PT100515B - Moleculas de acido nucleico, precursores de antigenios de rejeicao de tumores, antigenios da rejeicao de tumores e suas utilizacoes - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito a uma sequência de DNA isolada que codifica um antigénio expresso por células tumorais que é reconhecido pelas células T citotóxicas, conduzindo à lise do tumor que o expressa. São também descritas células transfectadas pela sequência de DNA e várias utilizações terapêuticas e de diagnóstico derivadas das propriedades do DNA e do antigénio que ele codifica.

Este pedido de patente é uma continuação em parte do Número de Série 807,043, apresentado em 12 de Dezembro, 1991, o qual é uma continuação em parte do Número de Série 764,364, apresentado em 23 de Setembro, 1991, o qual é uma continuação em parte do Número de Série 728,838, apresentado em 9 de Julho, 1991, o qual é uma continuação em parte do Número de Série 705,702, apresentado em 23 de Maio de 1991 e agora abandonados.

CAMPO DO INVENTO

Este invento está relacionado em geral com o campo da imunogenética aplicado ao estudo da oncologia. Mais especificamente, ele está relacionado com o estudo e análise de mecanismos pelos quais os tumores são reconhecidos pelo sistema imune do hospedeiro como seja através da apresentação dos chamados antigénios da rejeição de tumores e expressão do que será aqui referido como precursores do antigénio de rejeição de tumores.

FUNDAMENTO E TRABALHOS ANTERIORES

O estudo do reconhecimento ou ausência de reconhecimento de células cancerosas por um organismo hospedeiro tem decorrido em muitas direcções diferentes.

A compreensão do campo presume algum conhecimento de imunologia e oncologia básicas.

Os primeiros trabalhos com tumores de murganhos revela) ram que estes apresentavam moléculas que conduziam à rejeição de células tumorais quando transplantados para animais singeneicos. Estas moléculas são reconhecidas por células T no animal recipiente e provocam uma resposta citolítica pelas células T com lise das células transplantadas. Esta evidência foi primeiro i

obtida com tumores induzidos in vitro por càfcínògénios, tais como metilcolantreno. Encontrou-se que os antigénios expressos pelos tumores e que induzem a resposta pelas células T são diferentes para cada um dos tumores. Ver Prehn, et al., J. Natl. Canc. Inst. 18: 769-778 (1957); Klein et al., Câncer Res.

20: 1561-1572 (1960); Gross, Câncer Res. 3: 326-333 (1943),

Basombrio, Câncer Res. 30: 2458-2462 (1970) para ensinamentos gerais sobre a indução de tumores com carcinogénios químicos e diferenças nos antigénios de superfície celular. Esta classe de antigénios tornou-se conhecida como antigénios de transplante específicos de tumores ou TSTAs. Após a observação da apresentação de tais antigénios quando induzidos por carcinogénios químicos, resultados semelhantes foram obtidos quando tumores foram induzidos in vitro via radiação ultravioleta. Ver Kripke, J.Natl. Canc. Inst. 53: 333-1336 (1974).

Se bem que as respostas imunes mediadas por células T fossem observadas para os tipos de tumores descritos supra, pensava-se que os tumores espontâneos de um modo geral não fossem imunogénicos. Pensava-se pois que estes não apresentavam antigénios que provocassem uma resposta ao tumor no indíviduo portador do tumor. Ver Hewitt, et al., Brit. J. Câncer 33: 241-259 (1976).

A família de linhas celulares apresentadoras do antigénio tum são variantes imunogénicas obtidas por mutagénese das células tumorais ou linhas celulares, como descrito por Boon et al., J. Exp. Med. 152: 1184-1193 (1980), a divulgação do qual é aqui incluido como referência. Para trabalhar, os antigénios tmu são obtidos por mutação de células tumorais que não dão origem a uma resposta imune em murganhos singeneicos e formam tumores (i.e., células tum⁺). Quando estas células tum⁺ são mutagenizadas, elas são rejeitadas por murganhos singeneicos e não formam tumores (portanto tum ). Ver Boon et al., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 74: 272 (1977), a divulgação do qual é aqui incluido como referência. Encontrou-se que muitos tipos de tumores apresentam este fenómeno. Ver, e.g. Frost et al., Câncer Res. 43: 125 (1983).

Parece que as variantes tum não formam tumores progressivos pois induzem um processo de rejeição imune. A evidência em favor desta hipótese inclui a capacidade das variantes tum”·' dos tumores, i.e., as que normalmente não formam tumores, para o fazerem em murganhos com sistema imune suprimido por irradiação subletal, Van Pel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:5282-5285 (1979); e a observação de que as células tum injectadas intraperitonealmente do mastocitoma P815 se multiplicam exponecialmente durante 12-15 dias e em seguida são eliminadas apenas em alguns poucos diasno meio de um influxo de linfócitos e macrófagos (Uyttenhove et al., J. Exp. Med. 152: 1175-1183 (1980)). Outra evidência inclui a observação de que os murganhos adquirem uma memória imune que lhes permite resistirem a subsequente desafio à mesma variante tum⁺, mesmo quando as quantidades imuno-supressoras de radiação são administradas com o desafio seguinte de células (Boon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:272-275 (1977); Van Pel et al., supra; Uyttenhove et al., supra).

Trabalhos de investigação posteriores demonstraram que quando so tumores espontâneos eram sujeitos a mutagénese, eram produzidas variantes imunogénicas que deram origem a uma resposta. De facto estas variantes foram capazes de induzir uma resposta imune protectora contra o antigénio tumoral. Ver Van Pel et al., J. Exp. Med. 157:1991-2001 (1983). Assim, mostrou-se que é possível induzir a apresentação de um chamado antigénio de rejeição de tumores num tumor que é um alvo para uma rejeição singeneica. Resultados semelhantes foram obtidos quando genes estranhos foram transfectados em tumores espontâneos. Ver Fearson et al., Câncer Res. 48: 2975-1980 (1988) relacionado com isto.

Foi encontrada uma classe de antigénios que são apresentados na superfície de células tumorais e que são reconhecidos por células T citotóxuicas, conduzindo à lise. Esta classe de antigénios será referida como antigénios de rejeição de tumores ou daqui em diante TRAs. Os TRAs podem ou não induzir respostas de anticorpos. 0 nível em que estes antigénios foram estudados, foi via estudos de caracterização de células T citolíticas, in vitro i.e., o estudo da identificação do antigénio por uma subsérie de células T citolíticas particulares (CTL daqui em diante). A subsérie prolifera quando do reconhecimento do antigénio de rejeição tumorál apresentado e as células que apresentem o antigénio são lisadas. Os estudos de caracterização identificaram clones CTL que lisam especificamente as células que expressem os antigénios. Exemplos deste trabalho podem ser encontrados em Levy et al., Adv. Câncer Res. 24: 1-59 (1977); Boon et al-, J. Exp.

Med. 152:1184-1193 (1980); Brunner et al., J. Immunol. 124:

1627-1634 (1980); Maryanski

Eur.

J. Immunol.

124:1627-1634 (1980); Maryanski et al.,

Eur. J. Immunol. 12: 406-412 (1982); Palladino et al., Canc. Res. 47: 5074-5079 (1987). Este tipo de análise é necessário para outros tipos de antigénios reconhecidos por CTLs, incluindo antigénios de histocompatibilidade minor, os antigénios H-Y específicos de machos e uma classe dde antigénios, referidos como antigénios tum e aqui discutidos .

Um exemplo de tumor da matéria descrita supra é conhecido como P815. Ver DePlaen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2274-2278 (1988); Szikora et al., EMBO J. 9: 1041-1050 (1990) e Sibille et al., J. Exp. Med. 172: 35-45 (1990), as divulgações dos quais são aqui incluídas como referência. 0 tumor P815 é um

mastoeitoma, induzido num muragnho DBA/2 com metilcolantreno e cultivado como um tumor in vitro e como linha celular. A linha P815 gerou muitos variantes tum após mutagénese, incluindo variantes referidas como P91A (DePlaen, supra), 35B (Szikora, supra) e P198 (Sibiile, supra). Pelo contrário os antigénios de rejeição de tumores - e isto é uma distinção chave - os antigénios tum” estão apenas presentes após as células tumorais serem mutagenizadas. Os antigénios de rejeição de tumores estão presentes em células de um dado tumor sem mutagénese. Portanto, com referência à literatura, uma linha celular pode ser tum⁺, como seja a linha referida como Pl e pode provocar a produção de variantes tum . Uma vez que o fenótipo tum difere do da linha de células parentais, espera-se uma diferença no DNA das linhas celulares tum” comparado com as linhas parentais tum⁺ e esta diferença pode ser explorada para localizar o gene de interesse em células tum”. Como resultado disto encontrou-se que genes das variantes tum tais como P91A, 35B e P198 diferem dos seus alelos normais por mutações pontuais nas regiões codificadoras do gene. Ver Szikora e Sibiile, supra e Lurquin et al., Cell 58: 293-303 (1989). Isto não acontece com os TRAs deste invento. Estes artigos também demonstraram que os peptídeos derivados do antigénio tum são apresentados pela molécula L para o reconhecimento d d d por CTLs. P91A é apresentado por L , P35 por D e P198 por K .

Encontrou-se agora que os genes que codificam as moléculas processadas para apresentação de antigénios de rejeição tumores (referidos como precursores do s antigénios de rejeição de tumores, moléculas precursoras ou TRAPs daqui em diante), não são expressos na maior parte dos tecidos normais adultos mas são expressos em células tumorais. Os genes que codificam os TRAPs foram agora isolados e clonados e representam uma fracção do invento aqui descrito.

gene é útil como fonte para o precursor de antigénios de rejeição de rejeição de tumores purificados e isolados e para os próprios TRA, gualguer um deles podendo ser usados como agente para o tratamento de cancro para o qual o antigénio é uma marca , assim como em várias abordagens de diagnóstico e sobrevivência em oncologia, discutido infra. Sabe-se, por exemplo, que as células tum^- podem ser usadas para gerar CTLs que lisam células apresentando diferentes antigénios tum assim como células tum⁺. Ver, e.g., Maryanski et al., Eur. J. Immunol. 12: 401 (1982); e Van den Eynde et al., Modern Trends in Leukemia IX (Junho 1990), as descrições dos quais são aqui incluídas como referência. 0 precursor do antigénio da rejeição de tumores pode ser expresso em células transfectadas pelo gene e depois usados para gerar uma resposta imune contra um tumor de interesse.

No caso paralelo de neoplasmas humanos, observou-se que culturas de células mistas autólogas de linfócitos-tumor (MLTC daqui em diante) frequentemente dão origem a linfócitos responsivos que lisam células tumorais autólogas e não lisam os alvos das células assassinas, células B autólogas transformadas por EBV ou fibroblastos autólogos (ver Anichini et al., Immunol. Today: 385-389 (1987)). Esta resposta foi particularmente bem estudada para melanomas e MLTC foi observado com células do sangue periférico ou com linfócitos infiltrantes de tumores. Exemplos da literatura nesta área incluem Knuth et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2804-2802 (1984); Mukherji et al., J. Exp. Med. 158: 240 (1983); Hérin et al., Int. J. Canc. 39: 390-396 (1987); Topalian et al., J. Clin. Oncol. 6: 839-853 (1988). Clones estáveis de células T citotóxicas (CTLs daqui em diante) foram obtidos a partir de células responsivas MLTC e estes clones são específicos para células tumorais. Ver Mukherji et al., supra. Hérin et al., supra. Knuth et al., supra. Os antigénios reconhecidos nas células tumorais por estes CTLs autólogos não parecem

representar um artefacto da cultura, uma vez que eles são encontrados em células tumorais. Topalian et al., supra: Degiovanni et al., Eur. J. Immunol. 20: 1865-1868 (1990). Estas observações, acopladas ãs técnicas usadas aqui para isolar os genes específicos de precursores de antigénios de rejeição de tumores murinos, conduziram ao isolamento de sequências de ãcido nucleico codificadoras dos precursores de antigénios da rejeição de tumores ou TRAs presentes em tumores humanos. Ê agora possível isolar as sequências de ácido nucleico que codificam precursores de antigénios da rejeição de tumores, incluindo, mas não estando limitado às mais características de um tumor particular, com ramificações que estão descritas infra. Estas sequências de ácidos nucleicos isoladas codificadoras dos precursores de antigénios de rejeição de tumores e suas aplicações, como descrito infra são também tema deste invento.

Estes e outros aspectos do invento são descritos na divulgação que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 descreve a detecção dos transfectantes expressando o antigénio P815A.

Figura 2 mostra a sensibilidade dos clones Pl.HTR, PO.HTR, transfectante genómico P1A.T2 e transfectante de cosmídeo P1A.TC3.1 à lise por várias CTLs, conforme determinado por ensaios de libertação de crómio.

Figura 3 é um mapa de restrição do cosmídeo CIA.3.1.

Figura 4 mostra a análise de Transferência Northern da expressão do gene PIA.

A Figura 5 estabelece a estrutura- do.gene PIA com s seus sítios de restrição.

Figura 6 mostra os resultados obtidos quando células foram transfectadas com o gene derivado de PIA, isolado a partir de células P815 ou de células normais e depois testado com lise por CTL.

Figura 7 mostra estudos líticos usando a linha celular de mastócitos L138.8A.

Figura 8 é um mapa de subfragmentos da sequência do fragmento E de 2,4 Kb do antigénio que também expressa o fragmento.

Figura 9 mostra homologia de secções do exão 3 dos genes mage 1, 2 e 3.

Figura 10 mostra o resultado de transferências Northern para genes MAGE em vários tecidos.

Figura 11 apresenta os dados da Figura 13 na forma de tabela.

Figura 12 mostra as experiências de transferência Southern usando as várias linhas celulares de melanoma humano empregues neste pedido de patente.

A Figura 13 é um esquema geral da expressão de genes MAGE 1, 2 e 3 por tecidos tumorais e normais.

BREVE DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIAS

SEQ ID NO: lê cDNA para parte do gene PIA.

SEQ ID NO: 2 apresenta a região codificadora de cDNA para o gene PIA.

ι

SEQ ID NO: 3 mostra DNA não codificador de cDNA de PIA que está 3' relativamente à região codificadora de SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 4 é toda a sequência de cDNA para PIA.

SEQ ID NO: 5 é a sequência de DNA genómico para PIA.

SEQ ID NO: 6 mostra a sequência de aminoácidos para os peptídeos antigénicos para PIA TRA. A sequência é para células que são A⁺B⁺, i.e. expressam tanto os antigénios A como B.

SEQ ID NO: 7 é uma sequência de ácido nucleico codificadora do antigénio E.

SEQ ID NO: 8 é uma sequência de ácido nucleico codificadora de MAGE1.

SEQ	ID	NO:	9 ι	é c	• gene para MAGE-2.
SEQ	ID	NO:	10	é	o gene para MAGE-21.
SEQ	ID	NO:	11	θ	cDNA para MAGE-3.
SEQ	ID	NO:	12	é	o gene para MAGE-31.

SEQ ID NO: 13 é o gene para MAGE-4.

X

SEQ	ID	NO:	14
SEQ	ID	NO:	15
SEQ	ID	NO:	16
SEQ	ID	NO:	17
SEQ	ID	NO:	18
SEQ	ID	NO:	19
SEQ	ID	NO:	20
SEQ	ID	NO:	21
SEQ	ID	NO:	22
SEQ	ID	NO:	23
SEQ	ID	NO:	24
SEQ	ID	NO:	25

o gene para MAGE-41 e

é cDNA para MAGE-4.

é cDNA para MAGE-5

DNA genómico para é

cDNA para MAGE-6

DNA é

DNA é

DNA é

DNA

DNA e

é

DNA

DNA e

4* e e

MAGE-51 genómico genómico genómico genómico genómico genómico genómico

para	MAGE-7.
para	MAGE-8.
para	MAGE-9.
para	MAGE-10.
para	MAGE-11.
para	smage-I.
para	smage-II.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE REALIZAÇÕES PREFERIDAS

Foram identificados muitos genes MAGE diferentes como se verá a partir das sequências que se seguem ao pedido. Os protocolos descritos nos exemplos que se seguem foram usados para isolar estes genes e sequências de cDNA.

MAGE como aqui é usado refere-se a uma sequência de ácido nucleico isolada a partir de células humanas. 0 acrónimo smage” é usado para descrever sequências de origem murina.

Quando são agui discutidos TRAP ou TRAs como sendo ι específico de um tipo de tumor, isto significa que a molécula em consideração está associada àquele tipo de tumor, se bem que não exclua necessariamente outros tipos de tumores.

EXEMPLO 1 )

Para identificar e isolar o gene codificador do antigénio P815A, usou-se a transfecção de genes. Esta abordagem requere uma fonte do gene e uma linha celular recipiente.A linha celular altamente transfectável Pl.HTR foi o material de partida como recipiente, mas não pode ser usada sem mais tratamento uma vez que apresenta o antigénio A, um dos quatro antiqénios tumorais de P815 reconhecidos. Ver Van Pel et al., Molecular Genetics 11: 467-475 (1985)· Assim, realizaram-se experiências de despiste para isolar linhas celulares que não expressam o antigénio e que possuem qualidades desejáveis de Pl.HTR.

Para fazer isto, Pl.HTR foi despistado com CTLs que ) eram específicas para cada um dos antígénios de tumores A, B, Ce

D. Tais CTLs foram descritos por Uyttenhove et al., J. Exp. Med. 157: 1040-1052 (1983).

g

Para fazer a selecção, 10 células Pl.HTR foram mistu* radas com 2-4 χ 10⁶ células do clone CTL num tubo de fundo redondo em 2 μΐ de meio e centrifugadas durante três minutos a 150xg. Após quatro horas a 37°C, as células foram colhidas e ressuspensas em 10 μΐ de meio, segundo Maryanski et al., Eur. J. Immunol. 12: 406-412 (1982). Outra informação sobre o ensaio CTL

e protocolo de despiste em geral, pode ser encontrado em Boon et al., J. Exp. Med. 152: 1184-1193 (1980) e Maryanski et al., Eur. J. Immunol. 12:406-412 (1982), a divulgação dos quais são aqui incluídos como referência.

Quando estas selecções foram realizadas, encontrou-se uma variante da linha celular que não expressava nem o antigénio A nem o B. Selecções adicionais com CTLs específicos do antigénio E deram então uma variante que também não possuia o antigénio C. Ver por favor a figura 2 para um resumo dos resultados destes despistes. A variante PO.HTR é negativa para os antigénios A, B, e C e foi portanto escolhida para as experiências de transfecção.

A linha celular PO.HTR foi depositada de acordo com o Tratado de Budapeste na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes do Instituto Pasteur, 28, Rue de Docteur Roux, 75724 Paris França e tem o número de acesso 1-1117.

Esta metodologia é adaptável a outras linhas celulares que sejam variantes de um tipo celular que normalmente apresenta um dos quatro antigénios tumorais de P815 reconhecidos, antigénios A, B, C e D, onde as variantes não apresentam qualquer um dos antigénios A, B ou C. Pl.HTR é uma linha celular de mastocitoma, portanto como se poderá ver o protocolo permite o isolamento de linhas celulares de mastocitoma biologicamente puras que não expressam qualquer um dos antigénios A, B ou C de P815, mas que são altamente transfectáveis. Podem ser igualmente despistados outros tipos de tumores da mesma forma para assegurar linhas celulares biologicamente puras. As linhas celulares resultantes devenm ser pelo menos transfectáveis com DNA estranho como é o caso de Pl.HTR e deverão ser seleccionados de forma a não expressarem um antigénio específico.

EXEMPLO 2

Trabalho anterior descrito por DePlaen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2274-2278 (1988) a divulgação do qual é aqui incluido como referência mostrou a eficácia da utilização da transfecção de uma biblioteca de cosmídeos para recuperar genes codificadores de antigénios tum .

plasmídeo selectivo e DNA genómico de Pl.HTR foram preparados, segundo Wolfel et al., Immunogenetics 26: 178-187 (1987). 0 processo de transfecção segundo Corsaro et al., Somatic Cell Molec. Genet 7: 603-616 (1981) com alguma modificação.

Resumidamente, 60 μg de DNA celular e 3 ^g de DNA do plasmídeo pHMR272, descrito por Bernard et al., Exp. Cell. Biol. 158: 237-243 (1985) foram misturados. Este plasmídeo confere resistência à higromicina a células recipientes e portanto proporciona uma forma conveniente de despiste dos transfectantes. 0 DNA misturado foi combinado com 940 μΐ de 1 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA; e 310 μΐ 1M CaCl₂. A solução foi adicionada lentamente e com agitação constante a 1,25 ml de Hepes 50 mM, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na₂HPO₄, ajustado a pH 7,1 com NaOH. Os precipitados de fosfato de cálcio - DNA ficaram a formar-se durante 30-45 minutos ã temperatura ambiente. Após isto, quinze grupos de células PO.HTR (5 x 10 ) por grupo foram centrifugadas durante 10 minutos a 400 g. Os sobrenadantes foram removidos e os sedimentos foram ressuspensos directamente no meio contendo os precipitados de DNA. Esta mistura foi incubada durante 20 minutos a 37°C, após o . 2 que foi adicionado a um frasco de cultura de tecidos de 80 cm contendo 22,5 ml de DMEM, suplementado com 10% de soro fetal. Após 24 horas o meio foi substituído. Quarente e oito horas após transfecção, as células foram colhidas e contadas. As células transfectadas foram seleccionadas em cultura em massa usando meio

de cultura suplementado com higromicina B (350 /xg/ml) Este tratamento seleccionou células pela resistência à higromicina.

Para cada grupo preparam-se dois frascos, cada um g contendo 8 x 10 células em 40 ml de meio. Para calcular o número g de transfectantes, 1 x 10 células de cada grupo foram sememadas em 5 ml de DMEM com 10% de soro fetal (FCS), 0,4% de bactoagar e 300 Mg/ml de higromicina B. As colónias foram então contadas 12 dias mais tarde. Fizeram-se duas determinações independentes e feita a média. Isto foi multiplicado por 5 para calcular o número de transfectantes no grupo correspondente. Teve-se de fazer correcção para a eficácia de clonagem de células P815, que se sabe ser cerca de 0,3.

EXEMPLO 3

Oito dias após transfecção como descrito no exemplo 2 supra, os transfectantes resistentes ao antibiótico foram separados das células mortas, usando centrifugação de densidade com Ficoll-Paque. Estas células foram mantidas em meio não selectivo durante 1 ou 2 dias. As células foram semeadas em microplacas de 96 cavidades (fundo redondo), a 30 células/microcavidade em 200 μΐ de meio de cultura. Preparam-se 100-400 microcavidades dependendo do número de transfectantes preparados. Os testes de colónias em agar deram cálculos de 500-3000. Após 5 dias,as , 4 cavidades continham cerca de 6 x 10 células e pias réplicas foram preparadas transferindo 1/10 das cavidades para microplacas que foram então incubadas a 30°C. Um dia mais tarde as placas mãe foram centrifugadas, o meio removido e 750 CTLs contra o antigénio A de P815 (CTL-P1:5) foram adicionados a cada uma das cavidades juntamente com 10 células do baço singeneicas em meio de cultura de CTL contendo 40 U/ml de IL-2 recombinante e meio HAT para matar as células estimuladoras.

Seis dias mais tarde, as placas foram examinadas para identificar cavidades onde proliferaram CTLs. Sempre que as placas apresentavam microculturas em proliferação, amostras de 100 μΐ das cavidades foram transferidas para uma placa contendo células alvo 51 3 3 .

Pl.HTR marcadas com Cr (2x10 - 4x10 por cavidade) e a libertação de crómio foi medida após 4 horas. Réplicas de microculturas correspondendo às que apresentam actividade elevada de CTL foram expandidas e clonadas por diluição limite em DMEM com 10% FCS. Cinco dias mais tarde, cerca de 200 clones foram colhidos e despistados com a linha celular CTL.P1:5, descrita supra, num ensaio de lise visual. Ver figura IA para estes resultados.

Nestas experiências, três dos quinze grupos de transfectantes deram algumas microculturas positivas. Estas microculturas foram testadas quanto à actividade lítica contra Pl.HTR, como descrito supra. A maior parte das microculturas onde foi observada microproliferação apresentaram actividade lítica. Esta actividade estava bem acima do fundo, como se mostra na figura 1B. Esta figura sumariza os dados em que dois grupos de células (grupos ”5 e 14), 400 e 300 microcavidades foram semeadas com 30 células transfectadas resistentes à higromicina. A amplificação e duplicação das microculturas foram seguidas da adição de CTL Pl:5 anti-A. Seis dias mais tarde, foi testada a actividade lítica contra Pl.HTR. Na figura, cada ponto representa a actividade lítica de uma microcultura isolada.

Microculturas em duplicado correspondendo a várias cavidades positivas foram subclonadas e mais de 1% dos subclones foram lisados por CTL anti-A. Assim, três transfectantes independentes expressando P815A foram obtidas a partir de 33000 transfectantes resistentes à higromicina. Uma destas linhas, referida daqui em diante como P1A.T2 foi posteriormente testada.

perfil de antigénio importante de P1A.T2 está apresentado na figura 2, este sendo obtido via ensaios anti-CTL do tipo descrito supra.

EXEMPLO 4

Os ensaios de CTL realizados para P1A.T2 demonstraram que apresentava o antigénio A (P815A) e portanto receberam o gene de Pl.HTR. Com aquela finalidade esta linha celular foi usada como fonte do gene para o precursor do antigénio nas experiências seguintes.

Trabalhos anteriores mostraram que genes codificadores dps antigénios tum podiam ser recuperados directamente a partir de transfectantes obtidos com uma biblioteca de cosmídeo. Ver Deplaen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2274-2278 (1988). Este processo foi seguido para a recuperação do gene P815.

DNA genómico total de P1A.T2 foi parcialmente digerido com a endonuclease de restrição Sau 3A1 e fraccionado por ultracentrifugação em gradiente densidade de NaCl para enriquecer em fragmentos de DNA de 35-50 Kb, segundo Grosveld et al., Gene 10:6715-6732 (1982). Estes fragmentos foram ligados aos braços do cosmídeo de C2RB, descrito por Bates et al., Gene 26: 137-146 (1983) , a divulgação do qual é aqui incluído como referência. Estes braços de cosmídeos foram obtidos por clivagem com Smal e tratamento com fosfatase de intestino de vitela, seguido de digestão com BamHI. 0 DNA ligado foi encapsidado nos componentes do fago lambda e titulado em E. coli ED 8767, seguindo Grosveld et al., supra. Aproximadamente 9x10 colónias resistentes à ampicilina foram obtidas por micrograma de inserção de DNA.

Os grupos de cosmídeos foram amplificados misturando 30000 cosmídeos independentes com 2 ml de ED 8767 em 10 mM MgC^, incubados 20 minutos a 37°C, diluído com 20 ml de meio Luria Bertani (LB), seguido de incubação durante uma hora. Esta suspensão foi titulada e usada para inocular 1 litro de meio LB na presença de ampicilina (50 gg/ml). A uma concentração de 8 bactérias de 2x10 células/ml (OD_g00=0,8), uma amostra de 10 ml foi congelada e 200 Mg/ml de cloranfenicol foi adicionado ã cultura para incubação durante a noite. DNA total de cosmídeo foi isolado pelo processo de lise alcalina e purificado em gradiente de cloreto de césio.

