PL226646B1 - Botaniczna substancja lekowa - Google Patents

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy botanicznej substancji lekowej (BDS) do wprowadzania do leku. Dotyczy on również BDS o danej czystości do stosowania w preparatach farmaceutycznych. W szczególności dotyczy on BDS zawierającej kannabinoidy otrzymane przez ekstrakcję z konopi.

W PCT/GB02/00620 zgłaszający ujawnia sposób wytwarzania ziołowego ekstraktu lekowego (botanicznej substancji lekowej) z konopi leczniczych. Sposób obejmuje:

1. etap ogrzewania w celu dekarboksylacji postaci kwasowej kannabinoidów do ich postaci obojętnej,

2. pierwszą ekstrakcję określoną objętością ciekłego ditlenku węgla w ciągu 6-8 godzin i

3. etap zmniejszenia udziału materiałów nie będącymi materiałami docelowymi określany jako odstearynowywanie, w którym to etapie strąca się woski.

Konkretniej, PCT/GB02/00620 przedstawia sposób w którym: etap 1 obejmuje ogrzewanie pociętych konopi (2-3 mm) w 100-150°C w ciągu okresu czasu dostatecznego dla umożliwienia dekarboksylacji, etap 2 obejmuje ekstrakcję CO2 z zastosowaniem:

a) gruboziarnistego proszku (cząsteczki przechodzą przez sito 3 mm),

b) gęstości upakowania 0,3 i

c) nadkrytycznych warunków 600 bar w 35°C w ciągu 4 godzin, chociaż można by, co jest potwierdzone, stosować inne kombinacje temperatury i ciśnienia w zakresie od 10-35°C i 60-600 bar (warunki zarówno nadkrytyczne, jak i podkrytyczne) i etap 3 obejmuje przeprowadzenie strącania etanolem w temperaturze -20°C w ciągu 24 godzin i usunięcie materiału woskowego przez filtrowanie.

W nadkrytycznym sposobie ujawnionym w PCT/GB02/00620 wytworzono:

a) ekstrakt o dużej zawartości THC zawierający:

60% tetrahydrokannabinolu (THC),

1-2% kannabidiolu (CBD)

4-5% innych śladowych kannabinoidów, włączając CBN (Wydajności ilościowe wyniosły 9% w/w w stosunku do suchej masy konopi leczniczych) i

b) ekstrakt o dużej zawartości CBD zawierający 60% CBD, 4% THC i 2% innych kannabinoidów (Wydajności ilościowe wyniosły 9% w/w w stosunku do suchej masy konopi leczniczych)

Ponieważ otrzymana BDS ma być wykorzystana w produkcie farmaceutycznym, niezbędne jest, aby sposób był bezpieczny, aby można go było zmieniać stosownie do dobrej praktyki produkcyjnej oraz aby dawał on wysoki stopień zwartości produktu i korzystnie również dobre wydajności.

Zasady ekstrakcji cieczą w stanie nadkrytycznym (SFE) znano od czasu prac Barona Cagniarda de la Tour w 1822 roku, kiedy to stwierdzono, że granica gaz-ciecz znikła, gdy zwiększyła się temperaturę niektórych materiałów przez ogrzewanie ich w zamkniętym szklanym naczyniu. Prowadząc te początkowe prace odkryto po raz pierwszy punkt krytyczny substancji. Punkt krytyczny oznacza temperaturę, powyżej której może wystąpić współistnienie faz gazowej, ciekłej lub stałej danej substancji. Później stwierdzono, że po doprowadzeniu substancji do krytycznych temperatury i ciśnienia lub powyżej ich, można było stosować je jako udoskonalone rozpuszczalniki do ekstrakcji i frakcjonowania złożonych mieszanin.

Metoda jest szeroko wykorzystywana w obróbce oleju napędowego i stosowano ją, na przykład, do oczyszczania i oddzielania olejów roślinnych oraz tranów rybich.

Atrakcyjną cechą SFE w stosunku do tradycyjnych rozpuszczalników jest to, że zdolność rozpuszczania (E°) można zmieniać przez modyfikację temperatury i ciśnienia powyżej punktu krytycznego.

Na typowym wykresie ciśnienie-temperatura dla danej substancji są trzy linie, które oznaczają równowagę między dwoma fazami. Linie te spotykają się w punkcie potrójnym. Linie oznaczają granicę faz między stanami gazowym, ciekłym i stałym, a punkty wzdłuż linii oznaczają równowagę między parami faz. Przykładowo, krzywa ciśnienia pary (temperatura wrzenia) zaczyna się w punkcie potrójnym i kończy się w punkcie krytycznym. Obszar krytyczny zaczyna się w tym punkcie, a płynem nadkrytycznym jest jakakolwiek substancja, która jest powyżej jej temperatury krytycznej (Tc) i ciśnienia krytycznego (Pc). Temperatura krytyczna jest to więc najwyższa temperatura, w której gaz można doprowadzić do przemiany w ciecz przez zwiększenie ciśnienia, a ciśnienie krytyczne jest to najwyższe ciśnienie, w którym ciecz można doprowadzić do przemiany w konwencjonalny gaz przez zwiękPL 226 646 B1 szenie temperatury. W tym tak zwanym obszarze krytycznym jest tylko jedna faza i posiada ona niektóre z własności, zarówno gazu, jak i cieczy.

Istnieje wiele rozpuszczalników, które można stosować do ekstrakcji substancji aktywnych z materiałów roślinnych. Tabela 1 przedstawia krytyczne temperaturę i ciśnienie niektórych z tych rozpuszczalników.

T a b e l a 1 - Warunki krytyczne rozpuszczalników

Rozpuszczalniki	Temperatura krytyczna (°C)	Ciśnienia krytyczne (bar)
Ditlenek węgla	31,1	73,8
Etan	32,2	48,8
Etylen	9,3	50,4
Propan	96,7	42,5
Propylen	91,9	46,2
Cykloheksan	280,3	40,7
Izopropanol	235,2	47,6
Benzen	289,0	48,9
Toluen	318,6	41,1
p-ksylen	343,1	35,2
Chlorotrifluorometan	28,9	39,2
Trichlorofluorometan	198,1	44,1
Amoniak	132,5	112,8
Woda	374,2	220,5

Jako korzystny rozpuszczalnik zastosowano ditlenek węgla, który ma temperaturę krytyczną 31,1°C i ciśnienie krytyczne 73,8 bar.

Ditlenek węgla jest szczególnie korzystny, ponieważ jest on dostępny po niskich kosztach u wielu dostawców i można go, w razie potrzeby, zawrócić do ponownego wykorzystania. Jakiekolwiek ubytki CO2 są również obojętne dla środowiska. Ponadto ekstrakcja CO2 jest bezpiecznym sposobem wytwarzania i można precyzyjnie ekstrahować bardzo wrażliwe cząsteczki.

Decydującą kwestią do rozważenia przy początkowym wyborze ciekłego CO2 jako rozpuszczalnika do wytwarzania standaryzowanego ekstraktu o dużej mocy ziela konopi był wysoki stopień selektywności, który można osiągnąć. W układzie CO2 ustalono, że zdolność solwatującą można przede wszystkim uważać za funkcję gęstości i temperatury, przy czym bardziej istotnym czynnikiem jest gęstość rozpuszczalnika.

Starannie sterując temperaturą i ciśnieniem poniżej nadkrytycznych temperatury i ciśnienia zgłaszający był w stanie wydzielić określone frakcje lipofilowe lub hydrofilowe bogate w kannabinoidy wraz innymi składnikami, które można stosunkowo łatwo wydzielić w celu otrzymania botanicznej substancji lekowej (BDS), która zawiera pożądane składniki w postaci, która jest farmaceutycznie akceptowana. W ten sposób ze złożonych mieszanin, które występują w surowcu botanicznym, można wydzielić składniki, które są znane jako substancje aktywne.

Ponadto, można uzyskać bardzo dobrą odtwarzalność poszczególnych partii między partiami, a niepożądane składniki, takie jak metale ciężkie, które w różnym stopniu mogą być obecne w surowcu botanicznym, mogą być pozostawione w wyeksploatowanym materiale.

Można również modyfikować warunki ekstrakcji w celu odrzucenia pozostałości pestycydowych, które mogą być obecne w początkowym materiale.

Korzyści zastosowania warunków podkrytycznych obejmują selektywny charakter ekstrakcji. Natomiast w przypadku SFE stwierdzono, że rozpuszczalnik poza rozpuszczaniem pożądanych kannabinoidów niekorzystnie rozpuszczał również inne materiały nie będące materiałami docelowymi, które okazały się trudne do wydzielenia w dalszym etapie oczyszczania.

Dla wyjaśnienia, gęstość podkrytycznego CO2 jest mała i pozostaje mała, nawet przy zwiększeniu ciśnienia aż do osiągnięcia punkt krytycznego układu. I tak, gdy zdolność solwatująca podkrytycz4

PL 226 646 B1 nego CO2 jest mniejsza, można osiągnąć wysoki stopień selektywności, ponieważ jedynie najbardziej rozpuszczalne składniki są skutecznie rozpuszczane przez CO2, w tym przypadku jest to frakcja kannabinoidowa. Rezultatem jest wytworzenie stosunkowo prostego ekstraktu zawierającego poza kannabinoidami jedynie ograniczoną liczbę związków nie będących związkami docelowymi, z których wiele można stosunkowo łatwo usunąć w nieskomplikowany sposób. Ponadto dodatkową korzyścią są oszczędności kosztów spowodowane działaniem przy stosunkowo niskich ciśnieniach i temperaturach.

W przeciwieństwie do tego, powyżej temperatury krytycznej 31°C ma miejsce znaczny wzrost gęstości CO2, ponieważ jest on wtedy w stanie płynnym nadkrytycznym. Skutkiem tego jest duży wzrost zdolności solwatującej rozpuszczalnika, co chociaż generalnie jest korzystne przez to, że więcej kannabinoidów rozpuszcza się zapewniając tym sposobem dobre wydajności, faktycznie okazuje się niekorzystne, ponieważ zmniejszona selektywność silniejszego rozpuszczalnika daje w rezultacie zwiększoną rozpuszczalność gamy związków nie będących związkami docelowymi, co czyni powstały ekstrakt trudniejszym w oczyszczaniu. Innymi słowy, skutkuje to wytworzeniem bardziej złożonych ekstraktów, w których stężenie związku docelowego może być znacznie słabsze (i.e. moc ekstraktu zmniejsza się).

Przedmiotem obecnego wynalazku jest botaniczna substancja lekowa, którą można otrzymać z surowca botanicznego z rośliny konopnej o dużej zawartości tetrahydrokanabinolu (THC), która charakteryzuje się tym, że wyżej wspomniana botaniczna substancja lekowa jest ekstraktem z rośliny konopnej o dużej zawartości THC zawierającym co najmniej 60% składników kanabinoidowych i mniej niż 40% składników nie-kanabinoidowych, nie więcej niż 5% CBD w/w w stosunku do zawartości THC i nie więcej niż 5% kannabinoidów innych niż THC i CBD w % w/w w stosunku do zawartości THC, przy czym składniki kanabinoidowe zawierają co najmniej 90% THC a składniki nie-kanabinoidowe zawierają terpeny i zmniejszone ilości wosków węglowodorowych i triglicerydowych oraz pigmentów roślinnych.

