CZ20001132A3 - Automatizovatelný, univerzálně použitelný způsob přípravy vzorků - Google Patents

Abstract

Způsob spočívá v selektivnímnavázání analyzovaných složek na pevnou adsorpční matrici v přítomnosti pufru pro rozklad vzorku, přičemž se analyzovaná složka, kterouje s výhodou nukleová kyselinajako DNA např· chromozomální DNA fragmentovaná chromozomální DNA piazmidováDNA virální DNA atd., nebo RNA např. mRNA tRNA rRNA nebo virální RNA atd., oddělí od znečištění vzorku, například proteinů nebo buněčných zlomků. Vzorkemmůže být libovolný vzorek, např. tělní tekutinajako krev, plazma, moč atd., vzorek tkáně, vzorek kultivovaných buněk nebo podobně

Description

Automatizovatelný, univerzálně použitelný způsob přípravy vzorků

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy biologických vzorků pro následný důkaz analyzované složky, zejména nukleové kyseliny, v tomto vzorku. Vynález se také týká reagenční soupravy a nového zařízení pro přípravu vzorku, jakož i nových magnetických pigmentů.

Dosavadní stav techniky

Při způsobu důkazu analyzované složky v biologickém vzorku jsou často kladeny zvláštní požadavky na přípravu vzorku. Jednak je analyzovaná složka často přítomna ve velmi malé koncentraci, a jednak se ve vzorku často nachází mnoho jiných látek, které mohou ovlivnit izolaci popř. stanovení analyzované složky.

WO 96/41811 popisuje způsob izolace analyzované složky, zejména nukleové kyseliny, z biologického vzorku, při kterém se vzorek, obsahující analyzovanou složku v kapalině, uvede do styku s magnetickými částicemi, které mají vnější sklovitý povrch, který je v podstatě bez pórů nebo má póry o průměru <10 nm, za podmínek při kterých se analyzovaná složka váže na povrch částic, a navázaná analyzovaná složka se od kapaliny vzorku oddělí. Tento způsob popsaný ve WO 96/46811 je velmi vhodný pro čištění analyzované složky z biologického vzorku. Není však bez dalšího použitelný pro automatizovanou přípravu vzorku.

Boom aj . (J.Clin.Microbiol. 28(1990), 495-503) popisuje rovněž postup pro čištění nukleových kyselin z biologického « · ’ · · · · · · · · · Τ • · ·: :

··· ···· ·· ··· ·* ** vzorku za použití částic oxidu křemičitého, frakcionovaných podle velikosti. Tento způsob je však obtížný, nevhodný pro automatizaci a kromě toho zahrnuje nebezpečí kontaminace.

Při způsobu extrakce nukleových kyselin popsaném v EP-A 0 757 106 se vzorek podrobí lýze, nukleové kyseliny přítomné ve vzorku se vážou na superparamagnetické kovové částice, které se pipetou odeberou z pokusné nádobky, a oddělí se tak od ostatních složek vzorku. Tento způsob má tu nevýhodu, že z důvodu nutnosti odebrat analyzované složky pipetou ze vzorku mohou nastat ztráty. Kromě toho použití více reakčních nádobek zahrnuje nebezpečí zavlečení a kontaminace.

Podstata vynálezu

Předložený vynález je založen na úkolu vytvořit způsob přípravy vzorku, při kterém jsou alespoň částečně odstraněny nevýhody stavu techniky. Zejména by měl být nový způsob automatizovatelný a měl by mít co nejjednodušší teplotní profil.

Tento úkol je vyřešen způsobem izolace analyzované složky z biologického vzorku, zahrnujícím kroky:

(a) uzavření vzorku do reakční nádoby, (b) přidání pevné adsorpčni matrice, (c) inkubace za podmínek, při kterých se analyzovaná složka váže na adsorpčni matrici, (d) odstranění nenavázaných podílů vzorku z reakční nádoby, (e) inkubace za podmínek, při kterých se analyzovaná složka eluuje z adsorpčni matrice, a (f) oddělení eluátu od adsorpčni matrice.

Dalším aspektem předloženého vynálezu je způsob izolace analyzované složky z biologického vzorku, zahrnující kroky:

• · ·

(a)	uzavření vzorku do reakční nádoby,
(b) (c)	přidání pevné adsorpční matrice, inkubace za podmínek, při kterých se analyzovaná složka
(d)	váže na adsorpční matrici, oddělení nenavázaných podílů vzorku od adsorpční matrice,
(e)	inkubace za podmínek, při kterých se analyzovaná složka
(f)	eluuje z adsorpční matrice, a oddělení eluátu od adsorpční matrice,

přičemž alespoň kroky (c) a (d) se provádí při v podstatě stejné teplotě.

Způsob podle vynálezu spočívá v selektivním navázání analyzovaných složek na pevné adsorpční matrici v přítomnosti pufru pro rozklad vzorku, přičemž analyzovaná složka, kterou je s výhodou nukleová kyselina jako DNA, např. chromozomální DNA, fragmentovaná chromozomální DNA, plazmidová DNA, virální DNA atd, nebo RNA, např. mRNA, tRNA, rRNA nevo virální RNA atd., oddělí od znečištění vzorku, například proteinů nebo buněčných zlomků. Vzorkem může být libovolný vzorek, např. tělní tekutina jako krev, plazma, moč atd., vzorek tkáně, vzorek kultivovaných buněk nebo podobně.

