PL219734B1

PL219734B1 - Lek przeciwnowotworowy, sposób jego wytwarzania oraz sposób jego stabilizacji

Info

Publication number: PL219734B1
Application number: PL394863A
Authority: PL
Inventors: Ilima Iliodorovna Volchenskova; Nadezhda Nikolaevna Maydanevich
Original assignee: Sokyrko Oleg Sergeevich
Priority date: 2008-12-22
Filing date: 2009-11-23
Publication date: 2015-07-31
Also published as: BRPI0923273A2; IL213446A0; IL213446A; WO2010074662A1; EA201100618A1; TR201104008T1; PL394863A1; CN102227222A; EA015680B1; BG66625B1; BG110926A; CN102227222B

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy medycyny, bardziej szczegółowo leków przeciwnowotworowych na bazie wodnego roztworu związków platyny, który można stosować do leczenia nowotworów złośliwych, a także dotyczy sposobów wytwarzania tych leków i ich stabilizacji.

Wśród leków przeciwnowotworowych szeroko stosowanych w praktyce medycznej, jedne z najbardziej skutecznych opierają się na wodnym roztworze monomerycznego kompleksu cisplatyny. W tych lekach jon platyny działa jako składnik aktywny, skoordynowany z takimi nośnikami ligandów, które są absorbowane przez komórki nowotworowe praktycznie z tą samą intensywnością, co przez normalne komórki. Z tego powodu leki zawierające cisplatynę charakteryzują się nie tylko wysoką aktywnością przeciwnowotworową, ale także wysoką toksycznością.

Nie mniej aktywne, ale o wiele mniej toksyczne leki przeciwnowotworowe opierają się na wodnym roztworze polimerycznego kompleksu platyny z kwasem deoksyrybonukleinowym (Pt-DNA) reprezentującym produkt reakcji cisplatyny i DNA, w którym jeden z ligandów - nośników jonu platyny jest nukleotydem wbudowanym w strukturę dwuniciowej spirali makrocząsteczek DNA, intensywnie absorbowanych przez szybko namnażające się komórki nowotworowe i w związku z tym leki przeciwnowotworowe zawierające wiązanie Pt-DNA działają na tkanki nowotworowe z wysokim stopniem selektywności i przy nieznacznym uszkodzeniu normalnych komórek [Treatment of nonresectable tumors of organs of an abdominal cavity. S.A. Shalimov, etc. 1998, p. 103].

Monomeryczny kompleks cisplatyny i polimeryczny kompleks Pt-DNA, które są podstawowymi substancjami w lekach, nie są dostatecznie rozpuszczalne i są chemicznie niestabilne w wodzie. Zatem do leków dodaje się dodatki farmaceutyczne w oparciu o ich wodne roztwory. Jako dodatki wykorzystują one farmaceutycznie dopuszczalne sole, regulatory pH i inne czynniki stabilizujące, korzystnie te, które kosztem ich własnej aktywności biologicznej wykazują równocześnie zdolność do zwiększania rozpuszczalności i stabilności chemicznej substancji podstawowej, umożliwiają zapewnienie skuteczności leczenia przy większej tolerancji.

Znany lek przeciwnowotworowy opiera się na wodnym roztworze pochodnej platyny z polianionem kwasu deoksyrybonukleinowego in situ (Pt-DNA) (substancja aktywna), który zawiera niezwiązane makrocząsteczki Pt-DNA posiadające rozmiar 0.05-0.15 mikronów w największym wymiarze, chlorek sodu, cytrynian sodu, chlorek amonu i fluorouracyl pod postacią soli sodowej (substancja pomocnicza) przy stosunku składników w roztworze wodnym, w % wagowych:

Pt-DNA - 0.130 - 0.153 chlorek sodu - 0.080 - 0.090 cytrynian sodu - 0.040 - 0.053 chlorek amonu - 0.015 - 0.018 fluorouracyl pod postacią soli sodowej - 0.025 - 0.370

[zob. ukraińskie zgłoszenie patentowe Nr 70 456, opublikowane 15.10.2004, zgłaszający Shalimov S.O., Voltchenskova I.I., Maidanevitch N.M.].

Jak pokazały badania, wodny roztwór znanego leku posiada pH wynoszące 6.5-7.5 i gęstość ₃ wynoszącą 1.0012-1.0016 g/sm³, przy której nie powiązane cząsteczki związku Pt-DNA posiadają najwyższą aktywność przeciwnowotworową, a fluorouracyl posiada zdolność wzmacniania tej aktywności i zmniejszania toksyczności pochodnej platyny, jeśli otrzymaną substancję utrzymuje się w zakresie temperatur powyżej 35°C. Zmniejszenie temperatury sprzyja wchodzeniu zasad cząsteczek Pt-DNA w oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe o charakterze kooperacyjnym z większą intensywnością niż w oddziaływania międzycząsteczkowe z odpowiednimi anionami fluorouracylu soli sodowej. W rezultacie przestrzenne struktury cząsteczek Pt-DNA są nieodwracalnie skondensowane. Wewnątrzcząsteczkowa kondensacja struktur, które zawierają bardzo małe atomy platyny z gęstością wy₃ noszącą 21.45 g/sm³ prowadzi do zmniejszenia struktur przestrzennych cząsteczek Pt-DNA do takich rozmiarów, że ich gęstość płynu przekracza gęstość roztworu i osadzają się grawitacyjnie pod postacią luźnego osadu.

Zatem aniony fluorouracylu są bardziej podatne na oddziaływania z protonami roztworu niż z zasadami Pt-DNA i w związku z tym przechodzą w stan neutralnych cząsteczek swojej własnej zasady, których rozpuszczalność w wodzie jest ograniczona i które osadzają się pod postacią kryształów i rozpuszczają przy wzroście temperatury. Sedymentacja substancji aktywnych i pomocniczych powoduje redukcję ich stężenia w czynnym roztworze, zmniejszając jego aktywność przeciwnowotworową

PL 219 734 B1 i moc terapeutyczną oraz ogranicza jej użycie wyłącznie do podawania miejscowego i wlewów dootrzewnowych, z wyłączeniem wlewów dożylnych i dotętniczych oraz drogi podawania śródmiąższowo.

