PL233476B1

PL233476B1 - Dwie pary oligonukleotydowych starterów do wykrywania obecności alleli dominującego lub recesywnego genu odporności na rdzę koronową Pc39 w genomie owsa zwyczajnego (Avena sativa L.), kombinacja dwóch par starterów oraz sposób wykrywania układu alleli genu Pc39

Info

Publication number: PL233476B1
Application number: PL422535A
Authority: PL
Inventors: Edyta Paczos-Grzęda; Sylwia Sowa
Original assignee: Univ Przyrodniczy W Lublinie
Priority date: 2017-08-11
Filing date: 2017-08-11
Publication date: 2019-10-31
Also published as: PL422535A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są dwie pary oligonukleotydowych starterów, mianowicie: silicoDArT2_F1 oraz silicoDArT2_R1 do wykrywania allelu dominującego genu odporności na rdzę koronową Pc39 w roślinach owsa o sekwencjach nr 1 i 2 przedstawionych na liście sekwencji oraz DArT2_F oraz DArT2_R do wykrywania allelu recesywnego genu Pc39 w roślinach owsa o sekwencjach nr 3 i 4 przedstawionych na liście sekwencji. Przedmiot wynalazku stanowi również kombinacja tych par. Przedmiotem zgłoszenia jest ponadto sposób identyfikacji allelu dominującego genu odporności na rdzę koronową Pc39 w roślinach owsa, w którym polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, a parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach nr 1 i 2 przedstawionych na liście sekwencji, przy czym stosuje się marker silicoDArT2. W wyniku reakcji PCR amplifikowany jest fragment DNA o długości 42 par zasad o sekwencji nr 5 przedstawionej na liście sekwencji. Natomiast identyfikację allelu recesywnego genu Pc39 w roślinach owsa, prowadzi się według sposobu, w którym polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, przy czym parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach nr 3 i 4 przedstawionych na liście sekwencji, przy czym stosuje się marker DArT2. W wyniku reakcji PCR amplifikowany jest fragment DNA o długości 420 par zasad o sekwencji nr 6 przedstawionej na liście sekwencji.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są dwie pary oligonukleotydowych starterów inicjujących amplifikację dwóch markerów molekularnych pozwalających na wykrycie obecności alleli dominującego lub recesywnego genu odporności na rdzę koronową Pc39 w genomie owsa zwyczajnego (Avena sativa L), kombinacja dwóch par starterów oraz sposób detekcji tych markerów w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR).

Rdza koronowa to najpowszechniej występująca choroba grzybowa owsa, występująca w każdym rejonie uprawy tego zboża, powodowana przez grzyb Puccicnia coronata Cda. f. sp. avenae P. Syd. & Syd. (Chong J., 2003. Disease of Oat. W: Bailey, K., Gossen, B., Gugel, R., Morrall, R. (Red), Diseases of Field Crops. The Canadian Phytotpathological Society, ss. 74-88). Patogen atakuje głównie liście i zaburza transport produktów fotosyntezy do rosnącego ziarna, znacząco obniżając jego jakość. Porażone rośliny rozwijają zredukowany system korzeniowy, co osłabia ich tolerancję na suszę (Simons, M.D., 1985. Crown rust. W: Roelfs, A.P., Bushnel, W.R. (Red.), The cereal rust Vol. 2 Diseases, Distribution, Epidemiology, and Control. Academic Press, Orlando, ss. 131-172). Choroba obniża również jakość słomy, co potęguje wylęganie roślin, które nie tylko uniemożliwia efektywną wegetację, ale również wzmaga podatność na atak innych patogenów i bardzo utrudnia zbiory.

Pożądaną alternatywą dla chemicznej ochrony roślin z użyciem fungicydów jest genetycznie warunkowana odporność o charakterze jakościowym, która sprzyja uzyskaniu wysokiego i stabilnego plonu, a także podnosi wartość ekologiczną rośliny, przez co jest obecnie jednym z ważniejszych celów hodowlanych owsa. Stosowanie środków ochrony roślin w przypadku owsa nie jest również tak proste, jak w przypadku innych zbóż ponieważ z uwagi na niewielki areał uprawy większość fungicydów nie jest testowana w uprawach owsa i w związku z tym nie jest dopuszczona do zwalczania patogenów owsa.

