FI117555B - Kasvaimen hyljintäantigeenin esiasteet, kasvaimen hyljintäantigeenit ja niiden käytöt - Google Patents

Description

117555

Kasvaimen hyljintäantigeenin esiasteet, kasvaimen hyljin-täantigeenit ja niiden käytöt Tämä patenttihakemus on jatko-osa patenttihakemuk-5 selle, jonka sarjanumero on 807 043, joka on rekisteröity 12.12.1991, joka on jatko-osa patenttihakemukselle, jonka sarjanumero on 764 364, joka on rekisteröity 23.9.1991, joka on jatko-osa patenttihakemukselle, jonka sarjanumero on 728 838, joka on rekisteröity 9.7.1991, joka on jatko-10 osa patenttihakemukselle, jonka sarjanumero on 705 702, joka on rekisteröity 23.5.1991 ja nyt hylätty.

Keksinnön alue Tämä keksintö koskee yleisesti immunogenetiikan .

aluetta sovellettuna onkologian tutkimukseen. Erikoisem-15 min, se koskee niiden mekanismien tutkimista ja analysointia, joilla organismin immuunisysteemi tunnistaa kasvai-met, kuten tuottamalla niin kutsuttuja kasvaimen hyljintä-antigeeneja ja ekspressoimalla sellaisia aineita, joita | tässä kutsutaan "kasvaimen hyljintäantigeenin esiasteik- ‘ 20 si".

Tausta ja aikaisempi ala

Tutkimus isäntäorganismin toimesta tapahtuneesta syöpäsolujen tunnistuksesta tai tunnistuksen puutteesta on * · • *' edennyt moniin eri suuntiin. Alueen ymmärtäminen edellyt- • « * « · 25 tää hiukan ymmärtämystä sekä perusimmunologiasta että on- • * * : kologiasta.

• · · : *.· Aiemmat tutkimukset hiiren kasvaimilla paljastivat, • · · ·’/ ί että nämä sisälsivät molekyylejä, jotka johtivat kasvain- solujen hyljintään silloin, kun ne siirrostettiin syngee- : ;*j 30 nisiin eläimiin. Vastaanottajaeläimen τ-solut "tunnista- • · * vat" nämä molekyylit ja herättävät sytolyyttisen T-solu- • * · vasteen niin, että siirrostetut solut lyysaavat. Tämä ha- • · · valttiin ensimmäisen kerran kasvaimilla, jotka oli indu- ·»· • · *...* soitu in vitro kemiallisilla karsinogeeneilla, kuten me- ....: 35 tyylikolantreenilla. Kasvainten ekspressoimien antigeenien • * 2 117555 ja niiden antigeenien, jotka saivat aikaan T-soluvasteen, havaittiin olevan erilaisia kussakin kasvaimessa. Katso Prehn et ai., J. Natl. Cane. Inst. 18: 769 - 778 (1957);

Klein et ai., Cancer Res. 20: 1561 - 1572 (1960): Gross, 5 Cancer Res. 3: 326 - 333 (1943), Basombrio, Cancer Res.

30: 2 458 - 2 462 (1970), joissa yleisesti opetetaan, kuinka indusoidaan kasvaimia kemiallisilla karsinogeeneilla, ja solupinta-antigeenien eroja. Tämä antigeeniluokka on tullut tunnetuksi "kasvainspesifisinä transplantaatio-10 antigeeneinä" tai "TSTAtna". Kun oli havaittu sellaisten antigeenien muodostuminen kemiallisilla karsinogeeneilla tapahtuneen indusoinnin jälkeen, samanlaiset tulokset saatiin, kun kasvaimia indusoitiin in vitro ultraviolettivalolla. Katso Kripke, J. Natl. Canc. Inst. 53: 333 - 1336 15 (1973). *

Samalla, kun T-soluvälitteiset immuunivasteet havaittiin yllä kuvatuille kasvaintyypeille, spontaanien kasvainten ajateltiin olevan yleisesti ei-immunogeenisia.

Näiden ei sen vuoksi uskottu muodostavan antigeenejä, jot-20 ka herättivät vasteen kasvainta vastaan kasvaimen sisältä vässä yksilössä. Katso Hewitt et ai., Brit. J. Cancer 33: . 241 - 259 (1976).

ι·* '

Tunf-antigeenia muodostavat solulinjat ovat ryhmä, * * • ” jotka ovat immunogeenisia muunnoksia, jotka on saatu ai- • · · · · 25 kaan mutagenisoimalla hiiren kasvainsoluja tai solulinjo- ϊ.ί : ja, kuten ovat kuvanneet Boon et ai., J. Exp. Med. 152: • * * ^ * 1184 - 1193 (1980), joiden kuvaus on liitetty viitteeksi.

• * * ί.ί ! Yksityiskohtaisemmin, tum'-anti geenit saadaan mutatoimalla kasvainsoluja, jotka eivät muodosta immuunivastetta syn- : 30 geenisissä hiirissä ja muodostavat kasvaimia (se on, ·*· .*·*. "tum+"-soluja). Kun näitä tum+-soluja mutagenisoidaan, syn- ; • · » geeniset hiiret hylkivät niitä ja ne eivät onnistu muodos- • · · *·* * tamaan kasvaimia (näin ollen "tum·”). Katso Boon et ai., ·»· .··.·' ·*Ε

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 272 (1977), jonka kuvaus on • ‘f ....: 35 liitetty viitteeksi. Monien kasvaintyyppien on osoitettu • · 117555 3 sisältävän tämän Ilmiön. Katso esim. Frost et ai.. Cancer Res. 43: 125 (1983).

On ilmeistä, että turn'-muunnokset eivät onnistu muodostamaan progressiivisia kasvaimia, koska ne herättävät ; 5 immuunihyljintäprosessin. Todiste tämän hypoteesin puolesta sisältää sen, että kasvainten "turn""-muunnokset, se on ne, jotka eivät normaalisti muodosta kasvaimia, kykenevät tekemään niin hiirissä, joiden immuunisysteemi on suppres-soitu ei-kuolettavalla säteilymäärällä, Van Pel et ai., 10 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 5 282 - 5 285 (1979); ja havainnon, että vatsaonteloon injektoidut mastosytooman P815 tum‘-solut jakautuvat eksponentiaalisesti 12 - 15 vuorokautta ja sitten ne eliminoituvat ainoastaan muutaman vuorokauden aikana kesken lymfosyytti- ja makrofagitulvaa -f 15 (Uyttenhove et ai., J. Exp. Med. 152: 1 175 - 1 183 (1980)). Lisätodisteet sisältävät sen havainnon, että hiiret muodostavat immunologisen muistin, joka sallii niiden vastustaa myöhempää altistusta samalle turn"-muunnokselle ^ jopa silloin, kun soluille annetaan altistuksen jälkeen t 20 immunosuppressiivinen määrä säteilyä (Boon et ai., Proc. >

Natl. Acad. Sei. USA 74: 272 - 275 (1977); Van Pel et ai., yllä; Uyttenhove et ai., yllä).

II** Myöhemmät tutkimukset ovat osoittaneet, että kun • ] spontaanit kasvaimet altistettiin mutageneesille, tuotet- 25 tiin inununogeenisia muunnoksia, jotka muodostivat vasteen.

• * · -r J Nämä muunnokset kykenivät todellakin saamaan aikaan suo- ·· · ; *.· jaavan immuunivasteen alkuperäistä kasvainta vastaan. Kat- • · « : - .h v : so Van Pel et ai., J. Exp. Med. 157: 1992 - 2001 (1983).

Näin ollen on osoitettu, että on mahdollista saada aikaan : 30 niin kutsutun "kasvaimen hyljintäantigeenin" muodostuminen • · · ;***. kasvaimessa, joka on kohde syngeeniselle hyljintävasteel- le. Samanlaiset tulokset on saatu, kun vieraita geenejä on ·.

• · · *·| * transfektoitu spontaaneihin kasvaimiin. Katso tämän suh- *··.* teen Fearson et ai., Cancer Res. 48: 2975 - 1980 (1988).

*;··· 35 On tunnistettu ryhmä antigeenejä, jotka muodostuvat « • · 4 117555 kasvainsolujen pinnalle ja jotka sytotoksiset T-solut tunnistavat, joka johtaa lyysiin. Tätä antigeeniryhmää kutsutaan "kasvaimen hyljintäantigeeneiksi" tai "TRA:ksi" tämän jälkeen. TRA-molekyylit voivat saada aikaan vasta-ainevas- *

5 teet tai sitten eivät. Siinä määrin kuin näitä antigeenejä on tutkittu, se on tapahtunut sytolyyttisten T-solujen karakterisointitutkimuksilla in vitro, se on, tutkimuksilla siitä, kuinka tietty sytolyyttinen T-solualaryhmä ("CTL" tämän jälkeen) tunnistaa antigeenin. Alaryhmä ja-10 kaantuu tunnistettuaan muodostuneen kasvaimen hyljintäan-tigeenin ja antigeeniä muodostavat solut lyysataan. Karak-terisointitutkimukset ovat tunnistaneet CTL-kloonit, jotka spesifisesti lyysaavat soluja, jotka ekspressoivat näitä antigeenejä. Esimerkkejä tästä työstä voidaan löytää jul- A

15 kaisuista Lecy et ai., Adv. Cancer Rea. 24: 1 - 59 (1977); ’?

Boon et ai., J. Exp. Med. 152: 1184 - 1193 (1980); Brunner et ai., J. Immunol. 124: 1 627 - 1 634 (1980); Maryanski ^ et ai., Eur. J. Immunol. 124: 1627 - 1634 (1980); Maryans- ki et ai., Eur. J. Immunol. 12: 406 - 412 (1982); Palladi-20 no et ai., Cane. Res. 47: 5 074 - 5 079 (1987). Tämän tyyppistä analyysiä tarvitaan muita CTL-solujen tunnista-' m·' mia antigeeni tyyppejä varten, sisältäen vähäisemmät histo- **** kompatibiliteettiantigeenit, urosspesifiset H-Y-antigeenit • · • *] ja ryhmän antigeenejä, joihin viitataan nimellä "tum"-an- * 25 tigeenit ja joista keskustellaan tässä.

• · i : Yllä kuvatun asian esimerkkikasvain tunnetaan ni- • · · • ’,· mellä P815. Katso DePlaen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 85: 2 274 - 2 278 (1988); Szikora et ai., EMBO J. 9: 1 041 - 1 050 (1990) ja Sibille et ai., J. Exp. Med. 172: ; **j 30 35 - 45 (1990), joiden kuvaukset on liitetty viitteeksi.

**· ,·*·. P815-kasvain on mastosytooma, joka on indusoitu DBA/2-hii- • · ^ ressä metyylikolantreenilla ja jota viljellään sekä in ji * * * *·* * vitro kasvaimena että solulinjana. P815-linja on muodosta- y * · · · :...· nut useita tum"-muunnoksia mutageneesin jälkeen sisältäen ·...: 35 muunnokset, joihin viitataan nimillä P19A (DePlaen et ai., ♦ • · s 117555 yllä), 35B (Szikora, yllä) ja P198 (Sibille, yllä). Verrattuna kasvaimen hyljintäantigeeneihin - ja tämä on keskeisin ero - tum'-antigeenit ovat läsnä ainoastaan sen jälkeen, kun kasvainsolut on mutagenisoitu. Kasvaimen hyijin- * 5 täantigeenit ovat läsnä tietyn kasvaimen soluissa ilman mutagenisointia. Näin ollen, kirjallisuutta lainaten, so-lulinja voi olla tum+, kuten linja, johon viitataan nimellä "Pl", ja se voidaan saada aikaan tuottamaan tum'-muunnok-sia. Koska tum'-fenotyyppi eroaa emosolulinjan fenotyypis-10 tä, voi odottaa, että tum'-solulinjojen DNArssa on eroa verrattuna niiden tum*-emolinjojen DNA:hän, ja että tätä eroa voidaan käyttää hyväksi tutkittavan geenin paikantamisessa tunf-soluissa. Tuloksena havaittiin, että tum'-muunnosten, kuten P91A-, 35B- ja P198-muunnosten, geenit 15 eroavat niiden normaalialleeleista pistemutaatioiden suhteen geenin koodattavilla alueilla. Katso Szikora ja Sibille, yllä, ja Lurquin et ai., Cell 58: 293 - 303 (1989). j! Tämä ei ole osoittautunut olevan näin tämän keksinnön mu- j, kaisten TRA-molekyylien suhteen. Nämä julkaisut osoittivat 20 myös, että tum‘-antigeeneista peräisin olevat peptidit tarjotaan Ld-molekyylin toimesta CTL-solujen tunnistettaviksi.

P91A:n tarjoaa Ld, P35:n Dd ja P198:n Kd.

I**’ Nyt on havaittu, että geenejä, jotka koodittavat • ·· molekyylejä, joita prosessoidaan muodostamaan tuotetut ·«·*« , 25 kasvaimen hyljintäantigeenit (joihin viitataan nimellä • * · j*: ϊ "kasvaimen hyljintäantigeenin esiasteet", "esiastemolekyy- I .· lit" tai "TRAP:t" tämän jälkeen), ei ekspressoida useim- • · · V · missä normaaleissa aikuisen kudoksissa, mutta niitä eksp- ressoidaan kasvainsoluissa. Geenit, jotka koodittavat 30 TRAP-molekyylejä, on nyt eristetty ja kloonattu, ja ne muodostavat osan tässä kuvattua keksintöä.

···

Geeni on käyttökelpoinen eristettyjen ja puhdistet- » • $ * "*]/ tujen kasvaimen hyljintäantigeeniesiasteiden ja TRA-mole- ;r • · '···* kyylien itsensä lähteenä, joista kumpaakin voidaan käyttää *:··· 35 aineena, jolla käsitellään syöpää, jolle antigeeni on ····· * ♦ 117555 6 "merkki”, kuin myös erilaisiin onkologian diagnostiikka-ja valvontamenetelmiin, joista keskustellaan jäljempänä.

Tiedetään esimerkiksi, että tum'-soluja voidaan käyttää muodostamaan CTL-solut, jotka lyysaavat solut, joissa on 'λ, 5 erilaiset tum'-antigeenit, kuin myös tura+-solut. Katso esim. Maryanski et ai., Eur. J. Immunol. 12: 401 (1982) ja Van den Eynde et ai., Modern Trends in Leukemia IX (kesäkuu, 1990), joiden kuvaukset on liitetty viitteeksi. Kasvaimen hyljintäantigeeniesiastetta voidaan ekspressoida 10 soluissa, jotka on transfektoitu geenillä, ja sitten käyttää muodostamaan immuunivaste tutkittua kasvainta vastaan.

Vastaavissa ihmisen kasvaintapauksissa on havaittu, että autologiset lymfosyytti-kasvainsolusekaviljelmät ("MLTC" tämän jälkeen) usein muodostavat vastelymfosyyt-15 tejä, jotka lyysaavat autologisia kasvainsoluja eivätkä lyysaa luonnollisia tappokohteita, autologisia EBV-trans-formoituja B-soluja tai autologisia fibroblateja (katso ^

Anichini et ai., Immunol. Today 8: 385 - 389 (1987)). Tätä vastetta on tutkittu erikoisen hyvin melanoomien kohdalla 20 ja MLTC-viljelmät on valmistettu joko perifeerisistä verisoluista tai kasvaimiin tunkeutuvista lymfosyyteistä. Kir-... jallisuusesimerkit tällä alueella sisältävät julkaisut !!** Knuth et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2 804 - 2 802 * · * . (1984); Mukherji et ai., J. Exp. Med. 158: 240 (1983); 25 Hdrin et ai., Int. J. Canc. 39: 390 - 396 (1987); Topalian ϊ··: : et ai., J. Clin. Oncol. 6: 839 - 853 (1988). MLTC-vaste-

·· I

: .· soluista on saatu aikaan stabiileja sytotoksisia T-solu- V * klooneja ("CTL:t" tämän jälkeen) ja nämä kloonit ovat spe- ' sifisiä kasvainsoluille. Katso Mukherji et ai., yllä, : 30 Herin et ai., yllä, Knuth et ai., yllä. Näiden autologis- *·· ·***; ten CTL-solujen kasvainsoluissa tunnistamat antigeenit • · * eivät tunnu olevan viljelyartefaktoja, koska ne löydetään • · · *·].* tuoreista kasvainsoluista. Topalian et ai., yllä; Degio- *···* vanni et ai., Eur. J. Immunol. 20: 1865 - 1868 (1990).

·;··; 35 Nämä havainnot yhdistettynä tässä käytettyihin menetel- • · · · * * ♦ • '1 7 117555 miin, joilla eristettiin geenit spesifisille hiiren kasvaimen hyljintäantigeeniesiasteille, ovat johtaneet sei- laisten nukleiinihapposekvenssien eristykseen, jotka koo-dittavat TRA-molekyylien kasvaimen hyljintäantigeeniesi- $1 5 asteita, jotka ovat läsnä ihmisen kasvaimissa. Nyt on mahdollista eristää nukleiinihapposekvenssit, jotka koodattavat kasvaimen hyljintäantigeeniesiasteita, jotka sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, tietyn kasvaimen ominaisimmat kasvaimen hyljintäantigeeniesiasteet, saaden ne 1Ö seurannaisvaikutukset, jotka on kuvattu jäljempänä. Nämä ;‘ ihmisen kasvaimen hyljintäantigeeniesiasteiden nukleiinihapposekvenssit ja niiden sovellukset, kuten on kuvattu jäljempänä, kuuluvat myös tähän keksintöön.

Näitä ja erilaiset muita keksinnön näkökohtia on 15 käsitelty laajemmin seuraavassa kuvauksessa. 1'

Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuvio 1 kuvaa niiden transfektanttien tunnistuksen, j jotka ekspressoivat P815A-antigeenia. j

Kuvio 2 esittää kloonien Pl.HTR, PO.HTR, genomlsen 1 20 transfektantin P1A.T2 ja kosmiditransfektantin P1A.TC3.1 herkkyyden eri CTL-solujen aiheuttamalle lyysille määri-m·m tettynä kromin vapautumistesteillä.

I*** Kuvio 3 on kosmidin CIA.3.1. restriktiokartta.

t «1 • , Kuvio 4 esittää Northern blot -analyysin PlA-geenin ***** 25 ekspressiosta. | • · · · ji ί·ί ί Kuvio 5 kuvaa PlA-geenin rakenteen yhdessä sen

Il f ί .· restriktiokohtien kanssa.

• · · 1 Kuvio 6 esittää tulokset, jotka saatiin, kun solut transfektoitiin PlA-geenillä, joka oli eristetty joko : :1; 30 P815- tai normaaleista soluista, ja sitten testattiin CTL- ; lyysillä.

• ·

Kuvio 7 esittää lyyttiset tutkimukset, joissa käy- 4 • · · 1 *·[/ tettiin syöttösolulinjaa L138.8A.

• · • 1 ··· • . ·» ·.

«···· • · • ' I 1 ··1·· · 117555 β

Kuvio 8 on antigeenin E-fragmentin 2,4 kiloemäksen pituisen sekvenssin alafragmenttien kartta, joka sekvenssi myös ekspressoi antigeeniä.

Kuvio 9 esittää mage 1, 2 ja 3 -geenien eksonin 3 5 alueiden homologiat. $

Kuvio 10 esittää eri kudosten MAGE-geenien Northern > blot -tuloksen.

Kuvio 11 esittää kuvion 13 tulokset taulukon muodossa.

10 Kuvio 12 esittää Southern blot -kokeet käyttäen ! ihmisen eri melanoomasolulinjoja, joita on käytetty tässä patenttihakemuksessa.

. , ·1ι

Kuvio 13 on yleistetty kaavio MAGE 1, 2 ja 3 -geenien ekspressiosta kasvainkudoksissa ja normaaleissa ku- ;1 15 doksissa.

Sekvenssien lyhyt kuvaus SEQ ID numero 1 on cDNA osalle PlA-geeniä.

SEQ ID numero 2 esittää PlA-geenin koodittavan alueen cDNA:n.

20 SEQ ID numero 3 esittää PlA-geenin cDNA:n ei-koo- K

dittavan DNA:n, joka on 3'-puolella SEQ ID numero 2:n koo- • dittavan alueen suhteen.

··· !!’* SEQ id numero 4 on PlA-geenin cDNA:n koko sekvens- . si.

··»·· 25 SEQ ID numero 5 on PlA-geenin genomisen DNA:n sek- i • · · !·: : venssi.

·· · J .· SEQ ID numero 6 esittää PIA TRA-molekyylin antigee- ··» V* nisten peptidien aminohapposekvenssin. Sekvenssi on so luille, jotka ovat A+, B+, se on, ne ekspressoivat sekä A- : 30 että B-antigeeneja.

··· «**'· SEQ ID numero 7 on antigeeniä E koodittava nukle- • · · iinihapposekvenssi.

i * · SEQ ID numero 8 on MAGE-l-molekyyliä koodittava nukleiinihapposekvenssi.

·;··· 35 SEQ ID numero 9 on MAGE-2-geeni.

····· • · 9 117555 t SEQ ID numero 10 on MAGE-21-geeni.

SEQ ID numero 11 on MAGE-3-cDNA.

SEQ ID numero 12 on MAGE-31-geeni.

SEQ ID numero 13 on MAGE-4-geeni.

5 SEQ ID numero 14 on MAGE-41-geeni. ’ SEQ ID numero 15 on MAGE-4-cDNA.

SEQ ID numero 16 on MAGE-5-cDNA.

SEQ ID numero 17 on genominen MAGE-51-DNA.

SEQ ID numero 18 on MAGE-6-cDNA.

10 SEQ ID numero 19 on genominen MAGE-7-DNA.

SEQ ID numero 20 on genominen MAGE-8-DNA.

SEQ ID numero 21 on genominen MAGE-9-DNA.

SEQ ID numero 22 on genominen MAGE-10-DNA.

SEQ ID numero 23 on genominen MAGE-11-DNA.

15 SEQ ID numero 24 on genominen smage-l-DNA.

SEQ ID numero 25 on genominen smage-II-DNA.

Suositeltavien suoritustapojen yksityiskohtainen kuvaus

Monia erilaisia "MAGE"-geenejä on tunnistettu, ku- 20 ten voidaan nähdä sekvensseistä, jotka seuraavat patent- tihakemusta. Seuraavissa esimerkeissä kuvattuja menetelmiä käytettiin näiden geenien ja cDNA-sekvenssien eristykseen.

·*. "MAGE" tässä käytettynä viittaa nukleiinihapposek- * ·· | . venssiin, joka eristettiin ihmisen soluista. Akronyymiä • · ' . . 25 "smage" käytetään hiiren alkuperää olevista sekvensseistä.

;**t* Kun tässä keskustellaan, että "TRAP-molekyylit" tai • · · • ·* "TRA-molekyylit" ovat spesifisiä kasvaintyypille se tar- · · · · koittaa, että tutkimuksen kohteena oleva molekyyli liittyy siihen kasvaintyyppiin, vaikka se voi myös liittyä muihin : j’: 30 kasvaintyyppeihin.

·’**; Esimerkki 1 ···

Antigeeniä P815A koodittavan geenin tunnistamiseksi · · ja eristämiseksi käytettiin geenitransfektiota. Tämä lä- * » **;·* hestymistapa tarvitsee sekä geenin lähteen että vastaanot-

·;··· 35 tajasolulinjan. Erittäin transfektoitava solulinja Pl.HTR

• m! • · 117555 10 oli aloitusmateriaali vastaanottajaksi, mutta sitä ei voitu käyttää ilman lisäkäsittelyä, koska se sisältää "antigeenin A", joka on yksi tunnistetuista P815-kasvainanti-geeneista. Katso Van Pel et ai., Molecular Genetics 11: r 5 467 - 475 (1985). Näin ollen suoritettiin seulontakokeet sellaisten solulinjojen eristämiseksi, jotka eivät eks-pressoineet antigeeniä ja jotka kuitenkin sisälsivät halutut Pl.HTR-solun ominaisuudet.

Tämän suorittamiseksi Pl.HTR seulottiin CTL-solujen 10 kanssa, jotka olivat spesifisiä kullekin kasvainantigee-nille A, B, C ja D. Sellaiset CTL-solut ovat kuvanneet Uyttenhove et ai., J. Exp. Med. 157: 1 040 - 1 052 (1983).

Selektion suorittamiseksi 106 P1 .HTR-solua sekoitet- i 7 '* tiin 2 - 4 x 10 CTL-kloonin solun kanssa pyöreäpohjäisessä 15 putkessa 2 ml:ssa alustaa ja sentrifugoitiin kolme minuuttia 150 x g:llä. Kun oli pidetty neljä tuntia 37 °C:ssa, solut pestiin ja suspendoitiin uudelleen 10 ml:aan alus- f taa, kuten ovat kuvanneet Maryanski et ai., Eur. J. Immu- 1 nol. 12: 406 - 412 (1982). Lisätietoja OTL-testistä ja 20 seulontamenetelmästä yleisesti voidaan löytää julkaisuista

Boon et ai., J. Exp. Med. 152: 1184 - 1193 (1980) ja Mary- ti anski et ai., Eur. J. Immunol. 12: 406 - 412 (1982), joi- j*" den kuvaukset on liitetty viitteeksi.

• · · * Kun nämä selektiot suoritettiin, löydettiin solu- , / 25 linjamuunnos, joka ei ekspressoinut antigeeniä A eikä B.

* · · *** ; Lisäselektiot CTL-soluilla, jotka olivat spesifisiä anti- • *#» ί .* geenille C, antoivat sitten muunnoksen, jolta puuttui myös ♦ ·· V ' antigeeni C. Ole hyvä ja katso kuvio 2, jossa on yhteen veto näistä seulonnoista. Muunnos P0.HTR on negatiivinen : 30 antigeenien A, B ja C suhteen ja se valittiin sen vuoksi ·***. transfektiokokeisiin.

···

Solulinja P0.HTR on talletettu Budapestin sopimuk- • ♦ · *;!/ sen mukaisesti kokoelmaan Institute Pasteur Collection • » *···* Nationale De Cultures De Microorganismes, 28, Rue de Doc- 9 • ♦ ♦ · 117555 11 teur Roux, 75724 Pariisi, Ranska, ja sen koodinumero on I- ;k 1117.

Tämä metodologia on sovellettavissa muiden solulin-jojen aikaan saamiseksi, jotka ovat sellaisen solutyypin ; 5 muunnoksia, joka tavallisesti sisältää ainakin yhden neljästä tunnetusta P8l5-kasvainantigeenista, se on, antigeeneistä A, B, C ja D, jossa muunnokset eivät sisällä mitään antigeeneistä A, B ja C. Pl.HTR on mastosytoomasolulinja, näin ollen voidaan nähdä, että menetelmä mahdollistaa sel-10 laisten biologisesti puhtaiden mastosytoomasolulinjojen eristyksen, jotka eivät ekspressoi mitään P815-antigee-neista A, B ja C, mutta jotka ovat erittäin transfektoi- - tavia. Muita kasvaintyyppejä voidaan myös seuloa tällä tavalla haluttujen, biologisesti puhtaiden solulinjojen i ·· · · " i 15 aikaan saamiseksi. Tuloksena syntyneiden solulinjojen tulisi olla ainakin yhtä transfektoitavia vieraalla DNA:11a kuin Pl.HTR, ja ne tulisi selektoida niin, että ne eivät , ekspressoi spesifistä antigeeniä.

Esimerkki 2 20 Aiempi työ, jonka ovat julkaiseet DePlaen et ai.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2 274 - 2 278 (1988), jonka ^ työn kuvaus on liitetty tähän viitteeksi, on osoittanut kosmidikirjastotransfektion käytön tehokkuuden tum'-anti- • . geenej a koodittavien geenien talteenotossa.

···♦· 25 Valmistettiin Pl.HTR-solun selektiivinen plasmidi- • s * ' t/r- ϊ·ϊ ϊ DNA ja genominen DNA julkaisun Viölfel et ai., Immunogene- ·· · : *.· tics 26: 178 - 187 (1987) mukaisesti. Transfektiomenetelmä ; ··· V : oli sen mukainen, jonka ovat julkaisseet Corsaro et ai.,

Somatic Cell Molec. Genet. 7: 603 - 616 (1981), johon teh- : 30 tiin hiukan modifikaatioita. Lyhyesti, sekoitettiin 60 pg ··· solun DNA:ta ja 3 pg plasmidin pHMR272 DNA:ta, jonka plas- ,l% midin ovat kuvanneet Bernard et ai., Exp. Cell. Biol. 158: • · · 237 - 243 (1985). Tämä plasmidi antaa hygromysiiniresis- • ♦ *··.* tenssin vastaanottajasoluille ja sen vuoksi suo helpon *:·*: 35 tavan transfektanttien seulomiseksi. Sekoitettu DNA yhdis- ·····..

• · 117555 12 tettlin 940 μ1:η kanssa liuosta, joka oli 1 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA, ja 310 μ1:η kanssa 1 M CaCl2:ia.

Liuos lisättiin hitaasti jatkuvasti sekoittaen 1,25 ml:aan liuosta, joka oli 50 mM Hepes, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HP04, 5 joka oli säädetty pH 7,l:een NaOHtlla. Kalsiumfosfaatti-DNA-saostumien annettiin muodostua 30 - 45 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen 15 ryhmää PO.HTR-solu-ja, joissa oli 5 x 106 solua per ryhmä, sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 400 x g. Supernatantit poistettiin ja pel-10 letit suspendoitiin uudelleen suoraan alustaan, joka sisälsi DNA-saostumat. Tätä seosta inkuboitiin 20 minuuttia 37 °C:ssa, jonka jälkeen se lisättiin 80 cm2 kudosviljely- ;’· pulloon, joka sisälsi 22,5 ml DMEM-alustaa, johon oli li- t sätty 10 % naudan sikiön seerumia. 24 tunnin kuluttua | * 15 alusta vaihdettiin tuoreeseen. 48 tuntia transfektion jäi- ? keen solut kerättiin ja laskettiin. Transfektoidut solut selektoitiin massaviljelmässä käyttäen viljelyalustaa, 4 johon oli lisätty hygromysiini B:tä (350 pg/ml). Tämä kä- y sittely selektoi hygromysiiniresistentit solut.

20 Kullekin ryhmälle valmistettiin kaksi pulloa, jois- s ta kumpikin sisälsi 8 x 106 solua 40 ml:ssa alustaa. Trans- . fektanttien määrän arvioimiseksi 1 x 106 solua kustakin • * · ryhmästä maljattiin 5 ml:aan DMEM-alustaa, jossa oli 10 % • * • *[ naudan sikiön seerumia (FCS), 0,4 % baktoagaria ja 300 pg • e · · * 25 hygromysiini B:tä/ml. Sitten pesäkkeet laskettiin 12 vuo- • 'ΐ • · * i.: : rokautta myöhemmin. Suoritettiin kaksi toisistaan riippu- ·♦ ♦ : *.· matonta määritystä ja laskettiin keskiarvo. Tämä kerrot- * · · V · tiin viidellä vastaavassa ryhmässä olevien transfektantti- en määrän arvioimiseksi. Korjaus oli tehtävä P815-solujen : 30 kloonaustehokkuuden vuoksi, jonka tiedetään olevan noin • · · .***. 0,3.

• · • · · * Esimerkki 3 · · • » · *·' * Kahdeksan vuorokautta yllä olevassa esimerkissä 2 kuvatun transfektion jälkeen erotettiin antibioottiresis- * ....: 35 tentit transfektantit kuolleista soluista käyttäen tiheys- • · « · · • · 13 117555 sentrifugointia Ficoll-Paque:lla. Näitä soluja pidettiin yllä ei-selektiivisessä alustassa 1 tai 2 vuorokautta.

Solut maljättiin 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille (pyöreäpohjaiset) tiheytenä 30 solua/mikrotiitterikuoppa 5 200 pl:ssa viljelyalustaa. Valmistettiin 100 - 400 mikro- tiitterikuoppaa riippuen valmistettujen transfektanttien määrästä. Agarpesäketestit antoivat arviot 500 - 3 000.

Viiden vuorokauden kuluttua valmistettiin kuopat, jotka sisälsivät noin 6 x 104 solua, ja rinnakkaismaljat valmis-10 tettiin siirtämällä 1/10 kuopista mikrotiitterilevyille, : ' Ί joita sitten inkuboitiin 30 pC:ssa. Vuorokautta myöhemmin „ alkuperäiset maljat sentrifugoitiin, alusta poistettiin ja " kuhunkin kuoppaan lisättiin 750 CTL-solua, jotka olivat P8l5:n antigeeni A:ta vastaan olevia (CTL-P1:5), yhdessä 15 106 säteilytetyn syngeenisen syöttäjäpernasolun kanssa CTL- viljelyalustassa, joka sisälsi 40 U ihmisen rekombinantti-IL-2-proteiinia/ml, ja HAT-alustassa stimulaattorisolujen tappamiseksi. Kuusi vuorokautta myöhemmin maljat tutkittiin silmin sellaisten kuoppien tunnistamiseksi, joissa 20 CTL-solut olivat lisääntyneet. Kun maljat osoittivat lisääntyvien mikroviljelmien olemassaolon, kuopista siirret-tiin 100 μ1:η määrät toiselle maljalle, joka sisälsi 51Cr-j!*’ leimattuja PI.HTR-kohdesoluja (2 x 103 - 4 x 103 per kuop- * [ pa), ja kromin vapautuminen mitattiin neljän tunnin kulut- *···· 25 tua. Niitä rinnakkaisia mikroviljelmiä, jotka vastasivat • * · M · niitä, jotka osoittivat korkean CTL-aktiivisuuden, laajen- »» » ^ : .· nettiin ja ne kloonattiin rajoittavalla laimennuksella ; • · · ·,· · DMEM-alustassa, jossa oli 10 % FCS:ia. Viisi vuorokautta myöhemmin kerättiin noin 200 kloonia ja ne seulottiin : 30 CTL.P1:5-solulinjalla, joka on kuvattu yllä, silmin tar- * * * ;***. kasteltavalla lyysitestillä. Katso kuviosta IA näiden tu- • * * lokset.

