CN109496829B - 一种高亚麻酸油菜基因供体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高亚麻酸油菜基因供体，该高亚麻酸油菜基因供体在中国典型培养物保藏中心的命名为甘蓝型油菜Brassica napus高亚麻酸油菜R8Q10，保藏号为CCTCC NO：P201820。利用该高亚麻酸油菜基因供体选育油菜新品种，通过自交、杂交、回交等衍生后代中分离出新的高亚麻酸品系，用于常规品种，或者利用自交不亲和、雄性不育等授粉控制系统，配制杂交种，能够获得脂肪酸中亚麻酸含量达到15％‑17％以上的高亚麻酸油菜品种。

Description

一种高亚麻酸油菜基因供体及其应用

技术领域

本发明属于农作物食用品质改良利用技术领域，具体涉及一种高亚麻酸油菜基因供体及其在品种的选育应用。

背景技术

1、油菜脂肪酸成分

油菜(主要指甘蓝型油菜Brassica napus L)是中国和世界的第二大油料农作物，是食用植物油最主要的来源，菜籽油中脂肪酸组成直接决定其食用品质和营养价值。油菜种子中的主要脂肪酸有以下七种(刘后利主编，油菜的遗传和育种,上海科学技术出版社，1985)，分别是棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1Δ9)、亚油酸(C18:2，Δ9，12)、α一亚麻酸(C18:3 Δ9，12，15)、二十碳烯酸(C20:1Δ9)和芥酸(C22:1Δ9)。其中棕榈酸、硬脂酸属于饱和脂肪酸，油酸(oleic acid)、亚油酸(linoleic acid) 和亚麻酸(linolenicacid,简称ALA)属于不饱和脂肪酸。亚油酸和亚麻酸是人体正常功能所必需的脂肪酸，自身不能合成而必须从食物中获取。

植物油中不同脂肪酸成分的含量通常以其在总脂肪酸中的相对含量(百分比例来表示)。在传统高芥酸油菜品种中，芥酸含量为48.52％，而油酸、亚油酸和亚麻酸分别为18～20％、12％、8％；对于低(无)芥酸油菜品种，其芥酸含量在1％以下，而油酸、亚油酸和亚麻酸分别为58～65％、18～22％和 8～10％(杨庆勇.油菜种子高油酸低亚麻酸的遗传控制及等位基因特异标记开发.华中农业大学博士论文,2012)。蔡东芳等对来源于世界主要油菜种植国家的192份甘蓝型油菜品系的三年种子用近红外光谱仪进行分析发现亚麻酸含量范围为4.41％～12.75％，均值6.90％～8.57％(蔡东芳，张书芬，肖英杰，吴江生，刘克德.甘蓝型油菜油酸、亚油酸和亚麻酸含量的关联分析.中国油料作物学报.2016，38(4):397-405)。总的来说，甘蓝型油菜脂肪酸中的亚麻酸含量约8～9％左右(李殿荣，陈文杰，于修烛，王灏，任军荣，张耀文.双低菜籽油的保健作用与高含油量优质油菜育种及高效益思考.2016,38(6):850-854)。

植物油脂脂肪酸合成是一个整体系统途径，尤其是油酸、亚油酸、亚麻酸和芥酸的合成过程具有密切关联。芥酸是油酸经过碳链延长后形成的，脂肪酸延长酶1(FAE1)基因突变降低油菜籽中芥酸含量并显著提高油酸的含量。油酸到亚油酸、亚麻酸合成途径主要受到FAD2、FAD3基因的控制。油酸去饱和酶(Fatty acid desaturase2，FAD2)是ω-6脂肪酸去饱和酶，在单不饱和脂肪酸中引入第二个双键。亚油酸去饱和酶(Fatty aciddesaturase3，FAD3)催化亚油酸产生第三个双键形成亚麻酸。这两个基因对于改变油菜种子中不饱和脂肪酸含量有重要作用。某些fad3突变削弱酶催化功能可以进一步降低亚麻酸含量，从而提高FAD3酶的底物油酸的含量(杨庆勇.油菜种子高油酸低亚麻酸的遗传控制及等位基因特异标记开发.华中农业大学博士论文,2012)。