Adsorpční matrice použitá při způsobu podle vynálezu je schopná za reakčních podmínek zajistit ve velké míře selektivní navázání analyzované složky. S výhodou se používá zvláštní adsorpční matrice, která s výhodou obsahuje skelné povrchy. Zvláště výhodné jsou magnetické skelné částice, zejména magnetické částice s vnějším skelným povrchem, popsané ve WO 96/41811, který je v podstatě bez pórů nebo má póry o průměru méně než 10 nm. Zvláště výhodné jsou feromagnetické částice, které mají velikost zrna mezi 10 a 60 μπι. Takovéto částice mohou obsahovat například jádro ze slídy a na ní imobilizovaných magnetických částic, uzavřené ve skelné vrstvě. Zatímco ve WO 96/41811 jsou magnetické částice • · předloženy v použitých reakčních nádobách v pevné formě, např. jako tablety nebo prášek, nasazují se magnetické částice podle vynálezu s výhodou ve formě suspenze. Zvláště vhodnými se ukázaly alkoholické suspenze s koncentraci asi 5 až 20 mg/ml. Překvapivě se ukázalo, že navzdory vysoké měrné hmotnosti magnetických skelných částic může být suspenze s vysokou reprodukovatelností odtažena ze zásobníku, čímž je umožněna automatizovatelnost provádění způsobu.

Ačkoliv při způsobu podle vynálezu vykazují skelné částice popsané ve WO 96/41811 dobré výsledky, byly získány zvláště dobré výsledky se skelnými částicemi, jejichž skelná fáze obsahuje následující kovové oxidy. SiO₂, B₂O₃, oxid alkalického kovu, např. K₂O a/nebo Na₂0 jakož i popřípadě Al₂O₃ a oxid kovu alkalických zemin, např. CaO. Podíly těchto kovových oxidů jsou následující: 50 až 95 % mol. SiO₂, 0,2 až 30 % mol. B₂O₃, 0 až 10 % mol. Al₂O₃, 0 až 20 % obj. oxidu kovu alkalických zemin a 0,2 až 20 % obj. oxidu alkalického kovu, přičemž procentické údaje jsou vztaženy vždy na celkovou hmotnost skelné fáze.

Pro izolaci RNA se ukázala jako zvláště vhodná skelná fáze, která obsahuje SiO₂, B₂O₃, K₂O, Al₂O₃, a CaO. Pro izolaci DNA se ukázala jako zvláště vhodná skelná fáze, která obsahuje SiO₂, B₂O₃ a Na₂0.

Adsorpční matrice se při způsobu podle vynálezu přidává s výhodou v množství, které odpovídá minimálnímu množství, potřebnému ke kvantitativnímu vázání analyzované složky, vyskytující se ve vzorku, zejména nukleové kyseliny, nebo je poněkud větší, s výhodou o nejvýše 50 %, a zvláště výhodně leží nejvýše 20 % nad tímto množstvím. Množství nukleové kyseliny, které lze očekávat v různých druzích vzorků - pokud není předem známo - může být předem stanoveno prostřednictvím obvyklých technik, například extrakcí fenol/chloroform a navazujícím měřením optické hustoty.

Krok (a) způsobu podle vynálezu zahrnuje rozklad vzorku v reakční nádobě. Tento rozklad se provádí obecně lýzou buněk přítomných ve vzorku za denaturujících podmínek, např. prostřednictvím přídavku proteázy a denaturačního pufru. Jako proteináza se použije s výhodou proteináza K, pronáza, elastáza a/nebo lysozym. Zvláště výhodné je použití proteinázy K.

Natrávení proteázy se provádí v denaturačním pufru, který obsahuje chaotropní sloučeninu, např. močovinu nebo deriváty močoviny, s výhodou chaotropní sůl, zvláště výhodně sůl guanicinu, jako například hydrochlorid guanidinu (zejména pro izolaci RNA) nebo chloristan nebo jodid. Pro soli guanidinu jsou výhodné koncentrace v rozmezí 1 až 3 mol/1.

Na rozdíl od způsobu přípravy vzorku popsaného ve WO 96/41811 se přidání pevné adsorpční matrice provádí teprve po rozkladu vzorku. Prostřednictvím tohoto vedení způsobu se dosahuje podstatně menšího nespecifického navázání nežádoucích složek vzorku, např. proteinů, na adsorpční matrici.

Podle kroku (c) se provádí selektivní navázání analyzované složky na adsorpční matrici prostřednictvím inkubace v pufru pro rozklad, s výhodou za chaotropních podmínek.

Krok (d) způsobu podle vynálezu zahrnuje oddělení nenavázaných složek vzorku od adsorpční matrice. S výhodou se nenavázané složky vzorku odstraňují z reakční nádoby. To se může realizovat popřípadě vícenásobným přidáním a odstraněním promývacího pufru, který s výhodou obsahuje alespoň 50 % obj. a zvláště výhodně alespoň 60 % obj . s vodou mísitelného • » • · · · organického rozpouštědla, jako například etanolu, propanolu a acetonu.

Kroky (c), (d) a/nebo (e) způsobu podle vynálezu se provádí s výhodou za kontinuálního nebo intervalového míchání (tzn. že fáze, během kterých se provádí míchání, se střídají s fázemi, ve kterých se reakční nádoba nachází v klidu) bez použití externího prostředku. S výhodou se toto míchání provádí otáčením reakční nádoby kolem její podélné osy při vícenásobné změně směru otáčení. Zvláště výhodně se míchací nádoba otáčí přesně kolem své podélné osy a změna směru otáčení se provádí tak, že vychýlení menisku kapaliny zůstává pod stanovenou hodnotou. Takovéto postupy míchání jsou popsány ve WO 91/15768 a EP-A-0 435 481.

