PT1019430E - ''processo para o isolamento de um ácido nucleico'' - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA O ISOLAMENTO DE UM ÁCIDO NUCLEICO" A invenção refere-se a um processo para a preparação de amostras biológicas para a subsequente detecção de um analito, em especial um ácido nucleico, nesta amostra. Além disso são disponibilizados kits de reagentes.
Num processo para a detecção de um analito numa amostra biológica são frequentemente estabelecidos requisitos especiais na preparação da amostra. Por um lado, o analito encontra-se frequentemente numa concentração muito pequena e por outro, encontram-se frequentemente na amostra muitas outras substâncias que podem restringir o isolamento ou a determinação do analito. 0 documento WO 36/41811 publica um processo para o isolamento de um analito, em especial de um ácido nucleico, a partir de uma amostra biológica, em que a amostra que contém o analito num liquido é colocada em contacto com partículas magnéticas que apresentam uma superfície exterior de vidro essencialmente livre de poros ou os poros apresentam um diâmetro < 10 nm, sob condições nas quais o analito é ligado à superfície das partículas, e o analito ligado é separado do líquido da amostra. As partículas magnéticas são aqui utilizadas na forma sólida e não na forma de uma suspensão. A superfície do vidro é constituída de um vidro de borossilicato. O processo descrito no documento WO 96/46811 adequa-se muito bem para a purificação de um analito a partir de uma amostra biológica. Não é porém 1 utilizável sem outros processos para uma preparação automatizada de amostra.
Boom et ai. (J. Clin. Microbiol. 28 (1990), 495-503) descrevem igualmente um protocolo para a purificação de ácidos nucleico a partir de uma amostra biológica utilizando partículas de óxido de silicio fraccionadas em função do tamanho. Este processo é porém complicado, não é adequado para uma automatização e contém, além disso, o perigo de arrastamentos.
Num método descrito no documento EP-A-0757106 para a extracção de ácidos nucleicos é efectuada a lise de uma amostra, os ácidos nucleicos existentes são ligados a partículas metálicas supermagnéticas, estas são removidas do recipiente da amostra com uma pipeta e assim separadas dos restantes componentes da amostra. Este processo tem a desvantagem de poderem ocorrer perdas devido à necessidade de remover o analito da amostra com uma pipeta. Além disso, a utilização de vários recipientes reaccionais apresenta o perigo de arrastamentos e contaminações. O objectivo na base da presente invenção consistiu assim em disponibilizar um novo processo de preparação de amostra no qual as desvantagens do estado da técnica são, pelo menos, parcialmente eliminadas. Em especial, o novo processo deve ser automatizável e apresentar, tanto quanto possível, um perfil de temperatura simples.
Este objectivo é resolvido através do processo para o isolamento de um analito a partir de uma amostra biológica, compreendendo os passos: 2 (a) Lise da amostra num recipiente reaccional, (b) Adição de partículas de vidro magnéticas na forma de uma suspensão alcoólica, (c) Incubação sob condições nas quais o analito se liga às partículas de vidro, (d) Remoção dos componentes da amostra que não se ligam ao recipiente reaccional, (e) Incubação sob condições nas quais o analito é eluído das partículas de vidro, e (f) Separação do eluato das partículas de vidro, em que muitos ou todos os passos são efectuados essencialmente à mesma temperatura, que se encontra, de um modo preferido, na gama da temperatura ambiente até 40 °C. O processo de acordo com a invenção baseia-se na ligação selectiva de analitos a uma matriz de adsorção sólida na presença de um tampão de lise da amostra, em que o analito, que é, de um modo preferido, um ácido nucleico, como ADN, por exemplo ADN cromossomal, ADN cromossomal fragmentado, ADN plasmídico, ADN virai etc., ou ARN, por exemplo, ARNm, ARNt, ARNr ou ARN virai etc., é separado de impurezas da amostra como, por exemplo, proteínas ou detritos celulares. A amostra pode ser uma qualquer amostra biológica, por exemplo, um fluído corporal, como sangue, plasma, urina, etc., uma amostra de tecido, uma amostra de células cultivadas ou similares. A matriz de adsorção utilizada no processo de acordo com a invenção, encontra-se em posição de assegurar uma ligação substancialmente selectiva do analito sob as condições reaccionais. De acordo com a invenção utilizam-se partículas de vidro magnéticas, em especial, as partículas de vidro magnéticas 3 descritas no documento WO 96/41811 com uma superfície de vidro exterior que é essencialmente livre de poros ou os poros apresentam um diâmetro menor que 10 nm. São especialmente preferidas partículas ferromagnéticas que apresentam um tamanho de partícula entre 10 e 60 ym. Tais partículas podem, por exemplo, conter um núcleo de mica e partículas magnéticas imobilizadas sobre este, que é envolvido pela camada de vidro. Enquanto no documento WO 96/4181 as partículas magnéticas se encontram na forma sólida, por exemplo, como comprimidos ou pó, colocadas previamente nos recipientes reaccionais respectivamente utilizados, de acordo com a invenção utilizam-se as partículas magnéticas na forma de uma suspensão alcoólica. Demonstraram ser especialmente adequadas suspensões alcoólicas com uma concentração de aproxima damente 5 até 20 mg/mL. Foi verificado de forma surpreendente, que apesar da elevada densidade específica das partículas magnéticas de vidro, a suspensão pode ser retirada de um recipiente de armazenamento com uma reprodutibilidade elevada, através da qual é possibilitada uma automatização da condução do processo.