2、高亚麻酸油菜育种的必要性

从上世纪70年代起，自加拿大发端的油菜品质育种使得油菜籽脂肪酸成分得到大幅度改良，是农作物品质改良的典范之一。首先，通过低芥酸育种去掉了营养价值不明确的芥酸(C22:1)而提高了ω-9的油酸(C18:1)、ω-6的亚油酸(C18:2)在脂肪酸中的比例，二者合起来含量升高到75％～80％左右，使得油菜成为营养价值媲美橄榄油的最佳食用油之一。后来，加拿大还通过诱变获得低亚麻酸种质，使ω-3的α-亚麻酸(C18:3)从平均8％～9％降低到3％以下，并且亚麻酸的降低使得油酸含量继续升高可到85％以上。降低亚麻酸的目的有2个：(1)亚麻酸容易氧化导致油脂酸败，降低后可延长菜籽油货架期；(2)能够减少高温烹饪过程产生的油烟。但后来的实践表明低亚麻酸育种并不能取得像低芥酸育种那样的巨大成绩。首先，低亚麻酸育种导向得油菜品种的多不饱和脂肪酸含量降低，营养价值有所降低。更为严重的问题是，由于亚麻酸(18:3)对油菜的生长发育起着至关重要的作用：亚麻酸是膜脂重要构成成分，更是植物体茉莉酸甲酯等合成途径的前体物质，对于植物的生物和非生物胁迫抗性反应起到重要的作用。高油酸、低亚麻酸(HOLL)品种存在对逆境胁迫抗性下降，长势差，贪青晚熟、产量低等严重缺陷，所以难以大面积推广。

关于高油酸、低亚麻酸的缺陷方面的文献积累已经很多，例如：

(1)Kinney AJ.Genetic modification of the storage lipids of plants.Current Opinion in Biotechnology，1994，5(2):144-151。

(2)Miquel M.James D,Dooner H.Arabidopsis requires polyunsaturatedlipids for low temperature survival.Proc Natl Acad Sci USA，1993， 90(13):6208。

(3)Miquel M.High-oleate oilseeds fail to develop at low temperature.Plant Physio1ogy，1994，106(2):421-427。

(4)Becker HC，and Schierholt A.Influence of oleic acid content onyield in winter oilseed rape.Crop Science，2011，51(5):1973-1979。

(5)Wang M，Liu M，Li D et a1.Overexpression of FAD2promotes seedgermination and hypocotyl elongation in Brassica napus.Plant Cell，Tissue andOrgan Culture，2010，102(2):205-211。

(6)Zhang J，Liu H，Sun J，et a1.Arabidopsis fatty acid desaturase FAD2is required for salt tolerance during seed germination and early seedlinggrowth.PloS one，2012，7(1):e30355。

目前的油菜品质育种概念有所改变，高亚麻酸重新得到重视，原因在于高亚麻酸的氧化问题不再成为桎梏：(1)由于人口激增及生活水平上升带来的食用油供给缺口增大，食用油货架期无需太久；(2)随着油品加工、储藏技术发展，油菜籽及食用商品油杂质少且密封性很好，因亚油酸、亚麻酸而导致油脂酸败的机会大为减少；(3)大众消费观念改变、食谱多元化变化使得高温煎炸比重有所下降，相反的，人类日益增长的生活需求对高亚麻酸保健油的需求很高。人类日益认识到：α-亚麻酸作为人体必需脂肪酸，在人体新陈代谢的过程中是不可缺少的成分，对人体的生长发育起着重要作用。健康理念使得大众消费对多不饱和脂肪酸的需求大为增加，各国卫生组织推荐的ω-3/ω-6的理想摄入比值1:5左右(见下表)，欧美发达国家膳食摄入该比例可以达到1:10～1:20，而目前国内食用油ω-3严重不足，该比值在1:20～1:40(孙翔宇等，多不饱和脂肪酸的研究进展.食品工业科技.2012， 33(7):418-423)。2014年6月，中国营养学会发布了2013版《中国居民膳食营养素参考摄入量(DRIs)》，首次增加了α-亚麻酸推荐值，规定中国居民(孕妇)每天摄入1600～1800毫克α-亚麻酸为宜。

