BG110926A

BG110926A - Antitoumorno lekarstvo, metod za polouchavaneto mou i metod za stabiliziraneto mou

Info

Publication number: BG110926A
Application number: BG10110926A
Authority: BG
Inventors: Oleg SOKIRKO; Ilima Volchenskova; Nadezhda Maydanevich
Original assignee: Oleg SOKIRKO
Priority date: 2008-12-22
Filing date: 2011-04-29
Publication date: 2011-10-31
Also published as: WO2010074662A1; PL219734B1; PL394863A1; CN102227222B; EA015680B1; EA201100618A1; CN102227222A; BRPI0923273A2; BG66625B1; TR201104008T1; IL213446A0; IL213446A

Abstract

Izobretenieto se otnasya do sferata na meditsinata, po-tochno do antitoumorni lekarstva na bazata na voden raztvor na platineno suedinenie, do metodi za polouchavane na gorespomenatite agenti i do metodi za tyahnoto stabilizirane. Metodut za stabilizirane na antitoumorni agenti na bazata na voden raztvor na platineno suedinenie se sustoi v izpolzvane na smes ot osnoven flouoroouratsil i ouratsil i oureya, a sushto i v izpolzvane na raztvor s ponizhena kontsentratsiya na protoni.

Description

Изобретението се отнася до сферата на медицината, а по-точно, до антитуморни лекарства на базата на воден разтвор на платинени съединения, които могат да се използват за лечение на злокачествени тумори, а също и до методите за тяхното получаване и стабилизиране.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Сред антитуморните лекарства, широко използвани в медицинската практика, едни от най-ефективните са на базата на воден разтвор на мономерен комплекс на цисплатина. Платинените йони действат като активна съставка в тези лекарства заедно с лиганд-носители, които се абсорбират от туморните клетки на практика със същия интензитет като нормалните клетки. Ето защо лекарствата, съдържащи цисплатина, се характеризират не само с висока антитуморна активност, но и с висока токсичност.

Не по-малко активни, но много по-малко токсични са антитуморните лекарства на базата на воден разтвор на полимерен комплекс на платина с дезоксирибонуклеинова киселина (Pt-ДНК), представляващ продукт на реакция на цисплатина и ДНК, при която един от лиганд-носителите на платинения йон е нуклеотид, вграден в структурата на двойноверижните макромолекули на ДНК, които се абсорбират интензивно само от бързо развиващи се туморни клетки, и следователно антитуморните лекарства, съдържащи Pt-ДНК връзка, повлияват туморните тъкани с висока степен на селективност при незначително увреждане на нормалните тъкани [Лечение на неоперабилни тумори на органи в коремната кухина, С.А. Шалимов и др.,

-21998,стр. 103].

Мономерният комплекс цисплатина и полимерният комплекс Pt-ДНК, които са основните вещества в лекарствата, не са достатъчно разтворими и са химически нестабилни във вода. Следователно, фармацевтичните добавки се добавят към лекарствата на базата на техните водни разтвори. Като добавки се използват фармакологично приемливи соли, рН-регулатори и други стабилизиращи агенти, за предпочитане, такива, които за сметка на собствената си биологична активност, проявяваща се едновременно със способността да се повиши разтворимостта и химическата стабилност на основното вещество, позволяват да се осигури ефективност на лечението и с по-добра поносимост.

Познато антитуморно лекарство на базата на воден разтвор на платинено производно с полианион на дезоксирибонуклеинова киселина in situ (Pt-ДНК) (активна съставка), което включва не-асоциирани макромолекули на Pt-ДНК с размер 0,05-0,15 микрона в най-голямото си измерение, натриев хлорид, натриев цитрат, амониев хлорид и флуороурацил под формата на натриева сол (помощно вещество) в съотношение на компонентите във водния разтвор, в тегловни %:

Pt-ДНК - 0,130-0,153 © Натриев хлорид - 0,080 - 0,090

Натриев цитрат - 0,040 - 0,053

Амониев хлорид - 0,015-0,018 .Флуороурацил под формата на натриева сол - 0,025 - 0,370 [виж декларационен патент на Украйна №70 456, публикуван на 15.10.2004г., заявители Шалимов С.А., Волченскова И.И., Майданевич Н.Н.].

Както сочат изследванията, водният разтвор на познато лекарство има pH 6,5-7,5 и плътност 1,0012-1,0016 g/cm³, при които не-асоциираните молекули на Pt-ДНК съединението имат най-висока антитуморна активност, а флуороурацилът притежава способността да засили тази активност и да

-3намали токсичността на платиненото производно, ако приетото вещество се поддържа при температура приблизително над 35°С. Понижаването на температурата подпомага базите на Pt-ДНК молекулите да влязат в интрамолекулни взаимодействия от кооперативен характер по-интензивно, отколкото в интермолекулни взаимодействия със съответните аниони на натриевата сол на флуороурацил. Ето защо пространствените структури на Pt-ДНК молекулите се кондензират необратимо. Интрамолекулното кондензиране на структури, които съдържат много малки атоми платина с плътност 21,45 g/sm , води до редуциране на пространствените структури на Pt-ДНК молекулите до размер, при който тяхната плътност в течно състояние надвишава плътността на разтвора и те се утаяват гравитационно под формата на рехава утайка.