Embora no processo de acordo com a invenção as partículas de vidro descritas no documento WO 96/41811 mostrem bons resultados, são obtidos resultados especialmente bons com partículas de vidro cuja fase de vidro compreenda os seguintes óxidos metálicos. Si02, B203, óxido de metal alcalino, por exemplo, K20 ou/e Na20 bem como eventualmente A1203 e um metal alcalino-terroso, como por exemplo, CaO. As proporções destes óxidos metálicos são, de um modo preferido, como se segue: 50 até 95% em mole de Si02, 0,2 até 30% em mole de B203, 0 até 10% em mole de A1203, 0 até 20% em mole de óxido de metal alcalino-terroso e 0,2 até 20% em mole de óxido de metal alcalino, em que 4 os dados percentuais respectivos se referem ao peso total da fase de vidro.
Para o isolamento de ARN demonstrou ser especialmente adequada, por exemplo, uma fase de vidro que contém Si02, B203, K20, A1203 e CaO. Para o isolamento de ADN demonstrou ser especialmente adequada uma fase de vidro que contém Si02, B203 e Na20. A matriz de adsorção é adicionada, no processo de acordo com a invenção, de um modo preferido, numa quantidade, que corresponde à quantidade minima necessária para a ligação quantitativa do analito existente na amostra, em especial um ácido nucleico, ou que está um pouco superior, de um modo preferido superior a no máximo 50% e especialmente preferido superior a no máximo 20% acima desta quantidade. A quantidade esperada de ácido nucleico nos diferentes tipos de amostras pode desde que ela não seja já conhecida - ser determinada previamente através de técnicas habituais, por exemplo, extracção com fenol/clorofórmio e medição subsequente da densidade óptica. O passo (a) do processo de acordo com a invenção compreende a digestão da amostra num recipiente reaccional. Esta digestão decorre em geral através de lise das células existentes na amostra sob condições de desnaturação, por exemplo, através da adição de uma protease e de um tampão de desnaturação. Como proteinase é utilizada de um modo preferido, proteínase K, pronase, elastase ou/e lisozima. A utilização de proteínase K é especialmente preferida. 5 A digestão da protease decorre num tampão de desnaturação que contém um composto caotrópico, por exemplo, ureia ou derivados de ureia, de um modo preferido, um sal caotrópico, de um modo especialmente preferido um sal de guanidinio como, por exemplo, o cloridrato de guanidinio (em especial para o isolamento de ADN) ou tiocianato de guanidinio (em especial para o isolamento de ARN) ou um perclorato ou iodeto. Para os sais de guanidinio são preferidas concentrações na gama de 1 até 3 mole/L.
Em contraste com o método descrito no documento WO 96/41811 para a preparação de amostras, a adição da matriz sólida de adsorção só decorre depois da digestão da amostra. Através desta condução do processo consegue-se uma ligação não especifica, de componentes da amostra indesejados, por exemplo, proteínas, significativamente mais pequena à matriz de adsorção,
De acordo com o passo (c) decorre a ligação selectiva do analito à matriz de adsorção decorre através de incubação no tampão de digestão, de um modo preferido, sob condições caotrópicas. 0 passo (d) do processo de acordo com a invenção compreende a separação de componentes da amostra não ligados da matriz de adsorção. De um modo preferido, são removidos do recipiente reaccional para este efeito os componentes da amostra não ligados. Isto pode ser conseguido através da adição e remoção, eventualmente várias vezes, de um tampão de lavagem que contém, de um modo preferido, um teor de pelo menos 50% (v/v) e de um modo especialmente preferido de pelo menos 60% (v/v) de um solvente orgânico miscível com água como, por exemplo, etanol, propanol e acetona. 6
Os passos (c) , (d) ou/e (e) do processo de acordo com a invenção decorrem, de um modo preferido, sob mistura continua ou intercalada (isto é, fases, durante as quais se mistura, alternando com fases em que o recipiente reaccional se encontra em descanso) sem adição de agentes externos. De um modo preferido esta mistura decorre através da rotação do recipiente reaccional em torno do seu eixo longitudinal enquanto reverte a direcção da rotação várias vezes. De um modo especialmente preferido o recipiente reaccional é rodado exactamente em torno do seu eixo longitudinal e a reversão da direcção de rotação é efectuada de tal forma que a deflecção do menisco do liquido se mantém abaixo de um predeterminado valor de separação. Tais processos de mistura são descritos nos documentos WO 91/15768 e EP-A-0435481. A duração para os passos (c) ou/e (e) é, de um modo preferido, no máximo de 20 minutos e compreende uma mistura continua ou uma mistura intercalada em ciclos curtos, de um modo preferido em ciclos curtos, de um modo preferido de no máximo de 2 minutos. Foram obtidos resultados especialmente bons através de misturas intercaladas num ciclo de um minuto compreendendo 20 segundos de mistura e 40 segundos de descanso.
