PL248452B1

PL248452B1 - Zmodyfikowane białko zielonej fluorescencji, sposób jego wytwarzania oraz jego zastosowanie do oznaczania niklu

Info

Publication number: PL248452B1
Application number: PL450057A
Authority: PL
Inventors: Marcin Olszewski; Katarzyna Szymańska; Emil Pituła; Monika Janik; Dawid NIDZWORSKI; Dawid Nidzworski; Beata Gromadzka
Original assignee: Inst Biotechnologii I Medycyny Molekularnej; Politechnika Warszawska
Priority date: 2024-10-17
Filing date: 2024-10-17
Publication date: 2025-12-15
Also published as: PL450057A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest zmodyfikowane, wzmocnione białko zielonej fluorescencji TST-eGFP-MBL-Ni2+, które ma sekwencję aminokwasową białka eGFP, w której w miejsce sekwencji DGFP obejmującej reszty aminokwasowe od 190 do 193 wstawiono co najmniej jedną, 7 aminokwasową sekwencję SEQ ID NO.1, która wiąże jony niklu. Zgłoszenie ujawnia też konstrukt genetyczny o sekwencji SEQ ID NO.3, którego ekspresja daje produkt w postaci zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Ni2+ o SEQ ID NO.2. Zgłoszenie obejmuje też sposób wytwarzania zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Ni2+ i jego zastosowanie do oznaczania niklu w próbkach ciekłych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowane białko zielonej fluorescencji z pętlą wiążącą jony niklu oraz domeną Twin-Strep-Tag, sposób jego otrzymywania i oczyszczania, oraz jego zastosowanie do oznaczania niklu w próbkach ciekłych. Przedmiotem wynalazku jest także konstrukt genetyczny do wytwarzania białka TST-eGFP-MBL-Ni²⁺. Wprowadzona domena Twin-Strep-Tag (TST) umożliwia efektywne oczyszczenie białka metodą chromatografii powinowactwa. Domena służy też do immobilizacji na powierzchni detektora białka stanowiącego warstwę bioreceptorową. Wprowadzenie pętli pozwoliło na rozdzielenie białka na dwie podjednostki, które w obecności jonów niklu ulegają zmianom konformacyjnym, zbliżając się do siebie i w konsekwencji emitując sygnał w postaci fluorescencji.

Szerokie zastosowanie niklu w różnych gałęziach przemysłu spowodowało wysoki poziom zanieczyszczenia ekosystemów naturalnych tym metalem. Ze względu na swoje właściwości fizykochemiczne jak również zdolność do szybkiego wchłaniania w organizmie nikiel stwarza poważne zagrożenie zarówno dla środowiska, jak i życia człowieka, dlatego tak ważne jest monitorowanie poziomu zanieczyszczeń tym metalem.

Wynalazek ma na celu otrzymanie i oczyszczanie zmodyfikowanego wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP) zdolnego do wiązania jonów niklu, mogącego jednocześnie stanowić warstwę bioreceptorową w układzie detekcyjnym, umożliwiając wykrywanie zanieczyszczeń w wodzie pitnej tym metalem ciężkim. Wynalazek obejmuje także zastosowanie zmodyfikowanego fuzyjnego białka eGFP w układach biosensorycznych, pozwalających na wykrywanie in situ jonów metalu niklu w sposób szybki, prosty, tani i mobilny. Jony można wykrywać w dowolnej próbce płynnej i w miejscu pobrania próbki.

Dotychczasowo stosowane metody określenia stężenia metali ciężkich/metaloidów (w tym niklu) w wodzie opierają się na wykorzystaniu analizy instrumentalnej oraz sensorów chemicznych i elektrochemicznych. Do metod analizy instrumentalnej należą atomowa spektrometria absorpcyjna AAS (ang. Atomic Absorption Spectrometry), atomowa spektrometria emisyjna z wzbudzaniem plazmowym ICP-AES (ang. Inductively Coupled Plasma - Atomic Emission Spectroscopy), spektrometria mas sprzężona z plazmą wzbudzaną indukcyjnie ICP-MS (ang. Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry) oraz chromatografia jonowymienna IEC (ang. lon Exchange Chromatography) połączona ze spektrometrią mas [1, 2, 3]. Do oznaczania niklu w próbkach środowiskowych najczęściej wykorzystywana jest pierwsza z wymienionych metod [2]. Wszystkie powyższe techniki charakteryzują się wysoką czułością.

Drugą stosowaną metodą detekcji jonów niklu jest wykorzystanie sensorów chemicznych. Działają one w oparciu o ligandy chelatujące jony metali. Ze względu na to, że wszystkie metale i jony metali przejściowych posiadają ładunek dodatni, azotowo-tlenowe ligandy chelatujące wykazują wysokie do nich powinowactwo, co umożliwia ilościową ocenę ich zawartości w analizowanych próbkach. Natomiast detekcja w przypadku sensorów elektrochemicznych polega na pomiarze zmiany parametrów, takich jak natężenie, napięcie i elekroluminescencja, zależnych od obecności lub braku jonów metalu w próbce. Powstały, w wyniku reakcji utleniania i redukcji, sygnał elektryczny jest mierzony i wiązany ze stężeniem substancji elektroaktywnych, lub szybkością ich produkcji/zużycia.

W sensorach chemicznych kompleksowanie jonów metali ciężkich wywołuje zmiany właściwości spektroskopowych wykorzystywanych związków, np. absorpcji czy fluorescencji, które są obierane i odpowiednio przetwarzane [1]. Przykład takiego czujnika stanowić może sensor kolorymetryczny wykorzystujący pochodne kumaryny. W ich przypadku utworzenie kompleksu z niklem powoduje, widoczną nieuzbrojonym okiem, zmianę koloru próbki z bezbarwnej na różową. Jest to związane z wystąpieniem silnego efektu batochromowego, polegającego na przesunięciu maksimum absorpcji z 341 nm na 516 nm. Sensor taki charakteryzuje się wysoką selektywnością względem jonów innych metali oraz dobrą czułością. Granicę wykrywalności tej metody stanowi 0,5 μM [5, 6]. Inny przypadek stanowi sensor oparty o wygaszanie fluorescencji pochodnej bispirazolu. Związanie jonów niklu w znaczący sposób ogranicza intensywność emisji tego fluoroforu, a testy kompetycyjne wykazują wysoką selektywność opracowanego fluorosensora. Jego granicę wykrywalności określono na 3,25 x 10^-7 M [5, 7].

Chemosensory cechuje szybkość działania, niski koszt oraz brak konieczności obróbki wstępnej analizowanej próbki, niestety ich wadą jest niska czułość [5].

Przykładem sensora elektrochemicznego używanego do wykrywania jonów metali jest wykorzystanie elektrody platynowej, pokrytej mieszaniną tlenku manganu (II, III) i chitozanu, umożliwiającą detekcję selenu i niklu w próbkach wodnych. Jego granica wykrywalności równa jest 0,718 μg/L. Chitozan jest polimerem polisacharydowym o wielu atrakcyjnych właściwościach, takich jak, wyjątkowa czułość i możliwość chemicznej modyfikacji. Natomiast M nsO4 jest znany ze swojego silnego charakteru elektrokatalitycznego, co czyni go idealnym do wykorzystania w układach elektrosensorycznych [8, 9]. Techniki elektrochemiczne uważane są za ekonomiczne, umożliwiają miniaturyzację, a w związku z tym analizę in situ. Są to techniki bardzo szybkie, o krótkim czasie analitycznym, pozwalające na monitorowanie on-line. Jednakże, oferują one dosyć niską czułość i mają wysokie granice oznaczalności (LOD).

