BRPI0821216B1

BRPI0821216B1 - método de identificação e seleção de plantas de soja portadoras de resistência e/ou tolerância à ferrugem asiática da soja (fas - phakopsora pachyrhizi)

Info

Publication number: BRPI0821216B1
Application number: BRPI0821216A
Authority: BR
Inventors: Garcia Alexandre; Harada Arlindo; Afonso De Souza Kiihl Romeu; Sanches Calvo Éberson
Original assignee: Tmg Tropical Melhoramento E Genetica Ltda
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-16
Publication date: 2019-01-02
Also published as: AR069366A1; BRPI0704999A2; AP2010005324A0; CO6280553A2; BR122018070711B1; US8759607B2; WO2009079729A8; WO2009079729A3; US20140235459A1; BRPI0821216A2; AP3062A; US8962914B2; WO2009079729A4; US20110191893A1; US20140255932A1; WO2009079729A2

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO E SELEÇÃO DE PLANTAS DE SOJA PORTADORAS DE RESISTÊNCIA E/OU TOLERÂNCIA À FERRUGEM ASIÁTICA DA SOJA (FAS - PHAKOPSORA PACHYRHIZI). Campo da Invenção

A presente invenção está diretamente relacionada a métodos de seleção para resistência ou tolerância à ferrugem, com destaque para ferrugem asiática da soja (FAS - Phakopsora pachyrhizi).

Além disso, a presente invenção refere-se ao uso de marcadores moleculares para o gênero Glycine, em especial para Glycine max. A presente invenção também trata de um método para identificar loci com características quantitativas e/ou qualitativas associadas com resistência ou tolerância à ferrugem em planta por meio de marcadores moleculares.

Os ditos marcadores podem ser utilizados para seleção assistida em programas de melhoramento que visem selecionar plantas resistentes ou tolerantes a doenças.

A presente invenção também se refere ao processo de piramidação de genes relacionados à resistência à ferrugem.

Ainda, os marcadores da presente invenção são úteis para clonagem posicionai de genes resistentes ou tolerantes à ferrugem.

Também são descritos um método de obtenção de cultivares resistentes ou tolerantes a doenças, um processo de obtenção de uma população de planta e um método de controle de doenças em uma população de planta.

Outro objeto da presente invenção é o uso de espécies do gênero Glycine, quais sejam PI 459025, PI 230970, PI 200456, PI 224270, PI 200526, PI 200487, PI 471904, como fonte de resistência para a obtenção de cultivares resistentes ou tolerantes a FAS.

Petição 870180138332, de 05/10/2018, pág. 7/13

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Antecedentes da Invenção

Soja (gênero Glycine) pertencente à família Fabaceae (leguminosa), assim como o feijão (Phaseolus), a lentilha e a ervilha (Pissum), é um grão rico em proteínas, cultivado como alimento tanto para seres humanos 5 quanto para animais. A palavra soja vem do japonês shoyu e é originária da China. A família Fabaceae é uma das maiores famílias botânicas, também conhecida como Leguminosae (leguminosas), de ampla distribuição geográfica. São aproximadamente 18.000 espécies em mais de 650 gêneros. Uma característica típica dessa família é apresentar o fruto do tipo legume, tam10 bém conhecido como vagem (há exceções). É subdividida em 3 subfamílias muito distintas: Faboideae (ou Papilionoideae), Caesalpinioideae (ou Caesalpiniaceae) e Mimosoideae (ou Mimosaceae). A variação no nome se deve à coexistência atual de mais de um sistema de classificação. Dados de literatura revelam que quase todas as espécies dessa família apresentam sim15 biose de suas raízes com bactérias do gênero Rhizobium e semelhantes, responsáveis pela fixação de nitrogênio da atmosfera, uma característica ecológica relevante e significativa. Além disso, são de grande importância econômica pela produção de alimentos.

A soja é considerada uma cultura importante e muito valorizada 20 pela agricultura mundial. Neste sentido, um dos principais objetivos dos meIhoristas de soja é desenvolver variedades mais estáveis, produtivas e resistentes a doenças, como por exemplo a ferrugem. Uma das principais razões dessa preocupação é maximizar a produção de grãos tanto para consumo humano como animal. Para atingir esses objetivos, o melhorista deve sele25 cionar e desenvolver cultivares que apresentem características superiores as do mercado.

Borém (1998) define melhoramento como a arte e a ciência que visam à modificação gênica das plantas para torná-las mais úteis ao homem. O melhorista Manoel Abílio de Queiroz (2001) (Queiroz, M.A., 2001 30 Melhoramento Genético no Brasil - realizações e perspectivas. In: Recurso Genéticos e Melhoramento de Plantas, cap.1. pg. 1-28.) faz alguns comentários a esse respeito num sentido mais amplo, contemplando todo o

3/45 processo de desenvolvimento da agricultura nos últimos dez mil anos, e sua contribuição na mudança de hábito das populações humanas que abandonaram o nomadismo e acataram o sedentarismo. Este fato ocorreu no momento em que os povos decidiram abandonar o extrativismo para iniciar o plantio 5 dos tipos de plantas mais adequados a sua sobrevivência. Essa prática durou um período longo e gerou alteração nas frequências gênicas das espécies escolhidas, além de proporcionar contribuições significativas na agricultura mundial. Sabe-se que a domesticação de novas espécies é relativamente recente, muito limitada e que a maioria das espécies que alimenta a hu10 manidade foi domesticada em tempos remotos, com destaque para os grãos.

O mesmo autor relata que com o advento do melhoramento genético, após a descoberta das Leis de Mendel, a ciência passou a desempenhar um papel preponderante no desenvolvimento de culturas de importân15 cia para o homem. Neste aspecto, textos foram publicados nas mais diversificadas áreas do conhecimento, além dos diferentes ramos da genética, inclusive os marcadores genéticos de DNA, relevantes para o monitoramento do melhoramento genético de plantas, com o objetivo de torná-lo mais eficiente na busca de melhoria dos caracteres que atendem as necessidades da 20 sociedade.

O melhoramento de plantas visa à obtenção de cultivares superiores às disponíveis no mercado, seja na produção de grãos, de massa verde ou fibras, na resistência às pragas e moléstias, seja, ainda, na maior riqueza em proteínas, óleo, qualidade da fibra ou outras características de 25 interesse (Conagin, A.; Ambrosano, G. Μ. B.; Nagai, V. Poder discriminativo da posição de classificação dos testes estatísticos na seleção de genótipos. Bragantia, v. 56, no. 2, p. 403-417, 1997.).

Dentre as principais contribuições do melhoramento para o complexo soja no Brasil, pode-se destacar o desenvolvimento de variedades 30 com adaptação a latitudes mais baixas e resistência às principais doenças (Arias, C. A. A. et al. Melhoramento e Biotecnologia: ferrugem da soja. In: IV Congresso Brasileiro da Soja. Realizado entre 05 e 08 de junho de 2006.

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Londrina (Anais)). Os mesmos autores também relatam que estudos envolvendo resistência genética proporcionam resultados positivos no sentido de auxiliarem na resolução de problemas de doenças. Dentre desse contexto podemos citar a mancha olho de rã (Cercospora sojina), o cancro da haste (Diaporthe phaseolorum f.sp. mirídionallis), o oídio (Microphaera diffusa) e o nematoide de cisto (Heterodera glycines). Além disso, Brogin (2005), (Brogin, R. L. Mapeamento de genes de resistência à ferrugem e de QTL's envolvidos na resistência à Septoriose. 2005. Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, ESALQ/USP, Piracicaba, SP.) acrescenta estudos de resistência à pústula bacteriana, ao crestamento bacteriano, podridão parda da haste, vírus da necrose da haste e vírus do mosaico comum da soja.

No caso da soja têm-se conhecimento que o melhoramento tem sido realizado através da introdução de materiais, seleção e hibridação (cruzamentos artificiais), resultando em nova linhagem pura que reúne alelos favoráveis presentes em dois ou mais genótipos. O material resultante desses processos pode ser utilizado pelos produtores rurais como uma nova cultivar.

Sabe-se que o sucesso de uma nova cultivar depende da escolha do germoplasma, de um bom planejamento do bloco de cruzamentos a ser utilizado pelo melhorista visando os objetivos programados, além da seleção dos parentais. Sabe-se também que é necessário conhecer o tipo de herança do caráter com o objetivo de racionalizar o processo de desenvolvimento de cultivares (Arias, C. A. A. et al. Melhoramento e Biotecnologia: ferrugem da soja. In: IV Congresso Brasileiro da Soja. Realizado entre 05 e 08 de junho de 2006. Londrina (Anais)). A capacidade de predizer a herança que certas características irão apresentar é de fundamental importância para a agricultura. Características controladas por um único gene apresentam resultados esperados pelos princípios de Mendel. Entretanto, características controladas por mais de um loco pode diferir do esperado. Métodos estatísticos e projetos experimentais são criados na tentativa de predizer a herança de numerosas características quantitativas relacionadas com as característi5/45 cas fenotípicas.

Na condução de gerações segregantes utiliza-se vários métodos dos quais pode-se destacar o Método da População (Bulk Method), o SSD (Single Seed Descent) e o retrocruzamento. No método da população, a 5 condução das gerações segregantes, geralmente de F2 e F5, é feita com a semeadura e colheita de todas as plantas misturadas em uma única população. Portanto, no método da população, as sementes utilizadas para cultivo de cada geração segregante são uma amostra das sementes colhidas na geração anterior. Após cinco gerações de autofecundação as plantas apre10 sentam elevado grau de homozigose e podem ser selecionadas para colheita individual (Souza, A. P. Biologia Molecular Aplicada ao Melhoramento. In: Recursos Genéticos e Melhoramento - Plantas. Luciano L. Nass; Afonso C. C. Valois; Itamar S. de Melo; Maria Clélia Valadares-lnglis. (Org.) 1^a. Ed. Rondonópolis, 2001, v. 1, p 939-966.

O método SSD em soja foi descrito por Brin (1966) (Brin, C.A.;

1966. A modified pedigree method of selection in soybeans. Crop Science, v.6, p.20) e consiste no avanço de gerações segregantes (de F2 até F5) coIhendo-se uma única vagem (2 a 3 sementes) de cada planta, porém apenas uma planta de cada vagem é utilizada para conduzir a próxima geração. É 20 colhida uma amostra para reserva. Dessa forma, no final do processo cada linhagem corresponde a uma planta F2 diferente e, portanto, têm-se uma redução na perda provocada pela amostragem deficiente ou ação da seleção natural.

O retrocruzamento não é propriamente um método para condu25 ção de populações segregantes. É uma estratégia utilizada para melhorar a expressão fenotípica de uma característica deficiente, especialmente se essa característica for de herança qualitativa. O uso permite a transferência de um gene ou de poucos genes de um parental denominado doador (PD) para outro parental denominado recorrente (PR), sendo que o parental recorrente 30 geralmente é uma cultivar de interesse comercial e que apresenta algum grau de deficiência no seu cultivo que necessita ser corrigida. Essa deficiência pode ser corrigida pelo processo de transferência do gene do parental

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doador, que não apresenta a deficiência, para o parental recorrente. Esse procedimento, ou seja, cruzamentos dos indivíduos da população segregante com o parental recorrente é retrocruzamentos são suficientes para recuperação de quase 100% do genótipo do parental recorrente (Souza, A. P.

Biologia Molecular Aplicada ao Melhoramento. In: Recursos Genéticos e Melhoramento - Plantas. Luciano L. Nass; Afonso C. C. Valois; Itamar S. de Melo; Maria Clélia Valadares-lnglis. (Org.) 1^a. Ed. Rondonópolis, 2001, v. 1, p 939-966).

No final do processo seletivo, o melhorista identifica uma ou al10 gumas linhas puras com características superiores que darão origem a uma nova cultivar.

É importante destacar que quando se trata do melhoramento visando resistência a doenças e pragas, a piramidação de genes é aconselhável. A piramidação diz respeito à associação de vários genes de resistên15 cia presentes em uma mesma cultivar visando a obtenção de uma resistência duradoura e de amplo espectro (Kelly, J. D.; Gepts, P.; Miklas, P. N.; Coyne, D. P. Tagging and mapping of genes and QTL and molecular markerassisted selection for traits of economic importance in bean and cowpea. Field Crops Research, v. 82, p. 135-154, 2003).