Nestas experiências preparou-se uma biblioteca de 650000 cosmídeos. O protocolo de amplificação envolveu o uso de 21 grupos de aproximadamente 30000 cosmídeos.

EXEMPLO 5

Usando os vinte um grupos de cosmídeos referidos atrás, g (60 /xg) e 4 pg de pHMR272, descrito supra, grupos de 5x10 células PO.HTR foram usados como hospedeiros transfectantes. A transfecção foi realizada da mesma forma que a descrita em experiências anteriores. Uma média de 3000 transfectantes por grupo foram testados quanto à apresentação de antigénio, novamente usando ensaios de CTL como descrito. Um grupo de cosmídeos repetidamente deu transfectantes positivos com uma frequência de cerca de 1/5000 transfectantes resistentes à droga. Os transfectantes, tal como P1A.T2 também apresentaram expressão tanto do

I antigénio A como do antigénio B. 0 padrão de expressão do transfectante P1A.TC3.1 está apresentado na Figura 2.

EXEMPLO 6

Conforme indicado no Exemplo 5, supra, foram isoladas três células independentes transfectadas com cosmídeos apresentando o antigénio P815A. 0 DNA destes transfectantes foi isolado e empacotado directamente com extractos do fago lambda, segundo DePlaen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2274-2278 (1988). 0 produto resultante foi titulado em E. coli ED 8767 com selecção à ampicilina, como no Exemplo 5. De forma semelhante, a amplificação dos cosmídeos e transfecção seguidas no Exemplo 5, novamente usando PO.HTR.

TABELA 1. Transferência do antigénio de expressão P815A por cosmídeos obtidos por encapsidação directa.

Transfectante obtido com a biblioteca de cosmídeos	N2 de cosmídeos obtidos por encapsidação directa de 0,5 Gg de DNA	N2 de transfectantes expressando P815A/n2 de transfectantes HmBr
TC3.1	32	87/192
TC3.2	32000	49/384
TC3.3	44	25/72

Os cosmídeos foram analisados com enzimas de restrição e encontrou-se que o transfectante de encapsidação directa P1A.TC3.1 continha 32 cosmídeos, 7 dos quais eram diferentes. Cada um destes 7 cosmídeos foram transfectados para PO.HTR como descrito supra, e novamente, seguindo os protocolos descritos atrás, os transfectantes foram estudados quanto à apresentação de P815A. Quatro dos transfectantes com cosmídeos mostraram apresentação de P815A e tal como em todas as experiências até aqui descritas, P814B foi coexpresso.

Dos quatro cosmídeos mostrando apresentação dos dois antigénios, o cosmídeoClA.3.1 tinha apenas 16,7 kilobases decomprimento e foi seleccionado para posterior análise como descrito infra.

cosmídeo CIA.3.1 foi sujeito a análise com endonucleases de restrição, dando o mapa apresentado na Figura 3.

Todos os fragmentos EcoRI foram transfectados, novamente usando os protocolos atrás descritos e apenas o fragmento de

7,4 kilobases produziu um transfectante que CTLs anti-A podiam lisar. Experiências semelhantes foram realizadas com os fragmentos PstI e apenas um fragmento de 4,1 Kb estava contido na sua totalidade dentro do fragmento EcoRI de 7,4 Kb produziu transfectantes lisáveis.

Este fragmento (i.e., o fragmento PstI) foi digerido com Smal, dando um fragmento de 2,3 Kb que também deu células hospedeiras apresentadoras dos antigénios A e B após transfecção. Finalmente, um fragmento de 900 bases de comprimento, delimitado por Smal/Xbal, também transferiu a expressão dos precursores destes dois antigénios, i.e. a célula hospedeira transfectada apresentou tanto o antigénio A como o antigénio B.

EXEMPLO 7 fragmento de 900 bases descrito atrás foi usado como sonda na linha celular parental Pl.HTR. Para conseguir isto, RNA celular total foi primeiro isolado usando o processo de guanidina-isotiocianato de Davies et al., Basic Methods In Molecular Bioloqy (Elseview Science Publishing Co, New York) (1986). A mesma referência foi a fonte do método usado para isolar e purificar mRNA poliA⁺ usando cromatografia em coluna de oligodT celulose.

As amostras foram então sujeitas a análise de transferências Northern. Amostras de RNA foram fraccionadas em géis de 1% de agarose contendo formaldeído 0,66M. Os géis foram tratados com 10XSSC (SSC: 0,15M NaCl; citrato de sódio 0,115M, pH 7,0) durante 30 minutos antes de transferência durante a noite para membranas de nitrocelulose. Estas foram incubadas durante duas horas a 80°C, após o que as membranas foram pré-hibridadas durante 15 minutos a 60 °C numa solução contendo 10% de dextran-sulfato, 1% SDS e 1M NaCl. A hibridação foi então realizada usando sonda desnaturada (o fragmento de 900 bases), juntamente com 100 Mg/ml de DNA de esperma de salmão.

Quando este protocolo foi realizado usando RNA poliA⁺ de Pl.HTR, uma banda de 1,2 Kb e duas bandas mais fracas foram identificadas, como se mostra na Figura 4, faixa 1 (6 gg do RNA).

A mesma sonda foi usada para o despiste de uma biblioteca de cDNA, preparada a partir de RNA poliA⁺ derivado da linha celular. Isto deu um clone com uma inserção de lkb, sugerindo a falta de um extremo 5'. As transferências Northern para o cDNA não estão apresentadas.

As experiências de hibridação em cada um dos casos foram realizadas durante a noite a 60 °C. As transferências foram lavadas duas vezes â temperatura ambiente com 2xSSC e duas vezes a 60°C com 2xSSC suplementado com 1% SDS.

As experiências anteriores mostraram o DNA expressando o precursor do antigénio P815A suficientemente para permitir a sequenciação , usando o método bem conhecido de terminação de cadeias didesoxi de Sanger. Isto foi realizado usando uma variedade de endonucleases de restrição e por iniciação específica com oligonucleótidos iniciadores sintéticos. Os resultados para os exões do gene estão estabelecidos na sequência id nS: 4.

EXEMPLO 8

A análise Northern descrita supra sugeriu a ausência do extremo 5' do cDNA. Para se obter esta sequência, preparou-se

cDNA a partir de RNA Pl.HTR usando um iniciador correspondendo às posições 320-303. A sequência foi então amplificada usando a reacção em cadeia com polimerase utilizando um iniciador 3' correspondendo às posições 286-266 e um iniciador 5' descrito por Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 8998-9002 (1988). Foi encontrada uma banda com o tamanho esperado (270 bases), a qual hibridou com o fragmento Smal/Xbal de 900 pb descrito supra numa transferência Southern. Após clonagem em ml3tg 130 lambda tg 131, o fragmento pequeno de 270 pb foi sequenciado. A sequência está apresentada na sequência id n2:l.

EXEMPLO 9

Após a obtenção das sequências descritas nos Exemplos 7 e 8 e descritas em seq id na: 4, uma região de 5,7 Kb do cosmídeo CIA.3.1 foi sequenciada. Sabe-se que este fragmento contem o fragmento de 900 bases que expressava P815A nos transfectantes. Esta experiência permitiu delinear intrões e exões uma vez que o cosmídeo é de origem genómica.

A estrutura delineada do gene está apresentada na figura 5. Juntamente com seq id no: 4, estes dados mostram que o gene para o precursor do antigénio, referido como PIA” daqui em diante, tem aproximadamente 5 kilobases de comprimento e contem 3 exões. Uma ORF para uma proteína de 224 aminoácidos começa no exão 1, terminando no exão 2. 0 fragmento de 900 pares de bases que transfere a expressão dos precursores dos antigénios A e B contem apenas o exão 1. A região do promotor contem uma caixa CAAT, conforme indicado em seq. id no: 1 e uma sequência potenciadora. Esta última característica foi observada nos promotores da maior parte dos genes MHC classe I, conforme observado por Geraghty et al, J. Exp. Med. 171: 1-18 (1990); Kimura et al., Cell 44: 261-272 (1986).

Realizou-se uma pesquisa de homologias por computador, usando o programa FASTA com parâmetros triplos K de 3 e 6, como sugerido por Lipman et al., Science 227: 1435-1441 (1985) e usando a saída 65 do banco de dados Genbank (Outubro 1990). Não se encontrou homologia excepto para um segmento de 95 bases correspondendo a parte de uma região ácida codificada pelo exão 1 (posições 524-618), o que é semelhante às sequências codificadoras das regiões ácidas na proteína nucleolar de murganho NO38/B23, como descrito por Bourbon et al., Mol. Biol. 200: 627-638 (1988) e schmidt-Zachmann et al.Chromosoma 96: 417-426 (1988). Cinquenta e seis de 95 bases eram idênticas. Para testar se estas homologias eram a causa da hibridação cruzada, fizeram-se experiências usando uma biblioteca de cDNA de baço de murganho despistada com o fragmento de 900 bases. Obtiveram-se clones de cDNA correspondendo muito de perto aos tamanhos das bandas de hibridação cruzada. Estes foram parcialmente sequenciados e encontrou-se que o cDNA de 2,6 Kb correspondia exactamente à sequência de cDNA descrita para a nucleolina de muragnho, enquanto que o cDNA de 1,5 Kb correspondia à proteína nucleolar de murganho NO38/B23.

A análise da sequência de nucleótidos do gene referido como PIA daqui em diante, sugere que o produto codificado tenha um peso molecular de 25 Kd. A análise da sequência id no: 4 mostra um potencial sinal de direccionamento nuclear nos resíduos

5-9 (Dinwall et al., Ann. Rev. Cell Biol. 2: 367-390 (1986)), assim como um domínio acídico grande nas posições 83-118. Conforme indicado supra, este contem a região de homologia entre PIA e as duas proteínas nucleolares. Um sítio de fosforilação putativo pode ser encontrado na posição 125 (serina). Também um segundo domínio acídico foi encontrado no extremo C de um segmento ininterrupto de 14 resíduos glutamato. Uma estrutura C-terminal semelhante foi encontrada por Kessel et al., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 84: 5306-5310 (1987), numa proteína de homeodomínios tendo localização nuclear.

Em estudos comparando a sequência do gene PIA com as sequências de P91A, 35B e P198, não foram encontradas semelhanças, mostrando que PIA é indicador de uma classe diferente de genes e antigénios.

EXEMPLO 10

Tendo a sonda PIA e a sequência, realizaram-se estudos para determinar se o gene presente no tecido normal era idêntico ao expresso pelo tumor. Para fazer isto, preparam-se bibliotecas de fagos usando lambda zapll 10 e DNA genómico de células de rim de murganho DBA2. PIA foi usado como sonda. As condições de hibridação foram as descritas supra e encontrou-se um clone com hibridação positiva. O clone continha os exões um e dois do gene PIA e correspondia às posições -0,7 a 3,8 da figura 5. Após localização desta sequência, realizou-se amplificação por PCR para se obter a sequência correspndendo a 3,0 a 4,5 da figura 5.

Realizou-se a análise da sequência e não se encontraram diferenças entre o gene dos rins normais e o gene PIA como obtido para as células tumorais P815.

Noutras experiências, o gene conforme encontrado em células de rim DBA/2 foi transfectado para PO.HTR, como descrito supra. Estas experiências, apresentadas na figura 7, mostraram que os antigénios A e B foram expressos de forma igualmente eficaz pelo gene de rim isolado a partir de células normais de rim e pelo gene P11A isolado a partir de células normais de rim derivadas de células tumorais P815.

Estas experiências levaram à conclusão de que o gene codificador do precursor do antigénio de rejeição de tumores é um gene que não resulta de uma mutação; em vez disso parece que o gene é o mesmo que está presente em células normais, mas não é expresso nelas. As ramificações deste resultado são importantes e e são discutidas infra.

Em estudos não apresentados encontrou-se a existência de variantes do gene. Algumas células eram PIA B⁺, em vez do normal PIA. A única diferença entre estas é uma mutação pontual no exão 1, com o tripleto 18 codificador de Ala na variante em lugar de Vai.

EXEMPLO 11

Realizaram-se experiências adicionais com outros tipos de células. Seguindo os protocolos descritos para as hibridações de transferências Northern supra, RNA de células normais de fígado e de baço foramtestadas para determinar se um transcrito do gene PIA podia ser encontrado. Os dados da transferência Northern estão apresentados na figura 4 e, como se pode ver, não há evidência de expressão.

A linha de células de murganho P815 a partir das quais foi isolado PIA é um mastocitoma. Portanto, estudaram-se linhas celulares de mastócitos para determinar se expressavam o gene. A linha celular de mastócitos MC/9, descrita por Nabel et al., Cell 23: 19-28 (1981) e culturas a curto prazo de mastócitos derivados de medula óssea foram testados como descrito supra (transferência Northern), mas não se encontrou qualquer transcrito. Pelo contrário quando uma linha celular dependente de IL-3 derivada de Balb/c L138.8A (Hultner et al., J. Immunol. 142: 3440-3446 (1989)) foi testada, encontrou-se um sinal forte. 0 trabalho com mastócitos está apresentado na figura 4.

Sabe-se que tanto os murganhos BALB/C como DBA/2 partilham o haplotipo H-2^a e portanto é possível testar a sensibilidade à lise usando as CTLs descritas supra. A figura 8 mostra estes resultados, o que essencialmente prova que CTLs anti-A e anti-B lisam fortemente as células, enquanto que as linhas anti-C e anti-D não fazem.

Realizaram-se outros testes noutras linhas de células tumorais, i.e., linha celular de teratocarcinoma PCC4 (Boon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 272-275 (1977) eleucémias LEC e WEH1-3B. A expressão não foi detectada em qualquer uma destas amostras.

EXEMPLO 12

A apresentação do antigénio PIA por moléculas MHC é interessante. Para testar isto, o cosmídeo CIA.3.1 foi transfectado para a linha celular de fibroblastos DAP, a qual apresenta o fenótipo H-2 . As linhas celulares foram transfectadas com genes dó. d expressando um dos antigénios K , D^a e L . Após transfecção tanto com o cosmídeo como com o gene MHC, foi estudada a lise com CTLs, novamente como descrito supra. Estes estudos, resumidos na Tabela 2, mostram que L é necessário para a apresentação dos antigénios PIA A e B.

TABELA 2. H-2-restrição dos antigénios P815A e P815B

Célula recipiente* N2 de clones lisados por CTL/ n^e de p

clones HmB *

	CTL anti-A	CTL anti-B
DAP (H-2k)	0/208	0/194
DAP+Kd	0/165	0/162
DAP+Dd	0/157	0/129
DAP+Ld	25/33	15/20

* Cosmídeo CIA.3.1 contendo todo o gene PIA foi transfectado em células DAP previamente transfectadas com genes H-2^a classe I como indicado.

* Colónias independentes resistentes a drogas foram testadas quanto à lise por CTL anti-A ou anti-B num ensaio visual.

A observação de que se pode associar a apresentação de um antqénio de rejeição de tumor a uma molécula particular de MHC foi confirmada nestas experiências com células humanas e moléculas de HLA, conforme elaborado infra.

EXEMPLO 13

V., ------------------------Usando a sequência do gene PIA assim como a sequência de aminoácidos dela derivada foram identificados peptídeos antigénicos que são A⁺ B⁺ (i.e. característicos de células que i . , — + expressam os antigénios A e B), e os que são A B . 0 peptídeo está apresentado na Figura 10. Este peptídeo quando administrado a amostras de células PO.HTR na presença de linhas celulares de CTL específicas .para as células que o apresentam, levou à lise das células PO.HTR, apoiando a hipótese de os peptídeos baseados no produto expresso pelo gene poderem ser usados como vacinas.

EXEMPLO 14

A linha celular de melanoma humano referida daqui em diante como MZ2-MEL não é uma linha celular clonal. Ela expressa quatro antigénios estáveis D, E, F e A. Ainda, são expressos dois outros antigénios B” e C por algumas sublinhas dio tumor.

Clones de CTL específicos para estes seis antigénios estão descritos por Van den Eynde et al., Int. J. Canc. 44: 634-640 (1989). Entre os subclones reconhecidos de MZ2-MEL estão MEL.43,

MEL3.0 e MEL3.1. (Van den Eynde et al., supra)♦ A linha celular

MEL3.1 expressa o antigénio E, conforme determinado por estudos com CTL como descrito para variantes de P815, supra, assim foi escolhida como a fonte da sequência de ácido nucleico expressando o precursor do antigénio.

Durante o isolamento da sequência de ácido nucleico com interesse codificador de um antigénio de rejeição de tumores, as técnicas desenvolvidas supra, mostraram que é necessária uma célula recipiente que preencha dois critérios: (i) a célula recipiente não deve expressar o TRAP com interesse nas condições normais e (ii) deve expressar a molécula HLA classe I com interesse. Também, a célula recipiente deve ter uma frequência de transfecção elevada, i.e. deve ser uma boa recipiente.

Para se conseguir tal linha celular, a sublinha clonal ME3.1 foi sujeita a selecção repetida com CTL 82/30 anti-E como descrito por Van den Eynde, supra. Os ciclos repetidos de selecção conduziram ao isolamento do subclone MZ2-MEL-2.2 isc E . Este subclone é também HPRT^-, (i.e., sensível ao meio HAT: hipoxantina

-4 . . -7 .... -5

M, aminopterina 3,8 χ 10 Μ, 2-desoxitimidina 1,6 χ 10 Μ).

Ο subclone será referido como MEL-2.2 por simplicidade.

EXEMPLO 15

O DNA genómico de MEL3.0 foi preparado segundo Wolfel et al., Immunogenetics 26: 178-187 (1987), a divulgação do qual é aqui incluida como referência. O plasmídeo pSVtkneoB, como descrito por Nicolas et al., Cold Spring Harb., Conf. Cell Prolif. 10:469-485 (1983) confere resistência à gentamicina, de forma que pode ser usado como marca da cotransfecção, como foi o caso desta experiência.

Seguindo um processo semelhante mas não idêntico ao de Corsao et al., Somatic Cell Molec. Genet 7: 603-616 (1981), DNA genómico total e o plasmídeo foram cotransfectados. 0 DNA genómico (60 μg) e DNA de plasmídeo (6 μg) foram misturados em 940 μΐ de 1 mM Tris.HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA, após o que 310 μΐ de CaCl₂ 1M foi adicionado. Esta solução foi adicionada lentamente com agitação constante a 1,25 ml de 2xHBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl 1,5 mM Na₂HPC>₄, ajustado a pH 7,1 com NaOH) o os precipitados de DNA e fosfato de cálcio formaram-se durante 30-45 minutos à temperatura ambiente, após o que foram aplicados a frascos de 2 cultura de tecidos de 80 cm os quais foram semeados 24 horas antes com 3x10 células MEL2.2, em 22,5 ml de meio de cultura para melanomas meio de Eagle modidicação de Dulbecco) suplementado com 10% de soro fetal de vitela. Após 24 horas, o meio foi substituído. Quarenta e oito horas após transfecção as células

2 foram colhidase semeadas a 4x10 céulas por frasco de 80 cm em meio de cultura de melanoma suplementado com 2 mg/ml de geneticina. A geneticina serve como marca selectiva.

EXEMPLO 16

Trinta dias após a transfecção, colónias resistentes à geneticina foram contadas, colhidas e cultivadas em meio não selectivo durante 2 ou 3 dias. As células transfectadas foram então semeadas em microplacas de 96 cavidades a 200 células/cavidade em 200 gl de meio de cultura com 20% de soro fetal de vitela (FCS) para se obter aproximadamente 30 colónias em crescimento por cavidade. 0 número de microculturas foi projectado para se conseguir redundância, i.e., de forma a que todos os transfectantes independentes ficassem representados pelo menos quatro vezes.

Após 10 dias, as cavidades continham aproximadamente 6x10 células. Estas células foram removidas e 1/3 de cada microcultura foi transferido para uma placa em duplicado. Após 6 horas, i.e., após nova aderência, o meio foi removido e adicionado 1500 CTL anti-E (CTL 82/30) a cada uma das cavidades em 100 μΐ de meio de cultura de CTLs com 35 U/ml de IL-2. Um dia mais tarde, o sobrenadante (50μ1) foi colhido e examinado relativamente à concentração de TNF, por razões estabelecidas no exemplo seguinte.

EXEMPLO 17 g

tamanho do genoma de mamífero é 6 x 10 Kb. Como a quantidade média de DNA integrado em cada transfectante resistente à droga era esperada como sendo de cerca de 200 Kb, foi necessário examinar um mínimo de 30000 transfectants para avaliar se o antigénio E tinha sido transfectado. Trabalhos anteriores com células de murganho mostraram que quando se usa um ensaio de estimulação de CTL, grupos contendo apenas 3% das células expressando o antigénio com interesse foram identificados. Isto deverá

reduzir o número de ensaios por um factor de 30. Se bem que um ensaio CT1 anti-E, como descrito supra, em células mistas E⁺/E^_ fosse útil, não foi suficiente pois não se conseguiu obter resultados consistentes.

Como resultado, foi projectado um teste alternativo. A estimulação de CTLs foi estudada por libertação do factor de necrose tumoral (TNF) usando metodologias bem conhecidas que não será necessário repetir aqui. Como descrito no Exemplo 15, 1500 células CTL 82/30 foram adicionadas por cavidade de transfectantes. Estes CTLs foram colhidos 6 dias após a estimulação. Como indicado supra, após 1/3 das células em cada uma das cavida. . 4 des ter sido removido e os restantes 2/3 (4x10 ) terem aderido novamente, as CTLs e IL-2 foram adicionadas. Os 50 gl de sobrenadante foram removidos 24 horas mais tarde e transferidos para uma . 4 microplaca contendo 3 x 10 W13 (WEHI-164 clone 13; Espevik et al., J. Immunol. Meth. 95: 99-105 (1986)) as células em 50 μΐ de meio de cultura W13 (RPMI-1640) suplementado com L-arginina (116 mg/1), L-asparagina (36 mg/1), L-glutamina (216 mg/1) e 10% FCS suplementado com 2 μg de actinomicina D a 37% numa atmosfera de 8%de CO₂· A linha celular W13 é uma linha celular de fibrossarcoma de murganho sensível ao TNF. Diluições de TNF-β recombinante em RPMI 1640 foram adicionados a controlos de células alvo.

As culturas W13 foram analisadas após 20 horas de incubação e a percentagem de células mortas foi medida usando uma adaptação do ensaio colorimétrico de Hansen et al., J. Immunol. Meth. 119: 203-210 (1989). Isto envolveu a adição de 50 ml de brometo de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio a

2,5 mg/ml em PBS, seguido de duas horas de incubação a 37°C. Os cristãos de formazano azuis escuros foram dissolvidos pela adição de 100 μΐ de solução de lise (1 volume de N,N dimetilformamida misturado a 37°C com dois volumes de água contendo 30% (p/v) de dodecilsulfato de sódio, a pH 4,7, ácido acético a 1,6% e 2,5% de

HC1 IN). As placas foram incubadas a 37°C durante a noite e DO lida a 570 nm usando 650 nm como controle. A percentagem de células mortas foi determinada pela seguinte fórmula:

r~“Ί | 100 -(DO₅₇₀ cavidade com amostra) |

100 x |1| | DO570 cavidade + meio|

L___l segundo Espevik et al., J. Immunol. Meth. 95:99-105 (1986). Os resultados mostraram que mesmo quando a proporção de células E⁺/E era tão baixo quanto 1/45, foi observada produção significativa de TNF, mostrando assim CTLs activos. Isto conduziu à decisão de testar os transfectantes resistentes à droga em grupos de 30.

EXEMPLO 18

As células foram testadas quanto à produção de TNF como discutido no Exemplo 17, supra. Um total de 100 grupos de células - 6 4

E (4x10 células/grupo) foram testadas apos transfecçao e 7 X10 transfectantes independentes resistentes à geneticina foram obtidos, para uma média de 700 por grupo. Apenas um grupo de células transfectadas condiziu a uma microcultura que levou o clone CTL anti-antigénio 82/30 a produzir TNF. Dos 300 clones testados, 8 eram positivos. Estes clones foram então testados quanto à lise por CTL anti-E, usando o ensaio convencional de . 51 libertação de Cr e encontrou-se que eram lisados tão eficazmente quanto a linha de céluls E⁺ original. O transfectante E.T1, discutido aqui, tinha o mesmo padrao de lise de MEL2.2 para CTLs contra os antigénios B, C, D, e F.

facto de apenas um transfectante apresentar o antigénio em 70000 transfectantes resistentes à geneticina pode à primeira parecer muito baixo mas não é. 0 trabalho descrito supra para P815 mostrou uma frequência média de 1/13000. A recipiente de DNA humano MEL2.2 parece integrar 5 vezes menos DNA do que Pl.HTR.

EXEMPLO 19

Uma vez encontrado o transfectante E.T1, a análise colocou várias questões incluindo se a causa era um contaminante E⁺ da população celular. A análise da apresentação do antigénio, descrita supra, mostra que E.T1 é B e C , tal como a célula recipiente MEL2.2. Encontrou-se também ser HPRT^- usando processos de selecção convencionais. Todas as células E⁺ usadas no trabalho aqui descrito, eram no entanto HPRT⁺.

Era também possível que um revertente E⁺ de MEL2.2 fosse a fonte de E.T1. Para testar isto, fez-se uso da observação feita por Perucho et al., Cell 22: 309-317 (1980), de que sequências cotransfectadas geralmente integram num único sítio do genoma. Se o antigénio E num transfectante resultar da cotransfecção com pSVtkneoB, então as sequências deveriam estar ligadas e a deleção do antigénio deveria também eliminar as sequências pSVtkneoB na vizinhança. Wolfel et al., supra mostrou que isto é verdadeiro. Se uma célula normalmente E for transfectada com pSVtkneoB, então as sequências deverão estar ligadas e a deleção do antigénio deve também eliminar as sequências vizinhas do pSVtkneoB. Se uma célula normalmente E⁺ transfectada com pSVtkneoB for E.T1, no entanto, a “co-deleção” não deverá

ocorrer. Para testar isto, o transfectante E.T1 foi sujeito a imuno-selecção com 82/30 como descrito supra. Obtiveram-se duas variantes que perderam o antigénio, as quais resistiram à lise por CTL. Nenhuma destas perdeu a resistência à geneticina; no entanto, a análise de transferências Southern mostrou a perda de várias sequências neo^r nos variantes, mostrando ligação estreita entre o gene E e o gene neo^r em E.T1, levando à conclusão de que

E.T1 era um transfectante.

EXEMPLO 20

O subclone MZ2-MEL 4B foi usado como fonte de DNA para a preparação de uma biblioteca em cosmídeo. Esta biblioteca de quase 700000 cosmídeos foi usada para transfectar células MZ2-MEL

2.2, seguindo os protocolos de transfecção de cosmídeos descritos supra.