表1部分是国家或组织提出的ω-6/ω-3多不饱和脂肪酸的推荐值(孙翔宇等，多不饱和脂肪酸的研究进展.食品工业科技.2012，33(7):418-423)。

但是，在通常的食物中，α-亚麻酸的含量极少，必须要靠改善食用油脂肪酸来补充。目前主要食用油如豆油、菜籽油均缺乏亚麻酸，人们不得不通过服用深海鱼油或者亚麻籽油胶囊来补充ω-3。深海鱼油需要大量捕杀北冰洋、南极高纬度海域鱼类，成本较高且破坏生海洋生态系统。亚麻(胡麻) 需要在冷凉干爽的特定区域种植，且产量很低难以扩大种植面积和总产量。最主要的是世界人口基数庞大，这些来源的油脂数量太少远远不能满足人口增长的生活需求。而油菜在中国、加拿大、欧盟、印度等主要生产区域均有数千万亩至上亿亩的栽培，作为一种世界主要油料作物和食用油来源，提高油菜中亚麻酸的比例可以显著地提高人类食物亚麻酸供给。因此，出于人类健康需要，更需培养高亚麻酸的油菜新品种。但目前EMS诱变得到的是低亚麻酸品种，未发现高亚麻酸油菜资源，所以没有建立高亚麻酸育种目标。鉴于我国居民膳食中α－亚麻酸摄入不足，以及我国食用植物油存储时间短、消费周转快，李殿荣等(李殿荣，陈文杰，于修烛，王灏，任军荣，张耀文. 双低菜籽油的保健作用与高含油量优质油菜育种及高效益思考.2016， 38(6):850-854)认为目前双低油菜育种中亚麻酸含量不宜降低，还应适当提高，以补充我国居民对亚麻酸摄入量的不足，这也是我国油菜品质改良应作出的科学选择之一。

3、低亚麻酸、高油酸对油菜生长势、农艺性状的影响

优良的农艺性状是一个栽培品种最基本的要求。对于高油酸及特高油酸突变体油菜农艺性状的研究持续了很长时间。Kinney指出，高油酸及特高油酸油菜(油酸含量分别为86％和89％)突变体植株会有一些如营养体生长变缓、花蕾死亡、低结实率、低耐冷性等不利的表现，使得这种高油酸油菜的产量极低(Kinney AJ.Genetic modification of thestorage lipids of plants.Current Opinion in Biotechnology.1994，5(2):144-151)。Miquel 等(Miquel M，James D,Dooner H.Arabidopsis requires polyunsaturatedlipids for low temperature survival.Proc Natl Acad Sci USA， 1993,90(13):6208；Miquel M.High-oleate oilseeds fail to develop at low temperature.PlantPhysio1ogy，1994，106(2):421-427)通过低温处理拟南芥fad2突变体，在第30天后突变体死亡而野生型所受影响不大，说明 FAD2基因功能(亚油酸和亚麻酸合成)是低温存活所必需的。

Wang等(Wang M，Liu M,Li D et a1.Overexpression of FAD2promotes seedgermination and hypocotyl elongation in Brassica napus.Plant Cell,Tissue andOrgan Culture,2010,102(2):205-211)发现过表达FAD2 能够促进种子萌发和下胚轴伸长。Becker等(Becker HC，Schierholt A.Influence of oleic acid content on yieldin winter oilseed rape.Crop Science，2011，51(5):1973-1979)在欧洲冬油菜中也发现高油酸含量会延缓种子的萌发，而且种子中油酸含量与产量呈负相关。Zhang等(Zhang J，Liu H，Sun J，et a1.Arabidopsis fatty acid desaturase FAD2is required for salttolerance during seed germination and early seedling growth.PloS one，2012，7(1):e30355)发现FAD2基因在拟南芥抗盐中具有重要作用，fad2突变体液泡和质膜的阳离子转运积累异常，对盐胁迫超敏感。这些研究结果说明油菜高亚麻酸育种尤为迫切。