Entretanto, na prática a piramidação de genes de resistência ou mesmo tolerância à ferrugem (FAS) torna-se difícil porque o melhorista não tem como distinguir visualmente as plantas com um ou mais genes de resistência ou tolerância, visto que fenotipicamente elas apresentam o mesmo tipo de reação, ou seja lesões tipo RB.

Neste cenário, a biotecnologia surgiu como uma ferramenta para facilitar e acelerar as pesquisas nas mais diversas áreas com destaque para genética e melhoramento. A utilização de marcadores moleculares é uma estratégia efetiva e rápida na identificação e transferência de novos genes (Tanskley S.D. (1983). Molecular markers in plant breeding. Plant Molecular 30 Biology Rep. 1: 3-8; Tanskley, S.D., McCouch S.R. (1997) Seed banks and molecular maps: unlocking genetic potential from the wild. Science v. 277: 1063-1066.). Os marcadores moleculares podem ser utilizados em progra7/45 mas de melhoramento que visem selecionar características qualitativas e quantitativas.

Sabe-se que os marcadores moleculares surgiram como uma grande contribuição do desenvolvimento das técnicas moleculares que per5 mitem a análise do genoma. São muitas as aplicações dos marcadores moleculares em plantas, sendo principalmente utilizadas no mapeamento de genes e QTLs (Quantitative Trait Loci) de interesse. Song et al (2004) (Song, Q.J., Marek, L.F., Shoemaker, R.C., Lark, K.G., Concibido, V.C., Delannay, X., Specht, J.E., Cregan, P.B. (2004). A new integrated genetic lin10 kage map of the soybean. Theorical and Applied Genetics, v. 109, p.122128), construíram um mapa denso de ligação para a soja e têm-se conhecimento que a associação de genes a marcadores moleculares em soja está sendo amplamente utilizada.

Como exemplos de marcadores moleculares, pode-se citar a 15 eletroforese de isoenzimas, Restricton Fragment Length Polymorphisms (RFLPs), Randon Amplified Polymorphic DNAs (RAPDs), Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction (AP-PCR), DNA Amplification Fringerprinting (DAF), Sequence Characterized Amplified Regions (SCARs), Amplified Fragment Length Polymorfisms (AFLPs), Simple Sequence Re20 peats (SSRs) e Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). Dentre os marcadores moleculares citados acima, os SSRs são de interesse para o mapeamento genético, pois cada marca corresponde a uma posição única no genoma, mas possui inúmeros alelos, gerando alto grau de polimorfismo (Cregan P.B., Jarvik, T., Bush, A.L., Shoemaker, R.C., Lark, K.G., Kahler, A.L., 25 Kaya, N., VanToai, T.T., Lohnes D.G., Chung, J., Specht, J.E. (1999). An

Integrated genetic linkage map of the soybean genome. Crop Science, v. 39: 1464-1490). Além disso, são de fácil utilização, produzem resultados consistentes e são acessíveis a quase todos os laboratórios de biotecnologia.

A construção de um mapa genético exige definir os tipos de 30 marcadores que serão mapeados e o tipo de delineamento genético a ser utilizado para se detectar o desequilíbrio de ligação entre eles. Os diversos tipos de delineamentos genéticos que podem ser utilizados para construir o

8/45 mapa genético de espécies vegetais têm em comum a produção de gerações em desequilíbrio de ligação para os loci segregantes, permitido a realização da análise de ligação. Diversos fatores são responsáveis pelo desequilíbrio de ligação, dentre eles a seleção e a deriva genética. Entretanto, em 5 gerações segregantes derivadas de cruzamentos entre linhagens (por ex.

geração F2 e de retrocruzamento), a causa principal desse fato está relacionada à ligação física dos loci, tendo sido a base genética da análise de ligação clássica construída. O desequilíbrio de ligação devido à ligação física dos loci é elevado nas populações derivadas de cruzamentos controlados, e 10 como consequência, o poder de se detectar a ligação entre dois loci fisicamente ligados também é alto. Dentro desse contexto, a escolha adequada dos materiais parentais é de fundamental importância na etapa inicial do processo (Coelho, A.S.G. e Silva, H.D. Construção de Mapas Genéticos & Mapeamento de QTL's Piracicaba, SP- fevereiro de 2002. 66p).

Após essas etapas, é feita análise de ligação com o objetivo de gerar mapa genético envolvendo a avaliação do padrão de segregação das marcas individuais, a detecção de desequilíbrio de ligação entre pares de marcas, a mensuração da distância entre as marcas e o ordenamento das marcas em grupos lineares de ligação. A classe fenotípica pela qual o gene 20 é responsável passa a ser encarada também como uma marca, porém morfológica e não molecular (Coelho, A.S.G e Silva, H.D. 2002 - citado acima).

Segundo os mesmo autores acima, a detecção da ligação entre os loci é realizada com base no teste de aderência de X², que se baseia na comparação das frequências observadas das diversas classes genotípicas 25 com aquelas esperadas sob a condição de segregação independente entre os loci. Este teste permite obter a estimativa da probabilidade de ocorrência de desvios observados dada a condição de independência. O nível de 5% de probabilidade é o ponto crítico para a rejeição da hipótese de independência. Nas condições onde a probabilidade de ocorrência dos desvios encontrados, 30 dada a condição de independência, era menor que 5%, rejeitou-se a hipótese e assume-se que os loci não estão segregando independentemente, ou seja, estão ligados.

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No caso da presente invenção, como já existe um mapa de ligação consenso da soja, identificaram-se as marcas ligadas ao gene através da estratégia de BSA (Bulk Segregant Analisys). O método de BSA, proposto por Michelmore et al. (1991), (Michemore, R.W., Paran, I., Kessell, R.V.

(1991). Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segreganting populations. Proceeding of the National Academy of Sciences of the Unitated State of América, v. 88, p.9828) é uma estratégia rápida e eficiente para identificar ligação entre marcadores molecula10 res e características qualitativas. Por essa técnica, os indivíduos de uma população F2 segregando para 2 alelos de um único gene são reunidos em 2 grupos (bulks) de genótipos homozigotos contrastantes. Já que a divisão dos bulks é feita levando em conta apenas a característica de interesse, todos os outros genes são agrupados ao acaso. Assim, o background ge15 nético se iguala entre os 2 grupos e eles se diferem apenas na região selecionada. Com isso, um marcador polimórfico entre os parentais contrastantes que mantiver o mesmo polimorfismo entre os 2 bulks, tem uma grande possibilidade de estar associado ao gene de interesse. Os autores ressaltam que as marcas precisam estar mais próximas que 15 cM do locus de interes20 se para serem efetivas, pois com essa distância, mesmo com a ocorrência de recombinação, a marca e o gene tendem a ficar juntos. Contudo, a distância limite para detecção da ligação parece ser de 25 cM.

Para a construção dos bulks, o número mínimo de indivíduos utilizados é determinado pela frequência com que se espera encontrar poli25 morfismo de marcas não ligadas ao gene de interesse entre os bulks, e isso reflete o tipo de marcador usado (dominante ou codominante). Para um marcador dominante, por exemplo, a probabilidade de um bulk de n indivíduos ter uma banda e um segundo bulk com o mesmo número de indivíduos não ter essa banda é de 2(1- [1/4^)(1/4)° quando a marca não está ligada ao 30 gene alvo. Ou seja, para 2 bulks contrastantes de 10 indivíduos, a probabilidade de uma marca não ligada ao gene alvo ser polimórfica entre 2 bulks é de 2x10'⁶ Sendo assim, com poucos indivíduos em cada bulk e mesmo

10/45 quando muitas marcas estão sendo utilizadas, a chance de detectar marcas não ligadas é pequena (Michemore, R.W., Paran, I., Kessell, R.V. (1991).

Mapmaker (Lander E.S.; Green, P.; Abrahamson, J.; Barlow, A.; Daly, M.J.; Lincoln, S.E.; Newburg, L. (1987). Mapmaker: an interactive com5 puter package for constructing genetic linkage maps of experimental and natural populations. Genomics, v.1, p. 174-181) é um software interativo para a construção de mapas genéticos de ligação. O programa usa um algoritmo eficiente para realizar análises de ligação de multipontos (o que é uma estimação simultânea de todas as frações de recombinação entre os dados) entre diversos loci, podendo trabalhar com marcadores moleculares dominantes, recessivos ou codominantes. Os dados utilizados podem ser provenientes de retrocruzamentos, populações F2 ou F3 resultantes de intercruzamentos e linhas congênitas recombinantes. As distâncias entre os loci são calculadas usando a máxima verossimilhança (Likelihood).

A construção de mapas de ligação é dificultada pela ocorrência de erros de genotipagem. Baixas taxas de erro já causam uma expansão do mapa e interferem na determinação da ordem genética correta. Por isso, a versão atual MapMaker/EXP 3.0 (Lincoln, S.E., Lander, S.L. (1993). Mapmaker/exp 3.0 and Mapmaker/QTL 1.1 Whitehead Inst. Of Med Res. Tech

Report. Cambridge, MA.) incorporou um algoritmo para a detecção de potenciais erros de genotipagem (Lincoln, S.E.; Lander, S.L. (1992) Systematic detection of errors in genetic linkage data. Genomics, v.14, p.604-610). O método detecta a grande maioria de erros e usando essa função é possível construir mapas precisos.

No processo de seleção para resistência a doenças, especialmente quando os patossistemas são difíceis de serem trabalhados, quer devido às dificuldades de manutenção, isolamento e inoculação do patógeno, quer no processo de avaliação da doença, o uso de marcadores moleculares é altamente desejado. É o caso da ferrugem asiática da soja. Sabe-se que os marcadores moleculares detectam a informação genética sem interferência do meio ambiente. Um outro ponto a ser considerado é a detecção de variações na sequência de nucleotídeos e até mesmo de regiões não trans-

11/45 critas. Agindo assim, pode-se eliminar, bem como aliviar a necessidade de se recorrer a processos fitopatológicos trabalhosos, identificando-se indivíduos de uma população segregante portadores do marcador ligado ao alelo favorável de interesse, resultando em economia de tempo e recursos.

Dentro desse contexto, a presente invenção vem contribuir de maneira significativa em programas de melhoramento que objetivem utilizar seleção assistida por marcadores moleculares, utilizando marcas moleculares ligadas a genes com resistência a doenças com destaque para a ferrugem asiática da soja. Essas marcas vêm contribuir para posicionar genes 10 relacionados com a resistência a doenças no mapa de ligação da soja, por exemplo.

A ferrugem asiática da soja (FAS), causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi, é considerada a doença foliar mais destrutiva da soja (Miles, M.R.; Frederick, R.D.; Hartman, G. (2003) Soybean rust: Is the U.S. soybean 15 crop at risk? Online. APSnet Feature, American Phytopathological Society).

A doença se espalha através dos uredósporos e tem o potencial de causar danos severos às lavouras de soja.