Techniki analizy instrumentalnej pozwalają na jednoczesną analizę zawartości wielu metali ciężkich, cechuje je niska granica wykrywalności LOD (ang. Limit Of Detection) i jak dotąd pozostają one najlepszymi dostępnymi metodami pod względem czułości i dokładności [1, 4]. Równocześnie należą do drogich i czasochłonnych technik wymagających wysoce specjalistycznego zaplecza sprzętowego oraz wykwalifikowanego personelu do jego obsługi.

Rozwiązania ze stanu techniki wykorzystywane obecnie do pomiaru stężenia jonów niklu w próbkach są czasochłonne i kosztowne oraz wymagają wstępnej obróbki próbki przed analizą i nie są możliwe do zastosowania bezpośrednio w miejscu poboru próbki.

To wszystko sprawia, że istnieje potrzeba poszukiwania bardziej praktycznych alternatyw oferujących szybkie i bezpośrednie testy do wykrywania obecności metali ciężkich bezpośrednio w miejscu pobrania, które nie wymagają wstępnej obróbki materiału oraz późniejszych etapów laboratoryjnych.

Korzystne skutki wynalazku

Wzmocnione białko zielonej fluorescencji (eGFP) znajduje powszechne zastosowanie w medycynie, biotechnologii czy biologii molekularnej m.in. przy: wizualizacji komórek, fuzji z białkami czy badaniach odziaływań białko-białko. Jego zdolność do emisji fluorescencji sprawia, że jest chętnie wykorzystywanym i badanym białkiem. Poprzez wprowadzenie modyfikacji w obrębie chromoforu można wpływać na jego fotostabilność czy intensywność świecenia. Ostatnie badania pokazują również, że białko eGFP może być wykorzystane do monitorowania zanieczyszczeń próbek jonami metali ciężkich [10, 11].

Proponowana technologia opiera się na procesie otrzymywania i oczyszczania zmodyfikowanego białka eGFP, wiążącego jony niklu, które stanowi kluczowy element układu biosensorycznego, pozwalającego na wykrywanie in situ jonów tego metalu w sposób szybki, tani i mobilny.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowane, wzmocnione białko zielonej fluorescencji TST -eGFP-MBL-Ni²⁺, charakteryzujące się tym, że ma sekwencję aminokwasową białka eGFP, w której w miejsce sekwencji DGFP obejmującej reszty aminokwasowe od 190 do 193 wstawiono co najmniej jedną, 7-aminokwasową sekwencję SEQ ID NO. 1. Sekwencja SEQ ID NO. 1 wiąże jony niklu Ni²⁺.

Białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ na końcu aminowym zawiera sekwencję TST.

W białku TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ ilość wstawionych sekwencji SEQ ID NO. 1 może wynosić od 1 do 10.

W korzystnym wariancie białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO. 2 ze wstawioną jedną 7-aminokwasową sekwencją SEQ ID NO. 1.

Przedmiotem wynalazku jest też konstrukt genetyczny o sekwencji SEQ ID NO. 3, którego ekspresja daje produkt w postaci zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ o SEQ ID NO. 2.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania zmodyfikowanego białka eGFP w komórkach bakteryjnych obejmujący etap, w którym do komórek bakterii wprowadza się wektor ekspresyjny zawierający konstrukt genetyczny o sekwencji kodującej białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺, korzystnie konstrukt genetyczny o SEQ ID NO. 3.

Sposób obejmuje ponadto etapy, w których:

a) hoduje się komórki bakterii z wprowadzonym wektorem ekspresyjnym w podłożu płynnym z wytrząsaniem,

b) przy zastosowaniu IPTG przeprowadza się indukcję nadekspresji konstruktu genetycznego do wytwarzania zmodyfikowanego białka eGFP,

c) odwirowuje się i zawiesza osad w buforze z lizozymem,

d) przeprowadza się sonikację,

e) prowadzi się odwirowanie zdezintegrowanych komórek 30 min. przy 12000 obr/min w 4°C, f) zbiera się supernatant,

g) zawiesza się pozostały osad w buforze z sarkozylem i tritonem X-100 i inkubuje lizat komórek przez noc w celu odzyskania frakcji nierozpuszczalnego białka,

h) łączy się frakcje lizatu z etapu f) i etapu g),

i) inkubuje się lizat z dodatkiem nukleaz,

j) prowadzi się odwirowanie 40 min przy 12000 obr/min w 4°C

k) filtruje się uzyskany supernatant na filtrze membranowym MCE 0,45 μm

l) oczyszcza się z supernatantu aktywne, rekombinowane białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ za pomocą chromatografii powinowactwa na złożu wiążącym domenę Strep-Tag,

m) odsala się frakcje, w których potwierdzono obecność białka eGFP za pomocą dializy,

n) zagęszcza się frakcje, w których detektor wykrył wiązanie peptydowe na koncentratorze wirówkowym o granicy odcięcia 10,000 MWCO 3-5 minut w 4°C, 5000 obr/min,

o) uzyskuje się zmodyfikowane białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ o stężeniu 0,8 mg/ml i czystości powyżej 90%.

Korzystnie hodowla w etapie a) prowadzona jest w zakresie temperatur 18-37°C z wytrząsaniem 200-250 obr/min.

Korzystnie indukcję w etapie b) przeprowadza się w momencie osiągnięcia przez bakterie gęstości hodowli OD600 0,5-0,6. Korzystnie w etapie b) końcowe stężenie IPTG wynosi 0,1-2 mM, a czas hodowli od momentu indukcji do zebrania komórek wynosi od 2 do 30 h.

Korzystnie w etapie c) wirowanie prowadzi się 15 min przy 4500 obr/min, a stężenie lizozymu w buforze wynosi 0,1 mg/ml.

Korzystnie w etapie d) parametry sonikacji to 30 sekund przy amplitudzie 5 mikronów z 30-sekundowym interwałem pomiędzy cyklami, przy 80% mocy sonikatora.

Korzystnie bufor stosowany w etapie g) zawiera dodatek detergentów anionowych i niejonowych oraz zawiera 2-10% sarkozyl i 2% Triton X-100.

Korzystnie w etapie i) dodaje się nukleazy w stężeniu 3,5 U/ml lizatu.

Korzystnie w etapie o) otrzymuje się aktywną, rozpuszczalną formę białka TST-eGFP-MBL-Ni²⁺.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Ni²⁺określonego powyżej jako biosensora nowej generacji do detekcji jonów niklu w biologicznych próbkach ciekłych. Korzystnie próbką ciekłą jest próbka wody.

Korzystnie zastosowanie zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ charakteryzuje się tym, że białko oddziałuje z jonami Ni²⁺, powodując zmianę poziomu intensywności fluorescencji.

