PL216370B1

PL216370B1 - Sposób otrzymywania 4-N-furfurylocytozyny, kompozycja antystarzeniowa oraz zastosowanie 4-N-furfurylocytozyny do wytwarzania kompozycji antystarzeniowej

Info

Publication number: PL216370B1
Application number: PL383867A
Authority: PL
Inventors: Jan Barciszewski; Wojciech T. Markiewicz; Eliza Wyszko; Maria Markiewicz; Monika Nowak; Katarzyna Rolle; Ewelina Adamska; Marcin K. Chmielewski
Original assignee: Inst Chemii Bioorg Pan
Priority date: 2007-11-25
Filing date: 2007-11-25
Publication date: 2014-03-31
Also published as: EP2225228B1; ES2610209T3; WO2009067035A3; PL383867A1; PL2225228T3; DK2225228T3; WO2009067035A2; US8404660B2; EP2225228A2; US20100317612A1

Description

Przedmiotami wynalazku są sposób wytwarzania 4-N-furfurylocytozyny, jej zastosowanie do wytwarzaniu kompozycji antystarzeniowej oraz kompozycja antystarzeniowa. 4-N-furfurylocytozyna charakteryzuje się licznymi właściwościami biologicznymi, dzięki którym może być ona wykorzystana jako kompozycja przeciwstarzeniowa, przeciwdziałająca obwisaniu i zwiotczeniu skóry, a także poprawieniu jej wyglądu, przy czym jej stosowanie nie powoduje istotnych zmian związanych ze wzrostem oraz rozwojem komórek skóry. W rozwiązaniu tym przedstawiono optymalne sposoby otrzymania tego związku, równocześnie przeprowadzane reakcje charakteryzują się wysoką wydajnością reakcji, a uzyskana 4-furfurylocytozyna może być zastosowana w przemyśle farmaceutycznym i kosm etycznym.

W zgłoszeniach patentowych JP2000319184 (opubl. 2000-11-21) oraz W09220340 (opubl. 1992-11-26) przedstawiono sposób poprawy wyglądu skóry ssaków poprzez zastosowanie odpowiedniej dawki podstawionej cytokininy aminopurynowej. Kompozycja zawierająca skuteczną dawkę

6-podstawionej cytokininy aminopurynowej (np. kinetyny 6-furfuryloaminopurynowej lub podobnej] stosowana jest na skórę ssaków w takiej ilości by poprawić jej wygląd estetyczny, przy równoczesnym nie wywołaniu istotnych zmian w rozwoju komórek tkanki skórnej oraz wpływu na współczynnik ich wzrostu.

W opisach patentowych CA2107896 (opubl. 1992-11-17), CA1339503 (opubl. 1997-10-21) opisano sposób i kompozycję do leczenia hiperproliferacyjnych chorób skóry z zastosowaniem cytokinin

6-aminopurynowych. Odkryto, że 6-podstawione cytokininy aminopurynowe, takie jak kinetyna, indukują różnicowanie komórek i w konsekwencji redukują bądź eliminują nieprawidłowo wysokie namnażanie hiperproliferujących komórek, związanych z hiperproliferacyjnymi chorobami skóry, takimi jak łuszczyca.

W opisie patentowym US5151425 (opubl. 1992-09-29) opisano sposób oraz kompozycję do leczenia stanów zapalnych oraz stosowaną w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej. Cytokininy roślinne działają skutecznie w przypadku leczenia stanów zapalnych, przyspieszają proces gojenia miejsc objętych zmianami chorobowymi oraz przynoszą natychmiastowe ukojenie w przypadku bólu, świądu oraz występowania innych reakcji immunologicznych będących skutkiem stanu zapalnego. Cytokinina roślinna jest podawana ssakom w odpowiedniej kompozycji farmaceutycznej. Kompozycje te zawierają cytokininę roślinną w odpowiednim nośniku nadającym się do naniesienia na skórę, np. maści hydrofilowej, alkoholu izopropylowego, bądź pudru.