Zasada fluorouracylowa jest znana z zastosowania jako strukturalny fragment tegafuru - prekursora fluorouracylu w organizmie - do przygotowania kompozycji przeciwnowotworowej zawierającej tegafur i uracyl w stosunku molowym 1:4 [patent USA 5534513, IPC 7 A61K 31/505, zgłaszający TAIHO PHARMACEUTICAL_CO LTD (JP), opublikowany 1996-07-09].

Mocznik jest znany z zastosowania jako diuretyk, keratolityk, czynnik zmniejszający ciśnienie wewnątrzczaszkowe i oftalmotoniczne [M.M.Turkevich. Pharmaceutical chemistry, 1973, p. 45], a także jako zaróbka dodawana do stałych postaci dawkowania do podawania doustnego.

Wysokie stężenie mocznika i wzrost pH powyżej 11 stosowane są do rozplatania skondensowanych nici naturalnego dwuniciowego DNA [A.Lenindzher. Biochemistry, 1976, strona 737].

Wodorotlenek sodu jest znany z zastosowania w farmacji do kontroli pH roztworów czynników terapeutycznych. Ponadto wiadomo, że pod wpływem wysokich stężeń mocznika i przy pH>11.0 rozplatają się podwójne nici naturalnego DNA [Lenindzher. Biochemistry, 1976, strona 737].

Jednakże we wskazanych źródłach nie powiedziano nic na temat zastosowania uracylu, mocznika i wodorotlenku sodu jako czynników zapobiegających wewnątrzcząsteczkowej kondensacji skondensowanych nici związków metali z DNA. Nie wiadomo też o zastosowaniu mocznika w postaciach dawkowania leków do podawania pozajelitowego. Skuteczne zakresy stężenia i stosunek substancji aktywnej, fluorouracylu i soli w wodnym roztworze zastrzeganego leku odpowiadają stosunkom określonym przy opracowaniu dobrze znanego leku do wlewów dootrzewnowych, dożylnych i dotętn i czych, które utrzymuje się w temperaturze 35-40°C. Zakresy stężeń uracylu i mocznika wyznacza się poprzez stosunek molowy fluorouracylu, uracylu i mocznika 1:1:1. Zakresy stężenia wodorotlenku sodu są ograniczone od dołu wartością pH, która wyklucza możliwość protonacji fluorouracylu, a od góry - wymogami farmaceutycznymi.

Istnieje inny znany sposób otrzymywania leku przeciwnowotworowego poprzez przechowanie nici DNA przez 16-26 godzin w roztworze soli cytrynianu, który zawiera chlore k sodu i cytrynian sodu, rozpuszczanie nici przez mechaniczne mieszanie i ogrzewanie roztworu DNA do 70-90°C, stopniowe wprowadzanie roztworu soli cytrynianowej cis-dichlorodiaminoplatyny (DDP) ogrzanego do tej samej temperatury do podgrzanego roztworu DNA, dodanie wodnego roztworu soli sodowej fluorouracylu do mieszaniny i termostatyczną kontrolę mieszaniny roztworów DNA i DDP w 70-90°C przez 15-20 minut [zob. ukraińskie zgłoszenie patentowe Nr 70 456, opublikowane 15.10.2004, zgłaszający Shalimov S.O., Voltchenskova I.I., Maidanevitch N.M.].

Dodanie wodnego roztworu soli sodowej fluorouracylu do mieszaniny roztworów DNA i DDP przed kontrolą termostatyczną nie sprzyja intensyfikacji oddziaływań wewnątrzcząsteczkowych cząsteczek Pt-DNA z powiązanymi cząsteczkami roztworu i osłabieniu w nich wewnątrzcząsteczkowych oddziaływań o charakterze kooperacyjnym i nie wyklucza możliwości oddziaływania anionów fluorouracylu z protonami roztworu w temperaturach niższych niż 35°C. Oto dlaczego dobrze znany sposób nie zapobiega nieodwołalnej kondensacji wewnątrzcząsteczkowej przestrzennych struktur Pt-DNA i nie koliduje z protonacją anionów fluorouracylu. Aby uniknąć tych zjawisk konieczne jest przeprowadzenie dodatkowych operacji technologicznych wprowadzenia do roztworu leku związków, które podnoszą ich pH, jak również gęstość, przed kontrolą termostatyczną. Ponadto zastosowanie reagentu przeciwnowotworowego otrzymanego na dobrze znanej drodze jest możliwe tylko w temperaturze 35-37°C, ponieważ spadek temperatury zmniejsza aktywność czynnika. Dodatkowo wysoka temperatura czynnika komplikuje jego przechowywanie, transport i zastosowanie.

Istnieje znany sposób stabilizacji leku przeciwnowotworowego opartego na wodnym roztworze cisplatyny o stężeniu wynoszącym 0.1-1.0 mg/ml, w którym wykorzystuje się chlorek sodu w ilości

1- 20 mg/ml, kwas chlorowodorowy aż do pH wynoszącego 2.0-3.0 i mannitol (diuretyk) w ilości

2- 150 mg/ml [patent ZSRR 1192596 A, opublikowany 15.11.85].

Istnieją znane wodne roztwory związku Pt-DNA stabilizowanego chlorkiem sodu i cytrynianem sodu (czynnik zapobiegający krzepnięciu krwi) w ilościach odpowiadających stosunkowi molowemu platyny, fosforu DNA, chlorku sodu i cytrynianu sodu 4:6:30:3 [patent ukraiński 60597. Opublikowany 15.07.05; 61543, opublikowany 15.08.05; 66476 A, opublikowany 17.05.04].

Jednakże najbardziej skutecznymi i najmniej toksycznymi lekami na bazie wodnego roztworu (pochodnych) Pt-DNA są związki (pochodne) opisane powyżej w patencie ukraińskim 70456. Są one stabilizowane chlorkiem sodu, cytrynianem sodu, chlorkiem amonu (lekiem powodującym działanie

PL 219 734 B1 wykrztuśne i wzmacniającym działanie diuretyny) i dodatkowo czynnikiem stabilizującym - solą sodową fluorouracylu we wskazanym powyżej stosunku składników w roztworze.

Sól sodowa fluorouracylu wzmacnia działanie przeciwnowotworowe i osłabia toksyczne podstawowej substancji i może działać zarówno jako modulator działania farmakologicznego makrocząsteczek Pt-DNA w organizmie i stabilizator stężenia makrocząsteczek Pt-DNA w wodnym roztworze leku.