Przedmiotem wynalazku jest sposób pomiaru stężenia jonów niklu w próbkach ciekłych, w którym białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ miesza się z próbką zawierającą jony niklu, a następnie rejestruje się widmo fluorescencji i odczytuje maksimum intensywności dla emisji przy długości fali λ = 500-530 nm, po wzbudzeniu białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ falą o długości λ =470-500 nm. Do pomiaru stosuje się białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ w stężeniu od 0,05 mg/ml do 5 mg/ml.

Sposób według wynalazku realizuje się dokonując pomiaru w biologicznych próbkach ciekłych, korzystnie próbkach wody.

Stężenie badanych jonów niklu mieści się w zakresie od 50 nM do 5 μM.

Przedmiot wynalazku został objaśniony w przykładach wykonania na rysunku, na którym: Fig. 1 przedstawia schemat mechanizmu działania zmodyfikowanego białka eGFP z pętlą MBL. Fig. 2 przedstawia mapę plazmidu ekspresyjnego pET21a(+), wykorzystywanego do przygotowania konstruktów genowych.

Fig. 3 przedstawia rozdział elektroforetyczny (SDS-PAGE) białek bakteryjnych szczepu E. coli Lemo21 (DE3) nadprodukującego białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺.

Fig. 4 przedstawia wynik rozdziału elektroforetycznego produktów oczyszczania białka TST-eGFP-MBL-Ni²⁺.

Fig. 5 przedstawia wynik rozdziału elektroforetycznego produktów oczyszczania TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ po etapie dializy oraz zagęszczony preparat białkowy.

Fig. 6 przedstawia schemat ideowy układu pomiarowego.

Fig. 7 przedstawia wyniki pomiarów emisji fluorescencji białka w obecności różnych stężeń metalu. Fig. 8 przedstawia zmianę poziomu natężenia fluorescencji odczytanej w λem = 510 nm, dla kolejnych pomiarów białka TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ z rosnącym stężeniem metalu.

Przedstawiony na Fig. 1 schemat mechanizmu działania zmodyfikowanego białka eGFP z pętlą MBL ilustruje białko eGFP składające się z 11 β-kartek, podzielonych na 2 podjednostki. Podjednostki zawierają: pierwszych 9 β-kartek (większa podjednostka z lewej strony) oraz dwie ostatnie, 10 i 11 β-kartkę (mniejsza podjednostka z prawej strony).

(A) Białko natywne, niezmodyfikowane wykazuje naturalną fluorescencję.

(B) Białko zmodyfikowane, do którego w regionie pętli aminokwasowej pomiędzy 9 i 10 β-kartką wprowadzono sekwencję wiążącą metal MBL nie wykazuje fluorescencji. Wstawienie sekwencji MBL w pętli powoduje jej wydłużenie, przez co dochodzi do oddalenia się od siebie podjednostek zmodyfikowanego białka eGFP oraz zmiany w obrębie chromoforu. W konsekwencji prowadzi to do utraty zdolności fluorescencji przez zmodyfikowane białko eGFP.

(C) Po związaniu jonów metalu do MBL następuje zmiana konformacyjna zmodyfikowanego eGFP, polegająca na zmniejszeniu dystansu pomiędzy fragmentami białka i gdy znajdą się one odpowiednio blisko siebie, zmodyfikowane białko eGFP ponownie wykazuje fluorescencję.

Fig. 2 przedstawia mapę plazmidu ekspresyjnego pET21a(+) (Addgene, USA), wykorzystywanego do przygotowania konstruktów genowych, gdzie w miejscu cięcia enzymów restrykcyjnych Ndel oraz Sall (zaznaczone w górnej części mapy plazmidu) wprowadzono zmodyfikowaną sekwencję eGFP.

Fig. 3 przedstawia rozdział elektroforetyczny (SDS-PAGE) białek bakteryjnych szczepu E. coli Lemo21 (DE3) nadprodukującego białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺. Kolejne ścieżki to: 1 - marker wielkości białek (#P7719), 2 - Lizat komórkowy przed indukcją, 3 - Lizat komórkowy po 21 h indukcji w 30°C; strzałką oznaczono białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ o wielkości 30 kDa.

Fig. 4 przedstawia wynik rozdziału elektroforetycznego w żelu poliakrylamidowym produktów oczyszczania białka TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ metodą chromatografii powinowactwa na kolumnie StrepTrap™ HP. Kolejne ścieżki to:

- nakładany na kolumnę lizat komórkowy E. coli Lemo21 (DE3) inkubowany z sarkozylem

- marker wielkości białek (#P7719)

- frakcja białek niewiążących się ze złożem (A24),

- frakcja białek po płukaniu kolumny buforem A (A26),

- frakcjaB36

- frakcjaB38,

- frakcjaB40,

- frakcjaB42,

- frakcjaB44,

- frakcjaB46, strzałką oznaczono białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ o wielkości 30 kDa.

Fig. 5 przedstawia wynik rozdziału elektroforetycznego w żelu poliakrylamidowym produktów oczyszczania TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ po etapie dializy oraz zagęszczony preparat białkowy. Kolejne ścieżki to:

- marker wielkości białek (#P7719)

- preparat białkowy przed dializą

- preparat białkowy po dializie

- preparat białkowy po filtracji (0,45 μm)

- zagęszczony preparat białkowy (3 μθ

- zagęszczony preparat białkowy (1 μθ strzałką oznaczono białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ o wielkości 30 kDa;

Schemat ideowy układu pomiarowego przedstawiony na Fig. 6 ilustruje układ, który zawiera laserowe źródło światła o centralnej długości fali 487 nm, dostosowane do maksimum absorpcji wybranego białka, oraz światłowodowy spektrometr laboratoryjny (USB4000, OceanOptics), rejestrujący widmo optyczne w zakresie 195-900 nm. Kapilara została umocowana w specjalnym uchwycie wykonanym w technologii druku 3D. Skolimowaną wiązkę światła laserowego ogniskuje się na powierzchni bocznej kapilary do postaci punktu, za pomocą soczewki asferycznej o ogniskowej 20 mm (AL2520, Thorlabs Inc.). Emitowany sygnał fluorescencji jest zbierany bezpośrednio przez nieuzbrojony koniec włókna światłowodowego o średnicy rdzenia 0c = 1000 μm i aperturze numerycznej NA = 0,39. Źródło światła jest umieszczone ortogonalnie w stosunku do światłowodu wyjściowego, co pozwala na częściowe ograniczenie sprzęganego sygnału źródła. W celu zwiększenia izolacji sygnału fluorescencji od sygnału źródła, w torze światłowodowym umieszczono filtr optyczny dolnoprzepustowy, tłumiący długości fali poniżej 495 nm (FGL495, Thorlabs Inc.)

Fig. 7 przedstawia wyniki pomiarów emisji fluorescencji TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ w obecności różnych stężeń metalu.

Fig. 8 przedstawia zmianę poziomu natężenia fluorescencji odczytanej w λem = 510 nm, dla kolejnych pomiarów białka TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ z rosnącym stężeniem metalu. Na wykresie pionową przerywaną linią zaznaczono dopuszczalny limit stężenia niklu na II stopniu utlenienia w wodzie wg. Normy WHO.

Wynalazek ujawnia sposób otrzymywania, oczyszczania i wykorzystania zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Ni²⁺, wiążącego jony niklu na drugim stopniu utlenienia, przy czym otrzymuje się aktywną formę białka produkowanego w systemie bakteryjnym.