4、油菜亚麻酸含量的育种改造方法

通过甲基磺酸乙酯EMS诱变育种，Rakow(Rakow G.Selektion auf linol undlinolen-saureghalt in rapssamen nach mutagener behand-1ung.Z Planzen，1973，69:205-209)、Auld等(Auld D，Heikkinen M，Erickson D. et a1.Rapeseed mutants withreduced levels of polyunsaturated fatty acids and increased levels of oleicacid.Crop Science，1992， 32(3):657-662)分别获得首例低亚麻酸突变体M11和高油酸突变体 Cascade。此后加拿大育成世界首个低亚麻酸品种Stellar(Scarth R， McVetty P，Rimmer S，et a1.Stellar low linolenic—high linoleic acid summer rape.CanadianJournal of Plant Science，1988，68:509-511)。官春云等(官春云.油菜高油酸遗传育种研究进展.作物研究,2006，20(1):1-8)通过60Co射线处理甘蓝型油菜湘油15号种子，对后代进行连续多代选择，获得油酸含量最高达93.5％的植株。

油菜育种专家们利用高油酸材料与亚麻酸含量3％的材料杂交，获得一系列油酸大于75％、亚麻酸含量小于3％的HOLL育种材料。然后将HOLL 育种材料作为导入系，以优良栽培品种作为轮回亲本，通过回交转育和标记辅助选择获得具有高油酸、低亚麻酸目的性状且遗传背景回复为轮回亲本程度高的优良品系(陈伟，范楚川，钦洁等.分子标记辅助选择改良甘蓝型油菜种子油酸和亚麻酸含量.分子植物育种，2011，9(2):190-197)。

另外，芬兰科学家采用定向选择的策略，通过单粒传法，在第4代自交个体中获得油酸含量达85—90％，亚麻酸含量为3-6％的白菜型油菜品种 (周永明.油菜品质遗传改良的进展和动态.国外农学：油料作物，1996， (1):1-5)。但是除过转基因手段之外，目前还没有公开报道获得高亚麻酸油菜。因此，高α-亚麻酸育种成为油菜育种及品质改良的新方向。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种高亚麻酸油菜基因供体及其在品种选育的应用。

为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：

一种高亚麻酸油菜基因供体，其特征在于，该高亚麻酸油菜基因供体在中国典型培养物保藏中心的命名为甘蓝型油菜Brassica napus高亚麻酸油菜R8Q10，保藏号为CCTCCNO：P201820。

根据申请人的实验证明，该高亚麻酸油菜基因供体可以用于品种选育的应用，具体按下列方式进行：

1)用高亚麻酸油菜基因供体或其衍生材料连续自交，对植株或籽粒的某些性状进行选择，选育与高亚麻酸油菜基因供体其他性状有所不同的新高亚麻酸品种；

2)或者用高亚麻酸油菜基因供体或其衍生材料，和其他油菜进行杂交，在后代中分离出高亚麻酸株系，进而培育为常规品种；

3)或者将高亚麻酸油菜基因供体导入各种授粉控制体系，选育高亚麻酸油菜杂交种。

所述导入的各种授粉控制体系包括自交不亲和、化学杀雄、或者各种可遗传的雄性不育。

所述各种可遗传的雄性不育为细胞质雄性不育、细胞核雄性不育和基因工程雄性不育。

本发明给出的高亚麻酸油菜基因供体，可以重演，并利用非转基因技术进行高亚麻酸油菜育种，符合国家有关转基因产品的管理政策。对于增加油菜食用品质，改善人类植物油中亚麻酸来源，保障心脑血管健康，具有很的应用价值。

具体实施方式

需要说明的是本发明涉及的高亚麻酸油菜基因供体，命名为甘蓝型油菜Brassica napus高亚麻酸油菜R8Q10，该基因供体的菌种于2018年8月2 日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，并登记入册，该生物菌种于2018年8月2日起保存30年。保藏号为：CCTCC NO：P201820。保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学。