Jednakże wodny roztwór związku Pt-DNA w znanych lekach posiada pH 6.5-7.5, przy którym zastosowanie soli sodowej fluorouracylu pozwala stabilizować stężenie Pt-DNA w roztworze w temperaturze powyżej 35°C. Spadek temperatury sprzyja wypływowi makrocząsteczek związku Pt-DNA z roztworu pod postacią luźnego osadu i sól sodowa fluorouracylu pod postacią kryształów zasady fluorouracylowej, który powoduje zmniejszenie stężenia substancji podstawowej i czynnika stabilizującego w roztworze medycznej postaci dawkowania leku i negatywnie wpływa na jego działanie przeciwnowotworowe i skuteczność terapeutyczną. Ponadto ogranicza on warunki przechowywania i możliwości zastosowania do zastosowań miejscowych i wlewów dootrzewnowych, wykluczając wlewy dożylne i dotętnicze, iniekcje endolimfatyczne i drogę podawania do śródmiąższowo.

Nie ma danych o zastosowaniu fluorouracylu, uracylu i zasady mocznikowej w sposób samoczynny lub w mieszaninie ze sobą lub o użyciu regulatorów pH jako czynników, które wpływają na alokację makrocząsteczkowych związków metali z DNA z roztworu. Nie ma także danych o zastosowaniu mocznika w medycznych postaciach dawkowania do podawania pozajelitowego.

Skuteczne zakresy stężeń oraz stosunek substancji podstawowej i soli w wodnym roztworze stabilizowanym w zastrzegany sposób odpowiadają stężeniom i stosunkom stwierdzonym przy opracowaniu znanego sposobu otrzymywania związku Pt-DNA w wodnym roztworze do wlewów dootrzewnowych, dożylnych i dotętniczych, które mają pH 6.5-7.5 i są utrzymywane w temperaturze 35-40°C. Zakresy stężenia fluorouracylu, uracylu i zasady mocznikowej wyznacza się poprzez stosunek molowy nukleotydu Pt-DNA. Fluorouracyl, uracyl i zasady mocznikowe wynoszą 1:(6-12): (0.6-1.2):(0.6-1.2). Zakresy stężenia regulatora pH są ograniczone od dołu wartościami, które wykluczają możliwość krystalizacji zasady fluorouracylowej, a od góry - wymogami farmaceutycznymi.

Oferowany sposób stabilizacji nie pozwala makrocząsteczkom Pt-DNA i zasady fluorouracylowej na wypływanie z roztworu, co z kolei zapewnia możliwość otrzymywania leków przeciwnowotworowych o takim stężeniu składników, które nie zmienia ich medycznych postaci dawkowania w temperaturze konserwacji w przedziale 25-5°C przy długim przechowywaniu.

W oparciu o powyższe, istnieje określony zakres problemów, które ma rozwiązać niniejszy wynalazek.

Jeden z problemów polega na stworzeniu leku przeciwnowotworowego, w którym poprzez dodanie do znanego czynnika uracylu, mocznika i wodorotlenku sodu otrzymamy możliwość zapobiegania wewnątrzcząsteczkowej kondensacji podstawowej substancji i protonowania substancji pomocniczej, zapobiegając tym samym ich osadzaniu i zmniejszeniu ich stężenia w roztworze w zakresie temperatur 25-15°C i osiągnięcie zwiększenia aktywności przeciwnowotworowej i skuteczności terapeutycznej leku i rozszerzenie jego zastosowania.

Drugi problem polega na opracowaniu sposobu otrzymywania leku przeciwnowotworowego, w którym poprzez zastosowanie wodnych roztworów uracylu, mocznika i wodorotlenku sodu w odpowiednich warunkach technologicznych osiągniemy atenuację intensywności oddziaływań wewnątrzcząsteczkowych o charakterze kooperacyjnym w cząsteczkach Pt-DNA, z jednej strony. Z drugiej strony, otrzymamy rozszerzenie intensywności oddziaływania ich zasad z odpowiednimi cząsteczkami w roztworze, mianowicie z fluorouracylem, uracylem i mocznikiem, co daje możliwość stworzenia leku zawierającego aktywną substancję Pt-DNA, której cząsteczki nie są skondensowane, przy równoczesnym konserwowaniu gotowego do użycia leku w zakresie temperatury 25-15°C, co z kolei zapobiega osadzaniu się makrocząsteczek z roztworu.

Trzeci problem polega na znalezieniu sposobu stabilizacji leków przeciwnowotworowych na bazie wodnego roztworu związku platyny o zwiększonym zróżnicowaniu specyficznego działania i zwiększonej skuteczności terapeutycznej.

Oferowany wynalazek rozwiązuje wskazane problemy.

Przedmiotem wynalazku jest lek przeciwnowotworowy na bazie wodnego roztworu pochodnej platyny z polianionem kwasu deoksyrybonukleinowego (Pt-DNA), który zawiera niezwiązane makrocząsteczki Pt-DNA o rozmiarze 0,05-0,15 mikronów w największym wymiarze, chlorek sodu, cytrynian sodu, chlorek amonu i fluorouracyl pod postacią soli sodowej, charakteryzujący się tym, że zawiera

PL 219 734 B1 dodatkowo uracyl i mocznik w stosunku molowym fluorouracylu, uracylu i mocznika 1:1:1 w stosunku składników w roztworze wodnym, w % wagowych:

Pt-DNA chlorek sodu cytrynian sodu chlorek amonu fluorouracyl pod postacią soli sodowej uracyl mocznik

0.130 - 0.153 0.080 - 0.090 0.040 - 0.053 0.015 - 0.018 0.025 - 0.370 0.018 - 0.270 0.010 - 0.144, a także wodorotlenek sodu do uzyskania pH 8.4-9.9.

₃

Korzystnie, gdy gęstość roztworu wynosi 1.0054-1.0058 g/cm³.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania leku przeciwnowotworowego opisanego powyżej, w którym przechowuje się nici DNA przez 16-26 godzin w roztworze soli cytrynianu, który zawiera chlorek sodu i cytrynian sodu, rozpuszcza się nici przez mechaniczne mieszanie i ogrzewanie roztworu DNA do 70-90°C, stopniowo wprowadza się roztwór soli cytrynianowej cisdichlorodiaminoplatyny (DDP) ogrzany do tej samej temperatury do podgrzanego roztworu DNA, przeprowadza się kontrolę termostatyczną mieszaniny roztworów DNA i DDP w 70-90°C przez 15-20 minut i dodaje się wodny roztwór soli sodowej fluorouracylu do mieszaniny przed kontrolą termostatyczną, charakteryzujący się tym, że równocześnie z wodnym roztworem soli sodowej fluorouracylu wprowadza się wodny roztwór uracylu i wodny roztwór mocznika w stężeniach, które odpowiadają stosunkowi molowemu fluorouracylu, uracylu i mocznika 1:1:1 oraz wodny roztwór wodorotlenku sodu o pH 11.0-12.0; a następnie roztwór leku doprowadza się do pH 8.4-9.9 i do gęstości wynoszącej 1.0054-1.0058 g/cm³.