Doba trvání kroku (c) a/nebo (e) je s výhodou maximálně 20 min a zahrnuje kontinuální míchání nebo intervalové míchání v krátkých cyklech, s výhodou v krátkých cyklech maximálně 2 minuty. Zvláště dobré výsledky byly získány s intervalovým mícháním v jednominutovém cyklu zahrnujícím 20 s míchání a 40 s klidu.

Při použití magnetických částic jako adsorpční matrice se může přidávání kapalin do reakční nádoby popř. odsávání kapalin z ní provádět za kontinuálního míchání, přičemž částice se v průběhu kroku odsávání drží v reakční nádobě prostřednictvím zapnutí magnetů. Prostřednictvím této míchací techniky se může způsob podle vynálezu flexibilně nastavit na různé druhy vzorku. Kromě toho je neustále zajištěno rovnoměrné rozdělení magnetických částic v kapalné fází.

Krok (e) způsobu podle vynálezu zahrnuje eluci analyzovaných složek z adsorpční matrice. K tomu se může, jak je známo ze stavu techniky, použít v podstatě rozpouštědel • · prostý nízkosolný pufr. Překvapivě však bylo zjištěno, že eluční pufr může obsahovat přídavné reagencie, jako například enzymy, např. pro manipulaci s nukleovými kyselinami použité enzymy jako například RNázy, DNázy, restrikční endonukleázy, ligázy, terminální transferázy a/nebo polymerázy. Když je analyzovanou složkou například DNA, může se během eluce přidávat RNáza prostá DNázy, aby byl zmenšen obsah nežádoucí RNA. Na druhé straně, když je analyzovanou složkou RNA, může se během eluce přidávat DNáza prostá RNázy. Odpovídajícím způsobem se mohou přidávat také jiné enzymy, jako například restrikční endonukleázy atd. Když se nukleová kyselina izolovaná způsobem podle vynálezu následně podrobuje amplifikaci, může se během eluce přidávat také zesilovací předsměs pro nukleové kyseliny, která obsahuje amplifikační pufr, nukleotid, primer, polymerázu a pufrovou sůl.

Krok (f) způsobu podle vynálezu zahrnuje oddělení eluátu od adsorpční matrice. Toto oddělení se může provádět obvyklým způsobem, např. sedimentací, s výhodou však magnetickou separací.

Analyzované složky izolované způsobem podle vynálezu mohou být následně dále zpracovány známým způsobem, v případě nukleových kyselin např. amplifikaci a následnou detekcí, detekcí bez předcházející amplifikace nebo sekvencováním. K tomu se mohou alikvotní díly eluátu přivádět k samotnému stanovení různých analyzovaných složek, např. různých virů, jako HIV, HCV a HBV.

Důležitým znakem způsobu podle vynálezu je, že mnoho nebo popřípadě dokonce všechny kroky se mohou provádět při v podstatě stejné teplotě, tzn. v teplotním rozmezí +2,5 °C. S výhodou je tato teplota v rozmezí od pokojové teploty do 70 °C, zvláště výhodně od pokojové teploty do 40 °C,

O · · ·· ···♦· ⁶ '·· ···· ·· ··· ·· ·· nej výhodně ji při pokojové teplotě, tzn. asi 18 až 32 °C. Podle výhodného provedení způsobu podle vynálezu se alespoň kroky (c) adsorpce a (d) praní provádějí při této teplotě. Zvláště výhodně se také jiné kroky, zejména kroky (a) rozkladu a/nebo (e) eluce, provádějí při této teplotě. Pro stanovení HIV v krevních vzorcích se například může celá příprava vzorku provádět při jednotné teplotě. Popřípadě se může po kroku (f) způsobu podle vynálezu navíc provádět krok dodatečné úpravy při zvýšené teplotě, čímž se při určitých analyzovaných složkách zlepší výtěžky při amplifikaci. Při jiných analyzovaných složkách může být potřebné provádět předúpravu a/nebo eluci při zvýšené teplotě. Zvýšená teplota přitom leží s výhodou v rozmezí od více než 40 °C až do 95 °C, např. asi 70 °C.

Provádění způsobu podle vynálezu se realizuje s výhodou v automatizovaném zářízení.Příklady takovýchto zařízení jsou popsány v následujícím. Dále je výhodné, že způsob přípravy vzorku podle vynálezu, alespoň kroky (a) až (e) , se provádí v jediné reakční nádobě, tzn. že nedochází k žádnému transferu do jiné reakční nádoby. To má za následek značné zjednodušení způsobu a vede kromě toho ke zmenšenému riziku kontaminace.

Ještě dalším předmětem vynálezu je reagenční souprava vhodná zejména pro provádění výše popsaného způsobu obsahující (a) proteázu, (b) pufr pro rozklad vzorku, (c) promývací pufr, (d) eluční pufr, a (q') suspenzi magnetických skelných částic.

Ještě dalším předmětem vynálezu je reagenční souprava pro izolaci DNA, obsahující magnetické skelné částice, jejichž skelná fáze obsahuje SiO₂, B₂O₃ a Na₂0, a reagenční souprava pro ·« ··« · • · • · · · izolaci RNA, obsahující magnetické skelná fáze obsahuje SiO₂, B₂O₃, Al₂O₃, skelné částice, CaO a K₂0.

j ej ichž

Konečně ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zařízení pro izolaci analyzovaných složek z biologického vzorku, obsahující kondicionér (1) vzorku, úložné zařízení pro reagencie (2), první úložné zařízení pro reakční nádoby pro přípravu vzorku (3), které je upraveno pro provozní teplotu <70 °C, zejména <40 °C, druhé úložné zařízení pro reakční nádoby (4a, 4b, 4c) , které popřípadě obsahuje chladící a/nebo ohřívací prostředek, a robotický přístroj (5).

