PL248750B1 - Zmodyfikowane wzmocnione białko zielonej fluorescencji eGFP, konstrukt genetyczny kodujący białko eGFP, sposób wytwarzania zmodyfikowanego białka eGFP, zastosowanie białka eGFP do detekcji jonów chromu oraz sposób pomiaru stężenia jonów chromu z wykorzystaniem zmodyfikowanego białka eGFP - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowane białko zielonej fluorescencji eGFP zdolne do wiązania jonów chromu, sposób jego wytwarzania, konstrukt genetyczny kodujący zmodyfikowane białko eGFP, zastosowanie zmodyfikowanego białka eGFP jako biosensora do detekcji jonów chromu oraz sposób pomiaru stężenia jonów chromu z wykorzystaniem zmodyfikowanego białka eGFP w ciekłych próbkach biologicznych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowane białko zielonej fluorescencji eGFP zdolne do wiązania jonów chromu, konstrukt genetyczny kodujący białko eGFP, sposób wytwarzania białka eGFP, jego zastosowanie do detekcji jonów chromu oraz sposób pomiaru stężenia jonów chromu w ciekłych próbkach biologicznych w ramach monitoringu zanieczyszczeń środowiska.

Zanieczyszczenie środowiska metalami ciężkimi, takimi jak chrom, stanowi poważne zagrożenie dla ekosystemów i zdrowia ludzkiego. Chrom jest szczególnie niebezpiecznym metalem ciężkim ze względu na swoją toksyczność i trwałość w środowisku (Barceloux DG. 1999). Przemysłowe działalności, takie jak galwanizacja, zakłady garbarskie i produkcja stali nierdzewnej, są powszechnymi źródłami zanieczyszczenia chromem. Niewłaściwe usuwanie i niewystarczające oczyszczanie odpadów przemysłowych mogą prowadzić do uwolnienia chromu do wód, gleby i powietrza, powodując zanieczyszczenie i potencjalne negatywne skutki dla życia wodnego, roślin i populacji ludzkich. Dlatego poziom chromu musi być ściśle regulowany i monitorowany.

Szkodliwe działanie chromu i innych metali ciężkich zależy od ich dawki i czasu ekspozycji. Z tego powodu różne organy regulujące ustalają maksymalne dopuszczalne limity metali ciężkich w wodzie pitnej. W tabeli 1 przedstawiono limity dla zawartości chromu w wodzie pitnej (United States Environmental Protection Agency, 2009. National Primary Drinking Water Regulations i Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 7.12.2017 r. w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi. Dz.U. 2017, poz. 2294).

Tabela 1. przedstawia maksymalne dopuszczalne limity zawartości chromu w wodzie pitnej według różnych organów regulacyjnych: Polska (PL), organ w ramach wspólnego programu normalizacji żywności FAO/WHO w Rzymie (WHO), Unia Europejska (EU), Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (USFDA), Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (EPA USA), Urząd ds. Bezpieczeństwa i Standardów Żywności Indii (FSSAI).

Metal ciężki	PL [ir]	WHO [Zr]	EU [^] L L 1	USFDA [V]	EPA USA [?]	FSSAI [^] L L J
Chrom	0,05	0,05	0,05	0,10	0,10	0,05

Obecnie określenie stężenia metali ciężkich/metaloidów, w tym chromu, dokonuje się przy użyciu drogich i czasochłonnych technik analizy instrumentalnej (Ammann AA., 2002). To wszystko sprawia, że istnieje potrzeba poszukiwania bardziej praktycznych alternatyw. Odpowiedzią może być wykorzystanie metod biologicznych/biotechnologicznych.

W ostatnich latach wiele uwagi poświęcono w szczególności rozwojowi biosensorów całokomórkowych (ang. whole cel biosensors, WCB), które zazwyczaj zawierają domeny wykrywające i reporterowe (Belkin S., 2003).

W systemach tych składniki operonu reagujące na stres są zwykle wykorzystywane jako domena wykrywająca (rozpoznająca cel), podczas gdy geny kodujące enzymy lub białka fluorescencyjne są wykorzystywane jako domeny reporterowe. Pomimo wielu zalet, takich jak: prostota, niski koszt, możliwość pomiaru nie tylko całkowitego, ale również biodostępnego poziomu metali, wady WCB takie jak m.in. niska selektywność/czułość, czy ograniczona liczba systemów genetycznych, ciągle ograniczają powszechne zastosowanie tych systemów do monitorowania środowiska.

W rzeczywistości selektywność WCB zależy od interakcji między białkami docelowymi i regulatorowymi w domenach wykrywających, a niska czułość jest spowodowana działaniem systemów obronnych mikroorganizmów w celu utrzymania homeostazy (Schalk IJ. i wsp., 2011).

Innowacyjnym podejściem do tematu mogą być biosensory bazujące na białku eGFP. Białko to znajduje powszechne zastosowanie w medycynie, biotechnologii czy biologii molekularnej, m.in. przy wizualizacji komórek, fuzji z innymi białkami czy badaniach odziaływań białko-białko. Poprzez wprowadzenie modyfikacji w obrębie chromoforu można też wpływać na jego fotostabilność czy intensywność świecenia. Ostatnie badania pokazują również, że białko eGFP może być wykorzystane do monitorowania zanieczyszczeń próbek jonami metali ciężkich. Lee W. i wsp., 2019 i Kim H. i wsp., 2019.

W stanie techniki znane są sposoby monitorowania zanieczyszczeń środowiska z użyciem biosensorów stanowiących komórki bakterii niosących zmodyfikowane białko zielonej fluorescencji. W publikacji Lee W. i wsp., 2019, przedstawiono nową strategię monitorowania zanieczyszczeń środowiska dzięki wykorzystaniu zmodyfikowanego wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (ang. enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP). Autorzy przedstawiają, że połączenie dwóch fragmentów split-eGFP może tworzyć natywną strukturę. W związku z tym zaprojektowano dwa nowe biosensory, bazujące na wykorzystaniu całych komórek bakterii Escherichia coli, zdolne do wykrywania jonów kadmu (Cd) i rtęci (Hg). Osiągnięto to poprzez wstawienie pętli wiążących metal (ang. Metal Binding Loop, MBL) między β-kartki 9 i 10 eGFP, które następnie ulegają zmianom konformacyjnym w wyniku interakcji między MBL a jonami Cd lub Hg. Związanie metalu powoduje emisję fluorescencji, którą można następnie monitorować z wykorzystaniem klasycznych technik analitycznych. W rezultacie stworzono dwa biosensory wykorzystujące bakterie E. coli, które wykazywały sygnał fluorescencyjny tylko podczas interakcji z jonami kadmu/rtęci, ujawniając perspektywę nowych biosensorów do specyficznego wykrywania jonów wybranych metali ciężkich. Z kolei w publikacji Kim H i wsp., 2019, opisano zmodyfikowane białko eGFP zdolne do wykrywania jonów metali Cd i Hg poprzez wstawienie MBL do regionu pętli eGFP, aby uczynić to białko nieaktywnym i wykazać, że wiązanie jonów metalu do MBL indukuje zmianę konformacyjną i przywraca pierwotną aktywność. W szczególności przebadano białko eGFP z sekwencją MBLCTTCGCG i wykazano, że biosensor WBC zawierający takie białko pozwala na ilościowe oznaczenie powyższych metali w zakresie stężeń 0-5 μM. W celu praktycznej weryfikacji przydatności opracowany biosensor wykorzystano do ilościowego oznaczenia Cd w sztucznie zmienionych próbkach gleby i wody. Uzyskane wyniki sugerowały, że czułość czujnika nie jest wystarczająca i musi zostać znacznie poprawiona. W publikacji Kim H i wsp., 2020, przedstawiono przegląd różnych rodzajów biosensorów wykorzystywanych do analizy wybranych jonów metali ciężkich.