Jeszcze kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób stabilizacji czynników przeciwnowotworowych na bazie wodnego roztworu pochodnej platyny z kwasem deoksyrybonukleinowym (Pt-DNA), charakteryzujący się tym, że wykorzystuje się mieszaninę fluorouracylu z uracylem i mocznikiem w stosunku molowym nukleotydu Pt-DNA fluorouracylu, uracylu i mocznika 1:(6-12):(0.6-1.2):(0.6-1.2) jako dodatkowego czynnika stabilizującego, zwiększając pH roztworu do wielkości z zakresu 8.4-9.9.

Korzystnie, gdy stężenie kompleksu Pt-DNA wynosi 1.30-1.53 mg/ml.

Korzystnie, gdy lek dodatkowo zawiera chlorek sodu w ilości 0.80-0.90 mg/ml.

Korzystnie, gdy lek dodatkowo zawiera cytrynian sodu w ilości 0.40-0.53 mg/ml.

Korzystnie, gdy lek dodatkowo zawiera chlorek amonu w ilości 0.15-0.18 mg/ml.

Korzystnie dzięki terapeutycznie dopuszczalnemu DNA, pozyskanemu z naturalnych źródeł lub zsyntetyzowanemu na drodze metod inżynierii genetycznej, z masą molową od 0.3-20 mln Daltonów.

Korzystnie, w celu doprowadzenia pH roztworów leków do 8.4-9.9 wykorzystuje się albo wodorotlenek sodu, albo wodorotlenek potasu, albo wodorotlenek amonu, lub jakikolwiek inny farmaceutycznie dopuszczalny regulator pH.

Oferowany sposób otrzymywania czynnika przeciwnowotworowego umożliwia osiągnięcie zwiększonych wartości pH i gęstości roztworu, które wykluczają możliwość oddziaływania fluorouracylu z protonami roztworu, co z kolei umożliwia otrzymanie leku z makrocząsteczkami Pt-DNA, które nie są skondensowane, o rozmiarze 0.05-0.15 mikronów w największym wymiarze, przy konserwowaniu gotowego do użycia leku w zakresie temperatury 25-15°C. Zatem zwiększanie gęstości roztworu zapobiega osadzaniu makrocząsteczek z roztworu leku.

W praktyce lek przeciwnowotworowy otrzymywano w następujący sposób.

Nici DNA przechowywano przez 16-26 godzin w roztworze soli cytrynianowej, która zawierała chlorek sodu i cytrynian sodu. Rozpuszczono je poprzez mechaniczne mieszanie i ogrzewanie roztworu DNA do 70-90°C. Do ogrzanego roztworu DNA wprowadzono stopniowo roztwór cis-dichlorodiaminoplatyny (DDP) w soli cytrynianowej ogrzany do tej samej temperatury. Następnie do mieszaniny dodano wodny roztwór soli sodowej fluorouracylu. Równocześnie z wodnym roztworem soli sodowej fluorouracylu dodaliśmy dodatkowo wodny roztwór uracylu i wodny roztwór mocznika w stężeniach, które odpowiadają stosunkowi molowemu fluorouracylu, uracylu i mocznika 1:1:1 oraz wodnemu roztworowi wodorotlenku sodu o pH 11.0-12.0. W ten sposób roztwór leku doprowadzono ₃ do pH 8.4-9.9 i gęstości 1.0054-1.0058 g/cm³. Po tym mieszaniny roztworów DNA i DDP utrzymywano w temperaturze 70-90°C przez 15-20 minut.

PL 219 734 B1

Przykłady otrzymywania leku przeciwnowotworowego pokazano w Tabeli 1, w której przykłady

1-3 odnoszą się do zastrzeganego leku, a przykład 4 - do znanego leku.

T a b e l a 1

Nr przykładu	Warunki otrzymywania leku	Czas konserwacji DNA, godzina	Ogrzewanie i kontrola termiczna temperatur
Ilość początkowych składników
DNA	DDP	NaCl	Na3Cyt	Na3Cy	Ura	Mocznik	NaOH
1	0.67	0.87	0.80	0.40	3.70	2.7	1.44	0.80	20	90
2	0.68	0.92	0.86	0.48	2.50	1.8	0.99	0.72	26	70
3	0.74	0.96	0.90	0.53	0.25	0.1	0.10	0.60	16	85
4	0.72	0.96	0.90	0.50	2.50				26	85

Symbole w tabeli: NaCl - chlorek sodu, Na3Cyt - cytrynian sodu, NaFu - fluorouracyl pod postacią soli sodowej, Ura - uracyl, Mocznik - mocznik.

Przy masach molowych uracylu 112 g-mol, fluorouracylu 153 g-mol, mocznika 60 g-mol w pierwszym przykładzie liczba moli uracylu wynosi 2.70/112 = 0.024; fluorouracylu - 3.70/153 = 0.024; mocznika - 1.44/60 = 0.024;

W drugim przykładzie ilość wskazanych substancji wynosi 0.016, a w trzecim - 0.0016. Zatem wodny roztwór uracylu i wodny roztwór mocznika wprowadzono w stężeniach odpowiadających stosunkowi molowemu fluorouracylu, uracylu i mocznika 1:1:1.

W zależności od warunków otrzymywania zastrzeganego leku, jego cechy porównano z cechami znanego leku. Wyniki przedstawiono w Tabeli 2, w której przykłady 1-3 odnoszą się do zastrzeganego leku, a przykład 4 - do znanego leku.