Zařízení podle vynálezu je vytvořeno tak, že je uspořádána jediná reakční nádoba pro provádění 4 hlavních kroků přípravy vzrku, totiž rozklad vzorku popř. lýzu, pro adsorpci uvolňované analyzované složky, např. nukleové kyseliny, na pevné adsorpční matrici, např. magnetických skelných částicích, pro promývání adsorpční matrice a pro eluci analyzované složky z adsorpční matrice.

Zařízení je vytvořeno tak, že první úložné zařízení je uspořádáno pro uložení reakčních nádob pro přípravu vzorku alespoň pro adsorpci analyzované složky na pevné adsorpční matrici a pro promývání adsorpční matrice. Ve výhodném provedení je první úložné zařízení uspořádáno dále pro rozklad vzorku a/nebo pro eluci analyzovaných složek z adsorpční matrice. Reakční nádoby pro přípravu vzorku mají objem s výhodou alespoň 1 ml, např. 1-5 ml.

Druhé úložné zařízení je uspořádáno pro reakční nádoby pro • fe fefefefe fe · fe fefefe ♦ ♦ · fefe fefe • * · · • · · · • fefe fe fefe fefe uchovávání a/nebo další zpracování analyzované složky, např. PCR-nádoby, které zpravidla mají tvar odlišný od reakčních nádob použitých pro přípravu vzorku. Reakční nádoby pro uchovávání a/nebo další zpracovaní mají objem s výhodou až 500 μί, např. 50-200 μΐ. Kromě toho může druhé úložné zařízení obsahovat nádoby pro reagencie, které jsou třeba pro další zpracování vzorku obsahujícího analyzované složky, např. PCRpředsměs.

Zařízení podle vynálezu může být vytvořeno tak, že jeden nebo více kroků přípravy vzorku a/nebo krok dodatečné úpravy se může provádět ve druhém úložném zařízení . při zvýšené teplotě. K tomu může být druhé úložné zařízení uspořádáno pro uložení reakčních nádob pro alespoň jeden zpracovací krok, zvolený z rozkladu vzorku, eluce vzorku z adsorpčni matrice a kroku dodatečné úpravy po eluci.

První úložné zařízení obsahuje s výhodou prostředek pro magnetickou separaci. Dále je výhodné, když první úložné zařízení obsahuje prostředek pro míchání reakčních nádob, zejména otáčením kolem podélné osy. Takovýto prostředek může být může být uspořádán popřípadě také pro druhé úložné zařízení.

Robotický nástroj obecně zahrnuje automatické pipetovací zařízení jakož i popřípadě prostředky pro transport reakčních nádob, např. mezi prvním a druhým úložným zařízením. Kromě toho může být integrován otvor víka a uzavírací jednotka.

V následujícím jsou detailně znázorněna zvláštní provedení zařízení podle vynálezu. V provedení znázorněném na obr. 1 obsahuje kondicionér (1) úložné zařízení pro reagencie (2) , úložné zařízení pro reakční nádoby pro přípravu vzorku (3) s funkcemi míchání a magnetické separace, které je uspořádáno • ·· · • ·· « ♦ · to · to • · · · • · ·· » »« >· ···· • · · · · · · • · · · ··· • ···· ♦ • · · · · ······· »· ··· pro teplotu s výhodou <40 °C, zvláště výhodně pro pokojovou teplotu.Zařízení dále obsahuje úložnou stanici pro další reakční nádoby (4a), např. pro PCR-nádoby, které má teplotu 4 °C až pokojovou teplotu. Zařízení dále obsahuje automatizovaná zařízení pro pipetování a manipulaci s reakčními nádobami (5), umožňující pohyb ve směru X, Y a Z. U tohoto provedení zařízení podle vynálezu se provádějí čtyři hlavní kroky přípravy vzorku, totiž lýza, adsorpce, promývání a eluce v prvním úložném zařízení v jediné reakční nádobě. Uložení eluátu a přidání dalších reagencií, např. PCRpředsměsi, se provádí ve druhém úložném zařízení. Pro další zpracování, např. pro následnou PCR, se nádoby dopravují k neznázorněnému zařízení, např. termocyklovači (neznázorněn).

Zařízení v provedení znázorněném na obr. 2 obsahuje druhé úložné zařízení (4b) , které je uspořádáno pro uložení reakčních nádob pro další zpracování, např. PCR-nádob, a je uspořádáno pro nastavení teploty 4 °C (chlazení PCR-předsměsi) až 95 °C pro zahřátí eluátu po eluci z adsorpční matrice. Pro zamezení tvorby kondenzátu na víku PCR-nádoby je výhodné otápění víka.

Podle provedení zařízení podle vynálezu znázorněného na obr. 3 je uspořádáno druhé úložné zařízení pro reakční nádoby (4c) , které je uspořádáno pro uložení PCR-nádob a nádob pro přípravu vzorku. V tomto druhém úložném zařízení se může provádět chlazení, např. na 4 °C, a ohřev, např. na 95 °C, pro lyzátu a/nebo eluátu. Také v tomto případě je pro zamezení tvorby kondenzátu na víku výhodné otápění víka.

Podle ještě dalšího provedení předloženého vynálezu (neznázorněného) je uspořádáno první úložné zařízení pro nastavení teploty <70 °C. Druhé úložné zařízení je, jak je δ 99 99 9999 ·· ·· ,: · · · · · ::::

Ο · · · ··· · · · · , *··» ·····;

• · · · · · ··· ·«· «·»· ·· ··· ·* ·· znázorněno na obr. 3, vhodné pro chlazení a ohřev nádob pro další zpracování a přípravu vzorku.