• · · *·[ Näissä kokeissa kolme 15:stä transfektanttiryhmästä * · '··.* antoi muutaman positiivisen mikroviljelmän. Nämä mikrovil- ·;*·· 35 jelmät testattiin lyyttisen aktiivisuuden suhteen Pl.HTR- • · 117555 14 solua vastaan, kuten on kuvattu yllä. Useimmat mikrovil-jelmät, joissa lisääntymistä oli havaittu, osoittivat lyyttisen aktiivisuuden. Tämä aktiivisuus oli paljon taustaa korkeammalla, kuten on osoitettu kuviossa IB. Tässä f 5 kuviossa on yhteenveto tuloksista, joissa kaksi soluryhmää (ryhmät "5" ja "14"), 400 ja 300 mikrotiitterikuoppaa, ympättiin 30:11a hygromysiiniresistentillä transfektoitu-neella solulla. Mikroviljelmien amplifioimisen ja kahdentamisen jälkeen lisättiin anti-A CTL-P1:5. Kuusi vuoro-10 kautta myöhemmin testattiin lyyttinen aktiivisuus Pl.HTR-solua vastaan. Kuviossa kukin piste vastaa yksittäisen mikroviljelmän lyyttistä aktiivisuutta.

Rinnakkaismikroviljelmät, jotka vastasivat useita positiivisia kuoppia, jatkokloonattiin ja usemamman kuin 15 1 % jatkoklooneista havaittiin olevan lyysaantuneen anti- A CTL-solujen toimesta. Näin ollen kolme toisistaan riippumatonta transfektanttia, jotka ekspressoivat P815A-anti-geenia, saatiin 33 000 hygromysiiniresistentistä transfek- 1 tantista. Yhtä näistä linjoista, johon tästä lähtien vii-20 tataan nimellä P1A.T2, testattiin edelleen.

PlA.T2-solun relevantti antigeeniprofiili esitetään kuviossa 2, joka profiili on saatu sen tyyppisillä anti- * j»]* CTL-testeillä, jotka on kuvattu yllä.

• ♦♦ . Esimerkki 4 ·♦··· . 25 PlA.T2-solulla suoritetut CTL-testit osoittivat, • · · ·♦· · että se sisälsi antigeenin A ("P815A") ja sen vuoksi oli • · · • .* saanut geenin P1.HTR-solulta. Tätä varten tätä solulinjaa * · · * käytettiin antigeeniesiasteen geenin lähteenä seuraavissa kokeissa.

: 30 Aiempi työ on osoittanut, että tum"-antigeenejä koo- dittavat geenit voidaan saada talteen suoraan sellaisista • ♦ * y.,t transfektanteista, jotka on saatu kosmidikirjastosta. Kat- .

so DePlaen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2 274 - *···* 2 278 (1988). Tätä menetelmää käytettiin P815-geenin saa- i ·;··· 35 miseksi.

·*··· • · 15 " 117555

PlA.T2-solun koko genomin DNA digestoitiin osittain Sau 3A1 -restriktioendonukleaasilla ja fraktioitiin NaCl-tiheysgradienttiultrasentrifugaatiolla 35 - 50 kiloemäksen ? DNA-fragmenttien rikastamiseksi seuraten menetelmää, jonka 5 ovat kuvanneet Grosveld et ai., Gene 10: 6 715 - 6 732 (1982). Nämä fragmentit ligoitiin kosmidin C2RB käsivarsiin, kuten ovat kuvanneet Bates et ai., Gene 26: 137 -146 (1983), jonka kuvaus on liitetty viitteeksi. Nämä kos-midikäsivarret on saatu katkaisemalla Smal-entsyymillä ja 10 käsittelemällä naudan suolen fosfataasilla, jonka jälkeen digestoitiin BamHI-entsyymillä. Ligoitu DNA pakattiin lambda-faagin komponentteihin ja titrattiin E coli ED 8767 -kannassa seuraten menetelmää, jonka ovat kuvanneett Gros- 1 veld et ai., yllä. Saatiin noin 9 x 105 ampisilliiniresis- 1 15 tenttiä pesäkettä per mikrogramma DNA-inserttiä.

Kosmidiryhmät amplifioitiin sekoittamalla 30 000 toisistaan riippumatonta kosmidia 2 ml:aan ED 8767 -kantaa 10 mM MgCl2-liuoksessa, inkuboimalla 20 minuuttia 37 °C:ssa, laimentamalla 20 ml:11a Luria-Bertani-alustaa 20 ("LB"), jonka jälkeen inkuboitiin yksi tunti. Tämä suspen sio titrattiin ja sitä käytettiin ympättäessä yksi litra LB-alustaa, jossa oli ampisilliinia (50 pg/ml). Kun bak- » teerikonsentraatio oli 2 x 10® solua/ml (OD600 = 0,8), jää- • [ dytettiin 10 ml erä ja viljelmään lisättiin 200 pg kloram- • •Ml 25 fenikolia/ml yli yön inkubointia varten. Kokonaiskosmidi- • · • · · M : DNA eristettiin alkalisella lyysimenetelmällä ja puhdis-

M I

: 1.· tettiin CsCl-gradientissa.

V · Näissä kokeissa valmistettiin 650 000 kosmidin kir jasto. Amplifikaatiomenetelrnässä käytettiin 21 noin 30 000 ; ;1; 30 kosmidin ryhmää.

• · ·

Esimerkki 5 • · Käyttäen 21 kosmidiryhmää, joihin viitattiin yllä • · *^1 (60 pg), ja 4 pg:aa plasmidia pHMR272, joka on kuvattu *·..1 yllä, käytettiin transfektioisäntinä PO.HTR-solujen ryh- • · 1· ....: 35 miä, jotka sisälsivät 5 x 106 solua. Transfektio suoritet- i Φ1 · · '16 117555 tiin samalla tavalla kuin on kuvattu edellä olevissa esimerkeissä. Keskimäärin 3 000 transfektanttia per ryhmä testattiin antigeenin läsnäolon suhteen käyttäen jälleen CTL-testejä, kuten on kuvattu. Yksi kosmidiryhmä antoi li 5 toistuvasti positiivisia transfektantteja frekvenssillä, " joka oli noin 1/5 000 lääkeresistenttiä transfektanttia. Transfektantit, kuten oli PlA.T2-solun tapauksessa, osoittivat myös molempien antigeenien A ja B ekspression. Transfektantin P1A.TC3.1 ekspressiokuvio on esitetty kuvi-10 ossa 2.

Esimerkki 6

Kuten yllä olevassa esimerkissä 5 on osoitettu, eristettiin kolme toisistaan riippumatonta kosmidilla transfektoitua solua, jotka sisälsivät P815A-antigeenin. .( 15 Näiden transfektanttien DNA eristettiin ja pakattiin suoraan lambda-faagiuutteisiin seuraten menetelmää, jonka ovat kuvanneet DePlaen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2 274 - 2 278 (1988). Tuloksena syntynyt tuote tiirattiin E. coli ED 8767 -kannassa ampisilliiniselektiolla, 20 kuten esimerkissä 5. Samalla tavalla kosmidit amplifioi- tiin ja transfektoitiin esimerkin 5 mukaisesti käyttäen jälleen PO.HTR-solua.

tt“ Havaittiin korkeat transfektiofrekvenssit, kuten on « · ' • ·· * . kuvattu seuraavassa taulukossa 1: «···· ’ * 25 • ϊ.: : Taulukko 1 * · t * * * ' ! .* Antigeenin P815A ekspression siirto suoralla pak- ··» : kauksella saaduilla kosmideilla

Kosmidikirjasolla Kosmidien määrä, P815A-anti-. ,·, 30 saatu transfek- kun pakattiin geeniä eks- **·*' tantti suoraan 0,5 pg pressoinen :***» DNA: ta transfektant- *1* tien määrä/ HMBr-transfek- 35 tenttien määrä TC3.1 32 87/192 *:·♦:* TC3.2 32 000 49/384 | TC3.3 44 25/72 17 " 117555

Kosmidit analysoitiin restriktioentsyymeillä ja havaittiin, että suoraan pakattu transfektantti P1A.TC3.1 sisälsi 32 kosmidia, joista 7 oli erilaisia. Kukin näistä i, $\ seitsemästä kosmidista transfektoitiin PO.HTR-soluun sa- s 5 maila tavalla kuin on kuvattu yllä Ja jälleen, seuraten yllä kuvattuja menetelmiä, transfektantit tutkittiin P815A-antigeenin läsnäolon suhteen. Neljä kosmiditransfek-tanteista osoitti F815A-antigeenin läsnäolon ja, kuten kaikissa tässä kuvatuissa kokeissa, P815B ekspressoitui 10 samalla.

Neljästä kosmidista, jotka osoittivat kahden antigeenin läsnäolon, kosmidi CIA.3.1 oli ainoastaan 16,7 kiloemäksen pituinen ja se valittiin lisäanalyyseihin, kuten on kuvattu jäljempänä. i 15 Kosmidi ClA.3.1 altistettiin restriktioendonukle- aasianalyysille muodostaen kuviossa 3 esitetty kartta.

Kaikki EcoRI-fragmentit transfektoitiin käyttäen .¾ jälleen yllä kuvattuja menetelmiä ja ainoastaan 7,4 kilo- v\ emäksen pituinen fragmentti tuotti sellaisen transfektan-20 tin, jonka anti-A CTL-solut pystyivät lyysaamaan. Saman laiset kokeet suoritettiin Pstl-fragmenteilla ja ainoas-taan 4,1 kiloemäksen fragmentti, joka oli täydellisesti !“* 7,4 kiloemäksen EcoRI-fragmentin sisällä, tuotti lyysaavat • *· * . transfektantit.

·····> 25 Tämä fragmentti (se on, 4,1 kiloemäksen pituinen • · * *·: ί PstI - fragmentti) digestoitiin Smal-entsyymillä saaden 2,3 ·· · : .* kiloemäksen pituinen fragmentti, joka myös tuotti isäntä- • · « V · solut, jotka sisälsivät antigeenit A ja B, transfektion jälkeen. Lopuksi, 900 emäksen pituinen fragmentti, joka : 30 oli aikaan saatu Smai/Xbal-entsyymeillä, myöskin siirsi ·*» ;***. näiden kahden antigeenin esiasteiden ekspression, se on, « · « transfektoitu isäntäsolu sisälsi sekä antigeenin A että • « · antigeenin B.

• · • · *·· • · · « · ·*♦*· • · 117555 18

Esimerkki 7

Yllä kuvattua 900 emäksen pituista fragmenttia käytettiin koettimena P815A-geenin ekspression tunnistamiseksi emosolulinjassa Pl.HTR. Tämän suorittamiseksi solun v 5 kokonais-RNA eristettiin ensin käyttäen guanidiini-isotio- syanaattimenetelmää, jonka ovat kuvanneet Davis et ai., -

Basic Methods In Molecular Biology (Elsevier Science Publishing Co., New York)(1986). Sama viite oli sen menetelmän lähteenä, jota käytettiin eristettäessä ja puhdistet-10 taessa polyA1 mRNA käyttäen oligodT-selluloosapylväskroma-tografiaa.

Sitten näytteet altistettiin Northern blot -analyysille. RNA-näytteet fraktioitiin 1 % agaroosigeeleissä, jotka sisälsivät 0,66 M formaldehydiä. Geelejä käsiteltiin f 15 10 x SSC -liuoksella (SSC: 0,15 M NaCl, 0,015 M natrium- sitraatti, pH 7,0) 30 minuutin ajan ennen kuin ne siirrettiin yli yön nitroselluloosamembraaneille. Näitä membraa- neja kuumennettiin kaksi tuntia 80 °C:ssa, jonka jälkeen membraaneja esihybridisoitiin 15 minuuttia 60 °C:ssa liuo-20 ksessa, joka sisälsi 10 % dekstraanisulfaattia, 1 % SDS:ää ja 1 M NaCl:ia. Sitten hybridisaatio suoritettiin käyttäen denaturoitua koetinta (900 emäksen fragmentti) yhdessä * lohen sperman DNA:n kanssa, jonka konsentraatio oli « · " 100 yg/ml.

117555 19 kaksi kertaa huoneenlämpötilassa 2 x SSC-liuoksella ja kahdesti 60 °C:ssa 2 x SSC-liuoksella, johon oli lisätty 1 % SDS:ää. ΐ

Edellä olevat kokeet rajasivat sen DNA:n, joka eks-5 pressoi P815A-antigeenin esiastetta, riittävästi niin, *

että se voitiin sekvensoida käyttäen hyvin tunnettua San-gerin dideoksi-ketjuterminaatio-menetelmää. Tämä suoritettiin muodostetuilla klooneilla käyttäen erilaisia restrik-tioendonukleaaseja ja käyttäen spesifistä aloitusta syn-10 teettisillä oligonukleotidialukkeilla. Geenin eksonien I

tulokset on kuvattu sekvenssissä, jonka numero on 4. .·'

Esimerkki 8

Yllä kuvattu Northern-analyysi antoi ehdottaa, että cDNA:n 5'-pää puuttui. Tämän sekvenssin saamiseksi valmis- :¾ 15 tettiin P1.HTR-solusta cDNA käyttäen aluketta, joka vas- tasi kohtaa 320 - 303. Sitten sekvenssi amplifioitiin polymeraasiketjureaktiolla käyttäen 3*-aluketta, joka vas- -· tasi kohtaa 286 - 266, ja 5’-aluketta, jonka ovat kuvanneet Frohman et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 20 8 998 - 9 002 (1988). Southern blot -analyysissä löydet tiin odotetun kokoinen rintama (270 emästä), joka hybridi-soitui yllä kuvattuun 900 emäsparin pituiseen Smal/Xbal- * I*“ fragmenttiin. Sen jälkeen, kun oli kloonattu ml3tg 130 * · ' *| lambda tg 131 -vektoriin, pieni 270 emäsparin fragmentti ·· « · « 25 sekvensoitiin. Sekvenssi on esitetty sekvenssissä, jonka i numero on 1, • ’,· Esimerkki 9 ' [ ϊ.ί ί Sen jälkeen, kun esimerkeissä 7 ja 8 ja sekvenssis sä numero 4 kuvatut sekvenssit oli saatu, sekvensoitiin : 30 CIA.3.1-kosmidin 5,7 kiloemäksen alue. Tämän fragmentin ·· * .***. tiedettiin sisältävän 900 emäksen fragmentin, joka eksp- • · · ressoi P815A-antigeenia transfektanteissa. Tämä koe salli • * t **| * intronien ja eksonien rajauksen, koska kosmidi on genomis- s ·...· ta alkuperää.

• Λ • ,'"1· * ♦ ··« • · «···· • · 117555 20

Geenin hahmoteltu rakenne on esitetty kuviossa 5.

Yhdessä sekvenssin numero 4 kanssa nämä tulokset osoittavat, että antigeenin esiasteen geeni, jota kutsutaan ni- . ΐ*· mellä "PIA" tämän jälkeen, on noin 5 kiloemäksen pituinen * 5 ja sisältää 3 eksonia. Avoin lukuraami 224 aminohapon pituiselle proteiinille alkaa eksonista 1 päättyen eksoniin 2. 900 emäsparin pituinen fragmentti, joka siirtää antigeenien A ja B esiasteiden ekspression, sisältää ainoastaan eksonin 1. Promoottorialue sisältää CAAT-alueen, ku-10 ten on osoitettu sekvenssissä numero 1, ja tehostajasek- venssin. Tämä jälkimmäinen ominaisuus on havaittu useimpi- i en MHC luokan I -geenien promoottoreissa, kuten ovat ku- i vanneet Geraghty et ai., J. Exp. Med. 171: 1 - 18 (1990);

Kimura et ai., Cell 44: 261 - 272 (1986). \ i 15 Suoritettiin homologiahaku tietokoneella käyttäen FASTA-ohjelmaa K-triple-parametreillä 3 ja 6, kuten ovat ehdottaneet Lipman et ai.. Science 227: 1 435 - 1 441 (1985), ja käyttäen Genbank-tietokantaa, julkaisua 65 (lokakuu 1990). Mitään homologiaa ei löydetty paitsi 95 20 emäksen pituisella alueella, joka vastaa osaa eksonin 1 koodittamasta happamasta alueesta (kohta 524 - 618), joka on samantapainen niiden sekvenssien kanssa, jotka koodit- * !*** tavat hiiren nukleoproteiinin N038/B23 happamia alueita, • * • ** kuten ovat kuvanneet Bourbon et ai.. Mol. Biol. 200: 627 - 25 638 (1988), ja Schmidt-Zachmann et ai., Chromosoma 96: • · : 417 - 426 (1988). 65 emästä 95 emäksestä olivat identti- ·· · • V siä. Sen testaamiseksi, olivatko nämä homologiat syynä Λ • · · ϊ4ί : ristihybridlsaatioon, suoritettiin kokeet käyttäen hiiren pernan cDNA-kirjastoa, joka seulottiin 900 emäksen pitui- ; 30 sella fragmentilla. Havaittiin cDNA-kloonit, jotka vasta- * * · sivat läheisesti ristihybridisoituvien rintamien kokoja.

• · · Nämä sekvensoitiin osittain ja löydettiin 2,6 kiloemäksen * · · '·* * pituinen cDNA, joka vastasi tarkalleen julkaistua hiiren • * * :...· nukleoliinin cDNA-sekvenssiä samalla, kun 1,5 kiloemäksen ··.·$ 35 pituinen cDNA vastasi hiiren nukleoproteiinia N038/B23.

····«.

• · . 21 117555

Geenin, johon viitataan tämän jälkeen nimellä "PIA", nukleotidisekvenssin analyysi antaa olettaa, että sen koodittaman tuotteen molekyylipaino on 25 kilodalto-nia. Sekvenssin numero 4 analyysi osoittaa mahdollisen ΐ 5 tumasignaalin jäännöksissä 5-9 (Dingwall et ai., Ann.

Rev. Cell Biol. 2: 367 - 390 (1986)) kuin myös suuren happaman domeenin kohdassa 83 - 118. Kuten yllä on osoitettu, tämä sisältää PlA-geenin ja kahden nukleoproteiinin välisen homologia-alueen. Mahdollinen fosforylaatiokohta voi-10 daan löytää kohdassa 125 (seriini). Myöskin toinen hapan domeeni löytyy läheltä C-päätä 14 glutamaattijäännöksen yhtenäisenä alueena. Samanlaisen C-pään rakenteen ovat löytäneet Kessel et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: r 5 306 - 5 310 (1987) hiiren homeodomeeniproteiinista, joka 15 sijaitsee tumassa.

Tutkimuksissa, joissa verrattiin PlA-geenin sekvenssiä P91A-, 35B- ja P198-sekvensseihin, mitään saman- ''4' kaltaisuuksia ei löydetty, joka osoittaa, että PIA on viite eri geenien ja antigeenien muodostamasta ryhmästä.

20 Esimerkki 10

Kun oli olemassa PlA-koetin ja sekvenssi, suoritet- Ϊ tiin tutkimukset sen määrittämikseksi, oliko normaalissa kudoksessa oleva geeni identtinen kasvaimen ekspressoimaan * . geeniin verrattuna. Tämän suorittamiseksi valmistettiin ··«·· 25 faagikirjastot käyttäen lambda zapll 10 -vektoria ja hii- • * · “·* ί ren DBA2-munuaissolujen genomista DNA:ta. PlA-geeniä käy- .* *.* tettiin koettimena. Hybridisaatio-olosuhteet olivat, kuten • · · V · yllä on kuvattu, ja löydettiin hybridisoituva klooni.

Klooni sisälsi PlA-geenin eksonit 1 ja 2 ja vastasi kohtaa : 30 0,7 - 3,8 kuviossa 5. Tämän sekvenssin sijainnin määrityk- * * * .**·. sen jälkeen suoritettiin PCR-amplifikaatio sen sekvenssin • · · saamiseksi, joka vastaa kuvion 5 kohtaa 3,8-4,5.

* · · ‘ Suoritettiin sekvenssianalyysi eikä mitään eroja • · *···* löydetty normaalin munuaisen geenin ja PlA-geenin, joka ·;··· 35 saatiin P815-kasvainsoluista, välillä.

• * « · · • · 117555 22

Lisäkokeissa DBA/2-mtinuaissoluissa oleva geeni siirrettiin PO.HTR-soluun, kuten yllä on kuvattu. Nämä kokeet, jotka on esitetty kuvan muodossa kuviossa 7 osoittivat, että antigeenit A ja B ekspressoitulvat yhtä tehok- j.

5 kaasti normaalista munuaisesta eristetyllä munuaisen geenillä kuin normaaleista munuaissoluista eristetyllä PIA- „ geenillä. Nämä kokeet johtivat siihen päätelmään, että kasvaimen hyijintäantigeenin esiastetta koodittava geeni on geeni, joka ei johdu mutaatiosta; mieluummin on ilmeis- 10 tä, että geeni on sama kuin on läsnä normaaleissa soluis- .;* sa, mutta se ei ekspressoidu niissä. Tämän löydön seuraamukset ovat tärkeitä ja niistä on keskusteltu jäljempänä.

Tutkimuksissa, joita ei ole käsitelty tässä laajemmin havaittiin, että geenin muunnokset olivat saatavissa.

15 Jotkin solut olivat tyyppiä "P1A'B+" mieluummin kuin normaaleita "PIA" tyyppejä. Ainoa ero näiden välillä on pis-temutaatio eksonissa 1, jossa 18. tripletti koodittaa muunnoksessa Ala:ia Vai:n sijasta.

Esimerkki 11 20 Suoritettiin lisäkokeita muilla solutyypeillä. Seu raten menetelmiä, jotka on kuvattu yllä Northern blot #·. -hybridisaatioita varten, normaalin maksan ja pernan solu- !**’ jen RNA testattiin sen määrittämiseksi, voidaanko PlA-gee- * ] nin transkripti löytää. Northern blot -tulokset on esitet- ··#·*! 25 ty kuviossa 4 ja, kuten voidaan nähdä, ei löydetä mitään * » · ί·ί : todistetta ekspressiosta.

• · · .

J *,· Hiiren P815-solulinja, josta PIA eristettiin, on • · · V ! mastosytooma. Sen vuoksi tutkittiin syöttösolulinjoja sen määrittämiseksi, ekspressoivatko ne geeniä. Syöttösolulin- : 30 ja MC/9, jonka ovat kuvanneet Nabel et ai., Cell 23: 19 - ··· 28 (1981), ja luuytimestä peräisin olevien syöttösolujen • tt lyhytaikaiset viljelmät testattiin samalla tavalla kuin on • · · **| * kuvattu yllä (Northern blot -analyysi), mutta mitään • · *··.* transkriptia ei löydetty. Tästä eroten, kun Balb/C-peräi-

·;··· 35 nen IL-3-proteiinista riippuvainen solulinja L138.8A

* * 23 : 117555 (Hiiltner et ai., 3. Immunol. 142: 3 440 - 3 446 (1989)) testattiin, löydettiin vahva signaali. Syöttösolutyö on esitetty kuviossa 4.

Tiedetään, että sekä Balb/C- että DBA/2-hiiret si-5 sältävät H-2d-haplotyypin ja näin oli mahdollista testata herkkyys lyysille käyttäen yllä kuvattuja CTL-soluja. Kuvio 8 esittää nämä tulokset, jotka ehdottomasti todistavat, että anti-A- ja anti-B-CTL-solut lyysasivat solut vahvasti, kun taas anti-C- ja anti-D-linjat eivät lyysan-10 neet.

Lisätestejä suoritettiin muilla hiiren kasvainso-lulinjoilla, se on, teratokarsinoomasolulinjalla PCC4 ; (Boon et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 272 - 275 (1977) ja leukemioilla LEC ja WEH1-3B. Ekspressiota ei i 15 voitu havaita missään näissä näytteissä.

Esimerkki 12

PlA-antigeenin todellinen tarjonta MHC-molekyylien toimesta oli mielenkiintoista. Tämän testaamiseksi kosmidi CIA.3.1 transfektoitiin fibroblastisolulinjaan DAP, joka 20 sisältää fenotyypin H-2k. Solulinjat transfektoitiin geeneillä, jotka ekspressoivat yhtä antigeeneistä Kd, Dd ja Ld. Sen jälkeen, kun transfektio oli suoritettu sekä kosmi-dilla että MHC-geenillä, tutkittiin lyysiä jälleen CTL- • · • " solujen kanssa, kuten on kuvattu yllä. Nämä tutkimukset, • IM· * * 25 joista on yhteenveto taulukossa 2 osoittavat, että Ld vaa- • · : ditaan PlA-antigeenien A ja B tarjontaan.

·· · • · * • e···.· ··* • · · • · · a • · » • · · ···.

• · · • « • « • · « ··· • ♦ # * · · • · · * · • · ··· •••a·-• · ····· • · 117555 24

Taulukko 2

Antigeenien P815A ja P815B H-2-restriktio

Vastaanottajasolu* CTL-solujen toimesta lyysai- neiden kloonien määrä/HmBr-5 kloonien määrä*

CTL-anti-A CTL-anti-B

DAP (H-2k) 0/208 0/194 DAP+Kd 0/165 0/162 DAP+Dd 0/157 0/129 10 DAP+Ld 25/33 15/20 * Rosmidi CIA.3.1, joka sisältää koko PlA-geenin, transfektoitiin DAP-soluihin, jotka oli aiemmin transfek- 3 toitu H-2d luokan I -geeneillä, kuten on osoitettu.

* Toisistaan riippumattomat lääkeresistentit pesäk-15 keet testattiin anti-A- tai anti-B-CTL-solujen aiheuttaman lyysin suhteen silmin tarkasteltavassa testissä.

Havainto, että kasvaimen hyljintäantigeenin tarjonta voidaan liittää tiettyyn MHC-molekyyliin, varmistettiin 20 kokeissa ihmisen soluilla ja HLA-molekyyleillä, kuten on käsitelty laajemmin jäljempänä.

Esimerkki 13 ··· Käyttäen PlA-geenin sekvenssiä kuin myös siitä saa- • · · · JV tavaa aminohapposekvenssiä tunnistettiin antigeeniset pep- 25 tidit, jotka olivat A+ B+ (se on, ominaisia soluille, jotka • · • ^ ekspressoivat sekä A- että B-antigeeneja) ja ne, jotka • » · UV olivat A"B+. Peptidi on esitetty kuviossa 10. Kun tätä pep- *.,* tidiä annettiin PO.HTR-solunäytteille silloin, kun läsnä • · · *·* * oli sitä sisältäville soluille spesifiset CTL-solulinjat, 30 se johti PO.HTR-solujen lyysaukseen, joka antaa tukea nä-kemykselle, että geenin ekspressoimaan tuotteeseen perus- ♦ · · :...· tuvia peptidejä voidaan käyttää rokotteina.

Esimerkki 14

Ihmisen melanoomasolulinja, josta tästä lähtien • · V 35 käytetään nimeä MZ2-MEL, ei ole klonaalinen solulinja. Se **“· ekspressoi neljää stabiilia antigeeniä, jotka autologiset • IMi • » 25 117555 CTL-solut tunnistavat, jotka antigeenit tunnetaan nimillä "D, E, F ja A". Lisäksi, kahta muuta antigeeniä "B" ja "C" ekspressoidaan kasvaimen joissain alalinjoissa. Näille kuudelle antigeenille spesifiset CTL-kloonit ovat kuvan-5 neet Van den Eynde et ai., Int. J. Canc. 44: 634 - 640 (1989). Tunnistettujen MZ2-MEL-alakloonien joukkoon kuuluvat MEL.43, MEL3.0 ja MEL3.1 (Van den Eynde et ai., yllä).

Solulinja MEL3.1 ekspressoi antigeeniä E määritettynä CTL-tutkimuksilla, kuten on kuvattu yllä P815-muunnoksilie, 10 näin ollen se valittiin lähteeksi sekvensoitaessa se nuk- ^ leiinihappo, joka ekspressoi antigeenin esiastetta.

Eristettäessä asiaankuuluvaa nukleiinihapposekvens-siä kasvaimen hyljintäantigeenin esiasteelle, yllä kehitetyt menetelmät osoittivat, että tarvitaan sellainen vas-15 taanottajasolu, joka täyttää kaksi kriteeriä: (i) vastaan-ottajasolun ei pidä ekspressoida tutkittavaa TRAP-molekyy-liä normaaleissa olosuhteissa, ja (ii) sen täytyy ekspressoida asiaankuuluvaa luokan I HLA-molekyyliä. Vastaanotta-jasolulla täytyy myös olla korkea transfektiofrekvenssi, 20 se on, sen täytyy olla "hyvä" vastaanottaja.

Sellaisen solulinjan aikaan saamiseksi klonaalinen alalinja ME3.1 altistettiin toistuvalle selektiolle anti-JI*' E CTL 82/30 -solulinjalla, kuten ovat kuvanneet Van den * *, Eynde et ai., yllä. Toistuvat selektiosyklit johtivat ala- 25 kloonin MZ2-MEL-2.2 isc E‘ eristykseen. Tämä alaklooni on • * * ί·ί ϊ myös HPRT” (se on, herkkä HAT-alustalle: 10"4 M hypoksantii- *♦ * .* V ni, 3,8 x 10"7 aminopteriini, 1,6 x 10-5 M 2-deoksitymidii- V : ni). Alakloonia nimitetään tämän jälkeen nimellä "MEL-2.2" yksinkertaisuuden vuoksi.

: 30 Esimerkki 15 • · · :***· MEL3.0-solulinjan genominen DNA valmistettiin sen ··« mukaisesti, kuten ovat kuvanneet Wolf el et ai., Immunoge- • * · netics 26: 178 - 187 (1987), jonka kuvaus on liitetty • · ’···* viitteeksi. Plasmidi pSVtkneoB, jonka ovat kuvanneet Nico- •j—i 35 las et ai., Cold Spring Harb., Conf. Cell Prolif. 10: • μ • f··· • · • ] 117555 26 469 - 485 (1983), antaa resistenssin genetlslinllle, näin ollen sitä voidaan käyttää yhteistransfektion merkkinä, kuten tehtiin tässä kokeessa.

Seuraten menetelmää, joka on samankaltainen, mutta ; 5 ei identtinen sille, jonka ovat kuvanneet Corsao et ai.,

Somatic Cell Molec. Genet. 7: 603 - 616 (1981), yhteis- transfektoitiin koko genomin DNA ja plasmidi. Genominen DNA (60 pg) ja plasmidin DNA (6 pg) sekoitettiin 940

pl:aan liuosta, joka oli 1 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM

10 EDTA, jonka jälkeen lisättiin 310 pl 1 M CaCl2:ia. Tämä liuos lisättiin hitaasti, samalla jatkuvasti sekoittaen, 1,25 ml:aan 2 x HBS-liuosta (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HP04, jonka pH oli säädetty 7,l:een Na0H:lla).

Kalsiumfosfaatti-DNA-saostumien annettiin muodostua 30 - 15 45 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, jonka jälkeen ne laitettiin 80 cm2 kudosviljelypulloihin, joihin oli ympätty 24 tuntia aiemmin 3 x 106 MEL2.2-solua 22,5 ml:ssa melanoo- maviljelyalustaa (Dulbecco's Modified Eagle's -alusta), johon oli lisätty 10 % naudan sikiön seerumia. 24 tunnin 1 « 20 kuluttua alusta vaihdettiin tuoreeseen. 48 tuntia trans- s fektion jälkeen solut kerättiin ja ympättiin tiheyteen 4 x .:. 1Q6 solua per 80 cm2 pullo melanoomaviljelyalustassa, johon ·*** oli lisätty 2 mg genetisiiniä/ml. Genetisiini toimii se- • · · * , lektiomerkkinä.

, / 25 Esimerkki 16 • · · ··1 : 13 vuorokautta transfektion jälkeen laskettiin ge- • · 2 ‘ .1 netisiiniresistentit pesäkkeet, ne kerättiin ja niitä vil- • · · V2 jeltiin ei-selektiivisessä alustassa 2 tai 3 vuorokautta.

Sitten transfektoidut solut maljattiin 96-kuoppaisille 30 mikrotiitterilevyille tiheytenä 200 solua/kuoppa 200 :***; piissä viljelyalustaa niin, että läsnä oli 20 % naudan ··· sikiön seerumia (FCS) niin, että saatiin noin 30 kasvavaa • · · • · · pesäkettä per kuoppa. Mikroviljelmien määrä suunnattiin • · *·”1 redundanssin aikaan saamiseksi, se on niin, että jokainen ···«· • · · ♦ · · 2 • · 117555 27 toisistaan riippumaton transfektantti olisi edustettuna ainakin neljä kertaa.

