PT1140212E - Utilização do rádio -223 em tecidos alvo calcificados, para paliação da dor e terapia do cancro ósseo - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DO RÁDIO-223 EM TECIDOS ALVO CALCIFICADOS, PARA PALIAÇÃO DA DOR E TERAPIA DO CANCRO ÓSSEO" A presente invenção refere-se à utilização do radionuclideo alcalino-terroso rádio-223, "análogo do cálcio", para atingir tecidos calcificados, e. g., osso e uma solução fisiológica aceitável compreendendo 223Ra para tratar osso e superfícies ósseas doentes. A utilização biomédica de radionuclídeos para a paliação da dor e/ou tratamento de cancro, incluindo o tratamento profiláctico de superfícies ósseas para atrasar/inactivar metástases não detectáveis, foi anteriormente baseada em emissores β e emissores de electrões de conversão.

Uma percentagem substancial de doentes com cancro é afectada por metástases esqueléticas. Tanto quanto 85% dos doentes com carcinoma avançado do pulmão, próstata e da mama, desenvolvem metástases ósseas (Garret, 1993/ Nielsen et al., 1991) . Os tratamentos estabelecidos, tais como terapia hormonal, quimioterapia e radioterapia externa, causam, frequentemente, respostas temporárias, mas, no final, a maioria dos doentes com cancro ósseo sofre uma reincidência (Kanis, 1995). Existe, consequentemente, uma forte necessidade de novas terapias para aliviar a dor e atrasar a progressão dos tumores. Têm sido incluídos isótopos radioactivos direccionados para o osso, em ensaios clínicos do tratamento do cancro esquelético (De Klerk 1 et al., 1992, Fossâ et al., 1992, Lee et al., 1996, Silberstein, 1996). Estes radiofármacos foram baseados em emissores de partículas β (Atkins, 1998) e, ultimamente, também em emissores de electrões de conversão (Atkins et al., 1995). Entre estes compostos que foram, até ao momento, aprovados pela US Food and Drug Administration, Le., encontram-se o estrôncio 89 (Metastron™) e 153Sm EDTMP (Lexidronam™) . 0 composto de estrôncio 89 apenas pode ser administrado em quantidades suficientes para a paliação da dor, não para terapia tumoral, uma vez que se verifica uma mielotoxicidade significativa, antes de poderem ser alcançados níveis significativos de dose terapêutica anti-tumoral (Silberman, 1996).

Recentemente, um dos requerentes foi autor de uma publicação (Larsen et al., 1999) demonstrando, por dosimetria, que os emissores α podem ser mais vantajosos do que os emissores β, como agentes osteofílicos. I. e., o menor alcance dos emissores α provoca uma menor exposição da medula óssea quando a fonte se encontra localizada em superfícies ósseas. Neste estudo, foram comparados dois agentes osteofílicos de bisfosfonato emissores a, com dois compostos emissores β, com estruturas químicas e afinidade óssea semelhantes. Os cálculos de dosimetria indicaram que, em murganhos, as proporções de dose entre a superfície óssea e a medula óssea foram, aproximadamente, 3 vezes mais elevadas com o emissor a, em comparação com o emissor β. Isto indica que os agentes osteofílicos emissores α podem apresentar vantagens em relação aos compostos emissores β e/ou de electrões, uma vez que a dose de radiação pode ser mais fortemente concentrada nas superfícies ósseas. Devido à curta meia-vida (t^=7,2 h) e, uma vez que a sua produção se encontra limitada a apenas alguns sítios em todo o 2 mundo, a astatina-211 não se encontra, de momento, ainda disponível para comercialização em grande escala.

Para além da astatina-211, apenas poucos isótopos radioactivos emissores de partículas α são, de momento, considerados úteis para aplicações biomédicas (Feinendegen et al., 1997). o sistema chumbo-212/bismuto-212 foi, anteriormente, utilizado para a preparação de agentes osteofílicos. 0 bismuto-212 complexado com etileno-diamina-tetra(ácido metileno-fosfónico) (EDTMP) ou 1,4,7,10-tetraazaciclododecano 1,4,7,10-tetra(ácido metileno-fosfónico) (DOTMP), demonstraram uma significativa afinidade óssea. No entanto, devido à curta meia-vida do bismuto-212 (t^=60,6 min), a exposição do tecido normal durante a fase de incorporação do radiofármaco seria considerável (Hassfjell et al., 1994, 1997). Isto será ainda mais pronunciado com o outro isótopo de bismuto emissor a, considerado para utilização biomédica, o bismuto-213 (t%=46 min) . Foram realizadas tentativas para utilizar chumbo-212 emissor β (tis=10,6 h) , como um produtor in vivo de 212Bi. No entanto, foi observada uma translocação significativa, produzindo uma elevada acumulação renal do emissor α (Hassfjell et al., 1997). Outros isótopos radioactivos emissores a, potencialmente úteis para aplicações biomédicas, são os isótopos de rádio 224 e 226. Tal como com outros metais alcalino-terrosos do grupo 11, o rádio no seu estado catiónico é um agente osteofílico natural.