Na utilização de partículas magnéticas como matriz de adsorção, a adição de líquidos no recipiente reaccional ou a filtração por sucção dos líquidos daqui, pode decorrer sob mistura contínua, em que as partículas são mantidas no recipiente reaccional durante o processo de filtração por sucção através da activação do íman. Através desta técnica de mistura o processo de acordo com a invenção pode ser ajustado de forma flexível para diferentes tipos de amostras. Além disso assegura- 7 se que existe continuamente uma distribuição uniforme das partículas magnéticas na fase líquida. 0 passo (e) do processo de acordo com a invenção compreende a eluição do analito da matriz de adsorção. Para este efeito pode-se por um lado - como é conhecido do estado da técnica -utilizar um tampão fracamente salino essencialmente livre de solventes orgânicos. Foi porém verificado surpreendentemente que o tampão de eluição pode conter adicionalmente reagentes, como, por exemplo, enzimas, por exemplo, enzimas para a manipulação de ácidos nucleicos, como RNases, DNases, endonucleases de restrição, ligases, transferases terminais ou/e polimerases. Se o analito for, por exemplo, um ADN, pode ser adicionada durante a eluição uma RNase livre de DNase, de maneira a diminuir o teor em ARN indesejado. Por outro lado pode-se - se o analito for um ARN - adicionar uma DNase livre de RNase durante a eluição. De forma correspondente podem ser adicionadas também outras enzimas, como por exemplo, endonucleases de restrição, etc.. Se o ácido nucleico isolado através do processo de acordo com a invenção for submetido a uma amplificação subsequente, pode também ser adicionada, durante a eluição, uma mistura padrão de amplificação de ácidos nucleicos, a qual contém o tampão de amplificação, nucleotídeos, iniciadores, polimerases e sais de tampão. 0 passo (f) do processo de acordo com a invenção compreende a separação do eluato da matriz de adsorção. Esta separação pode decorrer da forma habitual, por exemplo, através de sedimentação, de um modo preferido porém, através de separação magnética. 8
Os analitos isolados através do processo de acordo com a invenção podem de seguida ser processados posteriormente de forma conhecida, no caso de ácidos nucleicos, através de amplificação seguida de detecção, detecção sem amplificação prévia ou sequenciação. Para esse efeito podem ser efectuadas determinações de diferentes analitos em aliquotas do eluato, por exemplo, diferentes virus, como VIH, VHC e VHB.
Uma caracteristica importante do processo de acordo com a invenção é o facto de muitos ou eventualmente mesmo todos os passos poderem ser efectuados essencialmente a mesma temperatura, isto é, dentro de uma gama de temperatura de ± 2,5 °C. De um modo preferido esta temperatura é na gama da temperatura ambiente até 70 °C, de um modo especialmente preferido da temperatura ambiente até 40 °C, sendo o mais preferido à temperatura ambiente, isto é, aproximadamente 18 até 32 °C. Numa forma de realização preferida do processo de acordo com a invenção são efectuados pelo menos os passos (c) da adsorção e (d) da lavagem a esta temperatura. De um modo especialmente preferido também outros passos, em especial o passo (a) da digestão ou/e (e) da eluição são efectuados a esta temperatura. Para a determinação de VIH em amostras de sangue, a totalidade da preparação da amostra pode decorrer, por exemplo, a uma única temperatura. Eventualmente depois do passo (f) do processo de acordo com a invenção, pode adicionalmente decorrer um passo de tratamento subsequente a uma temperatura superior, através do qual o rendimento para determinados analitos é melhorado numa amplificação. Para outros analitos pode ser necessário que o tratamento prévio ou/e a eluição decorra a uma temperatura superior. A temperatura superior encontra-se aqui, de um modo preferido, na gama de mais que 40 °C até 95 °C, por exemplo, aproximadamente 70 °C. 9 A execução do processo de acordo com a invenção decorre, de um modo preferido num dispositivo automatizado. Exemplos para tais dispositivos são descritos de seguida. Além disso é preferido que para a preparação da amostra de acordo com o processo de acordo com a invenção sejam efectuados, pelo menos os passos (a) até (e), num único recipiente reaccional, isto é, que não ocorra nenhuma transferência para outro recipiente reaccional. Isto tem como consequência uma considerável simplificação do processo e conduz além disso a um risco de contaminação menor.