Rozwiązania ze stanu techniki wykorzystywane obecnie do pomiaru stężenia jonów chromu w próbkach są czasochłonne i kosztowne oraz wymagają wstępnej obróbki próbki przed analizą i nie są możliwe do zastosowania bezpośrednio w miejscu poboru próbki. Biosensory stosowane do oznaczania innych jonów metali ciężkich takich jak kadm, czy rtęć oparte na całych komórkach bakteryjnych (WCB) charakteryzuje niska selektywność/czułość, ograniczona liczba systemów genetycznych, wielogodzinny czas odpowiedzi na obecność metalu, konieczność hodowli mikroorganizmu, z czym wiąże się konieczność zachowania odpowiednich warunków (np. zapewnienie temperatury 30-37°C do inkubacji WCB).

W stanie techniki brakuje szybkich i bezpośrednich testów do wykrywania obecności metali ciężkich bezpośrednio w miejscu pobrania, które nie wymagają wstępnej obróbki materiału oraz późniejszych etapów laboratoryjnych.

Celem wynalazku jest wykorzystanie zmodyfikowanego fuzyjnego białka eGFP w układach biosensorycznych, pozwalających na wykrywanie in situ jonów metalu chromu w sposób szybki, prosty, tani i mobilny. Jony można wykrywać w dowolnej próbce płynnej i w miejscu pobrania próbki.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowane, wzmocnione białko zielonej fluorescencji TST-eGFP-MBL-Cr3+, charakteryzujące się tym, że w sekwencji aminokwasowej białka o SEQ ID NO.2 w miejsce sekwencji DGFP obejmującej reszty aminokwasowe od 190 do 193 wstawiono co najmniej jedną, 7-aminokwasową sekwencję SEQ ID NO.1. Korzystnie sekwencja SEQ ID NO.1 wiąże jony chromu Cr³⁺.

Korzystnie białko TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ charakteryzuje się tym, że na końcu aminowym zawiera sekwencję TST. Korzystnie białko TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ charakteryzuje się tym, że ilość dołączonych powtórzeń sekwencji SEQ ID NO. 1 w białku wynosi od 1 do 10.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest konstrukt genetyczny o sekwencji SEQ ID NO. 3, którego ekspresja daje produkt w postaci zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ o SEQ ID NO. 2.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ w komórkach bakteryjnych obejmujący następujące etapy:

a) wprowadzenie wektora ekspresyjnego do komórek bakterii, przy czym wektor zawiera konstrukt genetyczny o sekwencji SEQ ID NO.3.

b) hodowlę bakterii w podłożu płynnym z wytrząsaniem

c) indukcję nadekspresji konstruktu genetycznego do wytwarzania zmodyfikowanego białka eGFP przy zastosowaniu IPTG

d) odwirowanie i zawieszenie osadu w buforze z lizozymem

e) sonikację

f) odwirowanie zdezintegrowanych komórek 30 min. przy 12000 obr/min. w 4°C.

g) zebranie supernatantu

h) zawieszenie pozostałego osadu w buforze z sarkozylem i tritonem X-100 i inkubację lizatu komórek przez noc w celu odzyskania frakcji nierozpuszczalnego białka.

i) połączenie frakcji lizatu z etapu g) i etapu h)

j) inkubację lizatu z dodatkiem nukleaz

k) odwirowanie 40 min przy 12000 obr/min w 4°C

l) filtrację uzyskanego supernatantu na filtrze membranowym MCE 0,45 μm

m) oczyszczanie z supernatantu aktywnego, rekombinowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr3+ za pomocą chromatografii powinowactwa na złożu wiążącym domenę Strep-Tag

n) odsalanie frakcji, w których potwierdzono obecność białka eGFP za pomocą chromatografii cieczowej na kolumnie ze złożem odsalającym

o) zagęszczenie frakcji, w których detektor wykrył wiązanie peptydowe na koncentratorze wirówkowym o granicy odcięcia 10,000 MWCO 3-5 minut w 4°C, 5000 obr/min

p) uzyskanie zmodyfikowanego białka eGFP o stężeniu 1-1,2 mg/ml i czystości powyżej 90%.

Korzystnie hodowla w etapie b) prowadzona jest w zakresie temperatur 18-37°C z wytrząsaniem 200-250 obr/min. Korzystnie indukcja w etapie c) następuje w momencie osiągnięcia przez bakterie gęstości hodowli OD600 0,5-0,6.

Korzystnie w etapie c) końcowe stężenie IPTG wynosi 0,1-2 mM, a czas hodowli od momentu indukcji do zebrania komórek wynosi od 2 do 30 h.

Korzystnie wirowanie w etapie d) trwa 15 min przy 4500 obr/min, a stężenie lizozymu w buforze wynosi 0,1 mg/ml.

Korzystnie w etapie e) parametry sonikacji to 30 sekund przy amplitudzie 5 mikronów z 30-sekundowym interwałem pomiędzy cyklami, przy 80% mocy sonikatora.

Korzystnie w buforze w etapie h) stosuje się dodatek detergentów anionowych i niejonowych.

Korzystnie jako detergenty stosuje się 2-10% sarkozyl i 2% Triton X-100.

Korzystnie w etapie j) dodaje się nukleazy w stężeniu 3,5 U/ml lizatu.

Korzystnie w etapie p) otrzymuje się aktywną, rozpuszczalną formę białka TST-eGFP-MBL-Cr³⁺.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ jako biosensora nowej generacji do detekcji jonów chromu w biologicznych próbkach ciekłych.

Korzystnie zastosowanie zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ charakteryzuje się tym, że próbką ciekłą jest próbka wody.

Korzystnie zastosowanie zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ charakteryzuje się tym, że białko oddziałuje z jonami Cr³⁺, powodując zmianę poziomu intensywności fluorescencji.

