PT1218736E - Processo e dispositivo para a mediação de células localizadas num ambiente líquido - Google Patents

Description

PE1218736 1

DESCRIÇÃO

"PROCESSO E DISPOSITIVO PARA MEDIÇÃO DE CÉLULAS LOCALIZADAS NUM AMBIENTE LÍQUIDO" 0 presente invento refere-se a um dispositivo para medição eléctrica de células localizadas num ambiente liquido, de acordo com o conceito da reivindicação 1. A patente DE 198 41 337 Cl já divulgou um dispositivo semelhante. 0 dispositivo divulgado pela patente mencionada anteriormente destina-se à manipulação intracelular de uma célula biológica; a detecção dos valores de medida não está mencionada na presente descrição. É do conhecimento geral a utilização de conjuntos de microeléctrodos na pesquiza de células biológicas. Estes conjuntos destinam-se por exemplo à estimulação de células ou à derivação de potenciais. As pesquisas, neste caso, podem ser efectuadas num ambiente biológico ou também num ambiente artificial. Para o efeito, os conjuntos abrangem uma multiplicidade de microeléctrodos numa estrutura de suporte, cujas dimensões se encontram na ordem de grandeza das células, ou seja no âmbito de alguns pm. A patente WO 97/05922, por exemplo, divulga de um modo geral um conjunto 2 ΡΕ1218736 de microeléctrodos deste tipo.

Nos conjuntos de microeléctrodos tradicionais está-se mais ou menos dependente do acaso, ou seja, se uma ou outra célula se aloja ou não num determinado eléctrodo. Na prática, as células só se alojam, geralmente, num eléctrodo parcialmente, pelo que a estimulação da célula ou a derivação de um potencial da célula está limitada a esta superfície parcial. Além disso, as células só se alojam soltas nos eléctrodos. Este facto pode acarretar problemas relativamente à resistência de isolamento para com o eléctrodo de referência. As células também podem acomodar-se fora da área de um eléctrodo, impossibilitando a realização da medição.

Num conjunto de microeléctrodos divulgado pela patente DE 197 12 309 A 1 estas desvantagens são evitadas colocando as células em micropipetas, e em cujo fundo se encontra um eléctrodo. Este eléctrodo possui um canal central, onde, através de canais de ligação apropriados, que passam no lado inferior dos eléctrodos, pode ser produzida uma subpressão. Desta forma é possivel atrair células individuais na direcção dos eléctrodos e fixá-las nos eléctrodos sob a acção de uma determinada pressão de contacto. Poderão então proceder-se a medições nos eléctrodos, mas somente do seu lado exterior.

Conhece-se, de um outro sector especializado, a chamada "Técnica Patch-Clamp", aspirar células por meio de 3 PE1218736 subpressão numa pipeta (consultar US-Z "NATURE", VOL. 260, pág. 799-801, 1976). Contudo, ao usar-se a técnica "Patch-Clamp" a pipeta tem de ser dirigida a uma célula isolada. Na técnica "Patch-Clamp" as células a serem contactadas não são deslocadas, pois elas, em regra, aderem a um substrato. O contacto tradicional de células por pipetas "Patch-Clamp", tem, contudo, a desvantagem de o número de células contactáveis simultaneamente ser extremamente limitado, dado que, por motivos de espaço, não poderem ser introduzidas aleatoriamente muitas pipetas na câmara de cultura.

Por outro lado, a Técnica "Patch-Clamp" em comparação com a técnica descrita anteriormente, na qual só podem ser efectuadas medições no lado exterior da célula, tem a vantagem de permitir a incorporação de medições no interior da célula.

No caso da Técnica "Patch-Clamp" com pipetas individuais, o processo decorre sob observação microscópica, de forma que uma frágil pipeta de vidro é levada por meio de um micromanipulador a uma célula individual que aderiu a um substrato, sendo a membrana aspirada cuidadosamente pela abertura da pipeta. Existe, portanto, um contacto directo entre a superfície da membrana e o vidro. Dai que uma mancha da membrana em relação ao fluido circundante é vedada e electricamente isolada. Este isolamento também é designado por "Gigaseal". Desta "configuração Cell-Attached" passa-se à "configuração Whole-Cell", em que a membrana isolada continua a ser 4 PE1218736 aspirada. Este processo acontece de forma a que a membrana seja rompida sob a pipeta. Dessa forma, forma-se um acesso isolado, hidráulica e electricamente, através da abertura da pipeta. A restante membrana da célula é, assim, acessivel electricamente num todo (o assim chamado "whole cell patch"). A aplicação deste método tradicional exige, contudo, uma grande experiência e sensibilidade. Várias células só podem ser manipuladas sequencialmente. Portanto, este método é impróprio para pesquisas de massa, como seria necessário por exemplo no sector de "Pharmascreening", de "Substanzscreening" e processos análogos. 0 documento WO 01/25769, não publicado, descreve um tipo de dispositivo, segundo o qual se encontra disposto um canal num substrato, o qual se encontra em comunicação com uma cavidade através de uma abertura. Em ambos os lados da abertura estão dispostos eléctrodos que permitem, através de técnicas de medição, a colheita de dados numa célula, que é aspirada através de subpressão no canal. Este documento não dá a conhecer a multiplicidade de canais, e a admissão ou a expulsão do fluido. A publicação Kostyuk et al: "Effect of internai fluoride and phosphate on membrane currents during intracellular dialysis of nerve cells", Nature 257, de 23 de Outubro 1975, pg. 691, descreve um processo de diálise intracelular e de medida de tensão em células, em que a célula respectiva não é posicionada numa abertura de um substrato plano, mas pelo contrário é aspirada no substrato 5 ΡΕ1218736 plano relativamente espesso numa abertura cónica convergente .

