PL248451B1 - Zmodyfikowane wzmocnione białko zielonej fluorescencji eGFP, konstrukt genetyczny kodujący zmodyfikowane białko eGFP, zastosowanie zmodyfikowanego białka eGFP do detekcji jonów rtęci oraz sposób pomiaru stężenia jonów rtęci z wykorzystaniem zmodyfikowanego białka eGFP - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest zmodyfikowane wzmocnione białko zielonej fluorescencji eGFP zdolne do wiązania jonów rtęci, sposób jego wytwarzania, konstrukt genetyczny kodujący zmodyfikowane białko eGFP, zastosowanie zmodyfikowanego białka eGFP jako element biosensora do detekcji jonów rtęci oraz sposób pomiaru stężenia jonów rtęci z wykorzystaniem zmodyfikowanego białka eGFP w ciekłych próbkach biologicznych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowane wzmocnione białko zielonej fluorescencji eGFP zdolne do wiązania jonów rtęci, konstrukt genetyczny kodujący zmodyfikowane białko eGFP, sposób wytwarzania zmodyfikowanego białka eGFP oraz jego zastosowanie do detekcji jonów rtęci w ciekłych próbkach biologicznych. Wynalazek znajduje zastosowanie w monitoringu zanieczyszczeń środowiska.

Zanieczyszczenie wód rtęcią stało się poważnym problemem ekologicznym, mającym dalekosiężne skutki dla ekosystemów, fauny oraz zdrowia ludzi. Rtęć, naturalnie występujący pierwiastek, dostaje się do środowisk wodnych poprzez różne szlaki. Główne źródła emisji rtęci to wybuchy wulkanów, aktywność geotermalna, wietrzenie skał, pożary lasów oraz spalanie paliw kopalnianych takich jak węgiel czy ropa naftowa. Reemisja rtęci zgromadzonej wcześniej w środowisku w sposób naturalny lub w wyniku działalności człowieka stanowi aż 60% rozkładu globalnej emisji tego pierwiastka (Asaduzzaman A. i wsp., 2019).

W atmosferze rtęć występuje głównie w postaci elementarnej. Łatwo ulega asymilacji przez drogi oddechowe oraz jest w stanie przekroczyć barierę krew-mózg i ulec utlenieniu do formy jonowej Hg²⁺. Może przedostawać się do atmosfery w stanie gazowym z termometrów, amalgamatu dentystycznego czy farb lateksowych (Bj0rklund G. i wsp., 2017). Dzięki właściwościom fizycznym, m.in: lotności, wysokiej prężność par i niskiej rozpuszczalności w wodzie, może być transportowana na dalekie odległości. Lotność i wysoka prężność par rtęci wydłużają czas przebywania rtęci w atmosferze i zmniejszają zdolność do osadzana się. Rtęć ulega sorpcji i desorpcji z małymi cząsteczkami, takimi jak pył czy sadza, wskutek czego może się przedostawać do środowiska wodnego. Związki takie jak reaktywne halogenki, rodnik hydroksylowy, ozon czy nadtlenek wodoru obecne w powietrzu utleniają rtęć do formy Hg²⁺, która również, w wyniku np. opadów atmosferycznych, może dostawać się do wody (Gonzalez-Raymat H. i wsp., 2017).

Wraz z szybkim rozwojem przemysłu poziom metali ciężkich w środowisku gwałtownie wzrasta, stanowiąc poważne zagrożenie dla wszystkich organizmów. W związku z tym monitorowanie zanieczyszczenia środowiska metalami ciężkimi, w tym rtęcią, stało się niezwykle ważne.

Tradycyjną techniką pozwalającą na kontrolowanie poziomu pierwiastków w ekosystemie jest analiza instrumentalna. Wykrycie i oznaczenie ilościowe metalu ciężkiego w badanej próbce środowiskowej może być wykonane za pomocą chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (GC-MS), spektrometrii atomowej emisyjnej z indukcyjnie sprzężoną plazmą (ICP-AES), wysokosprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (HPLC-MS) czy spektrometrii mas ze wzbudzeniem w plazmie indukcyjnie sprzężonej (ICP-MS) (Kim H. i wsp., 2020). Popularność stosowania tych technik wynika z ich wysokiej czułości i dokładności, lecz niestety nie są one wolne od wad. Przygotowanie próbek do analizy jest skomplikowane i czasochłonne, z kolei sprzęt jest drogi i wymaga obsługi przez dobrze wykwalifikowany personel. Ponadto, próbka wymaga transportu do specjalistycznego laboratorium, więc nie może być analizowana w czasie rzeczywistym w miejscu jej pobrania. Wynik analizy określa całkowitą ilość metali ciężkich w badanym materiale, co nie reprezentuje części aktywnych biologicznie jonów. Dana próbka w zależności od pochodzenia środowiskowego może różnić się dostępnością aktywnych biologicznie jonów ze względu na różnice w rozpuszczalności czy kompleksowanie z innymi obecnymi w próbce związkami (Kim H. i wsp., 2019 i Kim H. i wsp., 2020).

Współcześnie poszukiwane są alternatywne narzędzia oparte na elektrochemii i systemach biologicznych, takich jak peptydy, białka czy całe mikroorganizmy. Czujniki chemiczne i biosensory są szybsze i prostsze niż tradycyjne techniki oparte na analizie instrumentalnej. Większość zaprojektowanych układów, wskutek interakcji z jonami metali, daje odpowiedź w postaci indukcji ekspresji genów reporterowych, zmiany konformacyjnej białka, wygaszania lub emisji fluoroforów, czy przesunięcia spektroskopowego (Kim H. i wsp., 2020). Dodatkowo, biosensory oparte na systemach biologicznych wypadają lepiej w porównaniu z konwencjonalnymi technikami z powodu możliwości zastosowania ich do pomiarów toksykologicznych.

Do czułego i selektywnego wykrywania jonów rtęci Hg²⁺ zaproponowano np. biosensor oparty na chemii koordynacyjnej tymina-Hg²⁺-tymina. Zakłada on współpracę jonów rtęci z proksymalnymi poli-T oligonukleotydami, wyznakowanymi ferrocenem i immobilizowanymi na powierzchni elektrody. Pod wpływem metalu para poli-T oligonukleotydów podlega zmianom konformacyjnym, wskutek których z pojedynczych elastycznych nici powstają dosyć sztywne kompleksy przypominające dupleksy. Powoduje to z kolei odsunięcie od elektrody znacznika i obniżenie prądu redoks (Liu SJ. i wsp., 2009). Sensory elektrochemiczne charakteryzują się niskim kosztem produkcji, krótkim czasem analizy, prostotą obsługi oraz możliwością wykonania analizy w terenie. Niestety wypadają gorzej w porównaniu z technikami spektroskopowymi i optycznymi, ze względu na niższą czułość i granicę wykrywalności (Bansod BK. i wsp., 2017).