Jeszcze kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób pomiaru stężenia jonów chromu z wykorzystaniem zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ charakteryzujący się tym, że białko TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ miesza się z próbką zawierającą jony chromu, a następnie rejestruje widmo fluorescencji i odczytuje maksimum intensywności dla emisji przy długości fali λ = 500-530 nm, po wzbudzeniu białka TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ falą o długości λ =470-500 nm.

Korzystnie sposób pomiaru charakteryzuje się tym, że stężenie zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ użytego do pomiaru wynosi od 0,05 mg/ml do 5 mg/ml.

Korzystnie sposób pomiaru charakteryzuje się tym, że pomiaru dokonuje się w biologicznych próbkach ciekłych.

Korzystnie sposób pomiaru charakteryzuje się tym, że próbką ciekłą jest próbka wody.

Korzystnie sposób pomiaru charakteryzuje się tym, że stężenie badanych jonów chromu mieści się w zakresie od 200 nM do 15 μΜ.

Przedmiot wynalazku został objaśniony w przykładach wykonania na rysunku, na którym:

Fig. 1 przedstawia schemat mechanizmu działania zmodyfikowanego białka eGFP z pętlą MBL. Białko eGFP składa się z 11 β-kartek, podzielonych na 2 podjednostki zawierające: pierwszych 9 β-kartek (większa podjednostka z lewej strony) oraz dwie ostatnie, 10 i 11 β-kartkę (mniejsza podjednostka z prawej strony). (A) Białko natywne, niezmodyfikowane wykazuje naturalną fluorescencję. (B) Białko zmodyfikowane, do którego w regionie pętli aminokwasowej pomiędzy 9 i 10 β-kartką wprowadzono sekwencję wiążącą metal MBL nie wykazuje fluorescencji. Wstawienie sekwencji MBL w pętli powoduje jej wydłużenie, przez co dochodzi do oddalenia się od siebie podjednostek zmodyfikowanego białka eGFP oraz zmiany w obrębie chromoforu. W konsekwencji prowadzi to do utraty zdolności fluorescencji przez zmodyfikowane białko eGFP. (C) Po związaniu jonów metalu do MBL następuje zmiana konformacyjna zmodyfikowanego eGFP, polegająca na zmniejszeniu dystansu pomiędzy fragmentami białka i gdy znajdą się one odpowiednio blisko siebie, zmodyfikowane białko eGFP ponownie wykazuje fluorescencję. Fig. 2 przedstawia mapę plazmidu ekspresyjnego pET21a(+) (Addgene), wykorzystywanego do przygotowania konstruktów genowych. W miejscu cięcia enzymów restrykcyjnych Ndel oraz Sall (zaznaczone w górnej części mapy plazmidu) wprowadzono zmodyfikowaną sekwencję eGFP.

Fig. 3 przedstawia rozdział elektroforetyczny (SDS-PAGE) białek bakteryjnych szczepu E. coli Lemo21 (DE3) nadprodukującego białko TST-eGFP-MBL-Cr3⁺. M - marker wielkości białek, 1 - Lizat komórkowy z hodowli nocnej, 2 - Lizat komórkowy przed indukcją, 3 - Lizat komórkowy po 2 h indukcji w 25°C, 4 Lizat komórkowy po 4 h indukcji w 25°C, 5 - Lizat komórkowy po 21 h indukcji w 25°C, 6 - Lizat komórkowy po 2 h indukcji w 30°C, 7 - Lizat komórkowy po 4 h indukcji w 30°C, 8 - Lizat komórkowy po 21 h indukcji w 30°C; strzałką oznaczono białko TST-eGFP-MBL-Cr3⁺ o wielkości 30 kDa.

Fig. 4 przedstawia wykres ilustrujący gradient buforów dla poszczególnych etapów oczyszczania białka TST-eGFP-MBL-Cr3⁺ wiążącego jony chromu za pomocą chromatografii powinowactwa.

Fig. 5 przedstawia chromatogram z oczyszczania białka TST-eGFP-MBL-Cr3⁺ za pomocą chromatografii powinowactwa na kolumnie StrepTrapTM HP.

Fig. 6 przedstawia wynik rozdziału elektroforetycznego w żelu poliakrylamidowym produktów oczyszczania białka TST-eGFP-MBL-Cr3⁺ metodą chromatografii powinowactwa na kolumnie StrepTrap™ HP.

M - marker wielkości białek,

- nakładany na kolumnę lizat komórkowy E. coli Lemo21(DE3),

- frakcja białek niewiążących się ze złożem (D8),

- frakcja białek po płukaniu kolumny buforem A (D14),

- 1. pula (C26-C31),

5-2. pula (C32-C34),

6-3. pula (C35-C38),

7-4. pula (C39-C43),

8-5. pula (C44-C47),

9-6. pula (C48-C53);

strzałką oznaczono białko TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ o wielkości 30 kDa.

Fig. 7 przedstawia wynik rozdziału elektroforetycznego w żelu poliakrylamidowym produktów oczyszczania TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ po etapie odsalania na kolumnie Bio-Gel P-6 Desalting.

M - marker wielkości białek,

- 1. pula (frakcje C26-C31) bez odsalania,

- frakcje D71-72,

- 2. frakcje D77-78,

- frakcje D83-84,

- frakcje D88-89,

- zagęszczony preparat białkowy (1 μθ,

- zagęszczony preparat białkowy (3 μθ;

strzałką oznaczono białko TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ o wielkości 30 kDa.

Fig. 8 przedstawia Wyniki pomiarów emisji fluorescencji TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ w obecności różnych stężeń metalu.

Fig. 9 przedstawia zmianę poziomu natężenia fluorescencji odczytanej w λem = 510 nm, dla kolejnych pomiarów białka TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ z rosnącym stężeniem metalu. Na wykresie pionową przerywaną linią zaznaczono dopuszczalny limit stężenia chromu na III stopniu utlenienia w wodzie wg. norm WHO i Normy Polskiej.

Przykłady wykonania

Wynalazek ujawnia sposób otrzymywania, oczyszczania i wykorzystania zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr³⁺, wiążącego jony chromu na trzecim stopniu utlenienia, przy czym otrzymuje się aktywną formę białka produkowanego w systemie bakteryjnym.

Rozwiązanie bazuje na modyfikacji eGFP typu split-protein system, które zakłada rozdzielenie białka na dwie podjednostki lub domeny. W natywnej formie białko jest nieaktywne, jego aktywacja następuje dopiero, gdy oba fragmenty znajdą się w swoim bliskim sąsiedztwie po związaniu jonów chromu (Fig. 1).