Zařízení podle vynálezu jsou zvláště vhodná pro použití ve výše popsaném způsobu.

Přehled obrázků na výkresech

Dále bude přihláška vynálezu blíže objasněna prostřednictvím následujících výkresů a příkladů. Na výkresech představuj e:

obr. 1 zařízení podle	schematické vynálezu,	znázornění	prvního	provedení
obr. 2 zařízení podle	schematické vynálezu,	znázornění	druhého	provedení
obr. 3 zařízení podle	schematické vynálezu,	znázornění	třetího	provedení
obr. 4	výsledek důkazu chlamydií	pomocí PCR	s manuální

a poloautomatizovanou přípravou vzorků, obr. 5 výsledek důkazu chlamydií pomocí PCR s poloautomatizovanou přípravou vzorků s různými teplotními profily při přípravě vzorků, obr. 6 výsledek důkazu HIV pomocí PCR s manuální přípravou vzorků (standardní postup) a s poloautomatizovanou přípravou vzorků při pokojové teplotě.

0·

0· · · · ·

0 · 0 ·

I 00 0 0

00· ·

0 » 000

Příklady provedení vynáleau

1. Výroba magnetických skelných částic

Byly použity dva různé sóly. Výroba sólu se provádí následovně:

Sol 1: (SÍQ₂:B.₂O₂.:Na₂Q=4Q:8:2)

Alkoholáty oxidů byly ve výše uvedených molárních poměrech, analogicky provedení podle příkladů 1 a 2 ve WO96/41811, navzájem promíchány do homogenní fáze. Na rozdíl od těchto provedení nebyla přidávána žádná HCI.

Následně bylo do 100 ml sólu vmícháno 30g g černé slídy Iriodin 600 (Merck).

Sol 2: (SÍ0₂;B₂0j:K2-Q-; Al₂Q_i;CaQ=76 :15 :5...;2.;,2)

Alkoholáty oxidů byly ve výše uvedených molárních poměrech, analogicky provedení podle příkladů 1 a 2 ve WO96/41811, navzájem promíchány do homogenní fáze. Na rozdíl od těchto provedení nebyla přidávána žádná HCI.

Následně bylo do 100 ml sólu vmícháno 30g g černé slídy Iriodin 600 (Merck).

Sóly byly následně podrobeny sušení rozprašováním.

Prášek získaný sušením rozprašováním byl podroben jemnému rozdělování sedimentací, tepelnému zpracování v dusíkové atmosféře (s objemovým průtokem 60 1/h) při rychlosti ohřevu 1 K/min a po dobu 1 h byl udržován na zhutňovací teplotě v rozmezí 6 00 až 700 °C. Následně byla pec ochlazena na 300 °C

0· · 0« * • 4

4444 • 4 <4 • · 0 *'

0 0 ·

4 4 4 4 • 0 0 0

00 a při této po dobu 1 hodiny proplachována kyslíkem. Po ochlazení na teplotu okolí byly magnetické skelné částice vyjmuty, předány k oddělení hrubého podílu a prosety na sítě 50 μιυ.

Magnetické skelné částice získané ze sólu 1 jsou vhodné zejména pro izolaci DNA. Magnetické skelné částice získané ze sólu 2 jsou vhodné zejména pro izolaci RNA.

2. Standardní postup přípravy vzorku pro izolaci nukleových kyseliny, např. DNA

Pro izolaci nukleových kyselin z biologických vzorků, například z úplné krve nebo kultivovaných buněk je vhodný následující standardní postup. Tímto způsobem získané nukleové kyseliny mohou být bezprostředně po eluci použity pro amplifikaci prostřednictvím PCR, restrikčního štěpení nebo ve skvrně (southernblot).

Reakční souprava obsahuje:

1. vázací pufr (4,7 mol/1 hydrochloridu guanidinu, 10 mmol/1 močoviny, 10 mmol/1 Tris Hel, 20 % Triton® X-100, pH 7

2. lyofilizovaná proteináza K (k naředění H₂O na koncentraci 20 mg/ml)

3. promývací pufr (56 % obj. etanolu, 20 mmol/NaCl, 10 mmol/1 Tris HCI pH 7,5)

4. eluční pufr (10 mmol/1 Tris pH 8,5)

5. magnetické skelné částice (MGP, Magnetische Glaspartikel)

a) tablety s 7,5 mg skelných částic nebo

b) 15% suspenze skelných částic v etanolu.

Komponenty soupravy jsou stabilní a mohou být skladovány při pokojové teplotě. Po rozpuštění proteinázy K ve vodě by se • fe

• · · * • •fefe • · · fe ·· fe* • · · fefe fefefe fe « fefefefe měl roztok rozdělit a skladovat při -20 °C. Zmrazený roztok je stabilní po dobu 12 měsíců.

Standardní postup

1. 200 pm vzorku se vloží do 2 ml reakční nádoby a převrství se 200 μΐ vázacího pufru a 40 μΐ roztoku proteinázy K. Následně se inkubuje po dobu 10 minut. Inkubace se s výhodou provádí při pokojové teplotě. Za určitých okolností však může být inkubační teplota zvýšena také až na 70 °C.

2. Po inkubaci se přidá 200 μΐ izopropanolu a jedna tableta MGP (nebo alternativně 200 μΐ suspenze MGP) a inkubuje se po dobu 5 minut při pokojové teplotě.