W ostatnich latach wiele uwagi poświęcono w szczególności rozwojowi biosensorów całokomórkowych (ang. whole cell biosensors, WCB), które zazwyczaj zawierają domeny wykrywające i reporterowe (Belkin S., 2003). Do wykrywania związków chemicznych, najczęściej za pośrednictwem sygnałów optycznych, wykorzystuje się specyficzne reakcje biochemiczne, w których pośredniczą całe komórki. Ich działanie opiera się głównie na reakcji operonów w odpowiedzi na stres komórkowy, wywoływany przez czynniki takie jak: wysokie temperatury, antybiotyki i metale. Komórki stanowiące podstawę detektora WCB to najczęściej modyfikowane genetycznie komórki bakteryjne Escherichia coli (E. coli), posiadające region promotora operonu zależnego od jonów metali oraz gen reporterowy (Lee W. i wsp., 2019 i Fernandez-López R. i wsp., 2015). Przy braku odpowiednich jonów metali białko regulatorowe wiąże się z sekwencją DNA operatora, co zapobiega transkrypcji genów reporterowych. Po przyłączeniu jonu metalu do białka regulatorowego dochodzi do utworzenia kompleksu białko-metal-jon, który oddysocjowuje od operatora lub powoduje przełączenie represora w aktywator, umożliwiając tym samym transkrypcję genów reporterowych. W tej roli najczęściej stosuje się β-galaktozydazę, lucyferazę czy białko zielonej fluorescencji, ponieważ do wytworzenia sygnałów wyjściowych nie wymagają one obecności dodatkowych składników, a sygnały te są łatwo wykrywalne (Jung J. i Lee SJ., 2019). Jakościowa i ilościowa ocena zawartości metalu w środowisku jest możliwa dzięki wprost proporcjonalnemu stosunkowi poziomu ekspresji genów reporterowych do zawartości analitu w próbce.

Innowacyjnym podejściem do tematu mogą być biosensory bazujące na zmodyfikowanym wzmocnionym białku zielonej fluorescencji (ang. enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP). Białko to znajduje powszechne zastosowanie w medycynie, biotechnologii czy biologii molekularnej, m.in. przy wizualizacji komórek, fuzji z innymi białkami czy badaniach odziaływań białko-białko. Poprzez wprowadzenie modyfikacji w obrębie chromoforu można też wpływać na jego fotostabilność, czy intensywność świecenia. Ostatnie badania pokazują również, że białko eGFP może być wykorzystane do monitorowania zanieczyszczeń próbek jonami metali ciężkich (Lee W. i wsp., 2019 i Kim H. i wsp., 2019).

W stanie techniki znane są sposoby monitorowania zanieczyszczeń środowiska z użyciem biosensorów stanowiących komórki bakterii niosących zmodyfikowane białko zielonej fluorescencji. W publikacji Lee W. i wsp., 2019, przedstawiono nową strategię monitorowania zanieczyszczeń środowiska dzięki wykorzystaniu systemu split-eGFP. eGFP. Autorzy przedstawiają, że połączenie dwóch fragmentów białka eGFP może prowadzić do odtworzenia natywnej struktury. W związku z tym zaprojektowano dwa nowe biosensory, bazujące na wykorzystaniu całych komórek bakterii E. coli, zdolne do wykrywania jonów kadmu (Cd²⁺) i rtęci (Hg²⁺). Osiągnięto to poprzez wstawienie pętli wiążących metal (ang. Metal Binding Loop, MBL) między β-kartki 9 i 10 białka eGFP, które następnie ulegają zmianom konformacyjnym w wyniku interakcji między MBL a jonami Cd²⁺ lub Hg²⁺. Związanie metalu powoduje emisję fluorescencji, którą można następnie monitorować z wykorzystaniem klasycznych technik analitycznych. W rezultacie stworzono dwa biosensory wykorzystujące bakterie E. coli, które wykazywały sygnał fluorescencyjny tylko podczas interakcji z jonami kadmu/rtęci, ujawniając perspektywę nowych biosensorów do specyficznego wykrywania jonów wybranych metali ciężkich. Z kolei w publikacji Kim H i wsp., 2019, opisano zmodyfikowane białko eGFP zdolne do wykrywania jonów kadmu i rtęci poprzez wstawienie MBL do regionu pętli eGFP, aby uczynić to białko nieaktywnym i wykazać, że wiązanie jonów metalu do MBL indukuje zmianę konformacyjną i przywraca pierwotną aktywność. W szczególności przebadano białko eGFP z sekwencją MBL CTTCGCG i wykazano, że biosensor WBC zawierający takie białko pozwala na ilościowe oznaczenie powyższych metali w zakresie stężeń 0-5 μM. W celu praktycznej weryfikacji przydatności opracowany biosensor wykorzystano do ilościowego oznaczenia kadmu w sztucznie zmienionych próbkach gleby i wody. Uzyskane wyniki sugerowały, że czułość czujnika nie jest wystarczająca i musi zostać znacznie poprawiona. Natomiast w pracy Wang X i wsp., 2017 wykorzystując metodę fage display wykazano specyficzność wiązania jonów rtęci do 7-aminokwasowej sekwencji TSYGRSS.

W publikacji Kim H i wsp., 2020, przedstawiono przegląd różnych rodzajów biosensorów wykorzystywanych do analizy wybranych jonów metali ciężkich.

Rozwiązania ze stanu techniki wykorzystywane obecnie do pomiaru stężenia jonów rtęci w próbkach są czasochłonne i kosztowne oraz wymagają wstępnej obróbki próbki przed analizą i nie są możliwe do zastosowania bezpośrednio w miejscu poboru próbki. Biosensory stosowane do oznaczania innych jonów metali ciężkich takich jak kadm, oparte na całych komórkach bakteryjnych (WCB), charakteryzuje niska selektywność/czułość, ograniczona liczba systemów genetycznych, wielogodzinny czas odpowiedzi na obecność metalu, konieczność hodowli mikroorganizmu, z czym wiąże się konieczność zachowania odpowiednich warunków (np. zapewnienie temperatury 30-37°C do inkubacji WCB).

W stanie techniki brakuje szybkich i bezpośrednich testów do wykrywania obecności metali ciężkich bezpośrednio w miejscu pobrania, które nie wymagają wstępnej obróbki materiału oraz późniejszych etapów laboratoryjnych.

Celem wynalazku jest wykorzystanie zmodyfikowanego wzmocnionego fuzyjnego białka eGFP w układach biosensorycznych, pozwalających na wykrywanie in situ jonów metalu rtęci w sposób szybki, prosty, tani i mobilny. Jony można wykrywać w dowolnej próbce płynnej i w miejscu pobrania próbki.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowane wzmocnione białko zielonej fluorescencji TST-eGFP-MBL-Hg²⁺, które zawiera co najmniej jedną 9-aminokwasową sekwencję SEQ ID NO. 1 wstawioną w miejsce sekwencji DGFP obejmującej reszty aminokwasowe od 190 do 193 białka eGFP. Korzystnie białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ zawiera od 1 do 10 powtórzeń sekwencji SEQID NO. 1. Sekwencja SEQ ID NO. 1 wiąże jony rtęci Hg²⁺.

Korzystnie, białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ zawiera jedną 9-aminokwasową sekwencję SEQ ID NO. 1 i posiada sekwencję aminokwasową SEQ ID NO. 2.

Białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ na końcu aminowym zawiera sekwencję TST.

Przedmiotem wynalazku jest też konstrukt genetyczny o sekwencji SEQ ID NO. 3, którego ekspresja daje produkt w postaci zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ o SEQ ID NO. 2.

Ponadto, wynalazek obejmuje sposób wytwarzania zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ w komórkach bakteryjnych, obejmujący etap wprowadzenia do komórek bakterii wektora ekspresyjnego zawierającego konstrukt genetyczny kodujący białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ z co najmniej jedną aminokwasową sekwencją SEQ ID NO. 1. Korzystnie sposób obejmuje etap wprowadzenia do komórek bakterii wektora ekspresyjnego zawierającego konstrukt genetyczny o SEQ ID NO. 3 kodujący białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ z jedną aminokwasową sekwencją SEQ ID NO. 1.