.Така анионите на флуороурацила са по-склонни да взаимодействат с протони от разтвора, отколкото с базите на Pt-ДНК и следователно преминават в състояние на неутрални молекули с тяхна собствена основа, чиято разтворимост във вода е ограничена и която се утаява под формата на кристали, които се разтварят при повишаване на температурата. Седиментирането на активни и помощни съставки предизвиква намаляване на тяхната концентрация в разтвора на агента и по този начин се редуцира неговата антитуморна активност и терапевтична сила, а също така се ограничава неговото приложение само до локални приложения и интраабдоминални инфузии, но отпадат интравенозни, интраартериални инфузии и интерстициален начин на приемане.

Известно е, че базата на флуороурацил се използва като структурен фрагмент на тегафур - прекурсор на флуороурацила в организма - за получаване на антитуморен състав, съдържащ тегафур и урацил в молно съотношение 1:4 [патент US5534513, IPC 7 А61К 31/505, заявител TAIHO PHARMACEUTICAL CO LTD (JP), публикуван на 9.07.1996r.J.

Известно е, че уреята се използва като диуретик, кератолитичен агент, агент, редуциращ интракраниалното налягане и офталмотонуса [М.М.

-4Туркевич, Фармацевтическая химия, 1973, стр. 45], а също и като ексципиент, добавен към твърди дозиращи форми за перорален прием.

.Известно е, че високите концентрации на урея и повишаването на pH до над 11 се използват за денатуриране на спирализирани нишки на натурална двойноверижна ДНК [А. Ленинджер. Биохимия, 1976, стр. 737].

Също така е известно, че натриевият хидроксид се използва във фармацията за контролиране на pH на разтвори на терапевтични агенти. Освен това, е известно, че под влияние на високи концентрации на урея и при pH >11,0 спирализираните двойни нишки на натурална ДНК се денатурират [Ленинджер. Биохимия, 1976, стр. 737].

Но в досега познатите източници не се споменава нищо за приложение на урацил, урея и натриев хидроксид като агенти, предотвратяващи интрамолекулното кондензиране на спирализирани нишки на метални съединения с ДНК. Нито пък е известно прилагането на урея в дозиращите форми на лекарства за парентерално приемане. Интервалите на ефективна концентрация и съотношението на активната съставка, флуороурацил и соли във воден разтвор на лекарството, за което се претендира, съответстват на съотношенията, посочени при разработването на добре познато лекарство за интраабдоминални, интравенозни и интраартериални инфузии, които се поддържат при температура 35-40°С. Интервалите на концентрация на урацил и урея се определят чрез модното съотношение на флуороурацил, урацил и урея 1:1:1. Интервалите на концентрация на натриев хидроксид са ограничени в долния край на интервала от стойността на pH, което изключва възможността за протониране на флуороурацила, и в горния край на интервала - от фармацевтичните изисквания.

Има и друг познат начин за получаване на антитуморно лекарство чрез поддържане на ДНК нишките в продължение на 16-26 часа в цитратносолеви разтвор, който съдържа натриев хлорид и натриев цитрат, разтваряне на нишките като се разбърква механично и загряване на ДНК разтвора до 7090°С, постепенно въвеждане на цитратно-солевия разтвор на цис-дихлоро-5диамино-платина (DDP), загрят до същата температура, в също загретия ДНК разтвор, добавяне към сместа на воден разтвор на натриева сол на флуороурацил и термостатен контрол на сместа на разтворите на ДНК и DDP при 70-90°С в продължение на 15-20 минути [виж декларационен патент на Украйна №70 456, публикуван на 15.10.2004г., заявители Шалимов С.А., Волченскова И.И., Майданевич Н.Н.].

Добавянето на воден разтвор на натриева сол на флуороурацил към сместа на разтворите на ДНК и DDP преди термостатния контрол не подпомага интензифицирането на интермолекулните взаимодействия на молекулите на Pt-ДНК със съответните молекули от разтвора и до отслабване на интрамолекулните взаимодействия с кооперативен характер в тях и не изключва възможността за взаимодействие на анионите на флуороурацила с протоните в разтвора при температури под 35°C. И ето защо този добре познат начин при стайна температура не предотвратява необратимото интрамолекулно кондензиране на Pt-ДНК пространствени структури и не пречи на протонирането на анионите на флуороурацила в лекарствения разтвор. За да се избегнат тези явления, е необходимо да се проведат допълнителни технологични операции за въвеждане в лекарствения разтвор на компоненти, които биха повишили неговото pH, както и плътността му, преди термостатния контрол. Освен това е възможно да се използва антитуморния агент, получен по добре познатия начин, само че при температура 35-37°С като понижаването на температурата води до понижаване на активността на агента. Също така високата температура на агента усложнява неговото съхранение, транспортиране и приложение.

Съществува начин за стабилизиране на антитуморно лекарство на базата на воден разтвор на цисплатина с концентрация 0,1-1,0 mg/ml, при който се използва натриев хлорид в количество от 1-20 mg/ml, солна киселина до pH 2,0-3,0 и манитол (диуретик) в количество от 2-150 mg/ml [СССР патент 1192596 А, публикуван на 15.11.1985г.].

Познати са водни разтвори на Pt-ДНК съединение, стабилизирани с

-6натриев хлорид и натриев цитрат (антикоагулиращ агент) в количества, отговарящи на молното съотношение на платина, ДНК фосфор, натриев хлорид и натриев цитрат 4:6:30:3 [патент на Украйна 60597. Публикуван на

15.07.2005г.; 61543, публикуван на 15.08.2005г.; 66476 А, публикуван на

17.05.2004г.].