Os isótopos de rádio 224 e 226 foram, anteriormente, estudados, em parte devido à sua afinidade óssea (Loyd et al., 1982, 1991; Muggenburg et al., 1996, Muller, 1971; Raabe et al., 1993; Rundo, 1978) . O rádio-226 não é considerado útil para a terapia direccionada com radionuclídeos, devido à sua longa meia-vida (1600 anos) e ao seu gás nobre radao-222 descendente 3 (t^=3,8 dias). Devido à sua natureza química, o radão é inerte à ligação química sob condições in vivo. Este pode, consequentemente, ser facilmente translocado in vivo, quando produzido a partir do decaimento do nuclídeo mãe (Rundo, 1978) . 0 radão inalado dissolve-se, principalmente, nos fluidos e gordura corporais e é, principalmente, eliminado do organismo por exalação (Rundo, 1978). Numa experiência utilizando amostras ósseas, Lloyd e Bruenger (1991) referiram que 89,5-94,25% do radão-222 se tinha libertado do osso, após ter sido administrado rádio-226 a cães. Ao contrário do rádio-226, o rádio-224 tem uma meia-vida (0^=3,64 dias) que parece muito adequada para aplicações biomédicas. 0 224Ra foi utilizado medicamente durante muitos anos, para tratar espondilite anquilosante (Delikan, 1978). Infelizmente, também se libertou do osso uma fracção significativa de isótopos descendentes do rádio-224, provavelmente, principalmente, devido ao radão-220 descendente (¾ de 55,6 s) (Lloyd et al., 1982; Muller et al., 1971; Rundo, 1978). É, deste modo, conhecido a partir de estudos anteriores, que quando os isótopos de rádio 224Ra e 226Ra foram incorporados no osso, ocorreu uma translocalisação significativa dos seus descendentes radão, o que pode explicar, pelo menos em parte, o conhecido efeito carcinogénico destes dois isótopos de rádio. Isto pode constituir uma das razões para os emissores α não terem sido avaliados clinicamente como radiofármacos osteofílicos contra cancros esqueléticos. É um objectivo da presente invenção proporcionar um radionuclídeo osteofílico útil como um agente farmacêutico, mostrando que os produtos de decaimento radioactivo da sua transformação não se translocalizam, significativamente, após a 4 sua incorporação no osso (válido, pelo menos, 3 dias após a administração) .

Os presentes requerentes fizeram a verificação significativa e algo inesperada de que ocorreu muito pouca translocação do radão descendente (assim como de outros radionuclideos da cadeia de decaimento), a partir do 223Ra localizado no osso. Por esse motivo, a serie do Ra pode ser utilizada para irradiar a superfície óssea, sem qualquer translocação significativa de radionuclideos (incluindo difusão na medula óssea) . Para além disso, o rádio-223, deve ser mais adequado como um radiofármaco osteofilico, uma vez que a meia-vida (11,4 dias) é cerca de três vezes a do 224Ra, permitindo uma incorporação mais profunda na matriz das superfícies ósseas, antes da ocorrência de decaimento. De igual modo, possivelmente ainda mais importante, o radão descendente, radão-219, tem uma meia-vida curta (3,9 segundos), o que deve diminuir a translocação em radão ou como resultado desse passo. Três das quatro partículas a emitidas durante o decaimento do 223Ra e dos nuclideos descendente, são emitidos imediatamente após a transformação do 223Ra (Seelman-Eggebert et al., 1981), i. e., das três primeiras transformações após o 223Ra, o decaimento alfa de 3, 9 segundos do 219Rn é o que apresenta a meia-vida mais longa (Tabela 1). O último emissor α na cadeia do 223Ra, 211Bi (^=2,15 min), segue o decaimento do emissor β chumbo-211 (t^=36,l min) e, consequentemente, pode apresentar alguma translocação. No entanto, se o precursor, chumbo-211, for aprisionado no interior da matriz óssea, a último partícula α na série do 223Ra pode ser, igualmente, distribuída à área da superfície óssea. Para além disso, as partículas α constituem radiação de transferência de energia linear elevada (LET elevada) que é extremamente citotóxica para células de mamífero (Hall, 1994; Ritter et al., 5 1977) . Uma fonte de radiação emissora de partículas a, localizada no tecido alvo pode distribuir radiação a uma área alvo mais pequena, reduzindo, deste modo, a exposição do tecido normal, em comparação com os emissores β. A presente invenção refere-se à utilização do radionuclídeo alcalino-terroso rádio-223, "análogo do cálcio", para atingir tecidos calcificados, e. g., osso e uma solução fisiológica aceitável compreendendo 223Ra, de forma a tratar osso e superfícies ósseas doentes.