Descoberta no Japão em 1902 se disseminou chegando à Ásia e Austrália em 1934, (Kochman, J.K. (1977). Soybean rust in Austrália. Pp. 4420 48 in: Rust of Soybean - The problem and research needs. R.E. Ford and

J.B. Sinclair, eds. International Agricultural Publications, Manila, The Philippines), índia em 1951 (Sharma, N.D.; Mehta, S.K. (1996). Soybean rust in Madhya Pradesh. Acta Botânica Indica, v. 24: 115-116), Hawaii em 1994 (Killgore, E.; Heu, R. (1994). First report of soybean rust in Hawaii. Plant Di25 sease, v. 78: 1216), e África em 1996 (Akinsanmi, O.A.; Ladipo, J.L.; Oyekan, P.O. (2001). First report of soybean rust (Phakopsora pachyrhizi) in Nigéria. Plant Disease, v.85, p.97). Na América do Sul a doença foi reportada pela primeira vez em 2001 no Paraguai (Morei, W.; Yorinori, J.T. (2002). Situacion de Ia roja de Ia soja em el Paraguay. Boi de Divulgacion No. 44. 30 Ministério da Agricultura y Granaderia, Centro Regional de Investigacion Agrícola, Capitan Miranda, Paraguay) e nos anos seguintes chegou ao Brasil, Argentina, Bolívia e Colômbia (Rossi, R.L. (2003). First report of Phakospora

12/45 pachrhizi, the casual organism of soybean rust in the Provence of Misiones, Argentina. Plant Disease, v. 87: 102; Yorinori, J.T.; Lazzarotto, J.J. (2004). Situação da ferrugem asiática da soja no Brasil e na América do Sul. In: Documentos / Embrapa Soja, no. 236, Londrina). Nesses países, as perdas de produtividade devido à ferrugem asiática da soja foram drásticas, variando de 10% a 80% em algumas lavouras (Yorinori JT (2004) Ferrugem asiática da soja no Brasil: evolução, importância econômica e controle. In: Junior JN, Lazzarotto JJ (eds) Documentos 247. Embrapa, Londrina, Brazil, 36p. Nos Estados Unidos, os primeiros sintomas da doença foram reportados em novembro de 2004 (Schneider, R.W.; Hollier, C.A.; Hitam, H.K. (2005). First report of soybean rust caused by Phakopsora pachyrhizi in the continental United States. Plant Disease, v. 89: 774) sendo que para 2005 era estimada perda de até 50% da produtividade (Dorrance, A.E.; Draper, M.A.; Hershman, D.E., eds. Using Foliar Fungicides to Manage Soybean Rust. NC-504 Land Grant Universities Cooperating. Bulletin SR-2005). Entretanto, devido às condições ambientais desfavoráveis ao patógeno, a doença não atingiu os níveis esperados (Sconyers, L.E.; Kemerait, R.C.; Brock, J.; Phillips, D.V.; Jost, P.H.; Sikora, E.J.; Gutierrez-Estrada, A.; Muller, J.D.; Marois, J.J.; Wright, D.L.; Harmon, C.L. (2006). Asian soybean rust development in 2005: A perspective from the Southeastern United State Online. APSnet Feature, American Phytopathological Society).

O desenvolvimento do fungo é favorecido por temperaturas entre 15° e 29°C e alta umidade. Em condições favoráveis, os sintomas podem ser detectados 5 a 8 dias após a infecção da planta pelos uredósporos (Marchett, M.A.; Melching, J.S.; Bromfield, K.R. (1976). The effects of temperatura and dew period on germination and infection by uresdospores of Phakopsora pachyrhizi. Phytopathology, v. 66: 461-463; Melching, J.S.; Dowler, W.M.; Koogle, D.L.; Royer, M.H. (1989). Effects of duration, frequency, and temperatura of leaf wetness periods on soybean rust. Plant Disease, v. 73: 117-122). Na soja cultivada, os primeiros sintomas são lesões poligonais de 2 a 5mm de coloração castanho claro, na face adaxial da folha. No período compreendido entre 10 e 14 dias, surgem na parte abaxial lesões em forma

13/45 de vulcão conhecidas como pústulas, onde são produzidos os uredósporos (Marchett, M.A.; Uecker, F.A.; Bromfield, K.R. (1975). Uredial development of Phakopsora pachyrhizi in soybeans. Phytopathology, v. 65: 822-823.; Melching, J.S.; Dowler, W.M.; Koogle, D.L.; Royer, M.H. (1989). Effects of duration, frequency and temperature of leaf wetness periods on soybean rust. Plant Disease, v. 73: 117-122). The effects of temperature and dew period on germination and infection by uresdospores of Phakopsora pachyrhizi. Phytopathology, v. 66: 461-463; Melching, J.S.; Dowler, W.M.; Koogle, D.L.; Royer, M.H. (1989). Effects of duration, frequency, and temperature of leaf wetness 10 periods on soybean rust. Plant Disease, v. 73: 117-122). Com o aumento da infecção, ocorrem lesões severas e a desfolhação prematura das plantas.

Apesar de as aplicações de fungicidas amenizarem as perdas, o uso de cultivares resistentes ou tolerantes é a melhor alternativa para controlar a doença, no sentido de diminuir os custos, facilitar o manejo, além de 15 auxiliar na preservação ambiental. Sabe-se que a resistência ao fungo ocorre naturalmente em genótipos do gênero Glycine (Burdon, J.J.; Marshall,

D.R. (1981). Evaluation of Australian native species of Glycine canescens, a wild relative of soybean. Theoretical Applied Genetics, v. 65: 44-45; Burdon, J.J. (1988). Major gene resistance to Phakopsora pachirhizi in Glycine ca20 nescens, a wild relative of soybean. Theoretical Applied Genetis, v. 75: 923928), e é tipicamente conferida pela reação de hipersensibilidade. Este é um tipo comum de resposta imune desencadeada pela presença de genes de resistência (R-gene) da planta quando desafiados por genes de avirulência do patógeneno (Avr-genes) (McDowelI, J.M.; Simon, S.A. (2006). Recent 25 insight sinto R gene evolution. Molecular Plant Pathology, v. 7: 437-448).

Neste sentido, genótipos resistentes apresentam lesão de coloração castanho-avermelhada (reddish brown - RB) com nenhuma ou pouca esporulação, enquanto os genótipos suscetíveis se destacam por apresentar lesões de coloração castanho-clara (TAN) e abundante esporulação.

Durante o processo de desenvolvimento de uma cultivar de soja resistente ou tolerante a FAS é necessário que as plantas sejam avaliadas, a cada geração, quanto ao seu grau de resistência ou tolerância ao patógeno,

14/45 identificando-se assim as plantas resistentes ou tolerantes a cada ciclo, até que a cultivar superior seja selecionada. Na prática, o processo de infecção ocorre naturalmente quando há esporos do fungo no ar ou artificialmente através da pulverização sobre as folhas com uma solução de esporos coletados de plantas previamente infectadas. A ocorrência natural é cíclica e muito dependente de condições climáticas. Além disso, nem sempre o meIhorista tem esporos disponíveis para proceder inoculações artificiais. Os motivos vão desde dificuldades técnicas para manutenção de plantas infectadas a proibições legais. Esta dificuldade é ainda mais pronunciada quando se tenta desenvolver cultivares resistentes em países onde a doença ainda não ocorreu e a praga ainda é quarentenária.

A soja cultivada (Glycine max) apresenta quatro genes qualitativos dominantes de resistência: Rppl identificado na PI 200492 ((McLean, R.J.; Byth, D.E. (1980). Inheritance of resistence to rust (Phakopsora pachyrhizi) in soybean. Australian Journal Agricultural Research, v. 31: 951956); Rpp2 na PI 230970 (Bromfield, K.R.; Hartwig, E.E. (1980). Resistence to soybean rust and mode of inheritance. Crop Science, v. 20, n.2, p.254255); Rpp3 na PI 462312 (Bromfield, K.R.; Melching, J.S. (1982). Sources of specific resistance to soybean rust. (Abstr.) Phytopatology, v. 72, p.706), e Rpp4 na PI 459025 (Hartwig, E.E. (1986). Identification of a fourth major gene conferring to resistance to soybean rust..Crop Science, v. 26, p.11351136). A resistência apresentada por cada gene é limitada a raças específicas do patógeno (Bonde, M.R.; Nester, S.E.; Austin, C.N.; Stone, C.L.; Frederick, R.D.; Hartman, G.L.; Miles, M.R. (2006). Evaluation of virulence of Phakopsora pachyrhizi and P. meibomiae isolates. Plant Disease, v. 90, p. 708-716.) sendo que essa resistência pode ser superada em um curto espaço de tempo devido à coevolução da resistência do hospedeiro e da virulência do patógeno (McDonald, B.A.; Celeste, L. (2002). Pathogen population genetics, evolutionary potential, and durable resistance. Annua. Ver. Phytopathology, v. 40, p.349-379). Associado a isso, ocorre o fato de que o fungo possui raças diferentes com distribuição geográfica variável. Desta forma, é impossível, por exemplo, poder assegurar que uma cultivar resistente ou

15/45 tolerante a FAS selecionada com esporos produzidos a campo nos EUA seja resistente ou tolerante quando cultivada em condições de campo no Brasil.

Em 2002, os 4 genes de resistência à FAS foram previamente relatados no Brasil como efetivos, além da resistência conferida pela a cultivar FT-2 ((Árias, C.A.A.; Brogin, R.L.; Yorinori, J.T.; Kiihl, R.A. de S.; Toledo, J.F.F. (2003). Um gene dominante determinando a resistência do cultivar FT-2 à ferrugem da soja (Phakopsora pachyrhizi Sydow). In: CongressoBrasileiro de Melhoramento de Plantas, 2.; Porto Seguro, 2003. Anais. Porto Seguro: Sociedade Brasileira de Melhoramento de Plantas - SBMP -.

(Compact disc)). Entretanto, na safra seguinte foi quebrada a resistência do

RppM Rpp3 e FT-2, simultaneamente ((Yorinori, J.T. (2004). Ferrugem asiática da soja no Brasil: evolução, importância econômica e controle. Yorinori,J.T. et al (eds) - Londrina: Embrapa Soja, 2004, 36p. (Documentos, 27)). Assim, esforços em controlar a FAS com o uso de cultivares resistentes por15 tando genes únicos ainda não resultaram em sucesso. Portanto, a identificação e utilização de novas fontes de resistência à doença são objetivos dos programas de melhoramento genético executados pelos geneticistas e meIhoristas de soja, além de representar uma necessidade para aqueles que estão envolvidos com a oleaginosa.

Frente ao exposto, fica clara a importância da presente invenção como uma metodologia de grande aplicabilidade para auxiliar no controle da FAS, facilitando e acelerando o desenvolvimento de cultivares resistentes ou tolerantes à doença. A presente invenção soluciona o problema da diversidade de raças e distribuição geográfica do patógeno porque permite que a 25 seleção seja feita na ausência do patógeno, através da análise de marcas polimórficas de DNA ligadas a alelos de resistência ou tolerância à ferrugem.

A presente invenção apresenta identificação de cinco novas fontes de resistência à FAS, através de análises genéticas. Trata-se de dois casos com resistência dominante (PI 200487 e PI 200526), em duas das 30 fontes a resistência é recessiva (PI 200456 e PI 224270) e em outra a resistência possui dominância incompleta (PI 471904). Trata-se do primeiro caso de resistência à FAS condicionada por um gene/alelo recessivo.

16/45

Além disso, a presente invenção também utiliza marcadores moleculares de SSR do mapa de ligação da soja para fazer o mapeamento genético dos genes dessas novas fontes, além do mapeamento dos genes presentes nas fontes originais de Rpp2 (PI 230970) e Rpp4 (PI 459025).

A presente invenção torna a associação de genes de resistência ou tolerância possível, pois identifica não só novos loci e alelos associados a esses loci, mas também seguimentos de DNA ligados a esses loci que podem ser facilmente rastreados durante o processo de melhoramento genético, independentemente do método de melhoramento empregado pelo meIhorista (SSD, Bulk, Retrocruzamento, etc), usando-se técnicas rotineiras de análise de DNA.

No contexto da presente invenção, a associação de genes de resistência ou tolerância a doenças com os marcadores moleculares tornará possível a clonagem posicionai (Kilian, A.; Chen, J.; Han, F.; Steffenson, B.; Kleinhofs, A. (1997). Towards map-based cloning of the barley stem rust resistance genes Rpg1 and Rpg4 using rice as na intergenomic cloning vehicle. Plant Molecular Biology, v. 35, p. 187-195; Yahiaoui, N.; Srichumpa, P.; Dudler, R.; Keller, B. (2004). Genome analysis at different ploidy leveis allows cloning of the powdery mildew resistance gene Pm3b from hexaploid wheat. Plant Journal, v. 37, p. 528-538) e com a clonagem a estrutura, organização e funcionamento dos genes pode ser melhor compreendida (Yan,

P.; Chen, X.M. (2006). Molecular mapping of a recessive gene for resistance to stripe rust in barley. Theoretic Applied Genetics, v. 113, p. 529-537). Além disso, essa associação permite a seleção assistida por marcadores identificando indiretamente indivíduos em populações segregantes (Kelly, J.D.; Gepts, P.; Miklas, P.N.; Coyne, D.P. (2003). Tagging and mapping of genes and QTL and molecular marker-assisted selection for traits of economic importance in bean and cowpea. Field Crops Research, v. 82, p. 135-154) portadores do alelo favorável sob seleção, resultando em economia de tempo e recursos.