Odporność na określoną rasę rdzy koronowej jest warunkowana monogenicznie i ma charakter dominujący (Simons, M.D., 1979. Influence of genes for resistance to Puccinia coronata from Avena sterilis on yield and rust reaction of cultivated oats. Phytopathology 69, 450-452). Dotychczas zidentyfikowano ponad 100 genów odporności na różne rasy fizjologiczne P. coronata, w tym również pochodzący z A. sterilis gen (Fleischmann G., McKenzie R.I.H., 1968. Inheritance of crown rust resistance in Avena sterilis. Crop Sci. 8, 710-713). Gen ten przez lata wykorzystywany był w hodowli owsa (McKenzie R.I.H., Martens J. W., Brown PD., Harder D.E., Nielsen J., Boughten G.R., 1981. Registration of Fidler oats. Crop Sci. 623); Brown P.D., Duguid S.D., Haber S., Chong J, Harder D.E., Menzies J., Noll J.S., McKenzie R.I.H., 2001. AC Assiniboia oat. Can. J. Plant Sci. 81, 77-79). Wykazano, że gen Pc39 jest nadal wysoce efektywny w polskich warunkach (Sowa S., Paczos-Grzęda E. 2017. Puccinia coronata fsp. avenae virulence in South Eastern Poland. Folia Pomer. Univ. Technol. Stetin., Agric., Aliment., Pise., Zootech, w druku), a jedyną polską odmianą z tym genem jest ‘Celer’ (Sowa S., Paczos-Grzęda E., niepublikowane).

Identyfikacja genu Pc39, podobnie jak innych genów odporności, w oparciu o obserwację fenotypu jest trudna i czasochłonna, a często wręcz niemożliwa, ze względu na brak izolatów P. coronata o odpowiednich profilach porażenia, czy epistatyczne właściwości niektórych genów z nim współdziałających. Jedyny marker dla genu Pc39 opracowali Wight i in. (Wight C.P., ODonoughue L.S., Chong J., Tinker N.A., Molnar S.J., ODonoughue L.S., Chong J., Tinker N. a., Molnar S.J., 2004. Discovery, localization, and sequence characterization of molecular markers for the crown rust resistance genes Pc38, Pc39, and Pc48 in cultivated oat (Avena sativa L). Mol. Breed. 14, 349-361). Autorzy obserwowali kosegregację markera RFLP cdo666 z genem Pc39 w populacji ‘Pendek-39’ x ‘Pendek-48’, zaś analiza sprzężeń przeprowadzona dla tego markera w populacji ‘OT328’ x ‘Dumont’ wykazała jego położenie w odległości 6cM od badanego genu. Niestety autorzy stwierdzili, że marker cdo666 występował również w innych populacjach, nie posiadających Pc39, w związku z czym nie polecają jego wykorzystania w selekcji wspomaganej markerami. Ponadto identyfikacja obecności markera cdo666 odbywa się przy udziale RFLP - jednego z najstarszych systemów markerowych, bardzo praco- i czasochłonnego, a także wymagającego bardzo dużej ilości, bardzo dobrej jakości DNA. Ten system markerowy nie jest wykorzystywany do analiz na szeroką skalę z uwagi na brak możliwości jego automatyzacji i zwiększenia przepustowości (Tanksley S.D., Young N.D., Paterson A.H, Bonierbale M.W., 1989. RFLP mapping in plant breeding: new tools for an old science. Nat. Biotechnol. 7, 257-264).

Celem wynalazku było znalezienie par oligonukleotydów i takiej ich kombinacji, która umożliwiłaby wykrycie obecności alleli dominującego lub recesywnego genu odporności na rdzę koronową w roślinach owsa zarówno w stadium siewki, jak i rośliny dorosłej.

PL 233 476 Β1

Istotę wynalazku stanowią dwie pary oligonukleotydowych starterów:

Para 1:

silicoDArT2_Fl 5’TGCAGCAGGTATGGAAGTGAC3’ (sekwencja nr 1) silicoDArT2_Rl 5’GAATTGACAGCGCGGTGCG3’ (sekwencja nr 2)

Para 2:

DArT2_F 5’GAAACGTGGGTTATGCTCGG3’ (sekwencja nr 3)

DArT2_R 5’AGACGCCGCGTACTCTCTAA3’ (sekwencja nr 4) do wykrywania alleli dominującego (para 1) lub recesywnego (para 2) genu w roślinach owsa.

Istotą kombinacji par oligonukleotydowych starterów do wykrywania allelu dominującego lub recesywnego genu odporności na rdzę koronową Pc39 w roślinach owsa jest to, że stanowią ją pary o sekwencjach nr 1 i 2 oraz 3 i 4 przedstawionych na liście sekwencji.