10 vuorokauden kuluttua kuopat sisälsivät noin 6 x 104 solua. Nämä solut irrotettiin ja 1/3 kustakin mikrovil-5 jelmästä siirrettiin rinnakkaiselle levylle. 6 tunnin kuluttua, se on, uudelleen kiinnittymisen jälkeen, alusta poistettiin ja kuhunkin kuoppaan lisättiin 1 500 anti-E-CTL-solua (CTL 82/30) 100 pl:ssa CTL-viljelyalustaa, jossa oli 35 U IL-2-proteiinia/ml. Vuorokausi myöhemmin super-10 natantti (50 μΐ) kerättiin ja se tutkittiin TNF-konsent-raation suhteen johtuen syistä, jotka on kuvattu seuraa-vassa esimerkissä. >:

Esimerkki 17

Nisäkäsgenomin koko on 6 x 10® kiloemästä. Koska 15 kuhunkin lääkeresistenttiin transfektanttiin integroitu neen DNA:n keskimääräisen määrän odotettiin olevan noin 200 kiloemästä, täytyy tutkia vähintään 30 000 transfek-tanttia sen varmistamiseksi, onko antigeeni E transfektoi-tunut. Aiempi työ hiiren soluilla on osoittanut, että kun 20 käytettiin CTL-stimulaatiotestiä, voitiin tunnistaa sel laiset ryhmät, joissa ainoastaan 3 % soluista ekspressoi tutkittavaa antigeeniä. Tämä alentaa testien määrää ker- ***’ toimella 30. Samalla, kun yllä kuvattu anti-E-CTL-testi * · • sekoitetuissa E+/E'-soluissa oli hyödyllinen, se ei ollut ·····' 25 riittävä, koska johdonmukaisia tuloksia ei voitu saada. i • · Ά : Tuloksena suunniteltiin vaihtoehtoinen testi. CTL- • · · ; *.· solujen stimulaatiota tutkittiin kasvaimen nekroosi teki jän ί.ί J ("TNF" ) vapautumisella käyttäen hyvin tunnettuja menetel miä, joita ei tarvitse toistaa tässä. Kuten esimerkissä 15 ; ;*j 30 on kuvattu, 1 500 CTL 82/30-solua lisättiin per kuoppa • · · .*·*. transfektantteja. Nämä CTL-solut kerättiin kuusi vuoro- « « ^ kautta stimulaation jälkeen. Kuten yllä on osoitettu, kun • I « *·’ 1/3 kussakin kuopassa olleista soluista oli poistettu ja • · · :...: jäljelle jääneet 2/3 (4 x 104) olivat kiinnittyneet uudel- ...•j 35 leen, siihen lisättiin CTL-solut ja IL-2-proteiini. 50 μΐ ····· • · 28 117555 supernatanttia poistettiin 24 tuntia myöhemmin ja siirrettiin mikrotiitterilevylle, joka sisälsi 3 x 104 W13-solua (WEHl-164-klooni 13; Espevik et ai., J. Immunol. Meth. 95: 99 - 105 (1986)) 50 μΐ:ssa W13-viljelyalustaa (RPMI-1640, 5 johon oli lisätty L-arginiinia (116 mg/1), L-asparagiinia (36 mg/1), L-glutamiinia (216 mg/1) ja 10 % FCS:ia), johon oli lisätty 2 pg aktinomysiini D:tä, 37 ??? 8 % C02-ilma-kehässä. Solulinja W13 on hiiren fibrosarkoomasolulinja, joka on herkkä TNF-molekyylille. Kohdesolukontrolleihin 10 lisättiin RPMI-1640-alustassa olevia TNF-B-rekombinantti-proteiinin laimennoksia.

i'* W13-viljelmät arvioitiin 20 tunnin inkubaation Jäi- i keen ja kuolleiden solujen prosenttimäärä mitattiin käyttäen kolorimetrisen testin, jonka ovat kuvanneet Hansen et 15 ai., J. Immunol. Meth. 119: 203 - 210 (1989), sovellusta.

Tässä lisättiin 50 ml (3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidia konsentraationa 2,5 mg/ - ml PBS-liuoksessa, jonka jälkeen inkuboitiin kaksi tuntia 37 °C:ssa. Tummansiniset formatsaanikiteet liuotettiin 20 lisäämällä 100 μΐ lyysiliuosta (yksi tilavuus N,N-dimetyy- liformamidia sekoitettuna 37 eC:ssa kahteen tilavuuteen * vettä sisältäen 30 % (w/v) natriumdodekyylisulfaattia y.y pH:ssa 4,7, 1,6 % etikkahappoa ja 2,5 % 1 N HCl:oa). Levy- * *] jä inkuboitiin 37 °C:ssa yli yön ja OD-arvot mitattiin s····- 25 570 nm:ssa käyttäen 650 nm:ia kontrollina. Kuolleiden so- f • · · : lujen prosenttimäärä määritettiin kaavalla: -¾ • · · * · • « ··♦ • · · 100-(OD570-näytekuoppa 30 100 x 1-- OD570-kuoppa + alusta • · * • · • · 1 ··# * • * * • · · * t # ,··*. jonka ovat kuvanneet Espevik et ai., J. Immunol. Meth. 95: • · *** 35 99 - 105 (1986). Tulokset osoittivat, että jopa silloin kun E+/E'-solujen suhde oli niinkin matala kuin 1/45, • · 117555 29 havaittiin merkittävä TNF-proteiinin tuotanto, joka osoitti aktiivisten CTL-solujen läsnäolon. Tämä johti päätökseen testata lääkeresistentit transfektantit 30: n ryhmissä.

5 Esimerkki 18

Solut testattiin TNF-tuoton suhteen, kuten on keskusteltu yllä olevassa esimerkissä 17. Kaikkiaan 100 E"-solujen ryhmää (4 x 106 solua/ryhmä) testattiin transfekti-on jälkeen ja saatiin 7 χ 104 toisistaan riippumatonta ge-10 netisiiniresistenttiä transfektanttia niin, että keskiarvo oli 700 per ryhmä. Ainoastaan yksi transfektoituneiden - solujen ryhmä johti mikroviljelykseen, joka sai anti-E-antigeeni-CTL-kloonin 82/30 tuottamaan TNF-proteiinia. 300 testatusta kloonista 8 oli positiivisia. Sitten nämä kloo-15 nit testattiin anti-E-CTL-solujen aiheuttaman lyysin suhteen käyttäen standardia 51Cr-vapautustestiä, ja niiden havaittiin lyysaantuvan yhtä tehokkaasti kuin alkuperäinen E+-solulinja. Transfektantilla E.Tl, josta keskustellaan tässä, oli sama lyysikuvio kuin MEL2.2-solulinjalla anti-20 geenejä B, C, D ja F vastaan olevien CTL-solujen suhteen.

Se tosiasia, että ainoastaan yksi transfektantti .j. ' sisälsi antigeenin 70 000 genetisiiniresistentistä trans- ψ II’’ fektantista voi aluksi tuntua hyvin alhaiselta, mutta se * . ei ole sitä. Yllä kuvattu työ P815-antigeenille osoitti 25 keskimääräisen frekvenssin 1/13 000. Ihmisen DNA-vastaan- • » · ·*! · ottaja MEL2.2 tuntuu integroivan viisi kertaa huonommin ? ·· · : V DNA:ta kuin Pl.THR.

• · « V · Esimerkki 19

Kun transfektantti E.Tl löydettiin, analyysien täy-: 30 tyi vastata useisiin kysymyksiin sisältäen sen, johtuiko se solupopulaation E+-kontaminantista. Antigeenisisällön • « · analyysi, kuten yllä on kuvattu osoittaa, että E.Tl on B' • · * ja C aivan kuten vastaanottajasolu MEL2.2. Sen havaittiin *·;·' myös olevan HPRT" käyttäen standardeja selektiomenetelmiä.

• · · * · • · ····♦.-* * 3° 117555

Kaikki tässä kuvatussa käytetyt E*-solut olivat kuitenkin HPRT*: ia.

Oli myös mahdollista, että MEL2.2-solulinjan E+-re-vertantti oli E.Tl-kloonin lähteenä. Tämän testaamiseksi 5 käytettiin hyväksi sitä havaintoa, jonka ovat tehneet Perucho et ai., Cell 22: 309 - 317 (1980), että yhteis-transfektoidut sekvenssit tavallisesti integroituvat yhdessä yhteen kohtaan vastaanottajan genomissa. Jos antigeeni E transfektantissa aiheutuu yhteistransfektiosta 10 plasmidin pSVtkneoB kanssa, sekvenssien tulisi olla kytkettyjä ja antigeenin deleetio voisi myös deletoida vie- '*' ressä olevat pSVtkneoB-sekvenssit. Wölfel et ai., yllä, ovat osoittaneet tämän olevan totta. Jos normaalisti E'-solu transfektoidaan plasmidilla pSVtkneoB, sekvenssien , 15 tulisi olla kytkettyjä ja antigeenin deleetio voisi myös deletoida vieressä olevat pSVtkneoB-sekvenssit. Jos normaalisti E+-solu, joka on transfektoitu plasmidilla pSVtkneoB, on E.Tl, ei "yhteisdeleetiota" kuitenkaan pitäisi tapahtua. Tämän testaamiseksi transfektantti E.Tl altis-20 tettiin immunoselektiolle solulinjalla 82/30, kuten on > kuvattu yllä. Saatiin kaksi antigeenin hävittänyttä muun- . nosta, jotka olivat resistenttejä tämän CTL-solun aiheut- • · · **** tamalle lyysille. Kumpikaan näistä ei ollut menettänyt • • “ genetisiiniresistenssiä; Southern blot -analyysi osoitti 25 kuitenkin useiden neor-sekvenssien häviämisen muunnoksissa, * · : joka osoittaa läheisen kytkennän E-geenin ja neor-geenin * • * * *V välillä E.Tl-kloonissa, joka johtaa sihhen päätelmään, : ί’: että E.Tl oli transfektantti.

Esimerkki 20 . .·. 30 E+-alakloonia MZ2-MEL 4B käytettiin DNA:n lähteenä • · · .·*·. valmistettaessa kosmidikirjasto. Tämä lähes 700 000 kos- • · · #j* midin kirjasto transfektoitiin MZ2-MEL2.2-soluihin seura- • · · *' * ten kosmiditransfektiomenetelmiä, jotka on kuvattu yllä.

• · · *...· Pakkaamalla kosmiditransfektanttien DNA suoraan ....: 35 lambdafaagin komponentteihin on joskus mahdollista löytää ····· • · ' _,*· 31 117555 sellaiset kosmidit, jotka sisältävät tutkittavat sekvenssit. Tämä menetelmä ei onnistunut tässä, joten pelastimme transfektoidun sekvenssin ligoimalla transfektantin DNA:n ]· kosmidivektorin pTL6 sopiviin restriktiofragmentteihin. | 5 Tätä yritettiin kahdella transfektantilla ja se onnistui toisella niistä. Yksi kosmidi, jota nimitetään nimellä B3, saatiin talteen tästä kokeesta ja se altistettiin restrik-tioendonukleaasidigestiolle Xmal-entsyymillä, tai suuren 12 kiloemäksen transfektoidun Xmal-fragmentin BamHI-diges-10 tiolle. Fragmentit kloonattiin vektoriin pTZ 18R ja sitten transfektoitiin MEL2.2-soluihin. Jälleen TNF-proteiinin tuotto oli mitta, jolla onnistunut transfektio määritettiin. Kokeet johtivat sen geenisekvenssin määritykseen, :·;ΐ joka kykenee transfektoimaan antigeenin E 12 kiloemäksen 15 Xmal-fragmentissa, ja sitten 12 kiloemäksen fragmentin

BamHI-digeroidussa 2,4 kiloemäksen fragmentissa.

2,4 kiloemäksen fragmentti hybridisoituu MZ2-MEL- J

solulinjasta peräisin olevan ja potilaan MZ-2 T-solukloo-nista peräisin olevan 2,4 kiloemäksen fragmentin kanssa 20 määritettynä Southern blot -analyysillä (BamHI/Smal-diges- * toitu DNA). Rintama ei ole läsnä niissä MZ2-MEL-solujen muunnoksissa, joista E'-antigeeni on hävinnyt, kuten voi-daan nähdä kuviosta 12.

• · • E-antigeenin esiastegeenin sekvenssi on määritetty 25 ja se on esitetty tässä: • · · f · · ··♦ t ·· · • · · • ·

• · · S

• · · w • ' • · ♦ * ♦ · ··· • ♦ ♦ · ♦ ·· ♦ . . .. '.λ· • · · ♦ ·· • · · .

• · * # • · ♦ i ·«···' Λ.

• · , i • . H· • · 117555 32 I ie I ao I ae- i ec | *o ι «0 1 c&xrecJuw: ccxoccaka aautataas «ccctjtct basaasasas c: ¢: xcrocArsAG acts^ibats tcacacaot: cascscakc xccxmiagc acx&asaak 12;

- 131 CA063CT67& CTTOCGCTCT OCACCCTSAO 685CC6T6SA T7CCXC77CC TfrSAKXCCA ItC

9 au caxxsexaoc ΑβίΒΑΜοει TKrcroAtA cajtatccxc abstcacaga bcasakatc j<: 341 CACAWSTGT BCCAGSAGXG AATCTTT&vC CTftUrKAC ACCAAWJ2C CUCCTfrCSA 3CC SOI CAMACA2AT AGGArXCCAi AOABrCXMC CTCACCTCCC TACTE7SAI37 CCT8XA5AA7 It: »tl C0ACCTCT6C TMCCMCTS tACCCT&AST ACCCtCXCAt TXCCXCC77C AWTtrrCAG <20 421 CGSASAGGSC JUCCCA&ASG ASAWATTCe C7«A«52A CASAJiASIA CCW.SiAGAA <4 0 411 GA7CTG7AAG TAWSCXXXG TIA&A37CTC CAAW7TCAC TTCTCA6CTG AWCC7C7CA 24 C *41 CACACTCCCT CTCTCCCCAO eCCTGXOMX · CTTCAT7GCC CA5CTCC7&C CCACACTCCr toe *01 ÖCCTOCTBCC CT&ASSASAQ TCATCATCTC TC7T&A&CAG A&2A9tCX3C ACTKAA&CC ttO <fl T&A50AA3CC CXTfiAWCCC AACAAKAMC CCTeseCTM XSTBTGXKA »CIGCCACC "53: IQ 121 TCCTCC7CC7 rrCCTCTGC: CCTCSSCASS CTaSAMAOC X&CC&ACTK TfrMfCAASA 'll: in BATcertccc asactcstca omascctc: cecrtreea ctascatcaa rroarrcsA no • 41 CACAS8SAAC CCA9T&AM9 17CCA0CA3C CGTSAABAK A(H»>CCAA0 tACGTCTTGI »CC ' til atcstgbag? ccTTcnccs aocaitaatc acxaagaam töoiisa"; μττμτγτ: m; *ti erecTcsru aatatcsack cag»sa3cca ctcacaaak ca&aaaxgct &iacaotgtc 3 coo 3021 ATSAAAAATT ACAAOSACT5 TITtCCISAC AXCTICSSCA AAUSTCT&A OrCCHSCAS 1610 $ 1011 CXMXCTT7G CCATT&ACST GAAGSAASCA BACCCCACtS GCCACTCCXA »6TCCTTSIS 1145 1141 ACCTvCCTAO 0TCTC7CC7A Τ&ΑΤ«ΐ£Χβ CTM37&AIA AX’CA&AXCAT OCCSAASAZA 1200 3261 CSCrrCCTSA TAATTCTCCT 6G7CA7SA?7 6CAA7Ö4AA3 QC0OSU70C TCCTGAOSA3 124 0 2211 GXAATCmS A&3A0CT4A0 T6TBAT&3A3 ΒΤ0ΪΑΤ&Α7Θ AlAWSASCA CAOraCCOAT 1110 15 2321 CCOSACCCCA C&AAGCTGCT CACCCAABA? TX0GT3CA55 AAAAQXACCX OOABTASGSC 1310 3311 AGGTGCCWA CAOTOATCeC GCACS=UTG A3TTCCIG7S &i;rCCAA&0 OCSCICSCT5 14 49 1441 AAACCA&CTA TC7&AAA0TC CTT&ACrOATO ΤΟλΓίΑΑΚΠ CA07&SAA4A CliC&Crr:; 1100 2*01 TcrrcccATC ccxocorsA* oca&ctttga ba&akama a&asssabtc tcascatsas nit mi TT6CA0CSAA csccAsresi AcaesiArre ooscaotca ccttccabm ccccctccaj i*jo 1(21 CA&C7TCBCC »BKTCGTGT CACAT&AOeC CCAT7CTTCA CTCTSAASAC AWWTCA5T 3(10 ' " * mi btxctsasxa esAaatTici sx-tctaxtcg etacno» umAten xcncrc:» 1140 3341 »aano» caaatctttt τχττχΑΑβββ ατμττβαλχ baacttcasc atccaagttx 31:0 2101 ATSAATOASA CCA3TCACAC ASTTCT876T AXATAGTTXA AM3IAA&AG TCTTG7G7TJ 1140 21(1 XAXTCASAT? 0&SAAA7CCA ΤΤΓΙΑΤΤΤΤΟ KUnsKU XAATAASA&C ACTfi&AATAA 3(20 > 20 2021 D7AC77ASAA A7C7CAAAAA T6ASSAS7AA AA7AGAT&AG A7AAA&AAC7 AAASAAATXA 3*40 2»Il ASACA7AC7C AATTCITOCC mXASCTCA CTCXATTCTi XAAAA7T77X AAACAXAXA7 2040 3441 OCATACC7C2 ATTXCCXT6S CTTCTTTQAe AA7CSAACAC AAA77AAA7C T&AAXAAASA 2100 ΐ , 3101 ASKTXCCre TTCACTSOCT CTTnCTTCX CCATSCACXa AKATCTOCX ΤΤΤΤβΟλλΜ 21(0 *:* 31(1 cacraasTiA otaotooasa tocsaaocta aoccicactc atacccaccc axamstbct 2220 '**' 0231 ABAatCSAOS ASCTeCAGTC ACGXAAXCftA βΟΤββΟΑΑϋΑ TBTCCTCUA AOATSTASSa 2240 : ·,. 3311 ΑΑΑΑβΤβΑΟΑ 6Αβ0ββ70λβ eCTBTfiesSC fCCASffTBAS Αβ70ΒΧΆ3Α6 TCTCAAT«C 2140 * 3341 cxoAocxasG β£Ατητβ« cmeeoAAA ctsgaotx&c vrcxeeeeoA actoattsia 3400 3401 ATCAJCTiM OTdftATCC 2411 * 25 I 20 I 30 I 30 I 40 I SO | «0 i ·*♦ • · · ··· · -‘is ·· · ifi 1 >* Esimerkki 21 • · « i* *·* * Kun 2,4 kiloemäksen genominen fragmentti pii tun- ?{ “i nistettu, suoritettiin tutkimukset sen määrittämiseksi, ♦ 30 ekspressoiko "E+"-alalinja mitään homologista DNA:ta. Solu- linjaa MZ2-MEL· 3.0 käytettiin lähteenä ja cDNA-kirjasto .*·*. valmistettiin sen mRNA:sta käyttäen alalla tunnettuja me- • · · netelmiä. 2,4 kiloemäksen fragmenttia käytettiin koetti- • *1* mena ja noin 1,8 kiloemäksen pituinen mRNA tunnistettiin e ***** 35 homologiseksi Northern blot -analyysiä käyttäen. cDNAita t • · · · · • · 33 117555 seulomalla saatiin kloonit, jotka olivat lähes täydellisesti identtisiä osille 2,4 kiloemäksen fragmenttia. Näin j tunnistettiin kaksi eksonia. Ylimääräinen eksoni paikannettiin näiden ylävirtaan sekvensoimalla sellaiset kos-5 midin B3 alueet, jotka sijaitsivat 2,4 kiloemäksen BamHI-fragmentin edessä. Geeni ulottuu noin 4,5 kiloemäksen pituiselle alueelle, kuten on esitetty kuviossa 8. Trans-kriptoidun alueen alkukohta varmistettiin käyttäen PCR:ää cDNA:n 5'-päälle. Kolme eksonia sisältävät 65, 73 ja 1551 10 emäsparia. ATG sijaitsee eksonin 3 kohdassa 66, jota seuraa 828 emäsparin pituinen lukuraami.

Esimerkki 22

Sen määrittämiseksi, voisivatko 2,4 kiloemäksen fragmentin pienemmät alueet siirtää antigeenin E ekspres-15 sion, valmistettiin pienemmät palat, jotka vastasivat suurempaa geeniä, käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä ja ne siirrettiin E'-soluihin. Kuvio 8 esittää kolmen alueen ra- 4 jät.

Antigeeniekspression siirto tällä tavalla osoittaa, 20 että geeni koodittaa antigeenin esiastetta mieluummin kuin ;i sellaista proteiinia, joka aktivoi antigeenin.

. Esimerkki 23 tv· "** Yllä kuvatun cDNA:n hybridisaatio paljasti yllät- • · * ” tävästi kaksi erilaista, mutta läheistä sukua olevaa i 25 cDNA:ta. Nämä cDNA:t, kun ne testattiin, eivät siirtäneet • · · : antigeenin E ekspressiota, mutta ne sisältävät oleellisen • V homologian ensimmäiselle cDNA-alueelle. Kolme aluetta tun- • · · * ! tuvat osoittavan juuri tunnistettujen geenien ryhmän ole massaolon, joita kutsutaan nimellä "MAGE", joka tarkoittaa * 30 "melanooma-antigeeni". Kuviossa 9 "mage-1" ohjaa MZ2-solu-··♦ jen antigeenin ekspressiota. Kuviossa 9 on esitetty osa ·· kunkin geenin kolmannesta eksonista. Toinen ja kolmas sek- • · · *·* * venssi ovat läheisemmin sukua toisilleen kuin ensimmäisel- ·»· • * *··.* le (18,1 ja 18,9 % ero verrattuna ensimmäiseen; 12 % ver- t ....i 35 rattuna toisiinsa). Saaduista 9 cDNA-kloonista saatiin ···«· • · 117555 34 kolme kutakin tyyppiä, joka antaa ehdottaa, että ekspres-sio on samantasoinen. "MAGE" viittaa tästä lähtien mole-

: - J

kyylien ryhmään ja niitä koodittaviin nukleiinihappoihin.

U

Nämä nukleiinihapot sisältävät tietynasteisen homologian il 5 ja niitä ekspressoidaan kasvainsoluissa, joihin kuuluu useat ihmisen kasvainsolutyypit, kuin myös ihmisen kasvaimissa. Ryhmää nimitetään nimellä "MAGE", koska ensimmäiset jäsenet tunnistettiin ihmisen melanoomasoluissa. Kuten seuraavat kokeet kuitenkin osoittavat, MAGE-ryhmän jäsenet 10 eivät ole ollenkaan rajoittuneet melanoomakasvaimiin; mieluummin MAGE viittaa ryhmään kasvaimen hyijintäantigeenin esiasteita ja niitä koodittaviin nukleiinihapposekvenssei-hin. Niistä tuloksena syntyneitä antigeenejä nimitetään tässä nimellä "MAGE TRA-molekyylit" tai "melanooma-anti- * 15 geenin kasvaimen hyljintäantigeenit".

Esimerkki 24

Kokeet hiiren kasvaimilla ovat osoittaneet, että T-solujen tunnistamat uudet antigeenit voivat johtua pistein-utaatioista, jotka modifioivat aktiivisia geenejä alueel-20 la, joka koodittaa uutta antigeenistä peptidiä. Uudet an- Γ tigeenit voivat syntyä myös sellaisten geenien aktivoitu-t;4 misella, joita ei ekspressoida useimmissa normaalisoluis- sa. Tämän asian selvittämiseksi MZ2-E-antigeenin kohdalla • ·

»M

• , melanoomasoluissa läsnäolevaa mage-1-geeniä verrattiin 25 potilaan MZ2 normaalisoluissa olevaan vastaavaan geeniin.

... ^

: Fytohemagglutiniini-aktivoitujen veren lymfosyyttien DNA:n I

•» · : .* amplifikaatio polymeraasiketjureaktiolla (PCR) suoritet- • » · V : tiin käyttäen alukkeita, jotka ympäröivät 1 300 emäsparin aluetta, joka sisälsi ensimmäisen puoliskon 2,4 kiloemäk- : 30 sen fragmentista. PCR-tuote saatiin odotetusti, kun taas * · · mitään ei saatu E'-muunnoksen DNA:ta käyttäen. Tämän PCR- • · · tuotteen sekvenssi osoittautui identtiseksi sen geenin *·* sekvenssin kanssa, joka on E+-melanoomasoluissa. Lisäksi • · ’··.* havaittiin, että MZ2-E-antigeeni ekspressoitui sellaisissa ····· 35 soluissa, jotka oli transfektoitu kloonatulla PCR-tuot- ΐ t ", • · » · · " .

• · ' , 117555 35 teelle. Tämä tulos antaa ehdottaa, että normaalisti hiljaisen geenin aktivaatio on vastuussa kasvaimen hyljintä-antigeenin MZ2-E ilmestymisestä.

Esimerkki 25 5 Mage-1-geenin ekspression arvioimiseksi eri normaa leissa ja kasvainsoluissa hybridisoitiin Northern blot -membraanit koettimella, joka sisälsi suurimman osan kolmannesta eksonista. Päinvastoin kuin tulos, joka havaittiin ihmisen kasvainsolulinjalla MZ2-MEL 3.0, mitään rin-10 tamaa ei havaittu RNA:lla, joka eristettiin potilaan MZ2 CTL-kloonista ja saman potilaan fytohemagglutiniinilla i aktivoiduista veren lymfosyyteistä. Myös useat muiden yk- t silöiden normaalikudokset olivat negatiivisia (kuvio 10 ja kuvio 11). Testattiin 14 muiden potilaiden melanoomasolu-15 linjaa. 11 oli positiivisia sisältäen rintamat, jotka olivat voimakkuudeltaan vaihtelevia. Näiden viljeltyjen solu-linjojen lisäksi analysoitiin neljä melanoomakasvainkudos-näytettä. Kaksi näytettä, sisältäen potilaan MZ2 metastaa-sin, olivat positiivisia, joka poisti sen mahdollisuuden, 20 että geenin ekspressio olisi kudosviljelyartefakta. Testattiin muutamia muita kasvaimia, jotka olivat muita his-tologisia tyyppejä, sisältäen keuhkokasvaimet. Useimmat näistä kasvaimista olivat positiivisia (kuviot 10 ja 11).

* * Nämä tulokset osoittivat, että MAGE-geeniryhmää ekspres- • · · · · 25 soidaan monissa melanoomissa ja myös muissa kasvaimissa.

• · · *.·: t Ne eivät kuitenkaan antaneet mitään selvää osoitusta sii- ; ·· * .· ’.· tä, mitkä geeneistä mage-1, 2 tai 3 ekspressoituivat näis- • 4« V · sä soluissa, koska DNA-koettimet, jotka vastasivat näitä kolmea geeniä, ristihybridisoitulvat melkoisessa määrin.

• 30 Tämän analyysin muodostamiseksi spesifisemmäksi käytettiin * * * PCR-amplifikaatiota ja hybridisaatiota erittäin spesifi- # · · sillä oligonukleotidikoettimilla. Saatiin cDNA:t ja ne • · * **]e* amplifioitiin PCRrllä käyttäen oligonukleotidialukkeita, · *···* jotka vastasivat sellaisia eksonin 3 sekvenssejä, jotka "··; 35 olivat identtisiä tässä keskustelluille kolmelle MAGE-gee- • · · · « • * 117555 36 nille. Sitten PCR-tuotteet testattiin niiden kyvyn suhteen hybridisoitua kolmeen muuhun oligonukleotidiin, jotka sisälsivät täydellisen spesifiteetin yhdelle näistä kolmesta geenistä (kuvio 9). Kontrollikokeet, jotka suoritettiin ·* 5 laimentamalla melanooman MZ2-MEL 3.0 RNA negatiivisista soluista peräsin olevalla RNA:11a osoitti, että tässä käytetyissä olosuhteissa signaalin voimakkuus aleni suhteessa laimennukseen ja että positiiviset signaalit voitiin edelleen tunnistaa laimennoksella 1/300. Normaalisolut (lymfo-10 syytit), jotka testattiin PCRrllä, varmistettiin negatiivisiksi näiden kolmen MAGE-geenin ekspression suhteen, joka antoi sen vuoksi ehdottaa, että ekspressiotaso oli t pienempi kuin yksikolmassadasosa MZ2-melanoomasolulinjan ' vastaavasta (kuvio 11). Melanoomasolulinjapaneelin tulok-15 set osoittivat selvästi, että jotkin melanoomat ekspres-soivat MAGE-geenejä mage-1, 2 ja 3, kun taas jotkin eks-pressoivat ainoastaan geenejä mage-2 ja 3 (kuviot 11 ja 10). Jotkin muista kasvaimista ekspressoivat myös kaikkia ; kolmea geeniä, kun taas toiset ekspressoivat ainoastaan 20 geenejä mage-2 ja 3 tai ainoastaan geeniä mage-3. On mahdotonta muodollisesti poistaa sitä, että jotkin positiivi-set PCR-tulokset eivät heijasta yhden MAGE-geenin ekspres-!!*’ siota kolmesta tunnistetusta MAGE-geenistä vaan jonkin • «t • vielä tunnistamattoman läheisesti sukua olevan geenin eks- 25 pressiota, joka sisältää aluke- ja hybridisaatio-oligonuk- i| • · · ϊ.ϊ : leotidien sekvenssin. Voidaan päätellä, että MAGE-geeni- ·· * : *.· ryhmää ekspressoidaan suuressa ryhmässä erilaisia kasvai- • · · ϊ,ϊ ί mia ja että nämä geenit ovat hiljaisia tähän asti testa tuissa normaaleissa soluissa.

: 30 Esimerkki 26 • * · .*·*. Sellaisen sekvenssin, joka transfektoi korkealla tehokkuudella ja tehokkaasti ekspressoi TRAP-molekyyliä, ·, • * · *·[ * olemassaolo teki mahdolliseksi tutkia liittyvän pääasial- • · lisen histokompatibiliteettikompleksin (MHC) luokan I mo-*;··· 35 lekyyliä. Potilaan MZ2 luokan I spesifiteetit ovat HLA-A1, •••e * · 37 ϊ. 1 1 7555 Α29, Β37, Β44 ja C6. Neljän muun potilaan, joilla oli AI yhteistä MZ2-potilaan kanssa, melanoomat yhteistransfek-toitiin 2,4 kiloemäksen fragmentin ja plasmidin pSVtkneoB kanssa. Kolme niistä antoi neor-transfektantit, jotka sti-5 muloivat TNF-proteiinin vapautumista anti-E-CTL-kloonista 82/30, joka on CD8+ (kuvio 10). Yhtään E"-transfektanttia ei saatu neljällä muulla melanoomalla, joista jotkin sisälsivät A29:n, B44:n tai C6:n, kuten MZ2. Tämä antaa ehdottaa, että MZ2-E-antigeenia tarjoava molekyyli on HLA-10 Ai. Tämän varmistukseksi havaittiin, että HLA-Al-potilai- den kasvaimista peräisin olevasta kuudesta melanoomasolu- i linjasta kaksi stimuloi TNF-proteiinin vapautumista poti- f laan MZ2 anti-E-CTL-kloonista 82/30. Yksi näistä kasvain-solulinjoista, MI13442-MEL, oli myös erittäin herkkä näi- ^ 15 den anti-E-CTL-solujen aiheuttamalle lyysille. Nämä kaksi € melanoomaa olivat ne, jotka ekspressoivat mage-l-geeniä (kuvio 13). Kahdeksan melanoomaa sellaisista potilaista, i joiden HLA-haplotyypit eivät sisältäneet Al:stä, tutkittiin niiden herkkyyden suhteen lyysille ja niiden kyvyn 20 suhteen stimuloida TNF-proteiinin vapautumista CTL-soluis- i ta. Yhdenkään ei havaittu olevan positiivinen. Joidenkin ^ ihmisen anti-kasvain-CTL-solujen kyky lyysata allogeenisia I.’*’ kasvaimia, jotka sisältävät sopivan HLA-spesifiteetin ai- • · • “ kuperäisen kasvaimen kanssa, on julkaistu aiemmin (Darrow 25 et ai., J. Immunol. 142: 3329 (1989)). On melko mahdollis- f • · · -ti ί·: : ta, että geenien mage-2 ja 3 koodittamat antigeeniset pep- • · · : *.· tidit voidaan myös tarjota autologisille CTL-soluille HLA- -jj

• · · X

V ' Alin tai muiden luokan I molekyylien toimesta, erikoisesti niiden samanlaisten tulosten valossa, jotka on saatu hii- : 30 ren kasvaimilla, kuten on käsitelty laajemmin yllä.

* * * ·***. Esimerkki 27 • · • · «

Kuten yllä on osoitettu, MZ2-melanooma ekspressoi • · · antigeenejä F, D ja A' antigeenin E lisäksi. Sen jälkeen, * · '·;·* kun antigeeniä E koodittava nukleiinihapposekvenssi oli ·«···, • « • · «· · • · 117555 eristetty, samanlaiset kokeet suoritettiin antigeeniä F koodittavan nukleiinihapposekvenssin eristämiseksi.