Os métodos da presente invenção mostram-se ainda de extrema importância em retrocruzamentos, acelerando a recuperação de genótipos

17/45 recorrentes. Também permite compreender a evolução dos genomas e as diferentes relações entre os diferentes genes.

Além disso, com os dados da presente invenção o processo de piramidação de genes será facilitado. A piramidação de genes é um processo trabalhoso com dificuldades na identificação da presença de múltiplos genes, visto que a seleção é feita fenotipicamente, via análise de sintomas. Utilizando marcadores moleculares ligados aos genes a serem piramidados, será possível o monitoramento dos genes introduzidos ao longo do processo (Alzate-Marin, A.L.; Cervigni, G.D.L.; Moreira, M.A. (2005). Marker assisted selection in the development of disease resistant plants, with emphasis on common bean and soybean. Fitopatologia Brasileira, v. 30, n.4, p. 333-342). Definições

As definições abaixo serão colocadas com o objetivo de esclarecer certos termos utilizados no escopo da invenção, facilitando a compreensão do leitor.

Alelos: Uma ou mais formas alternativas de gene.

Cromossomo: é uma unidade discreta do genoma portadora de muitos genes. Cada cromossomo consiste em uma molécula muito longa de DNA de fita dupla e uma massa aproximadamente igual de proteínas. Ele é visível como uma entidade morfológica somente durante a divisão celular.

Cruzamento Artificial: Um cruzamento para introduzir um novo material genético no interior da planta com o objetivo de desenvolver uma nova variedade.

Cruzamento-Teste: envolve o cruzamento de um genótipo desconhecido com um homozigoto recessivo, de forma que os fenótipos da progênie correspondem diretamente aos cromossomos carregados pelo progenitor de genótipo desconhecido.

Distância de Mapa Genético: é medida em cM (centimorgans) = recombinação percentual (algumas vezes sujeita a reajustes).

Divergência: é a diferença percentual da sequência nucleotídica entre duas sequências de DNA relacionadas ou da sequência de aminoácidos entre duas proteínas.

18/45

Gene: (cístron) é o segmento de DNA envolvido na produção de uma molécula de RNA que pode ser traduzida a uma cadeia polipeptídica; ele inclui as regiões que precedem e seguem-se (líder e trailer) à região codificadora, bem como as sequências intervenientes (íntrons) entre os segmentos codificadores individuais (éxons).

Genótipo: é a constituição genética de célula ou organismo.

Geração F1: é a primeira geração produzida pelo cruzamento de duas linhagens parentais (homozigotas).

Grupo de Ligação: inclui todos os loci que podem ser conectados (direta ou indiretamente) por relações de ligação; pode ser equivalente a um cromossomo.

Heteroziqoto: é um indivíduo com diferentes alelos em alguns loci determinados.

Homoziqoto: é um indivíduo com o mesmo alelo nos loci correspondentes dos cromossomos homólogos.

Ligação: descreve a tendência apresentada por alguns genes de serem herdados conjuntamente. Ela é resultado da localização dos genes no mesmo cromossomo e é medida pela porcentagem de recombinação entre os loci.

Locus: é a posição em um cromossomo onde reside o gene de uma determinada característica; o locus pode ser ocupado por qualquer um dos alelos do gene.

Mapa genético: Mapa com as posições relativas dos loci genéticos que compõem o genoma de um organismo. O mapa é determinado com base na herança conjunta dos loci. As distâncias entre os loci são calculadas pela frequência de recombinação entre eles e é mensurada em cM.

Marcador, Marcador Molecular, Marcador Ácido Nucleico: se refere a uma sequência de nucleotídeos utilizada como ponto de referência que identifica um locus ligado geneticamente. Um marcador pode ser derivado de sequência nucleotídica genômica ou de sequências de nucleotídeos expressas (como por exemplo a partir de cDNA). No contexto dessa invenção o termo pode estar associado a algum marcador ou a outro locus gené-

19/45 tico (por exemplo, locus relacionado à resistência a doenças), onde o par de marcador ou o marcador e o segundo locus estão geneticamente ligados no mesmo grupo de ligação, portanto, estão em desequilíbrio de ligação. Neste aspecto, o desequilíbrio de ligação é definido como sendo qualquer desvio das frequências esperadas sob independência, indicando a existência de uma associação entre loci. Deste modo, para que os marcadores moleculares possam contribuir nos estudos de herança e no melhoramento, é necessário que a população esteja em desequilíbrio de ligação, pois caso contrário, a probabilidade de ocorrência de determinada classe de marcador seria independente da segregação dos alelos de um dado gene ou QTL de interesse, por exemplo.

Melhoramento: ciência que visa à modificação gênica de organismos vivos.

Patóqeno: organismo que causa doença, agente infeccioso.

Planta Introduzida - PI: genótipo de planta incorporado a qualquer região diferente do seu centro de origem primário.

Piramidação de genes: refere-se ao acúmulo de dois ou mais genes que conferem o fenótipo de interesse em genótipos elites, quer seja por métodos clássicos de melhoramento, quer seja por transformação.

Polimorfismo: refere-se à ocorrência simultânea na população de genomas que apresentam variações alélicas (como alelos que produzem diferentes fenótipos ou - por exemplo - diferença no tamanho das sequências de determinados microssatélites).

Repetição em Tandem: são cópias múltiplas da mesma sequência dispostas em série.

Resistente a Doenças: habilidade de natureza genética para prevenir a infecção por um patógeno. Algumas formas de resistência excluem o patógeno ou previnem sua disseminação pela liberação de toxinas por parte do hospedeiro, e outras toleram a toxina do patógeno; habilidade para resistir a um fator abiótico ou biótico.

Retrocruzamento: cruzamento de um indivíduo com um de seus genitores. A descendência deste cruzamento é dita geração ou progênie de

20/45 retrocruzamento.

Seleção: descreve o uso de determinadas condições para permitir a sobrevivência exclusiva de células com um determinado fenótipo.

Suscetível: incapaz de resistir ou tolerar um dano causado por estresse biótico ou abiótico.

Tolerante: organismo (planta) que possui habilidade em conviver com um patógeno.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1. A mostra o mapa de ligação da soja para o grupo G e B ilustra o mapa da população F2 resultante da PI459025 X Coodetec 208.

Figura 2. A mostra o mapa de ligação de soja para o grupo J e B ilustra o mapa da população F2 resultante do cruzamento entre PI 224270 X Coodetec 208.

Figura 3. A representa o mapa de ligação da soja para o grupo N; B mostra o mapa de ligação da população F2 resultante do cruzamento entre PI 200456 X Coodetec 208; C ilustra o mapa resultante do cruzamento entre PI 471904 (Orba) X Coodetec 208 que resultou em uma população F2; D representa o mapa a partir de F2 resultante do cruzamento entre PI 200526 X Coodetec 208.

Figura 4. Seleção em F2 de indivíduos portadores de 2 genes de resistência à FAS. P1 representa PI 200456, fonte de RppN e P2 representa PI 459025, fonte de Rpp4. Sat_275 está geneticamente ligado a RppN; portanto, é necessário identificar indivíduos que apresentem o mesmo padrão de bandas de P1. Satt288 está ligado ao gene de resistência identificado na fonte original de Rpp4, então são identificados indivíduos com o padrão de amplificação de P2. No caso, apenas o indivíduo 7 será selecionado como portador dos 2 genes de resistência.

Figura 5. Severidade de doença - mostra a progressão da doença em cultivares suscetíveis a FAS (CD 202, CD 215, BRS 232, BRS 133) em comparação às linhagens resistentes (CB06-953, CB06-954, CB06-955, CB06-956, CB06-957, CB06-958, CB06-959, CB06-960, CB06-961, CB06962, CB06-963, CB06-964, entre outras). Claramente as linhagens resisten21/45 tes apresentaram, na ausência de fungicidas, uma redução média de aproximadamente 60 % na severidade da doença quando comparada com as linhagens suscetíveis a FAS.

Figura 6. Produção de grãos (Kg/Ha) em linhagens de soja resistentes à ferrugem asiática. Doze linhagens irmãs derivadas do cruzamento PI 635026 X TMGLM-3219 foram avaliadas em condições de campo sob alta infestação de ferrugem. O gráfico representa a produtividade (Kg/Há) em duas condições distintas (com e sem fungicida) para cada uma das linhagens. As cultivares suscetíveis CD 202, CD 215, BRS 232 e BRS 1333 foram utilizadas como padrões de suscetibilidade.

Figura 7. Janela de aplicação de fungicida.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção trata de métodos de identificação e uso de marcadores genéticos com destaque para soja, e em particular, marcadores que estão ligados a loci para resistência ou tolerância à doenças, como por exemplo resistentes ou tolerantes à ferrugem asiática da soja, em diferentes espécies do gênero Glycine.

Uma concretização da presente invenção refere-se a um método de identificação e seleção de indivíduos portadores de uma característica fenotípica de interesse a partir de uma população biológica, em particular uma população de planta, que compreende:

(a) associar um marcador molecular à característica fenotípica de interesse;

(b) segregar indivíduos da população biológica pela presença ou ausência de pelo menos um marcador molecular associado à dita característica fenotípica, em que a dita característica fenotípica é conferida por um ou mais loci genéticos;

(c) indicar os marcadores que mostram o perfil dos indivíduos segregantes de (b); e (d) determinar os padrões dos marcadores de (c) dos loci genéticos associados com a característica fenotípica de interesse.

Preferencialmente, pode ser utilizada uma população de plantas

22/45 do gênero Glycine, em particular da espécie Glycine Max, compreendendo pelo menos 11 indivíduos.

A característica fenotípica de interesse pode ser produtividade e resistência e/ou tolerância a doenças, particularmente ferrugem asiática da soja, sendo conferida por um locus ou QTL.

O marcador molecular pode ser um fragmento de DNA, cDNA ou RNA exibindo pelo menos pequenas variações nas sequências de nucleotídeos entre os indivíduos da população biológica. De preferência, o marcador é selecionado a partir de RFLPs, RAPDs, AFLPs, SSRs, SNPs, ESTs e sondas de RGA, estando posicionado em uma região de um grupo de ligação. Preferencialmente, o marcador molecular é qualquer marcador mapeado a 10 cM ou menos do locus ou QTL da característica fenotípica de interesse.

O grupo de ligação representa todos os loci que podem ser conectados direta ou indiretamente por relações de ligação. Particularmente, o grupo de ligação é parte de um cromossomo ou um cromossomo completo. Ele pode ser selecionado do grupo que consiste em grupo de ligação G, grupo de ligação J e grupo de ligação N do mapa de ligação consenso da soja.

Em uma modalidade preferida, o grupo de ligação é o grupo de ligação G do mapa de ligação consenso da soja e o marcador molecular é um ou mais dentre Satt12, A816_1, A890 1, Sat_164, Satt503, Satt517, Sat_143, Mng273_2, Satt288, A121_2, A885_1, Satt612, K493_1, T005_2, bac1 F11 Rhnd e OP_M02a.

Em outra modalidade preferida, o grupo de ligação é o grupo de ligação J do mapa de ligação consenso da soja e o marcador molecular é um ou mais dentre Satt215, Sat_361, Sct_001, Sat_093, A109_9, Sat_366, Satt621, Satt620, Sat_350, RGA 3, RGA_2a, Satt244 e Satt431.

Em uma outra modalidade preferida, o grupo de ligação é o grupo de ligação N do mapa de ligação consenso da soja e o marcador molecular é um ou mais dentre A426_2, Sle_003, i4_2, Sat_084, Satt393, Satt584, Satt485, Sat_166, Sat_208, BLT049_1, Bng095_2, OP_F13, Satt125, Sat_275, Sle_3, RGA_6b, OP_U09b, mO128_1, Sat_280, Satt080 e

23/45

Sat_266.