Neste pedido de patente os requerentes verificaram uma nova o o o utilização para o Ra, i. e., como radiofarmaco emissor a, para atingir tecidos calcificados, e. g., superfícies ósseas e lesões tumorais ósseas. Como indicado pelas propriedades do(s) radionuclídeo(s) assim como pelos exemplos experimentais, apresentados no presente pedido de patente, o rádio-223 pode ser adequado como um radiofármaco osteofílico. Como um exemplo, a invenção pode ser utilizada para o tratamento profiláctico do cancro, distribuindo uma dose dirigida para superfícies ósseas em doentes com uma elevada probabilidade de terem micrometástases não detectadas em superfícies ósseas. Outro exemplo da sua utilização potencial poderá consistir no tratamento de locais ósseos dolorosos, de uma forma semelhante aos radiofármacos emissores β e de electrões para a paliação da dor óssea, anteriormente descritos. 0 rádio-223, localizado nas superfícies ósseas e/ou em tumores calcificados, pode, em conjunto com os seus nuclídeos descendentes, distribuir uma dose intensa e altamente localizada de partículas α com uma dose da medula óssea inferior, em comparação com os radiofármacos emissores β e/ou emissores de 6 electrões, actualmente utilizados. Podem ser tratadas doenças esqueléticas, e. g., cancro primário ou metastático do osso com o radiofármaco 223Ra. A presente invenção inclui a utilização do nuclideo como uma espécie catiónica e/ou associada a um quelante ou a outra forma de uma molécula transportadora, com afinidade para tecidos calcificados. Isto inclui, igualmente, mas não se encontra limitado à combinação do rádio-223 com um quelante que pode ser, subsequentemente, conjugado com uma molécula com afinidade para tecidos calcificados. A intenção consiste em utilizar o isótopo radioactivo para produzir uma cascata de partículas α em superfícies ósseas e/ou em tumores calcificados, para paliação da dor causada por várias doenças e/ou para a utilização profiláctica contra possíveis doenças mínimas do esqueleto, e/ou, igualmente, para o tratamento terapêutico do cancro estabelecido no osso. As doenças, em que podem ser utilizados isótopos radioactivos incluem, mas não são limitadas a metástases esqueléticas de cancro da próstata, mama, rim e pulmão, assim como, cancro ósseo primário e, igualmente, mieloma múltiplo. São preparadas soluções de rádio-223 para utilização para atingir tecidos calcificados ou para irradiação da superfície óssea. Os exemplos seguintes mostram uma incorporação elevada e selectiva do 223Ra no osso, com muito pouca relocalização dos nuclídeos descendentes. Isto mostra que as superfícies ósseas podem ser esterilizadas, de forma a inactivar depósitos microscópicos de células cancerosas e que as lesões cancerosas calcificadas podem, igualmente, ser irradiadas, quer para paliação, quer para terapia com este isótopo. 0 composto diferencia-se de outros radiofármacos com afinidade óssea, 7 normalmente utilizados, por o componente da dose principal se encontrar sob a forma de partículas a que têm um alcance muito mais curto, em comparação com os emissores beta e de electrões frequentemente utilizados. Consequentemente, a dose distribuída à medula óssea vermelha pode ser siqnificativamente reduzida com este novo composto, i. e., a mielotoxicidade será, provavelmente, reduzida. 0 rádio-223 diferencia-se do radionuclídeo médico rádio-224, anteriormente utilizado, pelo seguinte: (1) o 223Ra tem uma meia-vida significativamente mais longa, permitindo melhores proporções entre o osso e os tecidos moles, devido a uma fracção significativamente maior deste isótopo ser eliminada dos tecidos moles, antes da ocorrência do decaimento. (2) Uma meia-vida mais longa permite, igualmente, uma incorporação mais profunda do radionuclídeo nas superfícies ósseas, à medida que a síntese óssea progride, melhorando, potencialmente, a retenção dos isótopos descendentes, os quais, de outro modo, se podem translocar, devido à difusão química e ao recuo nuclear. (3) Do mesmo modo, a meia-vida mais curta do 219Rn a partir do 223Ra em comparação com o 220Rn a partir do 224Ra, assegura uma menor translocação de nuclideos descendentes da i o o g serie Ra. 0 sal de 223Ra, ou um seu derivado, serão administrados a um mamífero, tal como um humano, que deste necessite, através de todas as vias de administração disponíveis, tais como oral, subcutânea, intravenosa, intra-arterial ou transcutânea. De um modo preferido, o composto activo é administrado por injecção ou infusão. A administração oral é realizada pela utilização de comprimidos, cápsulas, pós ou na forma liquida, tal como suspensão, solução, xarope ou emulsão. Quando sob a forma de 8 comprimidos, são utilizados excipientes, agentes lubrificantes e agentes de ligação convencionais. Quando administrado sob a forma liquida, são utilizados veiculos liquidos convencionais. Quando administrado sob a forma de soluções para injecção ou infusão, o veiculo é, de um modo preferido, soro fisiológico isotónico, com ou sem agente(s) para estabilizar o catião rádio, para impedir a precipitação de sais de rádio ou de complexos insolúveis. 0 principio activo, de acordo com a invenção, pode ser utilizado tanto no tratamento profiláctico, paliativo como no terapêutico, de doenças não malignas e malignas, afectando ossos e tecidos moles. As doenças malignas são seleccionadas do grupo consistindo em cancro da próstata, cancro da mama, cancro do rim e urinário, cancro ósseo primário, cancro do pulmão e mieloma múltiplo e a doença não maligna é seleccionada do grupo consistindo em doenças autoimunitárias que afectam articulações e o esqueleto, e. g. artrite reumatóide, escleroderma e espondiloartropatias. A preparação fisiologicamente aceitável para administração in vivo, de acordo com a presente invenção, compreende o sal de rádio-223 dissolvido, com ou sem um único catião ou uma combinação de vários, como um veiculo análogo de um catião de um metal alcalino-terroso estabilizante, com ou sem um agente para impedir a precipitação e/ou a produção de colóides, para além de veiculos e adjuvantes farmacologicamente aceitáveis. 0 catião que actua como catião de metal alcalino-terroso estabilizante, pode ser seleccionado do grupo consistindo em magnésio, cálcio e estrôncio. Para além disso, o agente para impedir precipitação e/ou produção de colóides é um ácido carboxilico ou uma combinação de ácidos carboxilicos, tais como ácido oxálico, 9 ácido oxaloacético, ácido tartárico, ácido succínico, ácido málico e ácido malónico. As concentrações dos compostos na preparação serão, de um modo geral, inferiores à dose LD 50 individual, por exemplo, inferior a 20% da dose LD 50 e, deste modo, irão variar para os diferentes componentes. A actividade do 223Ra irá ser dependente do tipo e via de administração e da patologia ou doença subjacentes e irá variar entre, aproximadamente, 50 kBq e, aproximadamente, 10 MBq, administrados em doses únicas ou múltiplas, para mamíferos, tais como, por exemplo, humanos.