Przedmiotem obecnego wynalazku jest także botaniczna substancja lekowa, którą można otrzymać z surowca botanicznego z rośliny konopnej o dużej zawartości CBD, która charakteryzuje się tym, że wyżej wspomniana botaniczna substancja lekowa jest ekstraktem z rośliny konopnej o dużej zawartości CBD zawierającym co najmniej 60% składników kanabinoidowych i mniej niż 40% składników nie-kanabinoidowych, nie więcej niż 7,5% THC w/w w stosunku do zawartości CBD i nie więcej niż 5% kannabinoidów innych niż CBD i THC w % w/w w stosunku do zawartości CBD, przy czym składniki kanabinoidowe zawierają co najmniej 85% CBD a składniki nie-kanabinoidowe zawierają terpeny i zmniejszone ilości wosków węglowodorowych i triglicerydowych oraz pigmentów roślinnych.

Korzystnie botaniczna substancja lekowa zawiera nie więcej niż 4 ppb aflatoksyny.

Korzystnie botaniczna substancja lekowa zawiera nie więcej niż 20 ppm metali ciężkich.

Korzystnie botaniczna substancja lekowa zawiera nie więcej niż 15% w/w rozpuszczalników resztkowych.

Korzystnie rozpuszczalnikiem resztkowym jest etanol.

₅

Korzystnie botaniczna substancja lekowa zawiera nie więcej niż 10⁵ cfu/g TVC, nie więcej niż 10⁴ cfu/g grzybów, nie więcej niż 10³ cfu/g pałeczek jelitowych i innych organizmów niegramujemnych i niewykrywalne E. Coli, Salmonella lub S. aureus.

Korzystnie botaniczna substancja lekowa zawiera co najmniej 60% kannabinoidów, z których co najmniej 90% stanowią THC, 1,5% stanowi CBD, a pozostałość zawiera inne drugorzędne kannabinoidy.

Korzystnie botaniczna substancja lekowa zawiera co najmniej 60% kannabinoidów, z których co najmniej 85% stanowią CBD, 3% stanowi THC, a pozostałość zawiera inne drugorzędne kannabinoidy.

Botaniczna substancja lekowa jest ekstraktem pochodzącym z konopnego materiału roślinnego, do którego to ekstraktu stosuje się definicja botanicznej substancji lekowej podana w Wytycznych do Projektu Wytycznych dotyczących Przemysłowych Botanicznych Produktów Lekowych, sierpień 2000, Departament ds. Zdrowia i Służb Socjalnych Stanów Zjednoczonych, Administracyjne Centrum Żywności i Leków ds. Oceny Leków i Badań Naukowych Substancja lekowa pochodna z jednej lub kilku roślin, alg lub grzybów makroskopowych. Wytwarza się ją z surowców botanicznych za pomocą jednego lub kilku z następujących sposobów: proszkowanie, metoda warowa, wyciskanie, ekstrakcja wodna, ekstrakcja etanolowa i inne podobne sposoby.

PL 226 646 B1

Materiał roślinny określa się jako roślinę lub część roślinną (np. kora, drewno, liście, łodygi, korzenie, kwiaty, owoce, nasiona, jagody lub ich części), jak również eksudaty, i obejmuje materiał wchodzący w zakres definicji surowca botanicznego zawartej w Wytycznych do Projektu Wytycznych dotyczących Przemysłowych Botanicznych Produktów Lekowych, sierpień 2000, Departament ds. Zdrowia i Służb Socjalnych Stanów Zjednoczonych, Administracyjne Centrum Żywności i Leków ds. Oceny Leków i Badań Naukowych.

Najczęściej, lecz niekonieczne, materiałem roślinnym będzie materiał roślinny lub surowiec botaniczny pochodzący z jednej lub kilku roślin konopnych.

Termin roślina konopna (rośliny konopne) obejmuje konopie siewne typu dzikiego, a także ich odmiany, włączając odmiany chemiczne konopi, które w stanie naturalnym zawierają różne ilości indywidualnych kannabinoidów, podgatunki indyjskie konopi siewnych, włączając odmiany var. indica i var. kafiristanica, konopie indyjskie, a także rośliny, które są wynikiem genetycznych krzyżówek, autokrzyżówek lub ich hybryd. Termin konopny materiał roślinny należy zatem rozumieć jako obejmujący materiał roślinny pochodzący z jednej lub kilku roślin konopnych. Dla uniknięcia wątpliwości stwierdza się niniejszym, że konopny materiał roślinny zawiera suchą biomasę konopną.

Sposób ekstrakcji kannabinoidów z materiału roślinnego obejmuje etap dekarboksylacji, ekstrakcję ciekłym ditlenkiem węgla (CO2) i etap zmniejszenia w ekstrakcie udziału materiałów nie będących materiałami docelowymi, przy czym ekstrakcję ciekłym CO2 prowadzi się w warunkach podkrytycznych w temperaturze 5-15°C i ciśnieniu 50-70 barów.

Sposób powyższy można stosować do wytwarzania ekstraktu bogatego w kannabinoidy z konopnego materiału roślinnego, zwłaszcza do wytwarzania ekstraktu z konopi, którym jest botaniczna substancja lekowa.

Korzystnie ekstrakcję CO2 prowadzi się w temperaturze między 8-12°C, najkorzystniej w temperaturze około 10°C.

Korzystnie ekstrakcję CO2 prowadzi się przy ciśnieniu między 55-65 barów, najkorzystniej się przy ciśnieniu wynoszącym konkretnie 60 barów.

Najkorzystniej CO2 ma masowe natężenie przepływu od 1000-1500 Kg/godz., korzystniej masowe natężenie przepływu wynoszące konkretnie 1250 Kg/godz.

Korzystnie ekstrakcję ciekłym CO2 prowadzi się do 10 godzin, najkorzystniej około 8 godzin.

W korzystnym przykładzie wykonania ciekły CO2 usuwa się przez rozszczelnienie, a uzyskany ekstrakt trzyma się w temperaturze w zakresie od -15°C do -20°C.

Etapem mającym na celu zmniejszenie w botanicznej substancji lekowej udziału materiałów nie będącymi materiałami docelowymi może być zasadniczo każda obróbka, która daje w rezultacie selektywne usuwanie niepożądanych składników (w przeciwieństwie do kannabinoidów), tak, że ilość niepożądanych składników obecnych w końcowej botanicznej substancji lekowej zmniejsza się. Materiałami nie będącymi materiałami docelowymi są jakiekolwiek materiały pochodzące z wyjściowego materiału roślinnego, których obecność w końcowej botanicznej substancji lekowej nie jest pożądana. W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku etap ten może obejmować strącanie alkoholem C1-C5, w którym materiał poddawany obróbce w etapie strącania alkoholem przed dodaniem alkoholu C1-C5 ogrzewa się do temperatury wyższej niż temperatura pokojowa. Zwykle etap mający na celu zmniejszenie w botanicznej substancji lekowej udziału materiałów nie będącymi materiałami docelowymi prowadzi się po ekstrakcji ciekłym CO2, w którym to przypadku materiał poddawany obróbce w strącaniu alkoholem jest produktem ekstrakcji ciekłym CO2. Ten ekstrakt jest sam w sobie botaniczną substancją lekową objętą definicją podaną wyżej.

Korzystnie alkoholem C1-C5 jest etanol. Korzystnie ekstrakt ogrzewa się do temperatury w zakresie od 36°C do 44°C, najkorzystniej około 40°C. Ogrzewanie materiału poddawanego obróbce przed dodaniem alkoholu C1-C5 skutkuje poprawą mieszania tego materiału z alkoholem C1-C5, a więc poprawia efektywność etapu strącania alkoholem.

Korzystnie alkohol C1-C5 dodaje się w ilości od 3:1 do 1:1 objętości alkoholu C1-C5 w stosunku masy materiału poddawanego obróbce, korzystniej w ilości około 2:1 objętości alkoholu C1-C5 w stosunku masy materiału poddawanego obróbce.

Roztwór powstały przez dodanie do materiału poddawanego obróbce alkoholu C1-C5 ochładza się i pozwala wytrącić się materiałom nierozpuszczalnym. Korzystnie roztwór ochładza się do temperatury w zakresie od -15°C do -25°C i korzystnie roztwór ochładza się w ciągu do 52 godzin.

Następnie usuwa się strącony osad materiałów nierozpuszczalnych, zwykle przez filtrowanie. Korzystnie filtrowanie przeprowadza się przez membranę 20 gm.

PL 226 646 B1

Sposób może ponadto obejmować wieloetapowe odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem. Może to być odparowanie obrotowe lub inne znane techniki.

Zwykle produkt z etapu strącania alkoholem C1-C5 poddaje się wieloetapowemu odparowaniu w celu usunięcia faktycznie całego alkoholu C1-C5 i wody. Korzystnie najpierw usuwa się alkohol C1-C5, a następnie wodę.

Korzystnie alkohol C1-C5 usuwa się przez ogrzewanie do temperatury w zakresie od 58°C do 62°C w celu uzyskania temperatury pary w zakresie 38°C do 42°C, pod próżnią w zakresie 168172 mbar, aż do momentu, gdy kondensat będzie występował w małej ilości lub nie będzie widoczny.

Następnie ponadto usuwa się wodę, korzystnie przez wieloetapową redukcję próżni stopniowo do około 50 mbar.

Etap dekarboksylacji można prowadzić przed ekstrakcją ciekłym CO2 lub po niej.

Etap dekarboksylacji prowadzi się przed ekstrakcją ciekłym CO2 i dokonuje się przez ogrzewanie materiału roślinnego do temperatur i w ciągu okresów czasu, które zapewniają co najmniej 95% przemianę kwasowych kannabinoidów w ich postać obojętną, gwarantując to, że termiczna degradacja THC do CBN jest mniejsza niż 10%.

Dekarboksylacja kwasów kannabinoidowych zależy od czasu i temperatury, i tak, w celu całkowitej dekarboksylacji danej ilości kwasu kannabinoidowego w wyższych temperaturach będzie zastosowany krótszy okres czasu. Przy wyborze odpowiednich warunków dekarboksylacji należy jednakże uwzględnić minimalizację termicznej degradacji pożądanych farmakologicznych kannabinoidów do niepożądanych produktów degradacji, szczególnie termicznej degradacji THC do kannabinolu (CBN).

Korzystnie dekarboksylację prowadzi się w wielostopniowym procesie ogrzewania, w którym:

i) materiał roślinny ogrzewa się do pierwszej temperatury w ciągu pierwszego (stosunkowo krótkiego) okresu czasu w celu odparowania zaabsorbowanej wody i umożliwienia równomiernego ogrzania materiału roślinnego i ii) temperaturę zwiększa się do drugiej temperatury w ciągu drugiego okresu czasu (zwykle dłuższego niż pierwszy okres czasu), aż nastąpi co najmniej 95% przemiana kwasowych kannabinoidów w ich postać obojętną.

Korzystnie pierwszy etap prowadzi się w temperaturze w zakresie 100°C do 110°C w ciągu 10-20 minut. Korzystniej pierwsza temperatura wynosi około 105°C i pierwszy okres czasu wynosi około 15 minut.

Jeśli materiał roślinny pochodzi z roślin konopnych o dużej zawartości CBD (określonej jako >90% CBD będącej zawartością procentową w stosunku do całkowitej zawartości kannabinoidów), korzystnie druga temperatura zawarta jest w zakresie od 115°C do 125°C, korzystnie wynosi około 120°C, a drugi okres czasu zawarty jest w zakresie od 45 do 75 minut, korzystnie wynosi około 60 minut. Korzystniej druga temperatura zawarta jest w zakresie od 135°C do 145°C, korzystnie wynosi około 140°, a drugi okres czasu zawarty jest w zakresie od 15 do 45 minut, korzystnie wynosi około 30 minut. Dla masy materiału roślinnego większej niż 4 kg, druga temperatura zawarta jest w zakresie od 140°C do 150°C, korzystnie wynosi około 145°C, a drugi okres czasu zawarty jest w zakresie od 55-90 minut. Te ostanie warunki są korzystne dla przetwarzanych ilości wynoszących, na przykład 4-6 kg wyjściowego materiału roślinnego, a dokładne wartości liczbowe, szczególnie okres czasu, mogą nieznacznie zmieniać się wraz ze zwiększoną masą.