3. Reakční nádoba se vloží do separátorů magnetických částic (Boehringer Mannheim, kat. č. 1 641 794) a provádí se separace po dobu asi 1 min.

4. Přebytek se odstraní a reakční nádoby se ze separátorů magnetických částic vyjmou.

5. Po přídavku 500 μΐ promývacího pufru se obsah reakční nádoby nádoby promíchá a znovu se na dobu asi 1 min dá do separátorů magnetických částic.

6. Přebytek se odstraní. Krok 5 se třikrát opakuje. Po posledním kroku promytí se zbývající promývací pufr zcela odstraní.

7. Pro eluci se přidá 100 μΐ popřípadě na 70 °C předehřátého elučního pufru. Poté se promíchá a inkubuje se po dobu 5 minut při pokojové teplotě. Vzorek se dá do separátorů magnetických částic a zbytek se převede do čisté reakční nádoby.

8. Takto získané nukleové kyseliny, např. DNA, jsou stabilní a mohou být následně přímo zpracovány nebo uchovávány při 4 °C.

• · · · ·· ·· • · · · · · • · · · · · · ·

Výše uvedený postup je možno příslušným způsobem použít pro mikrotitrační desky, např. hlubokoděrované mikrotitrační desky (např. Rittěr, H.J.Bioanalytic).

3. Důkaz DNA chlamydie trachomates prostřednictvím PCR

3.1, Manuální standardní postup přípravy, vzorku

200 μΐ vzorku močoviny a 240 μΐ vázacího pufru/roztoku proteinázy K (5:1) se napipetuje do 2 ml reakční nádoby, podrobí se vířivému míchání a inkubuje se při 70 °C po dobu 10 minut. Poté se vzorek za 5 minut ochladí na pokojovou teplotu.

Ke vzorku se napipetuje 200 μΐ izopropanolového roztoku MGP. Bezprostředně poté následuje vířivé míchání. Vzorek se poté po dobu 15 min inkubuje v míchačce, např. Thermomischer 5436 (Eppendorf).

MPG se koncentrují převedením vzorku do magnetického separátoru. Po jedné minutě se zbytek zcela odpipetuje.

K MGP se pipetuje 0,5 ml promývacího pufru. Vzorek se podrobí vířivému míchání a poté se převede do magnetického separátoru. Zbytek se odpipetuje po 1 min. Postup promývání se ještě dvakrát opakuje.

K MGP se přidá 200 elučního pufru. Vzorek se inkubuje 10 po dobu 10 min při 70 °C v termomíchačce při 1400 otáčkách za minutu. Kondenzační voda se shromáždí krátkým odstředěním. Vzorek se převede do magnetického separátoru a po 1 minutě se odebere 180 μΐ eluátu. Eluát se pipetuje do nové reakční nádoby a uchovává se při 4 °C (při době uchovávání <24 h) nebo při -

• β · °C (při delších dobách uchovávání).

Pro PCR se použije 50 μΐ eluátu. Vyhodnocení se provádí prostřednictvím elektrochemiluminiscence.

3.2. Postup poloautomatizovaného způsobu

Místo vířivého míchání popsaného v 3.1. a temperování v termostatu se provádí poloautomatizovaný způsob, při kterém při kterém se provádí míchání a temperováni v míchacím a temperovacím modulu. Obr. 4 představuje porovnání stanovení chlamydií (vzorek: 100 elementárních částic protilátky na 100 ml moči; šestinásobné stanovení) mezi manuálním standardním postupem (Vortex) a poloautomatickým postupem (MTM). Je zřejmé, že v automatizací nenastane ovlivnění citlivosti.

3.3, Poloautomatizovaný postup při pokojové teplotě

Příprava vzorku se provádí jak je popsáno v bodě 3.2. Lýza a eluce se však provádí při pokojové teplotě.

3.4. Poloautomatizovaný postup přípravy vzorku při pokojové teplotě s návaznou úpravou eluátu

Příprava vzorku se provádí jak je popsáno v bodě 3.3. Po eluci se provádí inkubace po dobu 10 minut při 70 °C.

Obr. 5 představuje srovnání stanovení chlamydií (vzorky: SWE1: 0 chalmidií - elementárních částic protilátky (EAK, Elementarantikorper) na ml moči, SWE2 : 10 EAK, SWE3 : 100 EAK a SWE4: 1000 EAK vždy na ml moči) mezi postupy přípravy vzorku popsanými v bodech 3.2, 3.3. a 3.4. Je zřejmé, že pro stanovení chlamydií je standardní postup oproti přípravě vzorku při pokojové teplotě (RT-postup MTM) citlivější.

•0 ·* 0· · 0 ·· ·· • 0 · 0 ·«·· • · ···· · · · · • ·· 0 0 · · ·· · • ·· 0 00·· ··· 00 000 « · *·

Výsledky přípravy vzorku při pokojové teplotě a následné úpravě eluátu (RT-postup MTM s úpravou) však ukazují, že tento efekt je možno z větší části kompenzovat. Překvapivě tedy během přípravy vzorku není potřebný žádný teplotní stupeň.

Pomocí tohoto poznatku je možné rozhodujícím způsobem zjednodušit způsob přípravy vzorku, neboř lýza, adsorpce, promývání a eluce se mohou provádět při teplotách < 40 °C, což zjednodušuje automatizaci, neboř není nutné otápění víka a regulace teploty.

4. Důkaz HIV-RNA prostřednictvím PCR

4.1. Manuální standardní postup přípravy vzorku

Zmrazená plazma se rozmrazí při 37 °C a k dalšímu zpracování se ochladí na ledu.