Ainda outro objectivo da invenção é um kit de reagentes, que se adequa em especial para a execução do processo acima descrito, compreendendo (a) uma protease, (b) um tampão de digestão de amostra, (c) um tampão de lavagem, (d) um tampão de eluição e (e) uma suspensão alcoólica de partículas magnéticas de vidro.
Também é descrito mas não é reivindicado, um dispositivo para o isolamento de um analito a partir de uma amostra biológica, compreendendo: um dispositivo para recolha para reagentes (2), um primeiro dispositivo de recolha para os recipientes reaccionais para a preparação da amostra (3), que está equipado para uma temperatura de operação de i 7 0 °C, em especial < 40 °C, 10 um segundo dispositivo de recolha para os recipientes reaccionais (4a, 4b, 4c) , que contém eventualmente um meio de arrefecimento ou/e aquecimento, e dispositivos de pipetagem automatizados. 0 dispositivo é equipado, de um modo preferido, de tal maneira que prevê um único recipiente reaccional para executar os 4 passos principais da preparação da amostra, designadamente digestão de uma amostra ou lise, adsorção do analito libertado, por exemplo um ácido nucleico, a uma matriz sólida de adsorção, por exemplo, partículas magnéticas de vidro, lavagem da matriz de adsorção e eluição do analito da matriz de adsorção. 0 dispositivo é equipado de tal maneira que o primeiro dispositivo de recolha está previsto para a recolhe dos recipientes reaccionais para a preparação da amostra, pelo menos, para a adsorção do analito à matriz sólida de adsorção e para a lavagem da matriz de adsorção. Numa forma de realização preferida o primeiro dispositivo de recolha está previsto além disso, para a digestão da amostra ou/e para a eluição do analito da matriz de adsorção. Os recipientes reaccionais para a preparação da amostra têm um volume, de um modo preferido, de pelo menos 1 mL, por exemplo, 1-5 mL. 0 segundo dispositivo de recolha está previsto para os recipientes reaccionais armazenarem ou/e processarem posteriormente o analito, por exemplo, recipientes de PCR, que habitualmente apresentam uma forma diferente dos recipientes reaccionais utilizados para a preparação da amostra. Os recipientes reaccionais para o armazenamento ou/e posterior processamento têm um volume de, de um modo preferido, até 500 yL, por exemplo 50-200 μL. Além disso o segundo dispositivo 11 de recolha pode conter recipientes para reagentes, que são necessários para o tratamento posterior do analito contido na amostra, por exemplo, uma mistura padrão de PCR. 0 dispositivo pode ser equipado de tal maneira que um ou vários passos da preparação da amostra ou/e um passo de tratamento posterior possa decorrer a uma temperatura mais elevada no segundo dispositivo de recolha. Para esse efeito o segundo dispositivo de recolha para a recolha dos recipientes reaccionais pode estar previsto, pelo menos, para um passo de tratamento, que é seleccionado da digestão da amostra, da eluição da amostra da matriz de adsorção e de um passo de tratamento posterior depois da eluição. 0 primeiro dispositivo de recolha compreende, de um modo preferido, meios para separação magnética. Além disso é preferido que o primeiro dispositivo de recolha compreenda meios para misturar os recipientes reaccionais, em especial, através de rotação em torno do seu eixo longitudinal. Tais meios podem, eventualmente também estar previstos para o segundo dispositivo de recolha. 0 dispositivo compreende, em geral, dispositivos de pipetagem automáticos, bem como eventualmente, meios de transporte para os recipientes reaccionais, por exemplo, entre o primeiro e segundo dispositivo de recolha. Além disso, pode estar integrada uma unidade de abertura e fecho de tampa.
De seguida são mostradas em detalhe formas de realização especiais. Na forma de realização mostrada na figura 1 o dispositivo (1) contém um dispositivo de recolha para reagentes (2) , um dispositivo de recolha para recipientes reaccionais para 12 a preparação da amostra (3) com as funções de mistura e separação magnética, que está previsto para uma temperatura, de um modo preferido, ^ 40 °C e de um modo especialmente preferido, a temperatura ambiente. O dispositivo contém além disso uma estação de recolha para outros recipientes (4a) reaccionais, por exemplo para recipientes de PCR, que apresenta uma temperatura de 4 °C até à temperatura ambiente. O dispositivo contém além disso dispositivos automatizados para a pipetagem e manipulação de recipientes (5) reaccionais, que possibilitam as movimentações na direcção X, Y e Z. Nesta forma de realização do dispositivo de acordo com a invenção os quatro passos principais da preparação de amostra, designadamente, lise, adsorção, lavagem e eluição, decorrem no primeiro dispositivo de recolha num único recipiente reaccional. O armazenamento de eluatos e a adição de outros reagentes, por exemplo, mistura padrão de PCR, decorre no segundo dispositivo de recolha. Para tratamento posterior, por exemplo, para um PCR subsequente, os recipientes são transferidos para um dispositivo correspondente, por exemplo, um termociclo (não mostrado).
