PL43499B1 - - Google Patents

Description

Opublikowania dnia 12 czerwca 1963 r.POLSKIEJ RZECZYPOSPOLITEJ LUDOWEJ OPIS PATENTOWY Nr 43499 KI. 6 b, 16/03 Instytut Antybiotyków Warszawa, Polska Sposób otrzymywania tetracykliny Pa/tent trwa od dnia 20 czerwca 1959 r.Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania tetracykliny za pomoca nieznanego dotychczas szczepu Streptomyces species 88, wyizolowa¬ nego z gleby w Polsce.Antybiotyk tetracyklina produkowany jest przez szczepy rodzaju Streptomyces. Dotych¬ czas tetracykline otrzymuje sie na drodze fer¬ mentacji trwajacej 48 godzin, w temperaturze 25—30°C, przy czym powstaly antybiotyk jest niejednorodny, poniewaz zawiera znaczne ilo¬ sci chlorotetracykliny (które mozna zmniej¬ szyc dodaniem substancji blokujacych). Po¬ nadto brzeczki otrzymywane w wyniku fer¬ mentacji przy uzyciu wyzej wymienionych szczepów zawieraja blizej nieokreslone pro¬ dukty metabolizmu które nastreczaja trudno¬ sci w toku dalszej przeróbki, ze wzgledu na tworzenie w fazach posrednich emulsji i osadów. Pociaga to za soba koniecznosc uzy¬ cia skomplikowanej aparatury do rozdzialu i zwieksza ilosc operacji niezbednych do uzys¬ kania gotowego produktu.Wynalazek ma na celu znaczne skrócenie czasu fermentacji, otrzymanie brzeczki fer¬ mentacyjnej zawierajacej wylacznie tetracykli¬ ne, bez koniecznosci dodawania inhibitorów hamujacych powstawanie chlorotetracykliny i wyeliminowanie powstajacych w 'dotychczas opracowanych procesach blizej nieokreslonych ubocznych produktów metabolizmu, wywolu¬ jacych omówione trudnosci w procesie prze¬ robu brzeczki fermentacyjnej.Cel ten udalo sie osiagnac wedlug wynalaz¬ ku przez zastosowanie w procesie produkcyj¬ nym szczepu Streptomyces specj es 88, wyizo^ lowanego z gleby w Polsce oraz ustalenie wa¬ runków, w których szczep ten wytwarza naj¬ wieksza ilosc antybiotyku. Szczep ten róza! sie od dotychczas opisanych producentów tetracykliny, jak to wynika z podanych nizej tablic.Charakterystyka szczepu na agarze: glicery¬ na — 1%, asparagina — 0,05%, ekstrakt mies¬ ny — 0,2%, K2HP04 — 0,05%, agar — 1,5%, pH = 7,2.Wzrost Zarodniko¬ wanie Pigment roz¬ puszczalny Grzybnia po¬ wietrzna Szczep Streptomyces aureofaciens dobry dobre brak strzepki proste grzybnia szara Szczep Streptomyces species dobry dobre brazowo-zielo- ny strzepki proste grzybnia brud- no-rózowa.Na agarze Czapek — Dox, dekstryna — 1%, NaNOs — 0,2%, K2HPOt — 0,1%, MgS04 — 0,05%, KCl — 0,05%, FeSOt — slady, agar — 1,5%, pH = 7,2.Wzrost Zarodniko¬ wanie Pigment roz¬ puszczalny Grzybnia po¬ wietrzna Rozpuszczal¬ nosc zelatyny Koagulacja mleka lakmu¬ sowego Hydroliza skrobii Wzrost i bar¬ wa na pozyw¬ ce ziemniacza¬ nej Redukcja azo¬ tanów Pozywka pro¬ dukcyjna z chlorkiem so¬ du Szczep Streptomyces aureofaciens umiarkowany slabe brak barwy skórza- sto-brazowej.Strzepki cien¬ kie w bardzo malej ilosci. nie rozpuszcza nie koaguluje slabo dobry, ciemno-szara nie redukuje slad tetracy¬ kliny Szczep Streptomyces species umiarkowany slabe zlocisto-poma- ranezowy intensywnie pomaranczowy nie rozpuszcza koaguluje slabo dobry, ciemno-szara