Pelo exposto, a tarefa da presente invenção consiste no aperfeiçoamento de um dispositivo do tipo descrito no inicio desta descrição, e que evita as anomalias anteriormente mencionadas. Em especial, o invento deverá possibilitar medições tanto quanto possível consistentes e preferencialmente paralelas numa multiplicidade de células, como se pretende na gama de "Screening" experimental e orientado para a aplicação de efeitos em agentes farmacêuticos a nível celular.

No caso de um dispositivo correspondente ao tipo mencionado no início da presente descrição, o invento propõe-se solucionar as anomalias de acordo com as características da reivindicação 1. A tarefa a que o invento se propõe resolver é solucionada deste modo completamente.

Com o dispositivo proposto pelo presente invento, o segundo eléctrodo é colocado na extremidade do canal oposto à face inferior da membrana de uma célula posicionada sobre a superfície do substrato, e o primeiro e o segundo eléctrodos estão adequados para interrogação eléctrica da célula, e o segundo eléctrodo encontra-se colocado na extremidade do canal oposto ao primeiro eléctrodo. 6 ΡΕ1218736

Portanto, a célula é interrogada electricamente por um eléctrodo, que está distanciado na direcção do canal do lado inferior da membrana. Para isso, pode ser inserida uma corrente no interior da célula.

Este método tem a vantagem de estabelecer um acesso eléctrico directo só no interior da célula. Pelo facto de a célula com a sua membrana exterior se encontrar completamente apoiada no fundo da micropipeta e ai estar fixada por meio da subpressão, forma-se de maneira automática o "Gigaseal" divulgado pela técnica "Patch-Clamp" tradicional, quer dizer uma resistência de fuga extremamente elevada e, por isso, afectando pouco a medição, entre o meio intracelular e extracelular. Pelo facto de o eléctrodo se encontrar afastado do "Gigaseal", há também a garantia de que a célula propriamente dita só entra em ligação com materiais isolados electricamente, pelo que a manutenção do "Gigaseal" encontra-se garantida.

Em comparação com as técnicas tradicionais "Patch-Clamp", a presente invenção possibilita a desistência de difícil manipulação com uma pipeta de vidro, dado que o funcionamento desta pipeta tradicional é exercida através do canal num substrato, onde é aplicada uma subpressão afim de ajustar uma "configuração Cell-Attached". Se, desta maneira, for ajustado um "Megaseal" entre a parede da célula e a superfície, na qual a célula é aspirada, a parte inferior da membrana é rompida através do aumento da subpressão, pelo que agora as medições poderão 7 ΡΕ1218736 ser realizadas através do canal pelo interior da célula circundada pela membrana. Alternativamente ou adicionalmente a isso, a membrana pode tornar-se microporosa através da adição de substâncias porosas e de fraca impedância. Pela adição destas substâncias porosas, tais como Nystatin ou Amphotericin B, formam-se poros nas membranas, possibilitando um acesso de fraca impedância no interior da célula, através do qual, todavia, não podem difundir-se quaisquer moléculas maiores. Deste modo, podem medir-se as intensidades resultantes das membranas, sem que para isso o lado inferior da membrana deva ser destruído. Alternativamente, nesta área a membrana pode também ser aberta ou rompida através de um curto impulso eléctrico.

Uma especial vantagem do presente invento apresenta-se no facto de o eléctrodo de medida poder ser colocado longe da membrana, e que a célula, com a sua membrana, não precisa de entrar em contacto com o eléctrodo, e que a medição pode realizar-se por meios intracelulares.

Enquanto que pela disposição divulgada pelo documento DE 197 12 309 Al só são possíveis medições extra- celulares, ou seja medições de variações de potencial provocadas por intensidades da membrana na vizinhança directa da célula, através do presente invento podem realizar-se medições intracelulares e extracelulares, quer dizer, pode ser medida e controlada a tensão aplicada além da membrana. Preferencialmente, é injectada uma corrente na ΡΕ1218736 membrana, para o efeito. 0 invento apropria-se em particular medida de pesquisas de massa no âmbito da "Pharmascreening" e de "Substanzscreening", da identificação clonal (GVO's; organismos variados geneticamente) e no quadro de optimizações de substância, onde a citoplasma de células biológicas é medida electricamente, concretamente ou directamente sequencial para um avultado número de células dessa espécie. 0 presente invento abre por isso, pela primeira vez, a possibilidade de aplicar, de forma inteiramente automática, uma técnica com as mesmas vantagens das técnicas "Patch-Clamp". Por esse motivo, podem ser investigadas paralelamente numerosas células deste espécie, de forma automática e em elevada multiplicidade.

Se o canal, na sua extremidade oposta do primeiro eléctrodo, comunicar através de válvulas com uma multiplicidade de canais, puder ser alimentado ou descarregado, tem a vantagem de, através de controle das condições de pressão nos canais de ligação, o interior da célula ficar em contacto com o fluido intracelular após formação da configuração "Whole-Cell", ou seja após rompimento da membrana.

Neste caso, a composição do meio líquido intracelular pode ser alterada depois da abertura da membrana ou da produção de microporos através da adição de 9 ΡΕ1218736 substâncias ou o meio liquido intracelular pode ser substituído. Para isso, o canal pode comunicar com dois ou mais canais, sendo que um será cheio com electrólito, que se assemelha na sua composição aos citoplasmas (fluido intracelular) ou é um fluido especial com aditivos hormonais.

Desta forma, possibilita-se uma influência eficaz e controlada do meio intracelular e, simultaneamente, o espectro possivel de medições realizadas é aumentado consideravelmente.

No aperfeiçoamento preferencial do dispositivo criado pelo presente invento, encontram-se previstos meios para comando de uma queda de pressão estática para ajustamento de uma configuração "Cell-Attached", mas também para o aumento intermitente da queda de pressão para o rompimento do lado inferior da membrana.