以下通过发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。

在以下的实施例中，申请人将籽粒脂肪酸中亚麻酸比例≥15％的油菜称为“高亚麻酸油菜”。

申请人在研究过程中，通过油菜品种间杂交，结合近红外光谱仪大量筛选资源，2014年、2015年先后得到了3个不同来源的高亚麻酸、低芥酸、低硫苷资源：

(1)YH2/黔5005，亚麻酸含量14.5％-16.0％，含油量43.9％-46.5％；

(2)YH2/Sapphire，亚麻酸含量13.0％-14.9％，含油量44.6％-44.9％；

(3)高亚麻酸油菜基因供体(以下简称R8Q10)：系谱Rfo/秦7//秦 8///秦10，亚麻酸含量14.3％-17.1％，含油量46.5％-49.1％。

比较上述YH2/黔5005、YH2/Sapphire和R8Q10，发现R8Q10的亚麻酸含量和油量最高，因此申请人将R8Q10在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，该在高亚麻酸油菜基因供体中国典型培养物保藏中心的命名为甘蓝型油菜Brassica napus高亚麻酸油菜R8Q10，保藏号为CCTCC NO：P201820。并初步选育成不育系、保持系和恢复系，为高亚麻酸油菜常规种、杂交种选育鉴定了坚实的材料基础。

据此，申请人采用高亚麻酸油菜基因供体用于品种选育的具体实施方案为：

1、总体概括：利用R8Q10为基因供体，选育新的高亚麻酸油菜品系，包括常规品种和杂交种。

2、利用R8Q10选育常规品种(相对杂交种而言)，其选育的基本程序有几种方式：

1)系统选择

用R8Q10连续自交，对植株或籽粒的某些性状(例如生育期、株高、抗性、含油量等)进行不断选择，选育与R8Q10在某些性状方面有所不同的新高亚麻酸油菜品种；

2)杂交育种

用R8Q10和其他油菜品种或育种材料进行杂交，在衍生后代中分离出高亚麻酸株系，经过自交纯合后就可以在育种中作为高亚麻酸油菜自交系或高亚麻酸油菜常规品种应用；

3)回交育种

用R8Q10和其他油菜(作为轮回亲本)进行杂交，其后代继续与轮回亲本回交若干次，在后代中分离出具有轮回亲本某些特性的高亚麻酸油菜株系；

3、将R8Q10导入各种授粉控制体系的亲本中，选育高亚麻酸油菜杂交种。导入各种授粉控制体系包括自交不亲和、化学杀雄、可遗传的雄性不育 (包括细胞质不育(英文缩写为CMS，例如油菜的Ogura CMS和Polima CMS))、或者质核互作不育、细胞核不育(英文缩写GMS或NMS，例如S45A，9012A)、光温敏核不育(TMS或TPGMS)、基因工程不育等(具体可参考傅廷栋主编. 杂交油菜的育种与利用[第二版].武汉:湖北科学技术出版社,2000))。

具体常见育种步骤包括，授粉亲本的选育以及杂交种的生产。

1)使R8Q10导入含有自交不亲和或者雄性不育基因的育种材料，选育自交不亲和系或不育系；

2)或者使R8Q10导入含有自交不亲和或雄性不育恢复基因的育种材料，选育恢复系；

3)上述步骤选育的自交不亲和系、不育系、恢复系之间杂交，产生具有高亚麻酸特性油菜的杂交种。

5、将R8Q10导入不同育种材料并培养成自交系，然后一部分高亚麻酸自交系用化学杀雄剂处理成雄性不育群体，再用另外的高亚麻酸油菜自交系给不育群体授粉，生产杂交种。

需要指出的是：由于控制脂肪酸含量的基因遗传效应一般符合加性主效基因+微效基因模式，所以生产高亚麻酸油菜杂交种的父本、母本均需要具有高亚麻酸特性，其亚麻酸控制基因可以相同，也可能来自不同原始供体。

以下是发明人给出的具体实施例。

实施例1：R8Q10、YH2-Sap、YH2-5005的研究、选育过程

通过油菜品种间杂交，结合FOSS 5500型近红外漫反射仪大量筛选，2015 年发现3个不同来源的、低芥酸、低硫苷资源高亚麻酸含量偏高(表2)。 2016年、2017年、2018年对这些材料进行重点筛选，结果其后代中高亚麻酸单株频率越来越高，逐渐稳定(表3)。近红外检测不同株系的总体品质为：