nie redukuje slad chlorote- tracykliny, slad nieziden¬ tyfikowanych antybiotyków x i y Chromatogra¬ fia w ukladzie octanu etylu nasyconego woda Rf w stosunku do chlorotetra- cykliny Szczep Streptomyces aureofaciens 1 chlorotetracy- klina, slad te¬ tracykliny Rf — 1 chlo- rotetracyklina Rf — 0,4 te¬ tracyklina Szczep Streptomyces species chlorotetra cy¬ klina, — slad, 1 tetracyklina, antybiotyk x, antybiotyk y RF — 1 chlo- rotetracyklina Rf — 0,4 te¬ tracyklina Rf — 0,26 an¬ tybiotyk X Rf — 0,15 an¬ tybiotyk y Wyizolowany szczep sluzyl do otrzymania mutantów produkcyjnych na drocize selekcji przy zastosowaniu wstepnych czynników mu¬ tagennych takich jak: promienie uLtrafioleto- we, promienie X, dwumetyloimina oraz in¬ nych znanych czynników.Szczep moze byc przechowywany w stanie zliofilizowanym w ciagu 2 lat nie tracac swojej aktywnosci.Jak stwierdzono, obecnosc produktów owsa w podlozu produkcyjnym, wplywa stymuluj a- \co na wzrost grzybni i wydajnosc antybioty- Do fermentacji glebinowej jako pozywke za¬ wierajaca przyswajalne zródlo wegla stosuje sie procfcukty owsa, np. platki owsiane, poza tym skrobie, dekstryne, gliifeoze, sacharoze, melase itp.Stwierdzono, iz produkty owsa, miedzy in¬ nymi np. platki owsiane, posiadaja 'dzialanie stymulujace i wlasnosci przeciwpienne.Jako zródlo przyswajalnego azotu stosuje sie wyciag namokowy kukurydzy, make ara¬ chidowa, make soiowa, drozdze itp., zas jako soli mineralnych NaBr, /NH4/2SO4, NH4N03, NH4Cl itp.Odpowiednie stezenie jonów wodorowych reguluje sie dodajac CoCO,.Do gaszenia piany stosuje sie oleje roslinne.Wedlug wynalazku fermentacje szczepu Streptomyces species 88 prowadzi sie np. w kadziach zelaznych, najkorzystniej w tempera¬ turze 30 — 32 °C, w czasie krótszym niz 48 go¬ dzin, najkorzystniej w czasie 30 — 42* godzin przy pH w granicach 5,0 — 7,2. Fermentacje prowadzi sie w warunkach tlenowych dostar¬ czajac od 0,5 do 0,75 objetosci powietrza/ob- - 2 -jetosc podloza na minute i stosuje sie 1—10,0% inoculum wegetatywnego.Oznaczanie aktywnosci plynów fermentacyj¬ nych prowadzi sie ogólnie znanymi metodami biologicznymi i fizykochemicznymi. Bardzo wazne jest stosowanie róznych pozywek dla stadiów posiewowych i produkcyjnego.Krótki czas fermentacji zapobiega autolizie grzybni i przyczynia sie do skrócenia czasu i ominiecia trudnosci zwiazanych z filtracja.W sposobie wedlug wynalazku mimo krótkie¬ go czasu fermentacji uzyskuje sie zawartosc antybiotyku w brzeczce 3000 — 4000 j/ml — co bylo niemozliwe do osiagniecia w tym cza¬ sie znanymi dotychczas metodami.Otrzymany antybiotyk izoluje sie z brzeczki w znany sposób, metoda wytracenia w postaci soli kompleksowej lub metoda ekstrakcji z brzeczki do rozpuszczalników organicznych w srodowisku alkalicznym z zastosowaniem prze¬ nosników, reekstrakcji do wody i wysalania.W trakcie izolowania antybiotyku nie pow¬ staja emuiLsje and osady w fazach posrednich, zarówno przy przejsciu antybcfttyku do roz¬ puszczalników organicznych, jak i przy reeks¬ trakcji do fazy wodnej.Ponizej podano przyklady, które blizej wy¬ jasniaja sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. Szczep Streptomyces species 88 hoduje sie na podlozu o nastepujacym skla¬ dzie: 5,0% — otreby pszenne 2,0% — agar — agar Zarodniki przeszczepia sie na podloze posie- wowe o skladzie: 3% — glikoza 0,5% — drozdze 1,25% — wyciag namokowy kukurydzy 0,5% — NH4NO3 0,2% — NaCl 0,4% — CaCOs wartosc pH przed sterylizacja = 7,0.Poclloze sterylizuje sie w temperaturze 110 — 115°C przez 30 minut, a nastepnie inkubu- je w temperaturze 30 — 32°C w ciagu 12—24 godzin.Tak przygotowany material posiewowy prze¬ szczepia sie na podloze produkcyjne o skla¬ dzie: 2,0% — maka z wytloków arachidowych 2,0% — maka ziemniaczana 2,0% — maka owsiana 1,25% — wyciag namokowy kukurydzy 0,5% — NH4NOs 0,2% — NaCl 0,4% — CaC03 0,75% — olej arachidowy wartosc pH przed sterylizacja 6,5.Fermentacje prowadzi sie przez 42 godziny w temperaturze 30 — 32°C.Brzeczke z kolb w ilosci 2,5 1 zakwasza sie kwasem szczawiowym do pH — 2,0, a nastep¬ nie saczy z ziemia okrzemkowa. Do przesa¬ czu dodaje sie 0,1% chlorku dwumetylolaury- lobenzyloamoniowego i 20% mieszaniny octanu butylu z butanolem w stosunku 4:1 i dopro¬ wadza pH do 8,0 za pomoca NaOH. Po 30 mi¬ nutach mieszania oddziela sie klarowna faze organiczna. Ekstrakcje przeprowadza sie dwu¬ krotnie. Polaczone, klarowne fazy organiczne zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem do polowy objetosci, a nastepnie dodaje 10% wody j pH mieszaniny doprowadza do 2,8 przy uzyciu H2SO4 (1:3). Po dwukrotnej ekstrakcji zbiera sie klarowna faze wodna i dodaje 'do niej 15% NaCl i pozostawia do krystalizacji.Po odsaczeniu otrzymuje sie 4,0 g preparatu chlorowodorku tetracykliny c mocy 950 mog/mg.Przyklad II. Brzeczke z kolb w ilosci 2 1 zakwasza sie kwasem szczawiowym do pH=2,5 dodaje chlorku dwumetylolaurylobenzyloamo- niowego w ilosci 0,1% i doprowadza do pH = 8,0, a nastepnie po dodaniu 0,3% ziemi okrzem¬ kowej i po 0,5 godzinnym mieszaniu saczy. Su¬ cha mieszanine o aktywnosci okolo 300 mcg/mg ekstrahuje sie metanolem zawierajacym 10% CaCl2. Ekstrakcje prowadzi sie trzykrotnie po 1 godzinie. Ekstrakty laczy sie, zageszcza do uzyskania okolo 100.000 mcg/ml, a nastepnie zakwasza stezonym HCl do wytracenia kryszta¬ lów chlorowodorku tetracykliny. Otrzymuje sie 0,52 g krystalicznego osadu o mocy 945 mcg/mg. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania tetracykliny na dro^ dze glebinowej fermentacji, w warunkach tle¬ nowych, znamienny tym, ze proces biosyntezy prowadzi sie w temperaturze 30 — 32 °C, w czasie 34 — 40 godzin, przy uzyciu szczepu Streptomyces species 88, który na podlozu o pH 5,0 — 7,2 zawierajacym j^^a' przyswa- jalnego wegla, asotu oraz soli mineralnych i rfiedzy innymi skladnikami — produkty owsa, wytwarza bez inhibitorów chlorowania z duza - 3 -wydajnoscia wylacznie tetracykline, która izo¬ luje sie z przeferrnentowanego podloza, zas w przypaclku braku w podlozu produktów owsa wytwarza tetracykline, chlor otetr a cykli¬ ne i dwa inne nie zidentyfikowane antybio¬ tyki. Instytut Antybiotyków Zastepca: mgr inz. Antoni Sen tek rzecznik patentowy 440. RSW „Prasa" Kielce. F PL