W zgłoszeniu patentowym W02006080262 (opubl. 2006-08-03) opisano aptamer AGE-2. Aptamer AGE-2 wiąże się do końcowego produktu zaawansowanej glikacji (AGE-2) wywodzącego się z aldehydu glicerynowego, jednak nie do ludzkiej albuminy osocza i zawiera przynajmniej 35 zasad i, gdzie zawartość cytozyny w zasadach wynosi przynajmniej 35%, a guaniny przynajmniej 32%.

W zgłoszeniu patentowym KR20010001290 (opubl. 2001-01-05) opisano kompozycje do zewnętrznego zastosowania, które wykazują skuteczne działanie przeciwko zmarszczkom oraz hamują ich powstawanie. Kompozycja zawiera retinol, sterol roślinny, izoflawonoid, cytokininę oraz kwas glicerynowy.

W zgłoszeniu patentowym JP2001031549 (opubl. 2001-02-06) opisano czynnik rekonstruujący pęczki włókien kolagenowych skóry oraz zawierającą ten czynnik kompozycję kosmetyczną. Związek ten może być ekstrahowany z roślin bądź syntetyzowany z adeniny i innych surowców. Zawartość czynnika rekonstrukcyjnego wykorzystywanego w preparatach skórnych stosowanych zewnętrznie wynosi korzystnie 0,001 do 5% wag., a szczególnie korzystnie 0,005 do 1% wag.

W zgłoszeniu patentowym US4753948 (opubl. 1988-06-28) opisano pochodne furfurylu bisindoli typu winblastyny oraz kompozycje farmaceutyczne je zawierające. Wynalazek dotyczy nowych pochodnych furfurylu o wzorze ogólnym (I), w którym R1 oznacza atom wodoru lub grupę acetylową, R2 oznacza grupę hydroksylową bądź etylową w pozycji beta, R3 oznacza grupę etylową w pozycji alfa; R4 oznacza atom wodoru; bądź R3 i R4 razem reprezentują mostek tlenowy; a B oznacza grupę hydroksylową grupy O-acylowy, oraz dodatek wodorosoli, rozwiązanie dotyczy także kompozycji farmaceutycznych zawierających nowe pochodne furfurylu. Związki o ogólnym wzorze (I) wykazują aktywność cytostatyczną o mniejszej toksyczności niż te dostępne komercyjnie, znane jako leki - alkaloidy bis-indoli typu winblastyny.

Pomimo opisanych powyżej związków i sposobów ich otrzymywania, a także kompozycji przeznaczonych do użytku zewnętrznego, wykazujących skuteczne działanie przeciwko procesom starzePL 216 370 B1 nia skóry - przeciw zmarszczkom oraz procesu hamowania ich powstawania, kompozycji zawierających cytokininy, podstawione cytokininy oraz nowe pochodne furfurylu, które po naniesieniu na skórę ssaków znacząco poprawiają jej wygląd, istnieje ciągle potrzeba otrzymania optymalnego sposobu wytwarzania związków, wykazujących aktywność cytostatyczną, przy jednocześnie mniejszej toksyczności, w stosunku do preparatów stosowanych w pielęgnacji skóry oraz do hamowania procesów chorobowych związanych z nieprawidłowym namnażaniem oraz obumieraniem komórek skóry.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu umożliwiającego otrzymanie 4-N-furfurylocytozyny, która będzie mogła być następnie zastosowana w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym do wytwarzania preparatów antystarzeniowych, uzyskując tym samym kompozycje wykazujące aktywność cytostatyczną, stosowane zewnętrznie na skórę i, charakterystyczne właściwości przeciwstarzeniowe, zapobiegające procesom starzenia skóry, takie jak powstawanie zmarszczek, obwisanie skóry oraz utratę jej elastyczności.

Realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów związanych z otrzymaniem kompozycji przeciwstarzeniowych nadających się do zastosowania na skórę ssaków, w takiej ilości by poprawiły jej wygląd nie powodując przy tym zmian we wzroście namnażania komórek tkanki skórnej, zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania 4-N-furfurylocytozyny, charakteryzujący się tym, że wytwarzanie 4-N-furfurylocytozyny obejmuje etap reakcji, w którym wodny roztwór cytozyny uzupełnia się furfuryloaminą i katalizatorem, korzystnie chlorkiem amonu, po czym mieszaninę doprowadza się do wrzenia przez 48 do 96 godzin, schładza i ekstrahuje chlorkiem metylenu, następnie warstwę organiczną przesącza się w celu wyizolowania produktu, zaś czysty produkt poddaje się krystalizacji.