De preferência, os marcadores moleculares são selecionados a partir de genótipos que apresentam fenótipos distintos, por exemplo, a partir dos genótipos de soja PI 459025, PI 230970, PI 200456, PI 224270, PI 200526, PI 200487 e PI 471904 ou genótipos que tenham genes de resistência à ferrugem asiática ou mesmo alelos dessas Pl's.

A identificação dos marcadores moleculares pode ser feita a partir de análise de ligação BSA seguida de mapeamento genético.

Uma outra concretização da presente invenção refere-se a um método de piramidação de genes associados com características fenotípicas de interesse em uma população de planta, em particular do gênero Glycine, preferencialmente da espécie Glycine max, compreendendo:

(a) associar um ou mais marcadores moleculares à característica fenotípica de interesse em uma ou mais plantas ou variedades de planta;

(b) identificar o(s) marcador(es) para cada gene a ser incorporado na etapa (c);

(c) incorporar os genes na população de planta por métodos de cruzamento entre as ditas plantas ou variedades de planta; e (d) monitorar a incorporação dos genes na população de planta através do(s) marcador(es).

Preferencialmente, a etapa (c) desse método consiste em incorporar o maior número possível de genes favoráveis para uma dada característica de interesse em um único genótipo.

A característica fenotípica de interesse pode ser produtividade e resistência e/ou tolerância a doenças, particularmente ferrugem asiática da soja.

O marcador molecular pode ser qualquer marcador mapeado a 10 cM ou menos do locus ou QTL da característica fenotípica de interesse. Pode estar posicionado em uma região de um grupo de ligação, tal como grupo de ligação G, grupo de ligação J e grupo de ligação N do mapa de ligação consenso da soja.

Em uma modalidade preferida, o grupo de ligação é o grupo de

24/45 ligação G do mapa de ligação consenso da soja e o marcador molecular é um ou mais dentre Satt12, A816_1, A890 1, Sat_164, Satt503, Satt517,

Sat_143, Mng273_2, Satt288, A121_2, A885_1, Satt612, K493_1, T005_2, bac1 F11 Rhnd e OP_M02a.

Em uma outra modalidade preferida, o grupo de ligação é o grupo de ligação N do mapa de ligação consenso da soja e o marcador molecular é um ou mais dentre A426_2, Sle_003, i4_2, Sat_084, Satt393, Satt584, Satt485, Sat_166, Sat_208, BLT049_1, Bng095_2, OP_F13, Satt125, Sat_275, Sle__3, RGA 6b, OP_U09b, mO128_1, Sat_280, Satt080 e Sat_266.

As plantas ou variedades de planta utilizadas podem ser selecionadas, por exemplo, a partir dos genótipos de soja PI 459025, PI 230970, PI 200456, PI 224270, PI 200526, PI 200487 e PI 471904, ou genótipos que tenham genes de resistência à ferrugem asiática ou mesmo alelos dessas Pl's. Preferencialmente, os genótipos de soja utilizados são PI 200456, PI 224270, PI 200526, PI 471904 ou alelos dessas Pl's. Particularmente, os alelos são selecionados dentre o locus rpp2 localizado no grupo de ligação J, e o locus RppN/rppN, localizado no grupo de ligação N, do mapa de ligação consenso da soja.

De preferência, são utilizados, como marcadores para o gene RppN/rppN nos genótipos PI 200456, PI 200487 e PI 200526, um ou mais dentre A426_2, Sle_003, i4_2, Sat_084, Satt393, Satt584, Satt485, Sat_166, Sat_208, BLT049_1, Bng095_2, OP_F13, Satt125, Sat_275, Sle_3, RGA_6b, OP_U09b, mO128_1, Sat_280, Satt080 e Sat_266. Preferencialmente, são utilizados, como marcadores para o gene rpp2 no genótipo PI 224270, um ou mais dentre Satt215, Sat_361, Sct_001, Sat_093, A109_9, Sat_366, Satt621, Satt620, Sat_350, RGA 3, RGA_2a, Satt244 e Satt431. Particularmente, são utilizados, como marcadores para o gene Rpp4 no ge

25/45 nótipo PI 459025, um ou mais dentre Satt12, A816_1, A890 1, Sat_164, Satt503, Satt517, Sat_143, Mng273_2, Satt288, A121_2, A885_1, Satt612, K493_1, T005_2, bac1F11Rhnd e OP_M02a.

Uma concretização adicional da presente invenção refere-se a um método para isolamento e identificação de genes associados com características fenotípicas de interesse em uma população de planta, em particular do gênero Glycine, preferencialmente da espécie Glycine max, através de clonagem posicionai, compreendendo:

(a) preparar de uma biblioteca genômica;

(b) selecionar fragmentos clonados a partir da dita biblioteca utilizando marcadores moleculares;

(c) utilizar os fragmentos clonados selecionados para criar um contig de insertos de DNA clonado; e (d) identificar o(s) gene(s) em um ou mais clones residentes no contig.

Em uma modalidade preferida, o grupo de ligação é o grupo de ligação G do mapa de ligação consenso da soja e o marcador molecular é um ou mais dentre Satt12, A816_1, A890_1, Sat_164, Satt503, Satt517, Sat_143, Mng273_2, Satt288, A121_2, A885_1, Satt612, K493_1, T005_2, bac1F11Rhnd e OP_M02a.

26/45

Em uma outra modalidade preferida, o grupo de ligação é o grupo de ligação N do mapa de ligação consenso da soja e o marcador molecular é um ou mais dentre A426 2, Sle_003, i4_2, Sat_084, Satt393, Satt584, Satt485, Sat_166, Sat_208, BLT049_1, Bng095_2, OP_F13, Satt125, Sat_275, Sle_3, RGA_6b, OP_U09b, mO128_1, Sat_280, Satt080 e Sat_266.

De preferência, o marcador molecular é utilizado para o gene RppN/rppN localizado no grupo de ligação N do mapa de ligação consenso da soja. Podem ser utilizados os contigs WmContig404, WmContig562, WmContig5258 ou WmContig6713 ou qualquer contig que contenha uma marca mais próxima que 5 cM do gene.

Outra concretização da presente invenção refere-se a um método de obtenção de cultivares, em particular uma cultivar do gênero Glycine, preferencialmente da espécie Glycine max, resistentes ou tolerantes a doenças, em particular a ferrugem asiática da soja, compreendendo:

(a) hibridação de uma fonte portadora de um ou mais genes e/ou alelos resistentes ou tolerantes a uma doença com uma linhagem ou cultivar suscetível à dita doença, mas agronomicamente adaptada à região para a qual se deseja obter a cultivar;

(b) avanço de geração utilizando pelo menos um método de melhoramento genético;

(c) utilização de pelo menos um dentre o método de identificação e seleção como definido anteriormente de acordo com a presente invenção, o método de piramidação de genes como definido anteriormente de acordo com a presente invenção e o método para isolamento e identificação de genes como definido anteriormente de acordo com a presente invenção para se obter a cultivar resistente ou tolerante à doença.

Preferencialmente, o método de melhoramento genético da etapa (b) é selecionado dentre Bulk, SSD, MSSD e Retrocruzamento.

Em uma modalidade preferida, a fonte portadora de um ou mais genes e/ou alelos resistentes ou tolerantes a uma doença utilizada na etapa (a) é PI 635026 e a linhagem suscetível à doença é TMGLM-3219.

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Em outra modalidade preferida, a cultivar obtida é selecionada dentre CB06-953, CB06-954, CB06-955, CB06-956, CB06-957, CB06-958, CB06-959, CB06-960, CB06-961, CB06-962, CB06-963 e CB06-964.

Uma outra concretização da presente invenção refere-se a um processo de obtenção de uma população de planta que apresenta uma característica fenotípica de interesse, compreendendo pelo menos um dentre o método de identificação e seleção como definido anteriormente de acordo com a presente invenção, o método de piramidação de genes como definido anteriormente de acordo com a presente invenção, o método para isolamen10 to e identificação de genes como definido anteriormente de acordo com a presente invenção e o método de obtenção de cultivares resistentes ou tolerantes a doenças como definido anteriormente de acordo com a presente invenção. A presente invenção também se refere à população de planta obtida por tal processo. Deve ser entendido aqui que população de planta 15 compreende sementes, grãos, mudas, cultivares, plantas adultas ou qualquer outro componente do Reino Plantae.

A presente invenção refere-se ainda ao uso dos genótipos de soja PI 459025, PI 230970, PI 200456, PI 224270, PI 200526, PI 200487 e PI 471904 como fonte de uma característica fenotípica de interesse no pro20 cesso de obtenção de uma população de planta que apresenta uma característica fenotípica de interesse de acordo com a presente invenção. A característica fenotípica de interesse pode ser produtividade e resistência e/ou tolerância a doenças, particularmente ferrugem asiática da soja.

Preferencialmente, são utilizados os genótipos de soja PI 25 200456, PI 224270, PI 200456, PI 200526 e PI 471904 ou Pl's que apresentem o gene de resistência ou tolerância nos mesmos loci destas.

Uma concretização adicional da presente invenção refere-se a um método de controle de doenças, em particular a ferrugem asiática da soja, em uma população de planta, em particular do gênero Glycine, preferen30 cialmente da espécie Glycine max, compreendendo o controle genético da doença utilizando pelo menos um dentre o método de identificação e seleção como definido anteriormente de acordo com a presente invenção, o método

28/45 de piramidação de genes como definido anteriormente de acordo com a presente invenção, o método para isolamento e identificação de genes como definido anteriormente de acordo com a presente invenção e o método de obtenção de cultivares resistentes ou tolerantes a doenças como definido anteriormente de acordo com a presente invenção.

Preferencialmente, o método compreende ainda o controle químico da doença através da aplicação de pelo menos um fungicida sobre a população de planta. Em particular, o fungicida é selecionado dentre triazóis, estrobirulinas, benzimidazóis, protioconazol e misturas dos mesmos.

Ainda, outra modalidade da presente invenção refere-se Exemplos

Os exemplos abaixo são meramente ilustrativos e não limitativos.

Exemplo 1

Melhoramento Genético - Melhoramento com Marcadores Moleculares Material - Planta

Os ensaios foram realizados em casa de vegetação com temperatura e umidade controladas. Foram escolhidos 48 genótipos resistentes à FAS. Testes de homozigose para resistência em diferentes genótipos foram realizados e selecionados 7 genótipos, entre eles Pis 200487, 200526 e 471904. A fonte do gene Rpp2 (PI 230970), do gene Rpp4 (PI 459025) e as Pis 200456 e PI 224270, portadoras de genes de resistência recessivo, também foram utilizadas na presente invenção. Populações utilizadas no trabalho foram obtidas a partir de cruzamento de cada uma das fontes de resistência com a cultivar suscetível Coodetec 208, utilizada como parental feminino, mas não limitada a essa cultivar.

Autofecundação das plantas F1. Cerca de 200 plantas F2 resultantes de cada cruzamento foram avaliadas quanto a resistência à FAS. Teste de progênie F2 3 foi conduzido com o objetivo de confirmar o fenótipo e determinar o genótipo das plantas F2. A fórmula n=log(1-P)/log(1-p) exigiu 11 plantas para cada progênie proporcionando uma confiança de P 0,95 de que o evento de menor probabilidade (p 0,25) ocorresse ao menos uma vez.

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Problemas de germinação exigiram que fossem plantadas 20 sementes e somente as progênies com 11 ou mais plantas foram avaliadas. Com isso, cerca de 180 plantas F2 de cada população foram caracterizadas. Dados obtidos foram utilizados para estudo do controle genético da doença e for5 mulação de hipóteses. Teste de Qui-quadrado foi utilizado para verificar se as proporções observadas não diferiam significativamente do esperado. Para as análises moleculares somente as plantas F2 caracterizadas foram utilizadas.