Jeśli materiał roślinny pochodzi z roślin konopnych o dużej zawartości THC (określonej jako >90% THC będącej zawartością procentową w stosunku do całkowitej zawartości kannabinoidów), korzystnie druga temperatura zawarta jest w zakresie od 115°C do 125°C, zwykle wynosi około 120°C, a korzystnie drugi okres czasu zawarty jest w zakresie od 45 do 75 minut, zwykle wynosi około 60 minut. Korzystniej druga temperatura zawarta jest w zakresie od 100°C do 110°C, korzystnie wynosi około 105°C, a drugi okres czasu zawarty jest w zakresie od 60 do 120 minut, korzystnie wynosi około 30 minut. W innym przykładzie wykonania, najkorzystniejszym dla masy materiału roślinnego większej niż 4 kg, druga temperatura zawarta jest w zakresie od 140°C do 150°C, korzystnie wynosi około 145°C, a drugi okres czasu zawarty jest w zakresie od 45 do 55 minut.

Najkorzystniej etap dekarboksylacji prowadzi się w temperaturach i w ciągu okresów czasu, które zapewniają co najmniej 97% przemianę kwasowych kannabinoidów w ich postać obojętną, gwarantując to, że termiczna degradacja THC do CBN jest mniejsza niż 5%.

Standardowe warunki oznaczeń kannabinoidów i sposoby obliczania zawartości kannabinoidów (w %) podaje się w załączonych przykładach.

PL 226 646 B1

Korzystnie materiał roślinny stosowany jako materiał wyjściowy w sposobie ekstrakcji rozdrabnia się, miele lub poddaje innej obróbce w celu otrzymania wielkości cząstek mniejszej niż 2 mm, lecz korzystnie większej niż 1 mm. Taka obróbka zwykle daje w rezultacie lepszą ekstrakcję kannabinoidów z materiału roślinnego, ponieważ poprawia się gęstość upakowania.

W korzystnym przykładzie wykonania sposób ekstrakcji może dodatkowo obejmować etap obróbki ekstraktu (lub materiału botanicznej substancji lekowej) pochodzącego z materiału roślinnego za pomocą węgla aktywnego drzewnego.

Zwykle etapowi temu będzie poddawać się produkt strącania alkoholem C1-C5, zazwyczaj natychmiast po filtrowaniu mającym na celu usunięcie strąconego osadu. Ciekły produkt strącania alkoholowego klasyfikuje się jako botaniczną substancję lekową zgodnie z definicją podaną powyżej. Dogodnie obróbkę za pomocą węgla aktywnego drzewnego można prowadzić przez przepuszczanie ciekłego materiału, który jest poddawany obróbce, w dół kolumny z węglem aktywnym drzewnym.

Jak ilustrują to załączone przykłady, obróbka za pomocą węgla aktywnego drzewnego poprawia znacznie stabilność botanicznych substancji lekowych pochodzących z konopnego materiału roślinnego, poprawiając znacznie odporność na termiczną degradację aktywnych kannabinoidów.

W korzystnym przykładzie wykonania sposób będzie obejmować następujące etapy obróbki konopnego materiału roślinnego, korzystnie prowadzone w podanej kolejności:

i) dekarboksylacja, ii) ekstrakcja ciekłym CO2 w celu wytworzenia surowej botanicznej substancji lekowej, iii) strącanie alkoholem C1-C5 w celu zmniejszenia udziału materiałów nie będącymi materiałami docelowymi, iv) filtrowanie w celu usunięcie strąconego osadu,

v) odparowanie w celu usunięcia alkoholu C1-C5 i wody w celu wytworzenia końcowej botanicznej substancji lekowej (BDS).

Etap obróbki za pomocą węgla aktywnego drzewnego może być włączony między etap iv) i etap v), co poprawia stabilność końcowej BDS.

Zgłaszający ustalił ponadto, że dodanie do rozpuszczalnika w postaci ciekłego ditlenku węgla porcji środka modyfikującego lub rozpuszczalnika polarnego, na przykład, alkoholu C1 do C5, przykładowo etanolu, może dodatkowo zwiększyć selektywność sposobu ekstrakcji.

Inny sposób ekstrakcji kannabinoidów z materiału roślinnego obejmuje ekstrakcję ciekłym CO2, charakteryzującą się tym, że do ditlenku węgla dodaje się organiczny środek modyfikujący lub rozpuszczalnik polarny.

Korzystnie środek modyfikujący lub rozpuszczalnik polarny dodaje się w ilości do 10% wagowych.

Korzystnie środkiem modyfikującym jest alkohol C1-C5, najkorzystniej etanol.

A zatem wynalazek przedstawia botaniczną substancję lekową, którą można otrzymać z surowca botanicznego z rośliny konopnej o dużej zawartości THC, mającej zawartość THC co najmniej 90% w/w w stosunku do całkowitej zawartości kannabinoidów, przy czym wyżej wspomniana botaniczna substancja lekowa jest ekstraktem pochodzącym z rośliny konopnej o dużej zawartości THC zawierającym co najmniej 50% THC w/w w stosunku do ekstraktu, nie więcej niż 5% CBD w % w/w w stosunku do zawartości THC i nie więcej niż 5% kannabinoidów innych niż THC i CBD w % w/w w stosunku do zawartości THC.

Korzystniej zawartość procentowa THC w/w ekstraktu wynosi co najmniej 55%, a jeszcze korzystniej co najmniej 60%. Poniżej podane zostaną inne kannabinoidy i metody oznaczania mające na celu określanie ilości.

Wynalazek przedstawia również botaniczną substancję lekową, którą można otrzymać z surowca botanicznego z rośliny konopnej o dużej zawartości CBD, mającej zawartość CBD co najmniej 90% w/w w stosunku do całkowitej zawartości kannabinoidów, przy czym wyżej wspomniana botaniczna substancja lekowa jest ekstraktem pochodzącym z rośliny konopnej o dużej zawartości CBD, który to ekstrakt zawiera co najmniej 50% CBD w/w w stosunku do ekstraktu, nie więcej niż 7,5% THC w/w w stosunku do zawartości CBD i nie więcej niż 5% kannabinoidów innych niż CBD i THC wyrażonych w % w/w w stosunku do zawartości CBD.

Wiadomo, że rośliny o dużej zawartości THC, takie jak, na przykład Skunk, uprawiano, chociaż z przeznaczeniem do używania jako narkotyki w celach rozrywkowych, stosując tradycyjne techniki uprawy, które można również wykorzystać w celu wytwarzania roślin bogatych w inne kannabinoidy, np. CBD, za pomocą naturalnej selekcji lub technik genetycznych, ponieważ zidentyfikowano ge8

PL 226 646 B1 ny syntazy kannabidiolanu i syntazy THC, patrz JP 2001029082 i JP 2000078979. Rasa gruntowa

Turcja CPRO 921018 jest przykładem rośliny o dużej zawartości CBD.

Botaniczne substancje lekowe można otrzymać z konopnego materiału roślinnego (surowiec botaniczny) z zastosowaniem sposobu ekstrakcji według wynalazku.

W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku botaniczna substancja lekowa zawiera nie więcej niż 4 ppb aflatoksyny.

W dalszym korzystnym przykładzie wykonania wynalazku botaniczna substancja lekowa zawiera nie więcej niż 20 ppm wszystkich metali ciężkich.

W dalszym korzystnym przykładzie wykonania wynalazku botaniczna substancja lekowa zawiera nie więcej niż 15% w/w resztkowych rozpuszczalników, dokładniej nie więcej niż 15% w/w etanolu.

W dalszym korzystnym przykładzie wykonania wynalazku botaniczna substancja lekowa zawie54 ra nie więcej niż 10⁵ cfu/g TVC (ogólna liczba bakterii wskaźnikowych), nie więcej niż 10⁴ cfu/g grzy₃ bów, nie więcej niż 10³ cfu/g pałeczek jelitowych i innych organizmów niegramujemnych oraz niewykrywalne E. Coli, Salmonella lub S. Aureus.

Wymienione powyżej parametry dotyczą czystości botanicznej substancji lekowej i określają poziom czystości, który jest korzystny, jeśli botaniczna substancja lekowa ma być zawarta w produkcie farmaceutycznym. Botaniczne substancje lekowe mające wymagany poziom czystości można otrzymać stosując sposób ekstrakcji według wynalazku, szczególnie stosując warunki operacyjne i procedury kontroli jakości przedstawione w załączonych przykładach. W technice znane są standardowe techniki oznaczania stosowane przy określaniu poziomu alfatoksyny, metali ciężkich, resztkowych rozpuszczalników i bakteryjnych czynników skażających w botanicznej substancji lekowej (e.g. standardowe procedury Ph.Eur). Dodatkowe szczegóły przedstawi się w załączonych Przykładach.

Botaniczne substancje lekowe uzyskane z konopnego materiału roślinnego zgodnie ze sposobami według wynalazku można sporządzać z jednym lub kilkoma farmaceutycznie akceptowanymi nośnikami, rozcieńczalnikami lub podłożami lub osadzać na powierzchni farmaceutycznie akceptowanej służącej odparowaniu w celu wytwarzania preparatów farmaceutycznych zawierających kannabinoidy jako środki farmaceutycznie aktywne.

A zatem w dalszym aspekcie przedstawia się sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej, jako środek aktywny, botaniczną substancję lekową, która jest ekstraktem z co najmniej jednej odmiany roślin konopnych, który to sposób obejmuje wytwarzanie botanicznej substancji lekowej zawierającej kannabinoidy z co najmniej jednej odmiany rośliny konopnej z zastosowaniem sposobu ekstrakcji według wynalazku i sporządzanie botanicznej substancji lekowej z jednym lub kilkoma farmaceutycznie akceptowanymi rozcieńczalnikami, nośnikami lub podłożami lub osadzanie botanicznej substancji lekowej na powierzchni farmaceutycznie akceptowanej służącej odparowaniu w celu wytwarzania kompozycji farmaceutycznej.

Odrębne botaniczne substancje lekowe można wytwarzać z indywidualnych odmian roślin konopnych mających różne zawartości kannabinoidów (np. roślin o dużej zawartości THC i dużej zawartości CBD), a następnie zmieszać lub połączyć razem przed sporządzeniem w celu wytworzenia końcowej kompozycji farmaceutycznej. To podejście jest korzystne, jeśli, na przykład, wskazane jest uzyskanie w końcowym preparacie określonego stosunku wagowego indywidualnych kannabinoidów.

Alternatywnie surowiec botaniczny z jednej lub kilku odmian rośliny konopnej o określonej zawartości kannabinoidów można zmieszać razem przed ekstrakcją jednej botanicznej substancji lekowej mającej pożądaną zawartość kannabinoidów, którą można następnie sporządzić w postaci końcowej kompozycji farmaceutycznej.

W celu wytwarzania kompozycji farmaceutycznej botaniczną substancję lekową można sporządzić z jakimikolwiek dogodnymi rozcieńczalnikami, nośnikami lub podłożami farmaceutycznie akceptowanymi. Wybór rozcieńczalników, nośników lub podłoży będzie zależał od pożądanej postaci dawkowania, która z kolei może zależeć od zamierzonej drogi podawania pacjentowi. Korzystne postacie dawkowania obejmują, inter alia, ciekłe postacie dawkowania do podawania przez urządzenia pompujące lub spraye aerozolowe, tabletki, pastylki, żele, kapsułki, czopki, proszki etc. oraz odparowywacze. Takie postacie dawkowania można wytwarzać zgodnie ze standardowymi zasadami sporządzania farmaceutycznego znanymi specjalistom w tej dziedzinie. Korzystne postacie dawkowania i sposoby wytwarzania takich postaci dawkowania są przedstawione w Międzynarodowym Zgłoszeniu zgłaszającego, które jest w trakcie postępowania patentowego PCT/GB02/00620 (WO 02/064103).

