PL233478B1 - Para oligonukleotydowych starterów do wykrywania oraz sposób wykrywania allelu dominującego genu odporności na rdzę koronową Pc39 w roślinach owsa zwyczajnego (Avena sativa L.) - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest para oligonukleotydowych starterów do wykrywania allelu dominującego genu odporności na rdzę koronową Pc39 w roślinach owsa o sekwencjach nr 1 i 2 przedstawionych na liście sekwencji. Zgłoszenie obejmuje ponadto, sposób identyfikacji allelu dominującego genu odporności na rdzę koronową Pc39 w roślinach owsa, w którym polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, a parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach nr 1 i 2 przedstawionych na liście sekwencji, przy czym stosuje się marker SRAP-SCAR_23-14. W wyniku PCR amplifikowany jest fragment DNA o długości 915 par zasad o sekwencji nr 3 przedstawionej na liście sekwencji.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest para oligonukleotydowych starterów inicjujących amplifikację markera molekularnego pozwalającego na wykrycie obecności allelu dominującego genu odporności na rdzę koronową Pc39 w genomie owsa zwyczajnego (Avena sativa L.) oraz sposób detekcji tego markera w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR).

Rdza koronowa to obok mączniaka prawdziwego najpowszechniej występująca choroba grzybowa owsa, występująca w każdym rejonie jego uprawy (Chong J. 2003. Disease of Oat. W: Bailey K., Gossen B., Gugel R., Morrall R. (Red.), Diseases of Field Crops. The Canadian Phytotpathological Society, ss. 74-88). Powodowana jest przez Puccicnia coronata Cda. f. sp. avenae P. Syd. & Syd., patogen należący do rzędu Uredinales, gromady Basidiomycotina. Jest to obligatoryjny, makrocykliczny pasożyt dwudomowy atakujący wiele gatunków traw, ale nie porażający innych poza owsem gatunków zbóż (Agros G., 2004. Plant Pathology, 5th ed. Elsevier, London, UK). Infekuje głównie liście i zaburza transport produktów fotosyntezy do rosnącego ziarna znacząco obniżając jego jakość. Porażone rośliny rozwijają zredukowany system korzeniowy, co osłabia ich tolerancję na suszę (Simons M.D., 1985. Crown rust. W: Roelfs A.P, Bushnel W.R. (Red.), The cereal rust Vol. 2 Diseases, Distribution, Epidemiology, and Control. Academic Press, Orlando, ss. 131-172). Choroba obniża również jakość słomy, co potęguje wylęganie roślin, które uniemożliwia efektywną wegetację, utrudnia zbiory i wzmaga podatność na atak innych patogenów.

Stosowanie fungicydów jest najprostszą metodą walki z tą chorobą, jednak chemiczne środki ochrony roślin stanowią poważne zagrożenie dla środowiska naturalnego, a ich wysokie koszty w porównaniu z ceną ziarna owsa czynią ten zabieg nieopłacalnym. Pożądaną alternatywą jest genetycznie dziedziczona odporność, która sprzyja uzyskaniu wysokiego i stabilnego plonu, a także podnosi wartość ekologiczną rośliny, przez co jest obecnie jednym z ważniejszych celów hodowlanych owsa.

Odporność na określoną rasę rdzy koronowej jest zazwyczaj cechą dominującą warunkowaną monogenicznie, specyficzną w stosunku do rasy patogenu. Dotychczas opisano ponad 100 genów odporności na różne rasy fizjologiczne P. coronata, w tym również gen Pc39 zidentyfikowany w dzikim gatunku Avena sterilis (Fleischmann G., McKenzie R.I.H., 1968. Inheritance of crown rust resistance in Avena sterilis. Crop Sci. 8, 710-713) i przez lata skutecznie wykorzystywany w hodowli owsa jako pojedynczy gen w odmianie (McKenzie R.I.H., Martens J.W., Brown P.D., Harder, E., Nielsen J., Boughten G.R., 1981. Registration of Fidler oats. Crop Sci. 623) lub w połączeniu z genami Pc38 (McMullen M.S., Patterson F.L., 1992. Oat cultivar development in the USA and Canada. Agron.), czy Pc68 (Brown P.D., Duguid S.D., Haber S., Chong J., Harder D.E., Menzies J., Noll J.S., McKenzie R.I.H., 2001. AC Assiniboia oat. Can. J. Plant Sci. 81, 77-79). Wykazano, że gen Pc39 jest nadal wysoce efektywny w polskich warunkach (Sowa S., Paczos-Grzęda E. 2017. Puccinia coronata f.sp. avenae virulence in South Eastern Poland. Folia Pomer. Univ. Technol. Stetin., Agric., Aliment., Pisc., Zootech. w druku).