Białko eGFP wiążące jony chromu zostało zmodyfikowane z wykorzystaniem inżynierii genetycznej (modyfikacja split-protein) w ten sposób, że w miejsce sekwencji 4 aminokwasów (DGPV) znajdują cej się pomiędzy strukturami β-kartek nr 9 i 10 tego białka wprowadzono odpowiednio sekwencję aminokwasową YKASLIT (SEQ ID NO. 1), która wiąże selektywnie jony chromu. Ponadto, białko zawiera dołączoną na końcu aminowym domenę Twin-Strep-Tag (WSHPQFEK-GGGSGGGSGG-SAWSHPQFEK), umożliwiającą jego efektywne oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa. Modyfikację genetyczną uzyskano dzięki usunięciu w genie kodującym białko eGFP sekwencji nukleotydowej 5’GACGGCCCCGTG 3’ (nukleotydy od pozycji 568 do 579) i na jej miejsce wstawienie w tym samym miejscu sekwencji nukleotydowej 5’TACAAAGCGAGCCTGATTACC3’ kodującej sekwencję wiążącą jony metalu.

Opracowane rozwiązanie bazuje na hodowli okresowej bakterii z gatunku Escherichia coli w podłożu płynnym LB, nadprodukujących (po uprzednim zaindukowaniu IPTG lub laktozą) zmodyfikowane białko eGFP wiążące jony Cr3+. Po hodowli prowadzi się izolację białka z komórek E. coli, zwiększa jego rozpuszczalność przez wielogodzinną inkubację w buforze zawierającym stężone detergenty anionowe (sarkozyl) oraz niejonowe (Triton X-100) i prowadzi się oczyszczanie na kolumnie zawierającej złoże wiążące domenę Twin-Strep-Tag metodą grawitacyjną lub z wykorzystaniem chromatografu FPLC. Wypracowane rozwiązanie umożliwia otrzymywanie aktywnego białka w dużych ilościach. Następnie oczyszczone białko znajduje zastosowanie do zbadania aktywności w układzie białko-dedykowany metal, co potwierdza możliwość wykorzystania uzyskanego konstruktu do badania stężenia jonów Cr³⁺ w zakresie dopuszczalnego limitu stężenia Cr3+ w wodzie wg. norm WHO i Normy Polskiej.

Przykład I

Przygotowanie konstruktu genowego do nadprodukcji rekombinowanego białka eGFP wiążącego jony chromu na trzecim stopniu utlenienia

Do wektora pET-21a (+) (Sigma Aldrich, Niemcy, nr kat. 69740) wprowadzono w miejsce enzymów restrykcyjnych Ndel oraz Sall zmodyfikowaną sekwencję kodującą białko eGFP. Sekwencję uzyskano w ten sposób, że do sekwencji nukleotydowej kodującej białko eGFP (810 pz) na N-końcu dodano sekwencję kodującą znacznik białkowy Twin-Strep-Tag a w miejscu sekwencji kodującej oryginalnie 4 reszty aminokwasowe DGPV wprowadzono sekwencję kodującą pętlę selektywnie wiążącą jony chromu na trzecim stopniu utlenienia (MBL-Cr³⁺ (SEQ ID NO. 3)). Sekwencja została wstawiona tak, że znajduje się pod kontrolą indukowalnego promotora T7.

Zaprojektowany wektor ekspresyjny został zamówiony do syntezy (Gene Universal, USA) i wykorzystany do transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli DH103 zgodnie z Przykładem II wykonania.

Przykład II

Transformacja komórek kompetentnych ϋΗ10β wektorem ekspresyjnym otrzymanym w przykładzie I oraz izolacja plazmidowego DNA

Do schłodzonej probówki typu Eppendorf dodano 50 μl komórek kompetentnych Escherichia coli DH10β F - mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ8018οΖΔΜ15 AlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ (ara-leu) 7697 galU galK λ - rpsL(StrR) nupG (ThermoScientific, USA) oraz 2 μl DNA plazmidowego pET-21a (+) z sekwencją kodującą białko zawierające pętlę wiążącą jony Cr3⁺ [TST-eGFP-MBL-Cr3⁺] o stężeniu 5 ng/pl. Mieszaninę dokładnie wymieszano przez pipetowanie i inkubowano w lodzie przez 30 minut. Następnie przeprowadzono szok termiczny umieszczając probówki w termobloku (Eppendorf, Niemcy) o temperaturze 42°C na 45 sekund. W kolejnym kroku inkubowano próbki w lodzie przez kolejne 5 minut. Po tym czasie dodano do mieszaniny 500 μl podłoża płynnego SOC (A&A Biotechnology, Polska), następnie prowadzono inkubację w stałej temperaturze 37°C przez 1 godzinę z wytrząs aniem (600 obr/min) w cieplarce laboratoryjnej (Pol-Eko Aparatura, Polska). Po godzinnej inkubacji hodowlę bakteryjną odwirowano (5 min, 5000 obr/min) (wirówka 5425 G, Eppendorf, Niemcy). Następnie usunięto 400 μl supernatantu a osad komórkowy zawieszono w pozostałym roztworze i wysiano na szalki z selekcyjnym podłożem stałym LA wzbogaconym o dodatek ampicyliny (50 μg/ml; Carl Roth, Niemcy). Następnie szalki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Po tym czasie pojedyncze kolonie bakterii, które wyrosły na szalce z podłożem selekcyjnym zaszczepiono do hodowli w płynnym podłożu LB o objętości 5 ml wzbogaconym o dodatek ampicyliny (50 μg/ml). Hodowle prowadzono przez noc w temperaturze 37°C z wytrząsaniem 220 obr/min (cieplarka laboratoryjna, Pol-Eko Aparatura, Polska). Następnie z takich hodowli izolowano plazmidowe DNA używając zestawu do izolacji plazmidowego DNA GeneJET (ThermoScientific, USA) postępując wg instrukcji producenta. Wyizolowane plazmidowe DNA po analizie na żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (0,5 μg/ml) oraz zmierzeniu jego stężenia przy pomocy Nanodrop (ThermoScientific, USA) przechowywano w 4°C do przeprowadzenia dalszych eksperymentów.

Przykład III

Transformacja komórek kompetentnych Escherichia coli Lemo21(DE3)

Do schłodzonej probówki typu Eppendorf dodano 50 μΙ komórek kompetentnych Escherichia coli Lemo21 (DE3): fhuA2 [lon] ompTgal (λ DE3) [dcm] AhsdS/pLemo(CamR) λ DE3 = λ sBamHlo AEcoRI-B int::(lacl::PlacUV5::T7 gene1) i21 Anin5pLemo = pACYC184-PrhaBAD-lysY (NewEngland BioLabs, USA) oraz 2 μΙ DNA plazmidowego pET-21 a (+) z sekwencją kodującą białko zawierające pętlę wiążącą jony Cr³⁺ [TST-eGFP-MBL-Cr³⁺] o stężeniu 30 ng/μΙ. Mieszaninę dokładnie wymieszano przez pipetowanie i inkubowano w lodzie przez 30 minut. Następnie przeprowadzono szok termiczny umieszczając probówki w termobloku (Eppendorf, Niemcy) o temperaturze 42°C na 45 sekund.