Szczególnie korzystnymi są preparaty ciekłe. Szczególnie korzystnym preparatem do podawania kannabinoidów, chociaż nie należy traktować go jako ograniczenia wynalazku, jest ciekły preparat

PL 226 646 B1 zawierający botaniczną substancję lekową, etanol i glikol propylenowy oraz ewentualnie środek aromatyzujący, taki jak olejek miętowy. Ten preparat można dogodnie podawać na błonę śluzową policzkową lub podjęzykową za pomocą sprayu pompującego. Zapewnia on skuteczną absorpcję aktywnych kannabinoidów.

Ponadto różne aspekty wynalazków są ilustrowane, jedynie przykładowo, za pomocą poniższych przykładów i załączonych Wykresów.

Wykres 1 przedstawia ubytek THC w czasie w 40°C dla wzorcowej botanicznej substancji lekowej (BDS) zawierającej THC i BDS zawierającej THC poddanej obróbce za pomocą węgla aktywnego drzewnego (oczyszczona BDS). Oś Y: ilość THC (wyrażona w procentach wartości t0), oś x: czas w miesiącach.

Wykres 2 przedstawia ubytek CBD w czasie w 40°C dla wzorcowej botanicznej substancji lekowej (BDS) zawierającej CBD i BDS zawierającej CBD poddanej obróbce za pomocą węgla aktywnego drzewnego (oczyszczona BDS). Oś Y: ilość CBD (wyrażona w procentach wartości t0), oś x: czas w miesiącach.

Wykres 3 przedstawia tworzenie się kannabinolu (CBN) w czasie w 40°C dla wzorcowej botanicznej substancji lekowej (BDS) zawierającej THC i BDS zawierającej THC poddanej obróbce za pomocą węgla aktywnego drzewnego (oczyszczona BDS). Oś Y: ilość CBN (wyrażona w procentach wartości t0), oś x: czas w miesiącach.

Skróty

Ogólnie przyjęte skróty głównych kannabinoidów są następujące:

Tetrahydrokannabinol (THC), A⁹-tetrahydrokannabinol (THC lub A⁹-THC), A⁸-tetrahydrokannabinol (A⁸-THC), odpowiednik propylowy A⁹-tetrahydrokannabinolu (THCV), kannabidiol (CBD), odpowiednik propylowy kannabidiolu (CBDV), kannabiol (CBN), kannabichromen (CBC), odpowiednik propylowy kannabichromenu (CBCV) i kannabigerol (CBG).

P r z y k ł a d 1 - Opracowanie sposobu ekstrakcji kannabinoidów z roślin konopnych

Wybór chemicznych odmian konopi

GW Pharma Ltd stworzył odrębne odmiany hybryd roślin konopnych w celu maksymalnego zwiększenia wydajności określonych składników chemicznych, kannabinoidów. Stosuje się dwa typy roślinne. Jedna odmiana chemiczna konopi wytwarza przede wszystkim THC, a druga odmiana chemiczna konopi wytwarza głównie CBD. Jednakże można otrzymać alternatywne odmiany - patrz, na przykład , zwykłe fenotypy kannabinoidów w 350 surowcach konopi, Smali i Beckstead, Lloydia, tom 36b, 1973, str. 144-156 i uprawiane z zastosowaniem technik dobrze znanych specjaliście w tej dziedzinie mających na celu maksymalne zwiększenie zawartości kannabinoidów.

Między THC i CBD istnieją podobieństwa chemiczne i strukturalne. Z powodu tych podobieństw oraz z uwagi na pochodzenie botaniczne materiałów wyjściowych przy opracowywaniu sposobów mających na celu ekstrakcję kannabinoidów można je uważać za wymienialne.

Korzystnie każdą odmianę chemiczną konopi poddaje się obróbce i kontroluje osobno w celu otrzymania dwóch odmiennych BDS. Jednak możliwe jest mieszanie materiału roślinnego z dwóch lub kilku odmian chemicznych lub stosowanie odmiany, która daje pożądany stosunek danych kannabinoidów przed ekstrakcją, a tym samym wytworzenie jednej BDS.

Wytwarzania surowca botanicznego

BDS wytwarza się z ekstraktów Cannabis sativa L. (rodzina Cannabidaceae). Konopie siewne zostały opisane w British Pharmacopoeia 1934. Konopie uprawia się na podstawie pozwolenia Ministerstwa Spraw Wewnętrznych Wielkiej Brytanii, pod kontrolą GW Pharma Ltd w Wielkiej Brytanii. Obiekty do upraw są wyposażone w zasłony i urządzenie klimatyzacyjne zapewniające pełną kontrolę (temperatura, wilgotność i oświetlenie o dużym natężeniu) tak, że możliwe jest otrzymanie w prawie identycznych warunkach kilku zbiorów upraw rocznie, co zapewnia ciągłość zaopatrzenia.

Uprawa

Rośliny konopne rozmnaża się z sadzonek pobranych z macierzystych roślin pochodzących z pojedynczego źródła siennego. A zatem rośliny wytwarza się przez rozmnażanie bezpłciowe, w którym wszystkie rośliny są żeńskie. Rozmnażanie z zastosowaniem sadzonek reguluje konsystencję genotypu.

Sadzonki sadzi się w kompoście dostarczonym w postaci nie zawierającej pestycydów. W czasie cyklu wzrostu rośliny podlewa się i stosuje się nawóz sztuczny o przedłużonym uwalnianiu. Dzięki kontrolowanym warunkom wzrostu rośliny w ciągu w przybliżeniu 12 tygodni osiągają dojrzałość.

W ciągu całego cyklu wzrostu rośliny nawadnia się jakościową wodą pitną.

W uprawie roślin konopnych nie stosuje się syntetycznych herbicydów ani pestycydów.

PL 226 646 B1

Kompost

Efektywna uprawa konopi wymaga zasilania środkami wzrostowymi absolutnie jednorodnymi.

Kompost charakteryzuje się miękką strukturą, dużą przepuszczalnością powietrzną, łatwym zwilżaniem, małą przewodnością i zbilansowanym zasobem substancji odżywczych. Kompost składa się torfu i dodanych minerałów naturalnych, w tym wapna palonego (węglany magnezu i wapnia) zapewniających regulację pH kompostu w trakcie cyklu wzrostu roślin konopnych.

Kompost zawiera odpowiedni zasób podstawowych minerałów i minimalną ilość minerałów o znanych szkodliwych działaniach ubocznych na rośliny. Niektóre minerały zawierające mangan mogą być obecne w kompoście w postaci nierozpuszczalnej i mogą być nadprogramowo uwalniane w postaci łatwo rozpuszczalnej. Kontrolowanie pH kompostu i monitorowanie nawadniania w celu uniknięcia nasycenia gruntu wodą zapewni kontrolę poziomów rozpuszczalnego manganu. Wartość pH kompostu utrzymuje się powyżej 5,5. Kompost nie zawiera pestycydów, ponieważ żadne pestycydy ani herbicydy nie są dodawane.

Nawóz sztuczny

Kompost zawiera nawóz sztuczny zidentyfikowany w dwóch odrębnych postaciach - nawóz sztuczny podstawowy i nawóz sztuczny o powolnym uwalnianiu. Dodatkowy nawóz sztuczny o powolnym uwalnianiu stosuje się do roślin w trakcie wzrostu.

Zwalczanie szkodników i chorób

W trakcie uprawy nie stosuje się żadnych sztucznych herbicydów ani pestycydów. Ostre warunki higieniczne zmniejszą dostęp szkodników i występowanie chorób.

Kontrola warunków wzrostu, obciążeń środowiskowych, takich jak susza, niedostateczne naświetlenie i niekorzystne temperatury, zmniejsza ryzyko chorób.

Regularne sprawdzanie roślin w trakcie cyklu wzrostu umożliwia wykrycie wadliwych roślin i szkodników. Mogą pojawić się wadliwe rośliny męskie, chociaż chwasty powinny być nieobecne dzięki kontrolowanym warunkom wzrostu i środowisku. W celu opanowania jakichkolwiek szkodników i chorób, które mogą się pojawić, stosuje się częste sprawdzania i biologiczne metody kontroli.

Zbiór roślin

Dzięki ścisłej kontroli warunków wzrostu rośliny konopne osiągają dojrzałość w ciągu w przybliżeniu 12 tygodni. W ostatnich tygodniach wzrostu rozwijają się zwarte żywiczne kwiaty. Pod koniec w przybliżeniu 11 tygodnia biosynteza kannabinoidowa wyraźnie zwalnia, a rośliny są gotowe do zbioru.

Całą roślinę tnie się i suszy w środowisku o kontrolowanych temperaturze i wilgotności:

- w przybliżeniu 21°C

- w przybliżeniu 38-45% RH.

Suchą roślinę ocenia się fizycznie w punkcie końcowym. THC i CBD są podstawowymi składnikami bioaktywnymi w BDS. Jednak składniki te są obecne w BRM jako kwasy karboksylowe nieaktywne biologicznie:

- THCA

- CBDA

W trakcie suszenia w czasie postacie kwasowe wolno ulegają dekarboksylacji. Liście i kwiaty usuwa się z większych łodyg w celu otrzymania surowca botanicznego (BRM).

Składowanie BRM

W warunkach składowania ubytek po wysuszeniu osiąga równowagę w przybliżeniu 10%. Warunki składowania suchego BRM będą zależeć od stanu fizycznego BRM.

Zwykłe warunki składowania BRM

- zabezpieczony przed światłem

- w przybliżeniu 15 - 25°C lub -20°C

- w przybliżeniu 38 - 45% RH

Wytwarzanie BRM w skrócie

Zbiór roślin

Suszenie (bez światła)

BRM (zawiera THCA + CBDA)

PL 226 646 B1

Mielenie w celu zmniejszenia wielkości cząstek do wielkości mniejszej niż 2000 pm

Dekarboksylacja postaci kwasowej kannabinoidów (THCA + CBDA) w celu wytworzenia obojętnych kannabinoidów (THC + CBD)

Opis typowego BRM pochodzącego z odmiany o dużej zawartości CBD ilustruje tabela 2.

T a b e l a 2

Badanie	Metoda	Opis
- A - B - C	Wizualna TLC HPLC/UV	Zgadza się Odpowiada wzorcowi (dla CBD i CBDA) Pozytywny dla CBDA
Oznaczenie CBDA + CBD	Wewnętrzna (HPLC/UV)	Nie mniej niż 90% oznaczanych kannabinoidów za pomocą powierzchni pików
Ubytek po suszeniu	Ph.Eur.	Nie więcej niż 15%
Aflakosyna*	Metoda UKAS	Nie więcej niż 4 ppb
Mikrobiologiczne:** - TVC - Grzyby - E. Coli	Ph.Eur.	Nie więcej niż 107cfg/g Nie więcej niż 105 cfg/g Nie więcej niż 102 cfg/g
Ciało obce	Ph.Eur.	Nie więcej niż 2%
Resztkowe herbicydy i pestycydy***	Ph.Eur.	Zgadza się

Metody analityczne

Identyfikacja wizualna

Makroskopowe własności umożliwiają odróżnienie cech rośliny konopnej od ewentualnych substancji użytych do zafałszowania produktu i substytutów. Jest to identyfikacja wizualna w stosunku do fotograficznego wzorca.