Rozwiązanie bazuje na modyfikacji eGFP typu split-protein system, które zakłada rozdzielenie białka na dwie podjednostki lub domeny. W natywnej formie białko jest nieaktywne, jego aktywacja następuje dopiero, gdy oba fragmenty znajdą się w swoim bliskim sąsiedztwie po związaniu jonów niklu (Fig. 1).

Białko eGFP wiążące jony niklu zostało zmodyfikowane z wykorzystaniem inżynierii genetycznej (modyfikacja split-protein) w ten sposób, że w miejsce sekwencji 4 aminokwasów (DGPV) znajdującej się pomiędzy strukturami β-kartek nr 9 i 10 tego białka wprowadzono odpowiednio sekwencję aminokwasową FPYRSTP (SEQ ID NO. 1), która wiąże selektywnie jony niklu. Ponadto, białko zawiera dołączoną na końcu aminowym domenę Twin-Strep-Tag (WSHPQFEK-GGGSGGGSGG-SAWSHPQFEK), umożliwiającą jego efektywne oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa. Modyfikację genetyczną uzyskano dzięki usunięciu w genie kodującym białko eGFP sekwencji nukleotydowej 5’GACGGCCCCGTG 3’ (nukleotydy od pozycji 568 do 579) i na jej miejsce wstawienie w tym samym miejscu sekwencji nukleotydowej 5’TTTCCGTATCGCAGCACCCCG3’ kodującej sekwencję wiążącą jony metalu.

Opracowane rozwiązanie bazuje na hodowli okresowej bakterii z gatunku E. coli w podłożu płynnym LB, nadprodukujących (po uprzednim zaindukowaniu IPTG lub laktozą) zmodyfikowane białko eGFP wiążące jony Ni²⁺. Po hodowli prowadzi się izolację białka z komórek E. coli, zwiększa jego rozpuszczalność przez wielogodzinną inkubację w buforze zawierającym stężone detergenty anionowe (sarkozyl) oraz niejonowe (Triton X-100) i prowadzi się oczyszczanie na kolumnie zawierającej złoże wiążące domenę Twin-Strep-Tag metodą grawitacyjną lub z wykorzystaniem chromatografu FPLC. Wypracowane rozwiązanie umożliwia otrzymywanie aktywnego białka w dużych ilościach. Następnie oczyszczone białko znajduje zastosowanie do zbadania aktywności w układzie białko-dedykowany metal, co potwierdza możliwość wykorzystania uzyskanego konstruktu do badania stężenia jonów Ni²⁺w zakresie dopuszczalnego limitu stężenia Ni²⁺ w wodzie wg. normy WHO.

Wynalazek zostanie poniżej zilustrowany w przykładach wykonania.

Przykład 1

Przygotowanie konstruktu genowego do nadprodukcji rekombinowanego białka eGFP wiążącego jony niklu na drugim stopniu utlenienia

Do wektora pET-21a (+) (Sigma Aldrich, Niemcy, nr kat. 69740) wprowadzono w miejsce enzymów restrykcyjnych Ndel oraz Sall zmodyfikowaną sekwencję kodującą białko eGFP (Fig. 2). Sekwencję uzyskano w ten sposób, że do sekwencji nukleotydowej kodującej białko eGFP (810 pz) na N-końcu dodano sekwencję kodującą znacznik białkowy Twin-Strep-Tag, a w miejscu sekwencji kodującej oryginalnie 4 reszty aminokwasowe DGPV wprowadzono sekwencję kodującą pętlę selektywnie wiążącą jony niklu na drugim stopniu utlenienia (MBL-Ni²⁺ (SEQ ID NO. 3)). Sekwencja została wstawiona tak, że znajduje się pod kontrolą indukowalnego promotora T7.

Zaprojektowany wektor ekspresyjny został zamówiony do syntezy (Gene Universal, USA) i wykorzystany do transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli DH103.

Przykład 2

Transformacja komórek kompetentnych DH10p wektorem ekspresyjnym otrzymanym w przykładzie 1 oraz izolacja plazmidowego DNA

Do schłodzonej probówki typu Eppendorf dodano 50 μl komórek kompetentnych Escherichia coli DH10pF- mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) <p80lacZAM15 AlacX74 recA1 endA1 araD139 A (ara-leu)7697 galU galKΛ- rpsL(StrR) nupG (ThermoScientific, USA) oraz 2 μl DNA plazmidowego pET-21a (+) z sekwencją kodującą białko zawierające pętlę wiążącą jony Ni²⁺ [TST-eGFP-MBL-Ni²⁺] o stężeniu 5 ng/pl. Mieszaninę dokładnie wymieszano przez pipetowanie i inkubowano w lodzie przez 30 minut. Następnie przeprowadzono szok termiczny umieszczając probówki w termobloku (Eppendorf, Niemcy) o temperaturze 42°C na 45 sekund. W kolejnym kroku inkubowano próbki w lodzie przez kolejne 5 minut. Po tym czasie dodano do mieszaniny 500 μl podłoża płynnego SOC (A&A Biotechnology, Polska), następnie prowadzono inkubację w stałej temperaturze 37°C przez 1 godzinę z wytrząsaniem (600 obr/min) w cieplarce laboratoryjnej (Pol-Eko Aparatura, Polska). Po godzinnej inkubacji hodowlę bakteryjną odwirowano (5 min, 5000 obr/min) (wirówka 5425 G, Eppendorf, Niemcy). Następnie usunięto 400 μl supernatantu, a osad komórkowy zawieszono w pozostałym roztworze i wysiano na szalki z selekcyjnym podłożem stałym LA wzbogaconym o dodatek ampicyliny (50 pg/ml; Carl Roth, Niemcy). Następnie szalki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Po tym czasie pojedyncze kolonie bakterii, które wyrosły na szalce z podłożem selekcyjnym zaszczepiono do hodowli w płynnym podłożu LB o objętości 5 ml wzbogaconym o dodatek ampicyliny (50 μg/ml). Hodowle prowadzono przez noc w temperaturze 37°C z wytrząsaniem 220 obr/min (cieplarka laboratoryjna, Pol-Eko Aparatura, Polska). Następnie z takich hodowli izolowano plazmidowe DNA używając zestawu do izolacji plazmidowego DNA GeneJET (Thermo Scientific, USA) postępując wg instrukcji producenta. Wyizolowane plazmidowe DNA po analizie na żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (0,5 μg/ml) oraz zmierzeniu jego stężenia przy pomocy Nanodrop (Thermo Scientific, USA) przechowywano w 4°C do przeprowadzenia dalszych eksperymentów.

Przykład 3

Transformacja komórek kompetentnych Escherichia coli Lemo21(DE3)

Do schłodzonej probówki typu Eppendorf dodano 50 μl komórek kompetentnych Escherichia coli Lemo21 (DE3): fhuA2 [lon] ompTgal (λ DE3) [dcm] ,\hsdS/pLemo(Cam^R) λ DE3 = λ sBamHlo AEcoRI-B int::(lacl::PlacUV5::T7genel) i21 Anin5pLemo = pACYC184-PrhaBAD-lysY (NewEngland BioLabs, USA) oraz 2 μl DNA plazmidowego pET-21a (+) z sekwencją kodującą białko zawierające pętlę wiążącą jony Ni²⁺ [TST-eGFP-MBL-Ni²⁺] o stężeniu 30 ng/pl. Mieszaninę dokładnie wymieszano przez pipetowanie i inkubowano w lodzie przez 30 minut. Następnie przeprowadzono szok termiczny, umieszczając probówki w termobloku (Eppendorf, Niemcy) o temperaturze 42°C na 45 sekund.