Sposób wytwarzania zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ według wynalazku obejmuje etapy:

a) wprowadzenie wektora ekspresyjnego zawierającego konstrukt genetyczny kodujący białko TST-

-eGFP-MBL-Hg²⁺ do komórek bakterii E. coli,

b) hodowlę bakterii w podłożu płynnym z wytrząsaniem,

c) indukcję nadekspresji konstruktu genetycznego do wytwarzania zmodyfikowanego białka eGFP przy zastosowaniu IPTG,

d) odwirowanie i zawieszenie osadu w buforze z lizozymem,

e) sonikację,

f) odwirowanie zdezintegrowanych komórek,

g) zebranie supernatantu,

h) zawieszenie pozostałego osadu w buforze z sarkozylem i tritonem Χ-100 i inkubację lizatu komórek w celu odzyskania frakcji nierozpuszczalnego białka,

i) połączenie frakcji lizatu z etapu g) i etapu h),

j) inkubację lizatu z dodatkiem nukleaz,

k) odwirowanie przy 12000 obr/min w 4°C,

l) filtrację uzyskanego supernatantu na filtrze membranowym MCE 0,45 μΜ,

m) oczyszczanie z supernatantu aktywnego, rekombinowanego białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ za pomocą chromatografii powinowactwa na złożu wiążącym domenę Strep-Tag,

n) odsalanie frakcji, w których potwierdzono obecność białka eGFP za pomocą chromatografii cieczowej na kolumnie ze złożem odsalającym,

o) zagęszczenie frakcji, w których detektor wykrył wiązanie peptydowe, na koncentratorze wirówkowym o granicy odcięcia 10,000 MWCO,

p) uzyskanie zmodyfikowanego białka eGFP o czystości powyżej 90%.

Korzystnie hodowla w etapie b) prowadzona jest w zakresie temperatur 18-37°C z wytrząsaniem 200-250 obr/min.

Korzystnie w etapie c) indukcja następuje w momencie osiągnięcia przez bakterie gęstości hodowli OD600 0,5-0,6, końcowe stężenie IPTG wynosi 0,1-2 mM, a czas hodowli od momentu indukcji do zebrania komórek wynosi od 2 do 30 h.

Korzystnie wirowanie w etapie d) prowadzi się 15 min przy 4500 obr/min, a stężenie lizozymu w buforze wynosi 0,1 mg/ml.

Korzystnie, w etapie e) parametry sonikacji to 30 sekund przy amplitudzie 5 mikronów z 30-sekundowym interwałem pomiędzy cyklami, przy 80% mocy sonikatora.

W etapie h) w buforze stosuje się dodatek detergentów anionowych i niejonowych, a inkubację prowadzi się przez noc. Stosuje się 2-10% sarkozyl i 2% Triton X-100.

Odwirowanie w etapie k) prowadzi się 40 min, a zagęszczanie w etapie o) w czasie 3-5 minut w 4°C przy 5000 obr/min.

W etapie j) dodaje się nukleazy w stężeniu 3,5 U/ml lizatu.

W etapie p) otrzymuje się aktywną, rozpuszczalną formę białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ zawierającego sekwencję aminokwasową SEQ ID NO. 1.

Zmodyfikowane wzmocnione białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ według wynalazku stosuje się jako biosensor do detekcji jonów rtęci w biologicznych próbkach ciekłych, przy czym korzystnie próbką ciekłą jest próbka wody.

Korzystnie, zastosowanie zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ charakteryzuje się tym, że białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ oddziałuje z jonami Hg²⁺, powodując zmianę poziomu intensywności fluorescencji.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób pomiaru stężenia jonów rtęci z wykorzystaniem zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ według wynalazku, w którym białko TST-eGFP- MBL-Hg²⁺ miesza się z próbką zawierającą jony rtęci, a następnie rejestruje widmo fluorescencji i odczytuje maksimum intensywności dla emisji przy długości fali z zakresu λ = 500-530 nm, po wzbudzeniu białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ falą o długości z zakresu λ =470-500 nm. Stężenie zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ użytego do pomiaru korzystnie wynosi od 0,05 mg/ml do 5 mg/ml. Pomiaru dokonuje się w biologicznych próbkach ciekłych, korzystnie w próbkach wody. Sposób według wynalazku obejmuje stężenie badanych jonów rtęci w zakresie od 10 nM do 5 μΜ.

Krótki opis figur rysunku

Przedmiot wynalazku został objaśniony w przykładach wykonania na rysunku, na którym: Fig. 1 przedstawia schemat mechanizmu działania zmodyfikowanego białka eGFP z pętlą MBL, Fig. 2 przedstawia mapę plazmidu ekspresyjnego pET21a(+) wykorzystywanego do przygotowania konstruktów genowych, Fig. 3 przedstawia rozdział elektroforetyczny (SDS-PAGE) białek bakteryjnych szczepu E. coli Lemo21 (DE3) nadprodukującego białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺, Fig. 4 przedstawia wynik rozdziału elektroforetycznego w żelu poliakrylamidowym produktów oczyszczania białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ metodą chromatografii powinowactwa, Fig. 5 przedstawia wynik rozdziału elektroforetycznego w żelu poliakrylamidowym produktów oczyszczania TST-eGFP-MBL-Hg²⁺, Fig. 6 przedstawia schemat układu pomiarowego, Fig. 7 przedstawia wyniki pomiarów emisji fluorescencji TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ w obecności różnych stężeń metalu, a Fig. 8 przedstawia zmianę poziomu natężenia fluorescencji odczytanej w λem = 510 nm, dla kolejnych pomiarów białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ z rosnącym stężeniem metalu.

Przedstawione na Fig. 1 białko eGFP składa się z 11 β-kartek, podzielonych na 2 podjednostki zawierające: pierwszych 9 β-kartek (większa podjednostka z lewej strony) oraz dwie ostatnie, 10 i 11 β-kartkę (mniejsza podjednostka z prawej strony), przy czym (A) białko natywne, niezmodyfikowane wykazuje naturalną fluorescencję, (B) białko zmodyfikowane, do którego w regionie pętli aminokwasowej pomiędzy 9 i 10 β-kartką wprowadzono sekwencję wiążącą metal MBL nie wykazuje fluorescencji. Wstawienie sekwencji MBL w pętli powoduje jej wydłużenie, przez co dochodzi do oddalenia się od siebie podjednostek zmodyfikowanego białka eGFP oraz zmiany w obrębie chromoforu. W konsekwencji prowadzi to do utraty zdolności fluorescencji przez zmodyfikowane białko eGFP. (C) Po związaniu jonów metalu do MBL następuje zmiana konformacyjna zmodyfikowanego eGFP, polegająca na zmniejszeniu dystansu pomiędzy fragmentami białka i gdy znajdą się one odpowiednio blisko siebie, zmodyfikowane białko eGFP ponownie wykazuje fluorescencję.

Fig. 2 przedstawia mapę plazmidu ekspresyjnego pET21a(+) (Addgene, USA), wykorzystywanego do przygotowania konstruktów genowych. W miejscu cięcia enzymów restrykcyjnych Ndel oraz Sall (zaznaczone w górnej części mapy plazmidu) wprowadzono zmodyfikowaną sekwencję eGFP.

Fig. 3 przedstawia rozdział elektroforetyczny (SDS-PAGE) białek bakteryjnych szczepu E. coli Lemo21 (DE3) nadprodukującego białkoTST-eGFP-MBL-Hg²⁺. Poszczególne ścieżki przedstawiają:

- marker wielkości białek (#26610),

- lizat komórkowy przed indukcją,

- lizat komórkowy po 21 h indukcji w 30°C.