Ao encapsidar-se o DNA dos transfectantes de cosmídeos directamente em componentes da fase lambda é algumas vezes possível recuperar cosmídeos que contêm as sequências com interesse. Este processo foi infrutífero aqui, portanto repescámos a sequência transfectada por ligação do DNA do transfectante aos fragmentos de restrição adequados do vector cosmídeo pTL6. Isto foi tentado com dois transfectantes e teve êxito com um deles. Um cosmídeo, referido como B3, foi recuperado a partir desta experiência e sujeito a digestão com endonucleases de restrição via Xmal ou por digestão com BamHI de um fragmento grande Xmal de 12 Kb transfectado. Os fragmentos foram clonados no vector pTZ 18R e depois transfectados para MEL2.2. Novamente, a produção de TNF foi a medida pela qual se determinou uma transfecção com êxito. As experiências conduziram à determinação de uma sequência de um gene capaz de transfectar o antigénio E no fragmento Xmal de 12

Kb e depois no fragmento de 2,4 Kb da digestão com BamHI do

segmento de 12 Kb.

fragmento de 2,4 Kb híbrida com um fragmento derivado de MZ2-MEL e com um clone de células T do doente MZ-2 conforme i determinado pelas transferências Southern (DNA digerido com BamHI/Smal). A banda está ausente dos variantes que perderam o antigénio E~ de MZ2-MEL, como se pode ver na Figura 12.

A sequência para o precursor do antigénio E foi deter minada e está aqui apresentada;

I 10 I 20 | 30

GGATCCAGGC CCTGCO.GGA AAÀATAXAAG «1 AC7GCA7GAG AGTGGGGATG TCACAGAGTC 121 CAGG-5CTG7G CT7GCGGTCT GCACCCTGAG 141 GGAACCAGGC AGTGÀGGOCT TGGTCTGAGA 241 CACAGGG7GT GCCAGCACCG AATG7TTGCC 301 CÀGGACACAT IGGAGTCCAC AGAGTCTGGC

61 CGACCTCTGC TGGCCGGCTG 5A7CCTGAGT 421 GGGACAGGCC 1ACCCAGAGG ACAGGXTTCC

Ê1 GATCTGCAAG TAGGCCTTTG TIAGAGCÍTC 541 CACACTCCC? CTC7CCCCAG GCC7G7G537 €01 GCCTGCTGCC C? GA CGA GAG TíA?CATu“C (£1 TGAGGAAGCC C7TGAGC-CCC AACAAGASGC 721 TCCTCCTCCT CTCCTC7GGT CCTGGXACC 741 GATCC7CCCC AGAGTCCTCA GG-GAGCCTCC 141 CAGA33CAAC CCAGTGA53G T7CCAGCÀ3C Kl ATÇTTGSAGT CCTTGTTCCÚ XGCACtAATC 961 CTCGCTCCTCA AA7A7CGAGC CAGGGA3CCA

1021 ITCAAAAATT ACAAGCXCTG TTTTCCTGAG 1041 CJGCTCTTOG GCATTGACGT GAAGGAAGCA 1141 ACC7GCC7AG G7CTC7CCTA TGATGGCCTG 1201 G3C?7CC?GA TAAT7G7CCT G37CA7GA77 12 £1 GAAATCTG3G AGGAGCTGXG TGTGATG3A3 ’ 1321 GGG-SAGCCCA GGJAGCTGCT CACCCAAGAT 1341 AGG7GCCGGA CAG7GATCCC GCACGCCATG 14 41 XAAOCAGCCA TGTGAAAGTC CTTGAGCATG 1501 TC77CCCATC CCTGCGTGAA GCAGCTTCGA 1561 TTGCA3CGAA GGCCAGTG33 AGGGGGACTG 1621 CAGCTTCCCC TGCCTCGTGT GACA7GàG3C 2(41 G77~7CA77A G7AGGTTTCT GTTCTATTGC 1741 TGGAA77G77 CAAA7G7777 TTTTTAAGGG 1401 A7GAA7GAGA GCA37CACAZ AG77C7G7GT 1161 TATTCAGATT &3·0λΑΑΤ70λ TTCTATTTTG 2521 OTÀTTOàGJU. ATGCGÀÀAAA TGAGCAGTAA 2542 AGAGACAGTC AATTCTTGCC TTATACCTCA 2041 GCATACCTGG XTTTCCTTGG CTTC777GAG 2101 ATTCTÍCCTG TTCACTGGCT t7TTTCTTCT 21(1 CCCTG-GGTTA GTAG7GGAGA TGCIAAGGTA 2221 AGA37CTAGG AGCTGCAGTC ACGCAA7CGA 2211 AAAATTGAGA GAGGGCTGAG GGTG7G33GC 2341 CTGAGCTGGG GCATTTTGGG Ct*?G3GAAA 2401 ATGATCTTGG CTMATCC

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CAAGGTTCAG TTCTCAGCTG AG-GCCTCTCA 54 0 • C7TCAT7GCC CAGCTC7TGC CCACAC7CC7 60 0 TC77GAGCAG AGGAGTCÍGC A7TGCAA3CC 660 CCT&GGCTGC TGTG7G7GCA O3CTGCCACC 72 0 CTOSAS-GAG-G TGCCCACTGC T&5G7CAACA 7E0 GCCT77CCCA C7ACCATCAA CT7CXC7CGA 440 CGTGAAGAGG AG-G-GGCCAAG CACCTCT73T 90 0 ACTaasaagg TGGCTOArrr GGTTGcrrrr 960 GTCACAAAGC CAGAAA7GCT GGAGAGTGT» 102 0 ATCT7CGGCA AAGCCTCTGA OTCCTTGCAG 104 0 GACCCCACCS GCCA7TCC7À TG7CC7TGTC 1140 CTGGG7GA7A XTCAGA7CA7 GCCCAAG.KCA 12 0 0 GCAA7GGAGG GCGGCCA7GC TCCTGA&GA3 12 £0 GTG2ATGA7G &3AGO3AGCA CAGTGCC7A7 13x0 TTGCTGCAGG AAAAGTACCT GGAGCACGGC 13 6 0 A3TTCCTGTG GGGOCCAÀOG GCCCTCGCTG 14 4 0 TGATCAAGGT CAGTSCAAGA G7TCGC7777 1500 GAGAGGA&GA AGAGGGAGTC TGAGCATGA3 156 0 G0CCA37GCA CCTTCCAGOC CCGCG7CCXS 162 0 CCATTCTTCA CTCTGAAGAG AGCGGTCA37 164 0 O7GAC77GGA CA777λ7777 TGTTCTC77T 174 0 ATGGTTGAAT GAA 777 CA GC A7CCAAG777 14 00 ATATAGTTCA A&GCTAAGAG TC77G7G777 14 60 TGXATTGGGA TAAÍAACAGC AGTGGAACAA 152 0 AA7AGATGAG ATAXAGAATT AAA3AAA.7TA 196 0

GTC2ATTCTG ΙΑΑΛλ777ΓΓ Αλλ5λΤλ7λ7 2040 AA7GTAAGAG AAA77ÀAA7C TGAATAAAGA 2100

CCATGCA77G AGCATCTGC7 TTTTG-GAASG 2160

AGCCAGAC7C ATACCCACOC ATAGG-GTCGT 222 0

GG7GGCAAGA TGTCCTCTAA AGATGTAGGG 22 6 0

TCCG-5G7GAG XZ5T5T?GGA3 TGTCAATGCC 234 0

CTGCAGTTCC TT7TGGGGGA OCTGATTGTA 24 00

2414

I 40

I 50

40

EXEMPLO 21

Após o segmento genómico de 2,4 Kb ter sido identificado, realizaram-se estudos para determinar se uma sublinha E⁺ expressava qualquer DNA homólogo. A linha celular MZ2-MEL 3.0 foi usada como fonte e preparada uma biblioteca de cDNA a partir do seu mRNA, usando técnicas conhecidas. 0 segmento de 2,4 Kb foi usado como sonda e mRNA com cerca de 1,8 Kb foi identificado como homólogo, usando análise de transferências Northern. Quando o cDNA foi despistado, obtiveram-se clones mostrando quase identidade completa com partes do fragmento de 2,4 Kb. Dois exões foram assim identificados. Um exão adicional foi situado a montante destes, via segmentos de sequenciação do cosmídeo B3 situado a seguir ao fragmento BamHI de 2,4 Kb. 0 gene estende-se por cerca de 4,5 Kb como se mostra na Figura 8. O ponto de partida da região transcrita foi confirmado usando PCR para o extremo 5' do cDNA. Os três exões compreendem 65, 73 e 1551 pares de bases. Um ATG está situado na posição 66 do exão 3, seguido de uma grelha de leitura de 828 pares de bases.

EXEMPLO 22

Para determinar se fragmentos mais pequenos do que o fragmento de 2,4 Kb podiam transferir a expressão do antigénio E, pedaços mais pequenos correspondendo ao fragmento maior foram preparados usando técnicas reconhecidas e transferidos para células E . A Figura 8 mostra as fronteiras dos três segmentos.

A transferência da expressão do antigénio desta forma indica que o gene codifica o precursor do antigénio, em vez de codificar uma proteina que active o antigénio.

to EXEMPLO 23

O despiste de cDNA descrito supra revelou, surpreendentemente, dois cDNAs diferentes mas estreitamente relacionados, surpreendentemente estes cDNAs, quando testados, não transferiram a expressão do antigénio E, mas apresentaram homologia substancial com o primeiro segmento de cDNA. Os três segmentos, parecem indicar uma nova família de genes referidos como MAGE para antigénio do melanoma. Na Figura 9, mage-1 dirige a expressão do antigénio a partir de células MZ2. Na Figura 9 estão apresentadas fracções do terceiro exão de cada gene. A segunda e terceiras sequências estão mais estreitamente relacionadas uma com a outra do que com a primeira (18.1 e 18,9% de diferença comparado com a primeira; 12% uma com a outra). De cada 9 clones de cDNA obtidos, obtiveram-se três de cada tipo, sugerindo expressão igual. MAGE como aqui é usado refere-se a uma família de moléculas e aos ácidos nucleicos que as codificam. Estes ácidos nucleicos partilham um certo grau de homologia e são expressos em células tumorais incluindo vários tipos de células de tumores humanos assim como em tumores humanos. A família é referida como MAGE pois os primeiros membros foram identificados em células de melanoma humano. Tal como as experiências que se seguem indicam, no entanto, os membros da família MAGE não estão todos restringidos a tumores do tipo melanoma; assim, MAGE refere-se a uma família de precursores do antigénio de rejeição de tumroes e sequências de ácido nucleico que os codificam. Os antigénios resultantes deles são referidos agui como MAGE TRAs ou antigénios da rejeição de tumores do antigénio de melanoma.

EXEMPLO 24

Experiências com tumores de murganho demonstraram que novos antigénios reconhecidos pelas células T podem resultar de

mutações pontuais que modificam genes activos numa região que codifica o novo peptídeo antigénico. Novos antigénios podem também surgir da activação de genes que não são expressos na maior parte das células normais. Para clarificar isto relativamente ao antigénio MZ2-E, o gene mage-1 presente nas células de melanoma foi comparado com o presente em células normais do paciente MZ2. A amplificação por reacção em cadeia com polimerase (PCR) do DNA de linfócitos do sangue activados com fito-hemaglutinina usando iniciadores à volta de um segmento de 1300 pb cobrindo a primeira metade do fragmento de 2,4 Kb. Conforme esperado, foi obtido um produto PCR enquanto nenhum foi conseguido com o DNA da variante E . A seguência deste produto de PCR mostrou-se idêntico à correspondente sequência do gene presente nas células de melanoma E⁺. Ainda, encontrou-se que o antigénio MZ2-E foi expresso por células transfectadas com o produto de PCR clonado. Este resultado sugere que a activação de um gene normalmente silencioso é responsável pelo aparecimento do antigénio de rejeição de tumores MZ2-E.

EXEMPLO 25

Para avaliar a expressão do gene mage-1 por várias células normais e de tumores, transferências Northern foram hibridadas com uma sonda cobrindo a maior parte do terceiro exão. Pelo contrário com o resultado observado com RNA isolado a partir de um clone de CTL do paciente MZ2 e linfócitos sanguíneos activados por fito-hemaglutinina do mesmo doente. Também foram negativos vários tecidos normais de outros indivíduos (Figura 10 e Figura 11). Quatorze linhas celulares de melanoma de outros doentes foram testados. Onze eram positivos com bandas de intensidade variável. Para além destas culturas de linhas celulares, quatro amostras de tecido de melanoma foram analisadas. Duas amostras, incluindo uma metástase do doente MZ2, mostraram-se positivas, excluindo a possibilidade de a expressão do gene representar um artefacto da cultura de tecidos. Alguns tumores de outros tipos histológicos, incluindo tumores do pulmão foram testados. A maior parte destes tumores foram positivos (Figuras 10 e 11). Estes resultados indicaram que a família de genes MAGE é expressa por muitos melanomas e também por outros tumores. No entanto, eles não proporcionam indicação clara sobre quais dos genes mage-1, 2 ou 3 eram expressos por estas células, pois as sondas de DNA correspondendo aos três genes deram hibridação cruzada num grau apreciável. Para tornar esta análise mais específica usou-se a amplificação por PCR e hibridação com sondas oligonucleotídicas altamente específicas. Obtiveram-se cDNAs e amplificaram-se por PCR usando oligonucleótidos iniciadores correspondendo às sequências do exão 3 que eram idênticas aos três genes MAGE aqui discutidos. Os produtos de PCR foram então testados quanto à sua capacidade para hibridarem com outros três oligonucleótidos que apresentaram especificidade completa para um dos três genes (Figura 9). Experiências testemunha realizadas por diluição do RNA de MZ2-MEL 3.0 em RNA de células negativas indicou que nas condições usadas a intensidade do sinal decresceu proporcionalmente à diluição e que sinais positivos puderam ainda ser detectados numa diluição de 1/300. As células normais (linfócitos) que foram testadas por PCR foram confirmadas como sendo negativas para a expressão dos três genes MAGE, sugerindo portanto um nível de expressão de menos de 1/300 relativamente à linha celular de melanoma MZ2 (Figura 11). Para o painel de linhas celulares de melanoma, os resultados mostram claramente que alguns melanomas expressavam genes MAGE mage 1, 2 e 3 enquanto outras expressaram apenas mage-2 e 3 (Figuras 11 e 10). Alguns dos outros tumores também expressaram os três genes enquanto que outros expressaram apenas mage-3 e 3 ou apenas mage-3. É impossível excluir formalmente que alguns resultados positivos de PCR não refletem a expressão de um dos três genes MAGE caracterizados

e de que ainda um outro gene estreitamente relacionado que possa partilhar a sequência de iniciação e os oligonucleótidos que hibridam. Pode-se concluir que a família do gene MAGE é expressa por um largo arranjo de diferentes tumores e que estes genes estejam silenciosos nas células normais testadas até agora.

EXEMPLO 26

A capacidade de uma sequência que transfecta com elevada eficácia e expressa eficazmente um TRAP tornou possível procurar a molécula do complexo major de histocompatibilidade (MHC) classe I associado. As especificidades da classe I do paciente MZ2 são HLA-A1, A29, B37, B44 e C6. Quatro outros melanomas de doentes que têm Al em comum com MZ2 foram cotransfectados com o fragmento de 2,4 Kb e pSVtkneoB. Três deles não deram transfectantes neo que estimulassem a libertação de TNF pelo clone anti-E 82/30 o qual é CD8+ (Figura 10). Não se obteve qualquer transformante E com quatro outros melanomas, alguns dos quais partilham A29, B44 ou C6 com MZ2. Isto sugere que a molécula de apresentação para o antigénio MZ2-E seja HLA-A1. Em confirmação, encontrou-se que de seis linhas celulares de melanoma derivadas de tumores de doentes HLA-A1, duas estimularam a libertação de TNF pelo clone de CTL anti-E 82/30 do paciente MZ. Uma destas linhas de células tumorais, MI13443-MEL também apresentou elevada sensibilidade à lise por estes CTL anti-E. Estes dois melanomas foram os que expressaram o gene mage-1 (Figura 13). Oito melanomas de doentes com haplotipos HLA que não incluíram Al foram examinados quanto à sua sensibilidade à lise e quanto ã sua capacidade para estimular a libertação de TNF pelos CTL. Não se encontrou qualquer um positivo. A capacidade de alguns CTL anti-tumor humanos lisarem tumores alogeneicos partilhando uma especificidade HLA apropriada com o tumor original foi anteriormente descrito (Darrow, et al., J. Immunol. 142:3329

(1989)). É possível que os peptídeos antigénicos codificados pelos genes mage 2 e 3 possam também ser apresentados a CTL autólogos por HLA-1 ou outras moléculas classe I, especialmente face a resultados semelhantes encontrados com tumores murinos, conforme elaborado supra.

EXEMPLO 27

Conforme indicado supra, o melanoma MX2 expressou os antigénios F, D e k', para além do antigénio E. Após isolamento da sequência de ácido nucleico codificadora do antigénio E, realizaram-se experiências semelhantes para isolar a sequência de ácido nucleico codificadora do antigénio F.

Para fazer isto, culturas da linha celular MZ2-MEL2.2, uma linha celular descrita supra, foram tratadas com CTL anti-F clone 76/6, da forma descrita para o tratamento com clones de CTL anti-E. Isto resultou no isolamento de uma variante que perdeu o antigénio, a qual foi então sujeita a vários ciclos de selecção. A linha celular resultante, MZ2-MEL2.25 era completamente resistente à lise por CTLs anti-F, aida que fosse lisada por CTLs anti-D.

Novamente seguindo os protocolos estabelecidos para o isolamento do DNA do precursor do antigénio E, a variante F foi transfectada com DNA genómico da linha celular F⁺ MZ2-MEL3.0. As experiências deram 90000 transfectantes resistentes à droga. Estes foram testados quanto à expressão de MZ2-F usando conjuntos de 30 células no ensaio de detecção de TNF elaborado como supra. Um conjunto estimulou a libertação de TNF por CTLs anti-F e foi clonado. Encontrou-se que cinco dos 145 clones estimulam CTLs anti-F. Ensaios de lise, também seguindo protocolos descritos

supra, confirmaram (i) a expressão do gene codificador do antigénio Fe (ii) a apresentação do próprio antigénio F.

EXEMPLO 28

Após identificação de linhas celulares F⁺, o DNA extraído delas foi usado para transfectar células. Para fazer isto preparou-se uma biblioteca em cosmídeo da linha celular MZ2-MEL.43 novamente usando os protocolos descritos supra. A biblioteca foi dividida em 14 grupos de cerca de 50000 cosmídeos e DNA de cada grupo foi transfectado para MZ2-MEL2.2.5. Testaram-se então os transfectantes quanto à sua capacidade para estimular a libertação de TNF a partir de um clone de CTL anti-F 76/6. Dos 14 grupos de cosmídeo, um produziu dois transfectantes independentes expressando o antigénio F; obteve-se dois positivos num total de 17500 transfectantes resistentes ã geneticina.

EXEMPLO 29

A existência de uma família de genes foi sugerida pelo padrão observado na transferência Southern (Figura 12). Para fazer isto, o fragmento BamHI de 2,4 Kb, o qual transferiu a . . 32 expressão do antigénio M22-E, foi marcado com P e usado como sonda numa transferência Southern de DNA digerido com BamHI do subclone clonado E+ M22-MEL2.2. As condições de hibridação . . 2 incluíram 50 μΐ/cm de 3,5 XSSC, solução de Denhardt lx; tampão fosfato de sódio 25 mM (pH 7,0), 0,5% SDS, 2 mM EDTA, onde as sondas de 2,4 Kb foram marcadas com [a p]dCTP (2-3000 Ci/mole), 6 a 3x10 cpm/ml. A hibridação foi realizada durante 18 horas a 65°C. Após isto, as membranas foram lavadas a 65°C quatro vezes durante uma hora cada em 2xSSC, 0,1% SDS. Para identificar a hibridação, as membranas foram autorradiografadas usando filme Kodak X-AR e écrans intensificadores Kodak X-Omatic.

Nos exemplos que se seguem, sempre que é referido hibridação, as condições de restringência usadas foram semelhantes às descritas supra. Condições de restringência tal como aqui é usado refere-se às condições anteriores; sujeitas a modificações de rotina conhecidas.

EXEMPLO 30

O cDNA codificador de mage 4 foi identificado a partir de uma amostra da linha celular de sarcoma humano LB23-SAR. Encontrou-se que esta linha celular não expressa mage 1, 2 ou 3 mas o mRNA da linha celular híbrida com a sequência de 2,4 Kb codificadora de mage 1. Para melhor estudar isto, preparou-se uma biblioteca de cDNA a partir de um mRNA total LB23-SAR e hibridou-se então com o fragmento de 2,4 Kb. Identificou-se uma sequência de cDNA que hibridou com esta sonda e que aqui em diante é referida como mage 4.

EXEMPLO 31

Realizaram-se experiências usando linfócitos activados com PHA de um paciente MZ2, a fonte de células MZ discutidas atrás. Uma sonda oligonucleotídica que apresentou homologia com mage 1 mas não com mage 2 ou 3 foi hibridado com uma biblioteca de cosmídeos derivada de células activadas com PHA. O tamanho do fragmento BamHI de cosmídeo que deu hibridação positiva, no entanto, foi de 4,5 Kb indicando assim que o material não era mage 1; no entanto, com base na homologia com mage 1-4, o fragmento pode ser referido como mage 5. A sequência de MAGE 5 está apresentada em SEQ ID NO: 16.

EXEMPLO 32

Testou-se a linha celular de melanoma LB-33-MEL. mRNA total da linha celular foi usado para preparar cDNA, o qual foi então amplificado com oligos CHO9: (ACTCAGCTCCTCCCAGATTT) e CH010: (GAAGAGGAGGGGCCAAG). Estes oligos correspondem a regiões do exão 3 que são comuns a mage 1, 2 e 3 anteriormente descritos.

Para fazer isto, 1 gg de RNA foi diluido com um volume total de 20 μΐ, usando 2 μΐ de tampão lOx PCR, 2 gl de cada dNTP 10 mM, 1,2 μΐ de MgCl₂ 25 mM, 1 μΐ de uma solução 80 mM de CHO9, descrito supra. 20 unidades de RNAsina e 200 unidades de transcriptase reversa de M-MLV. Isto foi seguido de incubação durante 40 minutos a 42°C. Seguiu-se a amplificação por PCR, usando 8 μΐ de tampão PCR lOx, 4,8 μΐ de MgCl₂ 25 mM, 1 μΐ de CHO10, 2,5 unidades de polimerase de Thermus aquaticus (Taq) e àgua num volume total de 100 μΐ. A amplificação foi então realizada durante 30 ciclos (1 minuto 94 °C; 2 minutos a 52°C, 3 minutos a 72°C). Dez μΐ de cada uma das reacções foram então fraccionadas por tamanho num gel de agarose seguido de transferência para nitrocelulose. Encontrou-se que o produto hibrida com o oligonucleótido sonda CHO18 (TCTTGTATCCTGGAGTCC). Esta sonda identificou mage 1 mas não mage 2 ou 3. No entanto, o produto não hibridou com a sonda SEQ 4 (TTGCCAAGATCTCAGGAA). Esta sonda também se liga a mage 1 mas não a 2 e 3. Isto indicou que o produto de PCR continha uma sequência que diferia de mage 1, 2 e 3. A sequenciação deste fragmento também indicou diferenças relativamente a mage 4 e 5. Estes resultados indicam uma sequência diferindo da anteriormente identificada mage 1, 2, 3, 4 e 5 foi designada mage

6.

EXEMPLO 33

Noutras experiências usando as bibliotecas de cosmídeo dos linfocitos activados com PHA de MZ2, o fragmento mage 1 de 2,4 Kb foi usado como sonda e isolado um fragmento complementar Este clone, no entanto, não se ligou a oligonucleótidos específicos de mage 1, 2, 3 ou 4. A sequência obtida mostra alguma homologia com o exão 3 de mage 1 e difere das mages 1-6. Foi referida como mage 7 daqui em diante. Despistes adicionais deram mage 8-11.

EXEMPLO 34

A utilidade dos TRAPs, assim como de TRAs derivados deles, é exemplificada pelo que se segue.

Encontrou-se que o exão 3 de mage 1 transfere a expressão do antigénio E. Como resultado, decidiu-se testar se peptídeos sintéticos derivados deste exão 3 podia ser usado para conferir sensibilidade a CTL anti-E.

Para fazer isto e usando protocolos convencionais, as céulas normalmente insensíveis a CTLs anti-E foram incubadas com os peptídeos sintéticos derivados do Exão 3.1. Usando os ensaios líticos de CTL descritos supra em P815A e uma concentração peptídica de 3 mM, o peptídeo Glu-Ala-Asp-Pro-Tre-Gli-His-ser-Tir mostrou-se o melhor. O ensaio mostrou lise de 30%, indicando que conferiu sensibilidade a CTL anti-E.

EXEMPLO 35

Sequências de ácido nucleico referidas como smage foram isoladas a partir de células de murganho. Usando os

protocolos descritos supra, preparou-se uma biblioteca em cosmídeos a partir do DNA de células normais de rim DBA/2, usando o vector cosmídeo MAGE-1. O DNA foi transferido para filtros de nylon e estes foram lavados em 2x SSC a 65 °C para identificar o material smage.

EXEMPLO 36

Outras amostras de tecido foram testadas quanto à presença de genes MAGE, usando os protocolos discutidos supra. Seguem-se alguns destes resultados.

Não houve expressão dos genes MAGE em tecido de tumores do cérebro ou do rim. Tecido de tumor do cólon apresentou expressão de MAGE 1, 2, 3 e 4, se bem que nem todas as células testadas apresentassem expressão de todos os genes MAGE. Isto é também verdadeiro para tumor pancreático (MAGE 1); células não pequenas do pulmão (MAGE 1, 2, 3 e 4), próstata (MAGE 1), sarcomas (MAGE 1, 2, 3 e 4), mama (MAGE 1, 2 e 3) e laringe (MAGE 1 e 4).

Glu-Ala-Asp-Pro-Tre-Gli-His-Ser-Tir.

A divulgação anterior, incluindo exemplos, coloca muitas armas de extremo valor nas mãos de peritos na matéria. Para começar, os exemplos identificam e proporcionam uma metodologia para o isolamento de moléculas de ácido nucleico que codificam os precursores do antigénio de rejeição de tumor assim como as moléculas de ácido nucleico complementares. Sabe-se que existe DNA na forma de cadeia dupla e que cada uma das duas cadeias é complementar da outra. A tecnologia de hibridação de ácido nucleico foi desenvolvida até ao ponto em que dada uma cadeia de DNA, o especialista na matéria pode isolar o seu complemento ou sintetizá-lo.