Но най-ефективните и най-малко токсичните антитуморни лекарства на базата на воден разтвор (производни) на Pt-ДНК са съединения (производни), описани по-горе в патента на Украйна 70456. Те са стабилизирани с натриев хлорид, натриев цитрат, амониев хлорид (лекарство, предизвикващо експекторация и засилване на диуретичното действие) и допълнителен стабилизиращ агент - натриев сол на флуороурацил в посоченото по-горе съотношение на компонентите на разтвора.

Натриевата сол на флуороурацила засилва антитуморните и отслабва токсичните ефекти на основното вещество като е способна да действа и като модулатор на фармакологичното действие на Pt-ДНК макромолекулите в организма и като стабилизатор на концентрацията на Pt-ДНК

макромолекулите в лекарствения воден разтвор.

Но водният разтвор на Pt-ДНК съединението в познатите лекарства има pH 6,5-7,5, при което използването на натриева сол на флуороурацил позволява стабилизиране на концентрацията на Pt-ДНК в разтвора при температура над 35 °C. Понижаването на температурата подпомага отделянето на макромолекулите на Pt-ДНК съединението от разтвора под формата на рехава утайка и на натриевата сол на флуороурацила под формата на основен флуороурацил на кристали, което предизвиква намаляване на основното съединение и на концентрацията на стабилизиращия агент в разтвора на дозиращата медицинска форма на лекарството и повлиява отрицателно неговата антитуморна активност и терапевтична ефективност. Също така това ограничава условията на съхранението му и възможностите за приложение до локално приложение и интраперитонеални инфузии, като отпадат интравенозни и интраартериални инфузии, ендолимфно инжектиране

-7и интерстициален начин на приемане.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изхождайки от гореспоменатото настоящото изобретението трябва да реши редица задачи.

Една от задачите на настоящото изобретение се състои в създаването на антитуморно лекарство, в което чрез добавяне на урацил, урея и натриев хидроксид към познат агент, се постига възможност за превенция на

интрамолекулно кондензиране на основното вещество и протониране на помощното вещество, като по този начин се избягва тяхното седиментиране и намаляване на концентрацията им в разтвора в интервал от температури 2515 °C, с което се постига повишаване на антитуморната активност и терапевтичната ефективност на лекарството и разширяване на приложението му.

Втората задача на настоящото изобретение се състои в разработване на начин за получаване на антитуморно лекарство, при който чрез използване на водни разтвори на урацил, урея и натриев хидроксид към познат агент при съответните технологични условия, се постига намаляване на интензитета на интрамолекулни взаимодействия от кооперативен характер в Pt-ДНК молекулите, от една страна. От друга страна, се постига повишаване на интензитета на взаимодействие на техните бази със съответните молекули в разтвора, а по-точно с флуороурацил, урацил и урея, което води до възможността за създаване на лекарство, съдържащо активната съставка PtДНК, чиито молекули не се кондензират при температурата на съхранение на готовото за използване лекарство в интервала 25-15°С, което на свой ред предотвратява седиментирането на макромолекули от разтвора.

Третата задача на настоящото изобретение се състои в намиране на метод за стабилизиране на антитуморни лекарства на базата на воден разтвор на платинено съединение с увеличена селективност на специфичното

-8действие и увеличена терапевтична ефективност.

Представените задачи се решават от настоящото изобретение.

Първата задача се решава чрез антитуморното лекарство на базата на воден разтвор на платинено производно с полианиони на дезоксирибонуклеинова киселина in situ (Pt-ДНК), което включва неасоциирани Pt-ДНК макромолекули с размер 0,05-0,15 микрона в найголямото си измерение, натриев хлорид, натриев цитрат, амониев хлорид и флуороурацил под формата на натриева сол съгласно изобретението, и съдържа допълнително урацил и урея в молно съотношение на флуороурацил, урацил и урея 1:1:1, при съотношение на компонентите във водния разтвор, тегловни %:

•Pt-ДНК - 0,130-0,153

Натриев хлорид - 0,080 - 0,090

Натриев цитрат - 0,040 - 0,053

Амониев хлорид - 0,015-0,018

Флуороурацил под формата на натриева сол - 0,025 - 0,370

Урацил - 0,018-0,270

Урея - 0,010-0,144, и още натриев хидроксид до достигане на pH 8,4 - 9,9.

©

Същевременно плътността на разтвора е 1,0054-1,0058 g/cm³.

Втората задача се решава чрез получаване на антитуморно лекарство чрез поддържане на ДНК нишките в продължение на 16-26 часа в цитратносолеви разтвор, който съдържа натриев хлорид и натриев цитрат, разтваряне на нишките като се разбърква механично и загряване на ДНК разтвора до 7090°С, постепенно въвеждане на цитратно-солевия разтвор на цис-дихлородиамино-платина (DDP), загрят до същата температура, в също загретия ДНК разтвор, добавяне към сместа на воден разтвор на натриева сол на флуороурацил и термостатен контрол на сместа на разтворите на ДНК и DDP при 70-90°С в продължение на 15-20 минути и добавяне към сместа на

-9разтворите на ДНК и DDP на воден разтвор на натриева сол на флуороурацил преди термостатния контрол. Съгласно изобретението преди термостатния контрол, заедно с воден разтвор на натриева сол на флуороурацил, трябва да се добави и воден разтвор на урацил и воден разтвор на урея в концентрации, които отговарят на молно съотношение на флуороурацил, урацил и урея 1:1:1, а също и воден разтвор на натриев хидроксид с pH 11,0-12,0; след което лекарственият разтвор се коригира до pH 8,4-9,9 и до плътност 1,00541,0058/сш³.