Sposób identyfikacji układu alleli dominującego lub recesywnego genu odporności na rdzę koronową Pc39 w roślinach owsa, w którym to sposobie polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem kombinacji dwóch par starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, polega na tym, że stosuje się kombinację par starterów:

Para 1:

Para 2:

DArT2_F 5 ’GAAACGTGGGTTATGCTCGG3’ (sekwencja nr 3)

DArT2_R 5’AGACGCCGCGTACTCTCTAA3’ (sekwencja nr 4), przy czym dla pary o sekwencjach nr 1 i 2 stosuje się marker silicoDArT2 przedstawiony na Fig. 1, o długości 42 pz związany z obecnością allelu dominującego genu Pc39 w roślinach owsa (sekwencja nr 5), a dla pary o sekwencjach nr 3 i 4 stosuje się marker DArT2 przedstawiony na Fig. 2, o długości 420 pz związany z obecnością allelu recesywnego genu Pc39 w roślinach owsa (sekwencja nr 6).

W pierwszym etapie wytworzono populację mieszańcową ‘Celer’ x STH9210, w której dawcą genu jest odmiana ‘Celer’. Następnie za pomocą testu fizjologicznego zidentyfikowano 40 roślin homozygotycznych Pc39Pc39- odpornych oraz 40 roślin - Pc39Pc39 porażonych. Po wyizolowaniu DNA roślin o przeciwstawnych fenotypach poddano je komercyjnej analizie polimorfizmu zredukowanej reprezentacji genomu DArT opartej na hybrydyzacji z sondami i mikromacierzach oraz DArTseq polegającej na sekwencjonowaniu zredukowanej reprezentacji genomu. Wyniki uzyskano w postaci macierzy binarnych. Po przyporządkowaniu segregacji fenotypów i genotypów zidentyfikowano sondy DArT oraz sekwencje silicoDArT, które stały się podstawą do projektowania odpowiednich par starterów:

Para 1:

silicoDArT2_F 1 5 ’ TGCAGC AGGTATGGAAGTGAC3 ’ silicoDArT2_Rl 5’ GAATTGAC AGCGCGGTGCG3 ’

Para 2:

DArT2_F 5OAAACGTGGGTTATGCTCGG3’

DArT2_R 5’AGACGCCGCGTACTCTCTAA3’

PL 233 476 B1

Z udziałem oligonukleotydowej pary starterów silicoDArT2_F1 oraz silicoDArT2_R1 uzyskano kodominujący marker silicoDArT2 (Fig. 1), który w prosty i szybki sposób identyfikuje rośliny owsa posiadające allel dominujący genu Pc39. Marker silicoDArT2 będący przedmiotem niniejszego zgłoszenia patentowego, który został opracowany w oparciu o wyniki analizy segregacji produktu silicoDArT2 o długości 42 pz, wykazywał sprzężenie genetyczne 1,3 cM z locus genu Pc39. Z kolei z udziałem oligonukleotydowej pary starterów DArT2_F oraz DArT2_R uzyskano kodominujący marker DArT2 (Fig. 2), który w prosty i szybki sposób identyfikuje rośliny owsa posiadające allel recesywny genu Pc39. Marker DArT2 będący przedmiotem niniejszego zgłoszenia patentowego opracowany w oparciu o wyniki analizy segregacji produktu DArT2 o długości 420 pz, wykazywał sprzężenie genetyczne 0,4 cM z locus genu Pc39. Oba markery mają charakter specyficzny, bazują na reakcji PCR oraz generują łatwe w interpretacji i powtarzalne wyniki umożliwiając ich zastosowanie w selekcji wspomaganej markerami.

Przeprowadzone badania markerów silicoDArT2 i DArT2 wykazały, że są one znacznikami, odpowiednio, allelu dominującego oraz recesywnego genu Pc39 w owsie zwyczajnym. Zastosowanie kombinacji markerów silicoDArT2 i DArT2 może być zatem przydatne do identyfikacji układu alleli genu Pc39 obecnego w materiałach hodowlanych owsa. W pracach hodowlanych pożądany genotyp stanowi wyłącznie homozygota dominująca, która gwarantuje odporność potomstwa, w przeciwieństwie do heterozygoty, która segreguje na formy odporne i porażone. Jedynym sposobem weryfikacji genotypu jest przeprowadzenie testu DNA. Zastosowanie dwóch par starterów umożliwia identyfikację markerów i określenie genotypu roślin owsa.