Molécula de ácido nucleico como aqui é usado refere-se a todas as espécies de DNA e RNA que possuem as propriedades discutidas supra. DNA genómico e complementar, ou cDNA, ambos codificam proteínas particulares e como os exemplos dirigidos para o isolamento de sequências codificadoras de MAGE mostram, esta divulgação ensina a um especialista como obter ambas.

De forma semelhante, podem ser conseguidas moléculas de RNA, como seja mRNA. Novamente, com referência a um especialista na matéria, uma vez que se tenha uma sequência codificadora, pode-se isolar mRNA ou sintetizá-lo.

Sequências complementares que não codificam TRAP, como seja DNA anti-codão ou mRNA são úteis, e.g. no despiste das sequências codificadoras assim como em metodologias para o bloqueio da sua expressão.

Também será claro que os exemplos mostram a produção de culturas biologicamente puras de linhas celulares que foram transfectadas com sequências de ácido nucleico que codificam ou expressam as moléculas TRAP. Tais culturas podem ser usadas como uma fonte para os antigénios de rejeição de tumores, e.g. ou como terapêutica. Este aspecto do invento é discutido infra.

As células transfectadas com as sequências codificadoras de TRAP podem também ser transfectadas com outras sequências codificadoras. São exemplos de outras sequências codificadoras genes de citoquinas, como seja interleuquinas (e.g., IL-2 ou IL-4) ou moléculas do complexo major de histocompatibilidade (MHC) ou do antigénio de leucócitos humanos (HLA). A transfecção de genes de citoquinas é importante pois a expressão destes espera-se que aumente a eficácia terapêutica da cultura biologicamente pura das células in vivo. São bem conhecidas as terapias

onde os transfectantes foram administrados a indivíduos para o tratamento de estados cancerosos. Numa realização particularrnente preferida, as células são transfectadas com sequências codificadoras de (i) uma molécula TRAP, (ii) uma molécula HLA/MHC e (iii) uma citoquina.

> ...

A transfecção com uma sequencia codificadora de MHC/HLA é desejável pois alguns TRAS podem ser preferencialmente ou especificamente apresentados apenas por moléculas particulares de MHC/HLA. Assim, sempre que uma célula recipiente já expresse a I molécula de MHC/HLA associada ã apresentação de um TRA, pode não ser necessário transfecção adicional se bem que a transformação possa ser usadas para provocar níveis mais elevados de expressão do antigénio. Por outro lado pode ser desejável transfectar com uma segunda sequência quando a célula recipiente não expressa normalmente a molécula MHC/HLA importante.

Deve-se entender certamente que a transfecção com uma sequência adicional não implica a transfecção com outras sequências .

termo biologicamente puro como aqui é usado em relação à linha celular aqui descrita significa simplesmente que i esta está essencialmente livre de outras células. Estrictamente falando, uma linha celular por definição é biologicamente pura.

A transfecção de células requere que seja usado um vector adequado. Assim, o invento engloba vectores de expressão onde uma sequência codificadora de TRAP de interesse está operacionalmente ligado a um promotor. O promotor pode ser um promotor forte, como seja um dos bem conhecidos no campo, ou um promotor diferencial, i.e., um que seja operativo apenas em tipos

celulares específicos. Os vectores de expressão podem também conter um genoma virai ou bacteriano na sua totalidade ou em parte, como seja o vírus da vacina ou BCG. Tais vectores são especialemnte úteis na preparação de vacinas.

Os vectores de expressão podem incorporar várias sequências codificadoras, desde que a sequência TRAP esteja contida neles. Os genes da citoquina e/ou MHC/HLA discutidos supra podem ser incluídos num único vector com a sequência TRAP. Caso isto não se pretenda então pode ser proporcionado um sistema de expressão em que dois ou mais vectores separados são usados, estando cada uma das sequências codificadoras operacionalmente ligada a um promotor. Novamente, o promotor pode ser um promotor forte ou diferencial. A cotransfecção é uma técnica bem conhecida e os especialistas neste campo podem utilizar esta tecnologia. Os vectores podem ser construídos de forma a codificaram a molécula TRA directamente em vez da molécula TRAP. Isto elimina a necessidade de processamento pós-tradução.

Conforme a discussão anterior tornou claro, as sequências codificam precursores do antigénio de rejeição de tumores (TRAPs) que, por sua vez, são processados em antigénios de rejeição de tumores (TRAs). As formas isoladas de ambas as categorias estão aqui descritas, incluindo exemplos específicos de cada uma delas. Talvez o seu aspecto mais importante sejam as vacinas para o tratamento de várias condições cancerosas. As evidências apontam para a apresentação de TRAs em células tumorais, seguido do desenvolvimento de uma resposta imune e eliminação das células. Os exemplos mostram que quando vários TRAs são administrados às células, é montada uma resposta CTL e as células apresentadoras são eliminadas. Este é co comportamento característico de vacinas e portanto de TRAPs, os quais são processados para dar TRAs e os próprios TRAs podenm ser usados, sozinhos ou

em composições farmaceuticamente adequadas, como sejam vacinas. De forma semelhante, as células apresentadoras podem ser usadas do mesmo modo, sozinhas ou combinadas com ingredientes para dar composições farmacêuticas. Outros materiais que podem ser usados como vacinas incluem células isoladas que apresentam a molécula TRA na sua superfície, assim como fragmentos TRAP, vírus mutagenizados, especialmente formas etioladas e bactérias transfectadas. Fragmentos como aqui é usado refere-se a peptídeos que são mais pequenos do que TRA, mnas que possuem as propriedades necessárias a uma vacina, como discutido supra. Uma outra vacina compreende ou consiste em complexos de TRA e da molécula HLA. As vacinas do tipo descrito aqui podem ser usadas na prevenção, i.e., via administração a um indíviduo numa quantidade suficiente para evitar o estabelecimento de um estado canceroso.

A geração de uma resposta imune, esteja ela relacionada com células T ou células B, é característica do efeito do antigénio de rejeição de tumores apresentado. Relativamente ã resposta de células B, esta envolve, inter alia a geração de anticorpos contra TRA, i.e., que especificamente se liga a ele. Em adição, as moléculas TRAP têm tamanho suficiente para serem imunogénicas e os anticorpos que se lhe ligam são parte deste invento. Estes anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais, este último sendo preparado por qualquer uma das metodologias bem conhecidas para a sua preparação que

Por exemplo, podem ser preparados e.g. um murganho Balb/C ou num transformantes de EBV. Em adição partir de um indíviduo atingido nao necessitam de ser repetidas aqui. mAbs usando um modelo animal, tubo de ensaio usando, e.g. pode ser isolado anti-soro a por uma condição cancerosa onde certas células apresentam um TRA. Tais anticorpos podem ser também gerados contra epítopos definidos pela interacção de moléculas TRA e HLA/MHC.

A revisão da divulgação anterior mostrará que existre uma série de aspectos de consideração relativamente ao sistema que pode ser referido como apresentação e reconhecimento do antigénio de rejeição de tumores. 0 reconhecimento destes fenómenos tem consequências de diagnóstico. Por exemplo, a existência de clones de CTL ou anticorpos específicos contra YTRA torna possível o diagnóstico ou controle de condições cancerosas (explicado infra), controlando as CTLs numa amostra de um indivíduo, ligação de anticorpos a TRAs ou a actividade de CTLs anti-TRA em ligação com amostras de um indivíduo. De forma semelhante, a expressão de moléculas de ácido nucleico codificadoras de TRAPs pode ser controlada via amplificação (e.g., reacção em cadeia com polimerase), hibridação anticodão, técnicas com sondas, etc. Várias amostras de indivíduos, incluindo fluidos do corpo (sangue, soro e outros exudados) tecidos e tumores podem ser assim testados.

Uma forma particular de diagnóstico é usar uma adaptação do teste da tuberculina convencional normalmente usado para o diagnóstico da tuberculose. Este teste convencional da pele administra uma forma estável de derivado de proteína purificado ou PPD como ajuda de diagnóstico. De forma paralela, TRAs de acordo com este invento pode ser usado neste tipo de teste da pele como auxiliar de diagnóstico ou método de controle.

termo estado canceroso é usado aqui para englobar todos os casos fisiológicos que começam com a iniciação do cancro e resultam na manifestação clínica final. Os tumores não surgem ab initio como tumores vísiveis; em vez disso existem vários casos associados à transformação de uma célula normal em maligna, seguido do desenvolvimento de um crescimento de biomassa, como sej atumor, metástases, etc. Em adição, a remissão pode ser concebida como parte de uma condição cancerosa como tumores que

por vezes desaparecem espontaneamente. Os aspectos de diagnóstico deste invento incluem todos os casos envolvidos em carcinogénese, desde a primeira transformação até ao estado maligno de uma célula isolada, até ao desenvolvimento de tumores e metástases, assim como remissão. Tudo isto é aqui incluido.

Sempre que se usa indivíduo, o termo engloba qualquer espécie que pode ser atingida por um estado canceroso. Isto inclui humanos e não humanos, como sejam animais domesticados, animais para acasalamento, etc.

Existem igualmente aspectos terapêuticos deste invento. A eficácia de administração de quantidades eficazes de TRAPs e TRAs como vacinas já foi discutido supra. De forma semelhante, pode-se desenvolver CTLs específicas in vitro e depois administrá-los ao indíviduo. Os anticorpos podem ser administrados, quer policlonais quer monoclonais, que especificamente se ligam a células que apresentem o TRA de interesse. Estes anticorpos podem ser acoplados a agentes antitumorais específicos, incluindo, mas não estando limitado a, metotrexato, compostos radiodinados, toxinas tais como ricino, outras drogas citostáticas ou citolíticas etc.Assim, é aqui incluida a terapia dirigida com anticorpos, tal como é a aplicação de deleções das células cancerosas pela utilização de CTLs.

Os termos e expressões que foram empregues são usados como termos de descrição e não de limitação e não existe intenção na utilização de tais termos e expressões em excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou partes delas, sendo reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do âmbito do invento.

(1) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) REQUERENTES: Boon, Thierry, Van den Eynde, Benoit (ii) TÍTULO DO INVENTO: Sequência de DNA isolada e purificada codificadora do antigénio expresso pelas células tumorais e reconhecido por células T citotóxicas e suas utilizações.

(iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 26 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO: Felfe & Lynch (B) RUA: 805 Third Avenue (C) CIDADE: New York City (D) ESTADO: New York (F) ZIP: 10022 (v) FORMA LIDA PELO COMPUTADOR:

(A) TIPO DE MEIO: Disquete, 5,25 polegadas, 360 Kb de memória (Β) IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS (D) SOFTWARE: Wordperfect (vi) DADOS CORRENTES DE PEDIDO DE PATENTE:

(A) NÚMERO DO PEDIDO:

(B) DATA DE APRESENTAÇÃO:

(vii) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: 07/807,043 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 12 de DEZEMBRO DE 1991 (Vii) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: 07/764,364 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 23 de SETEMBRO de 1991

(vii) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: 07/728,838 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 9 de JULHO de 1991 (vii) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES:

(A) NÚMEROD OD PEDIDO: 07/705,702 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 23 de MAIO de 1991 (viii)INFORMAÇÃO DO PROCURADOR/AGENTE:

(A) NOME: Hanson, Norman D.

(B) NÚMERO DE REGISTO: 30,946 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/ASSUNTO: LUD 253.4 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÃO:

(A) TELEFONE: (212) 688-9200 (B) TELEFAX: (212) 838-3884

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 462 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE''MOLÉCULA: DNA genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

)ACCACAGGAG ATCACTCATT CTCGTGGGGG CTTGTGAATT CCCCCTCCCA AGAACTCTTC GTCAACGCCA TATCTTAACT

AATGAAAAGA GGGTGTCTGA GTTTGTGAGC TGTACCCTTT CCTCGTGCTG CGGAGGAAGG TTGCACTGAG TAGCTCGGCT

ACCCGGGACT GTTCTGCGAT CTTGGGTAGG CACGTAAAAA TGCTGAGTTT AGGGAGGACC CTGGTCGAAG TCCTGCTGGT

CCCAAAGACG ATTCATCCCT AAGTTTTGCA AGTAGTCCAG AGAAGTCTTC CCCCCCCTTT AAGTAAGCCG ACCCTTTGTG

CTAGATGTGT CAGCCAATGA AGTTCCGCCT AGTTTACTAC CTTATAGAAG GCTCTCCCAG CTAGCTTGCG CC

GAAGATCCTG GCTTACTGTT ACAGCTCTAG ACCCTCCCTC TCTTCCGTAT CATGCATTGT ACTCTACTCT

120 180 240 300 360 420 462

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 675 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE * MOLÉCULA: DNA genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

ATG

TCT

GAT

AAC

AAG

AAA

CCA

GAC

AAA

GCC

CAC’

AGT

GGC

TCA

GGT

GGT

48

Met

Ser

Asp

Asn

Lys

Lys

Pro

Asp

Lys

Ala

His

Ser

Gly

Ser

Gly

Gly

5

10

15

GAC

GGT

GAT

GGG

AAT

AGG

TGC

AAT

TTA

TTG

CAC

CGG

TAC

TCC

CTG

GAA

96

Asp

Gly

Asp

Gly

Asn

Arg

Cys

Asn

Leu

Leu

His

Arg

Tyr

Ser

Leu

Glu

20

25

30

GAA

ATT

CTG

CCT

TAT

CTA

GGG

TGG

CTG

GTC

TTC

GCT

GTT

GTC

ACA

ACA

144

Glu

Ile

Leu

Pro

Tyr

Leu

Gly

Trp

Leu

Val

Phe

Ala

Val

Val

Thr

Thr

35

40

45

AGT

TTT

CTG

GCG

CTC

CAG

ATG

TTC

ATA

GAC

GCC

CTT

TAT

GAG

GAG

CAG

192

Ser

Phe

Leu

Ala

Leu

Gin

Met

Phe

Ile

Asp

Ala

Leu

Tyr

Glu

Glu

Gin

50

55

60

TAT

GAA

AGG

GAT

GTG

GCC

TGG

ATA

GCC

AGG

CAA

AGC

AAG

CGC

ATG

TCC

240

Tyr

Glu

Arg

Asp

Val

Ala

Trp

Ile

Ala

Arg

Gin

Ser

Lys

Arg

Met

Ser

65

70

75

80

TCT

GTC

GAT

GAG

GAT

GAA

GAC

GAT

GAG

GAT

GAT

GAG

GAT

GAC

TAC

TAC

288

Ser

Val

Asp

Glu

Asp

Glu

Asp

Asp

Glu

Asp

Asp

Glu

Asp

Asp

Tyr

Tyr

85

90

95

GAC

GAC

GAG

GAC

GAC

GAC

GAC

GAT

GCC

TTC

TAT

GAT

GAT

GAG

GAT

GAT

336

Asp

Asp

Glu

Asp

Asp

Asp

Asp

Asp

Ala

Phe

Tyr

Asp

Asp

Glu

Asp

Asp

100

105

110

GAG

GAA·

GAA

GAA

TTG

GAG

AAC

CTG

ATG

GAT

GAT

GAA

TCA

GAA

GAT

GAG

384

Glu

Glu

Glu

G1U

Leu

G1U

Asn

Leu

Met

Asp

Asp

Glu

Ser

Glu

Asp

G1U

115

120

125

GCC

GAA

GAA

GAG

ATG

AGC

GTG

GAA

ATG

GGT

GCC

GGA

GCT

GAG

GAA

ATG

432

Ala

Glu

Glu

Glu

Met

Ser

Val

Glu

Met

Gly

Ala

Gly

Ala

Glu

Glu

Met

130

135

140

GGT

GCT

GGC

GCT

AAC

TGT

GCC

TGT

GTT

CCT

GGC

CAT

CAT

TTA

AGG

AAG

480

Gly

Ala

Gly

Ala

Asn

Cys

Ala

Cys

Val

Pro

Gly

HÍS

HÍS

Leu

Arg

Lys

145

150

155

160

AAT

GAA

GTG

AAG

TGT

AGG

ATG

ATT

TAT

TTC

TTC

CAC

GAC

CCT

AAT

TTC

528

Asn

Glu

Val

Lys

Cys

Arg

Met

Ile

Tyr

Phe

Phe

His

Asp

Pro

Asn

Phe

165

170

175

CTG

GTG

TCT

ATA

CCA

GTG

AAC

CCT

AAG

GAA

CAA

ATG

GAG

TGT

AGG

TGT

576

Leu

Val

Ser

Ile

Pro

Val

Asn

Pro

Lys

Glu

Gin

Met

Glu

Cys

Arg

Cys

180

185

190

GAA

AAT

GCT

GAT

GAA

GAG

GTT

GCA

ATG

GAA

GAG

GAA

GAA

GAA

GAA

GAG

624

Glu

Asn

Ala

Asp

Glu

Glu

Val

Ala

Met

Glu

Glu

Glu

Glu

G1U

Glu

Glu

195

200

210

GAG

GAG

GAG

GAG

GAA

GAG

GAA

ATG

GGA

AAC

CCG

GAT

GGC

TTC

TCA

CCT

672

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Met

Gly

Asn

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Pro

220

225

230

235

TAG

675

(2)

INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 228 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE'‘MOLÉCULA: DNA genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

GCATGCAGTT GCAAAGCCCA GAAGAAAGAA ATGGACAGCG GAAGAAGTGG TTGTTTTTTT TTCCCCTTCA TTAATTTTCT AGTTTTTAGT AATCCAGAAA ATTTGATTTT GTTCTAAAGT TCATTATGCA AAGATGTCAC CAACAGACTT CTGACTGCAT GGTGAACTTT CATATGATAC ATAGGATTAC ACTTGTACCT GTTAAAAATA AAAGTTTGAC TTGCATAC

120 180 228 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1365 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE^fMOLÉCULA: DNA genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

ACCACAGGAG AATGAAAAGA ACCCGGGACT CCCAAAGACG CTAGATGTGT50

GAAGATCCTG ATCACTCATT GGGTGTCTGA GTTCTGCGAT ATTCATCCCT100

CAGCCAATGA GCTTACTGTT CTCGTGGGGG GTTTGTGAGC CTTGGGTAGG150

AAGTTTTGCA AGTTCCGCCT ACAGCTCTAG CTTGTGAATT TGTACCCTTT200

CACGTAAAAA AGTAGTCCAG AGTTTACTAC ACCCTCCCTC CCCCCTCCCA250

CCTCGTGCTG TGCTGAGTTT AGAAGTCTTC CTTATAGAAG TCTTCCGTAT300

AGAACTCTTC CGGAGGAAGG AGGGAGGACC CCCCCCCTTT GCTCTCCCAG350

CATGCATTGT GTCAACGCCA TTGCACTGAG CTGGTCGAAG AAGTAAGCCG400

CTAGCTTGCG ACTCTACTCT TATCTTAACT TAGCTCGGCT TCCTGCTGGT450

ACCCTTTGTG CC462

ATG TCT GAT AAC AAG AAA CCA GAC AAA GCC CAC AGT GGC TCA504

GGT GGT GAC GGT GAT GGG AAT AGG TGC AAT TTA TTG CAC CGG54 6

TAC TCC CTG GAA GAA ATT CTG CCT TAT CTA GGG TGG CTG GTC588

TTC GCT GTT GTC ACA ACA AGT TTT CTG GCG CTC CAG ATG TTC630

ATA GAC GCC CTT TAT GAG GAG CAG TAT GAA AGG GAT GTG GCC672

TGG ATA GCC AGG CAA AGC AAG CGC ATG TCC TCT GTC GAT GAG714

GAT GAA GAC GAT GAG GAT GAT GAG GAT GAC TAC TAC GAC GAC756

GAG GAC GAC GAC GAC GAT GCC TTC TAT GAT GAT GAG GAT GAT798

GAG GAA GAA GAA TTG GAG AAC CTG ATG GAT GAT GAA TCA GAA840

GAT GAG GCC GAA GAA GAG ATG AGC GTG GAA ATG GGT GCC GGA882

GCT GAG GAA ATG GGT GCT GGC GCT AAC TGT GCC TGT GTT CCT924

GGC CAT CAT TTA AGG AAG AAT GAA GTG AAG TGT AGG ATG ATT966

TAT TTC TTC CAC GAC CCT AAT TTC CTG GTG TCT ATA CCA GTG1008

AAC CCT AAG GAA CAA ATG GAG TGT AGG TGT GAA AAT GCT GAT1050

GAA GAG GTT GCA ATG GAA GAG GAA GAA GAA GAA GAG GAG GAG1092

GAG GAG GAA GAG GAA ATG GGA AAC CCG GAT GGC TTC TCA CCT1134

TAG1137

GCATGCAGTT GCAAAGCCCA GAAGAAAGAA ATGGACAGCG GAAGAAGTGG1187

TTGTTTTTTT TTCCCCTTCA TTAATTTTCT AGTTTTTAGT AATCCAGAAA1237

ATTTGATTTT GTTCTAAAGT TCATTATGCA AAGATGTCAC CAACAGACTT1287

CTGACTGCAT GGTGAACTTT CATATGATAC ATAGGATTAC ACTTGTACCT1337

GTTAAAAATA AAAGTTTGAC TTGCATAC1365

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 469S pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE^MOLÊCULA: DNA genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA; SEQ ID NO: 5:

ACCACAGGAG AATGAAAAGA ACCCGGGACT CCCAAAGACG CTAGATGTGT GAAGATCCTG ATCACTCATT GGGTGTCTGA GTTCTGCGAT ATTCATCCCT CAGCCAATGA GCTTACTGTT CTCGTGGGGG GTTTGTGAGC CTTGGGTÀGG AAGTTTTGCA AGTTCCGCCT ACAGCTCTAG CTTGTGAATT TGTACCCTTT CACGTAAAAA AGTAGTCCAG AGTTTACTAC ACCCTCCCTC CCCCCTCCCA CCTCGTGCTG TGCTGAGTTT AGAAGTCTTC CTTATAGAAG TCTTCCGTAT AGAACTCTTC CGGAGGAAGG AGGGAGGACC CCCCCCCTTT GCTCTCCCAG CATGCATTGT GTCAACGCCA TTGCACTGAG CTGGTCGAAG AAGTAAGCCG CTAGCTTGCG ACTCTACTCT TATCTTAACT TAGCTCGGCT TCCTGCTGGT ACCCTTTGTG CC

ATG

TCT

GAT

AAC

AAG

AAA

CCA

GAC

AAA

GCC

CAC

AGT

GGC

TCA

GGT

GGT

GAC

GGT

GAT

GGG

AAT

AGG

TGC

AAT

TTA

TTG

CAC

CGG

TAC

TCC

CTG

GAA

GAA

ATT

CTG

CCT

TAT

CTA

GGG

TGG

CTG

GTC

TTC

GCT

GTT

GTC

ACA

ACA

AGT

TTT

CTG

GCG

CTC

CAG

ATG

TTC

ATA

GAC

GCC

CTT

TAT

GAG

GAG

CAG

TAT

GAA

AGG

GAT

GTG

GCC

TGG

ATA

GCC

AGG

CAA

AGC

AAG

CGC

ATG

TCC

TCT

GTC

GAT

GAG

GAT

GAA

GAC

GAT

GAG

GAT

GAT

GAG

GAT

GAC

TAC

TAC

GAC

GAC

GAG

GAC

GAC

GAC

GAC

GAT

GCC

TTC

TAT

GAT

GAT

GAG

GAT

GAT

GAG

GAA

GAA

GAA

TTG

GAG

AAC

CTG

ATG

GAT

GAT

GAA

TCA

GAA

GAT

GAG

GCC

GAA

GAA

GAG

ATG

AGC

GTG

GAA

ATG

GGT

GCC

GGA

GCT

GAG

GAA

ATG

GGT

GCT

GGC

GCT

AAC

TGT

GCC

T

GTGAGTAACC CTCTTGCCCA TGGAGCCATT CCCCACTCCT TTCAGTCCAT TCCCCCTCGG TTCAGGCTTC CCTTTTCGCG TCACCAGCTT TCCTGCTCCC CTACCTGCTT TGCTCCTCCC CCTCCCTCCC TTGGTTTTTC TCACTCTGTA CCTCCCAAAT GCCTTTCTTT AACTCCCCTT TTCCCTTCCG CCTCCCCCTC GCCCCGTTCC

CGTGGTCTTT CATCTGTAGT CCTGGCTCTC TGCTCCGCTC CCTGCTCTGC CTCAACTTTT CCCATTTGCT CCTTTTCTTT TGCTCTCCCT CTCCCCCTCC CCCTCCCCCT TCCCCCTCCC CCTCCCCAGG GAGACAGGGT GACCAGGCTG GCTGGGATTA TTTCTCCTCT TTGGCACCTT GCACCCTTCC TTTGCTCGAC CCTTTTTTGT

ACTCTAGATT AAAGACCACA CTGTCCACGC TCTTTCCTTT TCCCTTTCCC CGTGCCTTCT CCTCTCCCGA CCTGCTCCCC GCTCCCCTCC CCTCCCTGTT TGCTGCTCCC CCTCCCTCCC CCTTTTTTTT TTCTCTTTGT GCCTCAAACT AAGGCTTGCA CTGGTCTCCC TCCTTTACAG TAGCCCTGCT TTTTAGCAGC GCCTTTCCTC

CAGGTGGGGT TTTTGGTTGG CTATCCCCGC TCCCACCTTG CTTTGCTCTC GCTCTCTGAT AACCCTCCCC TCCCCCTCCC CCCTTTTGCA TACCCTTCAC TCCCTATTTG TATTTGCATT T Ί* T?