Предложеният метод на получаване на антитуморен агент позволява постигане на повишени стойности на pH и на плътност на разтвора, което изключва възможността за взаимодействие на флуороурацила с протоните в разтвора, което на свой ред дава възможност да се получи лекарството с PtДНК макромолекули, които не са кондензирани, с размер 0,05-0,15 микрона в най-голямото си измерение, при температура на съхранение на готовото за използване лекарство в интервала 25-15°С. Така повишаването на плътността на разтвора предотвратява седиментирането на макромолекули от лекарствения разтвор.

В практиката антитуморното лекарство се получава по следния начин.

ДНК нишките се поддържат в продължение на 16-26 часа в цитратносолеви разтвор, който съдържа натриев хлорид и натриев цитрат. Нишките се разтварят като се разбърква механично и ДНК разтворът се загрява до 7090°С. Постепенно се въвежда цитратно-солевия разтвор на цис-дихлородиамино-платина (DDP), загрят до същата температура, в също загретия ДНК разтвор. След това към сместа се добавя воден разтвор на натриева сол на флуороурацил. Същевременно заедно с водния разтвор на натриева сол на флуороурацил се добавят воден разтвор на урацил и воден разтвор на урея в концентрации, които отговарят на молно съотношение на флуороурацил, урацил и урея 1:1:1, а също и воден разтвор на натриев хидроксид с pH 11,0-12,0. По този начин лекарственият разтвор се коригира до pH 8,4-9,9 и до плътност 1,0054-1,0058/ст³. След това смесите на разтворите на ДНК и DDP се поддържат при температура 70-90°С в продължение на 15-20 минути.

-10ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Примерите за получаване на антитуморно лекарство са представени в Таблица 1, където Примери 1-3 се отнасят до лекарството, за което се претендира, а Пример 4 - до вече познато лекарство.

Таблица 1

№ на примера	Условия на получаване на лекарството	Време за съхране ние на ДНК, часове	температура на загряване и термостатен контрол, °C
Количество на изходните компоненти, g/1
ДНК	DDP	NaCI	Na₃Cyt	Na₃Cy	Ura	Урея	NaOH
1	0,67	0,87	0,80	0,40	3,70	2,70	1,44	0,80	20	90
2	0,68	0,92	0,86	0,48	2,50	1,84	0,99	0,72	26	70
3	0,74	0,96	0,90	0,53	0,25	0,18	0,10	0,60	16	85
4	0,72	0,96	0,90	0,50	2,50				26	85

Символи в таблицата: NaCI - натриев хлорид, Na₃Cyt - натриев цитрат, NaFu - флуороурацил под формата на натриева сол, Ura - урацил, Урея.

С моларното тегло на урацила 112 g-мола, на флуороурацила 153 gмола, на уреята 60 g-мола за първия пример броят на моловете урацил е равен на 2,70/112 = 0,024; флуороурацил - 3,70/153 = 0,024; урея - 1,44/60 = 0,024;

За втория пример броят на посочените вещества е равен на 0,016, а за третия пример - 0,0016. Следователно воден разтвор на урацил и воден разтвор на урея се добавят в концентрации, отговарящи на моларното съотношение на флуороурацил, урацил и урея 1:1:1.

Характеристиките на лекарството, за което се претендира, в зависимост от условията на получаването му, са сравнени с характеристиките на • · • · познатото лекарство. Резултатите са представени в Таблица 2, където

Примери 1-3 се отнасят до лекарството, за което се претендира, а Пример 4 - до вече познато лекарство.

Таблица 2

№ на при мера	Характеристики на полученото лекарство
Температура на съхранение, °C	Състав на лекарството, тегловни %		Размер на молекулите Pt-ДНК мкм	Плътност на разтвора g/cnr
Pt-ДНК	NaCl	Na,Cyt	NHtCyt	NaFu	Ura	Урея	NaOH ДО достигане на pH на разтвора
1	15	0,130	0,082	0,053	0,015	0,370	0,272	0,142	9,9	0,05-0,15	1,0056
2	15	0,142	0,080	0,048	0,016	0,250	0,182	0,098	8,4	0,05-0,14	1,0058
20	0,142	0,080	0,048	0,016	0,250	0,182	0,098	8,8	0,05-0,15	1,0054
25	0,142	0,080	0,048	0,016	0,250	0,182	0,098	9,2	0,05-0,15	1,0054
3	20	0,153	0,090	0,040	0,018	0,025	0,016	0,010	8,8	0,05-0,15	1,0056
4	- 25	0,152	0,085	0,046	0,015	0,250			6,9	0,03-0,07	1,0012
15	0,152	0,085	0,046	0,015	0,250			6,6	0,02-0,05	1,0016

Разликите във водните разтвори на лекарството, за което се претендира, и познатото лекарство се доказват от различните стойности на pH, които се определят потенциометрично, и различните стойности на плътността, определени по пикнометричен метод. Разликите в пространствените структури на Pt-ДНК молекулите, които се образуват при температура под 35 °C в познатото лекарство и в лекарството, за което се претендира, се потвърждават в примерите в таблицата с различните им размери в молекулните структури, които според електронно микроскопските данни се различават едни от други 2-3 пъти. Размерът на молекулните структури в примерите на лекарството, за което се претендира, отговаря на размера на не-асоциираните индивидуални макромолекули на веществото, което потвърждава липсата на интрамолекулно кондензиране на Pt-ДНК молекулите в лекарството, съхранявано при температура 25-15°С.