Strzałką oznaczono białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ o wielkości 30 kDa.

Fig. 4 przedstawia wynik rozdziału elektroforetycznego w żelu poliakrylamidowym produktów oczyszczania białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ metodą chromatografii powinowactwa na kolumnie StrepTrap™ HP. Poszczególne ścieżki przedstawiają:

- lizat komórkowy E. coli Lemo21(DE3),

- nakładany na kolumnę lizat komórkowy E. coli Lemo21 (DE3) inkubowany z sarkozylem,

- frakcja białek niewiążących się ze złożem (A6),

- frakcja białek po płukaniu kolumny buforem A (A8),

- marker wielkości białek (#26614),

- frakcjaB20,

- frakcjaB23,

- frakcjaB27,

- frakcjaB31,

- frakcjaB38.

Strzałką oznaczono białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ o wielkości 30 kDa.

Fig. 5 przedstawia wynik rozdziału elektroforetycznego w żelu poliakrylamidowym produktów oczyszczania TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ na różnych etapach procesu: żel A - po etapie odsalania na kolumnie Bio-Gel P-6 Desalting, gdzie ścieżki oznaczają:

- nakładana na kolumnę pula frakcji do odsalania (frakcje B20-B38),

- odsolona frakcjaB12,

- odsolona frakcjaB14,

- odsolona frakcjaB18,

- odsolona frakcjaB20,

- marker wielkości białek (#26614).

Strzałką oznaczono białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ o wielkości 30 kDa.

żel B - zagęszczony preparat białkowy:

- marker wielkości białek (#26614),

- zagęszczony preparat białkowy (1 μθ,

- zagęszczony preparat białkowy (5 μθ.

Strzałką oznaczono białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ o wielkości 30 kDa.

Fig. 6 przedstawia schemat autorskiego układu pomiarowego, składającego się ze źródła światła laserowego skierowanego na badaną ciekłą próbkę umieszczoną w kapilarze. Emitowane z próbki światło fluorescencyjne poprzez światłowód kierowane jest do detektora.

Fig. 7 przedstawia wyniki pomiarów emisji fluorescencji TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ w obecności różnych stężeń metalu.

Fig. 8 przedstawia zmianę poziomu natężenia fluorescencji odczytanej w λem = 510 nm, dla kolejnych pomiarów białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ z rosnącym stężeniem metalu. Na wykresie pionową przerywaną linią zaznaczono dopuszczalny limit stężenia rtęci na II stopniu utlenienia w wodzie wg. Normy WHO.

Przykłady wykonania

Wynalazek ujawnia sposób otrzymywania, oczyszczania i wykorzystania zmodyfikowanego wzmocnionego białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺, wiążącego jony rtęci na drugim stopniu utlenienia, przy czym otrzymuje się aktywną formę białka produkowanego w systemie bakteryjnym.

Rozwiązanie bazuje na modyfikacji eGFP typu split-protein system, które zakłada rozdzielenie białka na dwie podjednostki lub domeny. W natywnej formie zmodyfikowane białko jest nieaktywne, jego aktywacja następuje dopiero, gdy oba fragmenty znajdą się w swoim bliskim sąsiedztwie po związaniu jonów rtęci (Fig. 1).

Zmodyfikowane białko eGFP wiążące jony rtęci zostało otrzymane z wykorzystaniem inżynierii genetycznej (modyfikacja split-protein) w ten sposób, że w miejsce sekwencji 4 aminokwasów (DGPV) znajdującej się pomiędzy strukturami β-kartek nr 9 i 10 tego białka wprowadzono odpowiednio jedną lub więcej sekwencję aminokwasową ATSYGRSSA (SEQ ID NO. 1), która wiąże selektywnie jony rtęci.

Modyfikację genetyczną uzyskano dzięki usunięciu w genie kodującym białko eGFP sekwencji nukleotydowej 5'GACGGCCCCGTG3' (nukleotydy od pozycji 568 do 579) i na jej miejsce wstawienie w tym samym miejscu co najmniej jednej sekwencji nukleotydowej 5'GCAACCAGCTATGGTCGTAGCAGCGCG3' kodującej sekwencję MBL wiążącą jony metalu. Ponadto, białko zawiera dołączoną na końcu aminowym domenę TST czyli Twin-Strep-Tag (WSHPQFEK-GGGSGGGSGG-SAWSHPQFEK), umożliwiającą jego efektywne oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa.

Opracowane rozwiązanie bazuje na hodowli okresowej bakterii z gatunku E. coli w podłożu płynnym LB, nadprodukujących (po uprzednim zaindukowaniu IPTG lub laktozą) zmodyfikowane białko eGFP wiążące jony Hg²⁺. Po hodowli prowadzi się izolację białka z komórek E. coli, zwiększa jego rozpuszczalność przez wielogodzinną inkubację w buforze zawierającym stężone detergenty anionowe (sarkozyl) oraz niejonowe (Triton X-100) i prowadzi się oczyszczanie na kolumnie zawierającej złoże wiążące domenę Twin-Strep-Tag metodą grawitacyjną lub z wykorzystaniem chromatografu FPLC. Wypracowane rozwiązanie umożliwia otrzymywanie aktywnego białka w dużych ilościach. Następnie oczyszczone białko znajduje zastosowanie do zbadania aktywności w układzie białko-dedykowany metal, co potwierdza możliwość wykorzystania uzyskanego konstruktu do badania stężenia jonów Hg²⁺ w zakresie dopuszczalnego limitu stężenia Hg²⁺ w wodzie wg. normy WHO.

P rzy kła d I

Przygotowanie konstruktu genowego do nadprodukcji rekombinowanego białka eGFP wiążącego jony rtęci na drugim stopniu utlenienia

Do wektora pET-21 a (+) (Sigma Aldrich, Niemcy, nr kat. 69740) wprowadzono w miejsce enzymów restrykcyjnych Ndel oraz Sall zmodyfikowaną sekwencję kodującą białko eGFP (Fig. 2). Sekwencję (SEQ ID NO. 3) uzyskano w ten sposób, że do sekwencji nukleotydowej kodującej białko eGFP (810 pz) na N-końcu dodano sekwencję kodującą znacznik białkowy Twin-Strep-Tag, a w miejscu sekwencji kodującej oryginalnie 4 reszty aminokwasowe DGPV wprowadzono sekwencję kodującą pętlę selektywnie wiążącą jony rtęci na drugim stopniu utlenienia (MBL-Hg²⁺). Sekwencja została wstawiona tak, że znajduje się pod kontrolą indukowalnego promotora T7.

Zaprojektowany wektor ekspresyjny został zamówiony do syntezy (Gene Universal, USA) i wykorzystany do transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli DH103 zgodnie z Przykładem II.