Desta forma, o ajustamento do "Megaseal", por um lado, pode ser alcançada de forma fidedigna e controlada e, por outro lado, ser mantido o "Meagaseal", enquanto que por meio de um curto impulso no lado inferior da membrana dá-se o rompimento e a colocação na parede do canal. Nesse caso, o sistema de comando está concebido de tal forma, que a subpressão estática é mantida de forma permanente, pelo que o "Megaseal" também será mantido no caso da configuração "Whole-Attached". 10 ΡΕ1218736

No caso do novo dispositivo, o segundo eléctrodo pode envolver em anel a extremidade oposta do canal.

Estas medidas têm a vantagem de o eléctrodo poder ser integrado, de forma simples, numa microestrutura, sendo configurado no lado inferior da camada, na qual o canal passa.

Numa outra variante do presente invento, o segundo eléctrodo, pelo contrário, está colocado à distância da extremidade oposta do canal.

Esta medida apresenta a vantagem do eléctrodo poder também ser colocado de forma móvel confrontando o canal, permitindo a medição sequente de várias células com o mesmo eléctrodo.

No aperfeiçoamento adicional do invento está colocado sobre o substrato uma micropipeta, em cujo fundo se encontra uma abertura.

Neste contexto, o fluido pode ser armazenado na parte superior do substrato de maneira especialmente adequada à investigação de massa. Para isso, as células podem ser conduzidas directamente por meio da micropipeta numa adequada forma de funil, até à proximidade da "foz" do canal de uma superfície do substrato. Em alternativa a abertura no fundo da micropipeta pode, contudo, ter também um diâmetro visivelmente maior, pelo que a condução da 11 ΡΕ1218736 célula até à "foz" do canal é atingida através da subpressão aplicada. Este procedimento facilita a realização da estrutura criada pelo presente invento.

Também é importante dispor uma multiplicidade de canais num substrato comum.

Deste modo, pode ser obtida uma estruturação compacta tratando-se de uma construção simplificada.

Neste caso, também é preferível a colocação de um grande número de micropipetas numa placa.

Deste modo, existe a vantagem de poderem efectuar-se medições paralelas ou sequenciais de forma simplificada em muitas células, porque todas as micropipetas se encontram numa placa comum. (0037) Tratando-se de versões oriundas do invento, que utilizam uma placa comum para as micropipetas, é também preferível que as placas sejam constituídas por camadas múltiplas.

Esta medida tem a vantagem de levar em conta os diferentes requisitos dos variados elementos que constituem a placa, através de uma selecção adequada dos materiais. isto é especialmente importante se, num aperfeiçoamento desta variante, a placa for constituída por uma camada superior, uma camada intermédia e uma camada 12 PE1218736 inferior, sendo que as micropipetas estão dispostas na camada superior, a camada intermédia formar o substrato com os canais e na camada inferior estão dispostos canais de ligação que conduzem aos canais e, numa versão importante, também cabos eléctricos de alimentação, que vão dar aos canais, assim como microeléctrodos.

Esta placa, constituída por três elementos, tem a vantagem de poderem ser aplicadas camadas específicas de diferentes espessuras e diferentes materiais para as três funções essenciais.

De acordo com outra versão do presente invento, o substrato está combinado com uma camada inferior, que é constituída por uma ou várias camadas de materiais fotoestruturais, e que permitem um comportamento espacial de canais de ligação, que vão dar aos canais.

Neste caso, a camada inferior pode ser colocada num suporte de vidro.

Através desta medida, torna-se possível a criação de uma estrura compacta e de uma construção simples. Os materiais fotoestruturáveis são determinados polímeros mas, também, vidros específicos. É preferível que os canais de ligação tenham uma largura entre 10pm e 40pm, preferencialmente cerca de 20 pm. 13 ΡΕ1218736

Os canais propriamente ditos têm preferencialmente um vão inferior a 10pm, preferencialmente menor do que 5pm.

Esta dimensão revelou-se óptima no presente contexto. Em especial, pelo facto de o vão dos canais ser menor do que o diâmetro das células, o posicionamento de cada célula apoia-se num canal.

Como já foi anteriormente sugerido, é importante que nestas versões apresentadas pelo presente invento, os eléctrodos estejam dispostos no lado inferior da camada intermédia ou no lado superior da camada inferior.

Esta medida tem a vantagem de os eléctrodos, juntamente com as suas linhas de admissão, possam ser configurados por meio de simples compressão, precipitação, metalização por vácuo e sequente microestruturação através de processos conhecidos (fotolitografia, processamento por corrosão, lift-off).

No caso presente, é também importante que os eléctrodos apresentem uma superfície quadrada - vista em planta com um comprimento de arestas entre 20pm e 60pm, de preferência 40pm.

Conforme já foi mencionado, pode prever-se, no caso presente, dispor as vias condutoras, que levam aos eléctrodos, entre a camada intermédia e a camada inferior. 14 PE1218736

Isto pode efectuar-se em alternativa, aplicando-as em baixo na camada intermédia e em cima na camada inferior. Aplicando no lado inferior da camada intermédia tem a vantagem de as vias condutoras poderem ser configuradas com os eléctrodos, especialmente com o mesmo material, nomeadamente com metal nobre, preferencialmente ouro.

As vias condutoras têm, neste caso, de preferência uma largura entre 5 pm e 30pm, preferencialmente cerca de 10 pm.

Conforme já foi anteriormente mencionado, na construção em camadas múltiplas da placa podem ser utilizados diferentes materiais nas respectivas camadas.

As diferentes camadas podem, por exemplo ser fabricadas de plástico, de polimetilmetacrilato (PMMA), Silicone, PTFE, "POLYIMID" ou de um material inorgânico, especialmente vidro, cerâmica ou silício.

Na fabricação do substrato utiliza-se preferencialmente "POLYMID" que, para este efeito, é utilizado como acetato, no qual os canais são configurados como orifícios. O substrato (o acetato) tem preferencialmente uma espessura entre 2 pm e 40 pm, de preferência cerca de 5 pm.