Teste de Resistência - Phakopsora pachyrhizi

Dados fenotípicos das populações F2 e F₂ 3 foram obtidos inoculando-se os indivíduos em estádio vegetativo V3/V4, com diferentes raças do fungo Phakopsora pachyrhizi. Os uredósporos foram coletados da cultivar suscetível FMT-Bacuri, mantido em casa de vegetação, lavando-se a superfície abaxial das folhas infectadas e suspendendo o material em água desti15 lada contendo tween 20 (0,1 mL/L). Solução resultante foi ajustada a concentração 50 X 10³ uredósporos/mL e pulverizada manualmente sobre as plantas. Esse procedimento foi realizado ao anoitecer. As plantas inoculadas foram mantidas sob temperatura de 25° C/20° C ± 3^o C dia/noite e iluminação natural. Aproximadamente 14 dias após a inoculação, quando os sinto20 mas da doença estavam evidentes, as plantas foram avaliadas quanto ao tipo de lesão apresentada (RB ou TAN). Uma vez realizadas as avaliações, o controle da doença foi efetuado aplicando-se o fungicida IMPACT®. Extração do DNA

Tecido foliar, sem a presença de lesões, foi coletado dos paren25 tais e de todas as plantas F2. O tecido foi congelado em nitrogênio liquido, liofilizado e triturado em um fino pó, que foi armazenado em câmara fria até serem conduzidas as extrações de DNA. A extração do DNA se baseou no protocolo proposto por Shagai-Maroof et al (1984) (Shagai-Maroof, M.A.; Soliman, K.M.; Jorgensen, R.A.; Allard, R.W. (1984). Ribosomal DNA spac30 er-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal locations, and populations dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of América, v. 81, p.8014-8018), com algumas

30/45 modificações.

Análises das marcas

As análises com as marcas de SSR foram conduzidas em 3 estágios. Foi realizado previamente um screening para encontrar polimorfismo entre os parentais utilizando 190 pares de primers de SSR escolhidos a partir do mapa de ligação da soja publicado por Song et al (2004) (Song,

Q.J.; Marek, L.F.; Schoemaker, R.C.; Lark, K.G.; Concibido, V.C.; Delannay, X.; Specht, J.E.; Cregan, P.B. (2004). A new integrated genetic linkage map of the soybean. Theoretical and Applied Genetics, v. 109, p. 122-128). As marcas escolhidas estão distribuídas uniformemente entre os 20 grupos de ligação da soja, cobrindo todo o genoma. A sequência de cada primer foi obtida no site http://www.soybase.org.

As evidências de ligação entre as marcas de SSR e a resistência foram verificadas através da análise de bulks segregantes (BSA) proposta por Michelmore et al. (1991) (Milchelmore, R.W.; Paran, I.; Kessell, R.V. (1991). Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of América, v. 88, p.9828-98-32). Dois bulks foram preparados para cada uma das 7 populações F2, combinandose amostras iguais de DNA de 10 indivíduos resistentes e 10 suscetíveis. Screening dos bulks foram realizados utilizando-se dos primers polimórficos entre os parentais de cada população. Evidenciado nos bulks o mesmo padrão de polimorfismo observado entre os parentais, a marca foi considerada ligada e assim a região do gene de cada população foi delimitada. Novas marcas de SSR existentes na região de cada gene foram testadas para o polimorfismo e usadas para o screening de todos os indivíduos das populações F2 correspondentes, que foram caracterizados pelo teste de progênie F2:3As PCR utilizadas para amplificação dos loci de microssatélites (SSR) tanto para análise de polimorfismo entre parentais quanto para o BSA, quanto para o screening dos indivíduos foram realizadas em termociclador

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PTC -200 (MJ Research), com um volume final de reação de 20 pL, contendo 30 ng de DNA template, 0,25uM de cada primer, 0,15uM de cada dNTP,

1,5 U de TAQ DNA polimerase, 2,5mM de MgCI₂ e 1 x PCR buffer. O programa de amplificação utilizado foi o seguinte: 1 ciclo de 95° C por 3 min 5 seguidos de 35 ciclos de 94° C por 30s, 55-60° C (dependendo de TM de cada primer) por 30s e 72° C por 45s e um ciclo final de 72° C por 10 min. Os produtos de PCR foram separados em gel de agarose MetaPhor® (Lonza Bioscience Switzerland) 3% ou 4% dependendo do tamanho do fragmento de SSR descrito no mapa, e corados com brometo de etídio. A aquisição de 10 imagem foi feita através de scanner Typhoon® (Molecular Dynamics Califórnia, USA).

Análise de Ligação

Testes de Qui-quadrado foram realizados para determinar se as segregações genotípicas das marcas de SSR (microssatélites) usadas no 15 mapeamento não diferiam significativamente do esperado. A construção do mapa de ligação foi realizada com o auxílio do Programa MAPMAKER/EXP 3.0 (Lincoln, S.E.; Lander, S.L. (1993). Mapmaker/exp 3.0 and Mapmaker/QTL 1.1 Whitehead Inst. Of Méd. Res. Tech Report. Cambridge, MA.) com as distâncias e ordem das marcas calculadas usando LOD score de 3.0 e a 20 função de Kosambi com uma distância máxima de 50cM. Os mapas obtidos foram comparados com o mapa de ligação consenso da soja.

Resultados

Os resultados da avaliação da presente invenção com relação aos genótipos que apresentam resistência são observados na tabela 01. Es25 sa avaliação se baseia no tipo de lesão apresentada (RB - resistentes e

TAN - suscetíveis). Os dados apresentados pela PI 459025, fonte original de Rpp4, confirmam a presença de um gene dominante embora não seja possível afirmar se realmente trata-se de Rpp4. O mesmo comportamento é apresentado pelas PI 200526 e PI 200487.

A segregação observada na PI 471904 indica a presença de gene dominante, contudo, esse dado foi obtido após genotipagem das plantas F2 pelo teste de progênie. A avaliação prévia do material em F2 revelou uma

32/45 segregação de 113R para 93S, que se ajusta a proporção de 1:1 (χ² = 2,142 P = 0,25 - 0,10). Esse fato ocorreu pela presença, neste material, de um gene com dominância incompleta. A dominância incompleta levou a um erro na avaliação fenotípica de F2 fazendo com que hora os heterozigotos fossem considerados resistentes hora como suscetíveis.

A PI 200456 apresenta gene recessivo resistente à FAS. O mesmo fato foi observado pela presente invenção na PI 224270, que também apresenta um gene recessivo para resistência. Essa é a primeira vez que foi reportado um gene recessivo conferindo o fenótipo de resistência à ferrugem asiática da soja (FAS). A PI 230970, citada na literatura como fonte do gene dominante Rpp2, apresenta resultados de segregação distorcidos e os dados não se adequaram à segregação de 3:1 e nem a de 9:7 (χ² =4,272 P < 0,05).

Com relação aos dados de mapeamento genético, após a genotipagem dos indivíduos com os primers da região em que o gene foi identificado, construiu-se um mapa de ligação das populações. O gene de resistência identificado na fonte original de Rpp4 (PI 459025) foi mapeado no grupo de ligação G, a 2,8 cM do primer Satt228 (Figura 1). Na região abaixo desse gene, o primer mais próximo foi o Satt191 à 31,3cM. Nessa região existem outros primers que podem estar mais próximos, contudo não foi possível utilizá-los no mapeamento pois nenhum se apresentou polimórfico para o cruzamento.

O gene recessivo da PI 224270 foi mapeado no grupo de ligação J, em uma região rica em SSRs e outros genes de resistência, entre os primers Satt215 (4,3 cM) e Sat_361 (4,7 cM) como mostra a Figura 3. Por ser uma região rica com marcas de SSRs muito próximas, a utilização de um maior número de marcas poderia resolver melhor as distâncias, mas apenas as marcas listadas na Figura 3 foram possíveis de uso para o cruzamento.

No grupo de ligação N, o gene recessivo da PI 200456, o gene com dominância incompleta da PI 471904 (Orba) e o gene dominante da PI 200526 (Shira Nuhi) foram mapeados na mesma posição, embora as distâncias entre os primers adjacentes fossem diferentes (Figura 3). O gene da PI

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200456 está a 1,6 cM do primer Sat_275 e a 7,2 cM do primer Sat_280, enquanto que em Orba essas distâncias em relação ao gene são de 0,6 cM e

3,6 cM e de 4,3 cM e 6,5 cM para o gene de Shira Nuhi. Mesmo com esses dados, ainda não é possível afirmar tratar-se de alelos do mesmo locus ou loci diferentes. Também ainda não é possível testar se os genes do grupo N estão no locus Z?pp1 ou Rpp3. Portanto, os genes desses materiais ficarão temporariamente sem nomenclatura e na presente invenção serão chamados de RppN para a PI 200487, PI 200526 e PI 472904 e RppN para a PI 200456.

Tabela 1

Tabela 1. Pais resistentes à Ferrugem cruzados com o parental CD 208 suscetível para permitir a segregação dos genes de resistência. Plantas obtidas são derivadas de famílias F2 caracterizadas pelo teste de progênie

F2-3. Testes Qui-quadrados foram utilizados para determinar se os resultados 15 obtidos estavam dentro dos resultados esperados._________________________

Teste F₂	Teste F_2:3
Parental resistente	N° de Plantas	Razão esperada	X2	R	N° de Plantas	Razão esperada	X2
R	S	Total	H	S	Total
PI 200526	156	47	203	3:1	0,369	48	85	44	177	1: 2: 1	0,458
(Shira					NS						NS
Nuhi)
PI 200487	150	49	199	3:1	0,015	45	69	36	150	1: 2: 1	2,040
(Kinoshita)					NS						NS
PI 459025	158	43	201	3:1	1,395	53	88	34	175	1: 2: 1	4,131
(Bing nan)					NS						NS
PI 471904	103	91	194	1:1	0,742	39	101	34	174	1: 2: 1	4,793
(Orba)					NS						NS
PI 230970	123	64	187	3:1	8,487*	19	108	73	200	1: 2: 1	30,44*
PI 200456	53	148	201	1:3	0,201	41	80	52	173	1: 2: 1	2,376
					NS						NS
PI 224270	43	152	195	1:3	0,904	34	87	53	174	1: 2: 1	4,149
					NS						NS

* Indicador estatístico do nível de significância do valor de Qui-quadrado (p=0,05).

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Tabela 2

Tabela 2. Para cada cruzamento, o alelo correspondente, o número de locus de SSR testados, a porcentagem de parentais polimórficos, o número de 5 SSR utilizado para a construção do mapa e o número de indivíduos genotipados no mapeamento.

Parental Resitente X Coodetec 208	Rpp alelo	N° de SSRs testados	% de Polimórfico SSRs	N° de SSRs usado no mapeamento	N° de indivíduos usados no mapeamento
PI 224270	rpp2f?;	177	38	10	174
PI 230970	Rpp2f?;	175	36	-	-
PI 459025	/?pp4(?;	169	41	10	175
(Bing nam)
PI 200456	RppN	182	40	12	173
PI 200526	RppN	192	43	14	177
(Shira Nuhi)
PI 200467	RppN	190	42	-	-
(Kinoshita)
PI 471904	RppN	177	40	13	174
(Orba)

Exemplo 2

Processo de Piramidação de Genes

A resistência à FAS apresenta-se raça específica e, portanto, genótipos carregando apenas um gene de resistência podem ter sua efetividade superada em um curto período de tempo. Para a obtenção de uma resistência duradoura e de amplo espectro, é extremamente interessante a união do maior número possível de genes de resistência em um único material. Tal processo de união é conhecido como piramidação e é facilitado com o auxílio de marcadores moleculares distintos, geneticamente ligados aos diversos genes de resistência. A utilização dos marcadores moleculares permite o monitoramento indireto da introdução de diferentes genes, processo trabalhoso e pouco preciso quando realizado apenas pela avaliação fenotípica da resistência.