Do l,5ml Sarstedtovy reakční nádoby se pipetuje 50 μΐ roztoku proteinázy K (25 mg/ml). K tomu se přidá 250 μΐ vzorku a míchá se ve Vortexu. Potom se přidá 300 μΐ lýzního pufru a znovu se míchá ve Vortexu.

Inkubuje se po dobu 10 min při pokojové teplotě v míchačce Eppendorf při 13 000 ot/min. Poté se přidá 300 μΐ suspenze MGP (6 mg/ml MGP v izopropanolu) , míchá se ve Vortexu a 2 0 min se inkubuje při pokojové teplotě při pokračujícím míchání. MGP se oddělí na magnetickém separátoru a přebytek se zcela odstraní.

K MGP se přidá 750 μΐ promývacího pufru. MGP se znovu suspenduje a oddělí se jak popsáno výše. Promývací operace se čtyřikrát opakuje, přičemž na konci se promývací pufr pečlivě odstraní.

• ···· ·· ··· ·· ··

Poté se přidá 100 μΐ elučního pufru a MGP se znovu suspenduje. Po 15minutové inkubaci při 80 °C v termomíchačce Eppendorf (13 000 ot/min) se 90 μΐ eluátu převede do nové reakční nádoby. Pro navazující určení HIV prostřednictvím RTPCR se použije 40 μΐ eluátu.

4.2, Poloautomatizovaný standardní postup přípravy vzorku

Příprava vzorku se provádí jak je popsáno v bodě 4.1, s tou výjimkou, že míchání a temperování se provádí na míchacím a temperovacím modulu.

4.3, Poloautomatizovaný postup při pokojové teplotě

Příprava vzorku se provádí v podstatě v bodě 4.2 kromě toho, že všechny kroky pokojové teplotě. Doba inkubace, adsorpce a 15 min.

jak je popsáno se provádí při eluce činí vždy

Z obr. 6 je zřejmé, že použitím automatizace a přípravy vzorku při pokojové teplotě (RT-postup MTM) nenastává žádné zhoršení citlivosti oproti standardnímu postupu při manuální přípravě vzorku (manuální). Reprodukovatelné výsledky byly získány při negativní, nízkopozitivní, středně pozitivní a vysoce pozitivní plazmě.

TV Z&oo9 9 9 · · «··· 19 11

9 9 9 111 1111

9 9 9 19· 9 111

9 19 9 9 1 9 9 9 1

9 11 lilii

991 9999 «· ··· 91 19

Claims (37)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob izolace analyzované nukleové kyseliny z biologického vzorku, zahrnující kroky:

   (a) uzavření vzorku do reakční nádoby, (b) přidání pevné adsorpčni matrice, (c) inkubace za podmínek, při kterých se analyzovaná složka váže na adsorpčni matrici, (d) odstranění nenavázaných podílů vzorku z reakční nádoby, (e) inkubace za podmínek, při kterých se analyzovaná složka eluuje z adsorpčni matrice, a (f) oddělení eluátu od adsorpčni matrice,

   přičemž alespoň kroky (a) až (e) se provádí při v podstatě stejné teplotě, která leží v podstatě v rozmezí od pokojové teploty do 40 °C.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že krok (a) zahrnuje přidání proteázy a denaturačního pufru.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že jako proteáza se použije proteáza K.
4. 4. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se použije denaturační pufr, který obsahuje sůl guanidinu, zejména hydrochlorid guanidinu a/nebo thiokyanát guanidinu.
5. 5. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že jako pevná adsorpčni matrice se použijí magnetické skelné částice.
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že magnetické skelné částice se přidávají ve formě suspenze.

   to · • to *· ···to «· ·« ♦ · ·*« · ·· ♦ • · · »··· «tototo • ♦·«· to·····

   Ol to· · · · · · « · ¹ «··«··* * · * * to to* · ·

   UPRAVENÁ STRANA
7. 7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že se použijí skelné částice, jejichž skelná fáze obsahuje SiO₂, B₂O₃ a Na₂O nebo SiO₂, B₂O₃, Al₂O₃, CaO a K₂0.
8. 8. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že adsorpční matrice se přidává v množství

   nejvýše 0 50 % větším než je množství, potřebné ke kvantitativnímu vázání analyzované složky, vyskytující se ve vzorku. 9. Způsob podle některého z předcházejících nároků,

   vyznačující se tím, že alespoň v průběhu kroků (c), (d) a/nebo (e) se provádí kontinuální nebo intervalové míchání bez použití externích prostředků.
9. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že míchání se provádí otáčením reakční nádoby kolem její podélné osy.
10. 11. Způsob podle nároku 9 nebo 10, vyznačující se tím, že doba provádění kroku (c) a/nebo (e) je vždy maximálně 20 min.
11. 12. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že krok (d) zahrnuje popřípadě vícenásobné přidání a odsání promývacího pufru.
12. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že se použije promývací pufr s obsahem alespoň 50 % obj. organického rozpouštědla mísitelného s vodou.
13. 14. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že v kroku (e) se přidávají přídavná reakční činidla jako například enzymy.
14. 15. Způsob podle některého z předcházejících nároků, • ♦

    UPRAVENA STRANA vyznačující se tím, že v kroku (e) se k eluci použije nízkosolný pufr.
15. 16. Způsob podle některého z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že v kroku (e) se pro eluci použije přidá zesilovací předsměs pro nukleové kyseliny.
16. 17. Způsob podle některého z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že teplota je 18 °C až 32 °C.
17. 18. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že po kroku (f) se provádí krok dodatečné úpravy při zvýšené teplotě.
18. 19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že zvýšená teplota je v rozmezí od více něž 40 °C do 95 °C.
19. 20. Způsob izolace analyzované nukleové kyseliny z biologického vzorku, zahrnující kroky:

    (a) uzavření vzorku do reakční nádoby, (b) přidání pevné adsorpční matrice, (c) inkubace za podmínek, při kterých se analyzovaná složka váže na adsorpční matrici, (d) oddělení nenavázaných podílů vzorku od adsorpční matrice, (e) inkubace za podmínek, při kterých se analyzovaná složka eluuje z adsorpční matrice, a (f) oddělení eluátu od adsorpční matrice, přičemž alespoň kroky (a) až (e) se provádí při v podstatě stejné teplotě, která je v rozmezí od pokojové teploty do 40 °C.
20. 21. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se provádí v automatizovaném zařízení.

    «· • ·· »♦ ♦ · » · • · ♦ · » ♦ « • · ***** • · · » ♦ « m · · · » ·

    25 ··» ···♦ ·· ·♦· ·* *·

    UPRAVENÁ STRANA
21. 22. Způsob podle nároku 1 nebo 21, vyznačující se tím, že kroky (a) až (e) se provádí v jediné reakční nádobě.
22. 23. Reagenční souprava pro izolaci analyzované nukleové kyseliny, zejména pro provádění způsobu podle jednoho z nároků 1 až 22, obsahující (a) proteázu, (b) pufr pro rozklad vzorku, (c) promývací pufr, (d) eluční pufr, a (e) suspenzi magnetických skelných částic.
23. 24. Reagenční souprava pro izolaci DNA, obsahující magnetické skelné částice, jejichž skelná fáze obsahuje SiO₂, Β₂θ3 3 Na₂O.
24. 25. Reagenční souprava pro izolaci RNA, obsahující magnetické skelné částice, jejichž skelná fáze obsahuje SiO₂, B₂C>3, Al₂O3 , CaO a K₂0.
25. 26. Zařízení pro izolaci analyzovaných nukleových kyselin z biologického vzorku, obsahující kondicionér (1) vzorku, úložné zařízení pro reagencie (2) , první úložné zařízení pro reakční nádoby pro přípravu vzorku (3), které je upraveno pro provozní teplotu <40 °C, druhé úložné zařízení pro reakční nádoby (4a, 4b, 4c) , které popřípadě obsahuje chladící a/nebo ohřívací prostředek, a robotický přístroj (5).
26. 27. Zařízení podle nároku 26, vyznačující se tím, že je uspořádána jediná reakční nádoba pro rozklad vzorku, pro adsorpci analyzované složky na pevné adsorpční matrici, pro • * • · • · • · » ···· ·* ···« » -

    UPRAVENA STRANA promývání adsorpční matrice a pro eluci analyzované složky z adsorpční matrice.
27. 28. Zařízení podle nároku 26 nebo 27, vyznačující se tím, že první úložné zařízení je uspořádáno pro uložení reakčních nádob pro přípravu vzorku alespoň pro adsorpcí analyzované složky na pevné adsorpční matrici a pro promývání adsorpční matrice.
28. 29. Zařízení podle nároku 28, vyznačující se tím, že první úložné zařízení je uspořádáno dále pro uložení reakčních nádob pro přípravu vzorku pro rozklad vzorku a/nebo pro eluci analyzovazých složek z adsorpční matrice.
29. 30. Zařízení podle některého z nároků 26 až 29, vyznačující se tím, že druhé úložné zařízení je uspořádáno pro uložení reakčních nádob pro uchovávání a/nebo další zpracování analyzované složky.
30. 31. Zařízení podle některého z nároků 26 až 30, vyznačující se tím, že druhé úložné zařízení je uspořádáno pro uložení nádob pro reagencie pro další zpracování vzorku.
31. 32. Zařízení podle některého z nároků 26 až 31, vyznačující se tím, že druhé úložné zařízení je uspořádáno pro uložení reakčních nádob pro alespoň jeden zpracovací krok při zvýšené teplotě, zvolený z rozkladu vzorku, eluce vzorku z adsorpční matrice a kroku dodatečné úpravy po eluci.
32. 33. Zařízení podle některého z nároků 26 až 32, vyznačující se tím, že první úložné zařízení obsahuje prostředek pro magnetickou separaci.
33. 34. Zařízení podle některého z nároků 26 až 33, • ·

    0» ♦ · · · · ♦ <

    • · 044 4 «0 1 • * · 000 0« <

    • ♦ 4 0 0 0 1

    UPRAVENA STRANA vyznačující se tím, že první úložné zařízení obsahuje prostředek pro míchání reakčních nádob otáčením kolem podélné osy.
34. 35. Zařízení podle některého z nároků 26 až 34, vyznačující se tím, že robotický přístroj obsahuje automatické pipetovací zařízení a popřípadě prostředek pro otevírání a uzavírání reakčních nádob.
35. 36. Zařízení podle některého z nároků 26 až 35, vyznačující se tím, že robotický přístroj obsahuje prostředek pro dopravu reakčních nádob mezi prvním a druhým úložným zařízením.
36. 37. Magnetická skelná částice obsahující magnetické jádro a skelnou obálku, která obsahuje SiO₂, B₂O₃, oxid alkalického kovu a popřípadě Al₂O₃ a oxid kovu alkalických zemin.
37. 38. Skelná částice podle nároku 37, vyznačující se tím, že skelná obálka obsahuje SiO₂, B₂O₃ a Na₂O nebo SiO₂, B₂O₃, Al₂O₃, K₂0 a CaO.