Na forma de realização mostrada na figura 2, o dispositivo contém um segundo dispositivo (4b) de recolha, que está previsto para a recolha de recipientes reaccionais para tratamento posterior, por exemplo, recipientes de PCR, e está previsto o ajustamento de uma temperatura de 4 °C (arrefecimento da mistura padrão de PCR) até 95 °C para aquecimento do eluato depois da eluição da matriz de adsorção. Para evitar a formação de condensação na tampa dos recipientes de PCR, é preferido um contra-aquecimento da tampa.
De acordo com a forma de realização representada na figura 3 do dispositivo de acordo com a invenção, está previsto um 13 segundo dispositivo (4c) de recolha para recipientes reaccionais que está previsto para a recolha de recipientes de PCR e recipientes de preparação de amostra. Neste segundo dispositivo de recolha pode decorrer um arrefecimento, por exemplo a 4 °C, e um aquecimento, por exemplo a 95 °C, para aquecer o lisado ou/e o eluato. Também aqui é preferido de um contra-aquecimento da tampa para evitar a formação de condensação na tampa dos recipientes reaccionais.
De acordo ainda com outra forma de realização da presente invenção (não mostrada), o primeiro dispositivo de recolha está previsto para o ajustamento de uma temperatura na gama é 70°C. O segundo dispositivo de recolha é adequado - como se mostra na figura 3 - para o arrefecimento e aquecimento de recipientes de preparação posterior de amostra e recipientes de preparação de amostra.
Além disso o presente pedido é explicado em mais detalhe através das seguintes figuras e exemplos. Mostram:
Figura 1 a representação esquemática de uma primeira forma de realização do dispositivo,
Figura 2 a representação esquemática de uma segunda forma de realização do dispositivo,
Figura 3 a representação esquemática de uma terceira forma de realização do dispositivo,
Figura 4 o resultado de uma detecção de clamídia através de PCR com preparação de amostra manual e semi-automatizada, 14
Figura 5 o resultado de uma detecção de clamídia através de PCR com preparação de amostra semi-automatizada e diferentes perfis de temperatura na preparação de amostra,
Figura β o resultado de uma detecção de VIH através de PCR com preparação de amostra manual (protocolo padrão) e preparação de amostra semi-automatizada à temperatura ambiente.
Exemplos 1. Preparação das partículas magnéticas de vidro
Foram utilizadas duas águas salinas diferentes. A preparação da água salina decorreu como se segue: Água salina 1: (Si02 :B2C>3 :Na2Q=40 : 8 :2)
Alcoolatos dos óxidos foram agitados uns com os outros nas relações molares acima, de forma análoga ao processo do exemplo 1 e 2 do documento WO 96/4181 a uma fase homogénea. Uma variação a isto foi a não utilização de HC1.
De seguida foram agitados 30 g de iriodina 600 Black Mica (Merk) em 100 mL de água salina. 15 Água salina 2: (SÍO2 :Β2θ3 :Κ2θ: AI2O3: CaO=76:15:5:2 :2)
Alcoolatos dos óxidos foram agitados uns com os outros nas relações molares acima, de forma análoga ao processo do exemplo 1 e 2 do documento WO 96/41811 a uma fase homogénea. Uma variação a isto foi a não utilização de HC1.
De seguida foram agitados 30 g de iriodina 600 Black Mica (Merk) em 100 mL de água salina.
As águas salinas foram de seguida submetidas a um processo de secagem por aspersão. O pó obtido através da secagem por aspersão foi submetido a uma separação fina através de sedimentação, um tratamento de temperatura sob atmosfera de azoto (60 L/h taxa de volume de fluxo) a uma velocidade de aquecimento de 1 K/min e mantido 1 hora a uma temperatura de espessamento na gama de 600 até 700 °C durante uma hora. De seguida o forno foi arrefecido a 300 °C e lavado a esta temperatura com oxigénio durante 1 hora. Depois do arrefecimento à temperatura ambiente foram recolhidas as partículas magnéticas de vidro e colocadas para a separação das partes grosseiras numa peneira de 50 ym e peneiradas.