Korzystnie, stosunek molowy cytozyny do furfuryloaminy do katalizatora chlorku amonu wynosi 0,36 : 6 : 0,3.

Korzystnie, gdy sposób otrzymywania 4-N-furfurylocytozyny jest procesem jednoetapowym.

Korzystnie, gdy synteza 4-N-furfurylocytozyny składa się z trzech etapów, przy czym w pierwszym etapie syntezuje się 4-N-p-toluenosulfonylo-2'-deoksycytydynę, w etapie drugim przeprowadza się reakcję furfuryloaminy z 4-N-p-tosylonylo-2'-deoksycytydyną, zaś trzeci etap polega na utworzeniu 4-N-furfurylocytozyny przez degradację wiązania N-glikozydowego wodnym roztworem nieorganicznego kwasu, przy czym równocześnie po utworzeniu 4-N-furfurylocytozyny, kwas odparowuje się lub zobojętnia wodnym roztworem NaOH, zaś powstałą sól odseparowywuje się na kolumnie chromatograficznej, zaś oczyszczanie związku na kolumnie chromatograficznej wykonuje się przynajmniej dwukrotnie, po czym główny produkt wymywa się wodnym roztworem metanolu, a następnie 4-N-furfurylocytozynę poddaje się krystalizacji w wodzie i otrzymuje się bezbarwne kryształy w formie cienkich igieł.

Korzystnie, gdy degradację wiązania N-glikozydowego w trzecim etapie przeprowadza się przy zastosowaniu wodnego roztworu nieorganicznego kwasu o pH zawartym w przedziale 3-3,5, zaś powstałą sól odseparowywuje się na kolumnie chromatograficznej w temp. 40-45°C, a główny produkt wymywa się wodnym 0,1% roztworem metanolu.

Korzystnie, gdy wydajność reakcji wynosi nie mniej niż 85%.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja antystarzeniowa, charakteryzująca się tym, że zawiera 4-N-furfurylocytozynę.

Korzystnie, gdy zawartość 4-N-furfurylocytozyny w kompozycji wynosi do 2%.

Jeszcze kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie 4-N-furfurylocytozyny do wytwarzania kompozycji antystarzeniowych.

Korzystnie, gdy zawartość 4-N-furfurylocytozyny w preparatach antystarzeniowych wynosi do 2%.

Załączone figury umożliwiają lepsze zrozumienie wynalazku.

Figura 1 przedstawia opisaną syntezę 4-N-furfurylocytozyny, gdzie:

(I) 4-N-p-toluenosulfonylo-2^,-deoksycytydyna, (II) 4-N-furfurylo-2'-deoksycytydyna, (III) 4-N-furfurylocytozyna, (IV) cytozyna i (a) furfuryloamina (V), (5 equiv.) w pirydynie, 80°C, 24 h; (b) 1M wodny HCl, 100°C, 0,5 h.

Figura 2 przedstawia analizę cytotoksyczności furfurylocytozyny (FC) w komórkach fibroblastów hodowanych od 1 dnia do 5 tygodni.

A. Obraz komórek fibroblastów traktowanych 100 μΜ furfurylocytozyny w stosunku do „nietraktowanej'' FC kontroli (C). Komórki były sprawdzane po 1 dniu do 5 tygodni.

PL 216 370 B1

B. Analiza RT-PCR ekspresji cDNA GAPDH w komórkach fibroblastów hodowanych przez 5 tygodni w obecności 100 μΜ FC w stosunku do „nietraktowanej kontroli. Całkowite RNA było izolowane z żywych komórek w celu przeprowadzenia reakcji RT. PCR wykonano ze specyficznymi primerami.

Fragmenty 300 bp (par zasad) były oddzielane na 1% agarozie barwionej bromkiem etydyny.