W kolejnym kroku inkubowano próbki w lodzie przez kolejne 5 minut. Po tym czasie dodano do mieszaniny 500 μl podłoża płynnego SOC (A&A Biotechnology, Polska), następnie prowadzono inkubację w stałej temperaturze 37°C przez 1 godzinę z wytrząsaniem (600 obr/min) w cieplarce laboratoryjnej (Pol-Eko Aparatura, Polska).

Po godzinnej inkubacji hodowlę bakteryjną odwirowano (5 min, 5000 obr/min) (wirówka 5425 G, Eppendorf, Niemcy). Następnie usunięto 400 μl supernatantu a osad komórkowy zawieszono w pozostałym roztworze i wysiano na szalki z podłożem stałym LA wzbogaconym o dodatek chloramfenikolu (20 μg/ml, Carl Roth, Niemcy) oraz ampicyliny (50 μg/ml). Następnie szalki Petriego inkubowano przez noc w temperaturze 37°C, a ostatecznie przechowywano w temperaturze 4°C do dalszych badań.

Przykład IV

Nadprodukcja białka TST-eGFP-MBL-Cr³⁺

Z uzyskanych hodowli na podłożu stałym wybrano pojedyncze kolonie bakterii E. coli Lemo21(DE3) z wtransformowanym rekombinowanym plazmidem niosącym gen kodujący białko TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ i zaszczepiono w 5 ml podłoża płynnego LB z dodatkiem chloramfenikolu (20 μg/ml) oraz ampicyliny (50 μg/ml). Hodowle prowadzono przez noc w temperaturze 37°C z wytrząsaniem 220 obr/min (cieplarka laboratoryjna, Pol-Eko Aparatura, Polska). Następnie hodowle odmłodzono poprzez dodanie 3 ml hodowli nocnej do 300 ml świeżego podłoża LB z dodatkiem chloramfenikolu oraz ampicyliny. Hodowle prowadzono w zakresie temperatur 18-37°C z wytrząsaniem 220 obr/min do osiągnięcia gęstości optycznej hodowli przy długości fali λ = 600 nm (OD600) wynoszącej 0,5-0,6.

Z hodowli o takiej gęstości pobrano 1 ml do osobnej probówki Eppendorf (kontrola ujemna) a do pozostałej objętości hodowli dodano IPTG (Biosynth, Szwajcaria) o końcowym stężeniu 1 mM w celu przeprowadzenia indukcji nadprodukcji białka TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ w komórkach bakterii. W trakcie prowadzenia nadprodukcji białka TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ pobrano próbki o objętości 1 ml po 2 h, 4 h i 24 h od indukcji IPTG. Próbki poddano analizie elektroforetycznej białek w żelu poliakrylamidowym (Fig. 2), zgodnie z Przykładem VI wykonania. Wszystkie pobrane próbki odwirowano (5000 obr/min, 5 min), odciągnięto supernatant, a osad zawieszono w 100 μl TE o pH 8,0 (0,5 M EDTA, 1 M Tris-HCL o pH 8,0). Po 24 h od indukcji hodowlę podzielono na próbkę o obj. 50 ml oraz pozostałą część. Obie zwirowano (15 min, 4500 obr/min), odciągnięto supernatant, a uzyskane osady przechowywano w -20°C do czasu oczyszczania (opisanego w Przykładzie VI wykonania).

Przykład V

Oczyszczanie rekombinowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr3⁺

Osad z 246 ml hodowli bakteryjnej E. coli Lemo21(DE3) nadprodukującej TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ po 24 h indukcji zawieszono w 15 ml buforu A (100 mM Tris - HCl pH 8,0; 150 mM NaCI), dodano 150 μl lizozymu (o stężeniu końcowym 0,1 mg/ml). Mieszaninę inkubowano na rotatorze przez 30 minut w temperaturze 4°C. Po upływie tego czasu próbkę umieszczono w zlewce z lodem i przeprowadzono proces sonikacji przy użyciu aparatury Sonopuls (Bandelin, Niemcy) w cyklu trzykrotnym (30 sekund przy amplitudzie 5 mikronów z 30-sekundowym interwałem pomiędzy cyklami, przy 80% mocy). Następnie zdezintegrowane komórki odwirowano (12000 obr/min, 30 min, 4°C). Supernatant przeniesiono do nowej probówki typu Falcon a osad zawieszono w 15 ml buforu B (100 mM Tris - HCl pH 8,0; 150 mM NaCI; 10% sarkozyl; 2% Triton X-100; 1 mM EDTA; 1 mM DTT) i inkubowano przez noc na rotatorze w temperaturze 4°C. Następnie mieszaninę połączono z pierwszym supernatantem i dodano bufor A do objętości 140 ml w celu obniżenia stężenia sarkozylu do wartości poniżej 2%, co jest granicznym stężeniem pozwalającym na efektywne wiązanie Twin-Strep-Tag do kolumny StrepTrap™ HP. Do tak rozcieńczonej mieszaniny dodano 2 μl nukleazy Viscolase (A&A Biotechnology, Polska) i inkubowano w 30°C przez 30 minut. Po tym czasie mieszaninę odwirowano (12000 obr/min, 40 min, 4°C) a następnie lizat (supernatant) poddano filtracji na filtrze membranowym MCE 0,45 μm na systemie do filtracji pod ciśnieniem (Chemax, Polska). Tak przygotowany lizat poddano oczyszczaniu za pomocą chromatografii powinowactwa, przeprowadzonej w pięciu etapach (Fig. 3) na kolumnie StrepTrap™ HP (Cytiva, USA) ze złożem Strep-Tactin, z wykorzystaniem chromatografu cieczowego FPLC NGC Quest 10 Plus Chromatography System (Biorad, Niemcy). W pierwszym etapie wykonano równoważenie kolumny poprzez płukanie złoża 5 objętościami kolumny (CV) buforem A, z zastosowaniem stałego przepływu wynoszącego 2 ml/min. Następnie na kolumnę naniesiono 140 ml (1,5 ml/min) wcześniej przygotowanego lizatu. Zbierając frakcje białek niewiążących się ze złożem (tzw. flow through fraction) pobrano próbkę o objętości 50 pi. W kolejnym etapie kolumnę płukano 5 CV (2 ml/min) buforu A i zbierano frakcję odpłukaną (tzw. column wash fraction). Pobrano 50 μl próbki tej frakcji. Następnie przeprowadzono elucję, w której początkowo przez 2 CV gradientowo zwiększano stężenie buforu C (100 mM T ris - HCl pH 8,0; 150 mM NaCI; 2,5 mM destiobiotyna) w stosunku do buforu A od 0% do 50%, po czym skokowo zwiększono zawartość nanoszonego buforu na kolumnę do 100% buforu C i kontynuowano elucję przez 5 CV. Kolektor ustawiono tak, aby zbierał 2-mililitrowe frakcje wymywane z kolumny. Z frakcji, w których na detektorze wykryto wzrost sygnału przy 215 nm, świadczący o obecności wiązania peptydowego w eluencie, pobrano po 50 μl próbki. Po zakończeniu etapu elucji kolumnę płukano buforem B o objętości 3 CV (2 ml/min). Chromatogram przedstawiający oczyszczanie zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr3+ przedstawia Fig. 4.