De acordo com a invenção, o rádio-223 é, adicionalmente, utilizado para produzir uma preparação farmaceuticamente activa para tratar doenças não malignas e malignas que afectam ossos, superfícies ósseas e tecidos moles, tanto paliativa como terapeuticamente. A preparação é administrada ao mamífero, tal como humanos ou animais, i. e. cães, que desta necessitem, numa quantidade paliativa ou terapeuticamente eficaz.

De acordo com a invenção, o rádio-223 pode ser utilizado numa terapia de combinação, em que a preparação de Ra e combinada com as seguintes classes de tratamento; quimioterapia incluindo bisfosfonatos, cirurgia, irradiação com feixe externo, radiofármacos osteofílicos emissores de radiação LET baixa e tratamento hormonal. A presente invenção é descrita, detalhadamente, no seguinte, através de exemplos, os quais, de modo algum se destinam a limitar o âmbito da invenção, como descrito pelas reivindicações em anexo. 10 A Tabela 1 apresenta as propriedades físicas do rádio-223 e dos seus nuclídeos descendentes (Ekstrõm et al., 1989). 0 decaimento do 223Ra e dos seus descendentes origina a emissão de quatro partículas a. Essa cascata de partículas α pode distribuir uma grande dose de radiação a um volume limitado. Consequentemente, o rádio-223, possui citotoxicidade extrema, mesmo em comparação com a maioria dos emissores α (Howell et al., 1997). 0 seguinte mostra a série de decaimento do Rádio-223 e seus descendentes (meia-vida e modo do decaimento entre parênteses): 223Ra (11,4 d., a) => 219Rn (3,9 s., a) => 215Po (1,8 ms, a) => 211Pb (36,1 min, β“) => 211Bi (2,15 min, a) => 207T1 (4,8 min, β~) => 207Pb (estável)

Tabela 1 Emissão a partir de 223Ra e descendentes*.

Nuclídeo ^*Rn /lbPo 211 Pb ^"Bi 2 U / τ ^ Energia α 5,64 MeV 6,75 MeV 7,39 MeV 6,55 MeV Energia β (máx) 0,47 MeV 0,47 MeV Fracção de Energia.# 0,207 0,248 0,271 < 0,017 0,24 < 0,017 *Dados de Seelmann-Eggebert et al., 1981 e Ekstrom et al., 1989 #Relativo à energia total emitida a partir da cadeia de decaimento completa.

A energia combinada da radiação emitida associada com o decaimento completo do 223Ra e descendentes: ~27,5 MeV 11 > 96%

Fracção de energia emitida sob a forma de partículas a:

Fracção de energia emitida sob a forma de partículas β: ^3% É, igualmente, emitida alguma radiação de gama (<0,3 MeV no total), durante o decaimento e pode ser utilizada para determinar a qualidade e a quantidade dos isótopos em amostras, utilizando espectroscopia gama. E. g. o rádio-223 tem um pico gama característico a 154,19 keV (abundância de 5,59%), o radão-219 tem um pico a 401,78 keV (6,6%) e o bismuto-211 tem um pico com 351,0 keV (12,8%) (Ekstrom et al., 1989). Estes podem ser utilizados para determinar se ocorre redistribuição in vivo para isótopos descendentes. O 223Ra tem, igualmente, um pico com 269,41 keV com uma abundância de 13,6%, mas isto pode ser difícil de distinguir a partir de um pico com 271,23 keV, com uma abundância de 219Rn de 9,9%.