ATCCCTGGCT CAGAAATCTG CCAGGACTGC TAATCCCTTT GACCCCCTCC CTGTTCCCTC CTTACCTCTC CTGGCTCCCC

GCATTCTTTA GGGTCATTGC TCCTCCCATC CCTCTGGAGC CTTGCTCCCC CCCCACCCTC TTCCTGTTCC TATTTACCTT CCTTTTCTTT CGCTTTTCCT CATTTTCGGG TTCGGGTGCT

GTCCTGGCAC CCTGCCTCTG CCCAGTGCAG TCTGCATGTT CCCTCCCTGT TCCCTGCTCC CCTGCTTTCT TCCACCTTCC

100

150

200

250

300

350

400

450

462

504

546

588

630

672

714

756

798

840

882

916

966 1016 1066 1116 1166 1216 1266 1316 1366 1416 1466 1516 1566 1616 1666 1716 1766 1816 1866 1916 1966

AGCTCACCTT TTTGTTTGTT TGGTTGTTTG GTTGTTTGGT TTGCTTTTTT 2016 _TTTTTTTTTT GCACCTTGTT TTCCAAGATC CCCCTCCCCC TCCGGCTTCC 2066 CCTCTGTGTG CCTTTCCTGT TCCCTCCCCC TCGCTGGCTC CCCCTCCCTT 2116 TCTGCCTTTC CTGTCCCTGC TCCCTTCTCT GCTAACCTTT TAATGCCTTT 2166 CTTTTCTAGA CTCCCCCCTC CAGGCTTGCT GTTTGCTTCT GTGCACTTTT 2216 CCTGACCCTG CTCCCCTTCC CCTCCCAGCT CCCCCCTCTT TTCCCACCTC 2266 CCTTTCTCCA GCCTGTCACC /CCTCCTTCTC TCCTCTCTGT TTCTCCCACT 2316 TCCTGCTTCC TTTACCCCTT CCCTCTCCCT ACTCTCCTCC CTGCCTGCTG 2366 GACTTCCTCT CCAGCCGCCC AGTTCCCTGC AGTCCTGGAG TCTTTCCTGC 2416 CTCTCTGTCC ATCACTTCCC CCTAGTTTCA CTTCCCTTTC ACTCTCCCCT 2466 ATGTGTCTCT CTTCCTATCT ATCCCTTCCT TTCTGTCCCC TCTCCTCTGT 2516 CCATCACCTC TCTCCTCCCT TCCCTTTCCT CTCTCTTCCA TTTTCTTCCA 2566 CCTGCTTCTT TACCCTGCCT CTCCCATTGC CCTCTTACCT TTATGCCCAT 2616 TCCATGTCCC CTCTCAATTC CCTGTCCCAT TGTGCTCCCT CACATCTTCC 2666 ATTTCCCTCT TTCTCCCTTA GCCTCTTCTT CCTCTTCTCT TGTATCTCCC 2716 TTCCCTTTGC TTCTCCCTCC TCCTTTCCCC TTCCCCTATG CCCTCTACTC 2766 TACTTGATCT TCTCTCCTCT CCACATACCC TTTTTCCTTT CCACCCTGCC 2816 CTTTGTCCCC AGACCCTACA GTATCCTGTG CACAGGAAGT GGGAGGTGCC 2866 ATCAACAACA AGGAGGCAAG AAACAGAGCA AAATCCCAAA ATCAGCAGGA 2916 AAGGCTGGAT GAAAATAAGG CCAGGTTCTG AGGACAGCTG GAATCTAGCC 2966 AAGTGGCTCC TATAACCCTA AGTACCAAGG GAGAAAGTGA TGGTGAÂGTT 3016 CTTGATCCTT GCTGCTTCTT TTACATATGT TGGCACATCT TTCTCAAATG 3066 CAGGCCATGC TCCATGCTTG GCGCTTGCTC AGCGTGGTTA AGTAATGGGA 3116 GAATCTGAAA ACTAGGGGCC AGTGGTTTGT TTTGGGGACA AATTAGCACG 3166 TAGTGATATT TCCCCCTAAA AATTATAACA AACAGATTCA TGATTTGAGA 3216 TCCTTCTACA GGTGAGAAGT GGAAAAATTG TCACTATGAA GTTCTTTTTA 3266 GGCTAAAGAT ACTTGGAACC ATAGAAGCGT TGTTAAAATA CTGCTTTCTT 3316 TTGCTAAAAT ATTCTTTCTC ACATATTCAT ATTCTCCAG 3355

GT GTT CCT GGC CAT CAT TTA AGG AAG AAT GAA GTG AAG TGT 3396 AGG ATG ATT TAT TTC TTC CAC GAC CCT AAT TTC CTG GTG TCT 3438 ATA CCA GTG AAC CCT AAG GAA CAA ATG GAG TGT AGG TGT GAA 3480 AAT G.CT GAT GAA GAG GTT GCA ATG GAA GAG GAA GAA GAA GAA 3522 GAG GAG GAG GAG GAG GAA GAG GAA ATG GGA AAC CCG GAT GGC 3564 TTC TCA CCT TAG 3576 GCATGCAGGT ACTGGCTTCA CTAACCAACC ATTCCTAACA TATGCCTGTA 3626 GCTAAGAGCA TCTTTTTAAA AAATATTATT GGTAAACTAA ACAATTGTTA 3676 TCTTTTTACA TTAATAAGTA TTAAATTAAT CCAGTATACA GTTTTAAGAA 3726 CCCTAAGTTA AACAGAAGTC AATGATGTCT AGATGCCTGT TCTTTAGATT 3776 GTAGTGAGAC TACTTACTAC AGATGAGAAG TTGTTAGACT CGGGAGTAGA 3826 GACCAGTAAA AGATCATGCA GTGAAATGTG GCCATGGAAA TCGCATATTG 3876 TTCTTATAGT ACCTTTGAGA CAGCTGATAA CAGCTGACAA AAATAAGTGT 3926 TTCAAGAAAG ATCACACGCC ATGGTTCACA TGCAAATTAT TATTTTGTCG 3976 TTCTGATTTT TTTCATTTCT AGACCTGTGG TTTTAAAGAG ATGAAAATCT 4026 CTTAAAATTT CCTTCATCTT TAATTTTCCT TAACTTTAGT TTTTTTCACT 4076 TAGAATTCAA TTCAAATTCT TAATTCAATC TTAATTTTTA GATTTCTTAA 4126 AATGTTTTTT AAAAAAAATG CAAATCTCAT TTTTAAGAGA TGAAAGCAGA 4176 GTAACTGGGG GGCTTAGGGA ATCTGTAGGG TTGCGGTATA GCAATAGGGA 4226 GTTCTGGTCT CTGAGAAGCA GTCAGAGAGA ATGGAAAACC AGGCCCTTGC 4276 CAGTAGGTTA GTGAGGTTGA TATGATCAGA TTATGGACAC TCTCCAAATC 4326 ATAAATACTC TAACAGCTAA GGATCTCTGA GGGAAACACA ACAGGGAAAT 4376 ATTTTAGTTT CTCCTTGAGA AACAATGACA AGACATAAAA TTGGCAAGAA 4426

AGTCAGGAGT GTATTCTAAT AAGTGTTGCT TATCTCTTAT TTTCTTCTAC4476

AGTTGCAAAG CCCAGAAGAA AGAAATGGAC AGCGGAAGAA GTGGTTGTTT4526

TTTTTTCCCC TTCATTAATT TTCTAGTTTT TAGTAATCCA GAAAATTTGA4576

TTTTGTTCTA AAGTTCATTA TGCAAAGATG TCACCAACAG ACTTCTGACT4626 ι GCATGGTGAA CTTTCATATG ATACATAGGA TTACACTTGT ACCTGTTAAA4676

AATAAAAGTT TGACTTGCAT AC4698

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Leu Pro Tir Leu Gli Trp Leu Vai Fen

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 2418 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE^fMOLÉCULA: DNA genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA; SEQ ID NO: 7;

GGATCCAGGC CCTGCCAGGA AAAATATAAG GGGGTCATCC ACTGCATGAG AGTGGGGATG TCCTGGTAGC ACTGAGAAGC CAGGGCTGTG GGCCCGTGGA TTCCTCTTCC TGGAGCTCCA TGGTCTGAGA CAGTATCCTC AGGTCACAGA GCCAGCAGTG AATGTTTGCC CTGAATGCAC CAGGACACAT AGGACTCCAC AGAGTCTGGC CCTGTAGAAT CGACCTCTGC TGGCCGGCTG TTCCTCCTTC AGGTTTTCAG GGGACAGGCC CTGGAGGCCA CAGAGGAGCA CCAAGGAGAA TTAGAGTCTC CAAGGTTCAG TTCTCAGCTG CTCTCCCCAG GCCTGTGGGT CTTCATTGCC GCCTGCTGCC CTGACGAGAG TCATCATGTC ACTGCAAGCC TGAGGAAGCC CTTGAGGCCC GTGTGTGTGC AGGCTGCCAC CTCCTCCTCC CCTGGAGGAG GTGCCCACTG CTGGGTCAAC AGGGAGCCTC CGCCTTTCCC ACTACCATCA CCCAGTGAGG GTTCCAGCAG CCGTGAAGAG TATCCTGGAG TCCTTGTTCC GAGCAGTAAT TGGTTGGTTT TCTGCTCCTC AAATATCGAG GCAGAAATGC TGGAGAGTGT CATCAAAAAT GATCTTCGGC AAAGCCTCTG AGTCCTTGCA TGAAGGAAGC AGACCCCACC GGCCACTCCT GGTCTCTCCT ATGATGGCCT GCTGGGTGAT AGGCTTCCTG ATAATTGTCC TGGTCATGAT CTCCTGAGGA GGAAATCTGG GAGGAGCTGA GGGAGGGAGC ACAGTGCCTA TGGGGAGCCC TTTGGTGCAG GAAAAGTACC TGGAGTACGG CGCACGCTAT GAGTTCCTGT GGGGTCCAAG ATGTGAAAGT CCTTGAGTAT GTGATCAAGG TTCTTCCCAT CCCTGCGTGA AGCAGCTTTG CTGAGCATGA GTTGCAGCCA AGGCCAGTGG ACCTTCCAGG GCCGCGTCCA GCAGCTTCCC CCCATTCTTC ACTCTGAAGA GAGCGGTCAG TGTTCTATTG GGTGACTTGG AGATTTATCT TCAAATGTTT TTTTTTAAGG GATGGTTGAA TATGAATGAC AGCAGTCACA CAGTTCTGTG GTCTTGTGTT TTATTCAGAT TGGGAAATCC ATAATAACAG CAGTGGAATA AGTACTTAGA AAATAGATGA GATAAAGAAC TAAAGAAATT CTTATACCTC AGTCTATTCT GTAAAATTTT

GGCCCTGCGT GAGAACAGAG 50 TCACAGAGTC CAGCCCACCC 100 CTTGCGGTCT GCACCCTGAG 150 GGAACCAGGC AGTGAGGCCT 200 GCAGAGGATG CACAGGGTGT 250 ACCAAGGGCC CCACCTGCCA 300 CTCACCTCCC TACTGTCAGT 350 TACCCTGAGT ACCCTCTCAC 400 AACCCAGAGG ACAGGATTCC 450 GATCTGTAAG TAGGCCTTTG 500 AGGCCTCTCA CACACTCCCT 550 CAGCTCCTGC CCACACTCCT 600 TCTTGAGCAG AGGAGTCTGC 650 AACAAGAGGC CCTGGGCCTG 700 TCTCCTCTGG TCCTGGGCAC 750 AGATCCTCCC CAGAGTCCTC 800 ACTTCACTCG ACAGAGGCAA 850 GAGGGGCCAA GCACCTCTTG 900 CACTAAGAAG GTGGCTGATT 950 CCAGGGAGCC AGTCACAAAG 1000 TACAAGCACT GTTTTCCTGA 1050 GCTGGTCTTT GGCATTGACG 1100 ATGTCCTTGT CACCTGCCTA 1150 AATCAGATCA TGCCCAAGAC 1200 TGCAATGGAG GGCGGCCATG 1250 GTGTGATGGA GGTGTATGAT 1300 AGGAAGCTGC TCACCCAAGA 1350 CAGGTGCCGG ACAGTGATCC 1400 GGCCCTCGCT GAAACCAGCT 1450 TCAGTGCAAG AGTTCGCTTT 1500 AGAGAGGAGG AAGAGGGAGT 1550 GAGGGGGACT GGGCCAGTGC 1600 CTGCCTCGTG TGACATGAGG 1650 TGTTCTCAGT AGTAGGTTTC 1700 TTGTTCTCTT TTGGAATTGT 1750 TGAACTTCAG CATCCAAGTT 1800 TATATAGTTT AAGGGTAAGA 1850 ATTCTATTTT GTGAATTGGG 1900 AATGTGAAAA ATGAGCAGTA 1950 AAGAGATAGT CAATTCTTGC 2000 TAAAGATATA TGCATACCTG 2050

GATTTCCTTG GCTTCTTTGA GAATGTAAGA GAAATTAAAT CTGAATAAAG AATTCTTCCT GTTCACTGGC TCTTTTCTTC TCCATGCACT GAGCATCTGC TTTTTGGAAG GCCCTGGGTT AGTAGTGGAG ATGCTAAGGT AAGCCAGACT CATACCCACC CATAGGGTCG TAGAGTCTAG GAGCTGCAGT CACGTAATCG AGGTGGCAAG ATGTCCTCTA AAGATGTAGG GAAAAGTGAG AGAGGGGTGA GGGTGTGGGG CTCCGGGTGA GAGTGGTGGA GTGTCAATGC CCTGAGCTGG GGCATTTTGG GCTTTGGGAA ACTGCAGTTC CTTCTGGGGG AGCTGATTGT AATGATCTTG GGTGGATCC

2100

2150

2200

2250

2300

2350

2400

2418

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 5724 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE^!MOLÉCULA: DNA genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

CCCGGGGCAC CACTGGCATC CCTCCCCCTA CCACCCCCAA TCCCTCCCTT50

TACGCCACCC ATCCAAACAT CTTCACGCTC ACCCCCAGCC CAAGCCAGGC100

AGAATCCGGT TCCACCCCTG CTCTCAACCC AGGGAAGCCC AGGTGCCCAG150

ATGTGACGCC ACTGACTTGA GCATTAGTGG TTAGAGAGAA GCGAGGTTTT200

CGGTCTGAGG GGCGGCTTGA GATCGGTGGA GGGAAGCGGG CCCAGCTCTG250

TAAGGAGGCA AGGTGACATG CTGAGGGAGG ACTGAGGACC CACTTACCCC300

AGATAGAGGA CCCCAAATAA TCCCTTCATG CCAGTCCTGG ACCATCTGGT350

GGTGGACTTC TCAGGCTGGG CCACCCCCAG CCCCCTTGCT GCTTAAACCA400

CTGGGGACTC GAAGTCAGAG CTCCGTGTGA TCAGGGAAGG GCTGCTTAGG450

AGAGGGCAGC GTCCAGGCTC TGCCAGACAT CATGCTCAGG ATTCTCAAGG500

AGGGCTGAGG GTCCCTAAGA CCCCACTCCC GTGACCCAAC CCCCACTCCA550

ATGCTCACTC CCGTGACCCA ACCCCCTCTT CATTGTCATT CCAACCCCCA600

CCCCACATCC CCCACCCCAT CCCTCAACCC TGATGCCCAT CCGCCCAGCC650

ATTCCACCCT CACCCCCACC CCCACCCCCA CGCCCACTCC CACCCCCACC700

CAGGCAGGAT CCGGTTCCCG CCAGGAAACA TCCGGGTGCC CGGATGTGAC750

GCCACTGACT TGCGCATTGT GGGGCAGAGA GAAGCGAGGT TTCCATTCTG800

AGGGACGGCG TAGAGTTCGG CCGAAGGAAC CTGACCCAGG CTCTGTGAGG850

AGGCAAGGTG AGAGGCTGAG GGAGGACTGA GGACCCCGCC ACTCCAAATA900

GAGAGCCCCA AATATTCCAG CCCCGCCCTT GCTGCCAGCC CTGGCCCACC950

CGCGGGAAGA CGTCTCAGCC TGGGCTGCCC CCAGACCCCT GCTCCAAAAG1000

CCTTGAGAGA CACCAGGTTC TTCTCCCCAA GCTCTGGAAT CAGAGGTTGC1050

TGTGACCAGG GCAGGACTGG TTAGGAGAGG GCAGGGCACA GGCTCTGCCA1100

GGCATCAAGA TCAGCACCCA AGAGGGAGGG CTGTGGGCCC CCAAGACTGC1150

ACTCCAATCC CCACTCCCAC CCCATTCGCA TTCCCATTCC CCACCCAACC1200

CCCATCTCCT CAGCTACACC TCCACCCCCA TCCCTACTCC TACTCCGTCA1250

CCTGACCACC ACCCTCCAGC CCCAGCACCA GCCCCAACCC TTCTGCCACC1300

TCACCCTCAC TGCCCCCAAC CCCACCCTCA TCTCTCTCAT GTGCCCCACT1350

CCCATCGCCT CCCCCATTCT GGCAGAATCC GGTTTGCCCC TGCTCTCAAC1400

CCAGGGAAGC CCTGGTAGGC CCGATGTGAA ACCACTGACT TGAACCTCAC1450

AGATCTGAGA GAAGCCAGGT TCATTTAATG GTTCTGAGGG GCGGCTTGAG1500

ATCCACTGAG GGGAGTGGTT TTAGGCTCTG TGAGGAGGCA AGGTGAGATG1550

CTGAGGGAGG ACTGAGGAGG CACACACCCC AGGTAGATGG CCCCAAAATG1600

ATCCAGTACC ACCCCTGCTG CCAGCCCTGG ACCACCCGGC CAGGACAGAT1650

GTCTCAGCTG GACCACCCCC CGTCCCGTCC CACTGCCACT TAACCCACAG1700

GGCAATCTGT AGTCATAGCT TATGTGACCG GGGCAGGGTT GGTCAGGAGA1750

GGCAGGGCCC AGGCATCAAG GTCCAGCATC CGCCCGGCAT TAGGGTCAGG1800

ACCCTGGGAG GGAACTGAGG GTTCCCCACC CACACCTGTC TCCTCATCTC1850

CACCGCCACC CCACTCACAT TCCCATACCT ACCCCCTACC CCCAACCTCA1900

TCTTGTCAGA ATCCCTGCTG TCAACCCACG GAAGCCACGG GAATGGCGGC '1950

CAGGCACTCG GATCTTGACG TCCCCATCCA GGGTCTGATG GAGGGAAGGG2000

GCTTGAACAG GGCCTCAGGG GAGCAGAGGG AGGGCCCTAC TGCGAGATGA2050 χΓ

GGGAGGCCTC AGAGGACCCA GCACCCTAGG ACACCGCACC CCTGTCTGAG 2100 ACTGAGGCTG CCACTTCTGG CCTCAAGAAT CAGAACGATG GGGACTCAGA 2150 TTGCATGGGG GTGGGACCCA GGCCTGCAAG GCTTACGCGG AGGAAGAGGA 2200 GGGAGGACTC AGGGGACCTT GGAATCCAGA TCAGTGTGGA CCTCGGCCCT 2250 GAGAGGTCCA GGGCACGGTG GCCACATATG GCCCATATTT CCTGCATCTT 2300 TGAGGTGACA GGACAGAGCT GTGGTCTGAG AAGTGGGGCC TCAGGTCAAC 2350 AGAGGGAGGA GTTCCAGGAT CCATATGGCC CAAGATGTGC CCCCTTCATG 2400 AGGACTGGGG ATATCCCCGG CTCAGAAAGA AGGGACTCCA CACAGTCTGG 2450 CTGTCCCCTT TTAGTAGCTC ΊΆσσΟΟσΑΟΟ AGATCAGGGA TGGCGGTATG 2500 TTCCATTCTC ACTTGTACCA CAGGCAGGAA GTTGGGGGGC CCTCAGGGAG 2550 ATGGGGTCTT GGGGTAAAGG GGGGATGTCT ACTCATGTCA GGGAATTGGG 2600 GGTTGAGGAA GCACAGGCGC TGGCAGGAAT AAAGATGAGT GAGACAGACA 2650 AGGCTATTGG AATCCACACC CCAGAACCAA AGGGGTCAGC CCTGGACACC 2700 TCACCCAGGA TGTGGCTTCT TTTTCACTCC TGTTTCCAGA TCTGGGGCAG 2750 GTGAGGACCT CATTCTCAGA GGGTGACTCA GGTCAACGTA GGGACCCCCA 2800 TCTGGTCTAA AGACAGAGCG GTCCCAGGAT CTGCCATGCG TTCGGGTGAG 2850 GAACATGAGG GAGGACTGAG GGTACCCCAG GACCAGAACA CTGAGGGAGA 2900 CTGCACAGAA ATCAGCCCTG CCCCTGCTGT CACCCCAGAG AGCATGGGCT 2950 GGGCCGTCTG CCGAGGTCCT TCCGTTATCC TGGGATCATT GATGTCAGGG 3000 ACGGGGAGGC CTTGGTCTGA GAAGGCTGCG CTCAGGTCAG TAGAGGÇAGC 3050 GTCCCAGGCC CTGCCAGGAG TCAAGGTGAG GACCAAGCGG GCACCTCACC 3150 CAGGACACAT TAATTCCAAT GAATTTTGAT ATCTCTTGCT GCCCTTCCCC 3200 AAGGACCTAG GCACGTGTGG CCAGATGTTT GTCCCCTCCT GTCCTTCCAT 3250 TCCTTATCAT GGATGTGAAC TCTTGATTTG GATTTCTCAG ACCAGCAAAA 3300 GGGCAGGATC CAGGCCCTGC CAGGAAAAAT ATAAGGGCCC TGCGTGAGAA 3350 CAGAGGGGGT CATCCACTGC ATGAGAGTGG GGATGTCACA GAGTCCAGCC 3400 CACCCTCCTG GTAGCACTGA GAAGCCAGGG CTGTGCTTGC GGTCTGCACC 3450 CTGAGGGCCC GTGGATTCCT CTTCCTGGAG CTCCAGGAAC CAGGCAGTGA 3500 GGCCTTGGTC TGAGACAGTA TCCTCAGGTC ACAGAGCAGA GGATGCACAG 3550 GGTGTGCCAG CAGTGAATGT TTGCCCTGAA TGCACACCAA GGGCCCCACC 3600 TGCCACAGGA CACATAGGAC TCCACAGAGT CTGGCCTCAC CTCCCTACTG 3650 TCAGTCCTGT AGAATCGACC TCTGCTGGCC GGCTGTACCC TGAGTACCCT 3700 CTCACTTCCT CCTTCAGGTT TTCAGGGGAC AGGCCAACCC AGAGGACAGG 3750 ATTCCCTGGA GGCCACAGAG GAGCACCAAG GAGAAGATCT GTAAGTAGGC 3800 CTTTGTTAGA GTCTCCAAGG TTCAGTTCTC AGCTGAGGCC TCTCACACAC 3850 TCCCTCTCTC CCCAGGCCTG TGGGTCTTCA TTGCCCAGCT CCTGCCCACA 3900 CTCCTGCCTG CTGCCCTGAC GAGAGTCATC 3930 ATG TCT CTT GAG CAG AGG AGT CTG CAC TGC AAG CCT GAG GAA 3972 GCC CTT GAG GCC CAA CAA GAG GCC CTG GGC CTG GTG TGT GTG 4014 CAG GCT GCC ACC TCC TCC TCC TCT CCT CTG GTC CTG GGC ACC 4056 CTG GAG GAG GTG CCC ACT GCT GGG TCA ACA GAT CCT CCC CAG 4098 AGT CCT CAG GGA GCC TCC GCC TTT CCC ACT ACC ATC AAC TTC 4140 ACT CGA CAG AGG CAA CCC AGT GAG GGT TCC AGC AGC CGT GAA 4182 GAG GAG GGG CCA AGC ACC TCT TGT ATC CTG GAG TCC TTG TTC 4224 CGA GCA GTA ATC ACT AAG AAG GTG GCT GAT TTG GTT GGT TTT 4266 CTG CTC CTC AAA TAT CGA GCC AGG GAG CCA GTC ACA AAG GCA 4308 GAA ATG CTG GAG AGT GTC ATC AAA AAT TAC AAG CAC TGT TTT 4350 CCT GAG ATC TTC GGC AAA GCC TCT GAG TCC TTG CAG CTG GTC 4392 TTT GGC ATT GAC GTG AAG GAA GCA GAC CCC ACC GGC CAC TCC 4434 TAT GTC CTT GTC ACC TGC CTA GGT CTC TCC TAT GAT GGC CTG 4476 CTG GGT GAT AAT CAG ATC ATG CCC AAG ACA GGC TTC CTG ATA 4518 ATT GTC CTG GTC ATG ATT GCA ATG GAG GGC GGC CAT GCT CCT 4560 GAG GAG GAA ATC TGG GAG GAG CTG AGT GTG ATG GAG GTG TAT 4602 GAT GGG AGG GAG CAC AGT GCC TAT GGG GAG CCC AGG AAG CTG 4644

CTC ACC CAA GAT TTG GTG CAG GAA AAG TAC CTG GAG TAC GGC4686

AGG TGC CGG ACA GTG ATC CCG CAC GCT ATG AGT TCC TGT GGG4728

GTC CAA GGG CCC TCG CTG^AAA CCA GCT ATG TGA4761

AAGTCCTTGA GTATGTGATC AAGGTCAGTG CAAGAGTTC4800

GCTTTTTCTT CCCATCCCTG CGTGAAGCAG CTTTGAGAGA GGAGGAAGAG4850

GGAGTCTGAG CATGAGTTGC AGCCAAGGCC AGTGGGAGGG GGACTGGGCC4900

AGTGCACCTT CCAGGGCCGC GTCCAGCAGC TTCCCCTGCC TCGTGTGACA4950

TGAGGCCCAT TCTTCACTCT GAAGAGAGCG GTCAGTGTTC TCAGTAGTAG5000

GTTTCTGTTC TATTGGGTGA CTTGGAGATT TATCTTTGTT CTCTTTTGGA5050

ATTGTTCAÀA TGTTTTTTTT TAAGGGATGG TTGAATGAAC TTCAGCATCC5100

AAGTTTATGA ATGACAGCAG TCACACAGTT CTGTGTATAT AGTTTAAGGG5150

TAAGAGTCTT GTGTTTTATT CAGATTGGGA AATCCATTCT ATTTTGTGAA5200

TTGGGATAAT AACAGCAGTG GAATAAGTAC TTAGAAATGT GAAAAATGAG5250

CAGTAAAATA GATGAGATAA AGAACTAAAG AAATTAAGAG ATAGTCAATT5300

CTTGCCTTAT ACCTCAGTCT ATTCTGTAAA ATTTTTAAAG ATATATGCAT5350

ACCTGGATTT CCTTGGCTTC TTTGAGAATG TAAGAGAAAT TAAATCTGAA5400

TAAAGAATTC TTCCTGTTCA CTGGCTCTTT TCTTCTCCAT GCACTGAGCA5450

TCTGCTTTTT GGAAGGCCCT GGGTTAGTAG TGGAGATGCT AAGGTAAGCC5500

AGACTCATAC CCACCCATAG GGTCGTAGAG TCTAGGAGCT GCAGTCACGT5550

AATCGAGGTG GCAAGATGTC CTCTAAAGAT GTAGGGAAAA GTGAGAGAGG5600

GGTGAGGGTG TGGGGCTCCG GGTGAGAGTG GTGGAGTGTC AATGCCCTGA5650

GCTGGGGCAT TTTGGGCTTT GGGAAACTGC AGTTCCTTCT GGGGGAGCTG5700

TTGTAATGA TCTTGGGTGG ATCC5724 χ' .