Para a camada inferior utiliza-se, de preferência, vidro. O vidro pode ser encontrado praticamente em qualquer espessura, podendo desta forma garantir-se a 15 PE1218736 estabilidade mecânica e podem ser abertos os necessários canais de ligação e outros, de forma tradicional.

Continuando o aperfeiçoamento adicional do presente invento, é importante dispor o substrato no lado inferior de uma placa, no qual se encontra constituída uma quantidade de orifícios, como micropipetas, e em que no fundo estão previstos orifícios, com os quais os canais do substrato são centrados.

Desta forma, pode-se fabricar, de forma relativamente simples, um corpo combinado com uma multiplicidade de micropipetas, nas quais estão distribuídos canais e eléctrodos.

De acordo com uma outra versão do presente invento, está prevista uma unidade hidráulica e de medida, que apresenta uma câmara aberta na direcção do lado inferior do substrato, e que está posicionada no lado inferior do substrato de tal forma que a câmara comunica com um canal seleccionado, que se encontra vedado para o exterior, e que a câmara está munida, pelo menos, de um eléctrodo, que se comunica com, pelo menos, um canal de ligação, que por sua vez está ligada a uma fonte de subpressão.

Neste caso, pode ser prevista uma unidade de processamento para processar e posicionar a placa e a unidade de subpressão e de medida relativamente uma à 16 PE1218736 outra.

Desta forma, uma única unidade de medida pode ser utilizada na medição sequencial de uma quantidade de células, o que oriqina uma economia considerável de custos.

Neste caso, podem ser utilizadas placas c/ retícula nomalizadas habituais no mercado ( conhecidas como "placas perfuradas 96", "placas perfuradas 384" ou análogas). Estas precisam unicamente de ser fechadas em baixo colocando-lhes o acetato munido dos canais orifícios. As medições das numerosas células nos orifícios da placa perfurada são praticadas sequencialmente, através do processamento da unidade de subpressão e de medida ou inversamente pelo processamento das placas reticuladas normalizadas, com referência a uma unidade fixa de subpressão ou de medida. Esta produz o impulso de subpressão para abertura da célula e, também contém o eléctrodo, para realizar a medição seguinte através do interior da célula.

Neste caso, como já anteriormente mencionado, pode-se de novo ligar a câmara, por meio de válvulas, a uma multiplicidade de canais de ligação, a fim de colocar o interior da célula em contacto com o fluido intracelular de acordo com a formação da configuração "Whole-Cell" ou poder alterar a composição do fluido intracelular.

Outras vantagens do invento estão patenteadas na 17 ΡΕ1218736 descrição e no desenho anexo. É evidente que as mencionadas caracteristicas e as indicadas a seguir, ainda por esclarecer, não são só utilizáveis na respectiva combinação mas, também, noutras combinações exclusivas, sem abandonarem o âmbito do presente invento. Exemplos das versões do presente invento encontram-se representados no desenho e detalhados na descrição seguinte:

Fig. 1 Vista em perspectiva extremamente esquematizada do exemplo da versão de um dispositivo criado pelo presente invento; Fig. 2 Corte por uma micropipeta, de acordo com a disposição da fig. 1, igualmente muito e s quemat i z ada; Fig. 3 Vista em planta de um micropipeta da fig. 2, em escala ligeiramente reduzida; Fig. 4 Secção da fig. 2 em escala ampliada, para esclarecimento do processo criado pelo presente invento. Fig. 5 Representação semelhante à da fig. 3, representando o nível técnico. Fig. 6 Vista em perspectiva e de uma secção ampliada; e

Figs.7a) a 7c) Diferentes fases na aspiração de uma célula, para formação de uma configuração "Cell-

Attached" e de uma configuração "Wholle-Cell" ΡΕ1218736 18 durante a utilização de dois canais de ligação com o canal em representação esquemáica simplificada.

Exemplo 1

Nas fig. 1 a 4 está identificada com 10 uma placa. Numa superfície da placa 10 está configurada por meio de molde uma guia de micropipeta 12. As micropipetas 12 são tridimensionais e têm dimensões próprias para a cultura de células. Numa placa 10 podem ser dispostas 8x12=96 micropipetas. A seta 14 indica que as micropipetas 12 podem ser cheias por cima, quer dizer com um liquido em que se encontram células para investigação. Neste caso, é possível encher individualmente as micropipetas 12 com diferentes líquidos e células.

Para realização das medições está previsto um módulo de ligação eléctrico 16 que pode ser acoplado lateralmente à placa 10, pelo que, para o efeito, está prevista uma quantidade suficiente de fichas 18. As fichas estão em ligação com uma rede de vias condutoras. Estas conduzem aos eléctrodos, que estão colocados na área das micropipetas 12, como ainda vai ser explicado. Do módulo de ligação eléctrica parte uma linha de dados 20 para um aparelho de comando 22. 19 PE1218736

Além disso, está previsto um módulo de ligação hidráulica 24, que também pode ser acoplado lateralmente à placa 10, designadamente através de uma quantidade correspondente de fichas hidráulicas 26. Através do módulo de ligação hdráulica 24, pode-se produzir de forma pré-determinada, em particular individualmente, uma subpressão sob a micropipeta, em especial com decurso intermitente, como ainda será abaixo relatado.