As partículas magnéticas de vidro obtidas da água salina 1 são especialmente adequadas para o isolamento de ADN. As partículas de vidro obtidas da água salina 2 são especialmente adequadas para o isolamento de ARN. 16
2. Protocolo padrão para a preparação de amostra para o isolamento de ácidos nucleicos, por exemplo, ADN
Para o isolamento de ácidos nucleicos a partir de amostras biológicas, como por exemplo, sangue total ou células cultivadas, é adequado o seguinte protocolo padrão. Os ácidos nucleicos obtidos desta maneira podem ser utilizados directamente depois da eluição para a amplificação através de PCR, uma digestão de restrição ou numa transferência de western. 0 kit de reacção contém: 1. Tampão aglutinante (4,7 mole/L de cloridrato de guanidinio, 10 mmole/L de ureia, 10 mmole/L de Tris HC1, 20 % de Triton® X-100, pH 5,7) 2. Proteinase K liofilizada (para dissolução em H20 a uma concentração de 20 mg/mL) 3. Tampão de lavagem (56% (v/v) de etanol, 20 mmole/NaCl, 10 mmole/L de Tris HC1 pH 7,5) 4. Tampão de eluição (10 mmole/L de Tris pH 8,5) 5. Partículas magnéticas de vidro (MPG) a) Comprimidos com respectivamente 7,5 mg das partículas de vidro ou b) 15% de suspensão das partículas de vidro em etanol
Os componentes do kit são estáveis e podem ser armazenados à temperatura ambiente. Depois da dissolução da proteinase K em água a solução deve ser transformada em aliquotas e armazenada a -20 °C. A solução congelada é estável durante 12 meses. 17
Protocolo padrão 1. 200 pL da amostra são adicionados a um recipiente reaccional de 2 mL e mistura-se com 200 pL de tampão aglutinante e 40 pL de solução de proteinase K. De seguida incuba-se durante 10 minutos. A incubação decorre, de um modo preferido, à temperatura ambiente. Sob determinadas circunstâncias a temperatura de incubação pode porém também ser elevada até 70 °C. 2. Depois da incubação são adicionados 200 pL de isopropanol e um comprimido de MGP (ou alternativamente 200 pL de suspensão de MGP) e incuba-se durante 5 minutos à temperatura ambiente. 3. O recipiente reaccional é colocado num separador magnético de partículas (Boehringer Mannheim, N° de Cat. 1 641 794) e separa-se por aproximadamente 1 minuto. 4. O sobrenadante é removido e os recipientes reaccionais são recolhidos do separador MP. 5. Depois da adição de 500 pL de tampão de lavagem, o conteúdo do recipiente reaccional é misturado e novamente colocado no separador MP durante aproximadamente 1 minuto. 6. O sobrenadante é removido. O passo 5 é repetido três vezes. Depois do último processo de lavagem remove-se completamente o tampão de lavagem restante. 18 7. Para a eluição são adicionados 100 pL, eventualmente pré-aquecidos a 70 °C, de tampão de eluição. Depois mistura-se e incuba-se durante 5 minutos à temperatura ambiente. A amostra é colocada no separador MP e o sobrenadante é conduzido para um recipiente reaccional limpo. 8. Os ácidos nucleicos assim obtidos, por exemplo, ADN, são estáveis e podem de seguida ser directamente processados posteriormente ou armazenados a 4 °C. O protocolo acima pode ser utilizado também correspondentemente em placas de microtitulação, por exemplo, placas de microtitulação de poços fundos (por exemplo, Ritter, H.J. Bioanalytic) .
3. Detecção de ADN de Chlamydia trachomatis através de PCR 3.1 Protocolo padrão manual para a preparação de amostra 200 pL de uma amostra de urina e 240 pL de tampão aglutinante/solução de proteinase K (5:1) são pipetados para um recipiente reaccional de 2 mL, submetidos a uma mistura com vortex e incuba-se a 70 °C durante 10 minutos. Depois arrefece-se a amostra durante 5 minutos à temperatura ambiente. São pipetados à amostra 200 pL de solução isopropanólica de MGP. Imediatamente a seguir decorre a mistura com vortex. A amostra é incubada depois durante 15 minutos num misturador, por exemplo, termomisturador 5436 (Eppendorf). 19
As MGP são concentradas através da condução da amostra num separador magnético. Depois de um minuto o sobrenadante é completamente removido por pipetagem.
Pipetam-se 0,5 mL de tampão de lavagem para as MGP. A amostra é submetida a uma mistura com vortex e depois conduzida ao separador magnético. O sobrenadante é removido por pipetagem após 1 minuto. O processo de lavagem é repetido ainda duas vezes.