C. Wykres przedstawiający udział procentowy ekspresji cDNA GAPDH pod wpływem FC. 100% ekspresja GAPDH była uzyskana dla komórek kontrolnych. Różnice w poziomie ekspresji zostały określone przy zastosowaniu programów Phosphoimager oraz ImageQant.

Figura 3 przedstawia wpływ furfurylocytozyny (FC) na ekspresję genu DNMT-1 w komórkach HeLa.

A. Obrazy komórek HeLa hodowanych przez 24 godziny, traktowanych 100 μΜ FC w stosunku do komórek „nietraktowanych”.

B. Analiza RT-PCR ekspresji genu DNMT-1 (500 bp) w komórkach HeLa traktowanych FC w stosunku do komórek .,nietraktowanych”. Analiza GAPDH ekspresji genu (300 bp) została przygotowana jako kontrola wewnętrzna. Fragmenty DNA były rozdzielane na 1% żelu agarozowym wybarwianym bromkiem etydyny.

Poniżej przedstawiono przykładowe rozwiązania wynalazku, w celu jego lepszego zrozumienia.

Przykłady

Wszystkie stosowane rozpuszczalniki oczyszczano i osuszano według standardowych metod. Do przeprowadzonych reakcji zastosowano powszechnie dostępne odczynniki: chlorek trimetylosililuTMSCI (POCh, Polska), chlorek kwasu p-toluenosulfonowego (Fluka), skoncentrowana woda amoniakalna (Merck), furfuryloamina (Fluka). Analizę chromatograficzną cienkowarstwową (TLC) wykonano na płytkach firmy Merck pokrytych żelem krzemionkowym Silicagel 60 F254, stosując jako eluent mieszaninę (A) dichlorometan/metanol (8:2). Do detekcji absorbancji UV stosowano promieniowanie ultrafioletowe (254 nm). Rozdział chromatograficzny wykonywano na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym o odwrotnej fazie firmy Merck 60 0,063 - 0,200 mm. Jako układ rozciągający użyto: ciepłą wodę/metanol (99,9:0,1). Widma ¹H-NMR i 01 ¹³C-NMR zarejestrowano na spektrometrze DMSO i DMSO, gdzie jako rozpuszczalnik zastosowano D2O, natomiast widmo masowe ES-MS na aparacie ES-MS Micromass ZQ firmy Waters.

P r z y k ł a d 1.

Synteza chemiczna 4-N-furfurylocytozyny w trzech etapach

Synteza chemiczna 4-N-furfurylocytozyny została uzyskana w trzech etapach (fig. 1). Etap pierwszy obejmował syntezę 4-N-p-toluenosulfonylo-2-deoksycytydyny (fig. 1 I), która była uzyskana zgodnie z procedurą opracowaną przez Markiewicz et al. [Markiewicz W.T., Groger G., Rosch R., Zebrowska A., Markiewicz M., Klotz M., Godzina P. and Seliger H. „New method of synthesis of fluorescently labelled oligonucleotides and their application in DNA sequencing” (1997) Nucleic Acid Res., 25, 18, 3672-3680],

Drugi etap obejmował reakcję furfuryloaminy (fig. 1 V) z 4-N-p-toluenosulfonylo-2'-deoksycytydyny (fig. 1 I). Trzeci etap był zależny od utworzenia 4-N-furfurylocytozyny (fig. 1 III), poprzez rozpad wiązania N-glikozylowego poprzez zastosowanie roztworu nieorganicznego kwasu w wodzie (pH roztworu ok. 3). Po zakończeniu reakcji (co potwierdzał ciemnożółty kolor mieszaniny reakcyjnej), kwas odparowywano, bądź neutralizowano poprzez zastosowanie wodnego roztworu NaOH, a wodę odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem do suchej pozostałości. Produkt wyizolowano na kolumnie chromatograficznej o fazie odwróconej. Główny produkt reakcji wykazywał niską rozpuszczalność we wszystkich rozpuszczalnikach, ale najlepiej był rozpuszczalny w wodzie, i w podwyższonej temperaturze. Z tego powodu, oczyszczania na kolumnie dokonywano przy zastosowaniu ciepłej wody (40-45°C). Kolumna była owinięta folią aluminiową, gdyż obniżenie temperatury wody prowadzone było w celu wytrącenia produktu na żelu. Oczyszczanie produktu wykonywane było dwukrotnie, ze względu na to, że degradacja kwasowa rybozy prowadziła do wielu produktów pośrednich, utrudniających proces oczyszczania.

