PL208751B1

PL208751B1 - Związki stanowiące analogi GLP-1, kompozycje zawierające takie związki oraz zastosowanie takich związków

Info

Publication number: PL208751B1
Application number: PL385112A
Authority: PL
Inventors: Zheng Xin Dong; David H. Coy
Original assignee: Sod Conseils Rech Applic; Univ Tulane
Priority date: 1998-12-07
Filing date: 1999-12-07
Publication date: 2011-06-30
Also published as: DE69938669D1; KR100458748B1; JP2006077022A; DK1137666T5; EP1137666B1; NO20100307L; RU2208015C2; IL143481A0; AU1751200A; KR20010102953A; DK1137666T3; AU770609B2; CA2352573C; CN1342166A; HUP0104579A2; US20090149378A1; HUP0104579A3; PL393611A1; NO330293B1; WO2000034332A1

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy związków stanowiących peptydowe analogi glukagonopodobnego peptydu-1, farmaceutycznie dopuszczalnych soli takich związków, kompozycji terapeutycznej zawierającej takie związki oraz zastosowania takich związków do wytwarzania leku do leczenia choroby wybranej z grupy obejmującej cukrzycę typu I i cukrzycę typu II.

Amid glukagonopodobnego peptydu-1(7-36) (GLP-1) jest syntetyzowany w jelitowych komórkach Langerhansa w wyniku tkankowo specyficznej potranslacyjnej obróbki prekursora glukagonu, pre-proglukagonu (Varndell, J. M. i wsp., J. Histochem Cytochem, 1985: 33: 1080-6) i jest wydzielany do krążenia w odpowiedzi na posiłek. Stężenie GLP-1 w osoczu zwiększa się z poziomu głodu w przybliż eniu 15 pmol/L do szczytowego poposił kowego poziomu 40 pmol/L. Wykazano, ż e dla danego wzrostu stężenia glukozy w osoczu, wzrost stężenia insuliny w osoczu jest około trzykrotnie wyższy, jeśli glukoza jest podawana doustnie w porównaniu z podawaniem dożylnym (Kreymann, B. i wsp., Lancet 1987: 2, 1300-4). To pokarmowe wzmocnienie uwalniania insuliny, znane jako działanie wydzielania wewnętrznego jest zasadniczo humoralne i obecnie uważa się, że GLP-1 jest najsilniejszym fizjologicznym związkiem wydzielania wewnętrznego u ludzi. Oprócz działania insulinotropowego, GLP-1 obniża wydzielanie glukagonu, opóźnia opróżnianie żołądka (Wettergren A. i wsp., Dig. Dis. Sci. 1993: 38: 665-73) i może wzmacniać obwodowe rozmieszczenie glukozy (D'Alessio, D. A. i wsp., J. Clin. Incest. 1994: 93: 2293-6).

W 1994, w wyniku obserwacji, że pojedyncza podskórna (s/c) dawka GLP-1 mogła całkowicie unormować poposiłkowy poziom glukozy u pacjentów cierpiących na cukrzycę niezależną od podawania insuliny (NIDDM) sugerowano skuteczność terapeutyczną GLP-1 (Gutniak, M. K. i wsp., Diabetes Care 1994: 17: 1039-44). Uważano, iż w działaniu tego związku bierze udział zarówno zwiększenie wydzielania insuliny, jak i zmniejszenie wydzielania glukagonu. Ponadto wykazano, że wlewy dożylne GLP-1 mogą opóźniać poposiłkowe opróżnianie żołądka u pacjentów cierpiących na NIDDM (Williams, B. i wsp., J. Clin. Endo. Metab. 1996: 81: 327-32). Inaczej niż pochodne sulfomocznika, działanie insulinotropowe GLP-1 zależy od stężenia glukozy w osoczu (Holz. G. G. 4th i wsp., Nature 1993: 361: 362-5). Zatem, utrata wydzielania insuliny za pośrednictwem GLP-1 przy niskim stężeniu glukozy w osoczu zabezpiecza przed ciężką hipoglikemią.

To połączenie różnych oddziaływań GLP-1 daje wyjątkowo korzystną możliwość zastosowań terapeutycznych w porównaniu do innych środków obecnie stosowanych do leczenia NIDDM.