Identyfikacja tego genu, podobnie jak innych genów odporności, w oparciu o obserwację fenotypu jest trudna i czasochłonna, a często wręcz niemożliwa, ze względu na brak izolatów P. coronata o odpowiednich profilach porażenia, czy epistatyczne właściwości niektórych genów z nim współdziałających. Jedyny marker dla genu Pc39 opracowali Wight i in. (Wight C.P., ODonoughue L.S., Chong J., Tinker N.A., Molnar S.J., ODonoughue L.S., Chong J., Tinker N. a., Molnar S.J., 2004. Discovery, localization, and sequence characterization of molecular markers for the crown rust resistance genes Pc38, Pc39, and Pc48 in cultivated oat (Avena sativa L.). Mol. Breed. 14, 349-361). Autorzy obserwowali konegregację markera RFLP cdo666 z genem Pc39 w populacji ‘Pendek-39’ x ‘Pendek-48’, zaś analiza sprzężeń przeprowadzona dla tego markera w populacji ‘OT328’ x ‘Dumont’ wykazała jego położenie w odległości 6cM od badanego genu. Niestety autorzy stwierdzili, że marker cdo666 występował również w innych populacjach, nie posiadających Pc39, w związku z czym nie polecają jego wykorzystania do selekcji w hodowli odpornościowej. Ponadto identyfikacja obecności markera cdo666 odbywa się przy udziale RFLP - jednego z najstarszych systemów markerowych, bardzo praco- i czasochłonnego, a także wymagającego bardzo dużej ilości, bardzo dobrej jakości DNA. Ten system markerowy nie jest wykorzystywany do analiz na szeroką skalę z uwagi na brak możliwości jego automatyzacji i zwiększenia przepustowości (Tanksley S.D., Young N.D., Paterson A.H, Bonierbale, M.W., 1989. RFLP mapping in plant breeding: new tools for an old science. Nat. Biotechnol. 7, 257-264).

Celem wynalazku było znalezienie takiej pary oligonukleotydów, które umożliwiłyby identyfikację allelu dominującego genu Pc39 warunkującego odporność roślin owsa na rdzę koronową zarówno w stadium siewki, jak i rośliny dorosłej.

PL 233 478 Β1

Przedmiot wynalazku stanowi para oligonukleotydowych starterów do wykrywania allelu dominującego genu Pc39 w roślinach owsa o sekwencjach:

Me23.F2 5’ GTCCAAACCGGGATATC 3’ (sekwencja nr 1)

Eml4.R2 5’GCGTACGAATTCTTTAC3’ (sekwencja nr 2)

Sposób identyfikacji allelu dominującego genu odporności na rdzę koronową Pc39 w roślinach owsa, w którym to sposobie polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, charakteryzuje się tym, że parę starterów stanowi para oligonukleotydów o sekwencjach:

Me23.F2 5’ GTCCAAACCGGGATATC 3’

Eml4.R2 5’GCGTACGAATTCTTTAC3’, przy czym stosuje się marker SRAP-SCAR 23-14, przedstawiony na Fig. 1, o długości 915 pz związany z obecnością allelu dominującego genu Pc39 w roślinach owsa (sekwencja nr 3).