Przeprowadzono następnie odsalanie frakcji, w których w poprzednim etapie zweryfikowano (stosując analizę elektroforetyczną białek w żelu poliakrylamidowym, Przykład VI wykonania) obecność oczyszczanego białka rekombinowanego TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ wykorzystując kolumnę Bio-Gel P-6 Desalting Cartridge (BioRad, USA) 10 ml oraz chromatograf cieczowy FPLC NGC Quest 10 Plus Chromatography System.

W pierwszym etapie wykonano równoważenie kolumny poprzez płukanie złoża 1,25 objętościami kolumny (CV) buforu D (20 mM Tris - HCl pH 7,5; 50 mM NaCI) przy stałym przepływie wynoszącym 1,5 ml/min. Zagęszczone frakcje o objętości 2 ml zawierające białko TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ nałożono na kolumnę z prędkością 1,5 ml/min. Następnie prowadzono elucję buforem D (2 CV, 1,5 ml/min) zbierając 2-mililitrowe frakcje wymywane z kolumny. Z frakcji, w których na detektorze wykryto wzrost sygnału przy 215 nm, świadczący o obecności wiązania peptydowego w eluencie, pobrano po 50 μl próbki. Przeprowadzono analizę elektroforetyczną białek w żelu poliakrylamidowym densytometryczną (Przykład VI wykonania).

Frakcje o zweryfikowanej obecności białka zagęszczono używając koncentratora wirówkowego o granicy odcięcia 10,000 MWCO (Milipore, USA) w seriach wirowań trwających 3-5 minut (4°C, 5000 obr/min), aż do uzyskania preparatu o objętości końcowej ok. 2 ml, który przechowywano w 4°C do dalszych analiz. Stopień czystości uzyskanego preparatu białkowego analizowany był na żelu poliakrylamidowym (Fig. 6), stosując analizę densytometryczną, zgodnie z Przykładem VI wykonania. Zmierzono także stężenie preparatu białkowego, zgodnie z Przykładem VII wykonania).

W efekcie końcowym stężenie rekombinowanego białka wyniosło 1,18 mg/ml a jego czystość znajdowała się na poziomie minimum 90%. Przygotowany preparat przebadano pod kątem oddziaływań białko-jony Cr3⁺, zgodnie z Przykładem IX wykonania.

Przykład VI

Analiza elektroforetyczną białka TST-eGFP-MBL-Cr3⁺ w żelu poliakrylamidowym μl próbki pobrane z hodowli bakteryjnych (Przykład IV wykonania) oraz pobierane po kolejnych etapach oczyszczenia (Przykład V wykonania) odwirowano (5 000 obr/min, 5 min) i usunięto supernatant. Uzyskany osad zawieszono w 100 μl buforu TE. Do nowej probówki przeniesiono 25 μl uzyskanego lizatu dodano 12,5 μl wody oraz 12,5 μl buforu do nanoszenia próbek na żel poliakrylamidowy i inkubowano w termobloku przez 10 min w temperaturze 95°C. Marker białkowy (Unstained Protein MW Marker #26610 (Thermo Scientific, USA)) denaturowano przez 5 min w temperaturze 95°C.

Do studzienek 12% żelu poliakrylamidowego nanoszono po 20 μl przygotowanych próbek lub 10 μl markera. Elektroforezę prowadzono przy 230 V aż do osiągnięcia przez barwnik dolnej krawędzi żelu rozdzielającego (aparat do elektroforezy z zasilaczem firmy BioRad, USA). Żel poliakrylamidowy po zakończonej elektroforezie delikatnie wyjęto spomiędzy szyb i umieszczono w roztworze barwiącym (Comassie Brilliant Blue R-250 250 mg / 50 ml roztworu, metanol 10 ml / 50 ml roztworu, lodowaty kwas octowy 40 ml / 50 ml roztworu). Całość umieszczono na wytrząsarce kołyskowej (Biosan, Polska), 5 min,

PL 248750 Β1 obr/min. Następnie żel odbarwiano poprzez kilkukrotne gotowanie w wodzie. Żel udokumentowano poprzez sfotografowanie z wykorzystaniem transiluminatora (ThermoFisher Scientific, USA) (Fig. 3, 6, 7).

Analizę densytometryczną wykonano na fotografiach za pomocą oprogramowania ImageJ (National Institute of Health, USA) stosując jako standard żel o znanym stężeniu BSA (Sigma Aldrich, Niemcy).

Przykład VII

Pomiar stężenia preparatu białkowego

Przygotowano pięciokrotnie rozcieńczony preparat białkowy. W kuwecie plastikowej umieszczono za pomocą pipety automatycznej 400 pl roztworu białka. Za pomocą Spektrofotometru SPECORD PLUS (Analitykjena, Niemcy) oraz programu WinASCPECT (Analytik Jena AG, Niemcy) zmierzono absorbancję przygotowanego preparatu białkowego przy długości fali równej 280 nm. Za pomocą ogólnodostępnego programu ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) używając sekwencji aminokwasowej białka TST-eGFP-MBL-Cr³* (przedstawiona poniżej) uzyskano współczynnik ekstynkcji białka służący do obliczenia stężenia białka z wykorzystaniem otrzymanego wyniku pomiaru absorbancji.

Do przeliczeń użyto sekwencji aminokwasowej białka TST-eGFP-MBL-Cr³* (269 reszt aminokwasowych) (SEQ ID NO. 2).

Stężenie obliczono ze wzoru:

x A

A - absorbancja [-] zmierzona przy długości fali 280 nm e - współczynnik TST-eGFP-MBL-Cr³* [cm²/mg]

I - grubość warstwy absorpcyjnej [cm] c - stężenie białka [mg/ml] x- rozcieńczenie preparatu białkowego użyte do pomiaru (x = 5)

Końcowo otrzymany preparat białkowy TST-eGFP-MBL-Cr³* miał stężenie 1,18 mg/ml. Takie stężenie w połączeniu z czystością powyżej 90% pozwalało na przeprowadzenie dalszych analiz.

Przykład VIII

Badanie oddziaływań białko-jony Cr³*

Przygotowano serię roztworów zawierających białko TST-eGFP-MBL-Cr³* o stężeniu c = 0,58 mg/ml oraz jony Cr³* w stężeniach: 250 nM, 500 nM, 1 pM, 5 pM oraz 10 pM. Stężenia jonów metalu dobrano tak, aby środkowy punkt (1 pM) pokrywał się z limitem stężenia chromu w wodzie określonymi przez normy jakościowe w Polsce. Aby optymalnie pobudzać zmodyfikowane białko eGFP, źródło laserowe zostało wybrane tak, aby pokrywało się z maksimum jego absorbcji. Pomiary optyczne wykonywano w zacienionym pomieszczeniu o temperaturze 21 °C. Spektrometr USB4000 (Ocean Optics, USA) nastawiono na czas integracji 100 ms, aby stosunek sygnału do szumu (SNR) przekraczał 20.