T a b e l a 2

Nr przykł.	Cechy otrzymanego leku
Temp. konse- rwacji, ^OC	Kompozycja leku, % wagowe		Rozmiar cząsteczek	Gęstość roztworu g/cm³
Pt-DNA	NaCI	Na3Cyt	NH4Cyt	NaFu	Ura	Mocznik	NaOH przed doprowadze- niem roztworu do pH
1	15	0.130	0.082	0.053	0.015	0.370	0.272	0.142	9.9	0.05-0.15	1.0056
2	15	0.142	0.080	0.048	0.016	0.250	0.182	0.098	8.4	0.05-0.15	1.0058
20	0.142	0.080	0.048	0.016	0.250	0.182	0.098	8.8	0.05-0.15	1.0054
25	0.142	0.080	0.048	0.016	0.250	0.182	0.098	9.2	0.05-0.15	1.0054
3	20	0.153	0.090	0.040	0.018	0.025	0.016	0.010	8.8	0.05-0.15	1.0056
4	25	0.152	0.085	0.046	0.015	0.250			6.9	0.03-0.07	1.0012
15	0.152	0.085	0.046	0.015	0.250			6.6	0.02-0.05	1.0016

Różnic w wodnych roztworach zastrzeganego leku i znanego leku dowodzą różne wartości pH, które są zdefiniowane potencjometrycznie, oraz różne wartości gęstości, oznaczone sposobem piknometrycznym. Różnic w strukturach przestrzennych cząsteczek Pt-DNA, które powstają w temperaturze niższej niż 35°C w znanym leku i w zastrzeganym leku, dowiedziono w przykładach w tabeli

PL 219 734 B1 poprzez ich różne rozmiary w strukturach cząsteczkowych, które według danych submikroskopowych różnią się od siebie 2-3-krotnie. Rozmiar struktur cząsteczkowych w przykładach zastrzeganego leku odpowiada rozmiarowi niezwiązanych indywidualnych makrocząsteczek substancji, co potwierdza brak wewnątrzcząsteczkowej kondensacji cząsteczek Pt-DNA w leku utrzymywanym w temperaturze 25-15°C.

Aktywność przeciwnowotworową znanego leku i zadeklarowanego leku badano w teście cytotoksyczności w modelu hodowli komórkowej otrzymanym z materiału chirurgicznego od pacjenta cierpiącego na oligodendroglejaka mózgu. Komórki hodowano w mieszaninie odżywczej o standardowej strukturze: Pożywka Eagle'a (40%), serum zarodka cielęcia (30-40%), glukoza (800 miligram %), insulina (0.2 jednostki/ml) w stałych warunkach kompozycji gazowej i temperaturze 36.5°C w komorze o regulowanej temperaturze.

dni po inokulacji w okresie intensywnego wzrostu kontrolne komórki w hodowli poddano działaniu normalnego roztworu soli fizjologicznej, a eksperymentalne komórki w hodowli poddano działaniu roztworów zastrzeganego leku i roztworu znanego leku, utrzymywanych w temperaturze 25-15°C. Okres inkubacji po działaniu na hodowle wynosił 24 godziny. Aktywność przeciwnowotworową oszacowano poprzez cytotoksyczność, którą scharakteryzowano względnie w porównaniu z kontrolną liczbą martwych komórek. Wyniki obliczeń względnej ilości martwych komórek, pokazane w procentach, przedstawiono w Tabeli 3, w której pod Nr 1 znajdują się wskaźniki kontrolnej hodowli komórkowej, poddanej działaniu normalnego roztworu soli fizjologicznej; pod Nr 2-4 - wskaźniki eksperymentalnych hodowli komórkowych poddanych działaniu roztworów zastrzeganego leku, pod Nr 5 - wskaźniki eksperymentalnych hodowli komórkowych poddanych działaniu roztworu znanego leku. Dane w Tabeli 3 przedstawiono bez danych o stężeniu soli chlorku sodu, cytrynianu sodu i chlorku amonu.

T a b e l a 3

Nr hodowli komórek	Lek	Temperatura konserwacji °C	Stężenie, mkg/ml	Procent martwych komórek
Pt-DNA	NaFu	Ura	Mocznik
1	Normalny roztwór soli fizjologicznej						0.7
2	Kompozycja według przykładu Nr 1	15	30.0	74.0	54.0	28.0	96.0
3	Kompozycja według przykładu Nr 2	15	30.0	50.0	36.0	20.0	86.8
		20	30.0	50.0	36.0	20.0	84.3
25	30.0	50.0	36.0	20.0	86.2
4	Kompozycja według przykładu Nr 3	20	30.0	5.0	3.6	2.0	64.7
5	Kompozycja według przykładu Nr 4	25	30.0	50.0			52.1
15	30.0	50.0			24.2

Dane z tabeli 3 pokazują, że w porównaniu ilościowego oszacowania aktywności przeciwnowotworowej w teście cytotoksyczności zastrzegany lek jest w zasadniczy sposób lepszy od znanego leku. Utrzymywany w identycznej temperaturze wynoszącej 15°C i wprowadzany do hodowli w identycznych stężeniach pochodnej Pt-DNA 30 mkg/ml i fluorouracylu 50 mkg/ml znany lek powoduje zniszczenie tylko 24.2% komórek, podczas gdy zastrzegany lek niszczy 86.6%.

Zatem oferowany lek utrzymuje swoją wysoką aktywność przeciwnowotworową i skuteczność terapeutyczną nawet w temperaturach 25-15°C, co znacząco upraszcza jego przechowywanie, transport i zastosowanie.

Oferowany lek można stosować w różnych postaciach dawkowania.

Zastrzegany lek przeciwnowotworowy stosowano w terapii klinicznej pierwotnych i metastatycznych nowotworów płuc, nerek, otrzewnej i opłucnej, narządów trawiennych i mięsaków układu ruchowego w postaciach dawkowania do podawania dożylnego, dotętniczego i dootrzewnowego; w terapii

PL 219 734 B1 nowotworowych uszkodzeń głowy, szyi i skóry - w postaciach dawkowania do podawania miejscowego pod postacią zabiegów; w nowotworach mózgu - śródmiąższowo z implantacją podczas operacji zbiornika Ommaya w podłożu chirurgicznie usuniętego nowotworu.

Doświadczenie z zastosowania klinicznego zastrzeganego leku pokazało, że użycie jego postaci dawkowania zarówno do zastosowania dootrzewnowego, jak i miejscowego oraz do jego podawania dożylnego, dotętniczego i śródmiąższowego, podnosi skuteczność chemioterapii, co wyraża się wzrostem oczekiwanej długości życia pacjenta i poprawą jakości życia podczas przebiegu leczenia i w dłuższym okresie czasu. Zarazem nie zaobserwowano u pacjentów rozwoju klinicznego lub laboratoryjnego żadnych istotnych skutków ubocznych.