Tämän suorittamiseksi MZ2-MEL2.2-solulinjan, joka on yllä kuvattu E"-solulinja, viljelmiä käsiteltiin anti-5 F-CTL-kloonilla 76/6 samalla tavalla kuin on kuvattu käsiteltäessä anti-E-CTL-klooneilla. Tämä johti sellaisen muunnoksen eristykseen, jolta puuttui F-antigeeni, joka sitten altistettiin useille selektiokierroksille. Tuloksena syntynyt solulinja "MZ2-MEL2.2.5" oli täysin resis-10 tentti anti-F-CTL-solujen aiheuttamalle lyysille, mutta silti osoittautui lyysaantuvan anti-D-CTL-soluilla. 'Ί Jälleen, seuraten antigeenin E esiasteen DNA:n i eristyksen menetelmiä, F"-muunnos transfektoitiin F+-solus-ta peräisin olevan genomisen DNA:n kanssa solulinjaan MZ2-15 MEL3.0. Kokeet antoivat 90 000 lääkeresistenttiä transfek- tanttia. Nämä testattiin MZ2-F:n ekspression suhteen käyttäen 30 solun ryhmiä TNF-tunnistustestissä, joka on käsi-telty laajemmin yllä. Yksi ryhmä stimuloi TNF-proteiinin ’ vapautumista anti-F-CTL-soluista ja se kloonattiin. Viiden 20 kloonin 145 kloonista havaittiin stimuloivan anti-F-CTL-soluja. Lyysitesti, joka myös tehtiin seuraten yllä kuvat-j tuja menetelmiä, vahvisti (i) antigeeniä F koodittavan **** geenin ekspression ja (ii) antigeenin F itsensä läsnäolon.

• 1 • ** Esimerkki 28 »·1 · 1 25 F1-solulinjojen tunnistuksen jälkeen niiden DNA:ta • · · · 5 ί.: : käytettiin solujen transfektoimiseen. Tämän suorittamisek- • V si valmistettiin F+-solulinjan MZ2-MEL.43 kosmidikirjasto • 1 · ’ ίφί J käyttäen jälleen yllä kuvattuja menetelmiä. Kirjasto jaet tiin 14:ään noin 50 000 kosmidin ryhmään ja kunkin ryhmän j 30 DNA transfektoitiin MZ2-MEL2.2.5-soluihin. Sitten trans-

Ml .**·. fektantit testattiin niiden kyvyn suhteen stimuloida TNF- • · 1 proteiinin vapautumista anti-F-CTL-kloonista 76/6. 14 kos- * · · **!/ midiryhmästä yksi tuotti kaksi toisistaan riippumatonta * · **··' transfektanttia, jotka ekspressoivat antigeeniä F; saanto • · · · · • t · ;>· 39 117555 oli kaksi positiivista 17 500 genitisiiniresistentistä transfektantista.

Esimerkki 29

Southern blot -analyysissä (kuvio 12) havaittu ku-5 vio ehdotti geeniryhmän olemassaolon. Tämän suorittamiseksi 2,4 kiloemäksen BamHI-fragmentti, joka siirsi antigeenin M22-E ekspression, leimattiin 32P:llä ja sitä käytettiin koettimena E*-kloonatun M22-MEL2.2-alakloonin BamHI-digestoidun DNA:n Southern blot -analyysissä. Hybridisaa-10 tio tehtiin olosuhteissa, jotka olivat 50 μΐ 3,5 x ς SSC:tä/cm2, 1 x Denhardt-liuosta, 25 mM natriumfosfaatti- v puskuria (pH 7,0), 0,5 % SDS:ää, 2 mM EDTAia, jossa oli 2,4 kiloemäksen koettimia, jotka oli leimattu [a32P]dCTP: 1-lä (2 - 3 000 Ci/mooli), määränä 3 x 106 cpm/ml. Hybridi- ~ 15 saatio suoritettiin 18 tuntia 65 °C:ssa. Tämän jälkeen membraanit pestiin 65 eC:ssa neljä kertaa liuoksella, joka oli 2 x SSC, 0,1 % SDS, yhden tunnin ajan kukin, ja lopuk- i si 30 minuuttia liuoksessa, joka oli 0,1 x SSC, 0,1 % SDS. Hybridisaation tunnistamiseksi membraaneille suoritettiin 20 autoradiografia käyttäen Kodak X-AR -filmiä ja herkkää

Kodak X-Omatic -vahvistuslevyä. 4 , Seuraavissa esimerkeissä aina, kun viitataan "hyb- • · · ··*· ridisaatioon", käytetyt ankaruusolosuhteet olivat saman- • · : laiset kuin yllä on kuvattu. "Ankarat olosuhteet" tässä ♦ ···*· _ * · 25 käytettynä viittaavat näin ollen edellämainittuihin olo- • · · ·:·£ · suhteisiin, jotka ovat alttiita rutiinille alalla tunne- ·· · : * : tulle modifikaatiolle.

• · ; r

Esimerkki 30

Mage-4:ää koodittava cDNA tunnistettiin Ihmisen y . 30 sarkoomasolulinjan LB23-SAR näytteestä. Tämän solulinjan ·♦· .*·♦. ei havaittu ekspressoivan geenejä mage-1, 2 tai 3, mutta • · solulinjan mRNA hybridisoitui mage-1:n 2,4 kiloemäksen *·** fragmenttiin. Tämän lisätutkimukseksi valmistettiin cDNA- ··· :...: kirjasto LB23-SAR-solui in jän kokonais-mRNA: sta, ja sitten * 35 se hybridisoitiin 2,4 kiloemäksen fragmenttiin. cDNA-sek- • · ...

117555 40 venssin havaittiin hybridisoituvan tähän koettimeen ja sitä nimitetään tästä lähtien nimellä mage-4.

Esimerkki 31

Suoritettiin kokeet käyttäen PHA-aktivoituja lym-5 fosyyttejä potilaasta "MZ2", jotka ovat yllä keskusteltu-

i I

jen "MZ"-solujen lähde. Oligonukleotidikoetin, joka osoitti homologiaa mage-l:n kanssa, mutta ei mage-2:n tai 3:n kanssa, hybridisoitiin kosmidikirjaston kanssa, joka kirjasto oli peräisin PHA-aktivoiduista soluista. Hybridisoi-10 tuvan BamHI-kosmidifragmentin koko oli kuitenkin 4,5 kilo-emästä, joka osoitti, että materiaali ei ollut mage-l:stä; kuitenkin, perustuen homologiaan mage 1 - 4:n kanssa, fragmenttia voidaan kutsua nimellä "mage 5". MAGE 5:n sekvenssi on esitetty sekvenssissä SEQ ID numero 16.

15 Esimerkki 32

Testattiin melanoomasolulinja lb-33-MEL. Solulinjan kokonais-mRNA:ta käytettiin cDNA:n valmistukseen, joka sitten amplifioitiin oligolla CH09: (ACTCAGCTCCTCCCAGATTT) ja oligolla CH010: (GAAGAGGAGGGGCCAAG). Nämä oligot vas-20 taavat eksonin 3 niitä alueita, jotka ovat yhteisiä aiemmin kuvatuille geeneille mage-1, 2 ja 3.

. Tämän suorittamiseksi 1 ug RNA:ta laimennettiin • · · r ^ **** 20 μ1:η kokonaistilavuudeksi käyttäen 2 pl:aa 10 x PCR- • ·

• “ puskuria, 2 pl:aa 10 mM dNTP:tä kutakin, 1,2 pl:aa 25 mM

25 MgCl2:ta, 1 pl:aa 80 mM CH09-liuosta, joka on kuvattu yllä, : 20 yksikköä RNasin-entsyymiä ja 200 yksikköä M-MLV-kään- • * · j '.· teiskopioijaentsyymiä. Tämän jälkeen inkuboitiin 40 mi- * • · · ϊ,ί I nuuttia 42 °C:ssa. Sen jälkeen suoritettiin PCR-amplifi-

kaatio käyttäen 8 pl:aa 10 x PCR-puskuria, 4,8 pl:aa 25 mM

: ;*; 30 MgCl2:ta, 1 pl:aa CH010:tä, 2,5 yksikköä Thermus acquaticus • * · .*·*. -polymeraasia ( "Taq" ) ja vettä niin, että kokonaistilavuus • · · * mlm oli 100 μΐ. Sitten amplifikaatio suoritettiin 30 syklillä • · · *·* * (1 minuutti 94 °C:ssa, 2 minuuttia 52 eC:ssa, 3 minuuttia • · · *...· 72 °C:ssa). Sitten 10 μΐ kutakin reaktiota fraktioitiin ....j 35 koon mukaan agaroosigeelissä, jonka jälkeen siirrettiin * * · 117555 41 nitroselluloosamembraanille. Tuotteen havaittiin hybridi-soituvan oligonukleotidikoettimen CH018 (TCTTGTATCCTGGAGT-CC) kanssa. Tämä koetin tunnisti mage 1 -geenin, mutta ei geenejä mage 2 tai 3. Tuote ei kuitenkaan hybridisoitunut 5 koettimeen SEQ 4 (TTGCCAAGATCTCAGGAA). Tämä koetin sitoutuu myös mage 1 -geeniin, mutta ei geeneihin mage 2 ja 3.

Tämä osoitti, että PCR-tuote sisälsi sekvenssin, joka erosi geeneistä mage 1, 2 ja 3. Tämän fragmentin sekvensointi osoitti myös erot verrattuna geeneihin mage 4 ja 5. Nämä 10 tulokset osoittavat sellaisen sekvenssin olemassaolon, joka eroaa aiemmin tunnistetuista geeneistä mage 1, 2, 3, 4 ja 5, ja se on nimetty geeniksi mage 6.

Esimerkki 33

Lisäkokeissa, joissa käytettiin kosmidikirjastoja 15 PHA-aktivoiduista MZ2-lymfosyyteistä, käytettiin 2,4 kilo-emäksen mage 1 -fragmenttia koettimena ja eristettiin komplementaarinen fragmentti. Tämä klooni ei kuitenkaan f sitoutunut geeneille mage 1, 2, 3 tai 4 spesifisiin oligo-nukleotideihin. Saatu sekvenssi osoittaa hiukan homologiaa 20 geenin mage 1 eksonin 3 kanssa ja se eroaa geeneistä mage 1-6. Sitä kutsutaan geeniksi mage 7 tämän jälkeen. Lisä- seulonnat antoivat geenit mage 8-11.

Esimerkki 34 • « • ·· .

* . TRAP-molekyylien kuin myös niistä peräisin olevien ·««·· 25 TRA-molekyylien käyttökelpoisuus valaistiin seuraavasti.

• · · : - “· ί Geenin mage 1 eksonin 3 osoitettiin siirtävän anti- ’ : *.· geenin E ekspression. Tuloksena päätettiin testata, voi- ··· , ·.· · täisiinkö tästä eksonista 3 peräisin olevia synteettisiä peptidejä käyttää herkkyyden aikaansaamiseksi anti-E-CTL- > : 30 soluille.

* · t .**·. Tämän suorittamiseksi, ja käyttäen standardeja me- ♦ · · netelmiä, normaalisti anti-E-CTL-soluille epäherkkiä solu- • * * *;| * ja inkuboitiin eksonista 3.1 peräisin olevien synteettis- • · *··»' ten peptidien kanssa. Käyttäen yllä P815A-antigeenilla ····· 35 kuvattuja CTL-lyysitestejä ja peptidin konsentraatiota 3 • * * ♦ · • · 117555 42 mM, peptidin Glu-Ala-Asp-Pro-Thr-Gly-His-Ser-Tyr havaittiin olevan paras. Testi osoitti 30 % lyysin, joka osoitti herkkyyden muodostumisen anti-E-CTL-soluille. *,

Esimerkki 35 5 Nukleiinihapposekvenssit, joihin viitataan nimellä

Msmage", eristettiin hiiren soluista. Käyttäen yllä kuvattuja menetelmiä, valmistettiin kosmidikirjasto normaalien DBA/2-munuaissolujen DNArsta käyttäen kosmidivektoria C2RB. Koettimena käytettiin geenin MAGE-1 2,4 kiloemäksen 10 BamHI-fragmenttia. DNA siirrettiin nailonfilttereille ja nämä pestiin 2 x SSC-liuoksessa 65 °C:ssa smage-materiaa-lin tunnistamiseksi.

Esimerkki 36

Lisäkudosnäytteitä testattiin MAGE-geenien läsnä-15 olon suhteen käyttäen yllä keskusteltuja menetelmiä. Jotkin näistä tuloksista on esitetty seuraavaksi.

Mitään MAGE-geenin ekspressiota ei ollut aivo- tai munuaiskasvainkudoksessa. Paksusuolen kasvainkudos sisälsi geenien MAGE 1, 2, 3 ja 4 ekspression, vaikka kaikki tes- 20 tatut kasvaimet eivät sisältäneet kaikkien MAGE-geenien ekspressiota. Tämä pitää paikkansa myös haiman kasvaimen .·. (MAGE 1), ei-piensolukeuhkosyövän (MAGE 1, 2, 3 ja 4), !!" eturauhasen kasvaimen (MAGE 1), sarkoomien (MAGE 1, 2, 3 • · · • . ja 4), rintakasvaimen (MAGE 1, 2 ja 3) ja kurkunpään kas- 25 vaimen (MAGE 1 ja 4) suhteen. r-.if, • · · /'..y· *·* * Edellä oleva kuvaus sisältäen esimerkit antaa monia 'i1 • · · : erittäin arvokkaita työvälineitä alan asiantuntijan kä- »·· : siin. Aluksi, esimerkit tunnistavat ja antavat menetelmät sellaisten nukleiinihappomolekyylien eristämiseksi, jotka : 30 koodattavat ihmisen kasvaimen hylj intäantigeenin esiastei- * · · j*”j ta kuin myös niille komplementaariset nukleiinihappomole- kyylit. Tiedetään, että dna esiintyy kaksijuosteisessa • · · muodossa ja että kumpikin kahdesta juosteesta on komple- • · *···* mentaarinen toisilleen. Nukleiinihappohybridisaatiomene- ·;··: 35 telmät ovat kehittyneet siihen pisteeseen, jossa alan asi- ·«··* • · 117555 43 antuntija voi eristää annetun DNA-juosteen komplementin, tai syntetisoida sen.

"Nukleiinihappomolekyyli" tässä käytettynä viittaa kaikkiin DNA- ja RNA-lajeihin, jotka sisältävät yllä kes-5 kustellut ominaisuudet. Genominen ja komplementaarinen DNA, tai "cDNA", molemmat koodittavat tiettyjä proteiineja ja kuten esimerkit, jotka on suunnattu MAGE-geenien koo-dittavien sekvenssien eristykseen osoittavat, tämä kuvaus opettaa alan asiantuntijalle, kuinka saada aikaan nämä 10 molemmat.

Samalla tavalla RNA-molekyylit, kuten mRNA, voidaan valmistaa. Jälleen, kun alan asiantuntijalla on koodittava sekvenssi käsillä, mRNA voidaan eristää tai syntetisoida.

Komplementaariset sekvenssit, jotka eivät koodita 15 TRAP-molekyyliä, kuten "antisense-DNA" tai mRNA, ovat käyttökelpoisia esim. hybridisoitaessa koodittavaa sekvenssiä kuin myös menetelmissä sen ekspression blokeeraa- i miseksi.

On myös selvää, että esimerkit esittävät biologi- 20 sesti puhtaiden solulinjaviljelmien tuoton, jotka solulin- jat on transfektoitu nukleiinihapposekvensseillä, jotka . koodittavat tai ekspressoivat TRAP-molekyylejä. Sellaisia '*** viljelmiä voidaan käyttää esim. kasvaimen hyljintäantigee- • * • nien lähteinä tai terapeuttisina aineina. Tästä keksinnön • * Φ · · * * 25 näkökohdasta on keskusteltu jäljempänä.

• · : Solut, jotka on transfektoitu TRAP-molekyyliä koo- • V dittavilla sekvensseillä, voidaan transfektoida myös muil- : la koodattavilla sekvensseillä. Esimerkit muista koodatta vista sekvensseistä sisältävät sytokiinigeenit, kuten in- ; ·*. 30 terleukiinit (esim. IL-2 tai IL-4) tai pääasiallisen his- • · · .*·. tokompatibiliteettikompleksin (MHC) tai ihmisen leukosyyt- • · · tiantigeenimolekyylit (HLA). Sytokiinigeenin transfektio * » · '·* * on arvokas, koska näiden ekspression odotetaan tehostavan • * · biologisesti puhtaan soluviljelmän terapeuttista tehok-• j..l 35 kuutta in vivo. Alalla tunnetaan hyvin terapiat, joissa *···· * · 117555 44 interleukiinitransfektantteja on annettu vastaanottajille syöpäsairauksien hoitamiseksi. Erikoisen suositeltavan suoritustavan mukaisesti solut transfektoidaan sekvensseillä, jotka koodattavat kutakin seuraavista: (i) TRAP-5 molekyyliä, (ii) HLA/MHC-molekyyliä ja (iii) sytokiiniä.

Transfektio MHC/HLA-molekyyliä koodittavalla sekvenssillä on toivottavaa, koska tietyt TRA-molekyylit voidaan ehkä valikoivasti tai spesifisesti tarjota ainoastaan tiettyjen MHC/HLA-molekyylien toimesta. Näin ollen, kun 10 vastaanottajasolu jo ekspressoi TRA-molekyylin tarjontaan liittyvää MHC/HLA-molekyyliä, lisätransfektio ei ehkä ole tarpeen, vaikka lisätransformaatiota voidaan käyttää antigeenin yliekspression aikaansaamiseksi. Toisaalta voi olla toivottavaa transfektoida toisella sekvenssillä silloin, 15 kun vastaanottajasolu ei normaalisti ekspressoi asiaankuuluvaa MHC/HLA-molekyyliä. On ymmärrettävä tietysti, että transfektio yhdellä lisäsekvenssillä ei poista lisätrans-fektiota muilla sekvensseillä.

Termi "biologisesti puhdas" tässä kuvatun solulin-20 jän yhteydessä käytettynä tarkoittaa yksinkertaisesti, että nämä ovat oleellisesti vapaita muista soluista. Tarkasti ottaen "solulinja" on määritelmän mukaan "biologi-sesti puhdas", mutta tämä esitys vahvistaa tämän täysin.

* * • "* Solujen transfektio edellyttää, että käytetään so- 25 pivaa vektoria. Näin ollen keksintö pitää sisällään eks- * * : pressiovektorit, joissa tutkittavaa TRAP-molekyyliä koo- • · * ; V dittava sekvenssi on toiminnallisesti liitetty promootto- • * Φ : riin. Promoottori voi olla vahva promoottori, kuten sel laiset, jotka ovat alla hyvin tunnettuja, tai eriytynyt ; j*. 30 promoottori, se tarkoittaa sellainen, joka on toimiva ai- * · · .**·. noestaan spesifisissä solutyypeissä. Ekspressiovektorit • · S" voivat myös sisältää viruksen tai bakteerin, kuten vacci- * * · V * nia-viruksen tai BCG-bakteerin, koko genomin tai osan sii- * · · *...· tä. Sellaiset vektorit ovat erikoisen käyttökelpoisia ro- 35 kotteita valmistettaessa. ’’ • · *«··* * · 117555 45

Ekspressiovektorit voivat sisältää useita koodit-tavia sekvenssejä niin kauan, kun niissä on TRAP-sekvens-si. Yllä kuvatut sytokiini- ja/tai MHC/HLA-geenit voivat olla sisällytettyinä yhteen vektoriin TRAP-sekvenssin 5 kanssa. Kun tätä ei haluta, voidaan muodostaa sellainen ekspressiosysteemi, jossa käytetään kahta tai useampaa erillistä vektoria, joissa kukin koodittava sekvenssi on toiminnallisesti liitettynä promoottoriin. Promoottori voi jälleen olla vahva tai eriytynyt promoottori. Yhteistrans-10 fektio on hyvin tunnettu menetelmä ja tämän alan asiantuntijalla odotetaan olevan tämän menetelmä saatavilla. Vektorit voidaan rakentaa niin, että ne koodattavat TRA-mole-kyyliä suoraan mieluummin kuin TRAP-molekyyliä. Tämä poistaa translaation jälkeisen prosessoinnin tarpeen.

15 Kuten yllä oleva keskustelu selvittää, sekvenssit koodittavat "kasvaimen hyljintäantigeenin esiasteita" ("TRAP"), jotka vuorostaan prosessoidaan kasvaimen hyljin- ? täantigeeneiksi ("TRA"). Näiden molempien luokkien eristetyt muodot on kuvattu tässä sisältäen spesifiset esimer-20 kit kustakin. Niiden ehkä huomattavin käyttökohde on roko-tekäyttö erilaisten syöpäsairauksien hoitoon. Todiste osoittaa TRA-molekyylien muodostumisen kasvainsoluihin, jonka jälkeen kehittyy immuunivaste ja seuraa solujen * . poistaminen. Esimerkit esittävät, että kun eri TRA-mole- ····· 25 kyylit annetaan soluille, syntyy CTL-vaste ja TRA-molekyy- > • * ♦ · liä sisältävät solut poistetaan. Tämä on rokotteille omi- ♦ · » i V nainen käytös ja näin ollen TRAP-molekyylejä, jotka pro- • · · V * sessoidaan TRA-molekyyleiksi, ja TRA-molekyylejä itseään voidaan käyttää, joko yksinään tai farmaseuttisesti sopi-: :*; 30 vissa koostumuksissa, rokotteina. Samalla tavalla niitä

«M

·“*. sisältäviä soluja voidaan käyttää samoin joko yksinään tai • · · yhdistettynä aineksien kanssa saaden farmaseuttiset koos- • · · tumukset. Lisämateriaalit, joita voidaan käyttää rokottei- * * *···* na, sisältävät eristetyt solut, jotka sisältävät TRA-mo- *:··· 35 lekyylin pinnallaan, kuin myös TRAP-fragmentit, mutatoidut • * « * « • « 117555 46 virukset, erikoisesti heikennetyt muodot, ja transfektoi-dut bakteerit. "Fragmentit" tässä käytettynä viittaavat l peptideihin, jotka ovat pienempiä kuin TRA, mutta jotka * sisältävät rokotteelta vaaditut ominaisuudet, kuten yllä 5 on keskusteltu. Eräs rokote koostuu tai sisältää TRA-mole-kyylin ja HLA-molekyylien kompleksin. Tässä kuvatun tyyppisiä rokotteita voidaan käyttää ehkäisevästi, se tarkoittaa, antamalla vastaanottajalle niitä riittävä määrä niin, että ehkäistään syöpäsairauden muodostuminen.

10 Immuunivasteen muodostuminen, oli se sitten T-solu- välitteinen tai B-soluvälitteinen, on tarjotun kasvaimen H-, hyijintäantigeenin ominaisvaikutus. Mitä tulee B-soluvas-teeseen, tämä sisältää muun muassa vasta-aineiden muodostumisen TRA-molekyyliä vastaan, se on sellaisten vasta-15 aineiden muodostumisen, jotka spesifisesti sitoutuvat siihen. Lisäksi TRAP-molekyylit ovat riittävän kokoisia niin, että ne ovat immunogeenisia ja vasta-aineet, jotka spesifisesti sitoutuvat niihin, ovat osa tätä keksintöä. Nämä vasta-aineet voivat olla polyklonaalisia tai monoklonaa-20 lisiä niin, että jälkimmäiset valmistetaan millä tahansa niiden hyvin tunnetulla valmistusmenetelmällä, joita ei . tarvitse tässä toistaa. Monoklonaaliset vasta-aineet voi- ··· !*" daan valmistaa esimerkiksi käyttäen eläinmallia, esim.

• · * *] Balb/C-hiirtä, tai koeputkessa käyttäen esim. EBV-trans- «··*· 25 formantteja. Lisäksi antiseerumi voidaan eristää sellai- * · ·'··'" -v * · · ί.ί ! sesta potilaasta, joka on sellaisen syöpäsairauden vaivaa- ' • · · • V ma, jossa tietyt solut sisältävät TRA-molekyyliä. Sellai- *♦· ί.ί ϊ set vasta-aineet voidaan myös muodostaa sellaisia epitoop- peja vastaan, joiden on määritelty reagoivan TRA-molekyy- : ·*; 30 Iin ja HLA/MHC-molekyylien kanssa.

··# .·“. Edellä olevan kuvauksen uudelleen tarkastelu osoit- • ♦ • * ♦ taa, että on olemassa useita puolia systeemille, jota voi- • · · *·* daan kutsua "kasvaimen hyijintäantigeenin tarjonnaksi ja • · · *...· tunnistukseksi". Näiden ilmiöiden tunnistuksella on diag- ....j 35 nostiset seuraukset. Esimerkiksi spesifisten CTL-kloonien ··*··- · 117555 47 tai TRA-vasta-aineiden olemassaolo tekee mahdolliseksi syöpäsairauksien diagnosoimisen tai tarkkailun (selitetty jäljempänä) niin, että tarkkaillaan potilasnäytteen CTL- 5 soluja, tarkkaillaan vasta-aineiden sitoutumista TRA:han 5 tai tarkkaillaan anti-TRA-CTL-solujen aktiivisuutta poti-lasnäytteiden yhteydessä. Samalla tavalla TRAP-molekyylin nukleiinihappomolekyylien ekspressiota voidaan tarkkailla amplifikaatiolla (esim. "polymeraasiketjureaktio"), anti-sense-hybridisaatiolla, koetinmenetelmillä ja niin edel-10 leen. Useita erilaisia potilaan näytteitä, sisältäen kehon ?l nesteet (esim. veren, seerumin ja muut tulehdusnesteet), kudokset ja kasvaimet, voidaan myös testata.

Erityinen diagnosointitapa on käyttää sovellusta standardista "tuberkuliinitestistä", jota tällä hetkellä 15 käytetään tuberkuloosin diagnosoimiseksi. Tässä standardissa ihotestissä käytetään "puhdistetun proteiinijohdannaisen" tai "pPD:n" stabiilia muotoa diagnostisena apuna. Vastaavalla tavalla tämän keksinnön mukaisia TRA-molekyy-lejä voidaan käyttää sellaisessa ihotestissä diagnostisena 20 apuna tai tarkkailumenetelmänä.

Termiä "syöpäsairaus" käytetään tässä niin, että se sisältää kaikki ne fysiologiset tapahtumat, jotka panevat "** vireille syövän synnyn ja jotka johtavat lopulliseen klii- * * • niseen ilmenemismuotoon. Kasvaimet eivät ilmaannu alusta ··««· 25 asti näkyvinä kasvaimina; mieluummin tapahtuu erilaisia : tapahtumia, jotka liittyvät normaalin solun transformoitu- ·· · ' • *.· mi seen pahanlaatuiseksi soluksi, jonka jälkeen kehittyy ···'· ''·*·.

5.5 5 biomassan, kuten kasvaimen, metastaasin, jne., kasvu. Lisäksi, remissiota voidaan pitää osana "syöpäsairautta", v ; 30 koska kasvaimet harvoin spontaanisti häviävät. Tämän kek- • · · .*". sinnön diagnostiset näkökohdat sisältävät kaikki ne tapah- ·*» .;. tumat, jotka ottavat osaa karsinogeneesiin, yksittäisen • · · *·*’ solun ensimmäisestä transformaatiosta pahanlaatuiseksi • · · • · *...* soluksi aina kasvaimen ja metastaasin kehittymiseen asti ·...: 35 kuin myös remission. Kaikki ne sisältyvät tähän.

117555 48

Kun termiä "potilas" on käytetty, se sisältää kaikki ne lajit, jotka voivat saada syöpäsairauden. Tämä sisältää ihmiset ja muut kuin ihmiset, kuten kotieläimet, karjan ja niin edelleen.

5 Tässä keksinnössä on myös terapeuttiset näkökohdat.

Riittävien TRAP- ja TRA-määrien tehokaasta rokoteannosta on jo keskusteltu yllä. Samalla tavalla voidaan kehittää spesifiset CTL-solut in vitro ja sitten antaa ne potilaalle. Voidaan antaa joko polyklonaalisia tai monoklonaalisia 10 . vasta-aineita, jotka sitoutuvat spesifisesti soluihin, jotka sisältävät tutkittavaa TRA-molekyyliä. Nämä vasta-aineet voidaan kiinnittää spesifisiin kasvaimen vastaisiin aineisiin sisältäen, mutta ei rajoittuen, metotreksaatin, radioaktiivisesti jodeeratut yhdisteet, toksiinit, kuten 15 risiinin, muut sytostaatit tai sytolyyttiset lääkkeet ja niin edelleen. Näin ollen "kohdennettu" vasta-aineterapia sisältyy tähän, kuten myös sovellutus syöpäsolujen poistamiseksi CTL-soluja käyttäen.

Termejä ja ilmaisuja, joita tässä on käytetty, on 20 käytetty kuvaavina termeinä eikä rajoittavina termeinä, eikä sellaisia termejä ja ilmaisuja ole tarkoitus käyttää . niin, että ne poistavat mitään ekvivalentteja niille omi- ;**: naisuuksille tai niiden osille, jotka on esitetty ja ku- • · • 1’ vattu niin, että on ymmärrettävä erilaisten mahdollisten * 1 25 modifikaatioiden kuuluvan keksinnön piiriin. ' aa " a a a a a a • aa a aa f • a a : aa' aa a a · • · a a a a a • aa· aa· ···

Ml aa a a a a a • • a a a a a • aa, a mi a a ' • a ··· a a , a a a a a • a >, , 'V: a a e a a • a 49 1 1 7555 (1) GENERAL INFORMATION! (i) APPLICANTS: Boon, Thierry, Van den Eynde, Benoit :.

(ii) TITLE OF INVENTION: Isolated And Purified DNA Sequence *

Coding Antigen Expreeeed By Tumor Celle And Recognized By Cytotoxic T Celia, And Uses Thereof (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 26 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Felfe 6 Lynch (B) STREET: 805 Third Avenue (C) CITY: New York City .

(D) STATE: New York (F) ZIP: 10022 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Diskette, 5.25 inch, 360 kb storage

(B) COMPUTER: IBM

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS

(D) SOFTWARE: Wordperfect · : ' i (vi) CURRENT APPLICATION DATA: . , (A) APPLICATION NUMBER: (B) FILING DATE: (vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: 07/807,043 |

(B) FILING DATE: 12-DECEMBER-1991 J

• 1 • * * (vii) PRIOR APPLICATION DATA* ·**.· (A) APPLICATION NUMBER: 07/764,364 • . (B) FILING DATE; 23-SEPTEMBER-1991 • * · · e e e : (Vii) PRIOR APPLICATION DATA; f ·* (A) APPLICATION NUMBER: 07/728,838 f ;*·'· (b) FILING DATE: 9-JULY-1991 | • · :T: (vii) PRIOR APPLICATION DATA: ( (A) APPLICATION NUMBER: 07/705,702 (B) FILING DATE: 23-May-l991 ' t · · *"·* (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: S ! (A) NAME: Hanson, Norman D.

*Γ (B) REGISTRATION NUMBER: 30,946 : ;*·*· (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: LUD 253.4 e (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: (212) 688-9200 •J··: (B) TELEFAX: (212) B38-3884 | e eeeee e e 117555 50 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO* It " (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 462 bate pairs (B) TYPE: nucleic acid (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA

(Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1: ACCACAGCAG AATGAAAAGA ACCCGGGACT CCCAAAGACG CTAGATGTGT 50 GAAGATCCTG ATCACTCATT GGGTGTCTGA GTTCTGCGAT ATTCATCCCT 100 | CAGCCAATGA GCTTACTGTT CTCGTGGGGG GTTTGTGAGC CTTGGGTAGG 150 ' AAGTTTTGCA AGTTCCGCCT ACAGCTCTAG CTTGTGAATT TGTACCCTTT 200 CACGTAAAAA AGTAGTCCAG AGTTTACTAC ACCCTCCCTC CCCCCTCCCA 250 CCTCGTGCTG TGCTGAGTTT AGAAGTCTTC CTTATAGAAG TCTTCCGTAT 300 AGAACTCTTC CGGAGGAAGG AGGGAGGACC CCCCCCCTTT GCTCTCCCAG 350 CATGCATTGT CTCAACGCCA TTGCACTGAG CTGGTCGAAG AAGTAAGCCG 400 CTAGCTTGCG ACTCTACTCT TATCTTAACT TAGCTCGGCT TCCTGCTGGT 450 ACCCTTTGTG CC 462 ·' ·#» e ··· · G·-:.· • •S'.· • 1 ··*·· • · * • · · >· ·····,.