Adicionam-se 200 mL de tampão de eluição às MPG. A amostra é incubada 10 minutos a 70 °C num termomisturador a 1400 rpm. A água de condensação é recolhida após curta centrifugação. A amostra é conduzida ao separador magnético e depois de 1 minuto remove-se 180 pL de eluato. O eluato é pipetado num novo recipiente reaccional e armazenado a 4 °C (para uma duração de armazenamento < 24 h) ou a -20 °C (para uma duração de armazenamento mais prolongada).
Para o PCR são utilizados 50 pL de eluato. A avaliação decorre através de electroquimioluminescência. 3.2 Protocolo para um processo semi-automatizado
Em lugar da mistura com vortex descrita em 3.1 e do aquecimento sobre um bloco térmico, efectua-se um processo semi-automatizado, no qual decorre a mistura e o aquecimento num módulo de mistura e aquecimento. A figura 4 mostra uma comparação da determinação de clamidias (amostra: 100 anticorpos elementares por 100 mL de urina; seis determinações) entre o 20 protocolo padrão manual (vortex) e o processo semi-automatizado (MTM). É evidente que através da automatização não ocorre nenhuma restrição da sensibilidade. 3.3 Protocolo semi-automatizado à temperatura ambiente A preparação da amostra decorre como se descreve no ponto 3.2. A lise e eluição são efectuadas porém à temperatura ambiente. 3.4 Protocolo de preparação de amostra semi-automatizado à temperatura ambiente com subsequente tratamento posterior do eluato A preparação da amostra decorre como se descreve no ponto 3.3. Depois da eluição decorreu uma incubação durante 10 minutos a 70 °C. A figura 5 mostra uma comparação da determinação de clamidias (amostras: SWE1, 0 anticorpos elementares de clamidias (EAK) por mL de urina, SWE 2: 10 EAK, SWE 3: 100 EAK e SWE 4: 1000 EAK respectivamente por mL de urina) entre os protocolos de preparação de amostra descritos nos pontos 3.2, 3.3 e 3.4. É evidente que para a determinação de clamidias, o protocolo padrão é mais sensível relativamente a uma preparação de amostra à temperatura ambiente (protocolo MTM à temperatura ambiente). Os resultados da preparação da amostra à temperatura ambiente e subsequente tratamento posterior do eluato (protocolo MTM à temperatura ambiente com tratamento posterior) mostram porém que este efeito pode ser em grande parte compensado. De forma 21 surpreendente não é necessário por essa razão nenhum passo de temperatura durante a própria preparação da amostra.
Através deste conhecimento o processo de preparação de amostra deixa-se simplificar de forma decisiva, uma vez que os passos da lise, da adsorção, da lavagem e da eluição podem decorrer a temperaturas ^ 40 °C, o que simplifica uma automatização, uma vez que não é necessário nenhum contra-aquecimento da tampa e regulação da temperatura.
4. Detecção de ARN de VIH através de PCR 4,1 Protocolo padrão para a preparação da amostra
Plasma congelado é descongelado 5 minutos a 37 °C e arrefecido sobre gelo para posterior processamento.
Num recipiente reaccional Sarstedt de 1,5 mL são pipetados 50 pL de uma solução de proteinase K (25 mg/mL) . A esta são adicionados 250 μL de amostra e mistura-se com vortex. Depois são adicionados 300 pL de tampão de lise e mistura-se de novo com vortex.
Incuba-se 10 minutos à temperatura ambiente sobre um misturador de Eppendorf a 13000 rpm. Depois são adicionados 300 pL de uma suspensão de MGP (6 mg/mL de MGP em isopropanol) , mistura-se com vortex e incuba-se 20 minutos à temperatura ambiente continuando a misturar. As MGP são separadas num separador magnético e o sobrenadante é completamente removido. 22 São adicionados às MGP 750 pL de tampão de lavagem. As MGP são ressuspendidas e separadas como se descreve anteriormente. O processo de lavagem é repetido quatro vezes, em que no fim o tampão de lavagem é cuidadosamente removido. São depois adicionados 100 pL de tampão de eluição e ressuspende-se as MGP. Depois de 15 minutos de incubação a 80 °C num termomisturador Eppendorf (13000 rpm) são transferiods 90 pL de eluato num novo recipiente reaccional. Para a determinação subsequente de VIH através de PCR à temperatura ambiente, utiliza-se 40 pL de eluato. 4.2 Protocolo padrão semi-automatizado para a preparação da amostra A preparação da amostra decorre como se descreve no ponto 4.1, excepto que a mistura e aquecimento decorreu num módulo de mistura e aquecimento. 4.3 Protocolo padrão semi-automatizado à temperatura ambiente A preparação da amostra decorre essencialmente como se descreve no ponto 4.2, excepto que todos os passos são conduzidos à temperatura ambiente. O período de duração da incubação para lise, adsorção e eluição é de respectivamente 15 minutos. É evidente da figura 6 que através da automatização e da preparação da amostra à temperatura ambiente (protocolo MTM à 23 temperatura ambiente) não ocorre nenhuma restrição da sensibilidade relativamente ao protocolo padrão para a preparação da amostra manual (manual). São obtidos resultados reprodutíveis quer para plasmas negativos, pouco positivos, moderadamente positivos e altamente positivos.