Para tal, é necessário selecionar genitores contrastantes para

35/45 genes de resistência às doenças de interesse, além de identificação das raças do patógeno de maior importância para a região à qual se destinam as novas cultivares, fazendo da piramidação de genes um processo útil em programas de melhoramento genético. Com esses objetivos, estudos de he5 rança da resistência às raças selecionadas a partir de cruzamentos entre fontes de resistência e a cultivar suscetível de interesse são realizados. Identificação de marcadores moleculares ligados aos diferentes genes de resistência; obtenção de isolinhas contendo os genes de resistência e as marcas moleculares correspondentes, normalmente por retrocruzamentos;

validação dos marcadores moleculares capazes de discriminar especificamente cada um dos genes de resistência, objetivando evitar problemas com os falsos positivos; além da obtenção das isolinhas que são intercruzadas com a finalidade de fazer a piramidação dos alelos de resistência.

Os genes /?ppN, bem como genes de identificados nas fontes originais de Rpp2 e RppA, que conferem resistência à FAS, foram posicionados no mapa de ligação consenso e, assim, é possível selecionar um conjunto de marcadores geneticamente ligados a cada gene. Na presente invenção, as fontes de /?ppN (PI 200456), o gene recessivo da PI224270 (provável rpp2), o gene dominante identificado na fonte original de Rpp4 (PI459025) e a cultivar suscetível Coodetec 205 foram utilizadas na piramidação dos 3 genes de resistência à FAS.

Marcadores moleculares de SSR nas proximidades dos genes de resistência, com distância igual ou inferior a 6 cM do gene, foram escolhidos a partir do mapa de ligação consenso da soja. Foram selecionados 11 25 marcadores do grupo de ligação N para o gene F?ppN, 18 marcadores do grupo J (provável rpp2) e para o gene presente na fonte de Rpp4 foram selecionados 7 marcadores do grupo de ligação G. A sequência de primers de cada marcador foi obtida no site www.soybase.org.

DNA genômico foi extraído de folhas jovens e sadias dos 4 ge30 nótipos, de acordo com o protocolo de Shagai-Maroof com modificações. Os locus de SSR foram amplificados pela PCR. Os fragmentos amplificados foram separados em gel de agarose MetaPhor 3% e verificados quanto ao

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polimorfismo entre os 4 genótipos. Os 2 marcadores mais próximos flanqueando cada gene que apresentaram bandas polimórficas entre todos os genótipos, foram selecionados para análises posteriores. Utilizando dois marcadores flanqueando os genes de resistência, espera-se que eficiência de se5 leção aproxime-se de 100%.

Para RppN foram selecionados os marcadores Sat_275 e Sat_280. Os marcadores Sat_255 e Satt215 foram selecionados para o gene recessivo da PI 224270 e Sat288 e Satt612 foram utilizados para o gene presente na fonte Rpp4. Os fragmentos amplificados pelos primers Sat_275 10 e Sat_280 na PI 200456 correspondem ao gene de resistência RppN. Os fragmentos amplificados pelos primers Sat_255 e Satt215 na PI 224270 identificam gene de resistência (provável rpp2) e os fragmentos amplificados pelos primers Sat288 e Satt612 na PI 459025 selecionam o gene de resistência identificado na fonte original de Rpp4.

Em posse de tais dados, foram realizados os cruzamentos artificiais entre os genótipos. A PI 200456 (RppN) foi hibridizada com a PI 224270 (provável rpp2). Foram obtidas 15 plantas F1 e essas plantas foram utilizadas para hibridização com a PI 459025 (fonte original de Rpp4). Desse cruzamento foram obtidas 100 plantas F1.

DNA de cotilédone de cada um dos 100 genótipos F1 foi extraído de acordo com o método de Dallaporta (1983) (Dellaporta, S.L.; Wood, J.; Hicks, J.B. 1983. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Molecular Biology. Report vol.1: 19-21) modificado e os genótipos foram analisados com os marcadores de RppN, e dos prováveis rpp2 e Rpp4. Os genótipos heterozigotos para tais marcadores foram selecionados e autofecundados. Os demais materiais foram descartados.

Na população F2 resultante dessa autofecundação, os genótipos estavam segregando para os 3 genes. Foram obtidos 300 genótipos F2, que foram identificados individualmente, e foi extraído DNA de cotilédone de a30 cordo com o método de Dallaporta (1983) modificado.

Foi realizado um screening dos 300 indivíduos com os 3 marcadores de SSR selecionados para cada gene de resistência a FAS. Na aná37/45 lise com os marcadores Sat_275 e Sat_280, foram identificados os genótipos que apresentavam o mesmo padrão de fragmento amplificado observado na PI 200456. Para os marcadores Sat_255 e Satt215, foram identificados os genótipos que apresentaram o mesmo padrão de amplificação da PI 224270. O padrão de amplificação dos marcadores e Sat288 e Satt612 observado na PI 459025 foi utilizado como parâmetro para identificar os indivíduos quando realizado *o screening para essas marcas.

Após tais análises, os dados dos 3 pares de marcadores foram sobrepostos e aqueles genótipos listados nos 3 casos foram selecionados, pois possuíam ambos os 3 genes de resistência. Todos os demais genótipos foram descartados.

Os genótipos selecionados foram então submetidos ao cruzamento com a cultivar Coodetec 205. Foram realizados 6 ciclos sucessivos de retrocruzamento e autofecundação. A cada ciclo foi realizada a análise com os marcadores moleculares e somente os genótipos que possuíam os 3 genes eram selecionados e levados adiante.

Dando sequência ao referido programa de melhoramento, alguns procedimentos devem tornar-se rotineiros, como a caracterização contínua da variabilidade genética dos patógenos e do hospedeiro, a introdução e caracterização de novas fontes de resistência e a identificação de marcadores moleculares ligados a alelos de resistência.

Exemplo 3

Clonagem Posicionai

Marcadores ligados em cada um dos QTLs para resistência ou tolerância à ferrugem asiática da soja podem ser usados na clonagem posicionai de genes. O primeiro passo desse processo consiste na criação de um mapa físico de um contig (contiguous overlapping of cloned DNA inseris), na região genômica compreendendo um ou mais marcadores do locus e do gene de interesse. O gene de interesse é então identificado e isolado em um ou mais clones presentes no contig. Dessa forma, é obtido o clone de um gene para ser utilizado em estudos de genética, transformação e desenvolvimento de novos fenótipos.

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Marcadores mapeados para resistência, especialmente aqueles que estão genética e fisicamente ligados aos QTL ou genes de interesse são usados na identificação de clones a partir de bibliotecas genômicas, incluindo, por exemplo, bibliotecas genômicas de soja feitas em cromossomos artificiais de bactérias (BAC), cromossomos artificiais de fungos (YAC) ou de bacteriófagos. Estes vetores são os preferidos para a clonagem posicionai por serem capazes de carregarem fragmento longo de DNA.

Ainda, a clonagem posicionai é tida como um método eficiente para isolar um gene quando seu mecanismo de ação e produto(s) ainda são desconhecidos. O método da clonagem exige alguns requisitos iniciais, sendo o primeiro deles, a presença de indivíduos de uma população com bases genéticas diferentes condicionando a característica de interesse. O segundo deles é a necessidade de ter genes responsáveis pela diferença no fenótipo que sejam passíveis de mapeamento para serem posicionados em locais do genoma.

O mapeamento genético de genes de resistência à FAS é o primeiro passo em direção à clonagem posicionai, em especial do gene RppN, localizado no grupo de ligação N. O mapeamento de RppN é relevante, pois nesse locus foram detectados alelos de resistência tanto recessivo quanto dominante. Pelo fato dos alelos terem comportamentos diferentes, mas conferirem o mesmo fenótipo, a clonagem do gene e estudo dos seus produtos contribui para a compreensão do mecanismo de ação dos genes de resistência.

Marek and Schoemaker (1997) (Marek FL, Schoemaker RC (1997) BAC contig development by fingerprint analysis in soybean. Genome 40: 420-427), construíram para a soja uma biblioteca genômica de BACs (bacterial artificial chromosome) com tamanho médio de insertos de 150k, apropriada para ser utilizada no mapeamento físico e clonagem posicionai. O mapa físico da soja, disponível no site www.soybase.org, apesar de ainda estar passando por uma checagem, apresenta inúmeros contigs construídos. Além disso, o mapa físico foi alinhado ao mapa genético, ancorando os contigs de BACs com marcadores moleculares. Somando as informações

39/45 do mapa físico com os dados do mapeamento genético do gene RppN, a clonagem de genes conferindo resistência à FAS torna-se uma realidade.

O gene RppN foi geneticamente mapeado no grupo de ligação N, flanqueado pelos marcadores de SSR Sat_275 e Sat_280. O contig WmContig404 do mapa físico da soja abrange essa região do grupo de ligação N e é formado pelo alinhamento de 219 clones. Pelo fato de esse contig ser muito extenso, é preciso realizar um screening nos 219 clones através da PCR com os primers de Sat_275 e Sat_280. O objetivo dessa análise é encontrar os clones que possuem tais marcadores e assim criar um contig menor, eliminando os clones que não estiverem no intervalo entre as duas marcas. Como exemplos não limitativos, podem ser citados também os contigs WmContig562, WmContig5258, WmContig6713 ou qualquer contig que contenha uma marca mais próxima que 5 cM do gene.

No passo seguinte, os fragmentos formadores do novo contig são sequenciados por shotgun visando encontrar novas marcas de SSR na região do gene de resistência. O sequenciamento também permite realizar a construção de primers para que sejam desenvolvidos marcadores SCAR ou para que, após uma reação de PCR, o produto amplificado possa ser eluído do gel e digerido com um cocktail de enzimas de restrição e assim gerar marcadores moleculares do tipo CAPs.

Os novos marcadores obtidos são utilizados no mapeamento genético de alta resolução, com população de aproximadamente 1.500 indivíduos (3.000 eventos meióticos), utilizando a estratégia de pooled-sample mapping proposta por Churchill et.al (1993) (Churchill GA, Giovannoni JJ, Tanksley SD (1993) Pooled- sampling makes high-resolution mapping practical with DNA markers. Proc. Natl. Acad. Sei. 90: 16-20). Analisando-se 3.000 eventos meióticos, existe 95% de probabilidade de se identificar uma recombinação em menos de 0,1 cM. Considerando o tamanho dos insertos da biblioteca de BACs, se um marcador for mapeado a 0,1 cM ou menos do gene, existem grandes chances de ambos estarem localizados no mesmo clone.

O marcador mais próximo ao gene é então utilizado para isolar

40/45 um único clone de BAC dentre aqueles previamente selecionados como exemplificado por Tanksley et al (1995) (Tanksley SD, Ganal MW, Martin GB (1995) Chromosome landing: a paradigm for map-bases gene cloning in plants with large genomes. Trends in Genetics 11: 63 - 68). Do fragmento do DNA da soja do clone isolado, é construída uma sonda radioativa através da técnica de random primer. Essa sonda é utilizada na hibridação em uma bibliotecas de cDNA construída a partir de tecido foliar de um genótipo resistente desafiado com o fungo causador da FAS.

Após a hibridação, poucos candidatos ao gene de resistência são identificados. As sequências dos produtos candidatos são determinadas, utilizam-se bases de dados, como por exemplo o BLAST, e comparam-se tais sequências com outras já depositadas, buscando encontrar homologia com genes de resistência já conhecidos.

A confirmação de qual sequência de cDNA corresponde ao gene alvo é obtida após: (1) encontrar relação da sequência com outros genes de resistência conhecidos; (2) demonstrar a cossegregação da sequência candidata com o fenótipo resistente; (3) analisar a expressão gênica de genótipos suscetíveis e resistentes inoculados com o fungo, através de Northern Blot, (4) transformar plantas suscetíveis com a sequência candidata para complementação do fenótipo.

Exemplo 4

Desenvolvimento de Cultivares Resistentes

Uma outra forma de aplicação da presente invenção é a criação de novas cultivares de soja com resistência a FAS, a partir de fontes exóticas de resistência como as introduções de plantas objetos da presente invenção. Neste caso, a nova cultivar pode ser obtida a partir da hibridação de uma PI exótica, portadora de um ou mais dos genes e/ou alelos de resistência a FAS descritos na presente invenção, com uma linhagem ou cultivar suscetível a FAS, mas agronomicamente adaptada ao país ou região para qual se deseja obter a nova cultivar. Após a obtenção dessa semente F^ segue-se o avanço de geração usando-se diferentes métodos de melhoramento clássico, p.ex., Bulk, SSD, MSSD, Retrocruzamento, dentre outros,

41/45 porém não limitado a esses métodos, conforme exposto nos Antecedentes da Invenção, de acordo com a preferência do melhorista. As plantas resistentes podem ser selecionadas ao longo do processo de avanço de geração através da inoculação artificial dos esporos do fungo, ou mesmo infecção 5 natural, ou ainda usando-se seleção assistida pelos marcadores moleculares descritos na presente invenção (Exemplos 1 e 2).

A título de exemplo, realizou-se uma hibridação da Pl 635026, resistente a FAS, com a linhagem adaptada TMGLM-3219, suscetível a FAS. A semente Fi resultante foi plantada em casa de vegetação para obtenção 10 de sementes F₂. Estas foram plantadas ainda em casa de vegetação e inoculadas com uma solução aquosa contendo 50 x 10³ esporos de P. pachyrhizi por ml. As plantas resistentes foram selecionadas e mantidas para produção de sementes F₃. Progênies F2 3 foram novamente semeadas em casa de vegetação e avaliadas para resistência à FAS como anteriormente. As 15 melhores plantas resistentes foram colhidas individualmente e as progênies (F_3:4) destas plantas foram semeadas a campo no verão de 2004/2005. Plantas individuais foram selecionadas dentro destas progênies com base no seu visual agronômico, originando progênies F_4:5 que foram semeadas em casa de vegetação e novamente avaliadas para resistência a FAS. Plantas resis20 tentes foram individualmente colhidas gerando progênies F_5:6 que foram semeadas a campo. Uma nova seleção de plantas individuais a campo foi feita com base no visual agronômico das progênies, gerando assim progênies F₆ 7 que foram denominadas CB06-953, CB06-954, CB06-955, CB06-956, CB06957, CB06-958, CB06-959, CB06-960, CB06-961, CB06-962, CB06-963, 25 CB06-964, entre outras progênies. Sementes destas progênies foram multiplicadas no inverno e no verão de 2006/2007 e entraram em ensaios de VCU (Valor de Cultivo e Uso).

Os ensaios foram feitos seguindo um delineamento de blocos ao acaso com três repetições, sendo a parcela experimental constituída por 30 quatro linhas de 5 metros de comprimento espaçadas por 45 cm. Os ensaios foram conduzidos em três ambientes distintos (Cambé, Campo Mourão e Ponta Grossa) no Estado do Paraná (Brasil). Em Cambé, foram instalados

42/45 dois ensaios onde um teve o controle total de doenças com 3 aplicações de fungicidas (triazóis e estrobirulinas) e o outro não sofreu nenhuma aplicação de fungicida. Entre as características avaliadas estão a produtividade de grãos e a progressão da severidade da doença, sendo esta avaliada de acordo com a metodologia descrita por Godoy, et al (2006) (GODOY, C.V., KOGA, L.J. & CANTERI, M.G. (2006) Diagrammatic scale for assessment of soybean rust severity. Fitopatologia Brasileira 31:063-068).

A Figura 5 mostra a progressão da doença em cultivares suscetíveis a FAS (CD 202, CD 215, BRS 232, BRS 133) em comparação às linhagens resistentes, como por exemplo linhagens CB06-956, CB06-960, CB06-954, CB06-955, CB06-957, CB06-964, CB06-953, CB06-958, CB06961, CB06-959, CB06-963, CB06-962, entre outras linhagens. Claramente, as linhagens resistentes apresentaram, na ausência de fungicidas, uma redução média de aproximadamente 60% na severidade da doença quando comparada com as linhagens suscetíveis a FAS. A Figura 6 mostra que esta redução na severidade refletiu-se drasticamente na produtividade de grãos, sendo que na ausência de fungicida todas as linhagens tiveram produtividade superior a todos os padrões suscetíveis.

Exemplo 5

Controle Genético Associado ao Uso de Fungicidas

O uso de fungicida tem-se mostrado como um método alternativo no controle da FAS. Dentro desse contexto, é evidente mais uma das aplicações da presente invenção. A associação do controle genético - através dos genes/alelos de resistência/tolerância a FAS descritos anteriormente, ou mesmo outros genes/alelos de efeito similar - com o controle químico através do uso de fungicidas, mostrando ser um método novo no controle da FAS. Neste caso, o produtor teria uma segurança maior de controle e a durabilidade dos genes de resistência/tolerância à ferrugem podería ser estendida.

Atualmente, a FAS é controlada com o uso de fungicidas dos grupos dos triazóis, estrobirulinas, benzimidazóis, protioconazol e outros. Ocorre que para o efetivo controle da doença o momento de aplicação é crí-

43/45 tico. Após a detecção da doença nas plantas, um atraso em dois dias na aplicação pode, sob condições favoráveis, inviabilizar o controle total dos danos. Resultados de pesquisa têm demonstrado que a perda do ponto de aplicação do fungicida produz cerca de 60% de danos, mesmo quando se 5 aumenta o número de aplicações sequenciais. Nessas condições, o efeito residual do fungicida é reduzido consideravelmente. Portanto, um novo método de controle da FAS, associando o uso de cultivares com resistência genética à aplicação de fungicidas é necessário.

Um outro ponto a ser considerado diz respeito à eficácia dos 10 diferentes tipos e marcas de fungicidas recomendados para o controle da FAS por apresentarem variações significativas. Além disso, alguns fungicidas somente são recomendados em aplicações chamadas preventivas, ou seja, quando são feitas antes do aparecimento dos sintomas (lesões) da doença (Godoy, C.V. & Canteri, M.G. Efeitos protetor, curativo e erradicante 15 de fungicida no controle de ferrugem da soja causada por Phakopsora pachyrhizi, em casa de vegetação. Fitopatologia Brasileira, v. 29 n.1, 97-101, jan-fev, 2004; Soares, R.F., Rubin, S.A.L.; Wielewicki, J.G.O. Fungicida no controle da ferrugem asiática (Phakopsora pachyrhizi) e produtividade da soja. Ciência Rural, v.34, n.4, p1245-1247, jul-ago, 2004). Na prática, porém 20 isso nem sempre é possível, pois além das condições climáticas e operacionais que podem impedir a aplicação, o produtor está sempre querendo postergar a aplicação para reduzir o número de aplicações durante o ciclo da cultura. Desta forma a maioria das aplicações é feita em caráter curativo.

Assim, o melhor momento, bem como o número de aplicações 25 do fungicida para efetivo controle da doença passa a ser diferente em materiais portadores de genes de resistência ou tolerância à FAS. Além disso, moléculas químicas que não proporcionavam um controle eficiente da doença podem passar a ter um controle eficiente na medida em que a lesão de resistência (lesão RB) produz uma menor esporulação.

Um experimento foi conduzido em condições de campo 2006/07 em Cambé, PR para se determinar o período ideal de aplicação de fungicida em uma linhagem resistente portadora de gene de resistência a FAS. Como

44/45 comparação foi usada a cultivar de soja BRS 133 que apresenta ciclo semelhante, mas é completamente suscetível a FAS. O fungicida escolhido para controle químico da FAS foi o produto comercial Opera® (BASF), uma mistura comercial de estrobirulina (piraclostrobin) e triazol (epoxiconazol). Porém, existe a possibilidade de uso de qualquer fungicida disponível no mercado. O ensaio foi conduzido em blocos ao acaso com três repetições, e os tratamentos químicos para BRS 133 e para a linhagem resistente foram:

- Testemunha: sem a aplicação do fungicida OperaC (Testemunha), mas com aplicação de fungicida Derosal® apenas para controle somente de doenças de final de ciclo;

- Controle: três aplicações (estágios reprodutivos R2, R4, e R5.5) de Opera®

- 6 tratamentos com aplicações únicas do fungicida Opera® em diferentes estádios de desenvolvimento (R2; R3; R4; R5.1; R5.3; R5.4)

O resumo dos tratamentos está exemplificado na Tabela 3.

Tabela 3

Tratamento	N° Aplicações	Estádio da Aplicação
T1 (Testemunha)	0	-
T2 (Controle)	3	R2, R4, R5.4
T3	2	R2, R5.1
T4	1	R2
T5	1	R3
T6	1	R4
T7	1	R5.1
T8	1	R5.3
T9	1	R5.4

A quantificação da severidade foi realizada quinzenalmente com o auxílio da escala diagramática desenvolvida por Godoy et al. (2006) (Godoy, C.V; Koga, L.J. & Canteri, M.G. Diagrammatic scale for assessment of soybean rust severity. Fitopatologia Brasileira. Fitopatologia Brasileira, v. 31, p.63-68, 2006). Os dados foram submetidos à análise de variância pelo teste F e as diferenças entre as médias, quando significativas, foram comparadas pelos testes de Tukey 5%, programa SASM-Agri (Canteri et al., 2001). Canteri, M. G., Althaus, R. A., Virgens Filho, J. S., Giglioti, E. A., Godoy, C. V.

45/45

Sasm - Agri: Sistema para análise e separação de médias em experimentos agrícolas pelos métodos Scott - Knott, Tukey e Duncan. Revista Brasileira de Agrocomputação, v.1, n.2, p.18-24. 2001).

A Figura 7 sumariza o resultado de uso de fungicida em materiais com resistência/tolerância à FAS, cujos dados demonstram atraso no início do desenvolvimento da doença e redução significativa do seu progresso na linhagem resistente. Observa-se que quando a linhagem resistente recebeu apenas uma aplicação de fungicida no estádio R5.1, a média de AACPD (Área Abaixo da Curva de Progresso da Doença) manteve-se semelhante ao Controle (linhagem resistente com 3 aplicações de fungicida) e não diferiu significativamente deste. Já a cultivar BRS 133 teve que receber uma aplicação de fungicida no estádio R3 para apresentar uma AACPD semelhante ao seu Controle (BRS 133 com 3 aplicações de fungicida) e não diferir significativamente deste. Isso mostra que o controle a FAS na linhagem resistente é efetivo com apenas uma aplicação de fungicida em qualquer momento entre os estádios reprodutivos R2 a R5.1. Já na BRS 133 o controle só é efetivo entre os estádios R2 e R3.

Na Linhagem resistente, com a aplicação de fungicida no estádio R5.4 o valor da AACPD difere significativamente do observado no tratamento controle, a severidade é elevada e o controle da doença neste ponto é ineficiente. Para BRS 133 essa situação é observada já no estádio R5.1. Nos demais estádios o controle é intermediário

Este resultado evidencia que a presença do gene de resistência atrasa o desenvolvimento da ferrugem, possibilitando, além da redução do número de aplicações, um maior intervalo (janela de aplicação) para pulverização do fungicida. Consequentemente o uso de fungicidas associado ao uso de cultivares com resistência genética possibilita que o controle da ferrugem asiática da soja seja realizado com maior eficácia e menor custo (Figura 7).

Tendo sido descrita com base em exemplos de concretização, deve ser entendido que a presente invenção abrange outras configurações, sendo limitada tão somente pelo escopo das reivindicações apensas.

Claims

1. Método de identificação e seleção de plantas de soja portadoras de resistência e/ou tolerância à ferrugem asiática da soja (FAS - Phakopsora pachyrhizi) a partir de uma população de plantas, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) extração de ácido nucleico de uma planta de soja;

(b) análise do ácido nucleico extraído para a presença de pelo menos um marcador molecular mapeado a 10 cM ou menos do lócus RppN para obter um padrão de amplificação de pelo menos um marcador molecular;

(c) comparação do padrão de amplificação obtido na etapa (b) com o padrão de amplificação do mesmo marcador utilizado na etapa (b) nos genótipos resistentes à ferrugem asiática da soja denominados internacionalmente de PI 200456, PI 200526, PI 200487 ou PI 471904, respectivamente;

(d) seleção das plantas que apresentem o mesmo padrão de amplificação que qualquer um dos genótipos resistentes da etapa (c);

em que o referido lócus RppN é mapeado no grupo de ligação N, flanqueado pelos marcadores compreendendo SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64.