·· * • · · • * ··· as# 1 * ' '

ess I

• - ··· • e s ···

Ml

• * a S

• · · e »*· ate a s S • • St s · a s ·· • : 'i a · . ' e • see· • e , 117555 51 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NOt 2« (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 675 base pair· (B) TYPE: nucleic acid (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA

<xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2: ATG TCT CAT AAC AAG AAA CCA GAC AAA GCC CAC ACT GGC TCA GGT GGT 48

Met Ser Asp Aen Lye Lye Pro Aap Lye Ala Hie Ser Gly Ser Gly Gly 5 10 15 "·; GAC GGT GAT GGG AAT AGG TGC AAT TTA TTG CAC CGG TAC TCC CTG GAA 96

Asp Gly Asp Gly Aan Arg Cya Aen Leu Leu Hie Arg Tyr Ser Leu Glu 20 25 30 GAA ATT CTG CCT TAT CTA GGG TGG CTG CTC TTC GCT GTT GTC ACA ACA 144

Glu lie Leu Pro Tyr Leu Gly Trp Leu Vai Phe Ala Vai Val Thr Thr 35 40 45 AGT TTT CTG GCG CTC CAG ATG TTC ATA GAC GCC CTT TAT GAG GAG CAG 192

Ser Phe Leu Ala Leu Gin Met Phe lie Αβρ Ala Leu Tyr Glu Glu Gin 50 55 60 ' TAT GAA AGG GAT GTG GCC TGG ATA GCC AGG CAA AGC AAG CGC ATG TCC 240

Tyr Glu Arg Aep Val Ala Trp lie Ala Arg Gin Ser Lye Arg Met Ser 65 70 75 80 TCT GTC GAT GAG GAT GAA GAC GAT GAG GAT GAT GAG GAT GAC TAC TAC 288 ... Ser Val Aep Glu Aep Glu Aep Aep Glu Aep Aep Glu Aep Aep Tyr Tyr ·*·· 85 90 95 • e • e e ·· GAC GAC GAG GAC GAC GAC GAC GAT GCC TTC TAT GAT GAT GAG GAT GAT 336 • * Aep Aep Glu Aep Aep Asp Aep Aep Ala Phe Tyr Asp Aep Glu Asp Aep : loo 105 no e · e ··· ♦ :*·*: GAG GAA GAA GAA TTG GAG AAC CTG ATG GAT GAT GAA TCA GAA GAT GAG 384 *..! Glu Glu Glu Glu Leu Glu Aen Leu Met Asp Aep Glu Ser Glu Aep Glu :.· · 115 120 125 , GCC GAA GAA GAG ATG AGC GTG GAA ATG GGT GCC GGA GCT GAG GAA ATG 432 • ;*· Ala Glu Glu Glu Met Ser Val Glu Met Gly Ala Gly Ala Glu Glu Met 130 135 140 • · • · • · · GGT GCT GGC GCT AAC TGT GCC TGT GTT CCT GGC CAT CAT TTA AGG AAG 480 ! ; : Gly Ala Gly Ala Aen Cye Ala Cye Val Pro Gly Hie Hie Leu Arg Lye 1.. 145 150 155 160 • e • e eee * , AAT GAA GTG AAG TGT AGG ATG ATT TAT TTC TTC CAC GAC CCT AAT TTC 528 *·**· Aen Glu Val Lye Cye Arg Met lie Tyr Phe Phe Hie Aep Pro Aen Phe ....: 165 170 175 117555 52 CTG GTG TCT ΛΤΑ CCA GTG AAC CCT AAG GAA CAA ATG GAG TOT AGG TGT 576

Leu Val Ser lie Pro Val Aen Pro Lye Glu Gin Met Glu Cye Arg Cye 180 185 190 GAA AAT GCT GAT GAA GAG GTT GCA ATG GAA GAG GAA GAA GAA GAA GAG 624 v;;<,

Glu Aan Ala Aap Glu Glu Val Ala Met Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 195 200 210 GAG GAG GAG GAG GAA GAG GAA ATG GGA AAC CCG GAT GGC TTC TCA CCT 672

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Met Gly Aan Pro Aap Gly Phe Ser Pro 220 225 230 235 TAG 675 > ; 1 (2) INFORMATION FOR 8BQUENCE ID NO* 3» (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 228 base paira (B) TYPE: nucleic acid (0) TOPOLOGY* linear

(ii) MOLECULE TYPE* genomic DNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3: GCATGCAGTT GCAAAGCCCA GAAGAAAGAA ATGGACAGCG GAAGAAGTGG TTGTTTTTTT 60 ? TTCCCCTTCA TTAATTTTCT AGTTTTTAGT AATCCAGAAA ATTTGATTTT GTTCTAAAGT 120 j TCATTATGCA AAGATGTCAC CAACAGACTT CTGACTGCAT GGTGAACTTT CATATGATAC 180 1 •••I ATAGGATTAC ACTTGTACCT GTTAAAAATA AAAGTTTGAC TTGCATAC 228 * * * • ♦ • · - / e · « ; e e · ··* · . -i ·· · i • · e . · e e • · e e e • · ♦ e e e ·.· . : i e » e i t|

Ml • ♦ 1 e « • e e • x

• M

• e · e e · a a»· e · e · ·£ • mm λ • -.¾ • ..-e«e«e * e e

MMI

• · 53 117555 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO: 4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 136S base pair· | (B) TYPE: nucleic acid (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4: ACCACAGGAG AATGAAAAGA ACCCGGGACT CCCAAAGACG CTAGATGTGT 50 GAAGATCCTG ATCACTCATT GGGTGTCTGA GTTCTGCGAT ATTCATCCCT 100 CAGCCAATGA GCTTACTGTT CTCGTGGGGG GTTTGTGAGC CTTGGGTAGG 150 AAGTTTTGCA AGTTCCGCCT ACAGCTCTAG CTTGTGAATT TGTACCCTTT 200 CACGTAAAAA AGTAGTCCAG AGTTTACTAC ACCCTCCCTC CCCCCTCCCA 250 CCTCGTGCTG TGCTGAGTTT AGAAGTCTTC CTTATAGAAG TCTTCCGTAT 300 AGAACTCTTC CGGAGGAAGG AGGGAGGACC CCCCCCCTTT GCTCTCCCAG 350 CATGCATTGT GTCAACGCCA TTGCACTGAG CTGGTCGAAG AAGTAAGCCG 400 CTAGCTTGCG ACTCTACTCT TATCTTAACT TAGCTCGGCT TCCTGCTGGT 450 ACCCTTTGTG CC 462 ATG TCT GAT AAC AAG AAA CCA GAC AAA GCC CAC ACT GGC TCA 504 GGT GGT GAC GGT GAT GGG AAT AGG TGC AAT TTA TTG CAC CGG 546 TAC TCC CTG GAA GAA ATT CTG CCT TAT CTA GGG TGG CTG GTC 588 TTC GCT GTT GTC ACA ACA ACT TTT CTG GCG CTC CAG ATG TTC 630 ATA GAC GCC CTT TAT GAG GAG CAG TAT GAA AGG GAT GTG GCC 672 ·§ TGG ATA GCC AGG CAA AGC AAG CGC ATG TCC TCT GTC GAT GAG 714 GAT GAA GAC GAT GAG GAT GAT GAG GAT GAC TAC TAC GAC GAC 756 GAG GAC GAC GAC GAC GAT GCC TTC TAT GAT GAT GAG GAT GAT 798 GAG GAA GAA GAA TTG GAG AAC CTG ATG GAT GAT GAA TCA GAA 840 GAT GAG GCC GAA GAA GAG ATG AGC GTG GAA ATG GGT GCC GGA 882 V.” GCT GAG GAA ATG GGT GCT GGC GCT AAC TGT GCC TGT GTT CCT 924 I *** GGC CAT CAT TTA AGG AAG AAT GAA GTG AAG TGT AGG ATG ATT 966 TAT TTC TTC CAC GAC CCT AAT TTC CTG GTG TCT ATA CCA GTG 1008 AAC CCT AAG GAA CAA ATG GAG TGT AGG TGT GAA AAT GCT GAT 1050 : GAA GAG GTT CCA ATG GAA GAG GAA GAA GAA GAA GAG GAG GAG 1092 “V GAG GAG GAA GAG CAA ATG GGA AAC CCG GAT GGC TTC TCA CCT 1134 • V TAG 1137 GCATGCAGTT GCAAAGCCCA CAAGAAAGAA ATGGACAGCG GAAGAAGTGG 1187 *·' 1 TTGTTTTTTT TTCCCCTTCA TTAATTTTCT AGTTTTTAGT AATCCAGAAA ' 1237 ATTTGATTTT GTTCTAAAGT TCATTATGCA AAGATGTCAC CAACAGACTT 1287 , CTGACTGCAT GGTGAACTTT CATATGATAC ATAGGATTAC ACTTGTACCT 1337 !#·#ί GTTAAAAATA AÄAGTTTGAC TTGCATAC 1365 ··· • · • · ··· ··· e ♦ e • e e ...

··· • e • 4 ··· e e ! ♦ e , .

117555 54 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NOt 5* (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS! (A) LENGTH! 4698 but pair· r (B) TYPE; nucleic acid (D) TOPOLOGY! linear <ii) MOLECULE TYPE! genomic DNA · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: S: ACCACAGGAG AATGAAAAGA ACCCGGGACT CCCAAAGACG CTAGATGTGT 50 GAAGATCCTG ATCACTCATT GGGTGTCTGA GTTCTGCGAT ATTCATCCCT 100 CAGCCAATGA GCTTACTGTT CTCGTGGGGG GTTTGTGAGC CTTGGGTAGG 150 AAGTTTTGCA AGTTCCGCCT ACAGCTCTAG CTTGTGAATT TGTACCCTTT 200 CACGTAAAAA AGTAGTCCAG AGTTTACTAC ACCCTCCCTC CCCCCTCCCA 250 CCTCGTGCTG TGCTGAGTTT AGAAGTCTTC CTTATAGAAG TCTTCCGTAT 300 AGAACTCTTC CGGAGGAAGG AGGGAGGACC CCCCCCCTTT GCTCTCCCAG 350 CATGCATTGT GTCAACGCCA TTGCACTGAG CTGGTCGAAG AAGTAAGCCG 400 CTAGCTTGCG ACTCTACTCT TATCTTAACT TAGCTCGGCT TCCTGCTGGT 450 ACCCTTTGTG CC 462 ATG TCT GAT AAC AAG AAA CCA GAC AAA GCC CAC AGT GGC TCA 504 GGT GGT GAC GGT GAT GGG AAT AGG TGC AAT TTA TTG CAC CGG 546 TAC TCC CTG GAA GAA ATT CTG CCT TAT CTA GGG TGG CTG GTC 588 TTC GCT GTT GTC ACA ACA AGT TTT CTG GCG CTC CAG ATG TTC 630 i *' ATA GAC GCC CTT TAT GAG GAG CAG TAT GAA AGG GAT GTG GCC 672 TGG ATA GCC AGG CAA AGC AAG CGC ATG TCC TCT GTC GAT GAG 714 GAT GAA GAC GAT GAG GAT GAT GAG GAT GAC TAC TAC GAC GAC 756 GAG GAC GAC GAC GAC GAT GCC TTC TAT GAT GAT GAG GAT GAT 798 GAG GAA GAA GAA TTG GAG AAC CTG ATG GAT GAT GAA TCA GAA 840 GAT GAG GCC GAA GAA GAG ATG AGC GTG GAA ATG GGT GCC GGA 882 CCT GAG GAA ATG GGT GCT GGC GCT AAC TOT GCC T 916 . GTGAGTAACC CGTGGTCTTT ACTCTAGATT CAGGTGGGGT GCATTCTTTA 966 **** CTCTTGCCCA CATCTGTAGT AAAGACCACA TTTTGGTTGG GGGTCATTGC 1016 Γ*.. TGGAGCCATT CCTGGCTCTC CTGTCCACGC CTATCCCCGC TCCTCCCATC 1066 * . CCCCACTCCT TGCTCCGCTC TCTTTCCTTT TCCCACCTTG CCTCTGGAGC 1116 ^ *"** TTCAGTCCAT CCTGCTCTGC TCCCTTTCCC CTTTGCTCTC CTTGCTCCCC 1166 : TCCCCCTCGG CTCAACTTTT CGTGCCTTCT GCTCTCTGAT CCCCACCCTC 1216 ·· * TTCAGCCTTC CCCATTTGCT CCTCTCCCGA AACCCTCCCC TTCCTGTTCC 1266 ·’·*: CCTTTTCGCG CCTTTTCTTT CCTGCTCCCC TCCCCCTCCC TATTTACCTT 1316 TCACCAGCTT TGCTCTCCCT GCTCCCCTCC CCCTTTTGCA CCTTTTCTTT 1366 V · TCCTGCTCCC CTCCCCCTCC CCTCCCTGTT TACCCTTCAC CGCTTTTCCT i 1416 CTACCTGCTT CCCTCCCCCT TGCTGCTCCC TCCCTATTTG CATTTTCGGG 1466 TGCTCCTCCC TCCCCCTCCC CCTCCCTCCC TATTTGCATT TTCGGGTGCT 1516 . CCTCCCTCCC CCTCCCCAGG CCTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 1566 ;;; TTGGTTnTC GAGACAGGGT TTCTCTTTGT ATCCCTGGCT GTCCTGCCAC 1616 TCACTCTGTA GACCAGGCTG GCCTCAAACT CAGAAATCTG CCTGCCTCTG 1666 CCTCCCAAAT GCTGGGATTA AAGGCTTGCA CCAGGACTCC CCCAGTGCAG 1716 GCCTTTCTTT TTTCTCCTCT CTGGTCTCCC TAATCCCTTT TCTGCATGTT 1766 AACTCCCCTT TTGGCACCTT TCCTTTACAG GACCCCCTCC CCCTCCCTGT 1816 *...· TTCCCTTCCG GCACCCTTCC TAGCCCTGCT CTGTTCCCTC TCCCTGCTCC 1866 * . CCTCCCCCTC TTTGCTCGAC TTTTAGCAGC CTTACCTCTC CCTGCTTTCT 1916 ·:**: GCCCCGTTCC CCTTTTTTGT GCCTTTCCTC CTGGCTCCCC TCCACCTTCC 1966 (ij AGCTCACCTT TTTGTTTGTT TGGTTGTTTG GTTGTTTGGT TTGCTTTTTT 2016 * ** TTTTTTTTTT GCACCTTGTT TTCCAAGATC CCCCTCCCCC TCCGGCTTCC 2066 CCTCTGTGTG CCTTTCCTCT TCCCTCCCCC TCGCTGGCTC CCCCTCCCTT 2116 55 : 117555 TCTCCCTTTC CTCTCCCTGC TCCCTTCTCT GCTAACCTTT TAATGCCTTT 2166 CTTTTCTAGA CTCCCCCCTC CAGGCTTGCT CTTTGCTTCT GTGCACTTTT 2216 CCTGACCCTG CTCCCCTTCC CCTCCCAGCT CCCCCCTCTT TTCCCACCTC 2266 CCTTTCTCCA GCCTGTCACC CCTCCTTCTC TCCTCTCTGT TTCTCCCACT 2316 TCCTCCTTCC TTTACCCCTT CCCTCTCCCT ACTCTCCTCC CTGCCTGCTG 2366 GACTTCCTCT CCAGCCGCCC AGTTCCCTGC AGTCCTCGAG TCTTTCCTGC 2416 CTCTCTGTCC ATCACTTCCC CCTAGTTTCA CTTCCCTTTC ACTCTCCCCT 2466 ATGTGTCTCT CTTCCTATCT ATCCCTTCCT TTCTGTCCCC TCTCCTCTGT 2516 CCATGACCTC TCTCCTCCCT TCCCTTTCCT CTCTCTTCCA TTTTCTTCCA 2566 CCTGCTTCTT TACCCTGCCT CTCCCATTGC CCTCTTACCT TTATGCCCAT 2616 TCCATGTCCC CTCTCAATTC CCTGTCCCAT TGTGCTCCCT CACATCTTCC 2666 ATTTCCCTCT TTCTCCCTTA GCCTCTTCTT CCTCTTCTCT TGTATCTCCC 2716 TTCCCTTTGC TTCTCCCTCC TCCTTTCCCC TTCCCCTATG CCCTCTACTC 2766 TACTTGATCT TCTCTCCTCT CCACATACCC TTTTTCCTTT CCACCCTGCC 2816 CTTTGTCCCC AGACCCTACA GTATCCTGTG CACAGGAAGT GGGAGGTGCC 2866 ATCAACAACA AGGAGGCAAG AAACAGAGCA AAATCCCAAA ATCAGCAGGA 2916 AAGGCTGGAT GAAAATAAGG CCAGGTTCTG AGGACAGCTG GAATCTAGCC 2966 AAGTGGCTCC TATAACCCTA AGTACCAAGG GAGAAAGTGA TGGTGAAGTT 3016 CTTGATCCTT GCTGCTTCTT TTACATATGT TGGCACATCT TTCTCAAATG 3066 CAGGCCATGC TCCATGCTTG GCGCTTGCTC AGCGTGGTTA AGTAATGGGA 3116 GAATCTGAAA ACTAGGGGCC AGTGGTTTGT TTTGGGGACA AATTAGCACG 3166 TAGTGATATT TCCCCCTAAA AATTATAACA AACAGATTCA TGATTTGAGA 3216 ‘ TCCTTCTACA GGTGAGAAGT GGAAAAATTG TCACTATGAA GTTCTTTTTA 3266 GGCTAAAGAT ACTTCGAACC ATAGAAGCGT TGTTAAAATA CTGCTTTCTT 3316 TTGCTAAAAT ATTCTTTCTC ACATATTCAT ATTCTCGAG 3355 GT err CCT GGC CAT CAT TTA AGO AAG AAT GAA GTG AAG TGT 3396 jj AGG ATG ATT TAT TTC TTC CAC GAC CCT AAT TTC CTG GTG TCT 3438 j ATA CCA GTG AAC CCT AAG GAA CAA ATG GAG TGT AGG TGT GAA 3480 | AAT GCT GAT GAA GAG GTT GCA ATG GAA GAG GAA GAA GAA GAA 3522 GAG GAG GAG GAG GAG GAA GAG GAA ATG GGA AAC CCG GAT GGC 3564 TTC TCA CCT TAG 3576 GCATGCAGGT ACTGGCTTCA CTAACCAACC ATTCCTAACA TATGCCTGTA 3626 * GCTAAGAGCA TCTTTTTAAA AAATATTATT GGTAAACTAA ACAATTGTTA 3676 ....J TCTTTTTACA TTAATAAGTA TTAAATTAAT CCAGTATACA GTTTTAAGAA 3726 CCCTAAGTTA AACAGAAGTC AATGATGTCT AGATGCCTGT TCTTTAGATT 3776 ' j : βΤλβΤβλαΑσ TACTTACTAC AGATGAGAAG TTGTTAGACT CGGGAGTAGA 3826 "V GACCAGTAAA AGATCATGCA GTGAAATGTG GCCATGGAAA TCGCATATTG 3876 : *,* TTCTTATAGT ACCTTTGAGA CAGCTGATAA CAGCTGACAA AAATAAGTGT 3926 TTCAAGAAAG ATCACACGCC ATGGTTCACA TGCAAATTAT TATTTTGTCG 3976 *·’ * TTCTGATTTT TTTCATTTCT AGACCTGTGG TTTTAAAGAG ATGAAAATCT , 4026 CTTAAAATTT CCTTCATCTT TAATTTTCCT TAACTTTAGT TTTTTTCACT 4076 :j . TAGAATTCAA TTCAAATTCT TAATTCAATC TTAATTTTTA GATTTCTTAA 4126 AATGTTTTTT AAAAAAAATG CAAATCTCAT TTTTAAGAGA TGAAAGCAGA 4176 GTAACTGGGG GGCTTAGGGA ATCTGTAGGG TTGCGGTATA GCAATAGGGA 4226 GTTCTGGTCT CTGAGAAGCA GTCAGAGAGA ATGGAAAACC AGGCCCTTGC 4276 .I. CAGTAGGTTA GTGAGGTTGA TATGATCAGA TTATGGACAC TCTCCAAATC 4326 V : ATAAATACTC TAACAGCTAA GGATCTCTGA GGGAAACACA ACAGGGAAAT 4376 .···. ATTTTAGTTT CTCCTTGAGA AACAATGACA AGACATAAAA TTGGCAAGAA 4426 *...* AGTCAGGAGT GTATTCTAAT AAGTGTTGCT TATCTCTTAT TTTCTTCTAC 4476 AGTTCCAAAG CCCAGAAGAA AGAAATGGAC AGCGGAAGAA GTGGTTGTTT 4526 • TTTTTTCCCC TTCATTAATT TTCTAGTTTT TAGTAATCCA GAAAATTTGA 4576 ....: TTTTGTTCTA AAGTTCATTA TGCAAAGATG TCACCAACAG ACTTCTGACT 4626 GCATGGTGAA CTTTCATATG ATACATAGGA TTACACTTGT ACCTGTTAAA 4676 AATAAAAGTT TGACTTGCAT AC 4698 56 117555 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO: 6: (1) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 9 amino acid· (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY; linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:

Leu Pro Tyr Leu Gly Trp Leu Val Phe 5 ' ' ' > • ’5 ' / ;, -¾ j‘ ; 1 · ? , p11 9 ···.

···· • e • e • · · e • · 1 • * · i ‘ • · » * ** * • · · • · · • * • « * · · * · e * * Ψ * • .1 . '· * · · • · · • · * * · * • e • « • a · *** « · · • * * * · · * * • · • · · e..·.' ).

♦ · * · 117555 57 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NOt 7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS! (A) LENGTH: 2418 base pair· (B) TYPE: nucleic acid (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7: GGATCCAGGC CCTGCCAGGA AAAATATAAG GGCCCTGCGT GAGAACAGAG 50

GGGGTCATCC actgcatgag agtggggatg TCACAGAGTC CAGCCCACCC 100 I

TCCTGGTAGC ACTGAGAAGC CAGGGCTGTG CTTGCGGTCT GCACCCTGAG 150 GGCCCGTGGA TTCCTCTTCC TGGAGCTCCA GGAACCAGGC AGTGAGGCCT 200 TGGTCTGAGA CAGTATCCTC AGGTCACAGA GCAGAGGATG CACAGGGTGT 250 GCCAGCAGTG AATGTTTGCC CTGAATCCAC ACCAAGGGCC CCACCTGCCA 300 CAGGACACAT AGGACTCCAC AGAGTCTGGC CTCACCTCCC TACTGTCAGT 350 CCTGTAGAAT CGACCTCTGC TGCCCGGCTG TACCCTGAGT ACCCTCTCAC 400 j TTCCTCCTTC AGGTTTTCAG GGGACAGGCC AACCCAGAGG ACAGGATTCC 450 : CTGGACGCCA CAGAGGAGCA CCAAGGAGAA GATCTGTAAG TAGGCCTTTG 500 TTAGAGTCTC CAAGGTTCAG TTCTCACCTG AGGCCTCTCA CACACTCCCT 550 CTCTCCCCAG GCCTGTGGGT CTTCATTGCC CAGCTCCTGC CCACACTCCT 600 GCCTGCTGCC CTGACGAGAG TCATCATGTC TCTTGAGCAG AGGAGTCTGC 650 ACTGCAAGCC TGAGGAAGCC CTTGAGGCCC AACAAGAGGC CCTGGGCCTG 700 GTGTGTGTGC AGGCTGCCAC CTCCTCCTCC TCTCCTCTGG TCCTGGGCAC 750 CCTGGAGGAG GTGCCCACTG CTGGGTCAAC AGATCCTCCC CAGAGTCCTC 800 AGGGAGCCTC CGCCTTTCCC ACTACCATCA ACTTCACTCG ACAGAGGCAA 850 CCCAGTGAGG GTTCCAGCAG CCGTGAAGAG GAGGGGCCAA GCACCTCTTG 900 TATCCTGGAG TCCTTGTTCC GAGCAGTAAT CACTAAGAAC CTGGCTGATT 950 TGGTTGGTTT TCTGCTCCTC AAATATCGAG CCAGGGAGCC AGTCACAAAG 1000 !.*[ GCAGAAATGC TGGAGAGTGT CATCAAAAAT TACAAGCACT GTTTTCCTGA 1050 | I ’** GATCTTCGGC AAAGCCTCTG AGTCCTTGCA GCTGGTCTTT GGCATTGACG 1100 j ....J TGAAGGAAGC AGACCCCACC GGCCACTCCT ATCTCCTTGT CACCTGCCTA 1150 GGTCTCTCCT ATGATGGCCT GCTGGGTGAT AATCAGATCA TGCCCAAGAC 1200 * :*: AGGCTTCCTG ATAATTGTCC TGGTCATGAT TGCAATGGAG GGCGGCCATG 1250 "V CTCCTGAGGA GGAAATCTGG GAGGAGCTGA GTGTGATGGA GGTGTATGAT 1300 j *.: GGGAGGGAGC ACAGTGCCTA TGGGGACCCC AGGAACCTGC TCACCCAAGA 1350 TTTGGTGCAG GAAAAGTACC TGGAGTACGG CAGGTGCCGG ACAGTGATCC 1400 * *·* * CGCACGCTAT GAGTTCCTGT GGGGTCCAAG GGCCCTCCCT GAAACCAGCT '1450 ATGTGAAAGT CCTTGAGTAT GTGATCAAGG TCAGTGCAAG AGTTCGCTTT 1500 TTCTTCCCAT CCCTGCGTGA AGCAGCTTTG AGAGAGGAGG AAGAGGGAGT 1550 CTGAGCATGA GTTGCAGCCA AGGCCAGTGG GAGGGGGACT GGGCCAGTGC 1600 ,···. ACCTTCCAGG GCCGCGTCCA GCAGCTTCCC CTGCCTCGTG TGACATGAGG 1650 *.··* CCCATTCTTC ACTCTGAAGA GAGCGGTCAG TGTTCTCAGT AGTAGGTTTC 1700 .1. TGTTCTATTG GGTGACTTGG AGATTTATCT TTGTTCTCTT TTGGAATTGT 1750 i : TCAAATGTTT TTTTTTAAGC GATGGTTGAA TGAACTTCAG CATCCAAGTT 1BOO \ .·*♦. TATGAATGAC AGCAGTCACA CAGTTCTGTG TATATAGTTT AAGGGTAAGA 1850 *...* GTCTTGTGTT TTATTCAGAT TGGGAAATCC ATTCTATTTT GTGAATTGGG 1900 "[,· ATAATAACAG CAGTCGAATA AGTACTTAGA AATGTGAAAA ATGAGCAGTA 1950 AAATAGATGA GATAAAGAAC TAAAGAAATT AAGAGATAGT CAATTCTTGC 2000 ....j CTTATACCTC AGTCTATTCT GTAAAATTTT TAAAGATATA TGCATACCTG 2050 GATTTCCTTG GCTTCTTTGA GAATGTAAGA GAAATTAAAT CTGAATAAAG 2100 AATTCTTCCT GTTCACTGGC TCTTTTCTTC TCCATGCACT CAGCATCTGC 2150 TTTTTCGAAG GCCCTGGGTT AGTAGTGGAG ATGCTAAGGT AAGCCAGACT 2200 117555 58 CATACCCACC CATAGGGTCG TAGAGTCTAG GAGCTGCAGT CACGTAATCG 2250 AGCTGGCAAG ATGTCCTCTA AAGATGTAGG GAAAAGTGAG AGAGGGGTGA 2300 GGGTGTGGGG CTCCGGGTGA CAGTGGTGGA GTGTCAATGC CCTGAGCTGG 2350 GCCATTTTGG GCTTTGGGAA ACTGCAGTTC CTTCTGGGGG AGCTGATTGT 2400 AATGATCTTG GGTGGATCC 2418 i • · · ·♦·· • · • · • ·· • · • · • * · • · * *** * ** · • t · • * • · • · · ...

• · · • · · • 1 • · · • · · • · a Ψ • · ' ···"' • · · • * · e*·,'".· • * • · * · · • · • · . - ·' jf 117555 59 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NOl 8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICSt (A) LENGTH: 5724 base pair· (B) TIPS: nucleic acid (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA

(ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: MAGE-1 gene <xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8: CCCGGGCCAC CACTGGCATC CCTCCCCCTA CCACCCCCAA TCCCTCCCTT 50 TACGCCACCC ATCCAAACAT CTTCACGCTC ACCCCCAGCC CAAGCCAGGC 100 | AGAATCCGGT TCCACCCCTG CTCTCAACCC AGGGAAGCCC AGGTGCCCAG 150 |

ATGTGACGCC ACTGACTTGA GCATTAGTGG TTAGAGAGAA GCGAGGTTTT 200 F

CGGTCTGAGG GGCGGCTTGA GATCGGTGGA GGGAAGCGGG CCCAGCTCTG 250 TAAGGAGGCA AGGTGACATG CTGAGGGAGG ACTGAGGACC CACTTACCCC 300 AGATAGAGGA CCCCAAATAA TCCCTTCATG CCAGTCCTGG ACCATCTGGT 350 GGTGGACTTC TCAGGCTGGG CCACCCCCAG CCCCCTTGCT GCTTAAACCA 400 CTGGGGACTC GAAGTCAGAG CTCCGTGTGA TCAGGGAAGG GCTGCTTAGG 450 AGAGGGCAGC GTCCAGGCTC TGCCAGACAT CATGCTCAGG ATTCTCAAGG 500 ACGGCTGAGG GTCCCTAAGA CCCCACTCCC GTGACCCAAC CCCCACTCCA 550 ATGCTCACTC CCGTGACCCA ACCCCCTCTT CATTGTCATT CCAACCCCCA 600 CCCCACATCC CCCACCCCAT CCCTCAACCC TGATGCCCAT CCGCCCAGCC 650 ATTCCACCCT CACCCCCACC CCCACCCCCA CGCCCACTCC CACCCCCACC 700 CAGGCAGGAT CCGGTTCCCG CCAGGAAACA TCCGGGTGCC CGGATGTGAC 750 GCCACTGACT TGCGCATTGT GGGGCAGAGA GAAGCGAGGT TTCCATTCTG 800 j AGGGACGGCG TAGAGTTCGG CCCAAGGAAC CTGACCCAGG CTCTGTGAGG 850 | AGGCAAGGTG AGAGGCTGAG GGAGGACTGA GGACCCCGCC ACTCCAAATA 900 GACAGCCCCA AATATTCCAG CCCCGCCCTT GCTGCCAGCC CTGGCCCACC 950 *!' CGCGGGAAGA CGTCTCAGCC TGGGCTGCCC CCAGACCCCT GCTCCAAAAG 1000 CCTTGACAGA CACCAGGTTC TTCTCCCCAA GCTCTGGAAT CAGAGGTTGC 1050 : '·· TGTGACCAGG GCAGGACTGG TTAGGACACG GCAGGGCACA GGCTCTCCCA 1100 GGCATCAAGA TCAGCACCCA AGAGGGAGGG CTGTGGGCCC CCAAGACTGC 1150 ACTCCAATCC CCACTCCCAC CCCATTCGCA TTCCCATTCC CCACCCAACC 1200 [ • :*: cccatctcct cagctacacc tccaccccca tccctactcc tactccgtca 1250 * cctgaccacc accctccagc cccagcacca GCCCCAACCC TTCTGCCACC 1300 • V TCACCCTCAC TGCCCCCAAC CCCACCCTCA TCTCTCTCAT GTGCCCCACT 1350 CCCATCGCCT CCCCCATTCT GGCAGAATCC GGTTTGCCCC TGCTCTCAAC 1400 '·* * CCAGGGAAGC CCTGGTAGGC CCGATGTGAA ACCACTGACT TGAACCTCAC >1450 AGATCTGAGA GAAGCCAGGT TCATTTAATG GTTCTGAGGG GCGGCTTGAG 15Q0 i , ATCCACTGAG GGGAGTGGTT TTAGGCTCTG TGAGGAGGCA AGGTGAGATG 1550 ·.·.· CTGAGGGAGG ACTGAGGAGG CACACACCCC AGGTAGATGG CCCCAAAATG 1600 ,···. ATCCAGTACC ACCCCTGCTG CCAGCCCTGG ACCACCCGGC CAGGACAGAT 1650 *·..* GTCTCAGCTG GACCACCCCC CGTCCCGTCC CACTGCCACT TAACCCACAG 1700 GGCAATCTGT AGTCATAGCT TATGTGACCG GGGCAGGGTT GGTCAGGAGA 1750 : * GGCAGGGCCC AGGCATCAAG GTCCAGCATC CGCCCGGCAT TAGGGTCAGG 1800 .·*·. ACCCTGGGAG GGAACTGAGG GTTCCCCACC CACACCTGTC TCCTCATCTC 1850 *···* CACCGCCACC CCACTCACAT TCCCATACCT ACCCCCTACC CCCAACCTCA 1900 ! >(|(· TCTTGTCAGA ATCCCTGCTG TCAACCCACG GAAGCCACGG GAATGGCGGC 1950 | ’·' * CAGGCACTCG GATCTTGACG TCCCCATCCA GGGTCTGATG GAGGGAAGGG 2000 ...·: GCTTGAACAG GGCCTCAGGG GACCAGAGGG AGGGCCCTAC TGCGAGATGA 2050 GGGAGGCCTC AGAGGACCCA GCACCCTAGG ACACCGCACC CCTGTCTGAC 2100 ACTGAGGCTG CCACTTCTGG CCTCAAGAAT CAGAACGATG GGGACTCAGA 2150 — \ 117555 - 60 TTGCATGGGG GTGGCACCCA GGCCTGCAAG GCTTACGCGG AGGAAGAGGA 2200 GGCAGGACTC AGCGGACCTT GGAATCCAGA TCAGTGTGGA CCTCGCCCCT 2250 GAGAGGTCCA GGGCACGGTG GCCACATATG GCCCATATTT CCTGCATCTT 2300 TGAGGTGACA GGACAGAGCT GTGGTCTGAG AAGTGGGGCC TCAGGTCAAC 2350 | AGAGGGAGGA GTTCCAGGAT CCATATGGCC CAAGATGTGC CCCCTTCATG 2400 AGGACTGGGG ATATCCCCGG CTCAGAAAGA AGGGACTCCA CACAGTCTGG 2450 CTGTCCCCTT TTAGTAGCTC TAGGGGGACC AGATCAGCGA TGGCGGTATG 2500 TTCCATTCTC ACTTGTACCA CAGGCAGGAA GTTGGGGGGC CCTCAGGGAG 2550 ATGGGGTCTT GGGGTAAAGG GGGGATGTCT ACTCATGTCA GGGAATTGGG 2600 GGTTGAGGAA GCACAGGCGC TGCCAGGAAT AAAGATGAGT GAGACAGACA 2650 AGGCTATTGG AATCCACACC CCAGAACCAA AGGGGTCAGC CCTGGACACC 2700 TCACCCAGGA TGTGGCTTCT TTTTCACTCC TGTTTCCAGA TCTGGGGCAG 2750 GTGAGGACCT CATTCTCAGA GGGTGACTCA GGTCAACGTA GGGACCCCCA 2800 TCTGGTCTAA AGACAGAGCG GTCCCAGGAT CTGCCATGCG TTCGGGXGAG 2850 I, GAACATGAGG GAGGACTGAG GGTACCCCAG GACCAGAACA CTGAGGGAGA 2900 | CTGCACAGAA ATCAGCCCTG CCCCTGCTGT CACCCCAGAG AGCATGGGCT 2950 1 GGGCCGTCTG CCGAGGTCCT TCCGTTATCC TGGGATCATT GATGTCAGGG 3000 ACGGGGAGGC CTTGGTCTGA GAAGGCTGCG CTCAGGTCAG TAGAGGGAGC 3050 GTCCCAGGCC CTGCCAGGAG TCAAGGTGAG GACCAAGCGG GCACCTCACC 3150 CAGGACAGAT TAATTCCAAT GAATTTTGAT ATCTCTTGCT GCCCTTCCCC 3200 AAGGACCTAG GCACGTGTGG CCAGATGTTT GTCCCCTCCT GTCCTTCCAT 3250 TCCTTATCAT GGATGTGAAC TCTTGATTTG GATTTCTCAG ACCAGCAAAA 3300 GGGCAGGATC CAGGCCCTGC CAGGAAAAAT ATAAGGGCCC TGCGTGAGAA 3350 CAGAGGGGGT CATCCACTGC ATGAGAGTGG GGATGTCACA GAGTCCAGCC 3400 CACCCTCCTC GTAGCACTGA GAAGCCAGGG CTGTCCTTGC GGTCTGCACC 3450 CTGAGGGCCC GTGGATTCCT CTTCCTGGAG CTCCAGGAAC CAGGCAGTGA 3500 GGCCTTGGTC TGAGACAGTA TCCTCAGGTC ACAGAGCAGA GGATGCACAG 3550 GGTGTGCCAG CAGTGAATGT TTGCCCTGAA TGCACACCAA GGGCCCCACC 3600 ;l· TGCCACAGGA CACATAGGAC TCCACAGAGT CTGGCCTCAC CTCCCTACTG 3650 1 TCAGTCCTGT AGAATCGACC TCTGCTGGCC GGCTGTACCC TGAGTACCCT 3700 4 t· CTCACTTCCT CCTTCAGGTT TTCAGCGGAC AGGCCAACCC ACAGGACAGG 3750 ATTCCCTGGA GGCCACAGAG GAGCACCAAG GAGAAGATCT GTAAGTAGGC 3800 CTTTGTTAGA GTCTCCAAGG TTCAGTTCTC AGCTGAGGCC TCTCACACAC 3850 * " TCCCTCTCTC CCCAGGCCTG TGGGTCTTCA TTGCCCAGCT CCTGCCCACA 3900 •I··· CTCCTGCCTG CTGCCCTGAC GAGAGTCATC 3930 i . . ATG TCT CTT GAG CAG AGG AGT CTG CAC TGC AAG CCT GAG GAA 3972 j :,: : GCC CTT GAG GCC CAA CAA GAG CCC CTG GGC CTG GTG TGT GTG 4014 i CAG GCT GCC ACC TCC TCC TCC TCT CCT CTG GTC CTG GGC ACC 4056 • ·* CTG GAG GAG GTG CCC ACT GCT GGG TCA ACA GAT CCT CCC CAG 4096 :*·*: AGT CCT CAG GCA GCC TCC GCC TTT CCC ACT ACC ATC AAC TTC 4140 * ACT CGA CAG AGG CAA CCC AGT GAG GGT TCC ACC AGC CGT GAA 4i82 GAG GAG GGG CCA AGC ACC TCT TGT ATC CTG GAG TCC TTG TTC 4224 . ,·. CGA GCA GTA ATC ACT AAG AAG GTG GCT GAT TTG GTT GGT TTT 4266 *·:·' CTG CTC CTC AAA TAT CGA GCC AGG GAG CCA GTC ACA AAG GCA 4308 ;***. GAA ATG CTG GAG ACT GTC ATC AAA AAT TAC AAG CAC TGT TTT 4350 " CCT GAG ATC TTC GGC AAA GCC TCT GAG TCC TTG CAG CTG GTC 4392 TTT GGC ATT CAC GTG AAG GAA GCA CAC CCC ACC GGC CAC TCC 4434 [ *·* * TAT GTC CTT GTC ACC TGC CTA GCT CTC TCC TAT GAT GGC CTG 4476 i