Foram descritos métodos de produção para o Rádio-223 (Atcher et al., 1989; Howell et al., 1997). O 223Ra é um membro de uma família radioactiva natural que tem origem no U {tu=l x 108 a.), através do 231Th (^=25, 6 a.) e na sequência 231Th -> 231Pa (t^=3,3 x 104 a) -> 227Ac (t^=21,7 a.) -> 227Th (t^= 18,7 d.) -> 223Ra (11,4 d.). Atcher et al. (1989) utilizaram um sistema de permuta catiónica (Bio-rad AG 50) para produzir Ra a partir de Ac. Howell et al. (1997) utilizaram a reacção nuclear 226Ra (n, Y) 227Ra, para produzir 223Ra. O 227Ra (^=42 min) é rapidamente transformado em 227Ac (^=21,77 anos), o qual pode ser separado através de diferentes métodos, a partir do material alvo 226Ra. Howell et al. (1997) separaram quimicamente o Ac, a partir de uma solução alvo. Após esse processo, o Ac, em conjunto com 12 seus produtos descendentes, foi transferido para uma coluna de permuta aniónica que reteve o 227Th, enquanto que a mãe e a descendência deste nuclideo foram eluidas. Ao fim de dez dias, o 223Ra pode ser eluido a partir da coluna de permuta iónica. Se fosse pretendido que os lotes clinicos fossem preparados por utilização do principio gerador, a aplicação de colunas de permuta iónica baseadas numa estrutura base orgânica pode ser sub-óptima, uma vez que a radiólise pode impedir a utilização múltipla a longo prazo de um gerador de rádio baseado neste tipo de materiais (Atcher et ai., 1989).

Foram desenvolvidos, recentemente, novos materiais, e encontram-se, presentemente, comercialmente disponíveis, que são úteis para a separação de radionuclideos actinídeos (selectividade para elementos f versus elementos alcalino-terrosos) . Estes são baseados em partículas de sílica covalentemente ligadas a ou impregnadas com grupos activos. As colunas podem ser preparadas utilizando este material, permitindo a eluição dalguns elementos sob condições que podem reter outros elementos. Será, igualmente, possível utilizar os grupos activos para a separação em sistemas de extracção húmido/húmido, utilizando um orgânico e uma fase aquosa.

EXEMPLOS

No Exemplo 1, seguinte, foi produzido 223Ra. A produção de 223Ra para utilizações biomédicas compreende, tanto colunas com matrizes inorgânicas como sistemas líquido/líquido. Uma coluna geradora contendo um derivado do ácido metano bis-fosfónico numa matriz inorgânica ou o método, podem, igualmente, compreender um passo de um processo de extracção líquido/líquido no qual são 13 utilizados um ou vários derivados do ácido metileno bis-fosfónico P, P' di-esterifiçado como agentes de transferência de fase.

No método, a coluna geradora contendo ácido P, P' di-octil metano bis-fosfónico numa matriz de silica e o processo de extracção líquido/líquido é realizado utilizando ácido P,P' di-octil metileno bis-fosfónico ou ácido P,P' di(2-etil-hexil) metano bis-fosfónico ou suas combinações como agentes de transferência de fase. 0 processo, no que respeita à coluna geradora é realizado utilizando ácidos minerais, os quais, após a neutralização, são capazes de proporcionar soluções fisiologicamente compatíveis dos seus sais, de um modo preferido, ácido nítrico ou ácido clorídrico. A concentração dos referidos ácidos minerais situa-se na gama de 0,01 a 8 M, de um modo mais preferido, entre 0,1 e 2 M, de um modo muito preferido, entre 0,5 e 1 Μ. O passo de extracção líquido/líquido é realizado utilizando uma fase aquosa consistindo em ácido mineral, de um modo preferido, ácido nítrico ou ácido clorídrico, cuja concentração se situa na gama de 0,01 a 8 M, de um modo mais preferido, entre 0,1 e 2 M, de um modo muito preferido, entre 0,8 e 1,5 M. EXEMPLO 1

Foram isolados 227Ac e 227Th a partir de uma fonte de 231Pa, preparada 27 anos antes (A amostra foi fornecida pelo Grupo de Radioquímica, Departamento de Química, Universidade de Oslo, Noruega), pela utilização de uma resina cromatográfica para extracção selectiva de elementos f. Os 227Ac e 227Th purificados, foram posteriormente adsorvidos por outra resina cromatográfica 14 para extracção selectiva de elementos f e utilizados como fonte de 223Ra. Este último material foi utilizado por Wu et al. (1997) para a construção de um gerador de 213Bi, baseado no 225Ac. Métodos: uma amostra da fonte de 213Pa (com descendentes), foi diluida 10 vezes, com HC1 1 M, numa solução aquosa de H2S04 5 M e HF 1 Μ. A solução foi aplicada numa coluna com 3 mm de diâmetro interno e 70 mm de comprimento contendo TRU-resin (EiChroM Industries, Darien, IL, EUA), a qual tinha sido pré-equilibrada com HC1 1 Μ. O 231Pa foi retido na coluna, enquanto que 227Ac, 227Th e 223Ra foram eluidos, parcialmente, pelo processo de aplicação e, parcialmente, por lavagem da coluna com 10 mL adicionais de HC1 1 M. Após este processo, foi preparado um gerador de 223Ra, utilizando uma modificação da técnica de empacotamento de coluna descrita por Wu et al. (1997). Foi preparada uma coluna de 3 x 50 mm de Resina de Silica Actinideo (EiChroM, Darien, IL, EUA) consistindo em ácido P, P' di-octil metano bis-fosfónico (DIPEX, EiChroM Industries, Darien, IL, EUA) sobre partículas de sílica, com um diâmetro na gama de 20-50 pm e pré-condicionada com HC1 1 M. Cerca de metade da resina foi, seguidamente, removida da coluna e misturada com o eluído da coluna de TRU-resina. O eluído contendo 227Ac, 227Th e 213Ra foi, seguidamente, aplicado numa coluna com 3 mm d.i. e 50 mm de comprimento, contendo Actinídeos-resina (Ac-resina) sobre sílica com 30-50 pm (EiChroM Industries, Darien IL, EUA). Resumidamente, a coluna foi preparada de acordo com o método de Wu et al. (1997) . Após o pré-condicionamento da coluna com HC1 1 M, foi removida metade do material e misturada com o eluído do passo anterior. 15