P rzy kła d I I

Transformacja komórek kompetentnych DH103 wektorem ekspresyjnym otrzymanym w przykładzie I oraz izolacja plazmidowego DNA

Do schłodzonej probówki typu Eppendorf dodano 50 μl komórek kompetentnych Escherichia coli DH10β F - mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80Ι3οΖΔΜ15 AlacX74 recA1 endA1 araD139 Λ (ara-leu)7697 galU galKλ - rpsL(StrR) nupG (ThermoScientific, USA) oraz 2 μl DNA plazmidowego pET-21 a (+) z sekwencją kodującą białko zawierające pętlę wiążącą jony Hg²⁺ [TST-eGFP-MBL-Hg²⁺] o stężeniu 5 ng/pl. Mieszaninę dokładnie wymieszano przez pipetowanie i inkubowano w lodzie przez 30 minut. Następnie przeprowadzono szok termiczny umieszczając probówki w termobloku (Eppendorf, Niemcy) o temperaturze 42°C na 45 sekund. W kolejnym kroku inkubowano próbki w lodzie przez kolejne 5 minut. Po tym czasie dodano do mieszaniny 500 μl podłoża płynnego SOC (A&A Biotechnology, Polska), następnie prowadzono inkubację w stałej temperaturze 37°C przez 1 godzinę z wytrząsaniem (600 obr/min) w cieplarce laboratoryjnej (Pol-Eko Aparatura, Polska). Po godzinnej inkubacji hodowlę bakteryjną odwirowano (5 min, 5000 obr/min) (wirówka 5425 G, Eppendorf, Niemcy). Następnie usunięto 400 μl supernatantu, a osad komórkowy zawieszono w pozostałym roztworze i wysiano na szalki z selekcyjnym podłożem stałym LA wzbogaconym o dodatek ampicyliny (50 μg/ml; Carl Roth, Niemcy). Następnie szalki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Po tym czasie pojedyncze kolonie bakterii, które wyrosły na szalce z podłożem selekcyjnym zaszczepiono do hodowli w płynnym podłożu LB o objętości 5 ml wzbogaconym o dodatek ampicyliny (50 μg/ml). Hodowle prowadzono przez noc w temperaturze 37°C z wytrząsaniem 220 obr/min (cieplarka laboratoryjna, Pol-Eko Aparatura, Polska). Następnie, z takich hodowli izolowano plazmidowe DNA używając zestawu do izolacji plazmidowego DNA GeneJET (Thermo Scientific, USA) postępując wg instrukcji producenta. Wyizolowane plazmidowe DNA po analizie na żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (0,5 μg/ml) oraz zmierzeniu jego stężenia przy pomocy Nanodrop (Thermo Scientific, USA) przechowywano w 4°C do przeprowadzenia dalszych eksperymentów.

Przykład III

Transformacja komórek kompetentnych Escherichia coli Lemo21 (DE3)

Do schłodzonej probówki typu Eppendorf dodano 50 μl komórek kompetentnych Escherichia coli Lemo21 (DE3): fhuA2 [lon] ompTgal (λ DE3) [dcm] ,\hsdS/pLemo(Cam^R) λ DE3 = λ sBamHlo AEcoRI-B int::(lacl::PlacUV5::T7 gene1) i21 Anin5pLemo = pACYC184-PrhaBAD-lysY (NewEngland BioLabs, USA) oraz 2 μΙ DNA plazmidowego pET-21 a (+) z sekwencją kodującą białko zawierające pętlę wiążącą jony Hg²⁺ [TST-eGFP-MBL-Hg²⁺] o stężeniu 30 ng/μΙ. Mieszaninę dokładnie wymieszano przez pipetowanie i inkubowano w lodzie przez 30 minut. Następnie przeprowadzono szok termiczny umieszczając probówki w termobloku (Eppendorf, Niemcy) o temperaturze 42°C na 45 sekund.

W kolejnym kroku inkubowano próbki w lodzie przez kolejne 5 minut. Po tym czasie dodano do mieszaniny 500 μl podłoża płynnego SOC (A&A Biotechnology, Polska), następnie prowadzono inkubację w stałej temperaturze 37°C przez 1 godzinę z wytrząsaniem (600 obr/min) w cieplarce laboratoryjnej (Pol-Eko Aparatura, Polska).

Po godzinnej inkubacji hodowlę bakteryjną odwirowano (5 min, 5000 obr/min) (wirówka 5425 G, Eppendorf, Niemcy). Następnie usunięto 400 μl supernatantu, a osad komórkowy zawieszono w pozostałym roztworze i wysiano na szalki z podłożem stałym LA wzbogaconym o dodatek chloramfenikolu (20 μg/ml, Carl Roth, Niemcy) oraz ampicyliny (50 μg/ml). Następnie szalki Petriego inkubowano przez noc w temperaturze 37°C, a ostatecznie przechowywano w temperaturze 4°C do dalszych badań.

Przykład IV

Nadprodukcja białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺

Z uzyskanych hodowli na podłożu stałym wybrano pojedyncze kolonie bakterii E. coli Lemo21(DE3) z wtransformowanym rekombinowanym plazmidem niosącym gen kodujący białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ i zaszczepiono w 5 ml podłoża płynnego LB z dodatkiem chloramfenikolu (20 μg/ml) oraz ampicyliny (50 μg/ml). Hodowle prowadzono przez noc w temperaturze 37°C z wytrząsaniem 220 obr/min (cieplarka laboratoryjna, Pol-Eko Aparatura, Polska). Następnie hodowle odmłodzono poprzez dodanie 3 ml hodowli nocnej do 300 ml świeżego podłoża LB z dodatkiem chloramfenikolu oraz ampicyliny. Hodowle prowadzono w zakresie temperatur 18-37°C z wytrząsaniem 220 obr/min do osiągnięcia gęstości optycznej hodowli przy długości fali λ = 600 nm (OD600) wynoszącej 0,5-0,6.

Z hodowli o takiej gęstości pobrano 1 ml do osobnej probówki Eppendorf (kontrola ujemna), a do pozostałej objętości hodowli dodano IPTG (Biosynth, Szwajcaria) o końcowym stężeniu 1 mM w celu przeprowadzenia indukcji nadprodukcji białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ w komórkach bakterii. W trakcie prowadzenia nadprodukcji białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ pobrano próbki o objętości 1 ml po 2 h, 4 h i 21 h od indukcji IPTG. Próbki poddano analizie elektroforetycznej białek w żelu poliakrylamidowym (Fig. 3), zgodnie z Przykładem VI. Wszystkie pobrane próbki odwirowano (5000 obr/min, 5 min), odciągnięto supernatant, a osad zawieszono w 100 μl TE o pH 8,0 (0,5 M EDTA, 1 M Tris-HCL o pH 8,0). Po 21 h od indukcji hodowlę podzielono na próbkę o obj. 50 ml oraz pozostałą część. Obie zwirowano (15 min, 4500 obr/min), odciągnięto supernatant, a uzyskane osady przechowywano w -20°C do czasu oczyszczania (opisanego w Przykładzie V).

P rzy kła d V

Oczyszczanie rekombinowanego białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺

Osad z 246 ml hodowli bakteryjnej E. coli Lemo21(DE3) nadprodukującej TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ po 21 h indukcji zawieszono w 15 ml buforu A (100 mM Tris - HCl pH 8,0; 150 mM NaCI), dodano 150 μl lizozymu (o stężeniu końcowym 0,1 mg/ml). Mieszaninę inkubowano na rotatorze przez 30 minut w temperaturze 4°C. Po upływie tego czasu próbkę umieszczono w zlewce z lodem i przeprowadzono proces sonikacji przy użyciu aparatury Sonopuls (Bandelin, Niemcy) w cyklu trzykrotnym (30 sekund przy amplitudzie 5 mikronów z 30 sekundowym interwałem pomiędzy cyklami, przy 80% mocy). Następnie zdezintegrowane komórki odwirowano (12000 obr/min, 30 min, 4°C). Supernatant przeniesiono do nowej probówki typu Falcon, a osad zawieszono w 15 ml buforu B (100 mM Tris - HCl pH 8,0; 150 mM NaCI; 10% sarkozyl; 2% Triton X-100; 1 mM EDTA; 1 mM DTT) i inkubowano przez noc na rotatorze w temperaturze 4°C. Następnie mieszaninę połączono z pierwszym supernatantem i dodano bufor A do objętości 140 ml w celu obniżenia stężenia sarkozylu do wartości poniżej 2%, co jest granicznym stężeniem pozwalającym na efektywne wiązanie Twin-Strep-Tag do kolumny StrepTrap™ HP. Do tak rozcieńczonej mieszaniny dodano 2 μl nukleazy Viscolase (A&A Biotechnology, Polska) i inkubowano w 30°C przez 30 minut. Po tym czasie mieszaninę odwirowano (12000 obr/min, 40 min, 4°C) a następnie lizat (supernatant) poddano filtracji na filtrze membranowym MCE 0,45 μm na systemie do filtracji pod ciśnieniem (Chemax, Polska). Tak przygotowany lizat poddano oczyszczaniu za pomocą chromatografii powinowactwa na kolumnie StrepTrap™ HP (Cytiva, USA) ze złożem Strep-Tactin, z wykorzystaniem chromatografu cieczowego FPLC NGC Quest 10 Plus Chromatography System (Biorad, Niemcy). W pierwszym etapie wykonano równoważenie kolumny poprzez płukanie złoża 5 objętościami kolumny (CV) buforem A, z zastosowaniem stałego przepływu wynoszącego 2 ml/min. Następnie na kolumnę naniesiono 140 ml (1,5 ml/min) wcześniej przygotowanego lizatu. Zbierając frakcje białek niewiążących się ze złożem (tzw. flow through fraction) pobrano próbkę o objętości 50 pl. W kolejnym etapie kolumnę płukano 5 CV (2 ml/min) buforu A i zbierano frakcję odpłukaną (tzw. column wash fraction). Pobrano 50 μl próbki tej frakcji. Następnie przeprowadzono elucję, w której początkowo przez 2 CV gradientowo zwiększano stężenie buforu C (100 mM Tris - HCl pH 8,0; 150 mM NaCI; 2,5 mM destiobiotyna) w stosunku do buforu A od 0% do 50%, po czym skokowo zwiększono zawartość nanoszonego buforu na kolumnę do 100% buforu C i kontynuowano elucję przez 5 CV. Kolektor ustawiono tak, aby zbierał 2-mililitrowe frakcje wymywane z kolumny. Z frakcji, w których na detektorze wykryto wzrost sygnału przy 215 nm, świadczący o obecności wiązania peptydowego w eluencie, pobrano próbki po 50 pl. Po zakończeniu etapu elucji kolumnę płukano buforem B o objętości 3 CV (2 ml/min). Pobrane próbki poddano następnie analizie na żelu poliakrylamidowym, zgodnie z Przykładem VI (Fig. 4).

Przeprowadzono następnie odsalanie frakcji, w których w poprzednim etapie zweryfikowano (stosując analizę elektroforetyczną białek w żelu poliakrylamidowym, Przykład VI) obecność oczyszczanego białka rekombinowanego TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ wykorzystując kolumnę Bio-Gel P-6 Desalting Cartridge (BioRad, USA) 10 ml oraz chromatograf cieczowy FPLC NGC Quest 10 Plus Chromatography System.

W pierwszym etapie wykonano równoważenie kolumny poprzez płukanie złoża 1,25 objętościami kolumny (CV) buforem D (20 mM Tris - HCl pH 7,5; 50 mM NaCI) przy stałym przepływie wynoszącym 1,5 ml/min. Zagęszczone frakcje o objętości 2 ml zawierające białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ nałożono na kolumnę z prędkością 1,5 ml/min. Następnie prowadzono elucję buforem D (2 CV, 1,5 ml/min) zbierając 2-mililitrowe frakcje wymywane z kolumny. Z frakcji, w których na detektorze wykryto wzrost sygnału przy 215 nm, świadczący o obecności wiązania peptydowego w eluencie, pobrano próbki po 50 pl. Przeprowadzono analizę elektroforetyczną białek w żelu poliakrylamidowym (Przykład VI).

Frakcje o zweryfikowanej obecności białka zagęszczono używając koncentratora wirówkowego o granicy odcięcia 10,000 MWCO (Milipore, USA) w seriach wirowań trwających 3-5 minut (5000 obr/min, 4°C), aż do uzyskania preparatu o objętości końcowej ok. 2 ml, który przechowywano w 4°C do dalszych analiz. Stopień czystości uzyskanego preparatu białkowego analizowany był na żelu poliakrylamidowym (Fig. 5), stosując analizę densytometryczną, zgodnie z Przykładem VI. Zmierzono także stężenie preparatu białkowego, zgodnie z Przykładem VII.

W efekcie końcowym stężenie rekombinowanego białka wyniosło 0,98 mg/ml, a jego czystość znajdowała się na poziomie minimum 90%. Przygotowany preparat przebadano pod kątem oddziaływań białko-jony Hg²⁺, zgodnie z Przykładem VIII.

P rzykład VI

Analiza elektroforetyczną białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ w żelu poliakrylamidowym μl próbki pobrane z hodowli bakteryjnych (Przykład IV) oraz pobierane po kolejnych etapach oczyszczenia (Przykład V) odwirowano (5 000 obr/min, 5 min) i usunięto supernatant. Uzyskany osad zawieszono w 100 μl buforu TE. Do nowej probówki przeniesiono 25 μl uzyskanego lizatu, dodano 12,5 μl wody oraz 12,5 μl buforu do nanoszenia próbek na żel poliakrylamidowy i inkubowano w termobloku przez 10 min w temperaturze 95°C. Marker białkowy (Unstained Protein MW Marker #26610 lub Unstained Protein MW Marker #26614 (Thermo Scientific, USA)) denaturowano przez 5 min w temperaturze 95°C.

Do studzienek 12% żelu poliakrylamidowego nanoszono po 20 μl przygotowanych próbek lub 10 μl markera. Elektroforezę prowadzono przy 230 V aż do osiągnięcia przez barwnik dolnej krawędzi żelu rozdzielającego (aparat do elektroforezy z zasilaczem firmy BioRad, USA). Żel poliakrylamidowy po zakończonej elektroforezie delikatnie wyjęto spomiędzy szyb i umieszczono w roztworze barwiącym (Comassie Brilliant Blue R-250, 250 mg/50 ml roztworu, metanol 10 ml/50 ml roztworu, lodowaty kwas octowy 40 ml/50 ml roztworu). Całość umieszczono na wytrząsarce kołyskowej (Biosan, Polska), 5 min, 32 obr/min. Następnie żel odbarwiano poprzez kilkukrotne gotowanie w wodzie. Żel udokumentowano poprzez sfotografowanie z wykorzystaniem transiluminatora (Thermo Fisher Scientific, USA) (Fig. 3, 4, 5). Analizę densytometryczną wykonano na fotografiach za pomocą oprogramowania ImageJ (National Institute of Health, USA) stosując jako standard żel o znanym stężeniu BSA (Sigma Aldrich, Niemcy).

PL 248451 Β1

Przykład VII

Pomiar stężenia preparatu białkowego

Przygotowano pięciokrotnie rozcieńczony preparat białkowy. W kuwecie plastikowej umieszczono za pomocą pipety automatycznej 400 μΙ roztworu białka. Za pomocą Spektrofotometru SPECORD PLUS (Analytik Jena AG, Niemcy) oraz programu WinASCPECT (Analytik Jena AG, Niemcy) zmierzono absorbancję przygotowanego preparatu białkowego przy długości fali równej 280 nm. Za pomocą ogólnodostępnego programu ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) używając sekwencji aminokwasowej białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ (przedstawiona poniżej) uzyskano współczynnik ekstynkcji białka służący do obliczenia stężenia białka z wykorzystaniem otrzymanego wyniku pomiaru absorbancji.