Para esta finalidade, as fichas hidráulicas 26 são ligadas às micropipetas através de uma fonte de alimentação dos canais de ligação e das aberturas 49 no fundo das micropipetas 12. Se todas as micropipetas 12 forem alimentadas com a mesma subpressão, todos os canais de ligação devem ser ligados em paralelo e serão ligados directamente do módulo de ligação hidráulica 24 com uma fonte de subpressão de comando central. Se, contudo, as micropipetas individuais 12 forem comandadas por subpressão individual, poderá também utilizar-se uma fonte central de subpressão, que é ligada à fonte de alimentação de canais de ligação, sendo que nestes canais se encontram válvulas de comando individual. Em alternativa, também podem ser montadas nos canais de ligação bombas miniaturas, em especial bombas miniatura de diafragma com comando individual. O comando eléctrico das válvulas ou das bombas miniaturas pode efectuar-se através do módulo eléctrico 16 ou do módulo hidráulico 24. Em qualquer dos casos, existe uma linha 28 que leva o comando dos elementos anteriormente mencionados, do módulo hidráulico 24 para o aparelho de 20 ΡΕ1218736 comando 22. O aparelho de comando 22 encontra-se em ligação com uma unidade multiplexer 30, a fim de poder executar, de forma previamente determinada, várias medições em simultâneo ou, se necessário, em sequência.

Conforme se reconhece na fig. 2 a placa 10 é constituída essencialmente por três camadas. Na camada 32 encontra-se uma camada intermédia ou um substrato 34 com a forma de acetato. A camada superior 36 é executada como camada microestruturada. A camada inferior 32 é constituída preferencialmente por vidro. O substrato 34 é preferencialmente uma folha de Polymid. A camada microestruturada 36 consiste, por outro lado, de polimetilmetacrilato (PMMA).

Na parte superior da camada inferior 32 encontra-se executado um canal de ligação 38. O canal de ligação 38, serve para comando individual da micropipeta repreentada na fig. 12. O canal 38 encontra-se em ligação com uma abertura 49 no fundo 48 da micropipeta 12 através de um canal vertical 40 no substrato 34. A micropipeta 12 é dotada, no seu lado superior, de uma secção cilíndrica 42, que é revestida com um eléctrodo de referência 44. Este encontra-se ligado a uma primeira ligação eléctrica 46. Esta encontra-se preferencialmente ligada à massa. (0074) Em baixo, à secção cilíndrica 42, liga-se uma secção em forma de funil, que forma o fundo 48, no qual é prevista a abertura 49. 21 ΡΕ1218736

Para colocação em volta da extremidade inferior do canal 40, existe um eléctrodo 50 com forma aproximada-mente circular. Para este efeito, é colocado sobre o lado inferior do substrato 34. O eléctrodo 50 é ligado a uma linha 52, que passa entre a camada inferior 32 e o substrato 34. O cabo de alimentação 52 pode, juntamente com o eléctrodo 50, por exemplo, ser comprimido, depositado por vaporização, separado ou sujeito a outro processamento análogo. O cabo 52 está ligado a um segundo contacto eléctrico 54.

Os eléctrodos 46 e 50 são constituídos por cloreto de prata (Ag/AgC). Estes eléctrodos são conhecidos pelos especialistas como "reversíveis" ou como "não polarisáveis". Eles têm a vantagem de permitirem realizar medições nas células, não só medições por tensão alterna, ou seja medições do pico de potencial (conhecidas por "spike"), mas também medições por tensão contínua. Também podem ser aplicados para "injecção de corrente".

Entre os eléctrodos 46 e 50 é medida a tensão de medida Uamp. Também pode ser armazenada através do contacto 54 uma corrente de simulação Ist, paralelamente à medição de tensão.

Isto será ainda esclarecido em detalhe, com base na fig. 4.

Conforme se reconhece na vista em planta da fig. 22 PE1218736 3, encontram-se vários eléctrodos 12 dispostos na placa 10 na forma de um reticulo, sendo que a sua dimensão d se posiciona entre 0,1 e 10 mm, preferencialmente cerca de 9 mm.

As micropipetas 12 possuem, na área da sua secção cilíndrica 42, um raio interno r entre 1 e 9 mm aproximadamente, de preferência cerca de 7 mm, o que permite um enchimento fácil. O vão do canal vertical 40 é menor do que 5 pm.

As vias condutoras 52 têm uma largura b entre 5 pm e 30 pm, de preferência cerca de 10 pm. Os eléctrodos 50 possuem uma vista quadrada em planta e têm um comprimento entre cantos a entre 20 pm e 60 pm. Os canais de ligação 38 têm uma largura b2 entre 10 pm e 40 pm, de preferência cerca de 20 pm. 0 substrato 34 ou o acetato têm entre 2 pm e 40 pm, de preferência cerca de 5 pm de espessura. A distância 1 das micropipetas 12 a partir do bordo da placa 10 é, no mínimo, de 2 cm, o que permite alcançar uma elevada resistência do Shunt, ou seja um desacoplamento eléctrico dos respectivos eléctrodos. O eléctrodo 50 e as vias condutoras 52 são constituídas preferencialmente por ouro. 23 ΡΕ1218736

Na fig. 2 está ainda indicado, que pode ser integrada uma microbomba 56 no canal de ligação 38, que pode ser comandada por meio de um terceiro contacto 58. Por meio da microbomba 56 ou de uma fonte de subpressão central ou ainda pela introdução de válvulas nos canais de ligação 38 pode ser ajustada uma subpressão com progressão temporal nos canais de ligação 38. A fig. 4 apresenta em escala aumentada a situação, em que a célula 60 mergulha no fundo 48 da micropipeta. Esta situação realiza-se através da gravidade, ou se, por aplicação de uma subpressão preferencialmente constante no canal 40, a célula é aspirada. A forma em funil da secção no fundo 48 da micropipeta 12 provoca também um desmembramento das células, pelo que, em regra, somente uma única célula 60 se colocará na abertura 49 no fundo da micropipeta 12 no canal 40.

Na fig. 4 está identificada a pele exterior ou membrana da célula 60 com o código 62 e o interior da célula com o 64. A célula 60 encontra-se num fluido circundante 66 que, no exemplo mostrado, também pode preencher os canais de ligação 38 e os canais 40 e ser lá substituível. Ela apoia-se com o seu lado inferior 68 no fundo 49.