Podstawową zaletą opracowanego systemu identyfikacji jest możliwość analizy roślin w bardzo wczesnym stadium rozwojowym, a wynik uzyskiwany jest w krótkim czasie i jest niezależny od warunków środowiska wzrostu i rozwoju rośliny. Kolejną zaletą jest brak konieczności stosowania żmudnych testów żywiciel patogen wymagających dysponowania określonym izolatem Puccinia coronata umożliwiającym identyfikację określonego genu odporności.

Fig. 1 przedstawia produkty PCR uzyskane w wyniku amplifikacji DNA roślin pokolenia F2 populacji ‘Celer’ x STH9210 po włączeniu do reakcji pary starterów silicoDArT2

M - marker wielkości GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder;

Celer, STH9210 - formy rodzicielskie badanej populacji;

19-867 - numery roślin populacji ‘Celer’ x STH9210 opisane pod względem fenotypu:

O - homozygoty odporne;

P - homozygoty wrażliwe;

H - heterozygoty.

Strzałką zaznaczono produkt różnicujący o masie ok. 42 pz.

Fig. 2 przedstawia produkty PCR uzyskane w wyniku amplifikacji DNA roślin pokolenia F2 populacji ‘Celer’ x STH9210 po włączeniu do reakcji pary starterów DArT2;

M - marker wielkości GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder;

Celer, STH9210 - formy rodzicielskie badanej populacji;

O - homozygoty odporne;

P - homozygoty wrażliwe;

H - heterozygoty.

Strzałką zaznaczono produkt różnicujący o masie ok. 420 pz.

PL 233 476 Β1

Sposób identyfikacji markerów silicoDArT2 i DArT2

Materiał:

DNA izolowane z liści owsa przy wykorzystaniu komercyjnie dostępnych zestawów.

Skład mieszaniny reakcji PCR (Polymerase chain rection) dla markera silicoDArT2

DNA	10-50ng
10 x Taq bufor (200 mM Tris-HCl, 200 mM KC1)	lx
dNTP	0,2 mM
MgCh	1 mM
Polimeraza Taq	0,5 U
Starter silicoDArT2 FI	0,1-0,2 μΜ
Starter silicoDArT2 R1	0,1-0,2 μΜ
H₂O	W zależności od objętości końcowej mieszaniny PCR

Skład mieszaniny reakcji PCR (Polymerase chain rection) dla markera DArT2

DNA	10 - 50 ng
10 x Taq bufor (200 mM Tris-HCl, 200 mM KC1)	lx
dNTP	0,2 mM
MgCh	1 mM
Polimeraza Taq	0,5-1,0 U
Starter DArT2 F	0,1-0,4 μΜ
Starter DArT2 R	0,1-0,4 μΜ
H₂O	W zależności od objętości końcowej mieszaniny PCR

Sekwencje starterów:

Para 1:

silicoDArT2_Fl 5’TGCAGCAGGTATGGAAGTGAC3’ silicoD ArT2_Rl 5OAATTGACAGCGCGGTGCG3’

Para 2;

DArT2_F 5OAAACGTGGGTTATGCTCGG3’

DArT2_R 5’AGACGCCGCGTACTCTCTAA3’

Startery projektowano przy użyciu programu Primer 3.0.

Warunki amplifikacji DNA

Reakcje PCR przeprowadzono w termocyklerze Biometra Proffesional (Biometra).

Profil termiczny reakcji PCR dla markera silicoDArT2: 95°C - 3 min, 35 cykli (94°C - 20 s, 68°C - 20 s, 72°C - 20 s), 72°C - 7 min.

Profil termiczny reakcji PCR dla markera DArT2: 95°C - 3 min, 37 cykli (94°C - 30 s, 65°C - 30 s, 72°C - 1 min), 72°C - 7 min.

Identyfikacja markera silicoDArT2:

Elektroforeza na 3% żelu agarozowym zawierającym 0,5 Jg/ml bromku etydyny w buforze TBE (pH 8,0) przy napięciu 100 V przez 40 min. Jako wzorzec długości fragmentów DNA użyto GeneRuler™ 100 bpDNA Ladder (Fermentas). Wizualizacji markera dokonano wykorzystując system DigiGeminus (Syngene).

PL 233 476 Β1

Identyfikacja markera DArT2:

Elektroforeza na 1,5% żelu agarozowym zawierającym 0,5 μg/ml bromku etydyny w buforze TBE (pH 8,0) przy napięciu 100 V przez 2 godz. Jako wzorzec długości fragmentów DNA użyto GeneRuler™ 100 bpDNA Ladder(Fermentas). Wizualizacji markera dokonano wykorzystując system DigiGeminus (Syngene).