W wielu badaniach wykazano, ż e jeś li GLP-1 jest podawany zdrowym osobom, to zwią zek ten skutecznie wpływa na poziom glukozy we krwi, jak i stężenia insuliny i glukagonu (Orskov, C, Diabetologia 35: 701-711, 1992; Holst, J. J. i wsp., Potential of GLP-1 in diabetes management in Glukagon III, Handbook of Experimental Pharmacology, Lefevbre PJ, Ed. Berlin, Springer Verlag, 1996, p. 311-326), efekty które zależą od poziomu glukozy (Kreymann, B. i wsp., Lancet ii: 1300-1304, 1987; Weir, G. C. i wsp., Diabetes 38: 338-342, 1989). Ponadto, jest on również skuteczny u pacjentów cierpiących na cukrzycę (Gutniak, M., N. Engel. J. Med. 226: 1316-1322, 1992; Nathan, D. M. i wsp., Diabetes Care 15: 270-276, 1992), normalizując poziomy glukozy we krwi u pacjentów cierpiących na cukrzycę typu II (Nauck, M.A. i wsp. Diabetologia 36: 741-744, 1993) i poprawia kontrolę poziomu glukozy we krwi u pacjentów cierpiących na cukrzycę typu I (Creutzfeldt, W. O. i wsp., Diabetes Care 19: 580-586, 1996), zwiększając możliwość zastosowania tego związku jako środka terapeutycznego.

Jednakże, GLP-1 jest metabolicznie niestabilny i półokres trwania tego związku (t1/2) w osoczu wynosi jedynie 1-2 min in vivo. Podawany z zewnątrz GLP-1 jest również gwałtownie rozkładany (Deacon, C. F. i wsp., Diabetes 44: 1126-1131, 1995). Ta metaboliczna niestabilność ogranicza terapeutyczne możliwości zastosowania naturalnego GLP-1. Zatem, istnieje potrzeba opracowania analogów GLP-1, które będą bardziej aktywne lub są bardziej stabilne metabolicznie niż naturalny GLP-1.

Przedmiotem wynalazku jest związek wybrany z grupy obejmującej:

[D-Ala⁸, Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]-GLP-1(7-34)NH₂;

[D-Ala^8,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH2;

[Ala^18,23,27, 3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH₂;

[Ala^16,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH₂;

[Ala^14,23,27,3-Pal^19,31)hGLP-1(7-35)-NH₂;

[Ala^22,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH₂;

[Ala^15,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH₂;

[Ala^17,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH₂;

PL 208 751 B1

[Ala^22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[Ala^15,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[Ala^18,20,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[Ala^21,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[Ala^22,23,26,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[Ala^22,23,27,32,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[A|a^22,23,26,27,3Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH₂;

[Ala^22,23,27,31,3-Pal¹⁹,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH₂;

[Ala^22,23,27,28,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH₂;

[Ala^22,23,27,29,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH₂;

[Ala^23,27,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH₂;

[Ala^20,22,23,27,3-Pal1^9,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH₂;

[Ala^22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH₂;

[Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH₂;

[D-Ala¹⁰,Ala^22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH₂;

[D-Ala⁸,Ala^17,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[Ala^17,23,27,3-Pal^19,26,31]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[D-Ala⁸,Ala¹⁷,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[Ala^17,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[D-Ala⁸,Ala^17,23,27,3-Pal^19,31,Tle²⁹]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[D-Ala⁸,Ala^17,23,27,3-Pal^19,31,Tle¹⁶]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[D-Ala⁸,Ala^17,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[D-Ala²²,Ala^17,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[Alb⁸,Ala^17,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[D-Ala⁸,Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-33)-NH₂;

[Alb⁸,Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-33)-NH₂;

[Ala^17,18,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[Ala^17,23,27,3-Pal^19,31,Tle³³,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[Tle¹⁶,Ala^17,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[N-Me-D-Ala⁸,Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-33)-NH₂;

[Alb⁸,Ala^{17,18,22,23,27},3-Pal^19,31]hGLP-1(7-33)-NH₂;

[Ala^{17,18,22,23,27},3-Pal^19,31,Tle^16,20,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[D-Ala⁸,Ala^{17,18,22,23,27},3-Pal^19,31,Tle¹⁶,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[D-Ala^8,22, Ala^17,18,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂;

[D-Ala^8,18, Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [D-Ala^8,17,Ala^18,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [D-Ala⁸,Ala^{17,18,22,23,27},3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂; oraz farmaceutycznie dopuszczalne sole tych związków.

Przedmiotem wynalazku jest również związek wybrany z grupy obejmującej:

[Aib⁸,A6c³²]hGLP-1(7-36)NH2;

[A6c^20,32]hGLP-1(7-36)-NH₂;

[A6c⁸]hGLP-1(8-36)-NH2;

[A6c⁸]hGLP-1(7-36)-NH2;

[A6c^16,20]hGLP-1(7-36)-NH₂;

[A6c^29,32]hGLP-1(7-36)-NH₂;

[A6c²⁰,Aib²⁴]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib²⁴,A6c^29,32]hGLP-1(7-36)-NH₂;

[A6c^16,29,32]hGLP-1(7-36)-NH₂;

[A5c⁸]hGLP-1(7-36)-NH2;

[A5c⁸,A6c^20,32]hGLP-1(7-36)-NH₂;