Logo que esta posição tenha sido atingida, produz-se no canal de ligação 38 um impulso de subpressão, como se encontra sugerido na fig. 4 por meio de uma seta 24 PE1218736 70. Este impulso da subpressão 70 é medido de forma a que o lado inferior 68 seja aberto e voltado para o canal 40 como se fosse uma gola 72. O interior da célula 64 encontra-se, então, ligada directamente com o canal 40 ou com o fluido nele contido. Alternativamente, poderá desistir-se do recurso ao impulso de subpressão e abrir o lado inferior da membrana, pela adição de substâncias porosas, tais como "NYSTATIN" ou Amphotericin B, para o surgimento de um acesso de baixa impedância para o interior da célula, não podendo todavia difundir quaisquer moléculas maiores.

Na fig. 4 encontra-se também desenhado o esquema eléctrico equivalente da célula 60. A resistência e a capacidade da membrana 62 encontra-se assinalada por Rm e Cm respectivamente. Rs é a resistência "Seal", concretamente a resistência de isolamento entre o interior da célula 64 e o meio extracelular 66 fora da célula 60. RP é a resistência entre o interior da célula 64 e o eléctrodo 50, enquanto que Rk é a resistência entre o eléctrodo 50 e o eléctrodo de referência 44.

Pelo facto de a gola 72 se colocar no canal 40 e aderir à parede 48, sem contudo atingir o eléctrodo 50 relativamente distante, Rs tem um valor muito alto "Gigaseal".

Sem corrente aplicada quer dizer que não flui 25 PE1218736 qualquer corrente pelo contacto 54 e através do canal de ligação 38, a tensão Uamp corresponde à tensão da membrana Um aplicada à membrana da célula. Por outro lado, através do canal de ligação, pode fluir uma corrente limitada, de acordo com a fórmula

U =———U amp D . n M Rk + Rp

Quer dizer a tensão da membrana Um é proporcional à tensão UamP.

No caso da iniciação de uma corrente de estimulação Ist no segundo contacto 54, é válida para a tensão da membrana Um no estado estacionária a fórmula:

UM RS-RM j

Rm +Rs para o caso de que seja Rk >>Rp + Rs Rm/ (Rs + Rm) . Esta condição é obtida no êmbito da presente invenção através de canais de ligação de comprimento suficiente com baixa secção do canal.

De acordo com o descrito anteriormente, a célula 60 é contactada no fundo da micropipeta tanto hidráulica como electricamente, sendo que, através da solução de electrólise, a subpressão necessária e, através da produção adicional de um impulso 70 da subpressão, o processo de abertura na célula 60 é activado. 26 PE1218736

Exemplo comparativo

Para ilustrar a diferença do procedimento e o nivel técnico correspondente à patente DE 197 12 309 Al encontra-se representada na fig. 5 uma imagem semelhante à da fig. 4, que corresponde à da disposição já conhecida. Os mesmos elementos estão munidos das mesmas referências, tendo sido acrecentado um "a".

Como se verifica claramente na fig. 5, neste nivel técnico a célula 60a encontra-se colocada directa-mente no eléctrodo 50a. A célula 60a é, por isso, alimentada electricamente do exterior, quer dizer, do lado externo da membrana 62a. A este nível técnico, o canal 40a serve exclusivamente para atrair e fixar a célula 60a ao fundo 48a, através da aplicação de uma baixa e determinad, subpressão, sendo que o fundo 48a, ao contrário do invento, é formado pelo eléctrodo 50a.

Mesmo quando a este nível técnico for aplicado à célula 60a um impulso de subpressão através do canal 40a e a membrana 62a for aberta (o que a este nível técnico não é o caso) formar-se-ia uma gola 72a na parte inferior 68a da célula 60a, que cobriria o eléctrodo 50a na zona do canal 40a. Apesar da abertura da célula 60a, o eléctrodo 50a impossibilitaria sempre a medição directa através do interior da célula 64a, mas continuaria sempre aplicado no lado exterior da membrana 62a. Por esse motivo, as medições por este dispositivo, no âmbito do actual nivel técnico, 27 ΡΕ1218736 mesmo abrindo o lado inferior 68a da célula não progrediriam doutra forma do que a descrita, pela qual a subpressão não conduziria a uma abertura da célula 60a.

Outro exemplo comparativo

Por fim a fig. 6 mostra-nos ainda um outro exemplo comparativo. O n° 80 na fig. 6 designa uma placa cuja forma é a tradicional. As placas 80 deste tipo são designadas como placas perfuradas 96. Elas são munidas de 96 orifícios 84 cilíndricos, dispostos verticalmente em reticulado. Estes orifícios 84 podem ser empregues como micropipetas. A placa 80 pode, como na fig. 6 em cima à direita, ser sugerida por meio de uma linha tracejada, também em camada múltipla, em especial, em camada dupla. É formado um fundo 82 dos orifícios cilíndricos ou micropipetas 84 através de um substrato 86 configurado como acetato, que se encontra colado, soldado ou fixo de qualquer forma em baixo à placa 80. O substrato 86 contém no centro do fundo 82, respectivamente, um canal 88 com a forma de buraco.

Inversamente ao exemplo da versão do presente invento, conf. fig. 2 a 4 sob o substrato 66 não há nenhum suporte com um sistema de canais de ligação. Em vez disso, está prevista uma unidade hidráulica e de medida 90, que 28 PE1218736 pode ser comandada individualmente, por baixo, ao lado inferior 91 do acetato 86. A unidade 90 abrange uma câmara 92, em forma de janela, que está munida na face frontal superior com uma junta de estanqueidade em forma de anel. Desse modo, a câmara 92 pode ser colocada bem em contacto com a face inferior 91, de tal forma que o eixo vertical da câmara 92 alinha com o eixo respectivo de um furo 88. A partir da câmara 92 existe uma conduta tubular 96 até uma unidade de subpressão, não representada no desenho. Desta forma, pode produzir-se um impulso de subpressão na câmara 92, conforme é indicado pela seta 98.