• ·

Антитуморните активности на познатото лекарство и на лекарството, за което се претендира, се изследват в теста за цитотоксичност върху модел с култивирани клетки, получени от хирургичен материал от пациент, болен от злокачествен олигодендроастроцитом на мозъка. Клетките се култивират в хранителна среда със стандартен състав: среда на Eagle (40%), ембрионален телешки серум (30-40%), глюкоза (800 милиграм %), инсулин (0,2 единици/ml) при постоянен състав на газовете и температура 36,5°С в инкубатор. 4 дни по-късно, след инокулиране в периода на интензивен растеж, контролната култура клетки се обработва с нормален физиологичен разтвор, а експерименталните култури клетки се обработват с разтворите на лекарството, за което се претендира, и разтвора на познатото лекарство, които се поддържат при температура 25-15°С. Културите се инкубират в продължение на 24 часа след обработването. Антитуморната активност се преценява според цитотоксичността, която се характеризира с относителното количество на загиналите клетки в сравнение с контролата. Резултатите от изчисленото относително количество загинали клетки, показано в проценти, са посочени в Таблица 3, където под №1 са показателите на контролната клетъчна култура, обработена с нормален физиологичен разтвор; под № 2-4 - показателите за експерименталните клетъчни култури, обработени с разтвори на лекарството, за което се претендира, а под № 5 - показателите за експерименталните клетъчни култури, обработени с разтвор на познатото лекарство. Данните в Таблица 3 са представени без данни за концентрация на солите на натриевия хлорид, натриевия цитрат и амониевия хлорид.

Таблица 3

Клетъчна култура №	Лекарство	Температурана съхранение, °C	Концент	тация, mkg/ml	Процент загинали клетки
Pt-DNA	NaFu	Ura	Урея
1	Нормален физиологичен разтвор						0,7
2	Състав от Пример №1	15	30,0	74,0	54,0	28,0	96,0
3	Състав от Пример №2	15	30,0	50,0	36,0	20,0	86,8
20	30,0	50,0	36,0	20,0	84,3
25	30,0	50,0	36,0	20,0	86,2
4 ·	Състав от Пример №3	20	30,0	5,0	3,6	2,0	64,7
5	Състав от Пример №4	25	30,0	50,0			52,1
15	30,0	50,0			24,2

Данните от Таблица 3 показват, че при сравняване на количественото

оценяване на антитуморната активност в теста за цитотоксичност, лекарството, за което се претендира, е значително по-добро от познатото лекарство. Съхранявани при еднаква температура 15°С и добавени към културата в идентични концентрации на Pt-ДНК производното от 30 mkg/ml и флуороурацил от 50 mkg/ml, познатото лекарство предизвиква разрушаване само на 24,2 % от клетките, докато лекарството, за което се претендира, разрушава 86,6 %.

Следователно, предложеното лекарство запазва високата си антитуморна активност и терапевтична ефективност дори при температури от 25-15°С, което значително улеснява съхранението, транспортирането и приложението.

Предложеното лекарство може да се използва в различни дозиращи форми.

Антитуморното лекарство, за което се претендира, се използва при клиничното лечение на първични и метастатични тумори не белите дробове, • · • · · · · · · · ·

- ·14^·· ·· ······ · · • ^χ ' · · · · · · ······ ·· · ······ бъбреците, перитонеума и плеврата, органите на храносмилателната система и при саркоматоза на опорно-двигателната система в дозиращи форми за интравенозно, интраартериално и интраабдоминално приложение; в терапията на туморните лезии на главата, шията и кожата - в дозиращи форми за локално приложение под формата на нанасяне; при мозъчни тумори - интерстициално с интраоперативно имплантиране на резервоар на Ommaya в ложето на хирургично отстранения тумор. Опитът при клинично приложение на лекарството, за което се претендира, показва, че използването на неговите дозиращи форми, както за интраабдоминално и за локално приложение, така и за интравенозно, интраартериално и интерстициално приложение, повишава ефективността на химиотерапията, което се изразява в повишаване на продължителността на живота на пациентите и подобряване на качеството на живот по време на курсовете на лечението и след това. Същевременно не се наблюдава никакво развитие на значими клинични или лабораторни странични ефекти при пациентите.

Следващата (третата) задача се решава от изобретението, за което се претендира, като се предлага метод за стабилизиране на антитуморни агенти на базата на воден разтвор (съединение) на платинено производно с дезоксирибонуклеинова киселина (Pt-ДНК). Съгласно този метод се използва смес от основен флуороурацил с урацил и урея в молно съотношение Pt-ДНК нуклеотид, основен флуороурацил, урацил и урея 1:(6-12:(0,6-1,2:(0,6-1,2) като допълнителен стабилизиращ агент, като концентрацията на протоните в разтвора се понижава до 8,4-9,9. Освен това, се използват съединения на платина с дезоксирибонуклеинова киселина (Pt-ДНК) в концентрация 1,3 ΟΙ,53 mg/ml, съдържащи натриев хлорид в обем 0,80-0,90 mg/ml, натриев цитрат в обем 0,40-0,53 mg/ml, амониев хлорид в обем 0,15-0,18 mg/ml и допълнителен стабилизиращ агент съгласно изобретението, а също така се използва и Pt-ДНК комплекс, чиито молекули не се отделят от разтвора при температура под 35°C.