Após 4 horas de agitação suave à temperatura ambiente, a pasta contendo os radionuclideos foi aplicada na coluna. Finalmente, a coluna foi lavada com 5 mL de HC1 1 Μ. A coluna reteve 227Ac e 227Th enquanto que o 223Ra pôde ser eluido com alguns mL de HC1 ou de HNO3, sem qualquer avanço significativo dos seus radionuclideos parentais e avós. Se pretendido, pode ser adicionado um passo de purificação subsequente eluindo, simplesmente, o eluido de 223Ra através de uma segunda coluna de AC-resina, para remover quaisquer vestígios de nuclideos parentais e avós. A solução de HC1 contendo 223Ra pode ser diluída num tampão, esterilizada por filtração e utilizada como tal. Alternativamente, o 223Ra purificado pode ser concentrado antes da utilização, aplicando a solução de HC1 numa coluna com 2 mm d.i. e de 25 mm de comprimento, contendo uma resina, e. g., AG 50W-X4-16 (Bio-Rad, Richmond, CA, EUA). Seguidamente, o 223Ra pode ser eluido, quase quantitativamente, através de um pequeno volume de HNO3 6 Μ. 0 HNO3 pode ser, seguidamente, evaporado e o resíduo pode ser resolvido numa solução que pode ser, susequentemente, esterilizada por filtração.

As medições quantitativas e qualitativas da radioactividade foram realizadas, quer utilizando o equipamento Ge-detector (Canberra, Meriden, CT, EUA) combinado com um amplificador e uma fonte de polarização EG&G Ortec (Oak Ridge, TN, EUA) para a espectroscopia gama e/ou um equipamento Canberra (modelo 7404-0 1 A) combinado com um equipamento EG&G Ortec para espectroscopia alf a.

Resultados: na coluna de TRU-resin, o 231Pa foi retido quantitativamente, í. e., o avanço foi inferior ao limite de 16 detecção de 0,5%, em comparação com a actividade descendente. Acima dos 90% do 227Ac e 223Th foram reunidos no eluido a partir da TRU-resin. Para a AC-resina, várias experiências indicaram rendimentos tipicos de 60-85 kBq de 223Ra por 100 kBq de 227Th na coluna (também denominado fonte ou gerador) nos mL iniciais da solução separada. O avanço do Ac e do Th foi determinado como sendo inferior a (limitado pela capacidade de detecção) 4 x 10 %, em comparação com o Ra. Deve ser salientado que os métodos de separação descritos podem ser, igualmente, utilizados com o 227Ac produzido a partir do 226Ra através de 226Ra (η. γ) 227Ra -> 227Ac .

Conclusão: É descrito um conjunto de métodos para a produção de 223Ra, assegurando um rendimento elevado e uma pureza elevada, útil para aplicações biológicas. A sua caracteristica distintiva consiste na maior facilidade de produção em rotina de niveis de actividade clinicamente relevantes de 223Ra a partir de Ac. Isto e realizado utilizando uma coluna geradora baseada numa matriz de silica (Wu et al., 1997) como comparado com processos anteriormente apresentados envolvendo mais resinas de permuta iónica sensíveis radiolíticas, contendo matrizes orgânicas (Atcher et al., 1989). EXEMPLO 2

Foi estudada a biodistribuição do rádio-223, preparado como descrito no Exemplo 1. Métodos: Os murganhos Balb/C macho jovens, com um peso corporal de 19-21 g foram injectados com 9 kBq de 223Ra em 150 pL de soro fisiológico isotónico. Foram sacrificados e dissecados 17 grupos de cinco animais às 6 h e aos 3 dias após a injecção. Foi medido o peso da amostra e as amostras foram contadas utilizando (A) um cristal de cintilação "tipo poço" de Nal (Harshaw Chemie BV, De Meern, Holanda) combinado com um Scaler Timer ST7 (NE Technology Ltd, Reading, UK) de unidades digitais, (B) um

Beckman LS 6500 (Beckman Instruments Inc. Fullerton, CA, EUA). As abundâncias relativas dos radionuclideos foram estudadas no sangue, figado, rim e em amostras padrão com mãe/descendente em equilibrio, utilizando um Ge-detector (Canberra, Meriden, CT, EUA) combinado com um amplificador e uma fonte de polarização EG&G Ortec (Oak Ridge, TN, EUA).