No fundo da câmara 92 encontra-se disposto um eléctrodo 100, que está ligado a um contacto externo 102.

Identificada com o n° 104 encontra-se indicada uma unidade de processamento de eixo múltiplo. Esta unidade permite que a unidade hidráulica e de medida 90 seja conduzida ao longo do lado inferior 91, designadamente da micropipeta 84 para a micropipeta 84, a fim de comprimir de forma estanque a unidade 90 ao lado inferior 91 pelo lado de baixo e em torno do respectivo furo 88. Através da alimentação da conduta tubular 96, por meio de um impulso de subpressão 98, pode ser realizada a mesma experiência, conforme foi esclarecido anteriormente pela fig. 4 no primeiro exemplo da invenção. 29 PE1218736 0 primeiro exemplo da invenção, de acordo com as fig. 2 a 4, tem a vantagem de uma placa compacta com todos os canais de ligação para comando das micropipetas 12 se encontrar à disposição, pelo que, sem necessidade de outros dispositivos de comando, unicamente através do comando de válvulas, contactos e outros componentes deste tipo, uma quantidade de medições pode ser realizada sequencialmente ou em serviço multiplex. 0 seguinte exemplo comparativo, de acordo com a fig. 6 tem, por outro lado, a vantagem de poder ser utilizada uma placa normal e os custos com uma camada inferior com uma multiplicidade de canais de ligação, vias condutoras e eléctrodos individuais podem ser reduzidos.

Exemplo 2

Nas fig. 7a) a 7c) encontra-se um outro exemplo do invento representado esquematicamente ao extremo, que será explicado seguidamente em detalhe.

Volta a estar previsto um substrato 110, que, por exemplo, é constituído por acetato de Polymid. No substrato 110 encontram-se configurados uma multiplicidade de canais, dos quais um, identificado com o n° 122, está representado. Na parte superior do substrato 110 enconta-se um fluido, no qual se encontram as células 112. Subadjacente ao canal 122 encontra-se figurada uma câmara 124, que comunica com o canal 122 e em cujo fundo, à semelhança da versão da fig. 30 ΡΕ1218736 6, está previsto um eléctrodo 126.

Inversamente às versões anteriormente descritas, esta câmara 124 não se encontra em comunicação só com um canal de ligação, mas sim com dois canais 130, 132. Estes canais 130 e 132 estão em comunicação com reservatórios de fluido Fi e F2 por meio de válvulas 118, 120. É evidente que a representação é puramente esquemática e que os canais 130, 132, por exemplo podem ser formados numa camada fotopolimerizada e que as válvulas são formadas nas extremidades exteriores dos canais.

Se , como representado na fig. 7a), a válvula 120 estiver fechada e a válvula 118 aberta, a aplicação de uma pressão Pi , que é menor do que a pressão Po, conduz ao canal 130 pelo fluido 114, para formação de um caudal na direcção da seta 133 através do canal 122 para o canal de alimentação 130. Isto provoca que a célula 112 seja aspirada e se deposite à superfície 128 do substrato 110 acima da abertura do canal 122 e que, devido à manutenção da subpressão se forme um "Megaseal", pelo que a configuração "Cell-Attached" é ajustada.

Se, entretanto, a válvula 120 for aberta, conforme a fig. 7b, sendo a relação Pi <P2 <Po mantida, a câmara 124 enche-se com meio intracelular do reservatório F2, enquanto que o canal de ligação 132 é ajustado ao canal 130. Neste caso, a pressão P2 deverá ser maior do que a 31 ΡΕ1218736 pressão Pi para que o caudal, a partir do canal de ligação 132, flua na direcção da seta 134 para o canal de ligação 130; além disso, ambas as pressões Pi e P2 terão de ser menores do que a pressão Po no meio extracelular 114 que envolve a célula 112.

Agora, na fase seguinte, conf. a fig. 7c), a válvula 118 é fechada e é aplicada uma subpressão intermitente no canal de ligação 132, pelo que P2 se torna menor do que Po (P2<<Po) . Dai que o lado inferior da membrana da célula 112, "remendo" da membrana, seja aspirado e rompido devido à acção do choque da subpressão, pelo que é ajustado um "Whole Cell-Patch-Clamp". O caudal, durante esta fase, flui na direcção da seta 135 através do canal 122 e do canal de ligação 132 para o reservatório F2. Neste caso, é atingido um estado em que a câmara 124 é cheia exclusivamente com meio intracelular 116. Seguidamente, pode-se trabalhar com um outro meio através da válvula 118, logo que se pretenda este processamento para a realização de medições. A vantagem desta disposição e deste procedimento baseia-se no facto de se poder trabalhar com o meio intracelular controlado com precisão, cuja composição pode ser influenciada ou que até possa ser utilizado um outro meio.

Esta versão de dois ou mais canais de ligação, que são comandados por meio de válvulas pode ser, por 32 ΡΕ1218736 princípio, combinada com a versão descrita anteriormente com base na fig. 1 a 4, assim como também com a versão da fig. 6.