Lisboa, 2 de Outubro de 2007 24

Claims (24)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para o isolamento de um analito de ácido nucleico a partir de uma amostra biológica, compreendendo os passos: (a) Lise da amostra num recipiente reaccional, (b) Adição de partículas de vidro magnéticas na forma de uma suspensão alcoólica, (c) Incubação sob condições nas quais o analito se liga às partículas de vidro, (d) Remoção dos componentes da amostra que não se ligam do recipiente reaccional, (e) Incubação sob condições nas quais o analito é eluído das partículas de vidro, e (f) Separação do eluato das partículas de vidro, em que muitos ou todos os passos são efectuados essencialmente à mesma temperatura.
  2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo (a) compreender a adição de uma protease e de um tampão de desnaturação.
  3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se utilizar proteínase K como protease.
  4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se utilizar um tampão de desnaturação, que contém um sal de guanidínio, em especial cloridrato de guanidínio ou/e tiocianato de guanidínio. 1
  5. 5. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por, pelo menos, os passos (a) até (e) serem efectuados essencialmente à mesma temperatura, que se encontra na gama da temperatura ambiente até 40 °C.
  6. 6. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 até 5, caracterizado por a suspensão alcoólica ter uma concentração aproximadamente de 5 até 20 mg/mL.
  7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado por se utilizarem partículas de vidro cuja fase de vidro contém Si02, B203 e Na20 ou Si02, B203, A1203, CaO e K20.
  8. 8. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por as partículas de vidro serem adicionadas numa quantidade, que se encontra no máximo 50% acima da quantidade que é necessária para a ligação quantitativa do analito existente na amostra.
  9. 9. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por decorrer durante os passos (c), (d) ou/e (e) uma mistura contínua ou intercalada sem adição de agentes externos.
  10. 10. Processo de acordo com as reivindicação 9, caracterizado por a mistura decorrer através de rotação do recipiente reaccional em torno do seu eixo longitudinal.
  11. 11. Processo de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado por a duração da execução dos passos (c) ou/e (e) ser respectivamente no máximo de 20 minutos. 2
  12. 12. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o passo (d) compreender uma adição e filtração por sucção, eventualmente repetidas várias vezes, de um tampão de lavagem.
  13. 13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por ser utilizado um tampão de lavagem com um teor de pelo menos 50% (v/v) de um solvente orgânico miscivel com água.
  14. 14. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por no passo (e) serem adicionados reagentes adicionais como, por exemplo, enzimas.
  15. 15. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por no passo (e) ser utilizado um tampão fracamente salino para a eluição.
  16. 16. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 até 14, caracterizado por no passo (e) ser adicionada para a eluição uma mistura padrão de amplificação de ácidos nucleicos.
  17. 17. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 até 16, caracterizado por a temperatura se encontrar na gama de 18 °C até 32 °C.
  18. 18. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por depois do passo (f) decorrer um passo de tratamento posterior a temperatura mais elevada. 3
  19. 19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a temperatura mais elevada se encontrar na gama de mais de 40 °C até 95 °C.
  20. 20. Processo para o isolamento de um analito de ácido nucleico a partir de uma amostra biológica, compreendendo os passos: (a) Lise da amostra num recipiente reaccional, (b) Adição de partículas de vidro magnéticas na forma de uma suspensão alcoólica, (c) Incubação sob condições nas quais o analito se liga as partículas de vidro, (d) Separação dos componentes da amostra que não se ligam ao recipiente reaccional, (e) Incubação sob condições nas quais o analito é eluído das partículas de vidro, e (f) Separação do eluato das partículas de vidro, em que muitos ou todos os passos são efectuados essencialmente à mesma temperatura.
  21. 21. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por, pelo menos, os passos (a) até (e) serem efectuados essencialmente à mesma temperatura, que se encontra na gama da temperatura ambiente até 40 °C.
  22. 22. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a condução do processo decorrer num dispositivo automatizado. 4
  23. 23. Processo de acordo com a reivindicação 1 até 22, caracterizado por os passos (a) até (e) serem efectuados num único recipiente reaccional.
  24. 24. kit de reagentes, para o isolamento de um analito de ácido nucleico, em especial para efectuar o processo de acordo com uma das reivindicações 1 até 23, compreendendo (a) uma protease, (b) um tampão de digestão de amostra, (c) um tampão de lavagem, (d) um tampão de eluição e (e) uma suspensão alcoólica de partículas magnéticas de vidro. Lisboa, 2 de Outubro de 2007 5
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