Fig. 1 przedstawia produkty SRAP-PCR uzyskane w wyniku amplifikacji DNA roślin pokolenia F2 populacji ‘Cele’ x STH9210 po włączeniu do reakcji pary starterów Me23.F2+Em14.R2 M - marker wielkości GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder; Celer, STH9210 - formy rodzicielskie badanej populacji;

19-244 - numery roślin populacji ‘Celer’ xSTH9210 opisane pod względem fenotypu:

O - homozygoty odporne;

P - homozygoty wrażliwe;

H - heterozygoty.

Strzałką zaznaczono marker SRAP-SCAR23-14 o długości 915 pz.

W pierwszym etapie wytworzono populację mieszańcową ‘Celer’ x STH9210, w której dawcą genu Pc39 jest odmiana ‘Celer’. Następnie za pomocą testu fizjologicznego zidentyfikowano 40 roślin homozygotycznych Pc39Pc39 - odpornych oraz 40 roślin Pc39Pc39 - porażonych. Po wyizolowaniu DNA roślin o przeciwstawnych fenotypach połączono je w pule zbiorcze i dokonano amplifikacji w obecności 1072 par starterów SRAP. Produkt różnicujący uzyskano z wykorzystaniem pary starterów SRAP Me23+Em14. Produkt poddano sekwencjonowaniu, a następnie zaprojektowano startery specyficzne:

Me23,F2 5’ GTCCAAACCGGGATATC 3’

Eml4.R2 5’GCGTACGAATTCTTTAC3’

Z udziałem oligonukleotydowych starterów Me23.F2 i Em14.R2 uzyskano kodominujący marker SRAP-SCAR 23-14 (Fig. 1), który w prosty i szybki sposób identyfikuje rośliny owsa posiadające allel dominujący genu Pc39. Marker SRAP-SCAR_23-14 będący przedmiotem niniejszego zgłoszenia patentowego został opracowany w oparciu o wyniki analizy segregacji produktu SRAP-SCAR 23-14 o masie 915 pz, wykazywał sprzężenie genetyczne 0,4 cM z locus genu Pc39, ma charakter specyficzny, bazuje na reakcji PCR oraz generuje łatwe w interpretacji i powtarzalne wyniki umożliwiając jego zastosowanie w selekcji wspomaganej markerami.

Przeprowadzone badania markera SRAP-SCAR 23-14 wykazały, że jest on znacznikiem allelu dominującego genu Pc39 w owsie zwyczajnym.

Zastosowanie markera SRAP-SCAR 23-14 może być przydatne do identyfikacji genu Pc39 obecnego w materiałach hodowlanych owsa. Podstawową zaletą opracowanego systemu identyfikacji jest możliwość analizy roślin w bardzo wczesnym stadium rozwojowym, a wynik uzyskiwany jest w krótkim czasie i jest niezależny od warunków środowiska wzrostu i rozwoju rośliny.

PL 233 478 Β1

Sposób identyfikacji markera SRAP-SCAR_23-14

Materiał:

DNA izolowane z liści owsa przy wykorzystaniu komercyjnie dostępnych zestawów.

DNA	10 - 50 ng
10 x Taq bufor (200 mM Tris-HCl, 200 mM KC1)	lx
dNTP	0,2 mM
MgCh	1-2 mM
Polimeraza Tag	0,5-1,0 U
Starter Me23.F2	0,1 -0,5 μΜ
Starter Eml4.R2	0,1 -0,5 μΜ
HaO	W zależności od objętości końcowej mieszaniny PCR

Sekwencje starterów:

Me23.F2 5’ GTCCAAACCGGGATATC 3’

Eml4.R2 5’ GCGTACGAATTCTTTAC 3’

Startery projektowano przy użyciu programu Primer 3.0.

Warunki amplifikacji DNA

Reakcję PCR przeprowadzono w termocyklerach: Biometra T1 (Biometra) lub Biometra Proffesional (Biometra).

Profil termiczny reakcji PCR: 95°C - 3 min, 37 cykli (94°C - 30 s, 55°C - 30 s, 72°C - 1 min), 72°C-7 min.