Като част от лекарството Pt-ДНК макромолекулите могат да съдържат една от ДНК, изолирана от натурални източници или синтезирана по методите на генното инженерство, без молекулната маса да се ограничава до

0,3-20 милиона (млн) Далтона.

За да се повиши pH на лекарствения разтвор до 8,4-9,9 се използва или натриев хидроксид, или калиев хидроксид, или амониев хидроксид или който и да е друг фармацевтично приемлив регулатор на pH.

Описаният начин за стабилизиране се използва в технологията на получаване на антитуморните лекарства, изброени в Таблица 4, които се различават едно от друго по природата на ДНК, от която произлиза Pt-ДНК съединението.

Таблица 4

№ антитуморно лекарство	Характеристики на ДНК, от която произлиза Pt-ДНК съединението
Произход	Съотношение A+T/G+C	Молекулно тегло, млн Далтони
1	Обработена с генно инженерство ДНК от филаделфийска хромозома	1,38	0,3-0,5
2	Сперма от сьомга	1,43	0,3-0,5
3	Слезка от плъх	1,43	3-4
4	Слезка от едър рогат добитък, марка Б	1,36	4-7
5	Слезка от младо прасе, марка Б	1,43	5-6
6	Човешки чернодробен тумор	1,54	18-20
7	Левкемичен тумор на Schvets при плъх	1,04	17-18
8	Слезка от едър рогат добитък, марка А	1,36	7-14
9	Слезка от младо прасе, марка А	1.43	12-16

.Символи в таблицата: А - аденин, Т - тимин, G - гуанин, С - цитозин.

В практиката методът за стабилизиране на антитуморни лекарства се извършва по следния начин. Водният разтвор на допълнителния стабилизиращ агент, съдържащ смес от основен флуороурацил и урея, се добавя към водния разтвор на, съдържащ Pt-ДНК съединението, чиито молекули не се отделят от разтвора при температура под 35 °C, натриев • ·

хлорид, натриев цитрат и амониев хлорид. Същевременно, заедно с водния разтвор на стабилизиращия агент се добавя воден разтвор на pH регулатор, съдържащ натриев хидроксид с pH до 11-12, с помощта на който разтворът на прицелния агент се коригира до pH 8,4-9,9.

Специфичните условия за метода за стабилизиране на антитуморни лекарства, представени в Таблица 4, като са посочени и количествата на изходните компоненти в разтвора на основното съединение, в разтвора на допълнителния стабилизиращ агент и в разтвора на pH регулатора, са представени в Таблица 5, където Примери 1-9 се отнасят до метода, за който се претендира, а Примери 10 и 11 - до познатия метод.

Таблица 5

№ при ме Ра	№	Условия, при които се осъществява метода
Количество на изходните компоненти, g/1
в разтвора на основното съединение	в разтвора на допълнителния стабилизиращ агент	в разтвора нарН регулатора
Pt-ДНК	NaCl	Na₃Cyt	NH4CI	NaFu	Fu	Ura	Урея	NaOH
1	1	1,30	0,83	0,53	0,17		2,75	0,236	0,127	0,75
2	2	1,53	0,87	0,50	0,15		3,23	0,255	0,149	0,73
3	3	1,48	0,80	0,46	0,18		3,12	0,224	0,132	0,80
4	4	1,50	0,90	0,48	0,15		2,38	0,205	0,122	0,63
5	5	1,30	0,85	0,45	0,16		2,06	0,158	0,106	0,68
6	6	1,30	0,80	0,40	0,15		1,37	0,118	0,063	0,60
7	7	1,40	0,85	0,46	0,16		1,47	0,147	0,080	0,70
8	8	1,53	0,90	0,53	0,18		1,62	0,139	0,099	0,80
9	9	1,48	0,88	0,42	0,17		2,34	0,157	0,108	0,75
10	8	1,50	0,90	0,50	0,18	1,89
11	9	1,48	0,80	0,53	0,15	1,82

Символи в таблицата: NaCl - натриев хлорид; Na₃Cyt - натриев цитрат; NH4CI - амониев хлорид; NaFu - натриева сол на флуороурацил; Fu

- основен флуороурацил; Ura - урацил; Урея; NaOH - натриев хидроксид.

Характеристиките на метода, за който се претендира, в зависимост от условията, при които се осъществява и от температурата на съхранение на лекарството, са сравнени с характеристиките на познатия метод с помощта на данните, представени в Таблица 6, където Примери 1-9 се отнасят до метода, за който се претендира, а Примери 10 и 11 - до познатия метод.