:*": CTC GGT GAT AAT CAG ATC ATG CCC AAG ACA GGC TTC CTG ATA 45IB

*** ATT GTC CTG GTC ATG ATT GCA ATG GAG GGC GGC CAT GCT CCT 4560 ··.·: GAG GAG GAA ATC TGG GAG GAG CTG AGT GTG ATG GAG GTG TAT 4602 * GAT GGG AGG GAG CAC AGT GCC TAT GGG GAG CCC AGG AAG CTG 4644 *"*: CTC ACC CAA GAT TTG GTG CAG GAA AAG TAC CTG GAG TAC GGC 4686 AGG TGC CGG ACA GTG ATC CCG CAC GCT ATG AGT TCC TGT GGG 4728 GTC CAA GGG CCC TCG CTG AAA CCA GCT ATG TGA 4761 61 117555 AAGTCCTTCA GTATGTGATC AAGGTCAGTG CAAGAGTTC 4800 GCTTTTTCTT CCCATCCCTG CGTGAAGCAG CTTTGAGAGA GGAGGAAGAG 4850 GGAGTCTGAG CATGAGTTGC AGCCAAGGCC AGTGGGAGGG GGACTGGGCC 4900 ,ji AGTGCACCTT CCAGGGCCGC GTCCAGCAGC TTCCCCTGCC TCGTGTGACA 4950 TGAGGCCCAT TCTTCACTCT GAAGAGACCG GTCAGTGTTC TCAGTAGTAG 5000 GTTTCTGTTC TATTGGGTGA CTTGGAGATT TATCTTTGTT CTCTTTTGGA 5050 ATTGTTCAAA TGTTTTTTTT TAAGGGATGG TTGAATGAAC TTCAGCATCC 5100 AAGXTTATGA ATGACACCAG TCACACAGTT CTGTGTATAT AGTTTAAGGG 5150 TAAGAGTCTT GTGTTTTATT CAGATTGGGA AATCCATTCT ATTTTGTGAA 5200 TTCGGATAAT AACAGCAGTG GAATAAGTAC TTAGAAATGT GAAAAATGAG 5250 GAGTAAAATA GATGAGATAA AGAACTAAAG AAATTAAGAG ATAGTCAATT 5300 CTTGCCTTAT ACCTCAGTCT ATTCTGTAAA ATTTTTAAAG ATATATGCAT 5350 ACCTGGATTT CCTTGGCTTC TTTGAGAATG TAAGAGAAAT TAAATCTGAA 5400 TAAAGAATTC TTCCTGTTCA CTGGCTCTTT TCTTCTCCAT GCACTGAGCA 5450 TCTGCTTTTT GGAAGGCCCT GGGTTAGTAG TGGAGATGCT AAGGTAAGCC 5500 AGACTCATAC CCACCCATAG GGTCGTAGAG TCTAGGAGCT GGAGTCACGT 5550 AATCGAGGTG GCAAGATGTC CTCTAAAGAT GTAGGGAAAA GTGAGAGAGG 5600 1 2 3 GGTGAGGGTG TGGGGCTCCG GGTGAGAGTG GTGGAGTGTC AATGCCCTGA 5650 GCTGGGGCAT TTTGGGCTTT GGGAAACTGC AGTTCCTTCT GGGGGAGCTG 5700 ATTGTAATGA TCTTGGGTGG ATCC 5724 ' i • · · ' ···» ·· • · ' ♦ ·· • · 1 • · • ♦ « • · » t «·· · ·:{ ··· .;.·« • · · • ♦ • · -.-.+, ··♦ • · ♦ *·1 1 I ·1! jj • · · • ♦ ♦ • · · • · • · ··· ··· ··· • · · I , .s'.

· · ♦ · -r 2 • · - 3 • ♦ ♦ ♦ 117555 62 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO: 9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: | (A) LENGTH: 4157 base pair· (B) TYPE: nucleic acid (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA

(ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: MAGE-2 gen· (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9: CCCATCCAGA TCCCCATCCO GGCAGAATCC GGTTCCACCC TTGCCGTGAA 50 CCCAGGGAAG TCAOGGGCCC GGATGTGACG CCACTGACTT GCACATTGGA 100 GGTCAGAGGA CAGCGAGATT CTCGCCCTGA GCAACGGCCT GACGTCGGCG 150 GAGGGAAGCA GGCGCAGGCT CCGTGAGGAG GCAAGGTAAG ACGCCGAGGG 200 AGGACTGAGG CGGGCCTCAC CCCAGACAGA GGGCCCCCAA TTAATCCAGC 250 GCTGCCTCTG CTGCCGGGCC TGGACCACCC TGCAGGGGAA GACTTCTCAG 300 GCTCAGTCGC CACCACCTCA CCCCGCCACC CCCCGCCGCT TTAACCGCAG 350 GGAACTCTGG CGTAAGAGCT TTGTGTGACC AGGGCAGGGC TGGTTAGAAG 400 TGCTCAGGGC CCAGACTCAG CCAGGAATCA AGGTCAGGAC CCCAAGAGGG 450 GACTGAGGGC AACCCACCCC CTACCCTCAC TACCAATCCC ATCCCCCAAC 500 ACCAACCCCA CCCCCATCCC TCAAACACCA ACCCCACCCC CAAACCCCAT 550 TCCCATCTCC TCCCCCACCA CCATCCTGGC AGAATCCGGC TTTGCCCCTG 600 CAATCAACCC ACGGAAGCTC CGGGAATGGC GGCCAAGCAC GCGGATCCTG 650 ACGTTCACAT GTACGGCTAA GGGAGGGAAG GGGTTGGGTC TCGTGAGTAT 700 GGCCTTTGGG ATGCACAGGA AGGGCCCAGG CCTCCTGGAA GACAGTGGAG 750 TCCTTAGGGG ACCCAGCATG CCAGGACAGG GGGCCCACTG TACCCCTGTC 800 TCAAACTGAG CCACCTTTTC ATTCAGCCGA GGGAATCCTA GGGATGCAGA 850 CCCACTTCAG GGGGTTGGGG CCCAGCCTGC GAGGAGTCAA GGGGAGGAAG 900 AAGAGGGAGG ACTGAGGGGA CCTTGGAGTC CAGATCAGTG GCAACCTTGG 950 '·· GCTGGGGGAT CCTGGGCACA GTGGCCGAAT GTGCCCCGTG CTCATTGCAC 1000 I!" CTTCAGGGTG ACAGAGAGTT GAGGGCTGTG GTCTGAGGGC TGGGACTTCA 1050 • '·· GGTCAGCAGA GGGAGGAATC CCAGGATCTG CCGGACCCAA GGTGTGCCCC 1100 .,CTTCATGAGG ACTCCCCATA CCCCCGGCCC AGAAAGAAGG GATGCCACAG 1150 AGTCTGGAAG TAAATTGTTC TTAGCTCTGG GGGAACCTGA TCAGGGATGG 1200 • ;*J CCCTAAGTGA CAATCTCATT TGTACCACAG GCAGGAGGTT GGGGAACCCT 1250 *",* CAGGGAGATA ACGTGTTGGT GTAAAGAGGA GCTGTCTGCT CATTTCAGGG 1300 I GGTTCCCCCT TGAGAAAGGG CAGTCCCTGG CAGGAGTAAA GATGAGTAAC 1350 CCACAGGAGG CCATCATAAC GTTCACCCTA GAACCAAAGG GGTCAGCCCT 1400 *·* 1 GGACAACGCA CGTGGGGTAA CAGGATGTGG CCCCTCCTCA CTTGTCTTTC '1450 CAGATCTCAG GGAGTTGATG ACCTTGTTTT CAGAAGGTGA CTCAGTCAAC 1500 . ACAGGGGCCC CTCTGGTCGA CAGATGCAGT GGTTCTAGGA TCTGCCAAGC 1550 : : ATCCAGGTGG λΟλΟΟΟΤσΑΟ βΤΑΟΟλΤΤσΑ ΟββΤλΟΟΟΟΤ GGGCCAGAAT 1600 GCAGCAAGGG GGCCCCATAG AAATCTGCCC TGCCCCTGCG GTTACTTCAG 1650 AGACCCTGGG CAGGGCTGTC AGCTGAAGTC CCTCCATTAT CTGGGATCTT 1700 TGATGTCAGG GAAGGGGAGG CCTTGGTCTG AAGGGGCTGG AGTCAGGTCA 1750 ‘ GTAGAGGGAG GGTCTCAGGC CCTGCCAGGA GTGGACGTGA GGACCAAGCG 1800 .·*·. GACTCGTCAC CCAGGACACC TGGACTCCAA TGAATTTCAC ATCTCTCGTT 1850 *...* GTCCTTCGCG GAGGACCTGG TCACGTATGG CCAGATOTGG GTCCCCTCTA 1900 . TCTCCTTCTG TACCATATCA GGGATGTGAG TTCTTGACAT GAGAGATTCT 1950 ‘ ***** CAAGCCAGCA AAAGGGTGGG ATTAGGCCCT ACAAGGAGAA AGGTGAGGGC 2000 ....: CCTGAGTGAG CACAGAGGGG ACCCTCCACC CAAGTAGAGT GGGGACCTCA 2050 CGGAGTCTGG CCAACCCTGC TGAGACTTCT GGGAATCCGT GGCTGTGCTT 2100 GCAGTCTGCA CACTGAAGGC CCGTCCATTC CTCTCCCAGG AATCAGGAGC 2150 117555 63 TCCAGCAACC AGGCAGTGAG GCCTTGGTCT GAGTCAGTGC CTCAGOTCAC 2200 AGAGCAGAGG GGACGCAGAC AGTGCCAACA CTGAAGGTTT GCCTGGAATG 2250 CACACCAAGG GCCCCACCCG CCCAGAACAA ATGGGACTCC AGAGGGCCTG 2300 GCCTCACCCT CCCTATTCTC AGTCCTGCAG CCTGACCATG TGCTGGCCGG 2350 CTGTACCCTG AGGTGCCCTC CCACTTCCTC CTTCAGGTTC TGAGGGGGAC 2400 AGGCTGACAA GTAGGACCCC AGGCACTCGA GGAGCATTGA AGGACAAGAT 2450 CTGTAAGTAA GCCTTTGTCA GAGCCTCCAA GGTTCAGTTC AGTTCTCACC 2500 TAAGGCCTCA CACACGCTCC TTCTCTCCCC AGGCCTGTGG GTCTTCATTG 2550 CCCAGCTCCT GCCCGCACTC CTGCCTGCTG CCCTGACCAG AGTCATC 2S97 ATG CCT CTT GAG CAG AGG ACT GAG CAC TGC AAG CCT GAA GAA 2639 GGC CTT GAG GCC CGA GGA GAG GCC CTG GGC CTG GTG GGT GCG 2661 CAG GCT CCT CCT ACT GAG GAG CAG CAG ACC CCT TCT TCC TCT 2723 TCT ACT CTA GTG GAA GTT ACC CTG GGG GAG GTG CCT GCT GCC 2765 GAC TCA CCG AGT CCT CCC CAC ACT CCT CAG GGA GCC TCC AGC 2807 TTC TCG ACT ACC ATC AAC TAC ACT CTT TGG AGA CAA TCC GAT 2849 GAG GGC TCC AGC AAC CAA GAA GAG GAG GGG CCA AGA ATG TTT 2891 CCC GAC CTG GAG TCC GAG TTC CAA GCA GCA ATC AGT AGG AAG 2933 ATG GTT GAG TTC GTT CAT TTT CTG CTC CTC AAG TAT CGA GCC 2975 AGG GAG CCG GTC ACA AAG GCA GAA ATG CTG GAG AGT GTC CTC 3017 AGA AAT TGC CAG GAC TTC TTT CCC GTG ATC TTC AGC AAA GCC 3059 TCC GAG TAC TTG CAG CTG GTC TTT GGC ATC GAG GTG GTG GAA 3101 GTG GTC CCC ATC AGC CAC TTG TAC ATC CTT GTC ACC TGC CTG 3143 GGC CTC TCC TAC GAT GGC CTG CTG GGC GAC AAT CAG GTC ATG 3185 CCC AAG ACA GGC CTC CTG ATA ATC GTC CTG GCC ATA ATC GCA 3227 ATA GAG GGC GAC TGT GCC CCT GAG GAG AAA ATC TGG GAG GAG 3269 CTG AGT ATG TTG GAG GTG TTT GAG GGG AGG GAG GAC AGT GTC 3311 TTC GCA CAT CCC AGG AAG CTG CTC ATG CAA GAT CTG GTG CAC 3353 GAA AAC TAC CTG GAG TAC CGG CAG GTG CCC GGC AGT GAT CCT 3395 GCA TGC TAC GAG TTC CTG TGG GGT CCA AGG GCC CTC ATT GAA 3437 ACC AGC TAT GTG AAA GTC CTG CAC CAT ACA CTA AAG ATC GGT 3479 ··· . GGA GAA CCT CAC ATT TCC TAC CCA CCC CTG CAT GAA CGG GCT 3521 I."" TTG AGA GAG GGA GAA GAG TGA 3542 • 1·· GTCTCAGCAC ATGTTGCAGC CAGGGCCAGT GGGAGGGGGT CTGGGCCAGT 3592 GCACCTTCCA GGGCCCCATC CATTAGCTTC CACTGCCTCG TGTGATATGA 3642 * 1 GGCCCATTCC TGCCTCTTTG AAGAGAGCAG TCAGCATTCT TAGCAGTGAG 3692 : TTTCTGTTCT GTTGGATGAC TTTGAGATTT ATCTTTCTTT CCTGTTGGAA 3742 *·1.1 TTGTTCAAAT GTTCCTTTTA ACAAATGGTT GGATGAACTT CAGCATCCAA 3792 • GTTTATGAAT GACAGTAGTC ACACATAGTG CTGTTTATAT AGTTTAGGGG 3842 TAAGAGTCCT GTTTTTTATT CAGATTGGGA AATCCATTCC ATTTTGTGAG 3892 *.1 1 TTGTCACATA ATAACAGCAG TGGAATATGT ATTTGCCTAT ATTGTGAACG (3942 AATTAGCAGT AAAATACATG ATACAAGGAA CTCAAAAGAT AGTTAATTCT 3992 TGCCTTATAC CTCAGTCTAT TATGTAAAAT TAAAAATATG TGTATGTTTT 4042 TGCTTCTTTG AGAATGCAAA AGAAATTAAA TCTGAATAAA TTCTTCCTGT 4092 '.’.l TCACTGGCTC ATTTCTTTAC CATTCACTCA GCATCTGCTC TGTGGAAGGC 4142 \„! CCTGGTAGTA GTCGG 4157 • t · • · · * · · · · • · * · • · 0 • ·1? • .· 1 r"4 0 9 64 117555 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NOt 10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 662 baee pair· (B) TYPE: nucleic acid (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA

(ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: MAGE-21 gene (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 10: GGATCCCCAT GGATCCAGCA AGAATCCAGT TCCACCCCTG CTGTGAACCC 50 | AGGGAAGTCA CGGGGCCGGA TGTGACGCCA CTGACTTGCC CGTTGGAGGT 100 CAGAGAACAG CGAGATTCTC GCCCTGAGCA ACGGCCTGAC GTCGGCGGAG 150 GGAAGCAGGC GCAGGCTCCG TGAGGAGGCA AGGTAAGATG CCGAGGGAGG 200 ACTGAGGCGG GCCTCACCCC AGACAGAGCG CCCCCAATAA TCCAGCGCTG 250 CCTCTGCTGC CAGGCCTGGA CCACCCTGCA GGGGAAGACT TCTCAGGCTC 300 AGTCGCCACC ACCTCACCCC GCCACCCCCC GCCGCTTTAA CCGCAGGGAA 350 CTCTGGTGTA AGAGCTTTGT GTGACCAGGG CAGGGCTGGT TAGAAGTGCT 400 CAGGGCCCAG ACTCACCCAG GAATCAAGGT CAGGACCCCA AGAGGGGACT 450 GAGGGTAACC CCCCCGCACC CCCACCACCA TTCCCATCCC CCAACACCAA 500 CCCCACCCCC ATCCCCCAAC ACCAAACCCA CCACCATCGC TCAAACATCA 550 ACGGCACCCC CAAACCCCGA TTCCCATCCC CACCCATCCT GGCAGAATCG 600 GAGCTTTCCC CCTGCAATCA ACCCACGGAA GCTCCGGGAA TGGCGGCCAA 650 CCACGCGGAT CC 662 ··· e ft··· ·· • e ft fte ft e MM· • ft ft ft ' • · · ft ft · ··· · ·· · • · ft • t ft ft • · ft

V * I

• ft ft ft*·..· ··« : • ♦ e 9 ft • ft ··· 9 • ft· • ♦ · e · # • · ft • · • ft • e e ft * • * : 1 • ft e e · ft ft ft • · ft ft e • · *9\ 117555 65 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NOs lit (1) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH; 1640 base pairs (8) TYPE; nucleic acid (D) TOPOLOGY: linear <ii) MOLECULE TYPEx cDNA to mRNA (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY; cDNA MAGE-3 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO! 11:

GCCGCGAGGG AAGCCGGCCC AGGCTCGGTG AGGAGGCAAG GTTCTGAGGG SO

GACAGGCTGA CCTGGAGGAC CAGAGGCCCC CGGAGGAGCA CTGAAGGAGA 100 AGATCTGCCA GTGGGTCTCC ATTGCCCAGC TCCTGCCCAC ACTCCCGCCT 150 GTTGCCCTGA CCAGAGTCAT C 171 ATG CCT CTT GAG CAG AGG ACT CAG CAC TGC AAG CCT GAA GAA 213 GGC CTT GAG GCC CGA GGA GAG GCC CTG GGC CTG GTG CGT GCG 255 CAG GCT CCT CCT ACT GAG GAG CAG GAG GCT GCC TCC TCC TCT 297 TCT ACT CTA GTT GAA GTC ACC CTG GGG GAG GTG CCT GCT GCC 339 GAG TCA CCA GAT CCT CCC CAG AGT CCT CAG GGA GCC TCC AGC 381 CTC CCC ACT ACC ATG AAC TAC CCT CTC TGG AGC CAA TCC TAT 423 GAG GAC TCC AGC AAC CAA GAA GAG GAG GGG CCA AGC ACC TTC 465 CCT GAC CTG GAG TCC GAG TTC CAA GCA GCA CTC AGT AGG AAG 507 GTG GCC GAG TTG GTT CAT TTT CTG CTC CTC AAG TAT CGA GCC 549 AGG GAG CCG GTC ACA AAG GCA GAA ATG CTC GGG AGT GTC GTC 591 GGA AAT TGG CAG TAT TTC TTT CCT GTG ATC TTC AGC AAA GCT 633 TCC AGT TCC TTG CAG CTG GTC TTT GGC ATC GAG CTG ATG GAA 675 GTG GAC CCC ATC GGC CAC TTG TAC ATC TTT GCC ACC TGC CTG 717 » GGC CTC TCC TAC GAT GGC CTG CTG GGT GAC AAT CAG ATC ATG 759 CCC AAG GCA GGC CTC CTG ATA ATC GTC CTG GCC ATA ATC GCA 801 ;·. ACA GAG GGC GAC TGT GCC CCT GAG GAG AAA ATC TGG GAG GAG 843 i ** CTG AGT GTG TTA GAG GTG TTT GAG GGG AGG GAA GAC AGT ATG 885 ·;··; TTG GGG GAT CCC AAG AAG CTG CTC ACC CAA CAT TTC GTG CAG 927 ., GAA AAC TAC CTG CAG TAC CGG CAG GTC CCC GGC AGT GAT CCT 969 ·.··. GCA TGT TAT GAA TTC CTG TGG GGT CCA AGG GCC CTC GTT GAA 1011 ;·.·. ACC AGC TAT GTG AAA GTC CTG CAC CAT ATG GTA AAG ATC AGT 1053 : .’ GGA GGA CCT CAC ATT TCC TAC CCA CCC CTG CAT GAG TGG GTT 1095 TTG AGA GAG GGG GAA GAG TGA 1116 ' 1 GTCTGAGCAC GAGTTGCAGC CAGGGCCAGT GGGAGGGGGT CTGGGCCAGT l 1166 GCACCTTCCG GGGCCGCATC CCTTAGTTTC CACTGCCTCC TGTGACGTGA 1216 GCCCCATTCT TCACTCTTTG AAGCGAGCAG TCAGCATTCT TAGTAGTGGG 1266 TTTCTGTTCT CTTGGATGAC TTTGAGATTA TTCTTTGTTT CCTGTTGGAG 1316 .***. TTGTTCAAAT GTTCCTTTTA ACGGATGGTT GAATGAGCGT CAGCATCCAG 1366 GTTTATGAAT GACAGTAGTC ACACATAGTG CTGTTTATAT AGTTTACGAG 1416 TAAGAGTCTT GttTTTTACT CAAATTgGGA AATCCATTCC ATTTTGTGAA 1466 *·1 1 TTGTGACATA ATAATAGCAG TGGTAAAAGT ATTTGCTTAA AATTGTGAGC 1516 GAATTAGCAA TAACATACAT GAGATAACTC AAGAAATCAA AAGATAGTTG 1566 “1 ATTCTTGCCT TGTACCTCAA TCTATTCTGT AAAATTAAAC AAATATGCAA 1616 ....: ACCAGGATTT CCTTGACTTC TTTG 1640 e e eeeee e e 117555 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO: 12: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 943 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (D) topology: linear

(14) molecule type: genomic DNA

(ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: MAGE-31 gene (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 12: GGATCCTCCA CCCCAGTAGA GTGGGGACCT CACAGAGTCT GGCCAACCCT 50 CCTGACAGTT CTGGGAATCC GTGGCTGCGT TTGCTGTCTG CACATTGGGG 100 GCCCGTGGAT TCCTCTCCCA GGAATCAGGA GCTCCACGAA CAAGGCAGTG 150 AGGACTTGGT CTGAGGCAGT GTCCTCAGGT CACAGAGTAG AGGGGgCTCA 200 GATAGTGCCA ACGGTGAAGG TTTGCCTTGG ATTCAAACCA AGGGCCCCAC 250 CTGCCCGAGA ACACATGGAC TCCAGAGCGC CTGGCCTCAC CCTCAATACT 300 TTCAGTCCTG CAGCCTCAGC ATGCGCTGGC CGGATGTACC CTGAGGTCCC 350 CTCTCACTTC CTCCTTCAGG TTCTGAGGGG ACAGGCTGAC CTGGAGGACC 400 AGAGGCCCCC GGAGGAGCAC TGAAGGAGAA GATCTGTAAG TAAGCCTTTG 450 TTAGAGCCTC CAAGGTTCCA TTCAGTACTC AGCTGAGGTC TCTCACATGC 500 TCCCTCTCTC CCCAGGCCAG TGGGTCTCCA TTGCCCAGCT CCTGCCCACA 550 CTCCCGCCTG TTGCCCTGAC CAGAGTCATC 580 ATG CCT CTT GAG CAG AGG AGT CAG CAC TGC AAG CCT GAA GAA 622 CGC CTT GAG GCC CGA GGA GAg GCC CTG GGC CTG GTG GGT GCG 664 CAG CCT CCT GCT ACT GAG GAG CAG GAG GCT GCC TCC TCC TCT 706 TCT AGT GTA GTT GAA GTC ACC CTG GGG GAG GTG CCT GCT GCC 748 GAG TCA CCA GAT CCT CCC CAG AGT CCT CAG GGA GCC TCC AGC 790 CTC CCC ACT ACC ATG AAC TAG CCT CTC TGG AGC CAA TCC TAT 832 GAG GAC TCC AGC AAC CAA GAA GAG GAG GGG CCA AGC ACC TTC 874 .:. CCT GAC CTG GAG TCT GAG TTC CAA GCA GCA CTC AGT AGG AAG 916 ···· GTG GCC AAG TTG GTT CAT TTT CTG CTC 943 • s • » * e e ·1 * • 1 • 1 .'.··» e 1 · ess s1e e -r • · e see.', e · • 1 • e e • e · ·.· · > e * 1 1 e e · S1e ess • e e e e e · • * e e see ; • e e . " 1 e e e e e * · · e e e 1 ’ e • · 117555 67 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NOt 13: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS) (A) LENGTH) 2531 base pair· (B) TYPE; nuclaic acid (0) TOPOLOGY) linear (ii) MOLECULE TYPE: ganottic DNA j (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: MAGE-4 gene <Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 13) GGATCCAGGC CCTGCCTGGA GAAATGTGAG GGCCCTGAGT GAACACAGTG 50 GGGATCATCC ACTCCATGAG AGTGGGGACC TCACAGAGTC CAGCCTACCC 100 TCTTGATGGC ACTGAGGGAC CGGGGCTGTG CTTACAGTCT GCACCCTAAG 150 GGCCGATGGA TTCCTCTCCT AGGAGCTCCA GGAACAAGGC AGTGAGGCCT 200 TGGTCTGAGA CAGTGTCCTC AGGTTACAGA GCACAGGATG CACAGGCTGT 250 GCCAGCAGTG AATGTTTGCC CTGAATGCAC ACCAAGGGCC CCACCTGCCA 300 CAAGACACAT AGGACTCCAA AGAGTCTGGC CTCACCTCCC TACCATCAAT 350 CCTGCAGAAT CGACCTCTGC TGGCCGGCTA TACCCTGAGG TGCTCTCTCA 400 CTTCCTCCTT CAGGTTCTGA GCAGACAGGC CAACCGGAGA CAGGATTCCC 450 ^ TGGAGGCCAC AGAGGAGCAC CAAGGAGAAG ATCTGTAAGT AAGCCTTTGT 500 TAGAGCCTCT AAGATTTGGT TCTCAGCTGA GGTCTCTCAC ATGCTCCCTC 550 TCTCCGTAGG CCTGTGGGTC CCCATTGCCC AGCTTTTGCC TGCACTCTTG 600 CCTGCTGCCC TGACCAGAGT CATC 624 ATG TCT TCT GAG CAG AAG AGT CAG CAC TGC AAG CCT GAG GAA 666 GGC GTT GAG GCC CAA GAA GAG GCC CTG GGC CTG GTG GGT GCA 708 CAG GCT CCT ACT ACT GAG GAG CAG GAG GCT GCT GTC TCC TCC 750 TCC TCT CCT CTG GTC CCT GGC ACC CTG GAG GAA GTG CCT GCT 792 GCT GAG TCA GCA GGT CCT CCC CAG AGT CCT CAG GGA GCC TCT 834 j GCC TTA CCC ACT ACC ATC AGC TTC ACT TGC TGG AGG CAA CCC 876 f "*l· AAT GAG GGT TCC AGC AGC CAA GAA GAG GAG GGG CCA AGC ACC 918 J*” TCG CCT GAC GCA GAG TCC TTG TTC CGA GAA GCA CTC AGT AAC 960 I '** AAG GTG GAT GAG TTG GCT CAT TTT CTG CTC CGC AAG TAT CGA 1002 ....I GCC AAG GAG CTG GTC ACA AAG GCA GAA ATG CTG GAG AGA GTC 1044 ATC AAA AAT TAG AAG CGC TGC TTT CCT GTG ATC TTC GGC AAA 1086 ! : gcc tcc gag tcc ctg aag atg atc ttt ggc att gac gtg aag 1128 j JIV GAA GTG GAC CCC GCC AGC AAC ACC TAC ACC CTT GTC ACC TGC 1170 ! : V CTG GCC CTT TCC TAT GAT GGC CTG CTG GGT AAT AAT CAG ATC 1212 TTT CCC AAG ACA GGC CTT CTG ATA ATC GTC CTG GGC ACA ATT 1254 *·* GCA ATG GAG GGC GAC AGC GCC TCT GAG GAG GAA ATC TGG GAG > 1296 GAG CTG GGT GTG ATG GGG GTG TAT GAT GGG AGG GAG CAC ACT 1338 . GTC TAT GGG GAG CCC AGG AAA CTG CTC ACC CAA GAT TGG GTG 1380 CAG GAA AAC TAC CTG GAG TAC CGG CAG GTA CCC GGC AGT AAT 1422 .···. CCT GCG CGC TAT GAG TTC CTG TGG GGT CCA AGG GCT CTG GCT 1464 GAA ACC AGC TAT GTG AAA GTC CTG GAG CAT GTG GTC AGG GTC 1506 AAT GCA AGA GTT CGC ATT GCC TAC CCA TCC CTG CGT GAA GCA 1548

v * GCT TTG TTA GAG GAG GAA GAG GGA GTC TGA 157B

.***. GCATGAGTTG CAGCCAGGGC TGTGGGGAAG GGGCAGGGCT GGGCCAGTGC 1528 *·..* ATCTAACAGC CCTGTGCAGC AGCTTCCCTT GCCTCGTGTA ACATGAGGCC 1678 CATTCTTCAC TCTGTTTGAA GAAAATAGTC AGTGTTCTTA GTAGTGGGTT 1728 TCTATTTTGT TGGATGACTT GGAGATTTAT CTCTGTTTCC TTTTACAATT 1778 ....j GTTGAAATGT TCCTTTTAAT GGATGGTTGA ATTAACTTCA GCATCCAAGT 1828 TTATGAATCG TAGTTAACGT ATATTGCTGT TAATATAGTT TAGGAGTAAG 1878 AGTCTTGTTT TTTATTCAGA TTGGGAAATC CGTTCTATTT TGTGAATTTG 1928 i 68 117555 GCACATAATA ACAGCAGTGG AGTAAGTATT TAGAAGTGTG AATTCACCGT 1978 GAAATACGTG AGATAAATTA AAAGATACTT AATTCCCGCC TTAXGCCTCA 2028 GTCTATTCTG TAAAATTTAA AAAXATATAT GCATACCTGG ATTTCCTTGG 2078 CTTCGTGAAT GTAAGAGAAA TTAAATCTGA ATAAATAATT CTTTCTGTTA 2128 ACTGGCTCAT TTCTTCTCTA TGCACTGAGC ATCTGCTCTG TGGAAGGCCC 2178 AGGATTAGTA GTGGAGATAC TAGGGTAAGC CAGACACACA CCTACCGATA 2228 GGGTATTAAG AGTCTAGGAG CGCGGTCATA TAATTAAGGT GACAAGATGT 2278 CCtCTAAGAT GTAGGGGAAA AGTAACGAGT GTGGGTATGG GGCTCCAGGT 2328 GAGAGTGGTC GGGTGTAAAT TCCCTGTGTG GGGCCTTTTG GGCTTTGGGA 2378 AACTGCATTT TCTTCTGAGG GATCTGATTC TAATGAAGCT TGGTGGGTCC 2428 AGGGCCAGAT TCTCAGAGGG AGAGGGAAAA GCCCAGATTG GAAAAGTTGC 2478 TCTGAGCAGT TCCTTTGTGA CAATGGATGA ACAGAGAGGA GCCTCTACCT 2528 GGG 2531 ' , ' jl • 1 · .