W kolejnym kroku inkubowano próbki w lodzie przez kolejne 5 minut. Po tym czasie dodano do mieszaniny 500 pl podłoża płynnego SOC (A&A Biotechnology, Polska), następnie prowadzono inkubację w stałej temperaturze 37°C przez 1 godzinę z wytrząsaniem (600 obr/min) w cieplarce laboratoryjnej (Pol-Eko Aparatura, Polska).

Po godzinnej inkubacji hodowlę bakteryjną odwirowano (5 min, 5000 obr/min) (wirówka 5425 G, Eppendorf, Niemcy). Następnie usunięto 400 pl supernatantu a osad komórkowy zawieszono w pozostałym roztworze i wysiano na szalki z podłożem stałym LA wzbogaconym o dodatek chloramfenikolu (20 pg/ml, Carl Roth, Niemcy) oraz ampicyliny (50 pg/ml). Następnie szalki Petriego inkubowano przez noc w temperaturze 37°C, a ostatecznie przechowywano w temperaturze 4°C do dalszych badań.

Przykład 4

Nadprodukcja białka TST-eGFP-MBL-Ni²⁺

Z uzyskanych hodowli na podłożu stałym wybrano pojedyncze kolonie bakterii E. coli Lemo21(DE3) z wtransformowanym rekombinowanym plazmidem niosącym gen kodujący białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ i zaszczepiono w 5 ml podłoża płynnego LB z dodatkiem chloramfenikolu (20 pg/ml) oraz ampicyliny (50 pg/ml). Hodowle prowadzono przez noc w temperaturze 37°C z wytrząsaniem 220 obr/min (cieplarka laboratoryjna, Pol-Eko Aparatura, Polska). Następnie hodowle odmłodzono poprzez dodanie 3 ml hodowli nocnej do 300 ml świeżego podłoża LB z dodatkiem chloramfenikolu oraz ampicyliny. Hodowle prowadzono w zakresie temperatur 18-37°C z wytrząsaniem 220 obr/min do osiągnięcia gęstości optycznej hodowli przy długości fali λ = 600 nm (OD600) wynoszącej 0,5-0,6.

Z hodowli o takiej gęstości pobrano 1 ml do osobnej probówki Eppendorff (kontrola ujemna) a do pozostałej objętości hodowli dodano IPTG (Biosynth, Szwajcaria) o końcowym stężeniu 1 mM w celu przeprowadzenia indukcji nadprodukcji białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ w komórkach bakterii. W trakcie prowadzenia nadprodukcji białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ pobrano próbki o objętości 1 ml po 2 h, 4 h i 24 h od indukcji IPTG. Próbki poddano analizie elektroforetycznej białek w żelu poliakrylamidowym (Fig. 3), zgodnie z Przykładem 6. Wszystkie pobrane próbki odwirowano (5000 obr/min, 5 min), odciągnięto supernatant, a osad zawieszono w 100 pl TE o pH 8,0 (0,5 M EDTA, 1 M Tris-HCL o pH 8,0). Po 24 h od indukcji hodowlę podzielono na próbkę o obj. 50 ml oraz pozostałą część. Obie zwirowano (15 min, 4500 obr/min), odciągnięto supernatant, a uzyskane osady przechowywano w -20°C do czasu oczyszczania (opisanego w Przykładzie 5).

Przykład 5

Oczyszczanie rekombinowanego białka TST-eGFP-MBL-Ni²⁺

Osad z 246 ml hodowli bakteryjnej E. coli Lemo21(DE3) nadprodukującej TST-eGFP-MBL-Ni²⁺po 24 h indukcji zawieszono w 15 ml buforu A (100 mM Tris - HCl pH 8,0; 150 mM NaCI), dodano 150 pl lizozymu (o stężeniu końcowym 0,1 mg/ml). Mieszaninę inkubowano na rotatorze przez 30 minut w temperaturze 4°C. Po upływie tego czasu próbkę umieszczono w zlewce z lodem i przeprowadzono proces sonikacji przy użyciu aparatury Sonopuls (Bandelin, Niemcy) w cyklu trzykrotnym (30 sekund przy amplitudzie 5 mikronów z 30 sekundowym interwałem pomiędzy cyklami, przy 80% mocy). Następnie zdezintegrowane komórki odwirowano (12000 obr/min, 30 min, 4°C). Supernatant przeniesiono do nowej probówki typu Falcon a osad zawieszono w 15 ml buforu B (100 mM Tris - HCl pH 8,0; 150 mM NaCI; 10% sarkozyl; 2% Triton X-100; 1 mM EDTA; 1 mM DTT) i inkubowano przez noc na rotatorze w temperaturze 4°C. Następnie mieszaninę połączono z pierwszym supernatantem i dodano bufor A do objętości 140 ml w celu obniżenia stężenia sarkozylu do wartości poniżej 2%, co jest granicznym stężeniem pozwalającym na efektywne wiązanie Twin-Strep-Tag do kolumny StrepTrap™ HP. Do tak rozcieńczonej mieszaniny dodano 2 μl nukleazy Viscolase (A&A Biotechnology, Polska) i inkubowano w 30°C przez 30 minut. Po tym czasie mieszaninę odwirowano (12000 obr/min, 40 min, 4°C) a następnie lizat (supernatant) poddano filtracji na filtrze membranowym MCE 0,45 μm na systemie do filtracji pod ciśnieniem (Chemax, Polska). Tak przygotowany lizat poddano oczyszczaniu za pomocą chromatografii powinowactwa na kolumnie StrepTrap™ HP (Cytiva, USA) ze złożem Strep-Tactin, z wykorzystaniem chromatografu cieczowego FPLC NGC Quest 10 Plus Chromatography System (Biorad, Niemcy). W pierwszym etapie wykonano równoważenie kolumny poprzez płukanie złoża 5 objętościami kolumny (CV) buforem A, z zastosowaniem stałego przepływu wynoszącego 2 ml/min. Następnie na kolumnę naniesiono 140 ml (1,5 ml/min) wcześniej przygotowanego lizatu. Zbierając frakcje białek niewiążących się ze złożem (tzw. flow through fraction) pobrano próbkę o objętości 50 pi. W kolejnym etapie kolumnę płukano 5 CV (2 ml/min) buforu A i zbierano frakcję odpłukaną (tzw. column wash fraction). Pobrano 50 μl próbki tej frakcji. Następnie przeprowadzono elucję buforem C (100 mM Tris - HCl pH 8,0; 150 mM NaCI; 2,5 mM destiobiotyna) przez 5 CV. Kolektor ustawiono tak, aby zbierał 3-mililitrowe frakcje wymywane z kolumny. Z frakcji, w których na detektorze wykryto wzrost sygnału przy 215 nm, świadczący o obecności wiązania peptydowego w eluencie, pobrano po 50 μl próbki. Po zakończeniu etapu elucji kolumnę płukano buforem B o objętości 3 CV (2 ml/min). Pobrane próbki poddano następnie analizie na żelu poliakrylamidowym, zgodnie z Przykładem 6 (Fig. 4).