Następny (trzeci) problem jest rozwiązany przez zastrzegany wynalazek, ponieważ oferuje sposób stabilizacji czynników przeciwnowotworowych na bazie wodnego roztworu (związku) pochodnej platyny z kwasem deoksyrybonukleinowym (Pt-DNA). Według tego sposobu wykorzystuje się mieszaninę zasady fluorouracylowej z uracylem i mocznikiem w stosunku molowym nukleotydu Pt-DNA zasady fluorouracylowej, uracylu i mocznika 1:(6-12:(0.6-1.2):(0.6-1.2) jako dodatkowego czynnika stabilizującego, zmniejszając równocześnie stężenie protonów w roztworze do 8.4-9.9.

Ponadto wykorzystuje się związki platyny z kwasem deoksyrybonukleinowym (Pt-DNA) w stężeniu równym 1.30-1.53 mg/ml, zawierające chlorek sodu w objętości wynoszącej 0.80-0.90 mg/ml, cytrynian sodu w objętości wynoszącej 0.40-0.53 mg/ml, chlorek amonu w objętości wynoszącej 0.15-0.18 mg/ml i dodatkowy czynnik stabilizujący według wynalazku, oraz stosuje się kompleks Pt-DNA, którego cząsteczki nie osadzają się z roztworu poniżej 35°C.

Jako część leku, makrocząsteczki Pt-DNA mogą zawierać jedną cząsteczkę DNA, przydzieloną z naturalnych źródeł lub zsyntetyzowaną na drodze metod inżynierii genetycznej, z masą cząsteczkową nie ograniczoną do 0.3-20 mln Daltonów.

W celu zwiększenia pH roztworu leku do 8.4-9.9 wykorzystuje się albo wodorotlenek sodu, albo wodorotlenek potasu, albo wodorotlenek amonu, albo jakikolwiek inny farmaceutycznie dopuszczalny regulator pH.

Zadeklarowany sposób stabilizacji wykorzystano w technologii otrzymywania przeciwnowotworowych leków wymienionych w Tabeli 4, które różniły się od siebie rodzajem ich DNA, prowadzących do związku Pt-DNA.

T a b e l a 4

Nr leku przeciwnowotworowego	Cechy DNA prowadzącego do związku Pt-DNA
Natura	Stosunek A+T/G+C	Masa molowa, mln Daltonów
1	Genetycznie zmodyfikowane DNA chromosomu filadelfijskiego	1.38	0.3-0.5
2	Nasienie łososia	1.43	0.3-0.5
3	Śledziona	1.43	3-4
4	Śledziona wołu, znak B	1.36	4-7
5	Śledziona prosięcia, znak B	1.43	5-6
6	Nowotwór ludzkiej wątroby	1.54	18-20
7	Nowotwór białaczkowy szczura Schvets	1.04	17-18
8	Śledziona wołu, znak A	1.36	7-14
9	Śledziona prosięcia, znak A	1.43	12-16

Symbole w tabeli: A - adenina, T - tymina, G - guanina, C - cytozyna.

W praktyce sposób stabilizacji leków przeciwnowotworowych przeprowadzono następująco. Wodny roztwór dodatkowego czynnika stabilizującego zawierający mieszaninę zasady fluorouracyloPL 219 734 B1 wej z uracylem i mocznikiem wprowadzono do wodnego roztworu zawierającego związek Pt-DNA, którego cząsteczki nie osadzają się z roztworu poniżej 35°C, chlorek sodu, cytrynian sodu i chlorek amonu. Równocześnie razem z wodnym roztworem czynnika stabilizującego wprowadzono wodny roztwór regulatora pH, zawierający wodorotlenek sodu o pH aż do 11-12, za pomocą którego roztwór czynnika docelowego doprowadzono do pH 8.4-9.9.

Szczególne warunki sposobu stabilizacji leków przeciwnowotworowych, przedstawione w Tabeli 4, wraz ze wskazaniem ilości początkowych składników w roztworze podstawowej substancji, w roztworze dodatkowego czynnika stabilizującego i w roztworze regulatora pH, pokazano w Tabeli 5, podczas gdy przykłady 1-9 odnoszą się do zastrzeganego sposobu, a przykłady 10 i 11 - do znanego sposobu.

T a b e l a 5

Nr przykładu	Nr leku przeciwnowotworowego	Warunki sposobu implementacji
Ilość początkowych składników, g/l
w roztworze substancji podstawowej	w roztworze dodatkowego czynnika stabilizującego	w roztworze regulatora pH
Pt-DNA	NaCl	Na₃Cyt	NH4CI	NaFu	Fu	Ura	Mocznik	NaOH
1	1	1.30	0.83	0.53	0.17		2.75	0.236	0.127	0.75
2	2	1.53	0.87	0.50	0.15		3.23	0.255	0.149	0.73
3	3	1.48	0.80	0.46	0.18		3.12	0.224	0.132	0.80
4	4	1.50	0.90	0.48	0.15		2.38	0.205	0.122	0.63
5	5	1.30	0.85	0.45	0.16		2.06	0.158	0.106	0.68
6	6	1.30	0.80	0.40	0.15		1.37	0.118	0.063	0.60
7	7	1.40	0.85	0.46	0.16		1.47	0.147	0.080	0.70
8	8	1.53	0.90	0.53	0.18		1.62	0.139	0.099	0.80
9	9	1.48	0.88	0.42	0.17		2.34	0.157	0.108	0.75
10	8	1.50	0.90	0.50	0.18	1.89
11	9	1.48	0.80	0.53	0.15	1.82

Symbole w tabeli: NaCl - chlorek sodu; Na3Cyt - cytrynian sodu; NHCl - chlorek amonu; NaFu - sól sodowa fluorouracylu; Fu - zasada fluorouracylowa; Ura - uracyl; Mocznik - mocznik; NaOH - wodorotlenek sodu.

Cechy zastrzeganego sposobu, w zależności od warunków jego implementacji i temperatury konserwacji leku, porównano z cechami znanego sposobu poprzez dane przedstawione w Tabeli 6, w której przykłady 1-9 odnoszą się do zastrzeganego sposobu, a przykłady 10 i 11 - do znanego sposobu.