Pomiar oraz analizę danych rozpoczynano od rejestracji widma ciemnego (Fb) w warunkach, gdy kapilara była wypełniona jedynie wodą dejonizowaną. Następnie, po napełnieniu kapilary odpowiednią próbą z TST-eGFP-MBL-Cr³*, została ona naświetlana źródłem laserowym i jednocześnie rejestrowano widmo emisji fluorescencji (Fe). Różnica między tymi dwoma pomiarami (AF = Fe - Fb), została użyta do identyfikacji emisji próbki, w zakresie 460-560 nm. Spektrometr USB4000 był nastawiony tak, aby zapisywał i uśredniał za każdym razem pięć pomiarów Fe. Analiza danych polega na śledzeniu zmian natężenia fluorescencji kolejnych próbek eGFP z metalem, dla długości fali A_em = 510 nm, która została określona jako maksimum emisji analitu IF = AF(A_em) (Fig. 7). Następnie dla długości fali A_em odczytano natężenia dla wykonanych pomiarów i wykreślono wykres ich zmiany, zaznaczając punkt detekcji stężenia określonego w normie (Fig. 8).

Zalety wynalazku:

Wynalazek ujawnia pionierską metodę otrzymywania zmodyfikowanego białka eGFP wiążącego jony chromu. Proponowana metoda jest wydajną ścieżką otrzymywania preparatu o wysokim stopniu homogenności. Otrzymuje się rozpuszczalną wersję białka eGFP (formę aktywną), która wykrywa jony Cr³⁺ w zakresie stężeń, które mieszczą się w przedziałach norm dla zawartości chromu w próbkach wody;

Wykrywanie jonów Cr³* możliwe jest nie tylko w próbkach wody, ale także każdej innej próbce w formie płynnej.

Wykaz literatury

1. Barceloux DG. (1999) Chromium, Journal of Toxicology: Clinical Toxicology, 37:2, 173-194.

2. United States Environmental Protection Agency (2009). National Primary Drinking Water Regulations.

3. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 7.12.2017 r. w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi. Dz.U. 2017, poz. 2294.

4. Ammann AA. (2002) Speciation of heavy metals in environmental water by ion chromatography coupled to ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 372,448-452.

5. Belkin S (2003) Microbial whole-cell sensing systems of environmental pollutants. Current Opinion in Microbiology, 6(3): 206-212.

6. Schalk IJ, Hannauer M, Braud A (2011) New roles for bacterial siderophores in metal transport and tolerance. Environmental Microbiology, 13(11): 2844-2854.

7. Lee W, Kim H, Kang Y, Lee Y, Yoon Y. (2019) A biosensor platform for metal detection based on enhanced green fluorescent protein. Sensors, 19(8), 1846. doi: 10.3390/s19081846.

8. Kim H, Lee W, Yoon Y. (2019) Heavy metal(loid) biosensor based on split-enhanced green fluorescent protein: development and characterization. Applied Microbiology and Biotechnology, 103: 6345-6352. doi.org/10.1007/s00253-019-09908-7.

9. Kim. H., Jang, G., Yoon, Y. Specific heavy metal/metalloid sensors: current state and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol 104, 907-914 (2020). doi.org/10.1007/s00253-019-10261-y.

PL 248750 Β1

Wykaz sekwencji:

<110> Politechnika Warszawska <120>

Zmodyfikowane wzmocnione białko zielonej fluorescencji eGFP, konstrukt genetyczny kodujący białko eGFP, zastosowanie białka eGFP do detekcji jonów chromu oraz sposób pomiaru stężenia jonów chromu z wykorzystaniem zmodyfikowanego białka eGFP.

<130> 60060 <160> 3 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> sekwencja więżąca jony chromu <400> 1

Tyr Lys Ala Ser Leu Ile Thr

5 <210> 2 <211> 269 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

PL 248750 Β1 <220>

<223> sekwencja <400> 2

Met Trp Ser His

Ser Gly Gly Ser

Lys Glu Glu Leu 35

Gly Asp Val Ssn 50

Asp Ala Thr Tyr 65

Lys Leu Pro Val

Val Gin Cys Phe

100

Phe Lys Ser Ala 115

Phe Lys Asp Asp

130

Gly Asp Thr Leu 145

Glu Asp Gly Asn

His Asn Val Tyr

180

Asn Phe Lys Tle 195

Asp His Tyr Gin

210

Thr Leu Pro Asp 225

Asp Pro Asn Glu

Ala Ala Gly Ile

260 zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MEL-Cr³⁺

Pro G1n Phe 5

Ser Ala Trp

Phe Thr Gly

Gly His Lys 55

Gly Lys Leu 70

Pro Trp Pro 85

Ser Arg Tyr

Met Pro Glu

Gly Asn Tyr 135

Val Asn Arg 150

Ile Leu Gly 165

Ile Met Ala

Arg His Asn

Gin Asn Thr

215

Asn His Tyr 230

Lys Arg Asp 245

Thr Leu Gly

Glu Lys Gly

Ser His Pro

Val Val Pro 40

Phe Ser Val

Thr Leu Lys

Thr Leu Val

Pro Asp His 105

Gly Tyr Val 120

Lys Thr Arg

Ile Glu Leu

His Lys Leu

170

Asp Lys Gin 185

Tle Glu Asp 200

Pro Tle Gly

Leu Ser Thr

His Met Val

250

Met Asp Glu

265

G1y Gly Ser

Gin Phe Glu

Ile Leu Val 45

Ser Gly Glu 60

Phe Ile Cys 75

Thr Thr Leu

Met Lys Gin

Gin Glu Arg 125

Ala Glu Val

140

Lys Gly Ile 155

Glu Tyr Asn

Lys Asn Gly

Gly Ser Val 205

Tyr Lys Ala 220

Gin Ser Ala 235

Leu Leu Glu

Leu Tyr Lys

G1 y G' y G1 y 15

Lys Val Ser 30

Glu Leu Asp

Gly Glu Gly

Thr Thr Gly 80

Thr Tyr Gly 95

His Asp Phe 110

Thr Ile Phe

Lys Phe Glu

Asp Phe Lys

160

Tyr Asn Ser 175 ile Lys Val 190

Gin Leu Ala

Ser Leu Ile

Leu Ser Lys

240

Phe Val Thr

5

PL 248750 Β1 <210> 3 <211> 810 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> sekwencja nukleotydowa kodującą białko TST-eGFP-MBL-Cr3+ <400> 3 atgtggtccc acccgcaatt tgaaaaaggt ggtggttctg gtggtggttc tggtggttct 60 tctgcatggt ctcatccaca atttgaaaaa gtgagcaagg aggagctgtt caccggggtg 120 gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 180 gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 240 aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 300 agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 360 tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 420 gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 480

PL 248750 Β1 gaggacggca acatcctggg gcacaagctg 540 atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc 600 gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac 660 gcgagcctga ttaccctgcc cgacaaccac 720 gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 780 gagtacaact acaacagcca caacgtctat aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc taccagcaga acacccccat cggctacaaa tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa

Claims (23)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zmodyfikowane, wzmocnione białko zielonej fluorescencji TST-eGFP-MBL-Cr³*, znamienne tym, że w sekwencji aminokwasowej białka o SEQ ID NO.2 w miejsce sekwencji DGFP obejmującej reszty aminokwasowe od 190 do 193 wstawiono co najmniej jedną, 7-aminokwasową sekwencję SEQ ID NO.1.
2. 2. Białko TST-eGFP-MBL-Cr³* według zastrzeżenia 1 znamienne tym, że sekwencja SEQ ID NO.1 wiąże jony chromu Cr³*.
3. 3. Białko TST-eGFP-MBL-Cr³* według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń 1-2, znamienne tym, że na końcu aminowym zawiera sekwencję TST.
4. 4. Białko TST-eGFP-MBL-Cr³* według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń 1-3, znamienne tym, że ilość dołączonych powtórzeń sekwencji SEQ ID NO. 1 w białku wynosi od 1 do 10.
5. 5. Konstrukt genetyczny o sekwencji SEOID NO. 3, którego ekspresja daje produkt w postaci zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr³* o SEQ ID NO. 2 według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń 1-4.
6. 6. Sposób wytwarzania zmodyfikowanego białka eGFP określonego zastrzeżeniem 1, w komórkach bakteryjnych obejmujący:

   a) wprowadzenie wektora ekspresyjnego do komórek bakterii, przy czym wektor zawiera konstrukt genetyczny określony zastrzeżeniem 5

   b) hodowlę bakterii w podłożu płynnym z wytrząsaniem

   c) indukcję nadekspresji konstruktu genetycznego do wytwarzania zmodyfikowanego białka eGFP przy zastosowaniu IPTG

   d) odwirowanie i zawieszenie osadu w buforze z lizozymem

   e) sonikację

   f) odwirowanie zdezintegrowanych komórek 30 min. przy 12000 obr/min. w 4°C

   g) zebranie supernatantu

   h) zawieszenie pozostałego osadu w buforze z sarkozylem i tritonem Χ-100 i inkubację lizatu komórek przez noc w celu odzyskania frakcji nierozpuszczalnego białka.

   i) połączenie frakcji lizatu z etapu g) i etapu h)

   j) inkubację lizatu z dodatkiem nukleaz

   k) odwirowanie 40 min przy 12000 obr/min w 4°C

   l) filtrację uzyskanego supernatantu na filtrze membranowym MCE 0,45 μm

   m) oczyszczanie z supernatantu aktywnego, rekombinowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr3⁺ za pomocą chromatografii powinowactwa na złożu wiążącym domenę Strep-Tag

   n) odsalanie frakcji, w których potwierdzono obecność białka eGFP za pomocą chromatografii cieczowej na kolumnie ze złożem odsalającym

   o) zagęszczenie frakcji, w których detektor wykrył wiązanie peptydowe na koncentratorze wirówkowym o granicy odcięcia 10,000 MWCO 3-5 minut w 4°C, 5000 obr/min

   p) uzyskanie zmodyfikowanego białka eGFP o stężeniu 1-1,2 mg/ml i czystości powyżej 90%.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że hodowla w etapie b) prowadzona jest w zakresie temperatur 18-37°C z wytrząsaniem 200-250 obr/min.
8. 8. Sposób według zastrz.6, znamienny tym, że indukcja w etapie c) następuje w momencie osiągnięcia przez bakterie gęstości hodowli OD600 0,5-0,6.
9. 9. Sposób według zastrzeżenia 6, znamienny tym, że w etapie c) końcowe stężenie IPTG wynosi 0,1-2 mM, a czas hodowli od momentu indukcji do zebrania komórek wynosi od 2 do 30 h.
10. 10. Sposób według zastrzeżenia 6, znamienny tym, że wirowanie w etapie d) trwa 15 min przy 4500 obr/min, a stężenie lizozymu w buforze wynosi 0,1 mg/ml.
11. 11. Sposób według zastrz.6 znamienny tym, że w etapie e) parametry sonikacji to 30 sekund przy amplitudzie 5 mikronów z 30 sekundowym interwałem pomiędzy cyklami, przy 80% mocy sonikatora.
12. 12. Sposób według zastrzeżenia 6, znamienny tym, że w buforze w etapie h) stosuje się dodatek detergentów anionowych i niejonowych.
13. 13. Sposób według zastrzeżenia 12 znamienny tym, że stosuje się 2-10% sarkozyl i 2% Triton X-100.
14. 14. Sposób według zastrzeżenia 6, znamienny tym, że w etapie j) dodaje się nukleazy w stężeniu 3,5 U/ml lizatu.
15. 15. Sposób według zastrzeżenia 6, znamienny tym, że w etapie p) otrzymuje się aktywną, rozpuszczalną formę białka eGFP określonego zastrzeżeniem 1.
16. 16. Zastosowanie zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr3⁺ określonego w zastrzeżeniu 1 jako biosensora nowej generacji do detekcji jonów chromu w biologicznych próbkach ciekłych.
17. 17. Zastosowanie zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr3⁺ według zastrzeżenia 16, znamienne tym, że próbką ciekłą jest próbka wody.
18. 18. Zastosowanie zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ według zastrzeżenia 16, znamienne tym, że białko eGFP oddziałuje z jonami Cr³⁺, powodując zmianę poziomu intensywności fluorescencji.
19. 19. Sposób pomiaru stężenia jonów chromu z wykorzystaniem zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ określonego zastrzeżeniem 1, znamienny tym, że białko TST-eGFP-MBL-Cr³⁺ miesza się z próbką zawierającą jony chromu, a następnie rejestruje widmo fluorescencji i odczytuje maksimum intensywności dla emisji przy długości fali λ = 500-530 nm, po wzbudzeniu białka TST-eGFP-MBL-Cr3⁺ falą o długości λ = 470-500 nm.
20. 20. Sposób według zastrzeżenia 19, znamienny tym, że stężenie zmodyfikowanego białka TST-eGFP-MBL-Cr3⁺ użytego do pomiaru wynosi od 0,05 mg/ml do 5 mg/ml.
21. 21. Sposób według zastrzeżenia 19, znamienny tym, że pomiaru dokonuje się w biologicznych próbkach ciekłych.
22. 22. Sposób według zastrzeżenia 21, znamienny tym, że próbką ciekłą jest próbka wody.
23. 23. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 19-22, znamienny tym, że stężenie badanych jonów chromu mieści się w zakresie od 200 nM do 15 μΜ.