Przeprowadzono następnie odsalanie frakcji, w których w poprzednim etapie zweryfikowano (stosując analizę elektroforetyczną białek w żelu poliakrylamidowym, Przykład 6) obecność oczyszczanego białka rekombinowanego TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ wykorzystując metodę dializy.

W pierwszym etapie frakcje połączono i umieszczono w przygotowanym worku dializacyjnym MWCO 10000 w zlewce zawierającej bufor D (20 mM Tris - HCl pH 7,5; 50 mM NaCI) i przez 2 godz. prowadzono dializę w warunkach ciągłego mieszania (mieszadło magnetyczne, 200 rpm) w 4°C. Następnie wymieniono bufor na świeży i prowadzono dializę przez 16 h w warunkach ciągłego mieszania (200 rpm, 4°C). Po tym czasie ponownie wymieniono bufor na świeży i prowadzono dializę warunkach ciągłego mieszania (200 rpm, 4°C) przez kolejne 2 godz. Po tym czasie preparat białkowy przelano z worków dializacyjnych do zlewki. Na etapie przygotowania dializy oraz po jej zakończeniu pobrano po 50 μl próbki preparatu białkowego do analizy na żelu poliakrylamidowym.

Uzyskany preparat białka zagęszczono używając koncentratora wirówkowego o granicy odcięcia 10,000 MWCO (Milipore, USA) w seriach wirowań trwających 3-5 minut (5000 obr/min, 4°C), aż do uzyskania preparatu o objętości końcowej ok. 2 ml, który przechowywano w 4°C do dalszych analiz. Dodatkowo, aby uniknąć jakichkolwiek zanieczyszczeń preparat przefiltrowano przez sterylny filtr strzykawowy (0,45 μm). Stopień czystości uzyskanego preparatu białkowego analizowany był na żelu poliakrylamidowym (Fig. 5), stosując analizę densytometryczną, zgodnie z Przykładem 6. Zmierzono także stężenie preparatu białkowego, zgodnie z Przykładem 7.

W efekcie końcowym stężenie rekombinowanego białka wyniosło 0,8 mg/ml a jego czystość znajdowała się na poziomie minimum 90%. Przygotowany preparat przebadano pod kątem oddziaływań białko-jony Ni²⁺, zgodnie z Przykładem 8.

Przykład 6

Analiza elektroforetyczną białka TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ w żelu poliakrylamidowym μl próbki pobrane z hodowli bakteryjnych (Przykład 4) oraz pobierane po kolejnych etapach oczyszczenia (Przykład 5) odwirowano (5 000 obr/min, 5 min) i usunięto supernatant. Uzyskany osad zawieszono w 100 μl buforu TE. Do nowej probówki przeniesiono 25 μl uzyskanego lizatu dodano 12,5 μl wody oraz 12,5 μl buforu do nanoszenia próbek na żel poliakrylamidowy i inkubowano w termobloku przez 10 min w temperaturze 95°C. Marker białkowy (Color Prestained Protein Standard, Broad Range #P7719 (New England BioLabs, USA)) denaturowano przez 5 min w temperaturze 95°C.

PL 248452 Β1

Do studzienek 12% żelu poliakrylamidowego nanoszono po 20 pl przygotowanych próbek lub 10 pl markera. Elektroforezę prowadzono przy 230 V aż do osiągnięcia przez barwnik dolnej krawędzi żelu rozdzielającego (aparat do elektroforezy z zasilaczem firmy BioRad, USA). Żel poliakrylamidowy po zakończonej elektroforezie delikatnie wyjęto spomiędzy szyb i umieszczono w roztworze barwiącym (Comassie Brilliant Blue R-250, 250 mg/50 ml roztworu, metanol 10 ml/50 ml roztworu, lodowaty kwas octowy 40 ml/50 ml roztworu). Całość umieszczono na wytrząsarce kołyskowej (Biosan, Polska), 5 min, 32 obr/min. Następnie żel odbarwiano poprzez kilkukrotne gotowanie w wodzie. Żel udokumentowano poprzez sfotografowanie z wykorzystaniem transiluminatora (Thermo Fisher Scientific, USA) (Fig. 3, 4, 5). Analizę densytometryczną wykonano na fotografiach za pomocą oprogramowania ImageJ (National Institute of Health, USA) stosując jako standard żel o znanym stężeniu BSA (Sigma Aldrich, Niemcy).

Przykład 7

Pomiar stężenia preparatu białkowego

Przygotowano pięciokrotnie rozcieńczony preparat białkowy. W kuwecie plastikowej umieszczono za pomocą pipety automatycznej 400 pl roztworu białka. Za pomocą Spektrofotometru SPECORD PLUS (Analytik Jena AG, Niemcy) oraz programu WinASCPECT (Analytik Jena AG, Niemcy) zmierzono absorbancję przygotowanego preparatu białkowego przy długości fali równej 280 nm. Za pomocą ogólnodostępnego programu ProtParam (https://web.expasyv.org/protparam/) używając sekwencji aminokwasowej białka TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ (przedstawiona poniżej) uzyskano współczynnik ekstynkcji białka służący do obliczenia stężenia białka z wykorzystaniem otrzymanego wyniku pomiaru absorbancji.

Do przeliczeń użyto sekwencji aminokwasowej białka TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ (269 reszt aminokwasowych) (SEQ ID NO. 3).

Stężenie obliczono ze wzoru:

x A gdzie:

A - absorbancja [-] zmierzona przy długości fali 280 nm e - współczynnik TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ [cm²/mg]

I - grubość warstwy absorpcyjnej [cm] c - stężenie białka [mg/ml] x- rozcieńczenie preparatu białkowego użyte do pomiaru (x = 5)

Końcowo otrzymany preparat białkowy TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ miał stężenie 0,98 mg/ml. Takie stężenie w połączeniu z czystością powyżej 90% pozwalało na przeprowadzenie dalszych analiz.

Przykład 8

Badanie oddziaływań białko-jony Ni²⁺

Jako pojemnik pomiarowy, wybrano kapilarę wykonaną ze szkła krzemionkowego o średnicy wewnętrznego tunelu 0wew = 500 pm i całkowitej zewnętrznej średnicy 0zew = 1000 pm (Sieć Badawcza Łukasiewicz - Instytut Mikroelektroniki i Fotoniki, Polska). Całkowita długość kapilary, wybranej do pomiaru fluorescencji, wyniosła 15 mm, co w rezultacie przekłada się na 2,9 pl całkowitej objętości gromadzonej cieczy.

Przygotowano serię roztworów zawierających białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ o stężeniu c = 0,5 mg/ml oraz jony Ni²⁺ w stężeniach: 10 nM, 50 nM, 500 nM, oraz 5 pM. Stężenia jonów metalu dobrano tak, aby środkowy punkt był zbliżony do normy jakościowej stężenia niklu w wodzie określonymi przez organizację WHO. Pomiary optyczne wykonywano w zacienionym pomieszczeniu laboratoryjnym o temperaturze 21 °C. Do uchwytu kapilary przymocowano specjalną przykrywkę dodatkowo tłumiącą światło zewnętrzne. Spektrometr USB4000 nastawiono na czas integracji 25 ms, a rejestrowane natężenie było dostateczne, aby stosunek sygnału do szumu (SNR) przekraczał 20.