PL 219 734 B1

T a b e l a 6

Nr przykładu	Nr leku przeciwnowotworowego	Cechy sposobu
Tempera- tura konser- wacji, °C	Stężenie składników w roztworze leku, mg/ml	Stosunek molowy nukleotydu Pt-DNA, Fu, Ura i Mocznika
Pt-DNA	NaCl	Na₃Cyt	NH4Cl	NaFu	Fu	NaOH przed doprowadze- niem roztworu do pH
1	1	25	1.30	0.87	0.53	0.17		2.75	9.5	1:12:1.2:1.2
2	2	20	1.53	0.83	0.50	0.15		3.22	9.4	1:12:1.1:1.2.
3	3	20	1.48	0.80	0.46	0.18		3.12	9.8	1:12:1:1.1
4	4	15	1.50	0.90	0.48	0.15		2.37	8.7	1:9:0.9:1.0
5	5	10	1.30	0.85	0.45	0.16		2.05	8.8	1:9:0.8:1.0
6	6	5	1.30	0.80	0.40	0.15		1.37	8.5	1:6:0.6:0.6
7	7	5	1.40	0.84	0.45	0.17		1.47	8.9	1:6:0.7:0.7
8	8	20	1.53	0.90	0.53	0.18		1.62	9.9	1:6:0.6:0.8
8	15	1.53	0.87	0.51	0.16		1.62	9.9	1:6:0.6:0.8
8	10	1.53	0.90	0.52	0.17		1.62	9.8	1:6:0.6:0.8
9	9	15	1.48	0.88	0.42	0.16		2.32	9.2	1:9:0.7:0.9
9	10	1.48	0.87	0.40	0.15		2.32	9.3	1:9:0.7:0.9
9	5	1.48	0.88	0.41	0.16		2.32	9.1	1:9:0.7:0.9
10	8	38	1.50	0.90	0.50	0.18	1.89		7.0
8	15	1.04	0.90	0.50	0.18	1.47		6.8
11	9	38	1.48	0.85	0.53	0.15	1.82		8.0
9	10	0.63	0.85	0.53	0.15	1.19		7.6

Różnice w cechach zastrzeganego sposobu i znanego dowodzą różne zakresy wartości pH, zmierzone na drodze potencjometrycznej, oraz brak zależności od temperatury stężeń substancji podstawowej i dodatkowego czynnika stabilizującego, kontrolowanych sposobami analizy ilościowej. Różnic w stężeniach, które powstają w znanym sposobie w temperaturze niższej niż 35°C dowiedziono w przykładach w tabeli poprzez zmniejszenie stężenia związku Pt-DNA z 1.50 mg/ml do 1.04 mg/ml,

PL 219 734 B1 tj. o 30.7%, oraz NaFu z 1.89 mg/ml do 1.47 mg/ml, tj. o 22% w wodnym roztworze leku utrzymywanego w 15°C.

Gdy lek utrzymywano w temperaturze około 10°C, stężenie spadało w przypadku Pt-DNA z 1.48 mg/ml do 0.63 mg/ml, tj. już o 57.4%, a w przypadku NaFu z 1.82 mg/ml do 1.19 mg/ml, tj. o 34.4%. Stężenia substancji podstawowej i dodatkowego czynnika stabilizującego w przykładach zastrzeganego sposobu odpowiadają stężeniom w roztworach utrzymywanych w temperaturach powyżej 35°C, co potwierdza zdolność sposobu do zapewnienia warunków, w których makrocząsteczki Pt-DNA i cząsteczki zasady fluorouracylowej nie osadzają się z roztworu podczas utrzymywania produktu docelowego w zakresie temperatury 25-5°C.

Aktywność przeciwnowotworowa, którą mogą zapewnić zastrzegane i znane sposoby stabilizacji leku, badano w teście cytotoksyczności na modelu komórek glejaka anaplastycznego ludzkiego mózgu przystosowanych do hodowli. Komórki przechowywano na podłożu odżywczym Eagle'a z dodatkiem serum zarodka cielęcia, glukozy i insuliny w stałych warunkach kompozycji gazu i temperaturze 36.5°C w komorze o regulowanej temperaturze. W okresie intensywnego wzrostu komórki hodowli kontrolnej poddano działaniu normalnego roztworu soli fizjologicznej, a komórki hodowli eksperymentalnych poddano działaniu roztworów leków stabilizowanych zastrzeganymi i znanymi sposobami, które były początkowo utrzymywane w temperaturze 10°C.

Aktywność przeciwnowotworową oceniono zgodnie z jego cytotoksycznością, określoną w odniesieniu do liczby komórek kontrolnych utraconych 24 godziny po tym, jak poddano je działaniu leków. Wyniki obliczeń względnej ilości utraconych komórek w procentach przedstawiono w Tabeli 7, w której pod Nr 1 znajdują się wskaźniki kontrolnej hodowli komórkowej, poddanej działaniu normalnego roztworu soli fizjologicznej; pod Nr 2-5 - wskaźniki eksperymentalnych hodowli komórkowych poddanych działaniu roztworów leków, stabilizowanych zastrzeganym sposobem, pod Nr 6 - wskaźniki eksperymentalnych hodowli komórkowych poddanych działaniu roztworu leku stabilizowanego znanym sposobem.

T a b e l a 7

Nr hodowli komórek	Temp. konser- wacji, °C	Lek	Ilość ml leku na 1 l hodowanej hodowli	Stężenie Pt-DNA w hodowanej hodowli	Procent utraconych komórek
1	10	Normalny roztwór soli fizjologicznej	0.02		1.7
2	10	Lek Nr 8, stabilizowany sposobem przedstawionym w przykładzie 8	0.02	30.6	86.4
3	10	Lek Nr 9 stabilizowany sposobem przedstawionym w przykładzie 9	0.02	29.6	80.4
4	10	Lek Nr 5, stabilizowany sposobem przedstawionym w przykładzie 5	0.02	26.0	78.8
5	10	Lek Nr 3, stabilizowany sposobem przedstawionym w przykładzie 3	0.02	29.6	82.1
6	10	Lek Nr 9 stabilizowany sposobem przedstawionym w przykładzie 9	0.02	12.6	32.2

Dane w Tabeli 7 pokazują, że w porównaniu ilościowego oszacowania aktywności przeciwnowotworowej w teście cytotoksyczności zastrzegany sposób stabilizacji jest zasadniczo lepszy od znanego sposobu. Utrzymywane w temperaturze 10°C i stosowane w identycznych objętościach wynoszących 0.02 ml z identycznymi ilościami wynoszącymi 1.48 mg/ml Pt-DNA w temperaturze powyżej 35°C wodne roztwory leku stabilizowane znanym sposobem stwarzają stężenie substancji podstawowej wynoszące tylko 12.6 mg/l po wprowadzeniu do pożywki hodowli w objętości wynoszącej 1 l, co powoduje zniszczenie tylko 32.2%, podczas gdy wodne roztwory leku stabilizowane zastrzeganym sposobem, po wprowadzeniu do pożywki hodowli, stwarzają w niej stężenie Pt-DNA wynoszące 29.6 mg/l, co powoduje zniszczenie 80.4-82.1% komórek.