(1)YH2/黔5005，简写YH2-5005，亚麻酸含量14.5-16.0％，亚油酸 18.5-19.7％，油酸49.6-55.3％，含油量43.9-46.5％；

(2)YH2/Sapphire，简称YH2-sap，亚麻酸13.0-14.9％，亚油酸 17.0-21.3％，油酸50.4％-62.4％，含油量44.6-44.9％；

(3)R8Q10，系谱Rfo/秦7//秦8///秦10，亚麻酸含量14.3％-17.1％，含油量46.5％-49.1％。

表2：2015年部分单株品质分析结果(近红外，特殊亚麻酸含量用加粗字体)

表3：2016年部分单株品质分析结果(近红外)

将不同年份、不同基因型材料的脂肪酸成分气相色谱仪精确测量(结果见表4)。

可见所选育的R8Q10、YH2-Sap、YH2-5005等亚麻酸含量普遍较高，部分株系达到17％以上。相比普通材料如中双9号、Q211紫等高80％以上，比低亚麻酸材料A28高3到4倍。

这些明显的表型差异证明其中存在必然的基因型差异，而不是随机误差。当然，同一材料的亚麻酸含量在不同年份间存在较大变异，说明亚麻酸含量受到气候等栽培因素的影响，不太稳定。

表4：气相色谱仪分析结果(百分含量)

实施例2：R8Q10在育种的应用

利用R8Q10和高含油量油菜自交系双8杂交，在R8Q10-双8的F3代中筛选到亚麻酸含量15％左右的2个株系，检测结果结果见表5。其后代亚麻酸也有高于15％的株系。

表5：R8Q10-双8的F3代中筛选到亚麻酸含量

实施例3：高亚麻酸杂交种选育

用YH2-5005、YH2-Sap与Polima CMS一个不育系ZH9A杂交，F₁代表现雄性不育，继续用YH2-5005、YH2-Sap进行回交2代以上，初步选育成不育系YH2-5005A、YH2-SapA。

由于R8Q10本身就是含细胞质雄性不育(CMS)恢复基因，是Ogura CMS 和PolimaCMS的恢复系。将来可以用恢复系R8Q10给不育系YH2-5005A、 YH2-SapA分别授粉生产高亚麻酸油菜杂交种。

实施例4：化学杀雄诱导不育生产高亚麻酸杂交种

2017年，用R8Q10做父本给化学杀雄剂酰嘧磺隆诱导的高亚麻酸自交系“双8-105”(系谱R8Q10/双8//杂105)不育群体授粉，产生F₁杂交种， 2018年播种，小区产量比亲本R8Q10和双8-105分别提高7.8％和5.2％，检测F₁代杂交种R8Q10×双8-105的亚麻酸含量分别16.02％。杂交种籽粒产量增加，而亚麻酸含量仍然很高，表明利用高亚麻酸杂交种选育是切实可行的。

Claims (3)

1.一种高亚麻酸油菜育种方法，其特征在于，按下列方式进行：

1)用高亚麻酸油菜基因供体或其衍生材料连续自交，对植株或籽粒的某些性状进行选择，选育与高亚麻酸油菜基因供体其他性状有所不同的新高亚麻酸品种；

2)或者用高亚麻酸油菜基因供体或其衍生材料，和其他油菜进行杂交，在后代中分离出高亚麻酸株系，进而培育为常规品种；

3)或者将高亚麻酸油菜基因供体导入各种授粉控制体系，选育高亚麻酸油菜杂交种；

所述高亚麻酸油菜基因供体，在中国典型培养物保藏中心的命名为甘蓝型油菜Brassica napus高亚麻酸油菜R8Q10，保藏号为CCTCC NO：P201820。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述导入的各种授粉控制体系包括自交不亲和、化学杀雄、或者各种可遗传的雄性不育。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述各种可遗传的雄性不育为细胞质雄性不育、细胞核雄性不育和基因工程雄性不育。