Lisboa, 13 de Abril de 2007

Claims (24)

1. ΡΕ1218736 1 REIVINDICAÇÕES 1. Dispositivo de medição eléctrica de células (60, 112) em ambiente liquido (66), com um substrato (34, 86), que é atravessado por um canal (40; 88; 122) com um lado inferior (68) da sua membrana (62) que pode ser posicionado sobre uma superfície (48; 85; 128) do substrato (34; 86), e também com meios (56) para produção de uma queda de pressão (70) ao longo do canal e com um primeiro eléctrodo (44), assim como um segundo eléctrodo (50; 100; 126), que está distanciado do primeiro eléctrodo (44) em direcção do canal (40; 88; 122), caracterizado por o segundo eléctrodo (50) estar disposto na extremidade do canal (40) oposta à face inferior (68) da membrana de uma célula (60; 112) posicionada sobre a superfície (45; 85; 128) do substrato (34; 86), e que os mencionadoos eléctrodos (44; 50; 126) são apropriados para interrogação eléctrica da célula (60; 112), e que o canal (122) na sua extremidade oposta ao primeiro eléctrodo (44) está ligado com um certo número de canais (130; 132) através de válvulas (118; 120), através dos quais o liquido (Fl e F2) pode ser admitido ou evacuado.
2. 2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os meios (56, 58) destinados ao comando da queda de pressão (70) estarem previstos, tanto para a produção de uma queda estática de pressão (70) para ajustamento de uma configuração "Cell-Attached", como 2 ΡΕ1218736 também para aumento intermitente da queda de pressão (70) para o rompimento da face inferior (68) da membrana (62).
3. 3. Dispositivo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o segundo eléctrodo (50) envolver a extremidade do canal (40) oposto de maneira circular.
4. 4. Dispositivo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 3, caracterizado por uma multiplicidade de canais (40; 88; 122) estarem dispostos num substrato comum (34; 86; 110).
5. 5. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se encontrar disposta sobre o substrato (34; 86) uma micropipeta (12; 84) em cujo fundo (48; 82) está prevista uma abertura (49; 88) .
6. 6. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o canal (40; 88; 122) apresentar um vão (x) menor do que 10pm, de preferência menor do que 5pm.
7. 7. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado por uma multiplicidade de micropipetas (12; 84) se encontrar disposta numa placa (10; 80) 3 ΡΕ1218736
8. 8. Dispositivo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a placa (12; 80) ser constituída por uma multiplicidade de camadas.
9. 9. Dispositivo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a placa (10) abranger uma camada superior (36) uma camada intermédia e uma camada inferior 32, e que na camada superior (36) estão dispostas as micropipetas (12), e que a camada intermédia forma o substrato (34), nos quais os canais (40) estão ordenados, e que a camada inferior (32) contém canais de ligação (38), que vão dar aos canais (40).
10. 10. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o substrato (34; 86) estar ligado a uma camada inferior (32), que é constituída por uma ou mais camadas de materiais foto-estruturáveis, que apresentam canais de ligação (38), que vão dar aos canais (40; 88; 122).
11. 11. Dispositivo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a camada inferior (32) estar colocada sobre um suporte de vidro,
12. 12. Dispositivo de acordo com as reivindicações 9, 10 ou 11, caracterizado por os canais de ligação (38) apresentarem uma largura (b2) entre 10pm e 40 pm de preferência à volta de 20pm. 4 PE1218736
13. 13. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado por o segundo eléctrodo (50) estar disposto no lado inferior do substrato (34) ou no lado superior da camada inferior (32).
14. 14. Dispositivo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por os segundos eléctrodos (50) apresentarem uma superfície quadrada com um comprimento de arestas (a) entre 20 pm e 60pm, de preferência à volta de 40pm.
15. 15. Dispositivo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado por estarem dispostas vias condutoras (52) para os segundos eléctrodos (50)entre o substrato (34) e a camada inferior (32)
16. 16. Dispositivo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por as vias condutoras (52)apresentarem uma largura (bl) entre 5 pm e 30 pm, de preferência cerca de 10 pm.
17. 17. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 9 a 16, caracterizado por, pelo menos, a camada superior (36), a camada inferior (32) ou o substrato (34), independentemente uns dos outros, serem constituídos por matéria plástica. especialmente polimetilmeta-crilato(PMMA), Silicone, PTFE, POLYIMID, ou de um material inorgânico, em especial silício, cerâmica ou vidro. 5 ΡΕ1218736
18. 18. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 9 a 17, caracterizado por o substrato (34; 86) apresentar uma espessura de camada de 2 pm a 40 pm, de preferência à volta de 5 pm.
19. 19. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado por o substrato (34; 86) ser constituído por acetato no qual estão formados uma multiplicidade de canais (40; 88) como perfurações.
20. 20. Dispositivo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o substrato (86) estar disposto no lado inferior de uma placa (80), na qual está formada uma multiplicidade de orifícios como micropipetas (84), cujo fundo é formado pelo substrato (86), no qual os canais (88) são configurados como furos.
21. 21. Dispositivo de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado por o substrato (86) estar disposto no lado inferior de uma placa (36), na qual está formada uma multiplicidade de orifícios como micropipetas (12), em cujo fundo (48) estão previstos furos (49), com os quais estão centrados os canais (40) do substrato (34).
22. 22. Dispositivo de acordo com as reivindicações 4 a 8, caracterizado por estar prevista uma unidade hidráulica e de medida (90) que apresenta uma câmara aberta no sentido do lado inferior do substrato (86; 110), e que está posicionada de tal forma no lado inferior do substrato 6 ΡΕ1218736 (86: 110), que a câmara (92; 124) comunica com um canal escolhido (88; 122) que está vedado de forma estanque para o exterior, sendo que a câmara (92; 124) contém, pelo menos, um eléctrodo (100; 126), e que pode ser ligada, pelo menos, a um canal (96; 130, 132), que está ligado a uma fonte de subpressão.
23. 23. Dispositivo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por a câmara (124) estar ligada a uma multiplicidade de canais (130; 132) por meio de válvulas (118; 120).
24. 24. Dispositivo de acordo com as reivindicações 22 ou 23, caracterizado por estar prevista uma unidade de deslocamento (104) para movimentar ou posicionar a placa (80) e a unidade de hidráulica e de medida (90), uma em relação à outra. Lisboa, 13 de Abril de 2007