Таблица 6

№ на примера	№ на антитуморно лекарство	Характеристики на метода
Температура на съхранение, °C	Концентрация на компонентите в лекарствения разтвор, mg/ml	Молно съотношение на Pt-ДНК нуклеотид, Fu, Ura и урея
Pt- ДНК	NaCl	Na₃Cyt	W1	NaFu	Fu	NaOH до достигане на pH на разтвора
1	1	25	1,30	0,87	0,53	0,17		2,75	9,5	1:12:1,2:1,2
2	2	20	1,53	0,83	0,50	0,15		3,22	9,4	1:12:1,1:1,2.
3	3	20	1,48	0,80	0,46	0,18		3,12	9,8	1:12:1:1,1
4	4	15	1,50	0,90	0,48	0,15		2,37	8,7	1:9:0,9:1,0
5	5	10	1,30	0,85	0,45	0,16		2,05	8,8	1:9:0,8:1,0
6	6	5	1,30	0,80	0,40	0,15		1,37	8,5	1:6:0,6:0,6
7	7	5	1,40	0,84	0,45	0,17		1,47	8,9	1:6:0,7:0,7
8	8	20	1,53	0,90	0,53	0,18		1,62	9,9	1:6:0,6:0,8
8	15	1,53	0,87	0,51	0,16		1,62	9,9	1:6:0,6:0,8
8	10	1,53	0,90	0,52	0,17		1,62	9,8	1:6:0,6:0,8
9	9	15	1,48	0,88	0,42	0,16		2,32	9,2	1:9:0,7:0,9
9	10	1,48	0,87	0,40	0,15		2,32	9,3	1:9:0,7:0,9
9	5	1,48	0,88	0,41	0,16		2,32	9,1	1:9:0,7:0,9
10	8	38	1,50	0,90	0,50	0,18	1,89		7,0
8	15	1,04	0,90	0,50	0,18	1,47		6,8
11	9	38	1,48	0,85	0,53	0,15	1,82		8,0
9	10	0,63	0,85	0,53	0,15	1,19		7,6

Разликите в характеристиките на метода, за който се претендира, и на познатия метод се доказват от различните стойности на pH, които се определят потенциометрично, и от липсата на температурна зависимост на концентрациите на основното съединение и на допълнителния стабилизиращ агент, контролирани с методите на количествения анализ. Разликите в концентрациите, които се появяват при спадане на температурата под 35 °C при познатия метод, са доказани в примерите в таблицата с намаляването на концентрацията на Pt-ДНК съединението от 1,50 mg/ml на 1,04 mg/ml, т.е. с 30,7%, а за NaFu от 1,89 mg/ml на 1,47 mg/ml, т.е. с 22% във водния разтвор на лекарството, съхранявано при 15°С.

Когато лекарството се съхранява при температура около 10°С концентрацията спада за Pt-ДНК от 1,48 mg/ml на 0,63 mg/ml, т.е. вече с цели 57,4%, а за NaFu от 1,82 mg/ml на 1,19 mg/ml, т.е. с 34,4%. Концентрациите на основното вещество и на допълнителния стабилизиращ агент в примерите на метода, за който се претендира, отговарят на концентрациите в разтворите, съхранявани при температури над 35 °C, което потвърждава способността на метода да осигури условия, при които Pt-ДНК макромолекулите и молекулите на основния флуороурацил да не се отделят

от разтвора при съхраняване на прицелния продукт в температурен интервал от 25-5°С.

Антитуморната активност, която метода, за който се претендира, и познатият метод за стабилизиране на лекарството могат да осигурят, се изследва с теста за цитотоксичност върху модел на клетки от анапластичен астроцитом от човешки мозък, адаптирани за култивиране. Клетките се държат в хранителна среда на Eagle с добавен ембрионален телешки серум, глюкоза и инсулин при постоянен състав на газовете и температура 36,5°С в инкубатор. В периода на интензивен растеж контролната клетъчна култура се обработва с нормален физиологичен разтвор, а експерименталните клетъчни култури се обработват с лекарствените разтвори, стабилизирани съгласно метода, за който се претендира, и съгласно познатия метод, които предварително са държани при температура 10°С. Културите се инкубират в продължение на 24 часа след обработването. Антитуморната активност се преценява според цитотоксичността, която се характеризира с относителното количество на клетките, загинали 24 часа след обработването с лекарствата, в сравнение с контролата. Резултатите от изчисленото относително количество загинали клетки, показано в проценти, са посочени в Таблица 7, където под №1 са показателите на контролната клетъчна култура, обработена с нормален физиологичен разтвор; под № 2-5 - показателите за експерименталните клетъчни култури, обработени с лекарствени разтвори, стабилизирани съгласно метода, за който се претендира, а под № 6 - показателите за експерименталните клетъчни култури, обработени с лекарствен разтвор, стабилизиран съгласно познатия метод.

Таблица 7

Клетъчни култури №№	Температура на съхранение, °C	Лекарство	Количество в ml на лекарството на 11 от култивираната култура	Концентрация на Pt-ДНК в култивираната култура	Процент загинали клетки
1	10	Нормален физиологичен разтвор	0,02		1,7
2	10	Лекарство № 8, стабилизирано по метода, представен в Пример 8	0,02	30,6	86,4
3	10	Лекарство № 9, стабилизирано по метода, представен в Пример 9	0,02	29,6	80,4
4	10	Лекарство № 5, стабилизирано по метода, представен в Пример 5	0,02	26,0	78,8
5	10	Лекарство № 3, стабилизирано по метода, представен в Пример 3	0,02	29,6	82,1
6	10	Лекарство № 9, стабилизирано по метода, представен в Пример 9	0,02	12,6	32,2

Данните в Таблица 7 свидетелстват, че при сравнение на количествената оценка на антитуморната активност с теста за цитотоксичност методът за стабилизиране, за който се претендира, е значително по-добър от познатия метод. Съхранявани при еднаква температура от 10°С и прилагани в еднакви обеми от 0,02 ml с идентични количества от 1,48 mg/ml Pt-ДНК, при температура над 35°С водните разтвори на лекарството, стабилизирани по познатия метод, дават концентрация на основното вещество само 12,6 mg/1 след добавянето им към културелната среда в обем 1 1, което води до разрушаване само на 32,2 %, докато водните разтвори, стабилизирани по метода, за който се претендира, след добавянето им към културелната среда, дават концентрация на Pt-ДНК 29,6 mg/1, което води до разрушаване на 80,482,1% от клетките.