Główny produkt wyizolowano stosując jako eluent 0,1% roztwór metanolu w ciepłej wodzie. Gdy temperatura rozpuszczalnika była wyższa niż 45°C, produkt mógł być wyizolowany szybciej. 4-N-furfurylocytozyna była krystalizowana w wodzie, dając bezbarwne kryształy w kształcie igieł.

Do roztworu 4-N-p-toluenosulfonylo-2-deoksycytydyny, (1,098; 2,878 mmol) w bezwodnej pirydynie (5,7 ml) dodano furfuryloaminę (1,3 ml; 14 mmol). Kolbę reakcyjną zamknięto i pozostawiono w suszarce o temp. 80°C na 12 godzin. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano dichlorometan (15 ml) i całość ekstrahowano wodą (3x15 ml). Wodną warstwę (zawierającą produkt) odparowano

PL 216 370 B1 pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano białą pianę z wydajnością około 85%. Analiza TLC wskazała, kompletne przereagowanie: Rt(A) 0.61.

¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 1,9 (m, 1H); 3,5 (d, J=2,9 Hz, 2H); 3.7 (m, 1H);

4,2 (m, 1H); 4,5 (d, J=5,5 Hz, 2H); 4,9 (t, J=4,4 Hz, 1H); 5,2 (d, J=2,9 Hz, 1H);

5,8 (d, J=7,4 Hz, 1H); 6,1 (t, J=0,79 Hz, J=0,32 Hz, 1H); 6,3 (dd, J=0,79 Hz, J=0,32 Hz, 1H); 6,4 (dd, J=3,2 Hz, J=1,8 Hz, 1H); 7,3 (dd, J=0,79 Hz, J=0,18 Hz, 1H); 8 (t, J=5,5 Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, DMSO) δ 20,88; 61,34; 70,37; 84,89; 87,89; 94,41; 107,24; 110,48; 125,59; 129,26; 140,23; 142,24; 151,75; 154,92; 163,10.

4-N-furfurylo-2'-deoksycytydynę (fig. 1 II) (2) (7,51 mg; 2,45 mmol) roztwarzano w 20 ml wodnego 1M roztworu kwasu HCl, po czym mieszaninę reakcyjną ogrzewano do wrzenia przez godzinę, do momentu pojawienia się żółtego koloru roztworu. Następnie, mieszaninę zobojętniono 1M wodnym roztworem NaOH. Mieszaninę reakcyjną odparowywano do sucha pod zredukowanym ciśnieniem. 4-N-furfurylocytozynę (3) izolowano na kolumnie chromatograficznej wypełnionej silikażelem, stosując jako eluent 0,1% roztwór metanolu w ciepłej wodzie (40-45°C). Otrzymano biały proszek z wydajnością 90%. Analiza TLC wykazała, że reakcja zaszła kompletnie: R_f(A) 0,54. ES-MS: ES” m/z 190(M-H+), 191(M); ES⁺ m/z 192(M+H⁺), 214(M+K⁺).

¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 4,4 (d, J=5,4 Hz, 2H); 5,6 (d, J=7,1 Hz, 1H); 6,3 (dd, J=0,73 Hz, J=3,2 Hz, H1); 6,4 (dd, J= 1,9 Hz, J=3,2 Hz); 7,2 (d, J=7,1, 1H), 7,6 (dd, J=0,73 Hz, J=1,9 Hz); 7,9 (t, J=5,6 Hz, J=5,1 Hz, 1H); 10,3 (s, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, DMSO) δ 20,88; 93,10; 107,16; 110,46; 125,59; 129,27; 141,82; 151,96; 156,55; 164,29.