Identyfikacja markera SRAP-SCAR_23-14:

Elektroforeza na 1,5% żelu agarozowym zawierającym 0,5 gg/ml bromku etydyny w buforze TBE (pH 8,0) przy napięciu 100 V przez 2 godziny. Jako wzorzec długości fragmentów DNA użyto GeneRuler™ 100 bpDNA Ladder (Fermentas). Wizualizacji markera dokonano wykorzystując system DigiGeminus (Syngene).

Wyniki:

Testowanie markera SRAP-SCAR_23-14 na osobnikach populacji STH9210 x ‘Celer’ wykazało wysoką zgodność segregacji markera z odpornością na rdzę koronową owsa (Wzór 1). Na 141 testowanych roślin ilość niedopasować wyniosła 9, czyli 6,42% niewłaściwie zakwalifikowanych genotypów na podstawie detekcji markera SRAP-SCAR_23-14. Na elektroforegramie przedstawiono amplifikowane fragmenty DNA po włączeniu do analizy pary starterów Me23.F2 i Em14.R2, świadczące o obecności w badanych genotypach allelu dominującego genu Pc39.

PL 233 478 Β1

LISTA SEKWENCJI

Sekwencja nr 1

5’ GTCCAAACCGGGATATC 3’

Sekwencja nr 2

5’ GCGTACGAATTCTTTAC 3’

Sekwencja nr 3

5’TTATGTCCAAACCGGGATATCTCAAAACATTTCSGTMCATSCCGGGG

TAAAAAAGGACAAAATGTCTGCCGAATCGGTAGGAAGTGGGTCCGGTTTG

TACTACAGGTACATGATCTAACGCCCGTGATTTTTTGAAAAAAAACATTTTT

AGACTCACAATATGTGGTTTCTTCAGAGATCCAATGCAAGTTCTAATGATG

CTCGTCCCCTATCTTCATGCACGCCGGTTCGACCTTAGTTCGAAAAGGGAA

AAATTCAAAGCAGGCATAAGATATTCAAAAAAGTTCGAACAATGTAAATC

CTTCGTGTGGTGTCATATTATGTGACATAGTTGCAAGGAAAAATGCCAGAC

TTGGTATATTGATCATCTCTCGAAAAAACCTTCACAAAATGACCTGTCATGT

TCGAGGTTTCATGGCTTTCGGTCAAATGACCAATGTTATGTGCTGAATCGC

GGCATAGTTTATGATATTGTGCCCATATTATGCATGTATGTGGAAATTGGGAT

GGAGCACAATGTTGCAGGAGGAAGTTTTCCTTTTCGTTACACGGAAAAGC

CATTTTCCATTTTCCGAGCGCAAAAAACGGGTCGTTTTGTAAAGCAACCA

CCAAAATGCTGTTTCAGAATGCTACCGTCCCATTTTTCTAAAATACTAGACC

ACCTTACATGGACTATCGTCCAAACCGGGATATCTCAAACTTTTCCGTCCAT

CCCAGGTAAAAAGGATAAATTTCTACCGAATCAGTAGGAAGTAGGGTTTGT

ACTACAGATACGATGATCTAACGCCCGTGATTTTTTGAAAAAATCATTTTTA

GACTCGCAATATGTGGATTCTTTAGAGATCCAATGCAAGTTCTAAATAAGA

AATAAGCCCATTTAGTCCCGGTTGGTAAAGAATTCGTACGCAGTCATAA3’

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Para oligonukleotydowych starterów do wykrywania allelu dominującego genu odporności na rdzę koronową Pc39 w roślinach owsa zwyczajnego o sekwencjach nr 1 i 2 przedstawionych na liście sekwencji.
2. 2. Sposób identyfikacji allelu dominującego genu odporności na rdzę koronową Pc39 w roślinach owsa zwyczajnego, w którym to sposobie polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, znamienny tym, że parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach nr 1 i 2 przedstawionych na liście sekwencji, przy czym stosuje się marker SRAP-SCAR_23-14, przedstawiony na Fig. 1.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w wyniku PCR amplifikowany jest fragment DNA o długości 915 par zasad o sekwencji nr 3 przedstawionej na liście sekwencji.