Identyfikacja za pomocą TLC

W celu skutecznego zidentyfikowania odmiany konopi za pomocą TLC wykorzystuje się zarówno czas retencji, jak i charakterystyczną barwę plam. W celu analizy TLC próbki laboratoryjne wytwarza się przez ekstrakcję suchego ziela. Porcje nanosi się na płytkę TLC obok próbek odniesienia dla THC i CBD. Po poddaniu działaniu odczynnika Fast Blue B THC i THCA ukazują się jako różowe plamy, natomiast CBD i CBDA są koloru pomarańczowego. Związki obojętne można odróżnić od kwasów porównując wartości Rf z wartością otrzymaną dla wzorców. Identyfikację potwierdza się przez porównanie Rf i koloru plamy próbki z wartością otrzymaną dla właściwego wzorca.

Identyfikacja za pomocą HPLC

W celu skutecznej identyfikacji odmiany konopi za pomocą HPLC wykorzystuje się porównanie czasów retencji kannabinoidów.

Konkretną metodą dla CBD i CBDA jest HPLC z odwróconymi fazami i dlatego też można stosować ją jako badanie identyfikujące. Próbki biomasy ekstrahuje się i odwirowuje się. Wykrycie wszystkich analitów dokonuje się przy 220 nm z dodatkowym potwierdzeniem analitów kwasowych przy 310 nm.

Oznaczanie (CBD + CBDA)

Oznaczenie to stosuje się w celu monitorowania zawartości CBD i CBDA w roślinie. Oznaczenie CBD i CBDA określa się stosując metodę HPLC.

Efektywność sposobu dekarboksylacji określa się dzieląc zawartość % w/w CBD przez całkowitą zawartość CBD + CBDA.

Ubytek po suszeniu

Ubytek po suszeniu ocenia się metodą pomiarową Ph.Eur.

PL 226 646 B1

Aflatoksyna

Aflatoksynę analizuje się stosując metodę akredytowaną przez Urząd Akredytujący Wielkiej Brytanii (UKAS).

Badanie mikrobiologiczne

Mikrobiologicznie roślinę ocenia się stosując metodo-logię Ph.Eur.

Ciało obce

Ciało obce ocenia się stosując metodę pomiarową Ph.Eur. Kwiaty, liście i boczne łodygi rozpościera się w postaci cienkiej warstwy na czystej powierzchni laboratoryjnej. Ciało obce oddziela się ręcznie najlepiej jak to możliwe i waży się. Wyniki wyraża się w % w/w ciała obcego w próbce ziołowej biomasy. Ciało obce może stanowić nie więcej niż 2% biomasy.

Resztkowe herbicydy i pestycydy

Rośliny konopne rosną w dobrze kontrolowanym środowisku. Nie stosuje się sztucznych herbicydów ani pestycydów lub też nie są one konieczne w trakcie uprawy.

W przypadku odmiany o dużej zawartości THC tworzy się opis ekwiwalentnego BRM (porównaj tabelę 2) i stosuje się identyczne metody analityczne, z wyjątkiem tego, że THC/THCA zastępuje

CBD/CBDA.

Dekarboksylacja

THC i CBD są podstawowymi składnikami bioaktywnymi w konopiach. Jednak składniki te są obecne w roślinach konopnych jako kwasy karboksylowe nieaktywne biologicznie. W celu ekstrakcji THC lub CBD z konopnego materiału roślinnego konieczna jest przemiana składowanych związków prekursorowych THCA i CBDA w postacie łatwiej ekstrahowalne i farmakologicznie aktywne. W stanie naturalnym kwasy THC i CBD wolno ulegają w czasie dekarboksylacji. Konwencjonalnym sposobem zwiększenia szybkości dekarboksylacji jest zastosowanie ciepła. Jednak THCA ulega przemianie nie tylko w THC, lecz również w inny kannabinoid, kannabinol (CBN).

°

THCA lub CBDA (C22H30O4) THC lub CBD (C21H30O2)

Procedurę dekarboksylacji realizuje się zwykle w ramach przygotowania materiału wyjściowego lub surowca botanicznego (BRM) przed rozpoczęciem procesu ekstrakcji.

Badania laboratoryjne - dekarboksylacja

Porcje zmielonego suchego materiału roślinnego poddano działaniu ciepła (w przybliżeniu 0,25 g o wielkości cząstek 1-2 mm). Utworzono eksperymentalny układ w skali pilotowej w celu określenia parametrów optymalnej przemiany THCA lub CBDA odpowiednio w THC i CBD, przy współistniejącym minimalnym ubytku tych powstałych związków spowodowanym termiczną degradacją do produktów termicznej degradacji, w przypadku THC jest to tworzenie się CBN.

Krótki opis materiałów i metod

Porcje (0,25 g) zmielonych (wielkość cząstek w przybliżeniu 1-2 nm) materiałów ziołowych, zarówno THCA, jak i CBDA, umieszczono w 20 ml fiolkach szklanych z fazą gazową nad roztworem i fiolki zamknięto szczelnie za pomocą uszczelek z kauczuku butylowego pokrytych teflonem z zaciskaną nasadką. Zamknięte fiolki ogrzewano w jednej z trzech temperatur w okresach czasu do 4 godzin, jak następuje: 105°C, 120°C, 140°C w ciągu 0,5, 1,0, 2,0 i 4,0 godzin.

Ogrzewanie przeprowadzono w piecu z wymuszonym obiegiem powietrza. Wykazano, że warunki w piecu miały dokładność w zakresie 0,5 - 1,0 stopnia w trzech zastosowanych temperaturach.

Po zakończeniu procesu ogrzewania reprezentatywne próbki zdekarboksylowanego zioła poddano oznaczeniom stosując techniki HPLC, GC i TLC. Wzorce THC, CBD i CBN zawarto w sekwencjach HPLC i GC.

Wyniki i dyskusje

Analiza za pomocą HPLC ekstraktów rozpuszczalnikowych wykazała zanik albo CBDA albo THCA zależnie od czasu w dwóch niższych temperaturach. W 140°C próbki we wcześniejszym punkcie czasowym po 0,5 godzinie zawierały jedynie bardzo małe poziomy wymycia piku przy czasach retencji CBDA lub THCA.

Tabele 3 i 4 przedstawiają dane HPLC określające ilościowo przemianę CBDA lub THCA w wolne związki. Podaje się również dane przedstawiające zawartość CBD lub THC i stosunek CBD/CBDA + CBD lub THC/THCA + THC. Przemianę postaci kwasów karboksylowych w odpowiednią postać zdekarboksylowaną można monitorować przez porównanie stosunku związki zdekarboksylowane/związki zdekarboksylowane plus niezdekarboksylowane z całkowitą zawartością związków

PL 226 646 B1 zdekarboksylowanych. Tak więc, gdy stosunek osiąga wartość maksymalną (>0,95), punkt wcześniejszy czas/temperatura, w którym zawartość THC lub CBD jest również maksymalna, powinien być optymalny dla procesu przemiany.

Tak więc dla zioła zawierającego CBD była odpowiednia 1 godzina w 120°C lub 0,5 godziny w 140°C.

Potwierdza to badanie chromatogramu TLC dla ekstraktów rozpuszczalnikowych, CBDA jest nieobecne po 1 godzinie w 120°C lub w każdym punkcie czasowym w 140°C.

W przypadku THC jest trzecie kryterium, tworzenie się CBN, kiedy to wskazane jest zminimalizowanie tworzenia się tego związku w trakcie termicznego procesu dekarboksylacji. Tabela 5 przedstawia dane z chromatografii gazowej (GC), z których można otrzymać stosunek CBN/THC. Wziąwszy pod uwagę jednocześnie stosunek THC/THCA + THC i maksymalną zawartość THC, minimalne tworzenie się CBN pojawia się po 0,5 godzinie lub 1,0 godzinie w 120°C. W 140°C nawet 0,5 godziny daje większą zawartość CBN niż każdy z dwóch niższych punktów czas/temperatura.

Dlatego też badania laboratoryjne wykazują optymalne warunki dekarboksylacji:

- Odmiana chemiczna wytwarzająca głównie CBD - 1 godzina w 120°C lub 0,5 godziny w 140°C.

- Odmiana chemiczna wytwarzająca głównie THC mająca na celu minimalizację tworzenia się CBN - 1 do 2 godzin w 105°C lub 1 godzina w 120°C.

Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, że faktycznie wszystkie z THCA znikły po 4 godz. w 105°C i po 1 godz. w 140°C. THCA nie jest widoczny w żadnym punkcie czasowym, gdy zioło ogrzewa się do 140°C. Mała ilość resztkowego zabarwienia przy tej wartości retencji w TLC i obecność przy małych poziomach piku zbieżnego z THCA w analizie HPLC może wskazywać raczej na mniejszą obecność kannabinoidu niż resztkowy THCA.

T a b e l a 3

Dane HPLC z dekarboksylacji materiału ziołowego CBDA

Temperatura	Czas (godziny)	CBD/CBD + CBDA	Powierzchnia piku CBD/0,1 g zioła
105°C	Zero	0,15	4769
0,5	0,22	5262
1,0	0,86	5598
2,0	0,93	5251
4,0	0,98	5242
120°C	0,5	0,91	5129
1,0	0,97	5217
2,0	0,99	5037
4,0	1,00	5200
140°C	0,5	0,96	5440
1,0	1,00	5105
2,0	1,00	5157
4,0	1,00	5005

T a b e l a 4

Dane HPLC z dekarboksylacji materiału ziołowego THCA

Temperatura	Czas (godziny)	THC/THC + THCA	Powierzchnia piku THC/0,1 g zioła
1	2	3	4
105°C	Zero	0,17	992,9
0,5	0,87	5749
1,0	0,93	5273
2,0	0,98	7734
4,0	0,99	7068

PL 226 646 B1 cd. tabeli 4

1	2	3	4
120°C	0,5	0,97	7189
1,0	0,99	6391
2,0	0,99	6500
4,0	1,00	5870
140°C	0,5	1,00	6724
1,0	1,00	5981
2,0	1,00	5361
4,0	1,00	4787

T a b e l a 5

Dane GC z dekarboksylacji materiału ziołowego THC

Temperatura	Czas (godziny)	CBN/THC (%)
105°C	Zero	2,4
0,5	3,5
1,0	4,2
2,0	3,7
4,0	5,6
120°C	0,5	3,2
1,0	4,1
2,0	6,7
4,0	11,3
140°C	0,5	5,7
1,0	13,00
2,0	17,5
4,0	23,8

Warunki dekarboksylacji dla skali seryjnej około 4 kg surowca botanicznego (BRM) są następujące.

W przybliżeniu 4 kg zmielonego BRM (albo THCA albo CBDA), który miano poddać dekarboksylacji, ogrzano wstępnie do 105°C i przetrzymywano w tej temperaturze w ciągu około 15 minut w celu odparowania jakiejkolwiek zaabsorbowanej wody i umożliwienia równomiernego ogrzania BRM. Następnie partię dodatkowo ogrzano do 145°C i przetrzymywano w tej temperaturze w ciągu około 45 minut w celu umożliwienia zakończenia dekarboksylacji o skuteczności większej niż 95%.

Czas ogrzewania BRM CBDA zwiększono do 55 minut w 145°C, ponieważ okazało się na podstawie wyników, że CBDA był nieznacznie bardziej odporny na dekarboksylację niż THCA. W partiach w skali handlowej ta różnica między CBD i THC byłaby nawet bardziej wyraźna. Czas ogrzewania BRM THC wyniósł w 145°C 45 minut.

Warunki zastosowane w skali pilotowej odzwierciedlają ściśle warunki określone jako optymalne w badaniach laboratoryjnych. Różnice można wyjaśnić przez wolniejszy i mniej efektywny przepływ ciepła przez zbiorniki i przez BRM przy większej wielkości partii w przypadku skali pilotowej.