Do przeliczeń użyto sekwencji aminokwasowej białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ (269 reszt aminokwasowych) (SEQ ID NO. 2).

Stężenie obliczono ze wzoru:

x A

A - absorbancja [-] zmierzona przy długości fali 280 nm e - współczynnikTST-eGFP-MBL-Hg²⁺ [cm²/mg]

I - grubość warstwy absorpcyjnej [cm] c - stężenie białka [mg/ml] x- rozcieńczenie preparatu białkowego użyte do pomiaru (x = 5)

Końcowo otrzymany preparat białkowy TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ miał stężenie 0,98 mg/ml. Takie stężenie w połączeniu z czystością powyżej 90% pozwalało na przeprowadzenie dalszych analiz.

Przykład VIII

Badanie oddziaływań białko-jony Hg²⁺

Przygotowano serię roztworów zawierających białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ o stężeniu c = 0,5 mg/ml oraz jony Hg²⁺ w stężeniach: 10 nM, 50 nM, 500 nM, oraz 5 μΜ. Stężenia jonów metalu dobrano tak, aby środkowy punkt pokrywał się z limitem stężenia rtęci w wodzie określonym przez normy jakościowe wydane przez WHO. Aby optymalnie pobudzać zmodyfikowane białko eGFP, źródło laserowe zostało wybrane tak, aby pokrywało się z maksimum jego absorbcji. Pomiary optyczne wykonywano w zacienionym pomieszczeniu o temperaturze 21 °C. Spektrometr USB4000 (Ocean Optics, USA) nastawiono na czas integracji 100 ms, a rejestrowane natężenie było dostateczne, aby stosunek sygnału do szumu (SNR) przekraczał 20.

Jako pojemnik pomiarowy, wybrano kapilarę wykonaną ze szkła krzemionkowego o średnicy wewnętrznego tunelu 0wew = 500 pm i całkowitej zewnętrznej średnicy 0zew = 1000 μπι (Sieć Badawcza Łukasiewicz - Instytut Mikroelektroniki i Fotoniki, Polska). Całkowita długość kapilary, wybranej do pomiaru fluorescencji, wyniosła 15 mm, co w rezultacie przekłada się na 2,9 μΙ całkowitej objętości gromadzonej cieczy.

Na potrzeby realizacji pomiaru cieczy w kapilarze, złożono autorski układ pomiarowy. Jako główne elementy układu wykorzystano laserowe źródło światła o centralnej długości fali 487 nm, dostosowane do maksimum absorpcji wybranego białka, oraz światłowodowy spektrometr laboratoryjny USB4000 (OceanOptics), rejestrujący widmo optyczne w zakresie 195-900 nm. Kapilarę umocowano w specjalnym uchwycie wykonanym w technologii druku 3D. Skolimowaną wiązkę światła laserowego ogniskowano na powierzchni bocznej kapilary do postaci punktu, za pomocą soczewki asferycznej o ogniskowej 20 mm (AL2520, Thorlabs Inc., USA). Emitowany sygnał fluorescencji był zbierany bezpośrednio przez nieuzbrojony koniec włókna światłowodowego o średnicy rdzenia 0_C = 600 pm i aperturze numerycznej NA = 0,5. Źródło światła zostało umieszczone ortogonalnie w stosunku do światłowodu wyjściowego, co pozwoliło na częściowe ograniczenie sprzęganego sygnału źródła. W celu dobrej izolacji sygnału fluorescencji od źródła, umieszczono w torze światłowodowym dodatkowo filtr optyczny przestrajalny KURIOS VB-1 (Thorlabs Inc.) nastawiony na centralną długość fali 510 nm i FWHM = 12 nm. Fig. 6 przedstawia schemat ideowy układu pomiarowego.

Pomiar oraz analizę danych rozpoczynano od rejestracji widma ciemnego (Fb) W warunkach, gdy kapilara była wypełniona jedynie wodą dejonizowaną. Następnie, po napełnieniu kapilary odpowiednią próbą z TST-eGFP-MBL-Hg²⁺, została ona naświetlana źródłem laserowym i jednocześnie rejestrowano widmo emisji fluorescencji (Fe). Różnica między tymi dwoma pomiarami (AF = Fe - Fb), została użyta do identyfikacji emisji próbki, w zakresie 460-560 nm. Spektrometr USB4000 był nastawiony tak, aby zapisywał i uśredniał za każdym razem pięć pomiarów Fe. Analiza danych polega na śledzeniu zmian natężenia fluorescencji kolejnych próbek eGFP z metalem, dla długości fali λοπ = 510 nm, która została określona jako maksimum emisji analitu IF = AF^em) (Fig. 7). Następnie dla długości fali λοπ odczytano natężenia dla wykonanych pomiarów i wykreślono wykres ich zmiany, zaznaczając punkt detekcji stężenia określonego w normie (Fig. 8).

Zalety wynalazku

Wynalazek ujawnia pionierską metodę otrzymywania zmodyfikowanego białka eGFP wiążącego jony rtęci. Proponowany metoda jest wydajną ścieżką otrzymywania preparatu o wysokim stopniu homogenności. Otrzymuje się rozpuszczalną wersję białka eGFP (formę aktywną), która wykrywa jony Hg²⁺ w zakresie stężeń, które mieszczą się w przedziałach norm dla zawartości rtęci w próbkach wody;

Wykrywanie jonów Hg²⁺ możliwe jest nie tylko w próbkach wody, ale także każdej innej próbce w formie płynnej.

Wykaz literatury

1. Asaduzzaman A, Riccardi D, Afaneh AT, Cooper CJ, Smith JC, Wang F, Parks JM, Schreckenbach G. (2019) Environmental Mercury Chemistry - In Silico, Accounts of Chemical Research, 52(2): 379-388. https://doi.org/10.1021/acs.accounts.8b00454.

2. Bansod BK, Kumar T, Thakur R, Rana S, Singh I. (2017) A review on various electrochemical techniques for heavy metal ions detection with different sensing platforms, Biosensors and Bioelectronics, 94: 443-455. https://doi.org/10.1016/j.bios.2017.03.031.

3. Belkin S. (2003) Microbial whole-cell sensing systems of environmental pollutants. Current Opinion in Microbiology, 6(3): 206-212. https://doi.org/10.1016/S1369-5274(03)00059-6.

4. Bj0rklund G, Dadar M, Mutter J, Aaseth J. (2017) The toxicology of mercury: Current research and emerging trends, Environmental research, 159: 545-554. https://doi.org/10.1016/j.en- vres.2017.08.051.

5. Gonzalez-Raymat H, Liu G, Liriano C, Li Y, Yin Y, Shi J, Jiang G, Cai Y. (2017) Elemental mercury: Its unique properties affect its behavior and fate in the environment, Environmental Pollution, 229: 69-86. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2017.04.101.

6. Fernandez-López R, Ruiz R, de la Cruz F, Moncali an G. (2015) Transcription factor-based biosensors enlightened by the analyte, Frontiers in microbiology, 1:6:648. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00648.

7. Jung J, Lee SJ. (2019) Biochemical and Biodiversity Insights into Heavy Metal Ion-Responsive Transcription Regulators for Synthetic Biological Heavy Metal Sensors, Journal of Microbiology and Biotechnology, 29(10): 1522-1542. https://doi.org/10.4014/jmb.1908.08002.