PL 219 734 B1

Zatem oferowany sposób stabilizacji zapewnia zwiększony selektywny specyficzny efekt związku Pt-DNA i jego zwiększoną skuteczność terapeutyczną nawet w temperaturach 25-5°C, jak również zapewnia rozszerzone warunki przechowywania leków i rozszerzony zakres ich stosowania poprzez użycie związku platyny z kwasem deoksyrybonukleinowym (Pt-DNA), którego makrocząsteczki nie osadzają się z roztworu w temperaturze niższej niż 35°C, kosztem użycia mieszaniny zasady fluorouracylowej z uracylem i mocznikiem, jak również kosztem użycia roztworu o obniżonym stężeniu protonów.

Leki przeciwnowotworowe stabilizowane zastrzeganym sposobem można stosować w różnych postaciach dawkowania.

Doświadczenie zastosowania klinicznego leków przeciwnowotworowych stabilizowanych zastrzeganym sposobem pokazało, że ich zastosowanie w postaciach dawkowania zarówno w dootrzewnowych i miejscowych drogach wprowadzania, jak i w drogach dożylnych, dotętniczych, endolimfatycznych i śródmiąższowych, podnosi wydajność terapii pierwotnych i metastatycznych nowotworów zlokalizowanych w głowie, szyi, płucach, nerkach, narządach trawiennych i obszarach układu ruchowego. Wzrost wydajności wyraża się wzrostem oczekiwanej długości życia pacjentów i polepszeniem ich jakości życia, zarówno podczas trwania leczenia, jak i w dłuższym okresie czasu po leczeniu. W tym samym czasie u pacjentów nie stwierdzono obecności rozwoju klinicznych lub laboratoryjnych efektów ubocznych.

Claims

1. Lek przeciwnowotworowy na bazie wodnego roztworu pochodnej platyny z polianionem kwasu deoksyrybonukleinowego (Pt-DNA), który zawiera niezwiązane makrocząsteczki Pt-DNA o rozmiarze 0,05-0,15 mikronów w największym wymiarze, chlorek sodu, cytrynian sodu, chlorek amonu i fluorouracyl pod postacią soli sodowej, znamienny tym, że zawiera dodatkowo uracyl i mocznik w stosunku molowym fluorouracylu, uracylu i mocznika 1:1:1 w stosunku składników w roztworze wodnym, w % wagowych:

Pt-DNA - 0.130 - 0.153 chlorek sodu - 0.080 - 0.090 cytrynian sodu - 0.040 - 0.053 chlorek amonu - 0.015 - 0.018 fluorouracyl pod postacią soli sodowej - 0.025 - 0.370 uracyl - 0.018 - 0.270 mocznik - 0.010 - 0.144, a także wodorotlenek sodu do uzyskania pH 8.4-9.9.

2. Lek przeciwnowotworowy według zastrz. 1, znamienny tym, że gęstość roztworu wynosi 1.0054-1.0058 g/cm³.

3. Sposób otrzymywania leku przeciwnowotworowego określonego w zastrzeżeniu numer 1, w którym przechowuje się nici DNA przez 16-26 godzin w roztworze soli cytrynianu, który zawiera chlorek sodu i cytrynian sodu, rozpuszcza się nici przez mechaniczne mieszanie i ogrzewanie roztworu DNA do 70-90°C, stopniowo wprowadza się roztwór soli cytrynianowej cis-dichlorodiaminoplatyny (DDP) ogrzany do tej samej temperatury do podgrzanego roztworu DNA, przeprowadza się kontrolę termostatyczną mieszaniny roztworów DNA i DDP w 70-90°C przez 15-20 minut i dodaje się wodny roztwór soli sodowej fluorouracylu do mieszaniny przed kontrolą termostatyczną, znamienny tym, że równocześnie z wodnym roztworem soli sodowej fluorouracylu wprowadza się wodny roztwór uracylu i wodny roztwór mocznika w stężeniach, które odpowiadają stosunkowi molowemu fluorouracylu, uracylu i mocznika 1:1:1 oraz wodny roztwór wodorotlenku sodu o pH 11.0-12.0; a następnie roztwór ₃ leku doprowadza się do pH 8.4-9.9 i do gęstości wynoszącej 1.0054-1.0058 g/cm³.

4. Sposób stabilizacji czynników przeciwnowotworowych na bazie wodnego roztworu pochodnej platyny z kwasem deoksyrybonukleinowym (Pt-DNA), znamienny tym, że wykorzystuje się mieszaninę fluorouracylu z uracylem i mocznikiem w stosunku molowym nukleotydu Pt-DNA fluorouracylu, uracylu i mocznika 1:(6-12):(0.6-1.2):(0.6-1.2) jako dodatkowego czynnika stabilizującego, zwiększając pH roztworu do wielkości z zakresu 8.4-9.9.

PL 219 734 B1

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stężenie kompleksu Pt-DNA wynosi 1.30-1.53 mg/ml.

6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że lek dodatkowo zawiera chlorek sodu w ilości 0.80-0.90 mg/ml.

7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że lek dodatkowo zawiera cytrynian sodu w ilości 0.40-0.53 mg/ml.

8. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że lek dodatkowo zawiera chlorek amonu w ilości 0.15-0.18 mg/ml.

9. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że dzięki terapeutycznie dopuszczalnemu DNA, pozyskanemu z naturalnych źródeł lub zsyntetyzowanemu na drodze metod inżynierii genetycznej, z masą molową od 0.3-20 mln Daltonów.

10. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że w celu doprowadzenia pH roztworów leków do 8.4-9.9 wykorzystuje się albo wodorotlenek sodu, albo wodorotlenek potasu, albo wodorotlenek amonu, lub jakikolwiek inny farmaceutycznie dopuszczalny regulator pH.