Tabele 6 i 7 przedstawiają dane mające na celu wykazanie skuteczności dekarboksylacji mierzonej zawartościami aktywnego biologicznie kannabinoidu, THC lub CBD.

PL 226 646 B1

T a b e l a 6

Skuteczność dekarboksylacji dla BRM CBD

Numer partii CBD	% Skuteczności dekarboksylacji specyfikacja >95%
A	98,8
B	99,5
C	98,3
D	100,0
E	100,0
F	100
G	96,9
H	100,0

Wzrost wielkości partii BRM CBD od w przybliżeniu 4 kg do 6 kg spowodował potrzebę zwiększenia czasu dekarboksylacji. Czas dekarboksylacji w 145°C zwiększono z 45 minut do 90 minut.

T a b e l a 7

Numer partii THC	% Skuteczności dekarboksylacji Specyfikacja >95%
I	98,4
J	97,3
K	98,5
L	100,0
M	97,8
N	99,9
O	100,0

Podsumowanie sposobu ekstrakcji

BDS ekstrahuje się z zdekarboksylowanego BRM z zastosowaniem metody z ciekłym ditlenkiem węgla. Polega to na ciągłym przepuszczaniu ciekłego ditlenku węgla przez pociętą biomasę, która zawarta jest w wysokociśnieniowym zbiorniku. Surowy ekstrakt rozpuszcza się w etanolu, ochładza do niskiej temperatury, następnie filtruje w celu usunięcia strąconych składników, takich jak woski. Usunięcie etanolu i wody pod próżnią daje BDS zawierający duże stężenia, zależnie od zastosowanej biomasy, albo CBD albo THC.

Schemat technologiczny typowego sposobu ekstrakcji

BRM poddaje się dekarboksylacji ogrzewając do w przybliżeniu 105°C w ciągu 15 minut, a następnie do w przybliżeniu 145°C w ciągu minimum 55 minut w przypadku THCA i 90 minut w przypadku CBDA i

Ekstrakcja ciekłym ditlenkiem węgla (CO2) [klasa spożywcza] w ciągu do 10 godzin

Warunki: ciśnienie w przybliżeniu 60 bar ± 10 bar i 10°C ± 5°C i

Usunięcie CO2 przez rozszczelnienie w celu uzyskania surowego ekstraktu ⁱ

Odstearynowanie - Rozpuszczenie surowego ekstraktu w etanolu, a następnie schłodzenie roztworu (-20°C ± 5°C/do 52 godzin) w celu strącenia niepożądanych wosków i

Usunięcie niepożądanego materiału woskowego przez filtrowanie na zimno (filtr 20 nm) ⁱ

Usunięcie etanolu i wody z filtratu przez odparowanie w cienkiej warstwie pod zmniejszonym ciśnieniem (60°C ± 2°C, z parą w 40°C ± 2°C/172 mbar i 72 mbar + 4 mbar) ⁱ

BDS (Przechowywane w -20°C ± 5°C)

PL 226 646 B1

Ekstrakcja nr 1

Pierwszą fazą sposobu wytwarzania jest ekstrakcja z zastosowaniem ciekłego CO2 w warunkach podkrytycznych.

Doświadczenia wykazały, że zarówno THC, jak i CBD, mogły być wyekstrahowane z konopnego materiału roślinnego z dużą efektywnością z zastosowaniem podkrytycznego CO2, w niskiej temperaturze w przybliżeniu 10 ± 5°C, z zastosowaniem ciśnienia w przybliżeniu 60 bar ± 10 bar.

Poniższa Tabela 8 przedstawia porównawcze dane otrzymane dla BDS bogatej THC.

T a b e l a 8

Nr ładunku	Ciśnienie Bar	Temperatura °C	% w/w usuniętego wosku	% THC w/w po odstearynowaniu
Ac1202	400	60	8,2	67,2
Ac1205	400	60	6,1	67,0
Ac1206	400	60	6,1	68,0
Trzy serie	60	10	2,2-4,8	59,9-73,7
			Śr. około 3	Śr. 65%

Na podstawie wyników można stwierdzić, że ma miejsce utrata selektywności, na co wskazuje duży ciężar wosku w warunkach nadkrytycznych. Chociaż przez odstearynowanie można usunąć większe ilości wosku, obróbka jest trudna, ponieważ, na przykład, blokują się filtry.

Podobne wyniki otrzymano dla CBD.

Korzystne warunki ekstrakcji ciekłym CO2 są następujące:

Zdekarboksylowany surowiec botaniczny pakuje się do pojedynczej kolumny i poddaje się działaniu ciekłego CO2 pod ciśnieniem.

- Wielkość partii: w przybliżeniu 60 kg

- Ciśnienie: 60 bar ± 10 bar

- Temperatura: 10°C± 5°C

- Czas: w przybliżeniu 8 godzin

- Przepływ masy CO2 1250 kg/godz. + 20%.

Korzystne parametry sposobu wytwarzania BDS są następujące: czas ekstrakcji > 10 godzin, ciśnienie CO2 50-70 bar, temperatura ekstrakcji 5-15°C, masa CO2 167 kg/kg BRM.

Po rozszczelnieniu i usunięciu CO2 surowy ekstrakt BDS zbiera się w zamkniętych zbiornikach. Pierwotny BRM zmniejsza się do w przybliżeniu 10% w/w surowego ekstraktu BDS. Surowy ekstrakt BDS przechowuje się w -20°C ± 5°C.

Surowy ekstrakt BDS zawiera woski i długołańcuchowe cząsteczki. Usunięcie ich przeprowadza się za pomocą procedury odstearynowania (ekstrakcja 2), która umożliwia ogrzanie surowego ekstraktu BDS do e.g. 40°C ± 4°C w celu przeprowadzenia materiału w stan ciekły. Dodaje się etanol w stosunku 2:1 objętości etanolu do masy surowego ekstraktu BDS. Następnie roztwór etanolowy ochładza się do -20°C ± 5°C i utrzymuje w tej temperaturze w ciągu około 48 godzin.

Po zakończeniu odstearynowania strącony osad usuwa się przez filtrowanie na zimno przez filtr 20 μm.

Ekstrakcja nr 2

Drugą fazą w sposobie wytwarzania jest ekstrakcja nr 2, określana jako ''odstearynowania z zastosowaniem etanolu. Surowy ekstrakt BDS wytwarza się z Ekstrakcji nr 1 i zawiera on składniki, takie jak woski. Etanol skutecznie ekstrahuje długołańcuchowe cząsteczki z surowego ekstraktu.

Badania

Stwierdzono, że przez ogrzewanie surowego ekstraktu BDS do w przybliżeniu 40°C ulepszono zdolność mieszania surowego ekstraktu z rozpuszczalnikiem.

Korzystne było ochładzanie roztworu odstearynowania do -20°C w ciągu około 48 godzin.

Korzystne parametry sposobu wytwarzania BDS są następujące: temperaturą ekstrakcji 36-44°C, stosunek etanol:produkt w przybliżeniu 2:1, temperatura zamrażarki -25°C do -15°C, czas 48-54 godzin.

PL 226 646 B1

Filtrowanie

Roztwór etanolowy wytworzony w drugiej fazie ekstrakcji wymaga filtrowania w celu usunięcia powstałego osadu. Korzystnie wielkość filtru wynosi 20 gm.

Korzystne parametru sposobu wytwarzania BDS są następujące: całkowity czas filtrowania > 6 godzin.

Odparowanie

Końcową fazą sposobu wytwarzania jest usunięcie etanolu i wody, które mogą być obecne. Korzystnie przeprowadza się ją przez ogrzewanie w 60°C± 2°C w celu uzyskania temperatury pary 40°C ± 2°C pod próżnią 172 mbar ± 4 mbar. Destylację w tych warunkach kontynuuje się aż do momentu, gdy kondensat będzie występował w małej ilości lub nie będzie widoczny. Obniżając dodatkowo próżnię, stopniowo, do w przybliżeniu 50 mbar kończy się usuwanie wody. Po zakończeniu BDS przenosi się do zamkniętych pojemników ze stali nierdzewnej i przechowuje się w zamrażarce w 20°C ± 5°C.

Korzystne parametry sposobu wytwarzania BDS są następujące: temperatura odparowującej pary 38-42°C, usunięcie etanolu pod próżnią 167-177 mbar, usunięcie wody pod próżnią 70-75 mbar 62-58 mbar 52-48 mbar, czas <8 godzin.

Charakterystyka BDS

BDS zawierająca THC jest brązowym, lepkim, półstałym ekstraktem zawierającym co najmniej 60% składników kannabinoidowych. Składniki kannabinoidowe zawierają co najmniej 90% THC, około 1,5% CBD z pozostałością składającą się z innych drugorzędnych kannabinoidów.

Skład chemiczny konopi zbadano gruntownie identyfikując ponad 400 związków [Hendricksi in., 1975, Turner i in., 1980). Zidentyfikowano ponad 60 kannabinoidów, przy czym najliczniej występowały CBDA i THCA (prekursory CBD i THC). Zwykle składniki niekannabinoidowe stanowią do 50% ekstraktów, zależnie od sposobu ekstrakcji. Zidentyfikowane chemiczne katego rie obejmują alkany (łańcuchy z 25-30 atomami węgla), związki azotowe, aminokwasy, cukry, aldehydy, alkohole i ketony, flawanoidy, glikozydy, witaminy, pigmenty i terpeny. W konopi zidentyfikowano około 95 mono- i seskwiterpenów, które są odpowiedzialne za charakterystyczny zapach.

Wykonano znaczną pracę w celu całkowitego wyjaśnienia struktury zarówno CBD, jak i THC, (zreasumowaną w powyższych materiałach) i oba związki wytworzono syntetycznie. Z BDS pomyślnie wydzielono czysty THC w dostatecznej ilości dla zastosowania jako materiał odniesienia w celu identyfikacji i określenia ilościowego.

Zanieczyszczenia

Substancja BDS jest selektywnym ekstraktem z suchych, zdekarboksylowanych liści i kwitnących koron określonych odmian chemicznych konopi siewnych. W roślinach konopnych stwierdzono gamę ponad 400 związków, włączając ponad 60 kannabinoidów (Turner 1980). Ponieważ występują one w naturze, nie uważa się za konieczne potraktowanie jakichkolwiek z tych związków jako zanieczyszczenia. Główne zanieczyszczenia pojawiają się zatem w czterech obszarach: pestycydy wprowadzone w trakcie procesu wzrostu, alfatoksyny, jakiekolwiek nowe produkty utworzone przez dekarboksylację i materiały inne niż kannabinoidy, które stanowią BDS.

Proces wzrostu jest ściśle kontrolowany z zastosowaniem wytycznych Dobrej Praktyki Rolniczej i ma miejsce w środowisku wzrostu w zamkniętym pomieszczeniu o kontrolowanym klimacie. W czasie wzrostu nie stosuje się na rośliny pestycydów, przy czym każde zwalczanie szkodników prowadzi się za pomocą środków biologicznych. Do środowiska wzrostowego nie wprowadza się żadnych pestycydów. W celu zapewnienia tego, aby żadne pozostałości pestycydowe nie były zawarte w produkcie, środowisko wzrostu bada się okresowo pod kątem pestycydów, o których wiadomo, że są stosowane przez dostawcę środowiska wzrostu.

Po zebraniu i wysuszeniu materiału roślinnego dodatkowo bada się okresowo próbki stosując zwykły ekran pestycydowy w celu upewnienia się, że nie miało miejsca zanieczyszczenie rośliny. Ewentualne pestycydy są odpowiednio kontrolowane w fazie BRM.

Surowiec może być mikrobiologicznie zanieczyszczony, co skutkuje alfatoksynami w produkcie, chociaż aby temu zapobiec starannie kontroluje się warunki wzrostu. Dlatego też BRMi BDS bada się okresowo na zawartość alfatoksyn.