4-N-furfurylocytozyna została rozpuszczona w minimalnej ilości wody, w jakiej produkt się rozpuszcza. Mieszanina została pozostawiona na noc w temperaturze otoczenia. Otrzymane kryształy odsączono i przemyto chlorkiem metylenu, a następnie suszono pod zmniejszonym ciśnieniem przez całą noc.

Do kolby kulistej, w której znajdowało się 40 g cytozyny (0,36 mol) dodano 190 ml furfuryloaminy (6 mol), taką samą ilość wody i 5,67 g katalizator - chlorek amonu (0,3 mol). Mieszaninę ogrzewano do wrzenia przez 48 - 96 h. Po schłodzeniu, mieszaninę reakcyjną ekstrahowano chlorkiem metylenu (ca. 300 ml). Warstwę organiczną przesączano w celu wyizolowania produktu. Surowy produkt poddano krystalizacji otrzymując 61,196 g czystego produktu z wydajnością 89%.

P r z y k ł a d 2.

Synteza chemiczna 4-N-furfurylocytozyny wyniku jednoetapowej reakcji

Celem syntezy było otrzymanie 4-N-furfurylocytozyny. Produkt ten otrzymano w jednoetapowej reakcji, w której cytozynę ogrzewano w wodnym roztworze furfuryloaminy. Do przeprowadzonych reakcji zastosowano dostępne odczynniki: cytozynę (Fluka), furfuryloaminę (Fluka). Analizę chromatograficzną cienkowarstwową TLC wykonano na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym Silicagel 60 F254 (Merck). Do detekcji absorbancji UV stosowano promieniowanie ultrafioletowe (254 nm). Widma ¹H-NMR i ¹³C-NMR zarejestrowano na spektrometrze Varian 300 MHz. Widmo masowe (EMS) zostało zmierzone przy zastosowaniu aparatu ES-MS ZQ (W aters) .

4-N-furfurylocytozyna (2)

Do kolby kulistej, w której znajdowało się 40 g cytozyny (0,36 mol) dodano 190 ml furfuryloaminy (6 mol) (fig. 1 IV i V), taką samą ilość wody i 5,67 g katalizatora - chlorku amonu (0,3 mol). Mieszaninę ogrzewano do wrzenia przez 48-96 h. Po schłodzeniu, mieszaninę reakcyjną ekstrahowano chlorkiem metylenu (ca. 300 ml). Warstwę organiczną przesączano w celu wyizolowania produktu. Surowy produkt poddano krystalizacji otrzymując 61,196 g czystego produktu z wydajnością 89%.

P r z y k ł a d 3.

Oczyszczanie produktu

Główny produkt (4-N-furfurylocytozyna) wykazuje niską rozpuszczalność we wszystkich rozpuszczalnikach, przy czym najlepiej rozpuszczalny jest w wodzie, w podwyższonej temperaturze. Z tego powodu, oczyszczania na kolumnie dokonywano przy zastosowaniu ciepłej wody (40-45°C). Kolumna była owinięta folią aluminiową, gdyż obniżenie temperatury wody prowadzone było w celu wytrącenia produktu na żelu. Oczyszczanie produktu wykonywane było dwukrotnie, ze względu na to, że degradacja kwasowa rybozy prowadziła do wielu produktów pośrednich, utrudniających proces oczyszczania.

PL 216 370 B1

Główny produkt wyizolowano stosując jako eluent 0,1% roztwór metanolu w ciepłej wodzie. Gdy temperatura rozpuszczalnika była wyższa niż 45°C, produkt mógł być wyizolowany szybciej. 4-N-furfurylocytozyna była krystalizowana w wodzie, dawała bezbarwne kryształy, w kształcie igieł.

P r z y k ł a d 4

Wpływ 4-N-furfurylocytozyny na morfologię komórek pasażowanych po 7 i 14 dniach

Badano rolę furfurylocytozyny (FC) w odniesieniu do cytotoksyczności (indukcji apoptozy, ekspresji genów). Badania doprowadziły do konkluzji, że zastosowanie FC prowadzi do zaskakujących wniosków, oraz stwierdzenia że działanie FC nie było do tej pory znane, a także wskazuje na duży potencjał możliwości zastosowania FC jako czynnika chemoterapeutycznego.