Pomiar oraz analizę danych rozpoczynano od rejestracji widma ciemnego (Fb), w warunkach, gdy kapilara była wypełniona jedynie wodną dejonizowaną. Następnie, po napełnieniu kapilary wybranym roztworem, została ona naświetlana źródłem laserowym i jednocześnie rejestrowano widmo emisji fluorescencji (Fe). Różnica między tymi dwoma pomiarami (AF = Fe - Fb), została użyta do identyfikacji emisji próbki, w zakresie 460-560 nm. Spektrometr USB4000 był nastawiony tak, aby zapisywał i uśredniał za każdym razem pięć pomiarów Fe. Pomiary wykonano dla eGFP-Ni wymieszanego z roztworami jonów metalu NiCb. Analiza danych polega na śledzeniu zmian natężenia fluorescencji, dla długości fali Aem = 510 nm, która została określona jako maksimum emisji analitu IF = AF(A_em) (Fig. 7).

Następnie dla długości fali λοπ odczytano wartości natężenia światła. Wykreślono wykres tych wartości w funkcji stężenia jonów metalu, zaznaczając linią wartość graniczną stężenia określonego w normie WHO (Fig.8).

Zalety wynalazku:

Wynalazek ujawnia pionierską metodę otrzymywania zmodyfikowanego białka eGFP wiążącego jony niklu. Proponowana metoda jest wydajną ścieżką otrzymywania preparatu o wysokim stopniu homogenności. Otrzymuje się rozpuszczalną wersję białka eGFP (formę aktywną), która wykrywa jony Ni²⁺ w zakresie stężeń, które mieszczą się w przedziałach norm dla zawartości niklu w próbkach wody;

Wykrywanie jonów Ni²⁺ możliwe jest nie tylko w próbkach wody, ale także każdej innej próbce w formie płynnej.

Literatura:

1. H. Kim, G. Jang, Y. Yoon, „Specific heavy metal/metalloid sensors: current state and perspectives”, Applied Microbiology and Biotechnology, tom 104, nr 3, pp. 907-914, 2020.

DOl:10.1007/s00253-019-10261-y.

2. D. Barałkiewicz, J. Siepak, „Chromium, Nickel and Cobalt in Environmental Samples and Existing Legal Norms”, Polish Journal of Environmental Studies, tom 8, nr 4, pp. 201-208, 1999.

3. CW. Huang, C. Lin, M. K. Nguyen, A. Hussain, X-T. Bui, H. H. Ngo, „A review of biosensor for environmental monitoring: principle, application, and corresponding achievement of sustainable development goals”, Bioengineered, tom 14, nr 21, 2023, pp 58-80. doi

1080/21655979.2022.2095089.

4. T. Hu, Q. Lai, Y. Zhang, Z. Liu, „Advances in Portable Heavy Metal lon Sensors”, Sensors, tom 23, nr 8, pp. 4125, 2023, DOI: 10.3390/s23084125.

5. S. Chakraborty, S. Rayalu, „Detection of nickel by chemo and fluoro sensing technologies”, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, tom 245, pp. 118915, 2021, DOI: 10.1016/j.saa.2020.118915.

6. J. Jiang, C. Gou, J. Luo, C. Yi, X. Liu, „A novel highly selective colorimetric sensor for Ni(ll) ion using coumarin derivatives”, Inorganic Chemistry Communications, tom 15, pp. 12-15, 2012, DOI: 10.1016/j.inoche.2011.09.027.

7. L. Lin, ST. Hu, YC. Yan, DJ. Wang, L. Fan, YJ. Hu, GD. Yin, „A highly selective chemosensor for nickel(ll) based on fluorescence quenching of a bispyrazole derivative”, Research on Chemical Intermediates, tom 43, nr 1, pp. 283-295, 2017, DOI: 10.1007/s11164-016-2621-9.

8. B. K. Bansod, T. Kumar, R. Thakur, S. Rana, I. Singh, „A review on various electrochemical techniques for heavy metal ions detection with different sensing platforms”, Biosensors and Bioelectronics, tom 94, pp. 443-455, 2017, DOI: 10.1016/j.bios.2017.03.031.

9. N. John, K. E. Abraham, H. A. Miller, „Detection of Selenium and Nickel Metal Ion in Water Using Mn3O4-Cn-Modified Electrode”, International Journal of Electrochemistry, tom 2021, pp. 1-9, 2021, DOI: 10.1155/2021/6650542.

10. Kim H, Lee W, Yoon Y. (2019) Heavy metal(loid) biosensor based on split-enhanced green fluorescent protein: development and characterization. Applied Microbiology and Biotechnology, 103:6345-6352. doi.org/10.1007/s00253-019-09908-7.

11. Lee W, Kim H, Kang Y, Lee Y, Yoon Y. (2019) A biosensor platform for metal detection based on enhanced green fluorescent protein. Sensors, 19(8), 1846. doi: 10.3390/s19081846.

PL 248452 Β1

Lista sekwencji <110> Politechnika Warszawska Instytut Biotechnologii i Medycyny Molekularnej <120> Zmodyfikowane białko zielonej fluorescencji, sposób wytwarzania oraz jego zastosowanie do oznaczania niklu <130> 64576 <160> 3 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Seguence <220>

<223> sekwencja atninokwasowa wiążąca jony niklu <400> 1 Phe Pro Tyr Arg Ser Thr Pro 1 5 < 210> 2 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Seguence jego <220>

< 223> sekwencja aminokwasowa zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL Ni2 + < 400> 2

Met Trp Ser His Pro Gin Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 15 1015

Ser Gly Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gin Phe Glu Lys Val Ser

2530

Lys Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp 35 4045

Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly 50 5560

Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr ThrGly

70 7580

Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr TyrGly

9095

Val Gin Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gin His Asp Phe 100 105110

Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gin Glu Arg Thr Ile Phe 115 120125

Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu

130 135140

PL 248452 Β1

Gly

Asp

Thr

Leu

Val

Asn

Arg

Ile

Glu

Leu

Lys

Gly

Ile

Asp

Phe

Lys

145

150

155

160

Glu

Asp

Gly

Asn

Ile

Leu

Gly

His

Lys

Leu

Glu

Tyr

Asn

Tyr

Asn

Ser

165

170

175

His

Asn

Val

Tyr

Ile

Met

Ala

Asp

Lys

Gin

Lys

Asn

Gly

Ile

Lys

Val

180

185

190

Asn

Phe

Lys

Ile

Arg

His

Asn

Ile

Glu

Asp

Gly

Ser

Val

Gin

Leu

Ala

195

200

205

Asp

His

Tyr

Gin

Asn

Thr

Pro

Ile

Gly

Phe

Pro

Tyr

Arg

Ser

Thr

210

215

220

Pro

Leu

Pro

Asp

Asn

His

Tyr

Leu

Ser

Thr

Gin

Ser

Ala

Leu

Ser

Lys

225

230

235

240

Asp

Pro

Asn

Glu

Lys

Arg

Asp

His

Met

Val

Leu

Glu

Phe

Val

Thr

245

250

255

Ala

Gly

Ile

Thr

Leu

Gly

Met

Asp

Glu

Leu

Tyr

Lys

260

265

<210> 3 <211> 810 <212> DNA <213> Artificial Seąuencs <220>

<223> sekwencja nukleotydowa kodująca białko TST-eGFP-MBL-Ni2+ <400> 3

atgtggtccc	acccgcaatt	tgaaaaaggt ggtggttctg	gtggtggttc	tggtggttct	60
tctgcatggt	ctcatccaca	atttgaaaaa	gtgagcaagg	aggagctgtt	caccggggtg	120
gtgcccatcc	tggtcgagct	ggacggcgac	gtaaacggcc	acaagttcag	cgtgtccggc	180
gagggcgagg	gcgatgccac	ctacggcaag	ctgaccctga	agttcatctg	caccaccggc	240
aagctgcccg	tgccctggcc	caccctcgtg	accaccctga	cctacggcgt	gcagtgcttc	300
agccgctacc	ccgaccacat	gaagcagcac	gacttcttca	agtccgccat	gcccgaaggc	360
tacgtccagg	agcgcaccat	cttcttcaag	gacgacggca	actacaagac	ccgcgccgag	420
gtgaagttcg	agggcgacac	cctggtgaac	cgcatcgagc	tgaagggcat	cgacttcaag	480
gaggacggca	acatcctggg	gcacaagctg	gagtacaact	acaacagcca	caacgtctat	540
atcatggccg	acaagcagaa	gaacggcatc	aaggtgaact	tcaagatccg	ccacaacatc	600
gaggacggca	gcgtgcagct	cgccgaccac	taccagcaga	acacccccat	cggctttccg	660
tatcgcagca	ccccgctgcc	cgacaaccac	tacctgagca	cccagtccgc	cctgagcaaa	720
gaccccaacg actctcggca	agaagcgcga tggacgagct	tcacatggtc gtacaa	ctgctggagt	tcgtgaccgc	cgccgggatc	780 810

Claims

1. Zmodyfikowane, wzmocnione białko zielonej fluorescencji TST-eGFP-MBL-Ni²⁺, znamienne tym, że ma sekwencję aminokwasową, białka eGFP, w której w miejsce sekwencji DGFP obejmującej reszty aminokwasowe od 190 do 193 wstawiono co najmniej jedną, 7-aminokwasową sekwencję SEQ ID NO. 1.

2. Białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ według zastrz. 1 znamienne tym, że sekwencja SEQ ID NO. 1 wiąże jony niklu Ni²⁺.

3. Białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że na końcu aminowym zawiera sekwencję TST.

4. Białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ według dowolnego z zastrz. 1-3, znamienne tym, że ilość wstawionych sekwencji SEQ ID NO. 1 w białku wynosi od 1 do 10.

5. Białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ według zastrz. 4 znamienne tym, że ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO.2 ze wstawioną jedną 7-aminokwasową sekwencją SEQ ID NO. 1.

6. Konstrukt genetyczny o sekwencji SEQ ID NO. 3, którego ekspresja daje produkt w postaci zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ o SEQ ID NO. 2 jak opisano w zastrzeżeniu 5.

7. Sposób wytwarzania zmodyfikowanego białka eGFP określonego zastrzeżeniem 1, w komórkach bakteryjnych znamienny tym, że obejmuje etap, w którym do komórek bakterii wprowadza się wektor ekspresyjny zawierający konstrukt genetyczny o sekwencji kodującej białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺, korzystnie konstrukt genetyczny o SEQ ID NO. 3.

8. Sposób według zastrz. 7 obejmujący ponadto etapy, w których:

c) odwirowuje się i zawiesza osad w buforze z lizozymem,

d) przeprowadza się sonikację,

e) prowadzi się odwirowanie zdezintegrowanych komórek 30 min. przy 12000 obr/min w 4°C,

f) zbiera się supernatant,

g) zawiesza się pozostały osad w buforze z sarkozylem i tritonem Χ-100 i inkubuje lizat komórek przez noc w celu odzyskania frakcji nierozpuszczalnego białka,

h) łączy się frakcje lizatu z etapu f) i etapu g),

i) inkubuje się lizat z dodatkiem nukleaz,

j) prowadzi się odwirowanie 40 min przy 12000 obr/min w 4°C,

k) filtruje się uzyskany supernatant na filtrze membranowym MCE 0,45 μm

l) oczyszcza się z supernatantu aktywne, rekombinowane białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺za pomocą chromatografii powinowactwa na złożu wiążącym domenę Strep-Tag,

m) odsala się frakcje, w których potwierdzono obecność białka eGFP za pomocą dializy, n) zagęszcza się frakcje, w których detektor wykrył wiązanie peptydowe na koncentratorze wirówkowym o granicy odcięcia 10,000 MWCO 3-5 minut w 4°C, 5000 obr/min,

o) uzyskuje się zmodyfikowane białko eGFP o stężeniu 0,8 mg/ml i czystości powyżej 90%.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że hodowlę w etapie a) prowadzi się w zakresie temperatur 18-37°C z wytrząsaniem 200-250 obr/min.

10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że indukcję w etapie b) przeprowadza się w momencie osiągnięcia przez bakterie gęstości hodowli OD600 0,5-0,6.

11. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że w etapie b) końcowe stężenie IPTG wynosi 0,1-2 mM, a czas hodowli od momentu indukcji do zebrania komórek wynosi od 2 do 30 h.

12. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że w etapie c) wirowanie prowadzi się 15 min przy 4500 obr/min, a stężenie lizozymu w buforze wynosi 0,1 mg/ml.

13. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że w etapie d) parametry sonikacji to 30 sekund przy amplitudzie 5 mikronów z 30-sekundowym interwałem pomiędzy cyklami, przy 80% mocy sonikatora.

14. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że bufor stosowany w etapie g) zawiera dodatek detergentów anionowych i niejonowych.

PL 248452 Β1

15. Sposób według zastrzeżenia 14 znamienny tym, że bufor stosowany w etapie g) zawiera 2-10% sarkozyl i 2% Triton Χ-100.

16. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że w etapie i) dodaje się nukleazy w stężeniu 3,5 U/ml lizatu.

17. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że w etapie o) otrzymuje się aktywną, rozpuszczalną formę białka eGFP określonego w zastrz. 1.

18. Zastosowanie zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ określonego w zastrz. 1 jako element biosensora do detekcji jonów niklu w biologicznych próbkach ciekłych.

19. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że próbką ciekłą jest próbka wody.

20. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że białko eGFP oddziałuje z jonami Ni²⁺, powodując zmianę poziomu intensywności fluorescencji.

21. Sposób pomiaru stężenia jonów niklu w próbkach ciekłych, znamienny tym, że białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ określone w zastrz. 1 miesza się z próbką zawierającą jony niklu, a następnie rejestruje się widmo fluorescencji i odczytuje maksimum intensywności dla emisji przy długości fali λ = 500-530 nm, po wzbudzeniu białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ falą o długości λ =470-500 nm.

22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że do pomiaru stosuje się białko TST-eGFP-MBL-Ni²⁺ w stężeniu od 0,05 mg/ml do 5 mg/ml.

23. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że pomiaru dokonuje się w biologicznych próbkach ciekłych.

24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że próbką ciekłą jest próbka wody.

25. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że stężenie badanych jonów niklu mieści się w zakresie od 50 nM do 5 pM.