Следователно, предложеният метод за стабилизиране осигурява повишен селективен специфичен ефект на Pt-ДНК съединението и неговата повишена терапевтична ефективност дори при температури от 25-5 °C, а също така осигурява улеснени условия за съхранение и разширен спектър на

приложение чрез използването на платинено съединение с дезоксирибонуклеинова киселина (Pt-ДНК), чиито молекули не се отделят от разтвора при температура под 35 °C чрез на използване на смес от основен флуороурацил с урацил и урея, а също и чрез използване на разтвора с понижена концентрация на протони.

Антитуморните лекарства, стабилизирани по метода, за който се претендира, могат да се използват в различни дозиращи форми.

Опитът при клинично приложение на лекарствата, стабилизирани по метода, за който се претендира, показва, че използването им в дозиращи форми, както за интраабдоминално и за локално приложение, така и за интравенозно, интраартериално, ендолимфно и интерстициално приложение, повишава ефективността на терапията на първични и метастатични тумори, локализирани в главата, шията, белите дробове, бъбреците, органите на • · храносмилателната система и опорно-двигателната система. Повишаването на ефективността се изразява в повишаване на продължителността на живота на пациентите и подобряване на качеството на живот по време на курсовете на лечението и след това. Същевременно не се наблюдава никакво развитие на значими клинични или лабораторни странични ефекти при пациентите.

Claims

1. Антитуморно лекарство на базата на воден разтвор на платинено производно с полианион на дезоксирибонуклеинова киселина, характеризиращо се с това, че включва не-асоциирани Pt-ДНК макромолекули с размер 0,05-0,15 микрона в най-голямото си измерение, натриев хлорид, натриев цитрат, амониев хлорид и флуороурацил под формата на натриева сол, различаващо се по това, че съдържа допълнително урацил и урея в молно съотношение на флуороурацил, урацил и урея 1:1:1, при съотношение на компонентите във водния разтвор, тегловни %:

Pt-ДНК

- 0,130-0,153

Натриев хлорид - 0,080 - 0,090

Натриев цитрат - 0,040 - 0,053

Амониев хлорид - 0,015-0,018

Урацил - 0,018-0,270

2. Антитуморно лекарство съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че се плътността на разтвора е 1,0054-1,0058 g/cm .

3. Метод за получаване на антитуморно лекарство, характеризиращ се с това, че включва поддържане на ДНК нишките в продължение на 16-26 часа в цитратно-солеви разтвор, който съдържа натриев хлорид и натриев цитрат, разтваряне на нишките като се разбърква механично и загряване на ДНК разтвора до 70-90°С, постепенно въвеждане на цитратно-солевия разтвор на цис-дихлоро-диамино-платина (DDP), загрят до същата температура, в също загретия ДНК разтвор, добавяне към сместа на воден разтвор на натриева сол • · на флуороурацил и термостатен контрол на сместа на разтворите на ДНК и DDP при 70-90°С в продължение на 15-20 минути и добавяне към сместа на разтворите на ДНК и DDP на воден разтвор на натриева сол на флуороурацил преди термостатния контрол. Този метод се различава по това, че преди термостатния контрол, заедно с воден разтвор на натриева сол на флуороурацил, трябва да се добави и воден разтвор на урацил и воден разтвор на урея в концентрации, които отговарят на молно съотношение на флуороурацил, урацил и урея 1:1:1, а също и воден разтвор на натриев хидроксид с pH 11,0-12,0; след което лекарственият разтвор се коригира до pH 8,4-9,9 и до плътност 1,0054-1,0058/ст³.

4. Метод за стабилизиране на антитуморни агенти на базата на воден разтвор на платинено производно с дезоксирибонуклеинова киселина (PtДНК). Този метод се различава по това, че се използва смес от основен флуороурацил с урацил и урея в молно съотношение на Pt-ДНК нуклеотид, основен флуороурацил, урацил и урея, 1:(6-12:(0,6-1,2:(0,6-1,2) като допълнителен стабилизиращ агент, понижавайки концентрацията на протони в разтвора до 8,4-9,9.

5. Метод съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че концентрацията на Pt-ДНК комплекса е 1,30-1,53 mg/ml.

6. Метод съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че лекарството съдържа допълнително натриев хлорид в количество от 0,80-0,90 mg/ml.

7. Метод съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че лекарството съдържа допълнително натриев цитрат в количество от 0,40-0,53 mg/ml.

8. Метод съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че лекарството съдържа допълнително амониев хлорид в количество от 0.15 - 0.18 mg/ml.

9. Метод съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че се използва терапевтично приемлива ДНК, възстановена от натурални източници или синтезирана с помощта на методите на генно инженерство, с молекулно тегло от 0,3- 20 милиона Далтона.

ti* ·>··

10. Метод съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че за коригиране на pH в лекарствените разтвори до 8,4-9,9 се използва или натриев хидроксид, или калиев хидроксид, или амониев хидроксид или който и да е друг фармакологично приет pH регулатор.

11. Антитуморно лекарство на базата на воден разтвор на платинено производно (съединение) с дезоксирибонуклеинова киселина, стабилизирано съгласно претенция 4.