Na początku konieczne było ustalenie efektu cytotoksycznego FC na przeżywalność komórek fibroblastów - w tym celu komórki fibroblastów hodowane były z 100 μΜ FC przez 5 tygodni. Obserwowano obniżanie żywotności komórek od razu po 3 tygodniu, podczas gdy hodowla kontrolna, nie traktowana FC, rozwijała się dobrze. Zaobserwowano zdecydowanie mniej żywych komórek, a po 5 tygodniach większość była wyraźnie martwa (fig. 2A).

W celu potwierdzenia tej obserwacji całkowite RNA było izolowane i przeprowadzono RT/PCR w celu analizy całkowitej ekspresji genu GAPDFI, w komórkach które przeżyły (fig. 2B). Analiza odwzorowania (phosphoimager) wykonywana była w celu dokonania oceny różnic w ekspresji GAPDH zachodzącej w komórkach fibroblastów. Zaobserwowano, że w komórkach traktowanych FC była ona o 72% niższa w porównaniu do komórek kontrolnych (fig. 2C).

W innym doświadczeniu analizowano wpływ FC na specyficzną ekspresję genu. W tym przypadku analiza dotyczyła DNMT-1. Wpływ FC na ekspresję DNMT-1 był sprawdzany w komórkach HeLa po 24 godzinach (fig. 3A). Zaobserwowano podwyższenie ekspresji DNMT-1 w komórkach traktowanych FC, w porównaniu do prób kontrolnych komórek HeLa, które nie były traktowane FC. Poziom ekspresji GAPDH był stały i zbliżony (fig. 3B).

Hodowla komórkowa

Komórki HeLa i fibroblasty wykorzystywane są w pracowni rutynowo. Komórki fibroblastów były hodowane na pożywce Optimem wzbogaconej 10% płodową surowicą cielęcą oraz antybiotykami, komórki HeLa hodowane były na pożywce RPMI 1640 wzbogaconej 10% płodową surowicą cielęcą oraz antybiotykami (penicyliną 100 U/ml i streptomycyną 100 μg/ml). Wszystkie linie komórkowe były inkubowane w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w powietrzu w temp. 37°C.

Do badań efektu cytotoksyczności FC na rozwój komórek w obecności lub nieobecności FC wykorzystano 1 x 10⁶ komórek na 6-studzienkowych płytkach.

Izolacja RNA i analiza PCR

Całkowite RNA z komórek było izolowane przy zastosowaniu jako odczynnika TRIZOL-u (Invitrogen). Próbki do analizy ekspresji genu były przygotowywane z porcji roztworu zawierających hodowane komórki HeLa i fibroblastów (1 x 10⁶ komórek), skąd były usuwane i homogenizowane w odczynniku TRIZOL (Invitrogen). Całkowite RNA było następnie ekstrahowane chloroformem i wytrącane przy zastosowaniu izopropanolu i etanolu. Przeprowadzano odwróconą transkrypcję stosując: 2 μg RNA, primer statystycznie losowy i RevertAid™ H Minus M-MuLV odwróconą transkryptazę (Fermentas) zgodnie z instrukcjami producenta. Otrzymane cDNA było amplifikowane primerami komplementarnymi do dehydrogenazy fosforanu-3-aldehydu glicerynowego, GAPDH (G1: GGGTGGAGCCAAACGGGTC, G2: GGAGTTGCTGTTGAAGTCGCA). Reakcja PCR została zainicjo-wana denaturacją w 94°C przez 2 min, annealing w 55°C przez 1 min, wydłużanie w 72°C przez 30 sekund, prowadzonej w 30 cyklach. Równe ilości amplifikowanych produktów zostały poddane elektroforezie na 1% żelu agarozowym, po czym wybarwiano je bromkiem etydyny.

Różnice w poziomie ekspresji zostały określone przy wykorzystaniu programów Phosphoimager i ImageQant.