Postać THC występująca w naturze w świeżo wyrosłej roślinie jest kwasowym THCA, chociaż występują małe ilości obojętnego THC. Przed ekstrakcją THCA dekarboksyluje się przez ogrzewanie w celu otrzymania obojętnego THC. Sposób jest skuteczny, lecz mała ilość THCA pozostaje i jest to

PL 226 646 B1 monitorowane w trakcie końcowego badania BDS. Termiczna degradacja THCA i THC w trakcie procesu dekarboksylacji jest możliwa i daje CBNA i CBN. Są one monitorowane w BDS.

Składniki nie będące kannabinoidami, które stanowią część balastową BDS, obejmują woski węglowodorowe i triglicerydowe, pigmenty roślinne i terpeny. Są one wspólnymi składnikami wielu innych ekstraktów roślin leczniczych i uważa się, że mają one małe znaczenie toksykologiczne i farmakologiczne. Gama innych obecnych składników jest szeroka, lecz zwykle są one obecne jedynie w małych ilościach.

Ilość balastu zmniejsza się przez proces odstearynowania, w którym strąca się woski. Uważa się, że materiały balastowe są rozpuszczalnikiem aktywnych składników i nie są oznaczane ani kontrolowane.

T a b e l a 9

Specyfikacja dotycząca kontroli BDS o dużej zawartości w CBD

Badanie	Metoda pomiarowa	Wartości graniczne
Wygląd	Wewnętrzna	Brązowa, lepka, półstała
Identyfikacja	TLC	Plamy mają charakterystyczne Rf i barwy,
- A	HPLC/UV	w porównaniu z wzorcem CBD
- B		Pozytywny dla CBD
Zawartość CBD	Wewnętrzna (HPLC-UV)	Nie mniej niż 55% w/w ekstraktu
Powiązane kannabinoidy	Wewnętrzne	Nie więcej niż 7, 5% zawartości CBD
- zawartość THC - inne (łącznie)	(HPLC-UV)	Nie więcej niż 5% zawartości CBD
Aflatoksyna*	TBA	Nie więcej niż 4 ppb
Całkowita zawartość metali ciężkich	Ph.Eur.	Nie więcej niż 20 ppm
Rozpuszczalniki resztkowe: - Etanol	Wewnętrzna	Nie więcej niż 5% w/w
Mikrobiologiczne: ***	Ph.Eur.	Nie więcej niż 105 cfg/g
- TVC		Nie więcej niż 104 cfg/g
- Grzyby - Inne pałeczki jelitowe i pewne inne organizmy niegramujemne		Nie więcej niż 103 cfg/g
- E. Coli		Nieobecne w 1 g
- Salmonella		Nieobecne w 10 g
- S. aureus		Nieobecne w 1 g

Procedury analityczne

Identyfikacja, oznaczenie i powiązane kannabinoidy

Zawartość THC, CBD i kannabinolu (CBN) w BFM i BDS określa się ilościowo przez ekstrakcję metanolem lub metanolem/ HP chloroformem (9:1). Metodą oznaczania ilościowego jest chromatografia cienkowarstwowa wysokosprawna z odwróconymi fazami (HPLC) z detekcją UV-220 nm. Każdą analizę należy przeprowadzać w świetle bursztynowym, ponieważ wiadomo, że związki będące przedmiotem zainteresowania są światłoczułe.

Sprzęt chromatograficzny i warunki

Sprzęt

Kolumna HPLC

Kolumna wstępna

Faza ruchoma

Układ Agilent (HP) 1100 HPLC z detektorem UV o zmiennej długości fali lub detektorem Diode-Array Discovery C8 5 pm 15 cm x 0,46 cm Kingsorb C18 5 pm 3 cm x 0,46 cm

Acetonitryl : Metanol : 0,25% w/v kwas octowy (16:7:6 w stosunku objętościowym)

Temp. kolumny

25°C

PL 226 646 B1

Szybkość przepływu Detekcja

Wstrzykiwana objętość Czas przejścia

Kolejność wymywania

1,0 ml min^-1

220 nm 600 mA maksymalne wychylenie na skali - Druga długość fali 310 nm 10 gm

20-25 minut (może rozciągać się na próbki zawierające małą ilość o pikach później eluujących)

BD, CBDA, Δ⁹ THCV, CBN, Δ⁹ THC, CBC, Δ⁹ THCA

Wytworzenie wzorca

-1

Podstawowe roztwory wzorcowe CBD, CBN, Δ⁹ THC w metanolu w przybliżeniu 1 mg 1 ml^-1 przechowuje się w -20°C.

Rozcieńczone wzorce robocze (0,1 mg/ml dla Δ⁹ THC i CBD i 0,01 mg/ml dla CBN) wytwarza się w metanolu ze wzorców podstawowych i przechowuje się w temperaturze -20°C (maksymalny okres dwanaście miesięcy po początkowym wytworzeniu). Po wytworzeniu podstawowe roztwory należy rozdzielić na fiolki zawierające jednakowe objętości w celu zmniejszenia ilości wzorca poddanego działaniu temperatury pokojowej. Przed zastosowaniem analizy próbki za pomocą HPLC wymaganą liczbę wzorcowych fiolek wyjmuje się i pozwala się im na osiągnięcie równowagi w temperaturze pokojowej.

Wytwarzanie próbek

We wszystkich wytwarzaniach można stosować alternatywne masy i objętości w celu uzyskania tych samych rozcieńczeń końcowych.

Surowiec botaniczny

- Dokładnie zważyć w przybliżeniu 100 mg pociętego suchego homogenicznego materiału i umieścić w 10 ml kolbie pomiarowej.

- Rozproszyć materiał w metanolu/chloroformie (9:1 v/v) i dopełnić objętość w tym samym rozpuszczalniku.

- Ekstrahować próbkę w wannie ultradźwiękowej w ciągu 15 minut.

- Odwirowywać próbki zawierające jednakowe objętości 3000 rpm w ciągu około 2 minut.

- Rozcieńczyć metanolem 100 gm supernatantu do 1 ml w odpowiedniej fiolce próbnej do HPLC. (Może być wymagane dalsze rozcieńczenie, jeśli stężenie głównego kannabinoidu jest poza liniowym zakresem roboczym).

Zdekarboksylowany surowiec botaniczny:

Tak jak w przypadku surowca botanicznego

Botaniczna substancja lekowa

- Dokładnie zważyć w przybliżeniu 80 mg BDS i umieścić w 50 ml kolbie pomiarowej.

- Rozpuścić BDS i dopełnić objętość metanolem.

- Rozcieńczyć metanolem 100 gm wytworzonego supernatantu do 1 ml w odpowiedniej fiolce automatycznego podajnika próbek do HPLC.

Procedura chromatograficzna

Próbki umieszcza się na stojaku automatycznego podajnika próbek w celu wprowadzenia w listę sekwencyjną w Agilent chemstation. W celu uzyskania danych ilościowych i czasów retencji stosuje się roztwory wzorcowe. Można je zwykle wstrzykiwać dwukrotnie lub trzykrotnie przed wstrzykiwaniem roztworów próbek, a następnie pojedynczo w odpowiednich przedziałach czasu w trakcie przebiegu, przy maksimum 10 próbek do badań między wzorcami.

Chromatograficzne kryteria kwalifikujące

T a b e l a 10

Wartości czasów retencji i względnych czasów retencji (RRT) względem Δ⁹ THC dla każdego analitu

Kannabinoid	Czaa retencji (minuty)	RRT(THC)
1	2	3
CBD	5,1-5,8	0,58
CBN	7,4-8,3	0,83

PL 226 646 B1 cd. tabeli 10

1	2	3
Δ9 THC	9,0-10,0	1,00
CBDA	5,5-6,2	0,615
Δ9 THCV	5,9-6,6	0,645
CBC	11,6-12,8	1,30
Δ9 THCA	14,6-16,0	1,605

T a b e l a 11

Kształt piku (współczynnik symetrii według metody British Pharmacopoeia)

Kannabinoid	Współczynnik symetrii
CBD	< 1,30
CBN	< 1,25
Δ9 THC	< 1,35

Obliczenie

Surowiec botaniczny

Poniższe równanie stosuje się w celu otrzymania wyniku dotyczącego czystości głównego kannabinoidu jako % aktualnie oznaczanych kannabinoidów (CBD, CBDA, CBN, Δ⁹ THC i Δ⁹ THCA) w partii.

Dla materiałów o dużej zawartości Δ⁹ THC:

suma powierzchni pików THC i THCA suma powierzchni pików oznaczanych kannabinoidów

W przypadku materiału o dużej zawartości CBD, CBD i CBDA zastępują w górnej linii równania THC i THCA.

Zdekarboksylowany surowiec botaniczny

Poniższe równanie stosuje się w celu obliczenia wydajności procesu dekarboksylacji:

Dla materiałów o dużej zawartości Δ⁹ THC:

% wydajności dekarboksylacji powierzchnia piku THC suma powierzchni pików THC i THCA xl00

W przypadku materiału o dużej zawartości CBD, CBD i CBDA zastępują w równaniu THC i THCA.

Botaniczna substancja lekowa

Poniższe równania stosuje się w celu obliczenia stężenia próbki substancji lekowej, stężenia kannabinoidów w indywidualnej próbce, zawartości procentowej oznaczanych kannabinoidów w substancji lekowej, ilości głównego kannabinoidu jako % aktualnie oznaczanych kannabinoidów i ilości głównego kannabinoidu w całej masie ekstrahowanej substancji lekowej.

Dla materiału o dużej zawartości Δ⁹ THC:

masa próbki

Stężenie próbki substancji lekowek = ------współczynnik rozcieńczenia gdzie współczynnik rozcieńczenia = 50 x 10 = 500

Stężenie THC próbki stęż, wzorca x śr. pow. próbki THC średnia powierzchnia wzorca THC % w/w zawart. THC substancji lekowej = stężenie próbki THC stężenie próbki substancji lekowej

PL 226 646 B1

CBD i CBN można podstawić do wszystkich z tych równań zamiast Δ⁹ THC w celu otrzymania wyników ilościowych dla obu substancji. Δ⁹ THCA i CBDA oblicza się również stosując wzorcowe stężenia dla Δ⁹ THC lub CBD przy braku własnych określonych wzorców odniesienia.

Odnośne substancje określa się jako sumę średnich wartości % w/w CBN, Δ⁹ THC i CBDA.

THC jako % całości oznaczanych kannabinoidów % w/w zawart. THC suma % w wszystkich oznaczanych kannabinoidów

Otrzymuje się całkowitą ilość Δ⁹ THC obecnego w całym ekstrakcie substancji lekowej.

P r z y k ł a d 2 - Analiza stabilizowania botanicznej substancji lekowej (BDS) przez częściowe oczyszczanie za pomocą węgla aktywnego drzewnego

Wyniki pochodzące z badań stabilności preparatów THC wskazują na to, że THC w postaci BDS jest nietrwały nawet w temperaturach przechowywania tak niskich jak 5°C. Kontrastuje to z zachowaniem oczyszczonego THC (Dronabinol USP) w miękkich żelowych kapsułkach Marinolu, dla których przyjmuje się w przechowywalność 2 lat w dość niskiej temperaturze otoczenia. Należy również zauważyć stwierdzenie, że przechowywalność roztworów wzorcowych THC w metanolu dostarczanych przez Sigma-Aldrich wynosi 4 lata, gdy są przechowywane schłodzone i chroni się je przed światłem.

Ta oczywista rozbieżność między stabilnością BDS (THC) i oczyszczonym THC skłoniła do spekulacji, że pewien składnik BDS destabilizował główny kannabinoid.