* • · ft · • · • · • ΦΦ • · ' .; • · 1 . 1 * 1 · f • 1 · · »· ·· · 1i • · · .:). • · « « Φ · 1 • 1 · • « ·

• I

L

* · · • » · * 1 1 • · · • · • · • · ·

• I

*·1 • · · • i *·· ·1 • 1 * ♦ ··1 « 1 ’ "'·£ a · 9 vii > -· · ' . ·.

117555 69 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO* 14* (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 2531 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA

(ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: MAGE-41 gene (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 14: GGATCCAGGC CCTGCCTGGA GAAATGTCAG GGCCCTCAGT GAAGACAGTG 50 GGGATCATCC ACTCCATGAG AGTGGGGACC TCACAGAGTC CAGCCTACCC 100 TCTTGATGGC ACTGAGGGAC CGGGGCTGTG CTTACAGTCT GCACCCTAAG 150 GGCCCATGGA TTCCTCTCCT AGGAGCTCCA GGAACAAGGC AGTGAGGCCT 200 TGGTCTGAGA CAGTGTCCTC AGGTTACAGA GCAGAGGATG CACAGGCTGT 2S0 GCCAGCAGTG AATGTTTGCC CTGAATGCAC ACCAAGGGCC CCACCTGCCA 300 CAAGACACAT AGGACTCCAA AGAGTCTGGC CTCACCTCCC TACCATCAAT 350 CCTGCAGAAT CGACCTCTGC TGGCCGGCTA TACCCTGAGG TGCTCTCTCA 400 CTTCCTCCTT CAGGTTCTGA CCAGACAGGC CAACCGGAGA CAGGATTCCC 450 TGGAGGCCAC AGAGGACCAC CAAGGAGAAG ATCTGTAAGT AAGCCTTTGT 500 TAGAGCCTCT AAGATTTGGT TCTCAGCTGA GGTCTCTCAC ATGCTCCCTC 550 TCTCCGTAGG CCTGTGGGTC CCCATTGCCC AGCTTTTGCC TGCACTCTTG 600 CCTGCTGCCC TGAGCAGAGT CATC 624 ATG TCT TCT GAG CAG AAG AGT CAG CAC TGC AAG CCT GAG GAA 666 GGC GTT GAG GCC CAA GAA GAG GCC CTG GGC CTG GTG GGT GCG 708 CAG GCT CCT ACT ACT GAG GAG CAG GAG CCT CCT GTC TCC TCC 750 TCC TCT CCT CTG GTC CCT GGC ACC CTG GAG GAA GTG CCT GCT 792 GCT GAG TCA GCA GGT CCT CCC CAG AGT CCT CAG GGA GCC TCT 834 GCC TTA CCC ACT ACC ATC AGC TTC ACT TGC TGG AGG CAA CCC 876 • AAT GAG GGT TCC AGC AGC CAA GAA GAG GAG GGG CCA AGC ACC 918 ..*** TCG CCT GAC GCA GAG TCC TTG TTC CGA GAA GCA CTC AGT AAC 960 AAG GTG GAT GAG TTG GCT CAT TTT CTG CTC CGC AAG TAT CGA 1002 • ** GCC AAG GAG CTG GTC ACA AAG GCA GAA ATG CTG GAG AGA GTC 1044 ····· ATC AAA AAT TAC AAG CGC TGC TTT CCT GTG ATC TTC GGC AAA 1086 . . GCC TCC GAG TCC CTG AAG ATG ATC TTT GGC ATT GAC GTG AAG 1128 ·,· · GAA GTG GAC CCC ACC AGC AAC ACC TAC ACC CTT GTC ACC TGC 1170 I*.·. CTG GGC CTT TCC TAT GAT GGC CTG CTG GGT AAT AAT CAG ATC 1212 ·' ·* TTT CCC AAG ACA GGC CTT CTG ATA ATC GTC CTG GGC ACA ATT 1254 ' gca atg gag ggc gac agc gcc tct gag gag gaa atc tgg gag 1296

* GAG CTG GGT GTG ATG GGG GTG TAT CAT GGG AGG GAG CAC ACT I 133B

GTC TAT GGG GAG CCC AGG AAA CTG CTC ACC CAA GAT TGG GTG 1380 ,·, CAG GAA AAC TAC CTG GAG TAC CGG CAC GTA CCC GGC AGT AAT 1422 CCT GCG CGC TAT GAG TTC CTG TGG GGT CCA AGG GCT CTG GCT 1464 .***. GAA ACC AGC TAT GTG AAA GTC CTG GAG CAT GTG CTC AGG GTC 1506 **··* AAT GCA AGA GTT CGC ATT GCC TAC CCA TCC CTG CGT GAA GCA 1548 .···. GCT TTG TTA GAG GAG GAA GAG GGA GTC TGA 1578 * GCATGAGTTG CAGCCAGGGC TGTGGGGAAG GGGCAGGGCT GGGCCAGTGC 1628 ;***: ATCTAACAGC CCTGTGCAGC AGCTTCCCTT GCCTCGTGTA ACATGAGGCC 1678 . i* *" CATTCTTCAC TCTGTTTGAA GAAAATAGTC AGTGTTCTTA GTAGTGGGTT 1728 TCTATTTTGT TGGATGACTT GGAGATTTAT CTCTGTTTCC TTTTACAATT 1778 :1 GTTGAAATGT TCCTTTTAAT GGATGGTTGA ATTAACTTCA GCATCCAAGT 1828 Ί*** TTATGAATCG TAGTTAACGT ATATTGCTGT TAATATAGTT TAGGAGTAAG 1878 AGTCTTGTTT TTTATTCAGA TTGGGAAATC CGTTCTATTT TGTGAATTTG 1928 GGACATAATA ACAGCAGTGG AGTAAGTATT TAGAAGTGTG AATTCACCGT 1978 70 1 1 7555 GAAATAGGTG ΜλΤλλλΙΤλ AAAGATACTT AATTCCCCCC TTATGCCTCA 2028 GTCTATTCTG TAAAATTTAA AAATATATAT GCATACCTGG ATTTCCTTGG 2078 CTTCGTGAAT GTAAGAGAAA TTAAATCTGA ATAAATAATT CTTTCTGTTA 2128 ACTGGCTCAT TTCTTCTCTA TGCACTGAGC ATCTGCTCTG TGGAAGGCCC 2178 AGGATTAGTA GTGGAGATAC TAGGGTAAGC CAGACACACA CCTACCGATA 2228 GGGTATTAAG AGTCTAGCAG CGCGGTCATA TAATTAAGGT GACAAGATGT 2278 CCTCTAAGAT GTAGGGGAAA AGTAACGAGT GTGGGTATGG GGCTCCAGGT 2328 GAGAGTGGTC GGGTGTAAAT TCCCTGTGTG GGGCCTTTTG GGCTTTGGGA 2378 AACTCCATTT TCTTCTGAGG GATCTGATTC TAATGAAGCT TGGTGGGTCC 2428 AGGGCCAGAT TCTCAGAGGG AGAGGGAAAA GCCCAGATTG GAAAAGTTGC 2478 TCTGAGCGGT TCCT77CTGA CAATGGATGA ACACAGAGGA GCCTCTACCT 2528 GGG 2531 • · · • « · t ** « · * 1· • , t • · • · • · Φ *·1 ··· · • · 1 ' 1 · • · ...

* · • 1 1 • · · * ' • · • · · • t · ·1· • • · · * • · · • · · • · · · · • • · · ' : i'4 • · • ' • · ; 7i - Ί 117555 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NOi 15» (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH: 1068 ba·· pair· (B) TYPE; nuclaic acid (D) TOPOLOGY» linear (ii) MOLECULE TYPE» cDNA to mRNA (ix) FEATURE» (A) NAME/KEY: cDNA MAGE-4 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION» SEQ ID NO» 15» C GGG CCA AGC ACC TCG CCT GAC GCA GAG TCC TTG TTC CGA 40 GAA GCA CTC AGT AAC AAG GTG GAT GAG TTG GCT CAT TTT CTG 82 CTC CGC AAG TAT CGA GCC AAG GAG CTG CTC ACA AAG CCA GAA 124 ATG CTG GAG AGA GTC ATC AAA AAT TAC AAG CGC TGC TTT CCT 166 GTG ATC TTC GGC AAA GCC TCC GAG TCC CTG AAG ATG ATC TTT 208 GGC ATT GAC GTG AAG GAA GTG GAC CCC GCC AGC AAC ACC TAC 250 ACC CTT GTC ACC TGC CTG GGC CTT TCC TAT GAT GGC CTG CTG 292 GGT AAT AAT CAG ATC TTT CCC AAG ACA GGC CTT CTG ATA ATC 334 GTC CTG GGC ACA ATT GCA ATG GAG GGC GAC AGC GCC TCT GAG 376 GAG GAA ATC TGG GAG GAG CTG GGT GTG ATG GGG GTG TAT GAT 418 GGG AGG GAG CAC ACT GTC TAT GGG GAG CCC AGG AAA CTG CTC 460 ACC CAA GAT TGG GTG CAG GAA AAC TAC CTG GAG TAC CGG CAG 602 GTA CCC GGC AGT AAT CCT GCG CGC TAT GAG TTC CTG TGG GGT 544 CCA AGG GCT CTG GCT GAA ACC AGC TAT GTG AAA GTC CTG GAG 586 CAT GTG GTC AGG GTC AAT GCA AGA GTT CGC ATT GCC TAC CCA 628 TCC CTG CGT GAA GCA GCT TTG TTA GAG GAG GAA GAG GGA GTC 670 ! <:

' TGAGCATGAG TTGCAGCCAG GGCTGTGGGG AAGGGGCAGG GCTGGGCCAC 720 K

TGCATCTAAC AGCCCTGTGC AGCAGCTTCC CTTGCCTCGT GTAACATGAG 770 .·. GCCCATTCTT CACTCTGTTT GAAGAAAATA GTCAGTGTTC TTAGTAGTGG 820 ...: GTTTCTATTT TGTTGGATGA CTTGCAGATT TATCTCTGTT TCCTTTTACA 870 ;1.tt ATTGTTGAAA TGTTCCTTTT AATGGATGGT TGAATTAACT TCAGCATCCA 920 * " AGTTTATGAA TCGTAGTTAA CGTATATTGC TGTTAATATA GTTTAGGAGT 970 *:2: AAGAGTCTTG TTTTTTATTC AGATTGGGAA ATCCGTTCTA TTTTGTGAAT 1020 . . TTGGGACATA ATAACAGCAG TGGAGTAAGT ATTTAGAAGT GTGAATTC 1068 • · · • · · · • · · • · · • · • ♦ ···-' • · · • a a

* I

a a a * 1 · ··# • a·..·.

• « a · · • · · • · · • · · a a··.' • · • a • a a •

•»«I

• a •••a 2 • a 117555 72 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO: 16: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 2226 base pair· (B) TYPE: nucleic acid (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA

(ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: MAGE-5 gene (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 16; GGATCCAGGC CTTGCCAGGA GAAAGGTGAG GGCCCTGTGT GAGCACAGAG 50 GGGACCATTC ACCCCAAGAG GGTGGAGACC TCACAGATTC CAGCCTACCC 100 TCCTGTTAGC ACTGGGGGCC TGAGGCTGTG CTTGCAGTCT GCACCCTGAG 150 GGCCCATGCA TTCCTCTTCC AGGAGCTCCA GGAAACAGAC ACTGAGGCCT 200 TGGTCTGAGG CCGTGCCCTC AGGTCACAGA GCAGAGGAGA TGCAGACGTC 250 TAGTGCCAGC AGTGAACGTT TGCCTTGAAT GCACACTAAT GGCCCCCATC 300 GCCCCAGAAC ATATGGGACT CCAGAGCACC TGGCCTCACC CTCTCTACTG 350 TCAGTCCTGC AGAATCAGCC TCTGCTTGCT TGTGTACCCT GACGTGCCCT 400 CTCACTTTTT CCTTCAGGTT CTCAGGGGAC AGGCTGACCA GGATCACCAG 450 GAAGCTCCAG AGGATCCCCA GGAGGCCCTA GAGGAGCACC AAAGGAGAAG 500 ATCTGTAAGT AAGCCTTTGT TAGAGCCTCC AAGGTTCAGT TTTTAGCTGA 550 GGCTTCTCAC ATGCTCCCTC TCTCTCCAGG CCAGTGGGTC TCCATTGCCC 600 AGCTCCTGCC GACACTCCTG CCTGTTGCGG TGACCAGAGT CGTC 644 ATG TCT CTT GAG CAG AAG AGT CAG CAC TGC AAG CCT GAG GAA 684 CTC CTC TGG TCC CAG GCA CCC TGG GGG AGG TGC CTG CTG CTG 728 , GGT CAC CAG GTC CTC TCA AGA GTC CTC AGG GAG CCT CCG CCA 770 TCC CCA CTG CCA TCG ATT TCA CTC TAT GGA GGC AAT CCA TTA 812 AGG GCT CCA GCA ACC AAG AAG AGG AGG GGC CAA GCA CCT CCC 854 , CTG ACC CAG AGT CTG TGT TCC GAG CAG CAC TCA GTA AGA AGG 896 TGG CTG ACT TGA 908 TTCATTTTCT GCTCCTCAAG TATTAAGTCA AGGAGCTGGT CACAAAGGCA 958 * *** GAAATCCTGG ACAGCGTCAT CAAAAATTAC AAGCGCTGCT TTCCTGAGAT 1008 ....: CTTCGGCAAA GCCTCCGAGT CCTTGCAGCT GGTCTTTGGC ATTGACGTGA 1058 AGGAAGCGGA CCCCACCAGC AACACCTACA CCCTTGTCAC CTGCCTGGGA 1108

: CTCCTATGAT GGCCTGCTGG TTGATAATAA TCAGATCATG CCCAAGACGG 1158 :'X

GCCTCCTGAT AATCGTCTTG GGCATCATTG CAATCGAGGG CAAATGCGTC 120B

* ’.· CCTGAGGAGA AAATCTGGGA GGAGCTGAGT GTGATGAAGG TGTATGTTGG 1258 GAGGGAGCAC AGTGTCTGTG GGGAGCCCAG GAAGCTGCTC ACCCAAGATT 1308 *·’ * TGGTGCAGGA AAACTACCTG GAGTACCGGC AGGTGCCCAG CAGTGATCCC, 1358 ATATGCTATG AGTTACTGTG CGGTCCAAGG GCACTCGCTG CTTGAAAGTA 1408 . CTGGACCACG TGGTCAGGGT CAATGCAAGA GTTCTCATTT CCTACCCATC 1458 *.·,· CCTGCGTGAA GCAGCTTTGA GAGAGGAGGA AGAGGCAGTC TGAGCATGAG 1508

.···. CTGCAGCCAG GGCCACTGCG AGGGGGGCTG GGCCAGTGCA CCTTCCAGGG 155B

*...· CTCCGTCCAG TAGTTTCCCC TGCCTTAATG TGACATGAGG CCCATTCTTC 1608 .I. TCTCTTTGAA GAGAGCAGTC AACATTCTTA GTAGTGGGTT TCTGTTCTAT 1658 * TGGATGACTT TGAGATTTGT CTTTGTTTCC TTTTGGAATT GTTCAAATGT 1708 > ,···. TTCTTTTAAT GGGTGGTTGA ATGAACTTCA GCATTCAAAT TTATGAATGA 1758 *···* CAGTAGTCAC ACATAGTGCT GTTTATATAG TTTAGGAGTA AGAGTCTTGT 1808 „\m· TTTTTATTCA GATTGGGAAA TCCATTCCAT TTTGTGAATT GGGACATAGT 1858 * * TACAGCAGTG GAATAAGTAT TCATTTAGAA ATGTGAATGA GCAGTAAAAC 1908 ···»· TGATGACATA AAGAAATTAA AAGATATTTA ATTCTTGCTT ATACTCAGTC 1958 TATTCGGTAA AATTTTTTTT AAAAAATGTG CATACCTGGA TTTCCTTGGC 2008 TTCTTTCAGA ATGTAAGACA AATTAAATCT GAATAAATCA TTCTCCCTGT 2058 117555 ;j 73 TCACTGGCTC ATTTATTCTC TATGCACTCA OCATTTGCTC TGTGGAAGCC 2108 ; CCTGGGTTAA TAGTGGAGAT GCTAAGGTAA GCCAGACTCA CCCCTACCCA 2158 CAGGGTAGTA AAGTCTAGGA GCAGCAGTCA TATAATTAAG GTGGAGAGAT 2208 GCCCTCTAAG ATGTAGAG 2226

• I

t ; . ' : ' . . ! , ,r • : _ . .

' i ί ; ί . ' ,ί • a a - * met1 • · 1 • ·» • a . ·ί fa

» 1 1 -vJ

• 1 · .·''·»

··1 a ·1 a f · I

• · » · ··· .1 • · · ---1 • » «

• I

• • I « a ♦ 1 aaa • · * · .- , i a • a • a a

*··' -J

aa# • a · ' : i • · ···"'/-' ··· * · 1 • a a · i ϊ> ; -..--.-1 74 117555 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO: 17: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: { (A) LENGTH: 2305 base pairs ' (B) TYPE: nucleic acid (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA

(ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: MAGE-51 gene (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 17: GGATCCAGGC CTTGCCAGGA GAAAGGTGAG GGCCCTGTGT GAGCACAGAG 50 GGGACCATTC ACCCCAAGAG GGTGGAGACC TCACAGATTC CAGCCTACCC 100 TCCTGTTAGC ACTGGGGGCC TGAGGCTGTG CTTGCAGTCT GCACCCTGAG 150 GGCCCATGCA TTCCTCTTCC ACGAGCTCCA GGAAACAGAC ACTGAGGCCT 200 TGGTCTGAGG CCGTGCCCTC AGGTCACAGA GCAGAGGAGA TGCAGACGTC 250 TAGTGCCAGC AGTGAACGTT TGCCTTGAAT GCACACTAAT GGCCCCCATC 300 GCCCCAGAAC ATATGGGACT CCAGAGCACC TGGCCTCACC CTCTCTACTG 350 TCAGTCCTGC AGAATCAGCC TCTGCTTGCT TGTGTACCCT GAGGTGCCCT 400

CTCACTTTTT CCTTCAGGTT CTCAGGGGAC AGGCTGACCA GGATCACCAG 450 A

GAAGCTCCAG AGGATCCCCA GGAGGCCCTA GAGGAGCACC AAAGGAGAAG 500 ATCTGTAAGT AACCCTTTGT TAGAGCCTCC AAGGTTCAGT TTTTAGCTGA 550 . i GGCTTCTCAC ATGCTCCCTC TCTCTCCAGG CCAGTGGGTC TCCATTGCCC 600 AGCTCCTGCC CACACTCCTG CCTGTTGCGG TGACCAGAGT CGTC 644 ATG TCT CTT GAG CAG AAG ACT CAG CAC TGC AAG CCT GAG GAA 666 GGC CTT CAC ACC CAA GAA GAG CCC TGG GCC TGG TGG GTG TGC 728 AGG CTG CCA CTA CTG AGG ACC AGG AGG CTG TGT CCT CCT CCT 770 CTC CTC TGG TCC CAG GCA CCC TGG GGC AGG TGC CTG CTG CTG 612 GGT CAC CAG GTC CTC TCA AGA GTC CTC AGG GAG CCT CCG CCA 854 .I. TCC CCA CTG CCA TCG ATT TCA CTC TAT GGA GGC AAT CCA TTA 896 ··· AGG GCT CCA GCA ACC AAG AAG AGG AGG GGC CAA GCA CCT CCC 938 Γ\. CTG ACC CAG AGT CTG TGT TCC GAG CAG CAC TCA GTA AGA AGG 980 * . TGG CTG ACT TGA 992 i TTCATTTTCT GCTCCTCAAG TATTAAGTCA AGGAGCCGGT CACAAAGGCA 1042 : GAAATGCTGG AGAGCGTCAT CAAAAATTAC AAGCGCTGCT TTCCTGAGAT 1092 :.: : cttcggcaaa gcctccgagt ccttgcagct ggtctttggc attgacgtga 1142 ! AGGAAGCGGA CCCCACCAGC AACACCTACA CCCTTGTCAC CTGCCTGGGA 1192 *..· CTCCTATGAT GGCCTGGTGG TTTAATCAGA TCATGCCCAA GACGGGCCTC 1242 :,: : ctgataatcc tcttgggcat gattgcaatg gagggcaaat gcgtccctga , 1292 GGAGAAAATC TGGGAGGAGC TGGGTGTGAT GAAGGTGTAT GTTGGGAGGG 1342 ] AGCACAGTGT CTGTGGGGAG CCCAGGAAGC TGCTCACCCA AGATTTGGTG 1392 \

. CAGGAAAACT ACCTGGAGTA CCGCAGGTGC CCAGCAGTGA TCCCATATGC 1442 I

**|·* TATGAGTTAC TGTGGGGTCC AAGGGCACTC GCTGCTTGAA AGTACTGGAG 1492 : : CACGTGGTCA GGGTCAATGC AAGAGTTCTC ATTTCCTACC CATCCCTGCA 1542 T TGAAGCAGCT TTGAGAGAGG AGGAAGAGGG AGTCTGAGCA TGAGCTGCAG 1592 CCACGGCCAC TGCCAGGGGG GCTGGGCCAG TGCACCTTCC AGGGCTCCGT 1642 *.. CCAGTAGTTT CCCCTGCCTT AATGTCACAT GAGGCCCATT CTTCTCTCTT 1692 :,,,: TGAAGAGAGC ΑσΤΟΑΑΟλΤΤ CTTAGTAGTG GGTTTCTGTT CTATTGGATG 1742 1 ·’, ACTTTGAGAT TTGTCTTTGT TTCCTTTTGG AATTGTTCAA ATGTTCCTTT 1792 r *:*·: TAATGGGTGG TTGAATGAAC TTCAGCATTC AAATTTATGA ATGACAGTAG 1842 ,. TCACACATAG TGCTGTTTAT ATAGTTTAGG AGTAAGAGTC TTGTTTTTTA 1892 '·"· TTCAGATTGG GAAATCCATT CCATTTTGTG AATTGGGACA TAGTTACAGC 1942 AGTGGAATAA GTATTCATTT AGAAATGTGA ATGAGCAGTA AAACTGATGA 1992 GATAAAGAAA TTAAAAGATA TTTAATTCTT GCCTTATACT CAGTCTATTC 2042

·''··’ * I

75 117555 GGTAAAATTT TTTTTTAAAK ATGTGCATAC CTGGATTTCC TTGGCTTCTT 2092 TGAGAATGTA AGACAAATTA AATCTGAATA AATCATTCTC CCTGTTCACT 2142 GGCTCATTTA TTCTCTATGC ACTGAGCATT TGCTCTGTGG AAGGCCCTGG 2192 GTTAATAGTG GAGATGCTAA GGTAAGCCAG ACTCACCCCT ACCCACAGGG 2242 TAGTAAAGTC TAGGAGCAGC AGTCATATAA TTAAGGTGGA GAGATGCCCT 2292 CTAAGATGTA GAG 2305 ..1 . 1 ' , i 'w ...

• · · ·«· ·· • 1 • ·· #·.·' • · • · • · · • · 1 · 1' ·# · .

• » · • · • 1 • · · • · 1 * I .

• · ·

• · · 'I

··« t ·1« [ • · 1

• 1 J

·1· 'f • · · • ·1 ···.· .

• · · 76 117555 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO: 18: <i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 225 base pair· (B) TYPE: nucleic acid (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: CDNA

(ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: MAGE-6 gene (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 18: TAT TTC TTT CCT GTG ATC TTC AGC AAA GCT TCC GAT TCC TTG 42 CAG CTG GTC TTT GGC ATC GAG CTG ATG GAA GTG GAC CCC ATC 84 GGC CAC GTG TAC ATC TTT GCC ACC TGC CTG GGC CTC TCC TAC 126 GAT GGC CTG CTG GGT GAC AAT CAG ATC ATG CCC AGG ACA GGC 168 TTC CTG ATA ATC ATC CTG GCC ATA ATC GCA AGA GAG GGC GAC 210 TGT GCC CCT GAG GAG 225 • · · ··*· ·· • ♦ • *· *···· ...

• · • * V · * • · · ··* · ·· · Φ a ·** • · ♦ • ♦ · • · · • * · ··· " *·· - «** • · · • · · • · · • · • · ··· • ··*·· ·«··· • · •f „ 117555 77 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO: 19: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH; 1947 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA

(ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: MACE-7 gene (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 19:

TGAATGOACA ACAAGGGCCC CACACTCCCC AGAACACAAG GGACTCCAGA SO

GAGCCCAGCC TCACCTTCCC TACTGTCAGT CCTGCAGCCT CAGCCTCTGC 100

TGGCCGGCTG TACCCTGAGG TGCCCTCTCA CTTCCTCCTT CAGGTTCTCA ISO

GCGGACACGC CGGCCAGGAG GTCAGAAGCC CCAGGAGGCC CCAGAGGAGC 200 ACCCAAGGAG AAGATCTGTA AGTAGGCCTT TGTTAGGGCC TCCAGGGCGT 250 GGTTCACAAA TGAGGCCCCT CACAAGCTCC TTCTCTCCCC ACATCTGTGG 300 GTTCCTCCCC ATCGCCCAGC TGCTGCCCGC ACTCCAGCCT GCTGCCCTGA 350 CCAGAGTCAT CATGTCTTCT GAGCAGAGGA GTCAGCACTG CAAGCCTGAG 400 GATGCCTTGA GGCCCAAGGA CAGGAGGCTC TGGGCCTGGT GGGTGCGCAG 450 GCTCCCGCCA CCGAGGAGCA CGAGGCTGCC TCCTCCTTCA CTCTGATTGA 500 AGGCACCCTG GAGGAGGTGC CTGCTGCTGG GTCCCCCAGT CCTCCCCTGA 550 GTCTCAGGGT TCCTCCTTTT CCCTGACCAT CAGCAACAAC ACTCTATGGA 600 GCCAATCCAG TGAGGGCACC AGCAGCCGGG AAGAGGAGGG GCCAACCACC 650 TAGACACACC CCGCTCACCT GGCGTCCTTG TTCCA 685 ATG GGA AGG TGG CTG ACT TGG TTC GCT TCC TGC TGC ACA AGT 727 ATC GAG TCA AGG AGC TGG TCA CAA AGG CAG AAA TGC TGG ACA 769 GTG TCA TCA AAA ATT ACA AGC ACT AGT TTC CTT GTG ATC TAT 811 GGC AAA GCC TCA GAG TGC ATG CAG GTG ATG TTT GGC ATT GAC B53 ATG AAG GAA GTG GAC CCC GCG GCC ACT CCT ACG TCC TTG TCA B95 CCT GCT TGG GCC TCT CCT ACA ATG GCC TGC TGG GTG ATG ATC 937 .*·. AGA GCA TGC CCG AGA CCG GCC TTC TGA 964 * ” TTATGGTCTT GACCATGATC TTAATGGAGG GCCACTGTGC CCCTGAGGAG 1014 "**: GCAATCTGGG AAGCGTTGAG TGTAATGGTG TATGATGGGA TGGAGCAGTT 1064 . TCTTTGGGCA GCTGAGGAAG CTGCTCACCC AAGATTGGGT GCAGGAAAAC 1114 i TACCTGCAAT ACCGCCAGGT GCCCAGCAGT GATCCCCCGT GCTACCAGTT 1164 CCTGTGGGGT CCAAGGGCCC TCATTGAAAC CAGCTATGTG AAAGTCCTGG 1214 ; ? ·* AGTATGCAGC CAGGGTCAGT ACTAAAGAGA GCATTTCCTA CCCATCCCTG 1264 CATGAAGAGG CTTTGGGAGA GGAGGAAGAG GGAGTCTGAG CAGAAGTTGC 1314 AGCCAGGGCC AGTGGGGCAG ATTGGGGGAG GGCCTGGGCA GTGCACGTTC1 1364 CACACATCCA CCACCTTCCC TGTCCTGTTA CATGAGGCCC ATTCTTCACT 1414 . .·. CTGTGTTTGA AGAGAGCAGT CAATGTTCTC AGTAGCGGGG AGTGTGTTGG 1464 GTGTGAGGGA ATACAAGGTG GACCATCTCT CAGTTCCTGT TCTCTTGGGC 1514 .***. GATTTGGAGG TTTATCTTTG TTTCCTTTTG CAGTCGTTCA AATGTTCCTT 1564 TTAATGGATG GTGTAATCAA CTTCAACATT CATTTCATGT ATGACAGTAG 1614 .’I*. GCAGACTTAC TGTTTTTTAT ATAGTTAAAA GTAAGTGCAT TGTTTTTTAT 1664 TTATGTAAGA AAATCTATGT TATTTCTTGA ATTGGGACAA CATAACATAG 1714 CAGAGGATTA AGTACCTTTT ATAATGTGAA ACAACAAAGC GCTAAAATGG 1764 GTGAGATAAA GAAATAAAGA AATTAAATTG GCTGGGCACG GTGGCTCACG 1814 ·;··; CCTGTAATCC CAGCACTTTA GGAGGCAGAG GCACGGGGAT CACGAGGTCA 1864 i GGAGATCGAG ACCATTCTGG CTAACACACT GAAACACCAT CTCTATTAAA 1914 “*“ AATACAAAAC TTAGCCGGGC GTGGTGGCGG GTG 1947 I' 78 117555 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO: 20: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1810 baee pair· (B) TYPE: nucleic acid (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA

(lx) FEATURE: (A) NAME/KEY: MAGE-8 gen· (xi) SEQUENCE DESCRIPTION; SEQ ID NO: 20:

'LU

GAGCTCCAGG AACCAGGCTG TGAGGTCTTG GTCTGAGGCA GTATCTTCAA 50 TCACAGAGCA TAAGAGGCCC AGGCAGTAGT AGCAGTCAAG CTGAGGTGGT 100 GTTTCCCCTG TATGTATACC AGAGGCCCCT CTGGCATCAG AACAGCAGGA 150 ACCCCACAGT TCCTGGCCCT ACCAGCCCTT TTGTCAGTCC TGGAGCCTTG 200 GCCTTTGCCA GGAGGCTGCA CCCTGAGATG CCCTCTCAAT TTCTCCTTCA 250 GGTTCGCAGA GAACAGGCCA GCCAGGAGGT CAGGAGGCCC CAGAGAAGCA 300 CTGAAGAAGA CCTGTAAGTA GACCTTTGTT AGGGCATCCA GGGTGTAGTA 350 CCCAGCTGAG GCCTCTCACA CGCTTCCTCT CTCCCCAGGC CTGTGGGTCT 400 CAATTGCCCA GCTCCGGCCC ACACTCTCCT GCTGCCCTGA CCTGAGTCAT 450 C 451 ATG CTT CTT GGG CAG AAG ACT CAG CGC TAC AAG GCT GAG GAA 493 GGC CTT CAG GCC CAA GGA CAG GCA CCA GGG CTT ATG GAT GTG 535 CAG ATT CCC ACA GCT GAG GAG CAG AAG GCT GCA TCC TCC TCC S77 TCT ACT CTG ATC ATG GGA ACC CTT GAG GAG GTG ACT GAT TCT 619 GGG TCA CCA ACT CCT CCC CAG ACT CCT GAG GGT GCC TCC TCT 661 TCC CTG ACT GTC ACC GAC AGC ACT CTG TGG AGC CAA TCC GAT 703 GAG GGT TCC AGC AGC AAT GAA GAG GAG GGG CCA AGC ACC TCC 745 CCG GAC CCA GCT CAC CTG GAG TCC CTG TTC CGG GAA GCA CTT 787 GAT GAG AAA GTG GCT GAG TTA GTT CGT TTC CTG CTC CGC AAA 829 ··· TAT CAA ATT AAG GAG CCG GTC ACA AAG GCA CAA ATG CTT GAG 871 ACT GTC ATC AAA AAT TAC AAG AAC CAC TTT CCT GAT ATC TTC 913 • *.. AGC AAA GCC TCT GAG TGC ATG CAG GTG ATC TTT GGC ATT GAT 955 GTG AAG GAA GTG GAC CCT GCC GGC CAC TCC TAC ATC CTT GTC 997 * ** ACC TGC CTG GGC CTC TCC TAT GAT CGC CTG CTG GGT GAT GAT 1039 j .*. CAG ACT ACG CCC AAG ACC GGC CTC CTG ATA ATC GTC CTG GGC 1081 j**/ ATG ATC TTA ATG GAG CGC AGC CGC GCC CCG GAG GAG GCA ATC 1123 ί TGG GAA GCA TTG AGT GTG ATG GGG GCT GTA TGA 1156 TGGGAGGGAG CACAGTGTCT ATTGGAAGCT CAGGAAGCTG CTCACCCAAG 1206 V * AGTGGGTGCA GGAGAACTAC CTGGAGTACC GCCAGGCGCC CGGCAGTGAT , 1256 CCTGTGCGCT ACGAGTTCCT GTGGGGTCCA AGGGCCCTTG CTGAAACCAG 1306 CTATGTGAAA GTCCTGGAGC ATGTGGTCAG GGTCAATGCA AGAGTTCGCA 1356 : tttcctaccc atccctgcat gaagagcctt tgggagagga gaaaggagtt i406 !!,' TGAGCAGGAG TTGCAGCTAG GGCCAGTGGG GCAGGTTGTG GCAGGGCCTG 1456 ·...· GGCCAGTCCA CGTTCCAGGG CCACATCCAC CACTTTCCCT GCTCTGTTAC 1506 ATGAGGCCCA TTCTTCACTC TGTGTTTGAA GAGAGCAGTC ACAGTTCTCA 1556 ::: gtagtgggga ccatgttggg tgtgagggaa cacagtgtgg accatctctc i606 AGTTCCTGTT CTATTCGGCG ATTTGGAGGT TTATCTTTGT TTCCTTTTGG 1656 %..· AATTGTTCCA ATGTTCCTTC TAATGGATGG TGTAATGAAC TTCAACATTC 1706 fj * . ATTTTATGTA TCACAGTAGA CAGACTTACT GCTTTTTATA TAGTTTAGGA 1756 | GTAAGAGTCT TGCTTTTCAT TTATACTGGG AAACCCATGT TATTTCTTGA 1806 jj ....: attc 1810 • * 117555 79 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO» 21» (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1412 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (D) TOPOLOGY: linear