Resultados: Os dados da biodistribuição são apresentados na Tabela 2. Os dados mostram que o 223Ra foi selectivamente concentrado no osso, em comparação com os tecidos moles. Enquanto que todos os valores dos tecido moles se reduziram entre as 6 h e os 3 dias após a injecção, os valores ósseos aumentaram com o tempo. As proporções entre o fémur e o sangue aumentaram de 129 para 691, das 6 h para os 3 dias. O baço apresentava a retenção mais elevada, medida entre os tecidos moles, mas a proporção entre o fémur e o baço aumentou, igualmente, com o tempo, de 6,4 para 23,7, entre as 6 h e os 3 dias após a injecção. 18

Tabela 2 Biodistribuição do rádio-223 em murganhos Balb/C, apresentada como a % de dose injectada por grama

Tecido 6 horas 3 dia s fémur 25 ,86 ± 1 , 99 34 , 55 ± 7 ,87 sangue 0, 20 ± 0, 23 0, 05 ± 0, 10 rim 4, 04 ± 0, 33 0, 38 ± 0, 08 fígado 0, 89 + 0, 18 o, 22 + 0, 32 pulmão 0, 59 ± 0, 56 o, 06 ± 0, 07 músculo 0, 72 ± 0, 39 0, 30 ± 0, 16 coração 0, 10 ± 0, 10 0, 06 ± 0, 07 cérebro 0, 04 ± 0, 01 0, 12 ± 0, 12 baço 4, 06 ± 1, 4 1, 46 ± 0, 54 intestino delgado 0, 79 ± 0, 26 0, 04 ± 0, 03 intestino grosso 2, 30 ± 0, 60 0, 13 ± 0, 02

Com base em dados de espectroscopia gama, não foi possível observar no osso e na maioria dos tecidos moles, qualquer diferença significativa na distribuição relativa do rádio-223 e dos seus descendentes, como determinado pela abundância de 211Bi. A proporção 211Bi: 223Ra no baço, no momento das 6 horas, situava-se, em média, em 54% em comparação com uma solução padrão. Por outro lado, no fígado e nos rins, as proporções Bi: Ra nas amostras situavam-se, em média, respectivamente, em 256 e 207% dos padrões. Isto indica que ocorreu alguma translocação nos tecidos moles. A actividade do 211Bi nos tecidos moles foi, igualmente, de um modo geral, muito baixa em comparação com a actividade óssea deste nuclídeo. O 211Bi nos tecidos moles pode ter sido produzido a partir do 223Ra presente nos tecidos moles. 19

Conclusão: foram obtidas excelentes proporções entre a o o o radioactividade do osso e do tecido normal, com Ra e descendentes, indicando um potencial significativo para atingir tecidos calcificados com esta série de radionuclideos.

Exemplo 3

Para examinar se houve alguma diferença, em termos de retenção de isótopos radioactivos em amostras óssea, entre o rádio-223 e o bismuto 211, foram estudados dados espectroscópicos gama para o osso versus uma solução padrão com 990

Ra e radionuclideos descendentes em equilíbrio.

Métodos: Foi realizada espectroscopia gama com um detector de germânio (Canberra, Meriden, CT, EUA) em amostras do fémur de murganhos, imediatamente após sacrificar e dissecar os animais. Foram estudadas amostras de uma solução padrão de 223Ra e radionuclideos descendentes em equilíbrio. Foram utilizados picos gama distintos a 351,0 keV (211Bi) e 154,2 keV ( 223Ra) . O índice de Localização (LI) foi determinado como se segue: LI = (Bbí/Sbí) / (BRa/SRa) E. g., BBí - taxa de contagem do 211Bi no osso; SRa - taxa de contagem do 223Ra no padrão

Foram comparados os espectros gama de cinco amostras, respectivamente, do grupo das 6 h e do grupo dos 3 dias, com, respectivamente, cinco e três amostras da solução padrão, utilizando teste t de Student para os conjuntos de dados. 20

Resultados: os valores do LI situaram-se, em média, em 0,85 (P = 0,059) no momento das 6 h e 0,97 (P = 0,749) no momento dos 3 dias. No entanto, as diferenças não foram significativas no que respeita ao nivel P = 0,05 para o conjuntos de dados.

Conclusão: Mesmo para o radionuclídeo representando a quarta transformação na série do 223Ra, a transformação em 211Pb, p p q a retenção no osso foi semelhante a do Ra. EXEMPLO 4

Para estudar a libertação potencial de isótopos descendentes apos a incorporação do Ra no osso, devido ao recuo nuclear ou devido a processos de difusão, foram examinados os fémures de cinco animais mortos 6 h e de 5 animais mortos 3 dias após a injecção. Métodos: Os ossos foram divididos longitudinalmente, de forma a expor as áreas de medula vermelha (esponjosa) e, seguidamente, foram cortados em pequenos fragmentos inferiores a 3 mg. Seguidamente, as amostras foram lavadas com PBS Dulbeccos (Sigma-Aldrich CO. LTD., Irvine, UK) utilizando centrifugação. O sobrenadante foi removido, misturado com o liquido de cintilação (Insta-Gel 11 plus, Packard BioScience BV, Groningem, Holanda) e contado num contador de cintilação (Beckman Instruments Inc. Fullerton, CA, EUA) . A contagem das amostras foi repetida após um dia. A diferença nas contagens após correcção para o decaimento do 223Ra, entre as duas medições foi utilizada como indicação da libertação de nuclídeo(s) descendente (s) a partir da matriz óssea. 21