Rozwiązaniem tego problemu byłoby oczyszczanie BDS (THC) w celu uzyskania dużej czystości, korzystnie krystalicznego kannabinoidu. Jednakże dodatkowe koszty obróbki związane z przetworzeniem BDS w czysty kannabinoid znacznie zwiększyłyby koszt gotowych produktów farmaceutycznych zawierających kannabinoid.

W związku z tym zgłaszający usiłował opracować etap prostego oczyszczania, w którym wytworzono by BDS o większej stabilności, lecz który nie zwiększyłby nadmiernie kosztów obróbki.

Zgłaszający ustalił, że etap oczyszczania za pomocą węgla aktywnego drzewnego można dogodnie prowadzić w ścisłym połączeniu z procesem odstearynowania przez przepuszczanie w jednym etapie roztworu etanolowego poddawanego odstearynowaniu przez warstwę filtracyjną w celu usunięcia strąconych wosków, a następnie bezpośrednio przez kolumnę z węglem aktywnym drzewnym, oraz że zastosowanie węgla aktywnego drzewnego znacząco poprawia przechowywalność.

Szczegóły doświadczalne

Roztwory albo BDS (THC) albo BDS (CBD) o stężeniu 100 mg/ml w etanolu absolutnym BP przepuszczono przez kolumnę z wypełnieniem w postaci węgla aktywnego drzewnego i zebrano eluat. Następnie rozcieńczono je dodatkowym etanolem absolutnym w celu osiągnięcia stężenia około 25 mg/ml kannabinoidu. Następnie roztwór przeniesiono do 10 ml fiolki typu AX1 (i.e. ze szkła brunatnego) i zamknięto zacisk. Próbki te określono jako BDS oczyszczana węglem aktywnym drzewnym.

Próbki roztworów BDS (THC) i BDS (CBD), których nie przepuszczono przez kolumnę z węglem aktywnym drzewnym, podobnie rozcieńczono w celu zapewnienia stężenia kannabinoidów 25 mg/ml, a następnie zamknięto we fiolce ze szkła brunatnego tego samego typu. Próbki te określono jako BDS wzorcowa i służyły one jako próbki kontrolne do badania stabilności.

Fiolki zawierające BDS wzorcową i BDS oczyszczoną za pomocą węgla aktywnego drzewnego każdego typu przechowywano w inkubatorze stabilności w 40°C, a następnie próbki okresowo wyjmowano w ciągu 1-12 miesięcy do analizy za pomocą HPLC zawartości kannabinoidów i określania za pomocą TLC profilu.

W analizie TLC z normalnymi fazami zastosowano następujące warunki:

Faza nieruchoma żel krzemionkowy G

Faza ruchoma 80 : 20 heksan/aceton

Rozwijanie 2 x 8 cm i.e. podwójne rozwijanie

Wizualizacja kąpiel w 0,1% w/v Fast Blue B (wod.)

W analizie TLC z odwróconymi fazami zastosowano następujące warunki:

Faza nieruchoma: powlekany żel krzemionkowy C18

Faza ruchoma 6 : 7 : 16 0,25% v/v kwas octowy (wod.)/metanol/acetonitryl

PL 226 646 B1

Rozwijanie 2 x 8 cm i.e. podwójne rozwijanie

Wizualizacja kąpiel w 0,1% w/v Fast Blue B (wod.)

Dla każdej próbki na płytce TLC zastosowano objętość roztworu zawierającego w przybliżeniu ąg całego kannabinoidu.

Wyniki i dyskusja

Roztwory etanolowe BDS (THC) wzorcowej i BDS (CBD) wzorcowej są dość intensywnie żółte. Przejście roztworów BDS przez węgiel aktywny drzewny skutecznie odbarwiło roztwory, przypuszczalnie przez adsorpcję pigmentów roślinnych koekstrahowanych z kannabinoidami w czasie wytwarzania BDS z ziela konopnego za pomocą ekstrakcji ciekłym CO2.

Wyniki analizy HPLC dla różnych roztworów BDS podane są w poniższej tabeli 12. Są one również przedstawione w postaci graficznej (Wykresy 1-3). Wszystkie dane podaje się w % oznaczenia tO. Wartości CBN podane są dla roztworów BDS (THC), ponieważ ten związek zidentyfikowano jako wskaźnik termicznej degradacji THC w poprzednich badaniach stabilności.

T a b e l a 12

Wartości oznaczania kannabinoidów dla roztworów BDS wzorcowych i oczyszczonych w ciągu 1-12 miesięcy w 40°C

Miesiące		1	4	6	12
BDS wzorcowa	THC	97,3%	92,4%	85,3%	74,0%
(THC)	CBN	104%	119%	133%	154%
BDS Oczyszczona	THC	102,9%	107,4%	96,0%	88,6%
(THC)	CBN	94%	111%	111%	120%
BDS wzorcowa (CBD)	CBD	100,3%	103,6%	93,3%	91,0%
BDS oczyszczona (CBD)	CBD	101,0%	100,7%	97,2%	96,9%

Z powyższych danych wynika całkiem wyraźne, że zarówno w przypadku BDS (THC), jak i BDS (CBD), istnieje pewien składnik balastu, który można usunąć za pomocą węgla aktywnego drzewnego, który destabilizuje kannabinoidy.

Porównanie poziomów degradacji osiągnięte po 12 miesiącach w 40°C dla BDS wzorcowej i odpowiedniej BDS oczyszczonej za pomocą węgla aktywnego drzewnego wykazuje, że zarówno dla ekstraktów THC, jak i ekstraktów CBD, oczyszczanie za pomocą węgla aktywnego drzewnego zwiększa odporność na termiczną degradację o ponad 50%.

Co się tyczy BDS (THC) stwierdzono wzrost poziomu CBN jako funkcję ubytku głównego kannabinoidu (Wykres 3). Tak jak zaobserwowano to w przypadku innych preparatów zawierających THC, potwierdza się ponownie, że poziom CBN jest wskaźnikiem termicznej degradacji.

Porównanie między obszarami kannabinoidowymi chromatogramów HPLC próbek BDS (CBD) wzorcowej i BDS (CBD) oczyszczonej po 12 miesiącach w 40°C (dane nieprzedstawione) nie ujawnił żadnej znaczącej informacji. Jednakże podobne porównanie chromatogramów HPLC BDS (THC) wzorcowej i oczyszczonej po degradacji dostarczyło informacji.

CBN był w większej ilości w bardziej zdegradowanej BDS wzorcowej nieoczyszczonej, lecz zaobserwowano również drugi znaczący produkt degradacji, który ponownie jest obecny w obu próbkach, lecz który występuje w większej ilości w bardziej zdegradowanej próbce. Ponownie widmo tego produktu degradacji było zasadniczo identyczne z widmem CBN i na bazie jego, a czas retencji okazał się być jednym z czasów retencji odpowiedników CBN.

Wniosek

Poprzez prostą obróbkę za pomocą węgla aktywnego drzewnego uzyskuje się znaczącą poprawę odporności na termiczną degradację.

P r z y k ł a d 3 - Efekt dodania środka modyfikującego w ekstrakcji CO₂ konopnego materiału roślinnego

Poniższy przykład przedstawia badanie wpływu dodania polarnego współrozpuszczalnika na własności ekstraktu wytworzonego z konopnego materiału roślinnego (odmiana chemiczna G5) przy zastosowaniu ekstrakcji ciekłym CO2 i ilustruje różnice selektywności uzyskane przy zastosowaniu subkrytycznej ekstrakcji CO2 w stosunku do ekstrakcji nadkrytycznej.

PL 226 646 B1

Szczegóły doświadczalne

Doświadczenia ekstrakcyjne przeprowadzono stosując urządzenie do ekstrakcji CO2 o pojemności 1 litra. Jako rozpuszczalniki zastosowano spożywczy CO2 i etanol absolutny klasy BP.

Zastosowano partię konopi G5 (odmiana chemiczna o dużej zawartości CBD). Zawartość CBD wyniosła 7,3% w/w po dekarboksylacji. Analizę zawartości kannabinoidów w ekstraktach przeprowadzono za pomocą HPLC.

Wyniki i dyskusja

Dane dotyczące kompozycji końcowego ekstraktu otrzymanego po 4-godzinnym okresie ekstrakcji w określonych warunkach przedstawia się poniżej w tabeli 13.

T a b e l a 13

Skład i dane dotyczące wydajności dla ekstraktów wytworzonych w różnych warunkach ekstrakcji

Próbka	Warunki ekstrakcji	% w/w ekstrakt	% CBD (w/w)	% uzysku CBD
AC470	10°C/60 bar	8,45	63,65	72,9%
AC471	40°C/100 bar	10,7%	54,4	579,5%
AC472	40°C/100 bar + 2% etanol	10,3%	64,65	91,0%

Efektywność uzysku opiera się na CBD dostępnych w zdekarboksylowanym materiale roślinnym załadowanym do zbiornika dla każdej ekstrakcji.

Wyniki ilustrują to, że zmiana warunków ekstrakcji z podkrytycznych na nadkrytyczne zwiększa zdolność solwatującą CO2 i daje w rezultacie wyższy uzysk dostępnych CBD. Jednakże nadkrytyczny CO2 może teraz rozpuszczać szerszą gamę związków, a ekstrakcja tego dodatkowego związku powoduje zmniejszenie stężenia CBD w ekstrakcie do tego stopnia, że jest ono teraz mniejsze niż stężenie uzyskane w ekstrakcji podkrytycznej. A zatem marginalny dodatkowy uzysk dostępnego CBD z surowca nie rekompensowałby tej wady i jest dowodem na to, że stosowanie warunków nadkrytycznych nie jest wskazane.

Dodanie 2% w/w etanolu absolutnego do nadkrytycznego CO2 jako środka modyfikującego zwiększa uzysk dostępnego CBD do >90%. Przypuszczalnie względnie polarny kannabinoid jest bardziej rozpuszczalny w ekstrakcie o zwiększonej polarności.

Co jest interesujące, przez dodanie polarnego środka modyfikującego nieznacznie zwiększa się stężenie CBD w ekstrakcie. To wydawałoby się wskazywać na to, że materiał niekannabinoidowy ulegający współekstrahowaniu obecny w materiale roślinnym jest mniej polarny niż docelowy kannabinoid, a zatem ekstrakcję tego materiału (balast) odrzuca się, gdy zwiększa się polarność. Tak więc, ekstrakcja konopnego materiału roślinnego nadkrytycznym CO2 + 2% w/w etanolem zapewnia wzrost uzysku docelowego związku aktywnego bez towarzyszącej wady w postaci utraty selektywności.

Podsumowanie

1. Przejście od warunków podkrytycznych do nadkrytycznych przynosi małą korzyść co się tyczy całkowitego uzysku kannabinoidu z surowego materiału, lecz skutkuje wadą w postaci zmniejszenia zawartości aktywnej ekstraktu.

2. Dodanie do nadkrytycznego CO2 środka modyfikującego - 2% etanolu absolutnego - daje w rezultacie znaczną poprawę w uzysku kannabinoidu z surowca, bez wady w postaci rozcieńczenia aktywnej zawartości przez materiał współekstrahowanym.

Claims (1)

1. Botaniczna substancja lekowa, którą można otrzymać z surowca botanicznego z rośliny konopnej o dużej zawartości tetrahydrokanabinolu (THC), znamienna tym, że wyżej wspomniana botaniczna substancja lekowa jest ekstraktem z rośliny konopnej o dużej zawartości THC zawierającym co najmniej 60% składników kanabinoidowych i mniej niż 40% składników nie-kanabinoidowych, nie więcej niż 5% CBD w/w w stosunku do zawartości THC i nie więcej niż 5% kannabinoidów innych niż THC i CBD w % w/w w stosunku do zawartości THC, przy czym składniki kanabinoidowe zawierają co najmniej 90% THC a składniki