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 4157 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE^fMOLÉCULA: DNA genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9:

CCCATCCAGA TCCCCATCCG GGCAGAATCC GGTTCCACCC TTGCCGTGAA50

CCCAGGGAAG TCACGGGCCC GGATGTGACG CCACTGACTT GCACATTGGA100

GGTCAGAGGA CAGCGAGATT CTCGCCCTGA GCAACGGCCT GACGTCGGCG150

GAGGGAAGCA GGCGCAGGCT CCGTGAGGAG GCAAGGTAAG ACGCCGAGGG200

AGGACTGAGG CGGGCCTCAC CCCAGACAGA GGGCCCCCAA TTAATCCAGC250

GCTGCCTCTG CTGCCGGGCC TGGACCACCC TGCAGGGGAA GACTTCTCAG300

GCTCAGTCGC CACCACCTCA CCCCGCCACC CCCCGCCGCT TTAACCGCAG350

GGAACTCTGG CGTAAGAGCT TTGTGTGACC AGGGCAGGGC TGGTTAGAAG400

TGCTCAGGGC CCAGACTCAG CCAGGAATCA AGGTCAGGAC CCCAAGAGGG450

GACTGAGGGC AACCCACCCC CTACCCTCAC TACCAATCCC ATCCCCCAAC500

ACCAACCCCA CCCCCATCCC TCAAACACCA ACCCCACCCC CAAACCCCAT550

TCCCATCTCC TCCCCCACCA CCATCCTGGC AGAATCCGGC TTTGCCCCTG600

CAATCAACCC ACGGAAGCTC CGGGAATGGC GGCCAAGCAC GCGGATCCTG650

ACGTTCACAT GTACGGCTAA GGGAGGGAAG GGGTTGGGTC TCGTGAGTAT700

GGCCTTTGGG ATGCAGAGGA AGGGCCCAGG CCTCCTGGAA GACAGTGGAG750

TCCTTAGGGG ACCCAGCATG CCAGGACAGG GGGCCCACTG TACCCCTGTC800

TCAAACTGAG CCACCTTTTC ATTCAGCCGA GGGAATCCTA GGGATGCAGA850

CCCACTTCAG GGGGTTGGGG CCCAGCCTGC GAGGAGTCAA GGGGAGGAAG900

AAGAGGGAGG ACTGAGGGGA CCTTGGAGTC CAGATCAGTG GCAACCTTGG950

GCTGGGGGAT CCTGGGCACA GTGGCCGAAT GTGCCCCGTG CTCATTGCAC1000

CTTCAGGGTG ACAGAGAGTT GAGGGCTGTG GTCTGAGGGC TGGGACTTCA1050

GGTCAGCÀGA GGGAGGAATC CCAGGATCTG CCGGACCCAA GGTGTGCCCC1100

CTTCATGAGG ACTCCCCATA CCCCCGGCCC AGAAAGAAGG GATGCCACAG1150

AGTCTGGAAG TAAATTGTTC TTAGCTCTGG GGGAACCTGA TCAGGGATGG1200

CCCTAAGTGA CAATCTCATT TGTACCACAG GCAGGAGGTT GGGGAACCCT1250

CAGGGAGATA AGGTGTTGGT GTAAAGAGGA GCTGTCTGCT CATTTCAGGG1300

GGTTCCCCCT TGAGAAAGGG CAGTCCCTGG CAGGAGTAAA GATGAGTAAC1350

CCACAGGAGG CCATCATAAC GTTCACCCTA GAACCAAAGG GGTCAGCCCT1400

GGACAACGCA CGTGGGGTAA CAGGATGTGG CCCCTCCTCA CTTGTCTTTC1450

CAGATCTCAG GGAGTTGATG ACCTTGTTTT CAGAAGGTGA CTCAGTCAAC1500

ACAGGGGCCC CTCTGGTCGA CAGATGCAGT GGTTCTAGGA TCTGCCAAGC1550

ATCCAGGTGG AGAGCCTGAG GTAGGATTGA GGGTACCCCT GGGCCAGAAT1600

GCAGCAAGGG GGCCCCATAG AAATCTGCCC TGCCCCTGCG GTTACTTCAG1650

AGACCCTGGG CAGGGCTGTC AGCTGAAGTC CCTCCATTAT CTGGGATCTT1700

TGATGTCAGG GAAGGGGAGG CCTTGGTCTG AAGGGGCTGG AGTCAGGTCA1750

GTAGAGGGAG GGTCTCAGGC CCTGCCAGGA GTGGACGTGA GGACCAAGCG1800

GACTCGTCAC CCAGGACACC TGGACTCCAA TGAATTTGAC ATCTCTCGTT1850

GTCCTTCGCG GAGGACCTGG TCACGTATGG CCAGATGTGG GTCCCCTCTA1900

TCTCCTTCTG TACCATATCA GGGATGTGAG TTCTTGACAT GAGAGATTCT1950

CAAGCCAGCA AAAGGGTGGG ATTAGGCCCT ACAAGGAGAA AGGTGAGGGC2000

CCTGAGTGAG CACAGAGGGG ACCCTCCACC CAAGTAGAGT GGGGACCTCA2050

CGGAGTCTGG CCAACCCTGC TGAGACTTCT GGGAATCCGT GGCTGTGCTT 2100

GCAGTCTGCA CACTGAAGGC CCGTGCATTC CTCTCCCAGG AATCAGGAGC 2150

TCCAGGAACC AGGCAGTGAG GçCCTTGGTCT GAGTCAGTGC CTCAGGTCAC 2200

AGAGCAGAGG GGACGCAGAC AGTGCCAACA CTGAAGGTTT GCCTGGAATG 2250

J CACACCAAGG GCCCCACCCG CCCAGAACAA ATGGGACTCC AGAGGGCCTG 2300

GCCTCACCCT CCCTATTCTC AGTCCTGCAG CCTGAGCATG TGCTGGCCGG2350

CTGTACCCTG AGGTGCCCTC CCACTTCCTC CTTCAGGTTC TGAGGGGGAC2400

AGGCTGACAA GTAGGACCCG AGGCACTGGA GGAGCATTGA AGGAGAAGAT2450

CTGTAAGTAA GCCTTTGTCA GAGCCTCCAA GGTTCAGTTC AGTTCTCACC2500

TAAGGCCTCA CACACGCTCC TTCTCTCCCC AGGCCTGTGG GTCTTCATTG2550

CCCAGCTCCT GCCCGCACTC CTGCCTGCTG CCCTGACCAG AGTCATC2597

I ATG CCT CTT GAG CAG AGG AGT CAG CAC TGC AAG CCT GAA GAA2639

GGC CTT GAG GCC CGA GGA GAG GCC CTG GGC CTG GTG GGT GCG2681

CAG GCT CCT GCT ACT GAG GAG CAG CAG ACC GCT TCT TCC TCT2723

TCT ACT CTA GTG GAA GTT ACC CTG GGG GAG GTG CCT GCT GCC2765

GAC TCA CCG AGT CCT CCC CAC AGT CCT CAG GGA GCC TCC AGC2807

TTC TCG ACT ACC ATC AAC TAC ACT CTT TGG AGA CAA TCC GAT2849

GAG GGC TCC AGC AAC CAA GAA GAG GAG GGG CCA AGA ATG TTT2891

CCC GAC CTG GAG TCC GAG TTC CAA GCA GCA ATC AGT AGG AAG2933

ATG GTT GAG TTG GTT CAT TTT CTG CTC CTC AAG TAT CGA GCC2975

AGG GAG CCG GTC ACA AAG GCA GAA ATG CTG GAG AGT GTC CTC3 017

AGA AAT TGC CAG GAC TTC TTT CCC GTG ATC TTC AGC AAA GCC3 059

TCC GAG TAC TTG CAG CTG GTC TTT GGC ATC GAG GTG GTG GAA3101

GTG GTC CCC ATC AGC CAC TTG TAC ATC CTT GTC ACC TGC CTG3143

GGC CTC TCC TAC GAT GGC CTG CTG GGC GAC AAT CAG GTC ATG3185

CCC AAG ACA GGC CTC CTG ATA ATC GTC CTG GCC ATA ATC GCA3227

ATA GAG GGC GAC TGT GCC CCT GAG GAG AAA ATC TGG GAG GAG3269

CTG AGT ATG TTG GAG GTG TTT GAG GGG AGG GAG GAC AGT GTC3311

TTC GCA CAT CCC AGG AAG CTG CTC ATG CAA GAT CTG GTG CAG3353

GAA AAC TAC CTG GAG TAC CGG CAG GTG CCC GGC AGT GAT CCT3 395

GCA TGC TAC GAG TTC CTG TGG GGT CCA AGG GCC CTC ATT GAA3437

ACC AGC TAT GTG AAA GTC CTG CAC CAT ACA CTA AAG ATC GGT3479

GGA GAA CCT CAC ATT TCC TAC CCA CCC CTG CAT GAA CGG GCT3521

TTG AGA GAG GGA GAA GAG TGA3542

GTCTCAGCAC ATGTTGCAGC CAGGGCCAGT GGGAGGGGGT CTGGGCCAGT3592

GCACCTTCCA GGGCCCCATC CATTAGCTTC CACTGCCTCG TGTGATATGA3642

GGCCCATTCC TGCCTCTTTG AAGAGAGCAG TCAGCATTCT TAGCAGTGAG3692 ¹ TTTCTGTTCT GTTGGATGAC TTTGAGATTT ATCTTTCTTT CCTGTTGGAA3742

TTGTTCAAAT GTTCCTTTTA ACAAATGGTT GGATGAACTT CAGCATCCAA3792

GTTTATGAAT GACAGTAGTC ACACATAGTG CTGTTTATAT AGTTTAGGGG3842

TAAGAGTCCT GTTTTTTATT CAGATTGGGA AATCCATTCC ATTTTGTGAG3892

TTGTCACATA ATAACAGCAG TGGAATATGT ATTTGCCTAT ATTGTGAACG3942

AATTAGCAGT AAAATACATG ATACAAGGAA CTCAAAAGAT AGTTAATTCT3992

TGCCTTATAC CTCAGTCTAT TATGTAAAAT TAAAAATATG TGTATGTTTT4042

TGCTTCTTTG AGAATGCAAA AGAAATTAAA TCTGAATAAA TTCTTCCTGT4092

TCACTGGCTC ATTTCTTTAC CATTCACTCA GCATCTGCTC TGTGGAAGGC4142

CCTGGTAGTA GTGGG4157

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 662 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE⁽MOLÉCULA: DNA genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10:

GGATCCCCAT GGATCCAGGA AGAATCCAGT TCCACCCCTG CTGTGAACCC 50 AGGGAAGTCA CGGGGCCGGA TGTGACGCCA CTGACTTGCG CGTTGGAGGT 100 CAGAGAACAG CGAGATTCTC GCCCTGAGCA ACGGCCTGAC GTCGGCGGAG 150 GGAAGCAGGC GCAGGCTCCG TGAGGAGGCA AGGTAAGATG CCGAGGGAGG 200 ACTGAGGCGG GCCTCACCCC AGACAGAGGG CCCCCAATAA TCCAGCGCTG 250 CCTCTGCTGC CAGGCCTGGA CCACCCTGCA GGGGAAGACT TCTCAGGCTC 300 AGTCGCCACC ACCTCACCCC GCCACCCCCC GCCGCTTTAA CCGCAGGGAA 350 CTCTGGTGTA AGAGCTTTGT GTGACCAGGG CAGGGCTGGT TAGAAGTGCT 400 CAGGGCCCAG ACTCAGCCAG GAATCAAGGT CAGGACCCCA AGAGGGGACT 450 GAGGGTAACC CCCCCGCACC CCCACCACCA TTCCCATCCC CCAACACCAA 500 CCCCACCCCC ATCCCCCAAC ACCAAACCCA CCACCATCGC TCAAACATCA 550 ACGGCACCCC CAAACCCCGA TTCCCATCCC CACCCATCCT GGCAGAATCG 600 GAGCTTTGCC CCTGCAATCA ACCCACGGAA GCTCCGGGAA TGGCGGCCAA 650 GCACGCGGAT CC 662

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1642 pares de bases (B) TIPO; ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE^ZMOLÉCULA: cDNA para irtRNA (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: cDNA MAGE-3 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11:

GCCGCGAGGG GACAGGCTGA AGATCTGCCA GTTGCCCTGA

AAGCCGGCCC CCTGGAGGAC GTGGGTCTCC CCAGAGTCAT

AGGCTCGGTG CAGAGGCCCC ATTGCCCAGC C

AGGAGGCAAG CGGAGGAGCA TCCTGCCCAC

GTTCTGAGGG CTGAAGGAGA ACTCCCGCCT

100

150

171

ATG

CCT

CTT

GAG

CAG

AGG

AGT

CAG

CAC

TGC

AAG

CCT

GAA

GAA

213

GGC

CTT

GAG

GCC

CGA

GGA

GAG

GCC

CTG

GGC

CTG

GTG

GGT

GCG

255

CAG

GCT

CCT

GCT

ACT

GAG

GAG

CAG

GAG

GCT

GCC

TCC

TCC

TCT

297

TCT

ACT

CTA

GTT

GAA

GTC

ACC

CTG

GGG

GAG

GTG

CCT

GCT

GCC

339

GAG

TCA

CCA

GAT

CCT

CCC

CAG

AGT

CCT

CAG

GGA

GCC

TCC

AGC

381

CTC

CCC

ACT

ACC

ATG

AAC

TAC

CCT

CTC

TGG

AGC

CAA

TCC

TAT

423

GAG

GAC

TCC

AGC

AAC

CAA

GAA

GAG

GAG

GGG

CCA

AGC

ACC

TTC

465

CCT

GAC

CTG

GAG

TCC

GAG

TTC

CAA

GCA

GCA

CTC

AGT

AGG

AAG

507

GTG

GCC

GAG

TTG

GTT

CAT

TTT

CTG

CTC

CTC

AAG

TAT

CGA

GCC

549

AGG

GAG

CCG

GTC

ACA

AAG

GCA

GAA

ATG

CTG

GGG

AGT

GTC

GTC

591

GGA

AAT

TGG

CAG

TAT

TTC

TTT

CCT

GTG

ATC

TTC

AGC

AAA

GCT

633

TCC

AGT

TCC

TTG

CAG

CTG

GTC

TTT

GGC

ATC

GAG

CTG

ATG

GAA

675

GTG

GAC

CCC

ATC

GGC

CAC

TTG

TAC

ATC

TTT

GCC

ACC

TGC

CTG

717

GGC

CTC

TCC

TAC

GAT

GGC

CTG

CTG

GGT

GAC

AAT

CAG

ATC

ATG

759

CCC

AAG

GCA

GGC

CTC

CTG

ATA

ATC

GTC

CTG

GCC

ATA

ATC

GCA

801

AGA

GAG

GGC

GAC

TGT

GCC

CCT

GAG

GAG

AAA

ATC

TGG

GAG

GAG

843

CTG

AGT

GTG

TTA

GAG

GTG

TTT

GAG

GGG

AGG

GAA

GAC

AGT

ATG

885

TTG

GGG

GAT

CCC

AAG

AAG

CTG

CTC

ACC

CAA

CAT

TTC

GTG

CAG

927

GAA

AAC

TAC

CTG

GAG

TAC

CGG

CAG

GTC

CCC

GGC

AGT

GAT

CCT

969

GCA

TGT

TAT

GAA

TTC

CTG

TGG

GGT

CCA

AGG

GCC

CTC

GTT

GAA

1011

ACC

AGC

TAT

GTG

AAA

GTC

CTG

CAC

CAT

ATG

GTA

AAG

ATC

AGT

1053

GGA

GGA

CCT

CAC

ATT

TCC

TAC

CCA

CCC

CTG

CAT

GAG

TGG

GTT

1095

TTG

AGA

GAG

GGG

GAA

GAG

TGA

1116

GTCTGAGCAC GCACCTTCCG GGCCCATTCT TTTCTGTTCT TTGTTCAAAT GTTTATGAAT TAAGAGTCTT TTGTGACATA GAATTAGCAA ATTCTTGCCT ACCAGGATTT

GAGTTGCAGC GGGCCGCATC TCACTCTTTG GTTGGATGAC GTTCCTTTTA GACAGTAGTC GttTTTTACT ATAATAGCAG TAACATACAT TGTACCTCAA CCTTGACTTC

CAGGGCCAGT CCTTAGTTTC AAGCGAGCAG TTTGAGATTA ACGGATGGTT ACACATAGTG CAAATTgGGA TGGTAAAAGT GAGATAACTC TCTATTCTGT TTTG

GGGAGGGGGT CACTGCCTCC TCAGCATTCT TTCTTTGTTT GAATGAGCGT CTGTTTATAT AATCCATTCC ATTTGCTTAA AAGAAATCAA AAAATTAAAC

CTGGGCCAGT TGTGACGTGA TAGTAGTGGG CCTGTTGGAG CAGCATCCAG AGTTTAGGAG ATTTTGTGAA AATTGTGAGC AAGATAGTTG AAATATGCAA

1166 1216 1266 1316 1366 1416 1466 1516 1566 1616 1640

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 943 pares de bases (B) TIPO; ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE^fMOLÉCULA: DNA genómico (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: gene MAGE-31 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12:

GGATCCTCCA CCTGACAGTT GCCCGTGGAT AGGACTTGGT GATAGTGCCA CTGCCCCAGA TTCAGTCCTG CTCTCACTTC AGAGGCCCCC TTAGAGCCTC TCCCTCTCTC CTCCCGCCTG

CCCCAGTAGA CTGGGAATCC TCCTCTCCCA CTGAGGCAGT ACGGTGAAGG ACACATGGAC CAGCCTCAGC CTCCTTCAGG GGAGGAGCAC CAAGGTTCCA CCCAGGCCAG TTGCCCTGAC

GTGGGGACCT GTGGCTGCGT GGAATCAGGA GTCCTCAGGT TTTGCCTTGG TCCAGAGCGC ATGCGCTGGC TTCTGAGGGG TGAAGGAGAA TTCAGTACTC TGGGTCTCCA CAGAGTCATC

CACAGAGTCT TTGCTGTCTG GCTCCAGGAA CACAGAGTAG ATTCAAACCA CTGGCCTCAC CGGATGTACC ACAGGCTGAC GATCTGTAAG AGCTGAGGTC TTGCCCAGCT

GGCCAACCCT CACATTGGGG CAAGGCAGTG AGGGGgCTCA AGGGCCCCAC CCTCAATACT CTGAGGTGCC CTGGAG^ACC TAAGCCTTTG TCTCACATGC CCTGCCCACA

ATG

CCT

CTT

GAG

CAG

AGG

AGT

CAG

CAC

TGC

AAG

CCT

GAA

GAA

GGC

CTT

GAG

GCC

CGA

GGA

GAg

GCC

CTG

GGC

CTG

GTG

GGT

GCG

CAG

GCT

CCT

GCT

ACT

GAG

GAG

CAG

GAG

GCT

GCC

TCC

TCC

TCT

TCT

AGT

GTA

GTT

GAA

GTC

ACC

CTG

GGG

GAG

GTG

CCT

GCT

GCC

GAG

TCA

CCA

GAT

CCT

CCC

CAG

AGT

CCT

CAG

GGA

GCC

TCC

AGC

CTC

CCC

ACT

ACC

ATG

AAC

TAC

CCT

CTC

TGG

AGC

CAA

TCC

TAT

GAG

GAC

TCC

AGC

AAC

CAA

GAA

GAG

GAG

GGG

CCA

AGC

ACC

TTC

CCT

GAC

CTG

GAG

TCT

GAG

TTC

CAA

GCA

GCA

CTC

AGT

AGG

AAG

GTG

GCC

AAG

TTG

GTT

CAT

TTT

CTG

CTC

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 580 622 664 706 748 790 832 874 916 943

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 2531 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE^fMOLÉCULA: DNA genómico (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: gene MAGE-4 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13:

GGATCCAGGC GGGATCATCC TCTTGATGGC GGCCCATGGA TGGTCTGAGA GCCAGCAGTG CAAGACACAT CCTGCAGAAT CTTCCTCCTT TGGAGGCCAC TAGAGCCTCT TCTCCGTAGG CCTGCTGCCC

CCTGCCTGGA ACTCCATGAG ACTGAGGGAC TTCCTCTCCT CAGTGTCCTC AATGTTTGCC AGGACTCCAA CGACCTCTGC CAGGTTCTGA AGAGGAGCAC AAGATTTGGT CCTGTGGGTC TGACCAGAGT

GAAATGTGAG AGTGGGGACC CGGGGCTGTG AGGAGCTCCA AGGTTACAGA CTGAATGCAC AGAGTCTGGC TGGCCGGCTA GCAGACAGGC CAAGGAGAAG TCTCAGCTGA CCCATTGCCC CATC

GGCCCTGAGT TCACAGAGTC CTTACAGTCT GGAACAAGGC GCAGAGGATG ACCAAGGGCC CTCACCTCCC TACCCTGAGG CAACCGGAGA ATCTGTAAGT GGTCTCTCAC AGCTTTTGCC

GAACACAGTG CAGCCTACCC GCACCCTAAG AGTGAGGCCT CACAGGCTGT CCACCTGCCA TACCATCAAT TGCTCTCTCA CAGGATTCCC AAGCCTTTGT ATGCTCCCTC TGCACTCTTG

I

ATG

TCT

TCT

GAG

CAG

AAG

AGT

CAG

CAC

TGC

AAG

CCT

GAG

GAA

GGC

GTT

GAG

GCC

CAA

GAA

GAG

GCC

CTG

GGC

CTG

GTG

GGT

GCA

CAG

GCT

CCT

ACT

ACT

GAG

GAG

CAG

GAG

GCT

GCT

GTC

TCC

TCC

TCC

TCT

CCT

CTG

GTC

CCT

GGC

ACC

CTG

GAG

GAA

GTG

CCT

GCT

GCT

GAG

TCA

GCA

GGT

CCT

CCC

CAG

AGT

CCT

CAG

GGA

GCC

TCT

GCC

TTA

CCC

ACT

ACC

ATC

AGC

TTC

ACT

TGC

TGG

AGG

CAA

CCC

AAT

GAG

GGT

TCC

AGC

AGC

CAA

GAA

GAG

GAG

GGG

CCA

AGC

ACC

TCG

CCT

GAC

GCA

GAG

TCC

TTG

TTC

CGA

GAA

GCA

CTC

AGT

AAC

AAG

GTG

GAT

GAG

TTG

GCT

CAT

TTT

CTG

CTC

CGC

AAG

TAT

CGA

GCC

AAG

GAG

CTG

GTC

ACA

AAG

GCA

GAA

ATG

CTG

GAG

AGA

GTC

ATC

AAA

AAT

TAC

AAG

CGC

TGC

TTT

CCT

GTG

ATC

TTC

GGC

AAA

GCC

TCC

GAG

TCC

CTG

AAG

ATG

ATC

TTT

GGC

ATT

GAC

GTG

AAG

GAA

GTG

GAC

CCC

GCC

AGC

AAC

ACC

TAC

ACC

CTT

GTC

ACC

TGC

CTG

GGC

CTT

TCC

TAT

GAT

GGC

CTG

CTG

GGT

AAT

AAT

CAG

ATC

TTT

CCC

AAG

ACA

GGC

CTT

CTG

ATA

ATC

GTC

CTG

GGC

ACA

ATT

GCA

ATG

GAG

GGC

GAC

AGC

GCC

TCT

GAG

GAG

GAA

ATC

TGG

GAG

GAG

CTG

GGT

GTG

ATG

GGG

GTG

TAT

GAT

GGG

AGG

GAG

CAC

ACT

GTC

TAT

GGG

GAG

CCC

AGG

AAA

CTG

CTC

ACC

CAA

GAT

TGG

GTG

CAG

GAA

AAC

TAC

CTG

GAG

TAC

CGG

CAG

GTA

CCC

GGC

AGT

AAT

CCT

GCG

CGC

TAT

GAG

TTC

CTG

TGG

GGT

CCA

AGG

GCT

CTG

GCT

GAA

ACC

AGC

TAT

GTG

AAA

GTC

CTG

GAG

CAT

GTG

GTC

AGG

GTC

AAT

GCA

AGA

GTT

CGC

ATT

GCC

TAC

CCA

TCC

CTG

CGT

GAA

GCA

GCT

TTG

TTA

GAG

GAG

GAA

GAG

GGA

GTC

TGA

GGGCCAGTGC ACATGAGGCC GTAGTGGGTT TTTTACAATT GCATCCAAGT

GCATGAGTTG ATCTAACAGC CATTCTTCAC TCTATTTTGT GTTGAAATGT

TGTGGGGAAG AGCTTCCCTT GAAAATAGTC GGAGATTTAT GGATGGTTGA

GGGCAGGGCT GCCTCGTGTA ÀGTGTTCTTA CTCTGTTTCC ATTAACTTCA

CAGCCAGGGC CCTGTGCAGC TCTGTTTGAA TGGATGACTT TCCTTTTAAT

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

624

666

708

750

792

834

876

918

960 1002 1044 1086 1128 1170 1212 1254 1296 1338 1380 1422 1464 1506 1548 1578 1628 1678 1728 1778 1828

TTATGAATCG TAGTTAACGT ATATTGCTGT AGTCTTGTTT TTTATTCAGA TTGGGAAATC GGACATAATA ACAGCAGTGG AGTAAGTATT GAAATAGGTG AGATAAATTA AAAGATACTT GTCTATTCTG TAAAATTTAA AAATATATAT CTTCGTGAAT GTAAGAGAAA TTAAATCTGA ACTGGCTCAT TTCTTCTCTA TGCACTGAGC AGGATTAGTA GTGGAGATAC TAGGGTAAGC GGGTATTAAG AGTCTAGGAG CGCGGTCATA CCTCTAAGÀT GTAGGGGAAA AGTAACGAGT GAGAGTGGTC GGGTGTAAAT TCCCTGTGTG AACTGCATTT TCTTCTGAGG GATCTGATTC AGGGCCAGAT TCTCAGAGGG AGAGGGAAAA TCTGAGCAGT TCCTTTGTGA CAATGGATGA GGG

TAATATAGTT TAGGAGTAAG	1878
CGTTCTATTT TGTGAATTTG	1928
TAGAAGTGTG AATTCACCGT	1978
AATTCCCGCC TTATGCCTCA	2028
GCATACCTGG ATTTCCTTGG	2078
ATAAATAATT CTTTCTGTTA	2128
ATCTGCTCTG TGGAAGGCCC	2178
CAGACACACA CCTACCGATA	•2228
TAATTAAGGT GACAAGATGT	2278
GTGGGTATGG GGCTCCAGGT	2328
GGGCCTTTTGGGCTTTGGGA	2378
TAATGAAGCT TGGTGGGTCC	2428
GCCCAGATTG GAAAAGTTGC	2478
ACAGAGAGGA GCCTCTACCT	2528

2531 >

X'.' (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14: ' : . , (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 2531 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE^;MOLÉCULA: DNA genómico

I (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: gene MAGE-41 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14:

GGATCCAGGC CCTGCCTGGA GAAATGTGAG GGCCCTGAGT GAACACAGTG50

GGGATCATCC ACTCCATGAG AGTGGGGACC TCACAGAGTC CAGCCTACCC100 i TCTTGATGGC ACTGAGGGAC CGGGGCTGTG CTTACAGTCT GCACCCTAAG150

GGCCCATGGA TTCCTCTCCT AGGAGCTCCA GGAACAAGGC AGTGAGGCCT200

TGGTCTGAGA CAGTGTCCTC AGGTTACAGA GCAGAGGATG CACAGGCTGT250

GCCAGCAGTG AATGTTTGCC CTGAATGCAC ACCAAGGGCC CCACCTGCCA300

CAAGACACAT AGGACTCCAA AGAGTCTGGC CTCACCTCCC TACCATCAAT350

CCTGCAGAAT CGACCTCTGC TGGCCGGCTA TACCCTGAGG TGCTCTCTCA400

CTTCCTCCTT CAGGTTCTGA GCAGACAGGC CAACCGGAGA CAGGATTCCC450

TGGAGGCCAC AGAGGAGCAC CAAGGAGAAG ATCTGTAAGT AAGCCTTTGT500

TAGAGCCTCT AAGATTTGGT TCTCAGCTGA GGTCTCTCAC ATGCTCCCTC550

TCTCCGTAGG CCTGTGGGTC CCCATTGCCC AGCTTTTGCC TGCACTCTTG600

CCTGCTGCCC TGAGCAGAGT CATC624

ATG TCT TCT GAG CAG AAG AGT CAG CAC TGC AAG CCT GAG GAA666

GGC GTT GAG GCC CAA GAA GAG GCC CTG GGC CTG GTG GGT GCG708

CAG GCT CCT ACT ACT GAG GAG CAG GAG GCT GCT GTC TCC TCC750

TCC TCT CCT CTG GTC CCT GGC ACC CTG GAG GAA GTG CCT GCT792

GCT GAG TCA GCA GGT CCT CCC CAG AGT CCT CAG GGA GCC TCT834

GCC TTA CCC ACT ACC ATC AGC TTC ACT TGC TGG AGG CAA CCC876

AAT GAG GGT TCC AGC AGC CAA GAA GAG GAG GGG CCA AGC ACC918

TCG CCT GAC GCA GAG TCC TTG TTC CGA GAA GCA CTC AGT AAC960

AAG GTG GAT GAG TTG GCT CAT TTT CTG CTC CGC AAG TAT CGA1002

GCC AAG GAG CTG GTC ACA AAG GCA GAA ATG CTG GAG AGA GTC1044

ATC AAA AAT TAC AAG CGC TGC TTT CCT GTG ATC TTC GGC AAA1086

GCC TCC GAG TCC CTG AAG ATG ATC TTT GGC ATT GAC GTG AAG1128

GAA GTG GAC CCC ACC AGC AAC ACC TAC ACC CTT GTC ACC TGC1170

CTG GGC CTT TCC TAT GAT GGC CTG CTG GGT AAT AAT CAG ATC1212

TTT CCC AAG ACA GGC CTT CTG ATA ATC GTC CTG GGC ACA ATT1254 • GCA ATG GAG GGC GAC AGC GCC TCT GAG GAG GAA ATC TGG GAG1296

GAG CTG GGT GTG ATG GGG GTG TAT GAT GGG AGG GAG CAC ACT1338

GTC TAT GGG GAG CCC AGG AAA CTG CTC ACC CAA GAT TGG GTG1380

CAG GAA AAC TAC CTG GAG TAC CGG CAG GTA CCC GGC AGT AAT1422

CCT GCG CGC TAT GAG TTC CTG TGG GGT CCA AGG GCT CTG GCT1464

GAA ACC AGC TAT GTG AAA GTC CTG GAG CAT GTG GTC AGG GTC1506

AAT GCA AGA GTT CGC ATT GCC TAC CCA TCC CTG CGT GAA GCA1548

GCT TTG TTA GAG GAG GAA GAG GGA GTC TGA1578

GCATGAGTTG CAGCCAGGGC TGTGGGGAAG GGGCAGGGCT GGGCCAGTGC1628

ATCTAACAGC CCTGTGCAGC AGCTTCCCTT GCCTCGTGTA ACATGAGGCC1678

CATTCTTCAC TCTGTTTGAA GAAAATAGTC AGTGTTCTTA GTAGTGGGTT1728

TCTATTTTGT TGGATGACTT GGAGATTTAT CTCTGTTTCC TTTTACAATT1778

GTTGAAATGT TCCTTTTAAT GGATGGTTGA ATTAACTTCA GCATCCAAGT1828

TTATGAATCG TAGTTAACGT ATATTGCTGT TAATATAGTT TAGGAGTAAG1878

AGTCTTGTTT TTTATTCAGA TTGGGAAATC CGTTCTATTT TGTGAATTTG1928

GGACATAATA ACAGCAGTGG AGTAAGTATT TAGAAGTGTG AATTCACCGT1978

GAAATAGGTG AGATAAATTA AAAGATACTT AATTCCCGCC TTATGCCTCA2028

GTCTATTCTG TAAAATTTAA AAATATATAT GCATACCTGG ATTTCCTTGG2078 | CTTCGTGAAT GTAAGAGAAA TTAAATCTGA ATAAATAATT CTTTCTGTTA2128

ACTGGCTCAT TTCTTCTCTA TGCACTGAGC ATCTGCTCTG TGGAAGGCCC2178

AGGATTAGTA GTGGAGATAC TAGGGTAAGC CAGACACACA CCTACCGATA2228

GGGTATTAAG AGTCTAGGAG CGCGGTCATA TAATTAAGGT GACAAGATGT2278

CCTCTAAGAT GTAGGGGAAA AGTAACGAGT GTGGGTATGG GGCTCCAGGT2328

GAGAGTGGTC GGGTGTAAAT TCCCTGTGTG GGGCCTTTTG GGCTTTGGGA2378

AACTCCATTT TCTTCTGAGG GATCTGATTC TAATGAAGCT TGGTGGGTCC2428

AGGGCCAGAT TCTCAGAGGG AGAGGGAAAA GCCCAGATTG GAAAAGTTGC2478

TCTGAGCGGT TCCTTTGTGA CAATGGATGA ACAGAGAGGA GCCTCTACCT2528

GGG2531

X \ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1068 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA; linear (ii) TIPO DE''MOLÉCULA: cDNA para mRNA (ix) CARACTERISTICA:

(A) NOME/CHAVE: cDNA MAGE-4 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15:

G GGG CCA AGC ACC TCG CCT GAC GCA GAG TCC TTG TTC CGA40 'GAA GCA CTC AGT AAC AAG GTG GAT GAG TTG GCT CAT TTT CTG82

CTC CGC AAG TAT CGA GCC AAG GAG CTG GTC ACA AAG GCA GAA124

ATG CTG GAG AGA GTC ATC AAA AAT TAC AAG CGC TGC TTT CCT166

GTG ATC TTC GGC AAA GCC TCC GAG TCC CTG AAG ATG ATC TTT208

GGC ATT GAC GTG AAG GAA GTG GAC CCC GCC AGC AAC ACC TAC250

ACC CTT GTC ACC TGC CTG GGC CTT TCC TAT GAT GGC CTG CTG292

GGT AAT AAT CAG ATC TTT CCC AAG ACA GGC CTT CTG ATA ATC334

GTC CTG GGC ACA ATT GCA ATG GAG GGC GAC AGC GCC TCT GAG37 6

GAG GAA ATC TGG GAG GAG CTG GGT GTG ATG GGG GTG TAT GAT418

GGG AGG GAG CAC ACT GTC TAT GGG GAG CCC AGG AAA CTG CTC460

ACC CAA GAT TGG GTG CAG GAA AAC TAC CTG GAG TAC CGG CAG502

GTA CCC GGC AGT AAT CCT GCG CGC TAT GAG TTC CTG TGG GGT544

CCA AGG GCT CTG GCT GAA ACC AGC TAT GTG AAA GTC CTG GAG586

CAT GTG GTC AGG GTC AAT GCA AGA GTT CGC ATT GCC TAC CCA628

TCC CTG CGT GAA GCA GCT TTG TTA GAG GAG GAA GAG GGA GTC670

TGAGCATGAG TTGCAGCCAG GGCTGTGGGG AAGGGGCAGG GCTGGGCCAG720

TGCATCTAAC AGCCCTGTGC AGCAGCTTCC CTTGCCTCGT GTAACATGAG770

GCCCATTCTT CACTCTGTTT GAAGAAAATA GTCAGTGTTC TTAGTAGTGG820

GTTTCTATTT TGTTGGATGA CTTGGAGATT TATCTCTGTT TCCTTTTACA870

ATTGTTGAAA TGTTCCTTTT AATGGATGGT TGAATTAACT TCAGCATCCA920

AGTTTATGAA TCGTAGTTAA CGTATATTGC TGTTAATATA GTTTAGGAGT970

AAGAGTCTTG TTTTTTATTC AGATTGGGAA ATCCGTTCTA TTTTGTGAAT1020

TTGGGACATA ATAACAGCAG TGGAGTAAGT ATTTAGAAGT GTGAATTC1068

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16: ....

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 2226 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE^fMOLÉCULA: DNA genómico (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: gene MAGE-5 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16:

GGATCCAGGC CTTGCCAGGA GAAAGGTGAG GGCCCTGTGT GAGCACAGAG 50 GGGACCATTC ACCCCAAGAG GGTGGAGACC TCACAGATTC CAGCCTACCC 100 TCCTGTTAGC ACTGGGGGCC TGAGGCTGTG CTTGCAGTCT GCACCCTGAG 150 GGCCCATGCA TTCCTCTTCC AGGAGCTCCA GGAAACAGAC ACTGAGGCCT 200 TGGTCTGAGG CCGTGCCCTC AGGTCACAGA GCAGAGGAGA TGCAGACGTC 250 TAGTGCCAGC AGTGAACGTT TGCCTTGAAT GCACACTAAT GGCCCCCATC 300 GCCCCAGAAC ATATGGGACT CCAGAGCACC TGGCCTCACC CTCTCTACTG 350 TCAGTCCTGC AGAATCAGCC TCTGCTTGCT TGTGTACCCT GAGGTGCCCT 400 CTCACTTTTT CCTTCAGGTT CTCAGGGGAC AGGCTGACCA GGATCACCAG 450 GAAGCTCCAG AGGATCCCCA GGAGGCCCTA GAGGAGCACC AAAGGAGAAG 500 ATCTGTAAGT AAGCCTTTGT TAGAGCCTCC AAGGTTCAGT TTTTAGCTGA 550 GGCTTCTCAC ATGCTCCCTC TCTCTCCAGG CCAGTGGGTC TCCATTGCCC 600 AGCTCCTGCC CACACTCCTG CCTGTTGCGG TGACCAGAGT CGTC 644 ATG TCT CTT GAG CAG AAG AGT CAG CAC TGC AAG CCT GAG GAA 684 CTC CTC TGG TCC CAG GCA CCC TGG GGG AGG TGC CTG CTG CTG 728 GGT CAC CAG GTC CTC TCA AGA GTC CTC AGG GAG CCT CCG CCA 770 TCC CCA CTG CCA TCG ATT TCA CTC TAT GGA GGC AAT CCA TTA 812 AGG GCT CCA GCA ACC AAG AAG AGG AGG GGC CAA GCA CCT CCC 854 CTG ACC CAG AGT CTG TGT TCC GAG CAG CAC TCA GTA AGA AGG 896 TGG CTG ACT TGA 908 TTCATTTTCT GCTCCTCAAG TATTAAGTCA AGGAGCTGGT CACAAAGGCA 958 GAAATGCTGG AGAGCGTCAT CAAAAATTAC AAGCGCTGCT TTCCTGAGAT 1008 CTTCGGCAAA GCCTCCGAGT CCTTGCAGCT GGTCTTTGGC ATTGACGTGA 1058 AGGAAGCGGA CCCCACCAGC AACACCTACA CCCTTGTCAC CTGCCTGGGA 1108 CTCCTATGAT GGCCTGCTGG TTGATAATAA TCAGATCATG CCCAAGACGG 1158 GCCTCCTGAT AATCGTCTTG GGCATGATTG CAATGGAGGG CAAATGCGTC 1208 CCTGAGGAGA AAATCTGGGA GGAGCTGAGT GTGATGAAGG TGTATGTTGG 1258 GAGGGAGCAC AGTGTCTGTG GGGAGCCCAG GAAGCTGCTC ACCCAAGATT 1308 TGGTGCAGGA AAACTACCTG GAGTACCGGC AGGTGCCCAG CAGTGATCCC 1358 ATATGCTATG AGTTACTGTG GGGTCCAAGG GCACTCGCTG CTTGAAAGTA 1408 CTGGAGCACG TGGTCAGGGT CAATGCAAGA GTTCTCATTT CCTACCCATC 1458 CCTGCGTGAA GCAGCTTTGA GAGAGGAGGA AGAGGGAGTC'TGAGCATGAG 1508 CTGCAGCCAG GGCCACTGCG AGGGGGGCTG GGCCAGTGCA CCTTCCAGGG 1558 CTCCGTCCAG TAGTTTCCCC TGCCTTAATG TGACATGAGG CCCATTCTTC 1608 TCTCTTTGAA GAGAGCAGTC AACATTCTTA GTAGTGGGTT TCTGTTCTAT 1658 TGGATGACTT TGAGATTTGT CTTTGTTTCC TTTTGGAATT GTTCAAATGT 1708 TTCTTTTAAT GGGTGGTTGA ATGAACTTCA GCATTCAAAT TTATGAATGA 1758 CAGTAGTCAC ACATAGTGCT GTTTATATAG TTTAGGAGTA AGAGTCTTGT 1808 TTTTTATTCA GATTGGGAAA TCCATTCCAT TTTGTGAÃTT GGGACATAGT 1858 TACAGCAGTG GAATAAGTAT TCATTTAGAA ATGTGAATGA GCAGTAAAAC 1908 TGATGACATA AAGAAATTAA AAGATATTTA ATTCTTGCTT ATACTCAGTC 1958

TATTCGGTAA TTCTTTGAGA TCACTGGCTC CCTGGGTTAA CAGGGTAGTA GCCCTCTAAG _AATTTTTTTT AAAAAATGTG catacctgga tttccttggc ATGTAAGACA AATTAAATCT GAATAAATCA TTCTCCCTGT ATTTATTCTC TATGCACTGA GCATTTGCTC TGTGGAAGGC TAGTGGAGAT GCTAAGGTAA GCCAGACTCA CCCCTACCCA AAGTCTAGGA GCAGCAGTCA TATAATTAAG GTGGAGAGAT ATGTAGAG

2008

2058

2108

2158

2208

2226

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 17:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 2305 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE^fMOLÉCULA: DNA genómico (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: gene MAGE-51 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17:

GGATCCAGGC CTTGCCAGGA GAAAGGTGAG GGCCCTGTGT GAGCACAGAG50

GGGACCATTC ACCCCAAGAG GGTGGAGACC TCACAGATTC CAGCCTACCC100

TCCTGTTAGC ACTGGGGGCC TGAGGCTGTG CTTGCAGTCT GCACCCTGAG150

GGCCCATGCA TTCCTCTTCC AGGAGCTCCA GGAAACAGAC ACTGAGGCCT200

TGGTCTGAGG CCGTGCCCTC AGGTCACAGA GCAGAGGAGA TGCAGACGTC250

TAGTGCCAGC AGTGAACGTT TGCCTTGAAT GCACACTAAT GGCCCCCATC300

GCCCCAGAAC ATATGGGACT CCAGAGCACC TGGCCTCACC CTCTCTACTG350

TCAGTCCTGC AGAATCAGCC TCTGCTTGCT TGTGTACCCT GAGGTGCCCT400

CTCACTTTTT CCTTCAGGTT CTCAGGGGAC AGGCTGACCA GGATCACCAG450

GAAGCTCCAG AGGATCCCCA GGAGGCCCTA GAGGAGCACC AAAGGAGAAG500

ATCTGTAAGT AAGCCTTTGT TAGAGCCTCC AAGGTTCAGT TTTTAGCTGA550

GGCTTCTCAC ATGCTCCCTC TCTCTCCAGG CCAGTGGGTC TCCATTGCCC600

AGCTCCTGCC CACACTCCTG CCTGTTGCGG TGACCAGAGT CGTC644

ATG TCT CTT GAG CAG AAG AGT CAG CAC TGC AAG CCT GAG GAA686

GGC CTT GAC ACC CAA GAA GAG CCC TGG GCC TGG TGG GTG TGC728

AGG CTG CCA CTA CTG AGG AGC AGG AGG CTG TGT CCT CCT CCT770

CTC CTC TGG TCC CAG GCA CCC TGG GGG AGG TGC CTG CTG CTG812

GGT CAC CAG GTC CTC TCA AGA GTC CTC AGG GAG CCT CCG CCA854

TCC CCA CTG CCA TCG ATT TCA CTC TAT GGA GGC AAT CCA TTA896

AGG GCÍ CCA GCA ACC AAG AAG AGG AGG GGC CAA GCA CCT CCC938

CTG ACC CAG AGT CTG TGT TCC GAG CAG CAC TCA GTA AGA AGG980

TGG CTG ACT TGA992

TTCATTTTCT GCTCCTCAAG TATTAAGTCA AGGAGCCGGT CACAAAGGCA1042

GAAATGCTGG AGAGCGTCAT CAAAAATTAC AAGCGCTGCT TTCCTGAGAT1092

CTTCGGCAAA GCCTCCGAGT CCTTGCAGCT GGTCTTTGGC ATTGACGTGA1142

AGGAAGCGGA CCCCACCAGC AACACCTACA CCCTTGTCAC CTGCCTGGGA1192

CTCCTATGAT GGCCTGGTGG TTTAATCAGA TCATGCCCAA GACGGGCCTC1242

CTGATAATCG TCTTGGGCAT GATTGCAATG GAGGGCAAAT GCGTCCCTGA1292 ι GGAGAAAATC TGGGAGGAGC TGGGTGTGAT GAAGGTGTAT GTTGGGAGGG1342

AGCACAGTGT CTGTGGGGAG CCCAGGAAGC TGCTCACCCA AGATTTGGTG1392

CAGGAAAACT ACCTGGAGTA CCGCAGGTGC CCAGCAGTGA TCCCATATGC1442

TATGAGTTAC TGTGGGGTCC AAGGGCACTC GCTGCTTGAA AGTACTGGAG1492

CACGTGGTCA GGGTCAATGC AAGAGTTCTC ATTTCCTACC CATCCCTGCA1542

TGAAGCAGCT TTGAGAGAGG AGGAAGAGGG AGTCTGAGCA TGAGCTGCAG1592

CCAGGGCCAC TGCGAGGGGG GCTGGGCCAG TGCACCTTCC AGGGCTCCGT1642

CCAGTAGTTT CCCCTGCCTT AATGTGACAT· GAGGCCCATT CTTCTCTCTT1692

TGAAGAGAGC AGTCAACATT CTTAGTAGTG GGTTTCTGTT CTATTGGATG1742

ACTTTGAGAT TTGTCTTTGT TTCCTTTTGG AATTGTTCAA ATGTTCCTTT1792

TAATGGGTGG TTGAATGAAC TTCAGCATTC AAATTTATGA ATGACAGTAG1842

TCACACATAG TGCTGTTTAT ATAGTTTAGG AGTAAGAGTC TTGTTTTTTA1892

TTCAGATTGG GAAATCCATT CCATTTTGTG AATTGGGACA TAGTTACAGC1942

AGTGGAATAA GTATTCATTT AGAAATGTGA ATGAGCAGTA AAACTGATGA 1992 GATAAAGAAA TTAAAAGATA TTTAATTCTT GCCTTATACT CAGTCTATTC 2042 GGTAAAATTT TTTTTTAAAA ATGTGCATAC CTGGATTTCC TTGGCTTCTT 2092 TGAGAATGTA AGACAAATTA AATCTGAATA AATCATTCTC CCTGTTCACT 2142 GGCTCATTTA TTCTCTATGC ACTGAGCATT TGCTCTGTGG AAGGCCCTGG 2192 GTTAATAGTG GAGATGCTAA GGTAAGCCAG ACTCACCCCT ACCCACAGGG 2242 TAGTAAAGTC TAGGAGCAGC AGTCATATAA TTAAGGTGGA GAGATGCCCT 2292 CTAAGATGTA GAG 2305

V (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 18:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 225 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE''MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: gene MAGE-6 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18:

TAT TTC TTT CCT GTG ATC TTC AGC AAA GCT TCC GAT TCC TTG 42 CAG CTG GTC TTT GGC ATC GAG CTG ATG GAA GTG GAC CCC ATC 84 GGC CAC GTG TAC ATC TTT GCC ACC TGC CTG GGC CTC TCC TAC 126 GAT GGC CTG CTG GGT GAC AAT CAG ATC ATG CCC AGG ACA GGC 168 TTC CTG ATA ATC ATC CTG GCC ATA ATC GCA AGA GAG GGC GAC 210 TGT GCC CCT GAG GAG 225

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 19:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1947 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE'MOLÉCULA: DNA genómico (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: gene MAGE-7 (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19:

TGAATGGACA ACAAGGGCCC CACACTCCCC AGAACACAAG GGACTCCAGA 50 GAGCCCAGCC TCACCTTCCC TACTGTCAGT CCTGCAGCCT CAGCCTCTGC 100 TGGCCGGCTG TACCCTGAGG TGCCCTCTCA CTTCCTCCTT CAGGTTCTCA 150 GCGGACAGGC CGGCCAGGAG GTCAGAAGCC CCAGGAGGCC CCAGAGGAGC 200 ACCGAAGGAG AAGATCTGTA AGTAGGCCTT TGTTAGGGCC TCCAGGGCGT 250 GGTTCACAAA TGAGGCCCCT CACAAGCTCC TTCTCTCCCC AGATCTGTGG 300 GTTCCTCCCC ATCGCCCAGC TGCTGCCCGC ACTCCAGCCT GCTGCCCTGA 350 CCAGAGTCAT CATGTCTTCT GAGCAGAGGA GTCAGCACTG CAÀGCCTGAG 400 GATGCCTTGA GGCCCAAGGA CAGGAGGCTC TGGGCCTGGT GGGTGCGCAG 450 GCTCCCGCCA CCGAGGAGCA CGAGGCTGCC TCCTCCTTCA CTCTGATTGA 500 AGGCACCCTG GAGGAGGTGC CTGCTGCTGG GTCCCCCAGT CCTCCCCTGA 550 GTCTCAGGGT TCCTCCTTTT CCCTGACCAT CAGCAACAAC ACTCTATGGA 600 GCCAATCCAG TGAGGGCACC AGCAGCCGGG AAGAGGAGGG GCCAACCACC 650 TAGACACACC CCGCTCACCT GGCGTCCTTG TTCCA 685 ATG GGA AGG TGG CTG AGT TGG TTC GCT TCC TGC TGC ACA AGT 727 ATC GAG TCA AGG AGC TGG TCA CAA AGG CAG AAA TGC TGG ACA 769 GTG TCA TCA AAA ATT ACA AGC ACT AGT TTC CTT GTG ATC TAT 811 GGC AAA GCC TCA GAG TGC ATG CAG GTG ATG TTT GGC ATT GAC 853 ATG AAG GAA GTG GAC CCC GCG GCC ACT CCT ACG TCC TTG TCA 895 CCT GCT TGG GCC TCT CCT ACA ATG GCC TGC TGG GTG ATG ATC 937 AGA GCA TGC CCG AGA CCG GCC TTC TGA 964 TTATGGTCTT GACCATGATC TTAATGGAGG GCCACTGTGC CCCTGAGGAG 1014 GCAATCTGGG AAGCGTTGAG TGTAATGGTG TATGATGGGA TGGAGCAGTT 1064 TCTTTGGGCA GCTGAGGAAG CTGCTCACCC AAGATTGGGT GCAGGAAAAC 1114 TACCTGCAAT ACCGCCAGGT GCCCAGCAGT GATCCCCCGT GCTACCAGTT 1164 CCTGTGGGGT CCAAGGGCCC TCATTGAAAC CAGCTATGTG AAAGTCCTGG 1214 AGTATGCAGC CAGGGTCAGT ACTAAAGAGA GCATTTCCTA CCCATCCCTG 1264 CATGAAGAGG CTTTGGGAGA GGAGGAAGAG GGAGTCTGAG CAGAAGTTGC 1314 AGCCAGGGCC AGTGGGGCAG ATTGGGGGAG GGCCTGGGCA GTGCACGTTC 1364 CACACATCCA CCACCTTCCC TGTCCTGTTA CATGAGGCCC ATTCTTCACT 1414 CTGTGTTTGA AGAGAGCAGT CAATGTTCTC AGTAGCGGGG AGTGTGTTGG 1464 GTGTGAGGGA ATACAAGGTG GACCATCTCT CAGTTCCTGT TCTCTTGGGC 1514 GATTTGGAGG TTTATCTTTG TTTCCTTTTG CAGTCGTTCA AATGTTCCTT 1564 TTAATGGATG GTGTAATGAA CTTCAACATT CATTTCATGT ATGACAGTAG 1614 GCAGACTTAC TGTTTTTTAT ATAGTTAAAA GTAAGTGCAT TGTTTTTTAT 1664 TTATGTAAGA AAATCTATGT TATTTCTTGA ATTGGGACAA CATAACATAG 1714 CAGAGGATTA AGTACCTTTT ATAATGTGAA AGAACAAAGC GGTAAAATGG 1764 GTGAGATAAA GAAATAAAGA AATTAAATTG GCTGGGCACG GTGGCTCACG 1814 CCTGTAATCC CAGCACTTTA GGAGGCAGAG GCACGGGGAT CACGAGGTCA 1864 GGAGATCGAG ACCATTCTGG CTAACACAGT GAAACACCAT CTCTATTAAA 1914 AATACAAAAC TTAGCCGGGC GTGGTGGCGG GTG 1947

-X* (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 20:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1810 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DEMOLÉCULA: DNA genómico (ix) CARACTERISTICA:

(A) NOME/CHAVE: gene MAGE-8 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 20:

GAGCTCCAGG AACCAGGCTG TGAGGTCTTG GTCTGAGGCA GTATCTTCAA50

TCACAGAGCA TAAGAGGCCC AGGCAGTAGT AGCAGTCAAG CTGAGGTGGT100 ι GTTTCCCCTG TATGTATACC AGAGGCCCCT CTGGCATCAG AACAGCAGGA150

ACCCCACAGT TCCTGGCCCT ACCAGCCCTT TTGTCAGTCC TGGAGCCTTG200

GCCTTTGCCA GGAGGCTGCA CCCTGAGATG CCCTCTCAAT TTCTCCTTCA250

GGTTCGCAGA GAACAGGCCA GCCAGGAGGT CAGGAGGCCC CAGAGAAGCA300

CTGAAGAAGA CCTGTAAGTA GACCTTTGTT AGGGCATCCA GGGTGTAGTA350

CCCAGCTGAG GCCTCTCACA CGCTTCCTCT CTCCCCAGGC CTGTGGGTCT400

CAATTGCCCA GCTCCGGCCC ACACTCTCCT GCTGCCCTGA CCTGAGTCAT450

C451

ATG CTT CTT GGG CAG AAG AGT CAG CGC TAC AAG GCT GAG GAA493

GGC CTT CAG GCC CAA GGA GAG GCA CCA GGG CTT ATG GAT GTG535

CAG ATT CCC ACA GCT GAG GAG CAG AAG GCT GCA TCC TCC TCC577

TCT ACT CTG ATC ATG GGA ACC CTT GAG GAG GTG ACT GAT TCT619

GGG TCA CCA AGT CCT CCC CAG AGT CCT GAG GGT GCC TCC TCT661

TCC CTG ACT GTC ACC GAC AGC ACT CTG TGG AGC CAA TCC GAT703

GAG GGT TCC AGC AGC AAT GAA GAG GAG GGG CCA AGC ACC TCC745

CCG GAC CCA GCT CAC CTG GAG TCC CTG TTC CGG GAA GCA CTT787

GAT GAÇ AAA GTG GCT GAG TTA GTT CGT TTC CTG CTC CGC AAA829

TAT CAA ATT AAG GAG CCG GTC ACA AAG GCA GAA ATG CTT GAG871

AGT GTC ATC AAA AAT TAC AAG AAC CAC TTT CCT GAT ATC TTC913

AGC AAA GCC TCT GAG TGC ATG CAG GTG ATC TTT GGC ATT GAT955

GTG AAG GAA GTG GAC CCT GCC GGC CAC TCC TAC ATC CTT GTC997

ACC TGC CTG GGC CTC TCC TAT GAT GGC CTG CTG GGT GAT GAT1039

CAG AGT ACG CCC AAG ACC GGC CTC CTG ATA ATC GTC CTG GGC1081

ATG ATC TTA ATG GAG GGC AGC CGC GCC CCG GAG GAG GCA ATC1123

TGG GAA GCA TTG AGT GTG ATG GGG GCT GTA TGA1156

TGGGAGGGAG CACAGTGTCT ATTGGAAGCT CAGGAAGCTG CTCACCCAAG1206

AGTGGGTGCA GGAGAACTAC CTGGAGTACC GCCAGGCGCC CGGCAGTGAT1256

CCTGTGCGCT ACGAGTTCCT GTGGGGTCCA AGGGCCCTTG CTGAAACCAG1306

CTATGTGAAA GTCCTGGAGC ATGTGGTCAG GGTCAATGCA AGAGTTCGCA1356

TTTCCTACCC ATCCCTGCAT GAAGAGGCTT TGGGAGAGGA GAAAGGAGTT1406

TGAGCAGGAG TTGCAGCTAG GGCCAGTGGG GCAGGTTGTG GGAGGGCCTG1456

GGCCAGTGCA CGTTCCAGGG CCACATCCAC CACTTTCCCT GCTCTGTTAC1506

ATGAGGCCCA TTCTTCACTC TGTGTTTGAA GAGAGCAGTC ACAGTTCTCA1556

GTAGTGGGGA GCATGTTGGG TGTGAGGGAA CACAGTGTGG ACCÀTCTCTC1606

AGTTCCTGTT CTATTGGGCG ATTTGGAGGT TTATCTTTGT TTCCTTTTGG1656

AATTGTTCCA ATGTTCCTTC TAATGGATGG TGTAATGAAC TTCAACATTC1706

ATTTTATGTA TGACAGTAGA CAGACTTACT GCTTTTTATA TAGTTTAGGA1756

GTAAGAGTCT TGCTTTTCAT TTATACTGGG AAACCCATGT TATTTCTTGA1806

ATTC1810

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 21:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1412 pares de bases (B) TIPO; ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE¹'MOLÉCULA: DNA genómico (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: gene MAGE-9 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 21:

) TCTGAGACAG TGTCCTCAGG TCGCAGAGCA GAGGAGACCC AGGCAGTGTC50

AGCAGTGAAG GTGAAGTGTT CACCCTGAAT GTGCACCAAG GGCCCCACCT100

GCCCCAGCAC ACATGGGACC CCATAGCACC TGGCCCCATT CCCCCTACTG150

TCACTCATAG AGCCTTGATC TCTGCAGGCT AGCTGCACGC TGAGTAGCCC200

TCTCACTTCC TCCCTCAGGT TCTCGGGACA GGCTAACCAG GAGGACAGGA250

GCCCCAAGAG GCCCCAGAGC AGCACTGACG AAGACCTGTA AGTCAGCCTT300

TGTTAGAACC TCCAÂGGTTC GGTTCTCAGC TGAAGTCTCT CACACACTCC350

CTCTCTCCCC AGGCCTGTGG GTCTCCATCG CCCAGCTCCT GCCCAÇGCTC400

CTGACTGCTG CCCTGACCAG AGTCATC '427

ATG TCT CTC GAG CAG AGG AGT CCG CAC TGC AAG CCT GAT GAA469

GAC CTT GAA GCC CAA GGA GAG GAC TTG GGC CTG ATG GGT GCA511

CAG GAA CCC ACA GGC GAG GAG GAG GAG ACT ACC TCC TCC TCT553

GAC AGC AAG GAG GAG GAG GTG TCT GCT GCT GGG TCA TCA AGT595

CCT CCC CAG AGT CCT CAG GGA GGC GCT TCC TCC TCC ATT TCC637

GTC TAC TAC ACT TTA TGG AGC CAA TTC GAT GAG GGC TCC AGC679

AGT CAA GAA GAG GAA GAG CCA AGC TCC TCG GTC GAC CCA GCT721

CAG CTG.GAG TTC ATG TTC CAA GAA GCA CTG AAA TTG AAG GTG763

GCT GAG TTG GTT CAT TTC CTG CTC CAC AAA TAT CGA GTC AAG805

GAG CCG GTC ACA AAG GCA GAA ATG CTG GAG AGC GTC ATC AAA847

AAT TAC AAG CGC TAC TTT CCT GTG ATC TTC GGC AAA GCC TCC889

GAG TTC ATG CAG GTG ATC TTT GGC ACT GAT GTG AAG GAG GTG931

GAC CCC GCC GGC CAC TCC TAC ATC CTT GTC ACT GCT CTT GGC973

CTC TCG TGC GAT AGC ATG CTG GGT GAT GGT CAT AGC ATG CCC1015

AAG GCC GCC CTC CTG ATC ATT GTC CTG GGT GTG ATC CTA ACC1057

AAA GAC AAC TGC GCC CCT GAA GAG GTT ATC TGG GAA GCG TTG1099

AGT GTG ATG GGG GTG TAT GTT GGG AAG GAG CAC ATG TTC TAC1141 ^GGG GAG CCC AGG AAG CTG CTC ACC CAA GAT TGG GTG CAG GAA1183

AAC TAC CTG GAG TAC CGG CAG GTG CCC GGC AGT GAT CCT GCG1225

CAC TAC GAG TTC CTG TGG GGT TCC AAG GCC CAC GCT GAA ACC1267

AGC TAT GAG AAG GTC ATA AAT TAT TTG GTC ATG CTC AAT GCA1309

AGA GAG CCC ATC TGC TAC CCA TCC CTT TAT GAA GAG GTT TTG1351

GGA GAG GAG CAA GAG GGA GTC TGA1375

GCACCAGCCG CAGCCGGGGC CAAAGTTTGT GGGGTCA1412

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 22:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 920 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE'MOLÉCULA: DNA genómico (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: gene MAGE-10 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ XD NO: 22:

ACCTGCTCCA GGACAAAGTG GACCCCACTG CATCAGCTCC ACCTACCCTA 50 CTGTCAGTCC TGGAGCCTTG GCCTCTGCCG GCTGCATCCT GAGGAGCCAT 100 CTCTCACTTC CTTCTTCAGG TTCTCAGGGG ACAGGGAGAG CAAGAGGTCA 150 AGAGCTGTGG GACACCACAG AGCAGCACTG AAGGAGAAGA CCTGTAAGTT 200 GGCCTTTGTT AGAACCTCCA GGGTGTGGTT CTCAGCTGTG GCCACTTACA 250 CCCTCCCTCT CTCCCCAGGC CTGTGGGTCC CCATCGCCCA AGTCCTGCCC 300 ACACTCCCAC CTGCTACCCT GATCAGAGTC ATC .. 3 33

ATG CCT CGA GCT CCA AAG CGT CAG CGC GAT CTT CAA TCC CAA AGT GAG ACA CAG CAG GCT CCC CTG GCT GTG GAG GAG GAT TCC ACC AGC TCC TCT TTT CCA TCC TCT TCT TCC TCC TCC TCC TCC TGC TAT CCT CCA GAG GAG GTT TCT GCT GAT GAT GAG CAG AGT GCT CAG ATA GCC TGC TCC TCC TCC CTT CCA TTA GAT CAA TCT GAT GAG AAG GAG GAG AGT CCA AGC ACC CTA CAG GAG TCT TTA CCC AGA AGT GAG ATA GAT TTG GTG CAG TTT CTG CTC TTC AAG TAT ATC ACA AAG GCA GAA ATA CTG GAG AGT GAA GAC CAC TTC CCT TTG TTG TTT AGT ATG CTG CTG GTC TTT GGC ATT GAT GTA

TGC	ATG	CCT	GAA	GAA	375
GGC	CTC	GAG	GGT	GCA	417
GCT	TCA	TCA	TCC	ACT	459
TTT	CCC	TCC	TCC	TCC	501
CTA	ATA	CCA	AGC	ACC	543
ACA	CCA	AAT	CCT	CCC	585
CCC	TCG	GTC	GTT	GCT	627
GGC	TCC	AGC	AGC	CAA	669
GTC	CTG	CCA	GAC	AGT	711
GAA	AAG	GTG	ACT	GAT	753
CAA	ATG	AAG	GAG	CCG	795
GTC	ATA	AAA	AAT	TAT	837
GAA	GCC	TCC	GAG	TGC	879
AAG	GAA	GTG	GAT	CC	920

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 23:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1107 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) topologia; linear (ii) TIPO DE'¹ MOLÉCULA: DNA genómico (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: gene MAGE-11 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 23:

AGAGAACAGG CCAACCTGGA GGACAGGAGT CCCAGGAGAA CCCAGAGGAT50

CACTGGAGGA GAACAAGTGT AAGTAGGCCT TTGTTAGATT CTCCATGGTT100

CATATCTCAT CTGAGTCTGT TCTCACGCTC CCTCTCTCCC CAGGCTGTGG150

GGCCCCATCA CCCAGATATT TCCCACAGTT CGGCCTGCTG ACCTAACCAG200

AGTCATCATG CCTCTTGAGC AAAGAAGTCA GCACTGCAAG CCTGAGGAAG250

CCTTCAGGCC CAAGAAGAAG ACCTGGGCCT GGTGGGTGCA CAGGCTCTCC300

AAGCTGAGGA GCAGGAGGCT GCCTTCTTCT CCTCTACTCT GAATGT-GGGC350

ACTCTAGAGG AGTTGCCTGC TGCTGAGTCA CCAAGTCCTC CCCAGAGTCC400

TCAGGAAGAG TCCTTCTCTC CCACTGCCAT GGATGCCATC TTTGGGAGCC450

TATCTGATGA GGGCTCTGGC AGCCAAGAAA AGGAGGGGCC AAGTACCTCG500

CCTGACCTGA TAGACCCTGA GTCCTTTTCC CAAGATATAC TACATGACAA550

GATAATTGAT TTGGTTCATT TATTCTCCGC AAGTATCGAG TCAAGGGGCT600

GATCACAAAG GCAGAA616

ATG CTG GGG AGT GTC ATC AAA AAT TAT GAG GAC TAC TTT CCT658

GAG ATA TTT AGG GAA GCC TCT GTA TGC ATG CAA CTG CTC TTT700

GGC ATT GAT GTG AAG GAA GTG GAC CCC ACT AGC CAC TCC TAT742

GTC CTT GTC ACC TCC CTC AAC CTC TCT TAT GAT GGC ATA CAG784

TGT AAT GAG CAG AGC ATG CCC AAG TCT GGC CTC CTG ATA ATA826

GTC CTG GGT GTA ATC TTC ATG GAG GGG AAC TGC ATC CCT GAA868

GAG GTT ATG TGG GAA GTC CTG AGC ATT ATG GGG GTG TAT GCT910

GGA AGG GAG CAC TTC CTC TTT GGG GAG CCC AAG AGG CTC CTT952

ACC CAA AAT TGG GTG CAG GAA AAG TAC CTG GTG TAC CGG CAG994

GTG CCC GGC ACT GAT CCT GCA TGC TAT GAG TTC CTG TGG GGT1036

CCA AGG GCC CAC GCT GAG ACC AGC AAG ATG AAA GTT CTT GAG1078

TAC ATA GCC AAT GCC AAT GGG AGG GAT CC1107

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 24:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 2105 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE'‘MOLÉCULA: DNA genómico (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: smage-I (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 24:

TCTGTCTGCA TATGCCTCCA CTTGTGTGTA GCAGTCTCAA ATGGATCTCT 50 CTCTACAGAC CTCTGTCTGT GTCTGGCACC CTAAGTGGCT TTGCATGGGC 100 ACAGGTTTCT GCCCCTGCAT GGAGCTTAAA TAGATCTTTC TCCACAGGCC 150 TATACCCCTG CATTGTAAGT TTAAGTGGCT TTATGTGGAT ACAGGTCTCT 200 GCCCTTGTAT GCAGGCCTAA GTTTTTCTGT CTGCTTAACC CCTCCAAGTG 250 AAGCTAGTGA AAGATCTAAC CCACTTTTGG AAGTCTGAAA CTAGACTTTT 3 00 ATGCAGTGGC CTAACAAGTT TTAATTTCTT CCACAGGGTT TGCAGAAAAG 350 AGCTTGATCC ACGAGTTCAG AAGTCCTGGT ATGTTCCTAG AAAG 394 ATG TTC TCC TGG AAA GCT TCA AAA GCC AGG TCT CCA TTA AGT 436 CCA AGG TAT TCT CTA CCT GGT AGT ACA GAG GTA CTT ACA GGT 478 TGT CAT TCT TAT CCT TCC AGA TTC CTG TCT GCC AGC TCT TTT 520 ACT TCA GCC CTG AGC ACA GTC AAC ATG CCT AGG GGT CAA AAG 565 AGT AAG ACC CGC TCC CGT GCA AAA CGA CAG CAG TCA CGC AGG 604 GAG GTT CCA GTA GTT CAG CCC ACT GCA GAG GAA GCA GGG TCT 646 TCT CCT GTT GAC CAG AGT GCT GGG TCC AGC TTC CCT GGT GGT 688 TCT GCT CCT CAG GGT GTG AAA ACC CCT GGA TCT TTT GGT GCA 730 GGT GTA TCC TGC ACA GGC TCT GGT ATA GGT GGT AGA AAT GCT 772 GCT GTC CTG CCT GAT ACA AAA AGT TCA GAT GGC ACC CAG GCA 814 GGG AÇT TCC ATT CAG CAC ACA CTG AAA GAT CCT ATC ATG AGG 856 AAG GCT AGT GTG CTG ATA GAA TTC CTG CTA GAT AAA TTT AAG 898 ATG AAA GAA GCA GTT ACA AGG AGT GAA ATG CTG GCA GTA GTT 94 0 AAC AAG AAG TAT AAG GAG CAA TTC CCT GAG ATC CTC AGG AGA 982 ACT TCT GCA CGC CTA GAA TTA GTC TTT GGT CTT GAG TTG AAG 1024 GAA ATT GAT CCC AGC ACT CAT TCC TAT TTG CTG GTA GGC AAA 1066 CTG GGT CTT TCC ACT GAG GGA AGT TTG AGT AGT AAC TGG GGG 1108 TTG CCT AGG ACA GGT CTC CTA ATG TCT GTC CTA GGT GTG ATC 1150 TTC ATG AAG GGT AAC CGT GCC ACT GAG CAA GAG GTC TGG CAA 1192 TTT CTG CAT GGA GTG GGG GTA TAT GCT GGG AAG AAG CAC TTG 1234 ATC TTT GGC GAG CCT GAG GAG TTT ATA AGA GAT GTA GTG CGG 1276 GAA AAT TAC CTG GAG TAC CGC CAG GTA CCT GGC AGT GAT CCC 1314 CCA AGC TAT GAG TTC CTG TGG GGA CCC AGA GCC CAT GCT GAA 1360 ACA ACC AAG ATG AAA GTC CTG GAA GTT TTA GCT AAA GTC AAT 14 02 GGC ACA GTC CCT AGT GCC TTC CCT AAT CTC TAC CAG TTG GCT 1444 CTT AGA GAT CAG GCA GGA GGG GTG CCA AGA AGG AGA GTT CAA 1486 GGC AAG GGT GTT CAT TCC AAG GCC CCA TCC CAA AAG TCC TCT 1528 AAC ATG TAG 1537 TTGAGTCTGT TCTGTTGTGT TTGAAAAACA GTCAGGCTCC TAATCAGTAG 1587 AGAGTTCATA GCCTACCAGA ACCAACATGC ATCCATTCTT GGCCTGTTAT 1637 ACATTAGTAG AATGGAGGCT ATTTTTGTTA CTTTTCAAAT GTTTGTTTAA 1687 CTAAACAGTG CTTTTTGCCA TGCTTCTTGT TAACTGCATA AAGAGGTAAC 1737

TGTCACTTGT CAGATTAGGA CTTGTTTTGT TATTTGCAAC AAACTGGAAA1787

ACATTATTTT GTTTTTACTA AAACATTGTG TAACATTGCA TTGGAGAAGG1837

GATTGTCATG GCAATGTGAT ATCATACAGT GGTGAAACAA CAGTGAAGTG1887

I GGAAAGTTTA TATTGTTAAT TTTGAAAATT TTATGAGTGT GATTGCTGTA1937

TACTTTTTTC TTTTTTGTAT AATGCTAAGT GAAATAAAGT TGGATTTGAT1987

GACTTTACTC AAATTCATTA GAAAGTAAAT CGTAAAACTC TATTACTTTA2037

TTATTTTCTT CAATTATGAA TTAAGCATTG GTTATCTGGA AGTTTCTCCA2087

GTAGCACAGG ATCTAGTATG AAATGTATCT AGTATAGGCA CTGACAGTGA2137

GTTATCAGAG TCT2150

SL' £ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 25: ' í (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 2099 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE¹¹ MOLÉCULA: DNA genómico (ÍX) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: smage-II (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 25:

ACCTTATTGG GTCTGTCTGC ATATGCCTCC ACTTGTGTGT AGCAGTCTCA50

AATGGATCTC TCTCTACAGA CCTCTGTCTG TGTCTGGCAC CCTAAGTGGC100

TTTGCATGGG CACAGGTTTC TGCCCCTGCA TGGAGCTTAA ATAGATCTTT150

CTCCACAGGC CTATACCCCT GCATTGTAAG TTTAAGTGGC TTTATGTGGA200

TACAGGTCTC TGCCCTTGTA TGCAGGCCTA AGTTTTTCTG TCTGCTTAGC250

CCCTCCAAGT GAAGCTAGTG AAAGATCTAA CCCACTTTTG GAAGTCTGAA300

ACTAGACTTT TATGCAGTGG CCTAACAAGT TTTAATTTCT TCCACAGGGT350

TTGCAGAAAA GAGCTTGATC CACGAGTTCG GAAGTCCTGG TATGTTCCTA400

GAAAGATGTT CTCCTGGAAA GCTTCAAAAG CCAGGTCTCC ATTAAGTCCA450

AGGTATTCTC TACCTGGTAG TACAGAGGTA CTTACAGGTT GTCATTCTTA500

TCTTTCCAGA TTCCTGTCTG CCAGCTCTTT TACTTCAGCC CTGAGCACAG550

TCAACATGCC TAGGGGTCAA AAGAGTAAGA CCCGCTCCCG TGCAAAACGA600

CAGCAGTCAC GCAGGGAGGT TCCAGTAGTT CAGCCCACTG CAGAGGAAGC650

AGGGTCTTCT CCTGTTGACC AGAGTGCTGG GTCCAGCTTC CCTGGTGGTT700

CTGCTCCTCA GGGTGTGAAA ACCCCTGGAT CTTTTGGTGC AGGTGTATCC750

TGCACAGGCT CTGGTATAGG TGGTAGAAAT GCTGCTGTCC TGCCTGATAC800

AAAAAGTTCA GATGGCACCC AGGCAGGGAC TTCCATTCAG CACACACTGA850

AAGATCCTAT CATGAGGAAG GCTAGTGTGC TGATAGAATT CCTGCTAGAT900

AAGTTTAAGA TGAAAGAAGC AGTTACAAGG AGTGAAATGC TGGCAGTAGT950

TAACAAGAAG TATAAGGAGC AATTCCCTGA GATCCTCAGG AGAACTTCTG1000

CACGCCTAGA ATTAGTCTTT GGTCTTGAGT TGAAGGAAAT TGATCCCAGC1050

ACTCATTCCT ATTTGCTGGT AGGCAAACTG GGTCTTTCCA CTGAGGGAAG1100

TTTGAGTAGT AACTGGGGGT TGCCTAGGAC AGGTCTCCTA ATGTCTGTCC1150

TAGGTGTGAT CTTCATGAAG GGTAACCGTG CCACTGAGCA AGAGGTCTGG1200

CAATTTCTGC ATGGAGTGGG GGTATATGCT GGGAAGAAGC ACTTGATCTT1250

TGGCGAGCCT GAGGAGTTTA TAAGAGATGT AGTGCGGGAA AATTACCTGG1300

AGTACCGCCA GGTACCTGGC AGTGATCCCC CAAGCTATGA GTTCCTGTGG1350 ₍GGACCCAGAG CCCATGCTGA AACAACCAAG ATGAAAGTCC TGGAAGTTTT1400

AGCTAAAGTC AATGGCACAG TCCCTAGTGC CTTCCCTAAT CTCTACCAGT1450

TGGCTCTTAG AGATCAGGCA GGAGGGGTGC CAAGAAGGAG AGTTCAAGGC1500

AAGGGTGTTC ATTCCAAGGC CCCATCCCAA AAGTCCTCTA ACATGTAGTT1550

GAGTCTGTTC TGTTGTGTTT GAAAAACAGT CAGGCTCCTA ATCAGTAGAG1600

AGTTCATAGC CTACCAGAAC CAACATGCAT CCATTCTTGG CCTGTTATAC1650

ATTAGTAGAA TGGAGGCTAT TTTTGTTACT TTTCAAATGT TTGTTTAACT1700

AAACAGTGCT TTTTGCCATG CTTCTTGTTA ACTGCATAAA GAGGTAACTG1750

TCACTTGTCA GATTAGGACT TGTTTTGTTA TTTGCAACAA ACTGGAAAAC1800

ATTATTTTGT TTTTACTAAA ACATTGTGTA ACATTGCATT GGAGAAGGGA1850

TTGTCATGGC AATGTGATAT CATACAGTGG TGAAACAACA GTGAAGTGGG1900

AAAGTTTATA TTGTTAGTTT TGAAAATTTT ATGAGTGTGA TTGCTGTATA1950

CTTTTTTCTT TTTTGTATAA TGCTAAGTGA AATAAAGTTG GATTTGATGA2000

CTTTACTCAA ATTCATTAGA AAGTAAATCA TAAAACTCTA TTACTTTATT ATTTTCTTCA ATTATTAATT AAGCATTGGT TATCTGGAAG TTTCTCCAG

2050

2099

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 26: ' Sf.

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 26:

Glu Ala Asp Pro Tre Gli His Ser Tir

Lisboa, 22 de Maio de 1992

J. PEREIRA DA CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON. 10-A 3? 1200 LISBOA

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES is. - Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada por codificar um precursor de antigénio da rejeição de tumores ou que é complementar da molécula de ácido nucleico que codifica um precursor de antigénio da rejeição de tumores.

   23. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a referida molécula codificar um precursor de antigénio da rejeição de tumores.

   33. - Molécula de ácido nucleico isolada da reivindicação 1, caracterizada por a referida molécula codificar um precursor de antigénio da rejeição de tumores humano.

   43. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a referida molécula ser complementar de uma molécula de ácido nucleico que codifica o precursor de antigénio da rejeição de tumores.

   53. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a referida molécula ser DNA.

   63. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a referida molécula ser RNA.

   73. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a referida molécula ser um gene.

   83. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por o referido DNA ser DNA genómico.

   9a. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por o referido DNA ser cDNA.

   103. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o referido RNA ser mRNA.

   lia. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por a referida molécula hibridar com ácido nucleico isolado que codifica o precursor de antigénio da rejeição de tumores em condições restringentes.

   12a. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a referida molécula codificar um precursor do antigénio MAGE ou ser complementar de uma molécula que codifica um precursor do antigénio MAGE.

   133. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por o referido precursor do antigénio MAGE ser seleccionado do grupo constituído por mage 1, mage 2, mage 3, mage 4, mage 5, mage 6, mage 7, mage 8, mage 9, mage 10, mage 11, smage I e smage II.

   14a. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por a referida molécula codificar um precursor do antigénio MAGE.

   153. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por a referida molécula ser complementar de uma molécula que codifica um precursor do antigénio MAGE.

   16^. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por a referida molécula ser DNA.

   173. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por a referida molécula ser RNA.

   18a. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por a referida molécula ser um gene.

   193. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por o referido DNA ser DNA genómico.

   203. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por o referido DNA ser cDNA.

   213. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por o referido RNA ser mRNA.

   22^a. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por compreender uma sequência de nucleótidos descrita na figura 12.

   233. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por a referida molécula hibridar com uma molécula que codifica um precursor do antigénio MAGE em condições restrigentes.

   24a. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser codificadora de um precursor de antigénio de rejeição de tumores para mastocitoma.

   253. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser codificadora do precursor do antigénio da rejeição de tumores PIA.

   263. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ter a sequência de nucleótidos da figura 6.

   273. - cultura biologicamente pura, caracterizada por ser de uma linha celular transfectada com a sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2.

   283. - Cultura biologicamente pura, caracterizada por ser de uma linha celular transfectada com a sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 12·

   293. - cultura biologicamente pura, caracterizada por ser de uma linha^ celular transfectada com a sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 22.

   303. - Cultura biologicamente pura de acordo com a reivindicação 27, caracterizada por ser seleccionada do grupo constituído por P1A.T2 e P1A.TC3.1.

   313. - Cultura biologicamente pura de uma linha‘celular altamente transfectável derivada de uma linha celular parental que expressa pelo menos um antigénio de tumor P815, caracterizada por a referida altamente transfectável não expressar qualquer um dos antigénios tumorais P815 A, B e C.

   32 3. - Linha celular biologicamente pura de acordo com a reivindicação 31, caracterizada por compreender a linha celular

   PO.HTR.

   33^a- - Cultura biologicamente pura de uma linha celular de acordo com a reivindicação 27, caracterizada por o referido precursor de antigénio de rejeição de tumores ser um precursor do antigénio da rejeição de tumores humano.

   34^a. - Cultura biologicamente pura de uma linha celular de acordo com a reivindicação 33, caracterizada por o referido precursor do antigénio de tumor humano ser encontrado em células de melanoma.

   35^a. - Linha celular biologicamente pura de acordo com a reivindicação 34, caracterizada por o referido precursor do antigénio de rejeição de tumores ser mage-1 e o referido DNA isolado ter a sequência de ácido nucleico: