据2018年4月对8个F1代的育性鉴定结果及2018年6月对农艺性状、单株产量、品质结果，结合2017年9月对父本自交单株的品质化验的结果，选择亚麻酸(ALA)含量＞17.5％；含油量＞49％，单株产量＞20g，单株亚麻酸(ALA)产出量＞1.71g的3个优异单株17GH120(17gh69-3自交)、17GH122(17gh69-4自交)、17GH128(17gh69-7自交)确立为初选保持系。
1.2混繁根据对亚麻酸(ALA)含量、含油量、单株产量、单株亚麻酸(ALA)产出量的遗传稳定性分析结果(表3)，筛选出3个保持系单株(17GH120、17GH122、17GH128)；2018年9月将初步选出的3个保持系单株子混合进行繁殖，田间代号为18GH220。
表3保持系的遗传稳定性分析结果
Figure BDA0003545113730000131
2、油菜高亚麻酸CMS不育系的转育
2.1油菜高亚麻酸CMS不育系的转育
2.1.1在冬油菜区大田转育出F2代2017年9月将收获的8个F1代(陕6A×17gh69)与对应8个父本(17gh69)的自交单株冬油菜区隔行种植，行间距为25-30cm,株间距为8-10cm。2018年4月对8个F1代进行育性鉴定，选择不育度＞98％、不育率100％；自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞17.4；亚麻酸(ALA)含量＞11.8％、含油量＞45.0％的3个F1代(17GH119(陕6A×17gh69-3自交)、17GH121(陕6A×17gh69-4自交)、17GH127(陕6A×17gh69-7自交)与对应的父本(17GH120(17gh69-3自交)、17GH 122(17gh69-4自交)、17GH128(17gh69-7自交))为亲本，每个材料分别选择3～5株，在盛花期去除主花序和倒1、2分枝的底部以开放的花蕾和上部的较小花蕾，保留将在2～3d内开放的花蕾，并对花蕾数进行统计，然后用自交袋套将F1代和对应父本套在一起；从第2d开始在上午9:00～11:00进行人工摇摆自交袋辅助授粉，重复3～5d。在袋子内的F1代终花后用剪刀剪掉父本；3d后拆掉自交袋，让F2代自然成熟。在成熟前统计出每个F2代的单株的结实性系数；收获后按单株化验品质。
2.1.2在温室转育、筛选出F3代2018年9月选择自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞17.4；亚麻酸(ALA)含量＞13.4％；含油量＞45.5％的3个F2代按照2.1.1的方法种植于冬油菜区，田间代号为18GH390～395。2018年11月将田间代号为3个F2代(18GH390、18GH392、18GH394)及对应的父本(18GH391、18GH393、18GH395)移入温室进行加代，行间距为25-30cm,株间距为5-8cm，编号为18GW3～8。2019年1月选择不育度＞98％、不育率100％的18GW3(18GH390)、18GW5(18GH392)、18GW7(18GH394)3个F2代与对应保持系18GW4(18GH391)、18GW6(18GH393)、18GW8(18GH395)套袋杂交，具体操作同2.1.1。
2.1.3在春油菜区筛选、转育出F4代2019年4月选择自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞18.4；亚麻酸(ALA)含量＞14.5％；含油量＞46.5％的2个F3代单株(18GW5、18GW7)与保持系(18GH220)按照2.1.1的方法种植于春油菜区，田间代号为19gh65～70。2019年7月选择不育度＞98％、不育率100％的19gh65(18GW5)、19gh69(18GW7)分别与保持系19gh66、19gh70套袋杂交。具体操作同2.1.1。
2.1.4在温室转育、筛选出F5代2019年9月选择自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞18.4；亚麻酸(ALA)含量＞15.39％；含油量＞47.3％的2个F4代单株(19gh65、19gh67)与保持系(18GH220)按照2.1.1的方法种植于冬油菜区，田间代号为19GH283～286。2019年11月将为2个F4代(19GH283、19GH285)及保持系19GH284、19GH286移入温室加代，栽植方法同2.1.2，编号为19GW1～4。2020年1月选择选择不育度＞98％、不育率100％；的1个F4代19GW3(19GH283)与保持系19GW4(19GH284)套袋杂交。具体操作同2.1.1。
2.1.5冬、春同时筛选、转育出F6代2020年4月、9月选择自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞18.4；亚麻酸含量＞16.36％；含油量＞48.2％的1个F5代单株(19GW3×GW4)种子及对应的保持系(18GH220)按照2.1.1的方法种植于春油菜区、冬油菜区，根据筛选指标在盛花期选择对F5代与保持系进行套袋杂交。具体操作同2.1.1。
2.2根据遗传稳定性确立油菜高亚麻酸CMS根据对F5、F6代的亚麻酸(ALA)含量、含油量、单株产量、单株亚麻酸(ALA)产出量的遗传稳定性分析结果(表4)，表明该CMS的表型变异系数(CV％)在2.98％～4.22％之间，说明遗传稳定。确立油菜高亚麻酸CMS代号为“YM-1A”，对应保持系代号为“YM-1B”。
表4 CMS的遗传稳定性分析结果
Figure BDA0003545113730000151
3、筛选效果
3.1在选育过程中CMS的品质、结实性逐步提高如图3所示，在选育过程中不同世代的CMS的亚麻酸(ALA)含量逐步提高，年平均增量为0.869；世代间(年)增长量逐步降低即F2-F1(1.6)＞F3-F2(1.11)＞F4-F3(0.93)＞F5-F4(0.87)＞F6-F5(0.6)。如图4所示，在选育过程中不同世代的CMS的含油量逐步提高，年平均增量为0.551；世代间(年)增长量之间为F4-F3(0.98)＞F3-F2(0.78)＞F5-F4(0.77)＞F6-F5(0.6)＞F2-F1(0.47)。如图5所示，在选育过程中不同世代的CMS的亚麻酸(ALA)产出量逐步提高，年平均增量为0.096；世代间(年)增长量逐步降低即F2-F1(0.16)＞F3-F2(0.14)＞F4-F3(0.12)＞F5-F4(0.09)＞F6-F5(0.04)。
3.2选育出的CMS的品质、结实性得到显著改良经对比发现，应用本发明技术选育的高亚麻酸CMS“YM-1A”与原CMS(陕6A)相比，含油量、亚麻酸(ALA)含量、异交结实系数、单株产量、单株亚麻酸(ALA)产出量分别提高8.45％、59.43％、12.8％、4.49％、80.65％；自交结实系数降低56.86％(表5)。
表5高亚麻酸CMS的选育筛选效果
Figure BDA0003545113730000161
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (6)

1.一种选育甘蓝型油菜高亚麻酸细胞质雄性不育系的方法，由以下步骤组成：
1)以已知的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系为母本，以高亚麻酸含量的甘蓝型油菜种质为父本，所述父本和母本按照1：1隔行种植，行间距为25～30cm，株间距为8～10cm；在盛花期套袋杂交，F1代自然成熟；在成熟前根据每个F1代单株的成角数、角粒数计算出结实性系数；收获后化验每株F1代的品质；按照F1代的筛选指标，筛选得到目标F1代；
所述父本的性状包括：亚麻酸含量＞15％；
所述目标F1代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞99％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本相比，含油量＞90％，亚麻酸含量＞65％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞17.4；
2)将目标F1代的种子与对应父本的自交单株按照1：1隔行种植，行间距为25～30cm，株间距为8～10cm；在盛花期套袋杂交，F2代自然成熟；在成熟前根据每个F2代单株的成角数、角粒数计算出结实性系数；收获后化验每株F2代的品质，按照F2代的筛选指标，筛选得到目标F2代；
所述目标F2代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞98％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本相比，含油量＞93％、亚麻酸含量＞75％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞17.4；
3)重复步骤2)，获得F5或F6代高亚麻酸甘蓝型油菜细胞质雄性不育系；
在步骤3)的选育过程中，目标F3代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞99％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本相比，含油量＞95％、亚麻酸含量＞80％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞18.0；
目标F4代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞99％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本相比，含油量＞97％、亚麻酸含量＞85％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞18.4；
目标F5代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞99％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本相比，含油量＞98％、亚麻酸含量＞90％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞18.4；
目标F6代的筛选指标包括育性指标、品质指标和结实性指标；所述育性指标为：不育度＞98％、不育率为100％；所述品质指标为：与父本相比，含油量＞98％、亚麻酸含量＞95％；所述结实性指标为：自交结实系数＜0.25、异交结实系数＞18.4；
所述目标F1代的筛选环境为春油菜区，目标F2代的筛选环境为冬油菜区，目标F3代的筛选环境为温室、目标F4代的筛选环境为春油菜区、目标F5代的筛选环境为温室、目标F6代的筛选环境为春油菜区、冬油菜区。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述在盛花期套袋杂交包括：在盛花期对所述母本和父本套袋后人工授粉，在所述的母本终花后解除套袋；
步骤2)中所述在盛花期套袋杂交包括：在盛花期对所述目标F1代和父本套袋后进行人工授粉，在所述目标F1代终花后去除父本，在所述母本终花后解除套袋。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中的两个相邻世代在不同种植区种植；所述种植区包括春油菜区、冬油菜区或温室。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中对所述母本和父本套袋包括：采用自交袋将母、父本的主花序、倒1分枝、倒2分枝套在一起；
步骤2)中对所述目标F1代和父本套袋包括：采用自交袋将F1代、父本的主花序、倒1分枝、倒2分枝套在一起。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，从F1代开始对不同世代的细胞质雄性不育株进行固定部位种子的单株间的育性、品质和结实性的比较筛选。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述已知的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系包括陕2A。
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