Wnioski

Wyniki wskazują, że furfurylocytozyna (FC) indukuje efekt cytotoksyczny w przypadku komórek fibroblastów hodowanych przez dłuższy czas (5 tygodni). Zjawisko to zaobserwowano po upływie 3 tygodnia hodowli komórek i stwierdzono zależność pomiędzy żywotnością komórek fibroblastów a obecnością FC. W celu wyjaśnienia tego efektu komórki HeLa były traktowane FC, po to by dokonać analizy specyficznej ekspresji genu.

Zaobserwowano, że FC inhibuje ekspresję metyltransferazy DNA (DNMT-1) w komórkach HeLa w porównaniu do prób kontrolnych. Metylacja dinukleotydów CpG w odcinkach promotorowych decyduje o transkrypcji genów i może być przyczyną wyciszania transkrypcyjnego. Enzym ten odgrywa

PL 216 370 B1 istotną rolę w procesach regulacji w komórkach ssaków. Alteracja - zmiana w szlaku metylacji DNA może wspomagać powstawanie nowotworu oraz predysponować geny do ulegania mutacjom. Furfurylocytozyna stanowi związek niskocząsteczkowy, który może blokować ekspresję DNMT-1 i dzięki temu może być zastosowana jako potencjalny inhibitor w przemyśle farmaceutycznym oraz kosmetycznym.

Claims

1. Sposób otrzymywania 4-N-furfurylocytozyny, znamienny tym, że wytwarzanie 4-N-furfurylocytozyny obejmuje etap reakcji, w którym wodny roztwór cytozyny uzupełnia się furfuryloaminą i katalizatorem, korzystnie chlorkiem amonu, po czym mieszaninę doprowadza się do wrzenia przez 48 do 96 godzin, schładza i ekstrahuje chlorkiem metylenu, następnie warstwę organiczną przesącza się w celu wyizolowania produktu, zaś czysty produkt poddaje się krystalizacji.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek molowy cytozyny do furfuryloaminy do katalizatora chlorku amonu wynosi 0,36 : 6 : 0,3.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że sposób otrzymywania 4-N furfurylocytozyny jest procesem jednoetapowym.

4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że synteza 4-N-furfurylocytozyny składa się z trzech etapów, przy czym w pierwszym etapie syntezuje się 4-N-p-toluenosulfonylo-2'-deoksycytydynę, w etapie drugim przeprowadza się reakcję furfuryloaminy z 4-N-p-tosylonylo-2'-deoksycytydyną, zaś trzeci etap polega na utworzeniu 4-N-furfurylocytozyny przez degradację wiązania N-glikozydowego wodnym roztworem nieorganicznego kwasu, przy czym równocześnie po utworzeniu 4-N-turfurylocytozyny, kwas odparowuje się lub zobojętnia wodnym roztworem NaOH, zaś powstałą sól odseparowywuje się na kolumnie chromatograficznej, zaś oczyszczanie związku na kolumnie chromatograficznej wykonuje się przynajmniej dwukrotnie, po czym główny produkt wymywa się wodnym roztworem metanolu, a następnie 4-N-furfurylocytozynę poddaje się krystalizacji w wodzie i otrzymuje się bezbarwne kryształy w formie cienkich igieł.

5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 4, znamienny tym, że degradację wiązania N-glikozydowego w trzecim etapie przeprowadza się przy zastosowaniu wodnego roztworu nieorganicznego kwasu o pH zawartym w przedziale 3-3,5, zaś powstałą sól odseparowywuje się na kolumnie chromatograficznej w temp. 40-45°C, a główny produkt wymywa się wodnym 0,1% roztworem metanolu.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wydajność reakcji wynosi nie mniej niż 85%.

7. Kompozycja antystarzeniowa, znamienna tym, że zawiera 4-N-furfurylocytozynę.

8. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że zawartość 4-N-furfurylocytozyny w kompozycji wynosi do 2%.

9. Zastosowanie 4-N-furfurylocytozyny do wytwarzania kompozycji antystarzeniowych.

10. Zastosowanie według zastrz. 15, w którym zawartość 4-N-furfurylocytozyny w preparatach antystarzeniowych wynosi do 2%.