Wyniki:

Testowanie markera silicoDArT2 na osobnikach populacji STH9210 x ‘Celer’ wykazało wysoką zgodność segregacji tego markera z odpornością na rdzę koronową owsa (Wzór 1). Na 150 testowanych roślin ilość niedopasować wyniosła 3, czyli 2,00% niewłaściwie zakwalifikowanych genotypów na podstawie detekcji markera silicoDArT2. Na elektroforegramie przedstawiono amplifikowane fragmenty DNA po włączeniu do analizy pary starterów silicoDArT2_F1 i silicoDArT2_R1, świadczące o obecności w badanych genotypach allelu dominującego genu.

W efekcie testowania markera DArT2 na osobnikach populacji STH9210 x ‘Celer’ stwierdzono wysoką zgodność segregacji tego markera z odpornością na rdzę koronową owsa (Wzór 2). Na 128 testowanych roślin ilość niedopasować wyniosła 4, czyli 3,12% niewłaściwie zakwalifikowanych genotypów na podstawie detekcji markera silicoDArT2. Na elektroforegramie przedstawiono amplifikowane fragmenty DNA po włączeniu do analizy pary starterów DArT2_F i DArT2_R, świadczące o obecności w badanych genotypach allelu recesywnego genu Pc39.

LISTA SEKWENCJI

Sekwencja nr 1

5’ TGCAGCAGGTATGGAAGTGAC3’

Sekwencja nr 2

5’ GAATTGACAGCGCGGTGCG 3’

Sekwencja nr 3

5’GAAACGTGGGTTATGCTCGG3’

Sekwencja nr 4 ’AGACGCCGCGTACTCTCTA A3 ’

Sekwencja nr 5 5’TGCAGCAGGTATGGAAGTGACGTCGCACCGCGCTGTCAATTC3’

Sekwencja nr 6 5’GAAACGTGGGTTATGCTCGGCGCACTCTTCAGGGTGCAGAGTTCTT TCTATTCAGCGACATATCTTGTAATCTGATACAGAAATTCACCAACTC CTGTAAGAGACTCAACATGGTTTGCCTTATTGTGCTGCACCCAAAAC AGAGGAAACAGAGTGAGCGCTACTGTAGCTCATCCGACAATGCGAA TATGCTCGCCAAAATTCTCATTGCACAATAAAAGTTCCTGACGGATA CCCGTCCGTTAAGCTGCTAACCACGTCTTCTTCACCTCATTGCACATC ATGCCCAAACTGTACTGACTGTAATGATGCGTAATAGTCAGACGTTC GGTAGAACTCTTAATCCTGATAGATATTACAGTCACAGAGCAGGTAT

AGCTATTTACAGATGGGTTCCCGG T TAGAGAGTACGCGGCGTCT3’

PL 233 476 Β1

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Para oligonukleotydowych starterów silicoDArT2_F1 oraz silicoDArT2_R1 do wykrywania allelu dominującego genu odporności na rdzę koronową Pc39w roślinach owsa o sekwencjach nr 1 i 2 przedstawionych na liście sekwencji.
2. Para oligonukleotydowych starterów DArT2_F oraz DArT2_R do wykrywania allelu recesywnego genu Pc39 w roślinach owsa o sekwencjach nr 3 i 4 przedstawionych na liście sekwencji.
3. Kombinacja par oligonukleotydowych starterów do wykrywania allelu dominującego lub recesywnego genu odporności na rdzę koronową Pc39 w roślinach owsa, znamienna tym, że stanowią ją pary o sekwencjach nr 1 i 2 oraz 3 i 4 przedstawionych na liście sekwencji.
4. Sposób identyfikacji układu alleli dominującego lub recesywnego genu odporności na rdzę koronową Pc39 w roślinach owsa, w którym to sposobie polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem kombinacji dwóch par starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, znamienny tym, że stosuje się kombinację par starterów według zastrz. 3, przy czym dla pary o sekwencjach nr 1 i 2 stosuje się marker silicoDArT2 przedstawiony na Fig. 1, a dla pary o sekwencjach nr 3 i 4 stosuje się marker DArT2 przedstawiony na Fig. 2.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że w wyniku reakcji PCR amplifikowany jest fragment DNA o długości 42 par zasad o sekwencji nr 5 przedstawionej na liście sekwencji, związany z obecnością allelu dominującego.
6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że w wyniku reakcji PCR amplifikowany jest fragment DNA o długości 420 par zasad o sekwencji nr 6 przedstawionej na liście sekwencji, związany z obecnością allelu recesywnego.