8. Kim H, Jang G, Yoon Y. (2020) Specific heavy metal/metalloid sensors: current state and perspectives, Applied Microbiology and Biotechnology, 104: 907-914. https://doi.org/10.1007/s00253-019-10261-y.

9. Kim H, Lee W, Yoon Y. (2019) Heavy metal(loid) biosensor based on split-enhanced green fluorescent protein: development and characterization. Applied Microbiology and Biotechnology, 103: 6345-6352. https://doi.org/10.1007/s00253-019-09908-7.

10. Lee W, Kim H, Kang Y, Lee Y, Yoon Y. (2019) A biosensor platform for metal detection based on enhanced green fluorescent protein. Sensors, 19(8), 1846. https:://doi.org/10.3390/s19081846.

11. Liu SJ, Nie H-G, Jiang J-H, Shen G-L, Yu R-Q. (2009) Electrochemical Sensor for Mercury(ll) Based on Conformational Switch Mediated by Interstrand Cooperative Coordination, Analytical chemistry, 81(14): 5724-5730. https://doi.org/10.1021/ac900527f.

12. Wang X, YangT, Zhang X, Chen M, Wang J. (2017) In situ growth of gold nanoparticles on Hg2+-binding M13 phages for mercury sensing, Nanoscale, 9: 16728-16734.

https://doi.org/10.1039/C7NR06292C.

13. World Health Organization. (1976) Environmental health criteria 1: mercury. Geneva: WHO, 94-131.

Claims (27)

1. Zmodyfikowane wzmocnione białko zielonej fluorescencji TST-eGFP-MBL-Hg²⁺, znamienne tym, że zawiera co najmniej jedną 9-aminokwasową sekwencję SEQ ID NO. 1 wstawioną w miejsce sekwencji DGFP obejmującej reszty aminokwasowe od 190 do 193 białka eGFP.

2. Białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera od 1 do 10 powtórzeń sekwencji SEQ ID NO. 1.

3. Białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że sekwencja SEQ ID NO. 1 wiąże jony rtęci Hg²⁺.

4. Białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera jedną 9-aminokwasową sekwencję SEQ ID NO. 1 i ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO. 2.

5. Białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że na końcu aminowym zawiera sekwencję TST.

6. Konstrukt genetyczny o sekwencji SEQID NO. 3, którego ekspresja daje produkt w postaci zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Hg2+ określonego w zastrz. 4 o SEQ ID NO. 2.

7. Sposób wytwarzania zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ w komórkach bakteryjnych, znamienny tym, że obejmuje etap wprowadzenia do komórek bakterii wektora ekspresyjnego zawierającego konstrukt genetyczny kodujący białko TST-eGFP-MBL-Hg2+ określone w zastrz. 1 z co najmniej jedną aminokwasową sekwencją SEQ ID NO. 1.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że dotyczy wytwarzania zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ o SEQ ID NO. 2, obejmujący etap wprowadzenia do komórek bakterii wektora ekspresyjnego zawierającego konstrukt genetyczny o SEQ ID NO. 3 kodujący białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ z jedną aminokwasową sekwencją SEQ ID NO. 1.

9. Sposób według zastrz. 7 albo 8 znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) wprowadzenie wektora ekspresyjnego zawierającego konstrukt genetyczny kodujący białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ do komórek bakterii E. coli,

b) hodowlę bakterii w podłożu płynnym z wytrząsaniem,

c) indukcję nadekspresji konstruktu genetycznego do wytwarzania zmodyfikowanego białka eGFP przy zastosowaniu IPTG,

d) odwirowanie i zawieszenie osadu w buforze z lizozymem,

e) sonikację,

f) odwirowanie zdezintegrowanych komórek,

g) zebranie supernatantu,

h) zawieszenie pozostałego osadu w buforze z sarkozylem i tritonem X-100 i inkubację lizatu komórek w celu odzyskania frakcji nierozpuszczalnego białka,

i) połączenie frakcji lizatu z etapu g) i etapu h),

j) inkubację lizatu z dodatkiem nukleaz,

k) odwirowanie przy 12000 obr/min w 4°C,

l) filtrację uzyskanego supernatantu na filtrze membranowym MCE 0,45 μm,

m) oczyszczanie z supernatantu aktywnego, rekombinowanego białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ za pomocą chromatografii powinowactwa na złożu wiążącym domenę Strep-Tag,

n) odsalanie frakcji, w których potwierdzono obecność białka eGFP za pomocą chromatografii cieczowej na kolumnie ze złożem odsalającym,

o) zagęszczenie frakcji, w których detektor wykrył wiązanie peptydowe, na koncentratorze wirówkowym o granicy odcięcia 10,000 MWCO,

p) uzyskanie zmodyfikowanego białka eGFP o czystości powyżej 90%.

10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że hodowla w etapie b) prowadzona jest w zakresie temperatur 18-37°C z wytrząsaniem 200-250 obr/min.

11. Sposób według zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, że indukcja w etapie c) następuje w momencie osiągnięcia przez bakterie gęstości hodowli OD600 0,5-0,6.

12. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 9-11, znamienny tym, że w etapie c) końcowe stężenie IPTG wynosi 0,1-2 mM, a czas hodowli od momentu indukcji do zebrania komórek wynosi od 2 do 30 h.

13. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 9-12, znamienny tym, że wirowanie w etapie d) prowadzi się 15 min przy 4500 obr/min, a stężenie lizozymu w buforze wynosi 0,1 mg/ml.

14. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 9-13, znamienny tym, że w etapie e) parametry sonikacji to 30 sekund przy amplitudzie 5 mikronów z 30 sekundowym interwałem pomiędzy cyklami, przy 80% mocy sonikatora.

15. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 9-14, znamienny tym, że w buforze w etapie h) stosuje się dodatek detergentów anionowych i niejonowych, a inkubację prowadzi się przez noc.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że stosuje się 2-10% sarkozyl i 2% Triton X-100.

17. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 9-16, znamienny tym, że odwirowanie w etapie k) prowadzi się 40 min, a zagęszczanie w etapie o) w czasie 3-5 minut w 4°C przy 5000 obr/min.

18. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 9-17, znamienny tym, że w etapie j) dodaje się nukleazy w stężeniu 3,5 U/ml lizatu.

19. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że w etapie p) otrzymuje się aktywną, rozpuszczalną formę białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ z zastrzeżenia 2.

20. Zastosowanie zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ określonego w zastrz. 1 jako element biosensora do detekcji jonów rtęci w biologicznych próbkach ciekłych.

21. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że próbką ciekłą jest próbka wody.

22. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że białko eGFP oddziałuje z jonami Hg²⁺, powodując zmianę poziomu intensywności fluorescencji.

23. Sposób pomiaru stężenia jonów rtęci z wykorzystaniem zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że białko TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ miesza się z próbką zawierającą jony rtęci, a następnie rejestruje widmo fluorescencji i odczytuje maksimum intensywności dla emisji przy długości fali z zakresu λ = 500-530 nm, po wzbudzeniu białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ falą o długości z zakresu λ =470-500 nm.

24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że stężenie zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Hg²⁺ użytego do pomiaru wynosi od 0,05 mg/ml do 5 mg/ml.

25. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że pomiaru dokonuje się w biologicznych próbkach ciekłych.

26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że próbką ciekłą jest próbka wody.

27. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 23-26, znamienny tym, że stężenie badanych jonów rtęci mieści się w zakresie od 10 nM do 5 μΜ.