Resultados: Os animais mortos após 6 horas apresentavam alguma libertação de actividade a partir do osso. Em comparação com a actividade total no osso, foi dissolvida uma média de 1,8% em PBS, durante a lavagem. Quando as soluções de lavagem foram novamente contadas, após 12 h, a actividade era, então, apenas, em média, 0,2% da amostra óssea. Isto indica que ocorreu alguma translocação de isótopos descendentes, mas a um grau muito pequeno (provavelmente, inferior a 2% dos isótopos descendentes) . Os animais mortos após 3 dias não apresentavam quaisquer contagens significativas, em comparação com o fundo na solução de lavagem, após a lavagem. Isto indica que, se ocorreu translocação, esta foi inferior ao limite de detecção, o qual foi estimado como sendo inferior a 1% da radioactividade óssea total.

Conclusões: Com base na fracção radioactiva extraivel a partir de amostras óssea finamente fragmentadas, é indicado que a libertação de nuclideos descendentes (translocação) a partir da matriz óssea é baixa, para a série do rádio-223. EXEMPLO 5

Foram desenvolvidos modelos animais com padrões de metástases experimentais parecidos com os frequentemente observados em doentes humanos (Engebraaten e Fodstad, 1999). Um destes modelos consiste em células MT-1 injectadas intracardiacamente em ratos nus e é caracterizado pelo desenvolvimento consistente da paralisia da perna traseira dos animais. O tratamento (sete dias após a inoculação das células tumorais) com os agentes quimioterapêuticos cisplatina ou 22 doxorubicina não melhorou a sobrevivência. A dissecção e o exame microscópico da coluna vertebral de animais afectados por tumores revelaram grandes massas de células tumorais, substituindo a medula óssea normal e destruindo a parte óssea da coluna vertebral. 0 envolvimento esquelético no modelo desenvolvido acima tornou-o adequado para demonstrar o potencial terapêutico do 223

Ra, de acordo com a invenção, contra metástases esqueleticas. Método: Foi estudado o potencial terapêutico do rádio-223 no modelo rato MT-l/nú, em que os animais foram inoculados com 1 x 106 células cancerosas MT-1 de mama humana por injecção no ventrículo esquerdo do coração, como descrito (Engebraaten e Fodstad. 1999). Estes animais desenvolvem, normalmente, paralisia causada pelo crescimento de tumores na coluna vertebral. Foram, então, tratados grupos de 4 e de 5 animais, ao fim de sete dias, recebendo uma injecção intravenosa de 200 pL de uma solução de veiculo com ou sem 10 kBq de rádio-223, de acordo com a invenção.

Resultados: o grupo de quatro animais tratado apenas com a solução de veiculo, sofreu uma paralisia provocada pelo crescimento tumoral na coluna vertebral e foi sacrificado entre 20-25 dias (média 22,25 dias) após a inoculação das células tumorais. No grupo de cinco animais que recebeu a solução de veiculo contendo 223Ra, um animal apresentava paralisia após 26 dias, um após 40 dias e um após 64 dias, enquanto que os dois animais restantes sobreviveram ao longo do período de acompanhamento experimental de 90 dias, após a inoculação das células tumorais, sem apresentarem sinais de paralisia. 23

Conclusão: 0 223Ra demonstrou um efeito anti-tumoral significativo em animais com metástases esqueléticas.

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Lisboa, 18 de Setembro de 2006 27

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de rádio-223 para produzir uma preparação farmaceuticamente activa para tratar ossos e superfícies ósseas doentes.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a preparação é utilizada numa terapia de combinação com um outro componente terapeuticamente activo.
3. 3. Utilização como reivindicada na reivindicação 2, em que o outro referido componente terapeuticamente activo é quimioterapia, cirurgia, irradiação com feixes externos, terapia com fármacos osteofílicos emissores de radiação LET baixa ou tratamento hormonal.
4. 4. Utilização como reivindicada na reivindicação 3, em que a referida quimioterapia é a terapia com bisfosfonato.
5. 5. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, em que a preparação que contém um sal de rádio-223 osteofilico dissolvido, é utilizada para terapia relacionada com doenças não malignas ou malignas afectando os ossos e, opcionalmente, também tecidos moles.
6. 6. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, em que a preparação que contém um sal de rádio-223 osteofilico dissolvido, é utilizada para paliação relacionada com doenças não malignas ou malignas afectando os ossos e, opcionalmente, também tecidos moles. 1
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 5 ou a reivindicação 6, em que as doenças malignas são seleccionadas do grupo consistindo em cancro da próstata, cancro da mama, cancro do rim e urinário, cancro ósseo primário, cancro do pulmão e mieloma múltiplo.
8. 8. Utilização como reivindicada em qualquer das reivindicações 1 a 4 para o tratamento do cancro primário ou metastático do osso.
9. 9. Utilização como reivindicada na reivindicação 8, em que o referido cancro metastático são metástases esqueléticas de cancro da próstata, mama, rim ou do pulmão. Lisboa, 18 de Setembro de 2006 2