(iij MOLECULE TYPE: genomic DNA

(lx) FEATURE: (A) NAME/KEY: MAGE-9 gene (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 21: TCTGAGACAG TGTCCTCAGG TCGCAGAGCA GAGGAGACCC AGGCAGTGTC 50 AGCAGTGAAG GTGAAGTGTT CACCCTGAAT GTGCACGAAG GGCCCCACCT 100 GCCCCAGCAC ACATGGGACC CCATAGCACC TGGCCCCATT CCCCCTACTG 150 TCACTCATAG AGCCTTGATC TCTGCAGGCT AGCTGCACGC TGAGTAGCCC 200 TCTCACTTCC TCCCTCAGGT TCTCGGGACA GGCTAACCAG GAGGACAGGA 250 GCCCCAAGAG GCCCCAGAGC AGCACTGACG AAGACCTGTA AGTCAGCCTT 300 TGTTAGAACC TCCAAGGTTC GGTTCTCAGC TGAAGTCTCT CACACACTCC 350 CTCTCTCCCC AGGCCTGTGG GTCTCCATCG CCCAGCTCCT GCCCACGCTC 400 CTGACTGCTG CCCTGACCAG AGTCATC 427 ATG TCT CTC GAG CAG AGG AGT CCG CAC TGC AAG CCT GAT GAA 469 GAC CTT GAA GCC CAA GGA GAG GAC TTG GGC CTG ATG GGT GCA 511 CAG GAA CCC ACA GGC GAG GAG GAG GAG ACT ACC TCC TCC TCT 553 GAC AGC AAG GAG GAG GAG GTG TCT GCT GCT GGG TCA TCA AGT 595 CCT CCC CAG AGT CCT CAG GGA GGC GCT TCC TCC TCC ATT TCC 637 CTC TAC TAC ACT TTA TGG AGC CAA TTC GAT GAG GGC TCC AGC 679 AGT CAA GAA GAG GAA GAG CCA AGC TCC TCC GTC GAC CCA GCT 721 CAG CTG GAG TTC ATG TTC CAA GAA GCA CTG AAA TTG AAG GTG 763 GCT GAG TTG GTT CAT TTC CTG CTC CAC AAA TAT CGA GTC AAG 805 ··♦ GAG CCG GTC ACA AAG CCA GAA ATG CTG GAG AGC GTC ATC AAA 847 11“ AAT TAC AAG CCC TAC TTT CCT GTG ATC TTC GGC AAA GCC TCC 889 : 1·· GAG TTC ATG CAG GTG ATC TTT GCC ACT GAT GTG AAG GAG GTG 931 GAC CCC GCC GGC CAC TCC TAC ATC CTT GTC ACT GCT CTT GGC 973 * CTC TCG TGC GAT AGC ATG CTG GGT GAT GGT CAT AGC ATG CCC 1015 1 • AAG GCC GCC CTC CTG ATC ATT GTC CTG GGT GTG ATC CTA ACC 1057 “V AAA GAC AAC TGC GCC CCT GAA GAG GTT ATC TGG GAA GCG TTG 1099 • \l AGT GTG ATG GGG GTG TAT GTT GGG AAG GAG CAC ATG TTC TAC 1141 GGG GAG CCC AGG AAG CTG CTC ACC CAA GAT TGG GTG CAG GAA 1183 *·1 1 AAC TAC CTG GAG TAC CGG CAG GTG CCC GGC AGT GAT CCT GCG, 1225 CAC TAC GAG TTC CTG TGG GGT TCC AAG GCC CAC GCT GAA ACC 1267 φ AGC TAT GAG AAG GTC ATA AAT TAT TTG GTC ATG CTC AAT GCA 1309 !J#: AGA GAG CCC ATC TGC TAC CCA TCC CTT TAT GAA GAG GTT TTG 1351 .••I, GGA CAG GAG CAA GAG GGA GTC TGA 1375 GCACCAGCCG CAGCCGGGGC CAAAGTTTGT GGGGTCA 1412 • • · e • · e ♦ ·· e e e e »e • e ··· e · e e · so 1 1 7555 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO: 22t (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS! -;! (A) LENGTH: 920 ba·· pair· (Bj TYPE: nucleic acid (0) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA

(ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: MAGE-10 gene (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 22: ACCTGCTCCA GGACAAAGTO GACCCCACTG GATCAGCTCC ACCTACCCTA 50 CTGTCAGTCC TGGAGCCTTG GCCTCTGCCG GCTGCATCCT GAGGAGCCAT 100 CTCTCACTTC CTTCTTCAGG TTCTCAGGGG ACAGGGAGAG CAAGAGGTCA 150 AGAGCTGTGG GACACCACAG AGCAGCACTG AAGGAGAAGA CCTGTAAGTT 200 GGCCTTTGTT AGAACCTCCA GGGTGTGGTT CTCAGCTGTG GCCACTTACA 250 CCCTCCCTCT CTCCCCAGGC CTGTGGGTCC CCATCGCCCA AGTCCTGCCC 300 ACACTCCCAC CTGCTACCCT GATCAGAGTC ATC 333 ATG CCT CCA GCT CCA AAG CGT CAG CGC TGC ATG CCT GAA GAA 375 GAT CTT CAA TCC CAA AGT GAG ACA CAG GGC CTC GAG GGT GCA 417 CAG GCT CCC CTG GCT GTG GAG GAG GAT GCT TCA TCA TCC ACT 459 TCC ACC AGC TCC TCT TTT CCA TCC TCT TTT CCC TCC TCC TCC 501 TCT TCC TCC TCC TCC TCC TGC TAT CCT CTA ATA CCA AGC ACC 543 CCA GAG GAG GTT TCT GCT GAT GAT GAG ACA CCA AAT CCT CCC 585 CAG AGT GCT CAG ATA GCC TGC TCC TCC CCC TCG GTC GTT GCT 627 TCC CTT CCA TTA GAT CAA TCT GAT GAG GGC TCC AGC AGC CAA 669 AAG GAG GAG AGT CCA AGC ACC CTA CAG GTC CTG CCA GAC AGT 711 GAG TCT TTA CCC AGA AGT GAG ATA GAT GAA AAG GTG ACT CAT 753 TTG GTG CAG TTT CTG CTC TTC AAG TAT CAA ATG AAG GAG CCG 795 ATC ACA AAG GCA GAA ATA CTG GAG AGT GTC ATA AAA AAT TAT 837 *:1 GAA GAC CAC TTC CCT TTG TTG TTT AGT GAA GCC TCC GAG TGC 879 •V ATG CTG CTG GTC TTT GGC ATT GAT GTA AAG GAA GTG GAT CC 920 e ee • • e«t«t e e e e e e e • e e • ee e ·» e e e • e · ·:!?': e · e e • ee • e · e e e • I 1 ♦ • · e e e · ee1 • ee

• · »I

• · U

• ee • · · • e e ··· ♦ e • e • 1 • •••a * 1 i e ♦ · 117555 81 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO: 23t (i) SEQUENCE CHARACTERISTICSs (A) LENGTH: 1107 baa· pairs (B) TYPE: nucleic acid (0) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA

(ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: MAGE-11 gene (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 23: . . ' ’ yA1

AGAGAACAGG CCAACCTGGA GGACAGGAGT CCCAGGAGAA CCCAGAGGAT SO

CACTCGAGGA GAACAAGTGT AAGTAGGCCT TTGTTAGATT CTCCATGGTT 100 1 CATATCTCAT CTGAGTCTGT TCTCACGCTC CCTCTCTCCC CAGGCTGTGG 150 GGCCCCATCA CCCAGATATT TCCCACAGTT CGGCCTGCTG ACCTAACCAG 200 AGTCATCATG CCTCTTGAGC AAAGAAGTCA GCACTGCAAG CCTGAGGAAG 250 CCTTCAGGCC CAAGAAGAAG ACCTGGGCCT GGTGGGTGCA CAGGCTCTCC 300 AAGCTGAGGA GCAGGAGGCT GCCTTCTTCT CCTCTACTCT GAATGTGGGC 350 ACTCTAGAGG AGTTGCCTGC TGCTGAGTCA CCAAGTCCTC CCCAGAGTCC 400 TCAGGAAGAG TCCTTCTCTC CCACTGCCAT GGATGCCATC TTTGGGAGCC 450 TATCTGATGA GGGCTCTGGC AGCCAAGAAA AGGAGGGGCC AAGTACCTCG 500 CCTGACCTGA TAGACCCTGA GTCCTTTTCC CAAGATATAC TACATGACAA 550 GATAATTGAT TTGGTTCATT TATTCTCCGC AAGTATCGAG TCAAGGGGCT 600 GATCACAAAG GCAGAA 616 ATG CTC GGG ACT GTC ATC AAA AAT TAT GAG GAC TAC TTT CCT 658 GAG ATA TTT AGG GAA GCC TCT GTA TGC ATG CAA CTG CTC TTT 700 GGC ATT GAT GTG AAG GAA GTG GAC CCC ACT AGC CAC TCC TAT 742 GTC CTT GTC ACC TCC CTC AAC CTC TCT TAT GAT GGC ATA CA0 784 .:. TGT AAT GAG CAG AGC ATG CCC AAG TCT GGC CTC CTG ATA ATA 826

··" GTC CTG GGT GTA ATC TTC ATG GAG GGG AAC TGC ATC CCT GAA 86B

Ϊ1·.. GAG GTT ATG TGG GAA GTC CTG AGC ATT ATG GGG GTG TAT GCT 910 . GGA AGG GAG CAC TTC CTC TTT GGG GAG CCC AAG AGG CTC CTT 952 **’’1 ACC CAA AAT TGG GTG CAG GAA AAG TAC CTG GTG TAC CGG CAG 994 : .·. GTG CCC GGC ACT GAT CCT GCA TGC TAT GAG TTC CTG TGG GGT 1036 : CCA AGG GCC CAC GCT GAG ACC AGC AAG ATG AAA GTT CTT GAG 1078 ·1·1; TAC ATA GCC AAT GCC AAT GGG AGG GAT CC 1107 t e 111 * 1 1 e e e .

• I

• · ♦ • e · ft: • · e • e e e eee •

• M

nee e·· • *11 e · • e

«II

• e • · · e e * · « · · · e a e 82 1 1 7555 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NOt 24: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 2150 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA * (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: amage-I

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 24: TCTCTCTGCA TATCCCTCCA CTTGTGTGTA GCAGTCTCAA ATGGATCTCT 50 CTCTACAGAC CTCTGTCTGT GTCTGGCACC CTAAGTGGCT TTGCATGGGC 100

ACAGGTTTCT GCCCCTGCAT GGAGCTTAAA TAGATCTTTC TCCACAGGCC ISO

TATACCCCTG CATTGTAAGT TTAAGTGGCT TTATGTGGAT ACAGGTCTCT 200 GCCCTTGTAT GCAGGCCTAA GTTTTTCTGT CTGCTTAACC CCTCCAAGTG 250 · AAGCTAGTGA AAGATCTAAC CCACTTTTGG AAGTCTGAAA CTAGACTTTT 300 ATGCAGTGGC CTAACAAGTT TTAATTTCTT CCACAGGGTT TGCAGAAAAG 350 AGCTTGATCC ACGAGTTCAG AAGTCCTGGT ATGTTCCTAG AAAG 394 ATG TTC TCC TGG AAA GCT TCA AAA GCC AGG TCT CCA TTA AGT 436 CCA AGG TAT TCT CTA CCT GGT AGT ACA GAG GTA CTT ACA GGT 478 TGT CAT TCT TAT CCT TCC AGA TTC CTG TCT GCC AGC TCT TTT 520 ! ACT TCA GCC CTG AGC ACA GTC AAC ATG CCT AGG GGT CAA AAG 565 AGT AAG ACC CGC TCC CGT GCA AAA CGA CAG CAG TCA CGC AGG 604 GAG CTT CCA GTA GTT CAG CCC ACT GCA GAG GAA GCA GGG TCT 646 TCT CCT GTT GAC CAG AGT GCT GGG TCC AGC TTC CCT GGT GGT 688 TCT GCT CCT CAG GGT GTG AAA ACC CCT GGA TCT TTT GGT GCA 730 j GGT GTA TCC TGC ACA GGC TCT GGT ATA GGT GGT AGA AAT GCT 772 j GCT GTC CTG CCT GAT ACA AAA AGT TCA GAT GGC ACC CAG GCA 814 ( *** GGG ACT TCC ATT CAG CAC ACA CTG AAA GAT CCT ATC ATG AGG 856 II'* AAC GCT AGT GTC CTG ATA GAA TTC CTG CTA GAT AAA TTT AAG 898 : *·· ATG AAA GAA GCA GTT ACA AGG AGT GAA ATG CTG GCA GTA GTT 940 ....: AAC AAG AAG TAT AAG GAG CAA TTC CCT GAG ATC CTC AGG AGA 982

ACT TCT GCA CGC CTA GAA TTA GTC TTT GGT CTT GAG TTG AAG 1024 : GAA ATT GAT CCC AGC ACT CAT TCC TAT TTG CTG GTA GGC AAA 1066 I

‘IV CTG GGT CTT TCC ACT GAG GGA AGT TTG AGT AGT AAC TGG GGG 1108 V

• V TTG CCT AGG ACA GGT CTC CTA ATG TCT GTC CTA GGT GTG ATC 1150 TTC ATG AAG GGT AAC CGT GCC ACT GAG CAA GAG GTC TGG CAA 1192 V ‘ TTT CTG CAT GGA GTG GGG GTA TAT GCT GGG AAG AAG CAC TTG, 1234 ATC TTT GGC GAG CCT GAG GAG TTT ATA AGA GAT GTA GTG CGG 1276 . GAA AAT TAC CTG GAG TAC CGC CAG GTA CCT GGC AGT GAT CCC 1314 j V.* CCA AGC TAT GAG TTC CTG TGG GGA CCC AGA GCC CAT GCT GAA 1360 ,···. ACA ACC AAG ATG AAA GTC CTG GAA GTT TTA GCT AAA GTC AAT 1402 *...* GGC ACA GTC CCT AGT GCC TTC CCT AAT CTC TAC CAG TTG GCT 1444 .1. CTT AGA GAT CAG GCA GGA GGG GTG CCA AGA AGG AGA GTT CAA I486 V * GGC AAG GGT GTT CAT TCC AAG GCC CCA TCC CAA AAG TCC TCT 1528 .*·*. AAC ATG TAG 1537 ’···* TTGAGTCTGT TCTGTTCTCT TTGAAAAACA GTCAGGCTCC TAATCAGTAG 1587 AGAGTTCATA GCCTACCACA ACCAACATGC ATCCATTCTT GGCCTGTTAT 1637 ACATTAGTAG AATGGAGGCT ATTTTTCTTA CTTTTCAAAT GTTTGTTTAA 1687 ....: CTAAACAGTG CTTTTTGCCA TCCTTCTTGT TAACTGCATA AAGAGGTAAC 1737 TGTCACTTGT CAGATTAGGA CTTGTTTTGT TATTTGCAAC AAACTGGAAA 1787 83 1 17 5 5 5 . Il ACATTATTTT GTTTTTACTA AAACATTGTG TAACATTGCA TTGGAGAAGG 1837 GATTGTCATG GCAATGTGAT ATCATACAGT GGTGAAACAA CAGTGAAGTG 1887 GGAAAGTTTA TATTGTTAAT TTTGAAAATT TTATGAGTGT GATTGCTGTA 1937 TACTTTTTTC TTTTTTGTAT AATGCTAAGT GAAATAAAGT TGGATTTGAT 1987 GACTTTACTC AAATTCATTA GAAAGTAAAT CGTAAAACTC TATTACTTTA 2037 TTATTTTCTT CAATTATGAA TTAAGCATTG GTTATCTGGA AGTTTCTCCA 2087 GTAGCACAGG ATCTAGTATG AAATGTATCT AGTATAGGCA CTGACAGTGA 2137 GTTATCAGAG TCT 2150 - i 11 • ' ... 11

I

'11 il ; .1! iJl • · j ·»· #··· ·· ♦ « • ··

• 1 I

t · • · · • · · r ···· • · » • · · * · .

• · • · · • · ♦ • · · * « · • · 1 ·1· • · ♦ » • 1 ··· «·« • · ·

♦ · · .H

• · i ··1 • · • · ' ii ·♦1 -:1 • · · Q4 1 17555 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NOt 25* (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS! (A) LENGTH: 2099 baa· pair· (B) TYPE: nucleic acid (D) TOPOLOGY! linear (ii) MOLECULE TYPE* genomic DNA (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY! amage-II (xi) SEQUENCE DESCRIPTION! SEQ ID NO* 25: ACCTTATTGG GTCTGTCTGC ATATGCCTCC ACTTGTGTGT AGCAGTCTCA 50 AATGGATCTC TCTCTACAGA CCTCTGTCTG TGTCTGGCAC CCTAAGTGGC 100 i TTTGCATGGG CACAGGTTTC TGCCCCTGCA TGGAGCTTAA ATAGATCTTT 150 i; CTCCACAGGC CTATACCCCT GCATTGTAAG TTTAAGTGGC TTTATGTGGA 200 TACAGGTCTC TGCCCTTGTA TGCAGGCCTA AGTTTTTCTG TCTGCTTAGC 250 CCCTCCAAGT GAAGCTAGTG AAAGATCTAA CCCACTTTTG GAACTCTGAA 300 ACTAGACTTT TATGCAGTGG CCTAACAAGT TTTAATTTCT TCCACAGGGT 350 TTGCAGAAAA GAGCTTGATC CACGAGTTCG GAAGTCCTGG TATGTTCCTA 400 GAAAGATGTT CTCCTGGAAA GCTTCAAAAG CCAGGTCTCC ATTAAGTCCA 450 AGGTATTCTC TACCTGGTAG TACAGAGGTA CTTACAGGTT GTCATTCTTA 500 TCTTTCCAGA TTCCTGTCTG CCAGCTCTTT TACTTCAGCC CTGAGCACAG 550 TCAACATGCC TAGGGGTCAA AAGAGTAAGA CCCGCTCCCC TGCAAAACGA 600 CAGCAGTCAC GCAGGGAGGT TCCAGTAGTT CAGCCCACTG CAGAGGAAGC 650 % AGGGTCTTCT CCTGTTGACC AGAGTGCTGG GTCCAGCTTC CCTGGTGGTT 700 CTCCTCCTGA GGGTGTGAAA ACCCCTGGAT CTTTTGGTGC AGGTGTATCC 750 jj

TGCACAGGCT CTGGTATAGG TGGTAGAAAT GCTGCTGTCC TGCCTGATAC BOO

AAAAAGTTCA GATGGCACCC AGGCAGGGAC TTCCATTCAG CACACACTGA 850 AAGATCCTAT CATGAGGAAG GCTAGTGTGC TGATAGAATT CCTGCTAGAT 900 .t. AAGTTTAAGA TGAAACAAGC AGTTACAAGG AGTGAAATGC TGGCAGTAGT 950 ···· TAACAAGAAG TATAAGGAGC AATTCCCTGA GATCCTCAGG AGAACTTCTG 1000 CACGCCTAGA ATTAGTCTTT GGTCTTGAGT TGAAGGAAAT TGATCCCAGC 1050 * , ACTCATTCCT ATTTGCTGGT AGGCAAACTG GGTCTTTCCA CTGAGGGAAG 1100 ***** TTTGAGTAGT AACTGCCGGT TGCCTAGGAC AGGTCTCCTA ATGTCTGTCC 1150 ; ,·, TAGGTGTGAT CTTCATGAAG GGTAACCGTG CCACTGAGCA AGAGGTCTGG 1200 ί.ί Ϊ CAATTTCTGC ATGGAGTGGG GGTATATGCT GGGAAGAAGC ACTTGATCTT 1250 *·*· TGGCGAGCCT GAGGAGTTTA TAAGAGATGT AGTGCGGGAA AATTACCTGG 1300 *.,* AGTACCGCCA GGTACCTGGC AGTGATCCCC CAAGCTATGA GTTCCTGTGG 1350 :,: : ggacccagag cccatgctga aacaaccaag ATGAAAGTCC TGGAAGTTTT 1400 AGCTAAAGTC AATGGCACAG TCCCTAGTGC CTTCCCTAAT CTCTACCAGT ' 1450 TGGCTCTTAG AGATCAGGCA GGAGGGGTGC CAAGAAGGAG AGTTCAAGGC 1500 AAGGGTGTTC ATTCCAAGGC CCCATCCCAA AAGTCCTCTA ACATGTAGTT 1550 '"f GAGTCTGTTC TGTTGTGTTT GAAAAACAGT CAGGCTCCTA ATCAGTAGAG 1600 / AGTTCATAGC CTACCAGAAC CAACATGCAT CCATTCTTGG CCTGTTATAC 1650 *1' ATTAGTAGAA TGGAGGCTAT TTTTGTTACT TTTCAAATGT TTGTTTAACT 1700 :*;'· AAACAGTGCT TTTTGCCATG CTTCTTGTTA ACTGCATAAA GAGGTAACTG 1750 TCACTTGTCA GATTAGGACT TGTTTTGTTA TTTGCAACAA ACTGGAAAAC 1800 :,,,: ATTATTTTGT TTTTACTAAA ACATTGTGTA ACATTGCATT GGAGAAGGGA 1850 ’·* TTGTCATGGC AATGTGATAT CATACAGTGG TGAAACAACA GTGAAGTGGO 1900 i ·:··· AAAGTTTATA TTGTTAGTTT TGAAAATTTT ATGAGTGTGA TTGCTGTATA 1950 , CTTTTTTCTT TTTTGTATAA TGCTAAGTGA AATAAAGTTG GATTTGATGA 2000 CTTTACTCAA ATTCATTAGA AAGTAAATCA TAAAACTCTA TTACTTTATT 2050 ATTTTCTTCA ATTATTAATT AAGCATTGGT TATCTGGAAG TTTCTCCAG 2099 es 1 1 7555 j (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID NO; 26s (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 9 amino acid· (B) TYPE: amino acid· (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 26:

Glu Ala Asp Pro Thr Gly Hia Ser Tyr

S

a · a aa a · ·· • a • ee • ' ' a e • e • •e·'· • · · III · «· · • · a e a a *a* a a # a a a

• I

9 a a a a a a III aae a a a a 999 9 a·· aaa a··., • aaa.'.' a a a a ·· 9 a a a a «

Claims (26)

1. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa kasvaimen hyijintäantigeenin esiastetta, jonka komplemen- > 5 taarinen sekvenssi hybridisoituu sekvenssiin nro 8:aan rajoittavissa olosuhteissa, jotka on määritelty pesuksi 65 °C:ssa 0,2 x SSC:lla, 0,1 x SSCrlla, jota seuraa 0,1 x SSC, 0,1% SDS.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty nukle- 10 iinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se koodittaa ihmisen kasvaimen hyijintäantigeenin esiastetta (TRAP) tai kasvaimen hyijintäantigeeniä (TRA).

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se koodittaa

4. Ekspressiovektori, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen nuk-leiinihappomolekyylin toiminnallisesti liitettynä promoottoriin .

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen ekspressiovekto ri, tunnettu siitä, että se sisältää nukleiinihappomo-lekyylin, joka koodittaa MAGE-l:stä peräisin olevaa pepti- II” diä toiminnallisesti liitettynä promoottoriin. S

*·· , • , 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen ekspressiovekto- M··· 25 ri, tunnettu siitä, että se sisältää bakteerin tai vi- • · t · * ί.ί : ruksen genomin tai osan siitä. ·· ·

7. Solun transfektiossa käyttökelpoinen ekspres- • · « V ί siosysteemi, tunnettu siitä, että se sisältää (i) en simmäisen vektorin, joka sisältää nukleiinihappomolekyy- : ·*: 30 Iin, joka koodittaa kasvaimen hyijintäantigeenin esiastet- • · · ta, ja (ii) toisen vektorin, joka on (a) vektori, joka si-saitaa nukleiinihappomolekyylin, joka koodittaa MHC- tai • · · **! * HLA-molekyyliä, joka tarjoaa mainitusta kasvaimen hyljin- • * '!t *···' täantigeenin esiasteesta peräisin olevan kasvaimen hyljin- ) ····· 35 täantigeenin, tai (b) vektori, joka sisältää nukleiinihap- pomolekyylin, joka koodittaa interleukiinia. 87 ! 117555

8. Menetelmä syöpäsairauden regression, progression tai puhkeamisen määrittämiseksi, tunnettu siitä, et- ·.; tä mahdollisen syöpäsairauden sairastavan potilaan näytteestä määritetään solulinjan lyysi kasvaimen hyljintäan- 5 tigeenille spesifistisen sytolyyttisten T-solujen vaiku-tuksesta tai kasvaimen hyijintäantigeenin esiaste tai hyl-jitäantigeeni määritetään immuunianalyysin, DNA-hybridi-saation tai polymeraasikejureaktion avulla.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että mainittu näyte on kehon neste.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritetään solulinjan lyysi kasvaimen hyijintäantigeenille spesifistisen sytolyyttisten T-solujen vaikutuksesta.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasvaimen hyijintäantigeenin esiaste tai hyijitäantigeeni määritetään immuunianalyysin, DNA-hybridisaation tai polymeraasikejureaktion avulla.

12. Menetelmä sellaisen biologisen materiaalin 20 valmistamiseksi, joka on käyttökelpoinen hoidettaessa syöpäsairautta sairastavaa potilasta, tunnettu siitä, että ,j, (i) transfektoidaan isäntäsolu nukleiinihappomole- kyylillä, joka koodittaa tai ekspressoi kasvaimen hyljin- * #« • , täantigeenin esiastetta, f···* 25 (ii) transfektoidaan mainittu isäntäsolu nukleii- • t · ί·ί ί nihappomolekyylillä, joka koodittaa ihmisen leukosyyttian- ** * : V tigeeniä (HLA), joka tarjoaa mainitusta kasvaimen hyljin- • « · V : täantigeenin esiasteesta peräisin olevan kasvaimen hyljin- : täantigeenin solun pinnalle, ja :j*: 30 (iii) käsitellään mainittuja isäntäsoluja olosuh- ·***: teissä, jotka suosivat nukleiinihappomolekyylien ekspres- ··· siota ja kasvaimen hyi j intäantigeenin tarjonnan ihmisen • Il leukosyyttiantigeenin toimesta. • · • · • · · • · * * · • · « ····· • · ; ββ 1 17555

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi mainitun isän-täsolun transfektoimisen nukleiinihapposekvenssillä, joka : koodittaa sytokiiniä.

14. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että mainittu molekyyli on: 1 a) DNA molekyyli, joka käsittää nukleotidisekvens-sin, joka on valittu sekvensseistä nrot 7, 8, 9, 11, 12, 13, 15, 16, 18 ja 19, samanpituisia komplementaarisia sek- 10 venssejä tai osia niistä; tai, b) ankarissa olosuhteissa sellaiseen DNA molekyyliin hybridisoituva, jolla on nukleotidisekvenssi, joka on valittu sekvensseistä nrot 7, 8, 9, 11, 12, 13, 15, 16, 18 ja 19 ja samanpituisia komplementaarisia sekvenssejä; 15 ja koodaa, tai on samanpituinen komplementti nuk- leiinihappomolekyylistä, joka koodaa polypeptidiä tai proteiinia, joka kykenee saamaan aikaan sytolyyttisen vasteen ihmisen T-lymfosyyteistä, kun sitä esitellään solun pinnalla, tai esiaste sellaiselle polypeptidille tai prote- ! ; 20 iinille.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen eristetty nuk- '1 leiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että mainittu mo- "1‘ lekyyli on cDNA, genominen DNA tai RNA molekyyli. • 1

♦ [ 16. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu 25 siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 15 mukaisen • · · ; DNA molekyylin RNA transkriptin. ·· » j V

17. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu ·#· ί.ϊ : siitä, että se käsittää nukleiinihapposekvenssin, joka koodaa polypeptidiä tai proteiinia, joka kykenee saamaan • ·1· 30 aikaan sytolyytisen vasteen T-lymfosyyteistä, kun sitä «·· .1·1. esitellään solun pinnalla, tai sellaisen polypeptidin tai ··1 proteiinin esiaste, joka on jonkin patenttivaatimuksen • · · *·1 1 14-16 mukaisen nukleiinihappomolekyylin koodaama, tai • · *·..· samanpituinen komplementaarinen nukleiinihappomolekyyli. «1··1 • · · 1 · · ♦ · 117555 8 9 :'Λ

15 MAGE-perheen jäsentä.

18. Jonkin patenttivaatimuksen 14 - 17 mukainen · eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että mainittu polypeptidi tai proteiini käsittää aminohappose- · kvenssin, joka on sekvenssissä nro 26. .i

19. Jonkin patenttivaatimuksen 14 - 17 mukainen eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se on ankarissa olosuhteissa hybridisoitavissa sellaisen ·: nukleiinihappomolekyylin kanssa, jolla on jossain sekvensseistä nro 7, 8, 9 ja 11 esitetty nukleotidi-sekvenssi tai 10 sopivan pituisen komplementaarisen nukleotidisekvenssin kanssa.

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että sillä on kuvassa 9 esitetty nukleotidisekvenssi tai jokin sekvesseis- 15 tä nrot 7, 8, 9, ja 11, tai samanpituinen komplementaari nen nukleotidisekvenssi.

21. Ekspressiovektori, tunnettu siitä, että se J käsittää jonkin patenttivaatimuksen 14 - 20 mukaisen nukleiinihappomolekyylin.

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen ekspressio vektori, tunnettu siitä, että nukleiinihappomolekyyli r·· on toiminnallisesti liitetty promoottoriin.

"'* 23. Patenttivaatimuksen 21 tai 22 mukainen eks- • · : " pressiovektori, tunnettu siitä, että se lisäksi käsit- * * 25 tää nukleiinihapposekvenssin, joka koodaa MHC- tai HLA- • · « ί.: ; molekyyliä, sytokiinia, bakteerin tai viruksen genomia tai aa · • V osaa niistä. ί

24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen ekspressiovek tori, tunnettu siitä, että sytokiini on interleukiini, • 30 edullisesti IL-2 tai IL-4. • · ♦ • aa .**·.

25. Jonkin patenttivaatimuksen 14-20 mukainen · eristetty nukleiinihappomolekyyli, jonkin patenttivaati- • · a *·* * muksen 21 - 24 mukainen ekspressiovektori, käytettäväksi • a · kasvainten diagnoosiin. a m atiat • a a • · 117555 90

26. Menetelmä sytolyyttisen T-solukasvuston tuottamiseksi, joka on reaktiivinen yksilön autologisia kas- : 1 vainsoluja kohtaan, tunnettu siitä, että otetaan yksi-löltä lymfosyyttinäyte ja sen jälkeen lymfosyyttinäytettä 5 kasvatetaan solujen, johon transfektoitu jonkin patenttivaatimuksen 14 - 20 mukaista nukleiinihappomolekyyliä tai jonkin patenttivaatimuksen 22 - 24 mukaista ekspressiovek-tor.ia, kanssa. ··· ···· • · • * • · · • · ’ * · « ··· * · · · • · · • * · # • « ·· * · Φ • · · • • 99 • m 9 *· Φ·Φ • · • · • · 9 9 ··.·'·.· • 9 9 ··· Φφφ • Φ • · *·· ··..·' • Φ • · 9i 1 1 7555