[Aib⁸,A6c³²]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib^8,25]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib^8,24]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib^8,30]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib⁸,Cha²⁰]hGLP-1(7-36)-NH2;

PL 208 751 B1

[Aib⁸,Cha³²]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib⁸,GIu²³]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib⁸,A6c²⁰]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib⁸,A6c^20,32]hGLP-1(7-36)-NH₂;

[Aib^8,22]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib⁸,e-Ala²²]hGLP-1 (7-36)-NH₂;

[Aib⁸,Lys²⁵]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib⁸,A6c¹²]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib⁸,A6c²⁹]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib⁸,A6c³³]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib^8,14]hGLP-1(7-36)NH2;

[Aib^8,18]hGLP-1(7-36)NH2;

[Aib^8,17]hGLP-1(7-36)NH2;

[Aib⁸,D-Arg;²⁶]hGLP-1(7-36)NH2; oraz farmaceutycznie dopuszczalne sole tych związków.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja terapeutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera skuteczną ilość związku określonego powyżej oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik lub rozcieńczalnik.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie skutecznej ilości związku określonego powyżej do wytwarzania leku do leczenia choroby wybranej z grupy obejmującej cukrzycę typu I i cukrzycę typu II.

Wszystkie związki według wynalazku posiadają L-aminokwas w pozycjach 7 i/albo 8.

Wynalazek może służyć do wywoływania aktywności agonistycznej receptora GLP-1 u pacjenta, który tego potrzebuje, poprzez podawanie temu pacjentowi skutecznej ilości związku określonego powyżej lub farmaceutycznie dopuszczalnej soli tego związku.

Wynalazek może również znaleźć zastosowanie w leczeniu chorób wybranych z grupy obejmującej otyłość, rak trzustki, choroby wydzielnicze dróg oddechowych, choroby metaboliczne, zapalenie stawów, osteoporozę, choroby centralnego układu nerwowego, restenozę, choroby neurodegeneracyjne, niewydolność nerek, niewydolność zastoinową serca, zespół nerczycowy, marskość wątroby, odmę płucną, i nadciśnienie, choroby które wymagają zmniejszenia pobierania pokarmu.

Z wyjątkiem N-końcowego aminokwasu, wszystkie skróty aminokwasów, np. Ala, w obecnym ujawnieniu oznaczają strukturę -NH-CH(R)-CO-, w której R oznacza łańcuch boczny aminokwasu (np. CH3 dla Ala). Dla N-końcowego aminokwasu, skróty oznaczają strukturę (R²R³)-N-CH(R)-CO-, w której R oznacza łańcuch boczny aminokwasu, a R² i R³ oznaczają podstawniki, które zostały zdefiniowane powyżej. Skróty: Cha, 3-Pal i Aib oznaczają odpowiednio następujące α-aminokwasy: cykloheksyloalaninę, e-(3-pirydynylo)alaninę, i kwas α-aminoizomasłowy. Definicje dla innych aminokwasów są następujące: N-Me-Ala oznacza N-metyloalaninę; Tle oznacza tert-butyloglicynę; Aib oznacza kwas α-aminoizomasłowy; β-Ala oznacza 6-alaninę; Gaba oznacza kwas γ-aminomasłowy.

A5c oznacza kwas 1-amino-1-cyklopentanokarboksylowy, a A6c oznacza kwas 1-amino-1-cykloheksanokarboksylowy (A6c). Grupy hydroksyalkilowa, hydroksyfenyloalkilowa i hydroksynaftyloalkilowa mogą zawierać 1-4 podstawników hydroksylowych. COX⁵ oznacza -C=OX⁵. Przykłady -C=OX⁵obejmują między innymi grupę acetylową i fenylopropionylową.

Pełne nazwy innych skrótów stosowanych w niniejszym opisie są następujące: Boc = t-butyloksykarbonyl, HF = fluorowodór, Fm = formyl, Xan = ksantyl, Bzl = benzyl, Tos = toluenosulfonian (tosyl), DNP = 2,4-dinitrofenylo, DMF = dimetyloformamid, DCM = dichlorometan, HBTU = sól 2-(1H-benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowa heksafluorofosforanu, DIEA = diizopropyloetyloamina, HOAc = kwas octowy, TFA = kwas trifluorooctowy, 2CIZ = 2-chlorobenzyloksykarbonyl i OcHex = O-cykloheksyl.

Peptyd według wynalazku jest również opisywany w inny sposób, np. [A5c⁸]hGLP-1(7-36)-NH2, z podstawionymi aminokwasami z sekwencji naturalnej umieszczonymi w nawiasach (np. A5c⁸ dla Ala⁶ w hGLP-1). Skrót GLP-1 oznacza peptyd 1 typu glukagonu, a hGLP-1 oznacza ludzki peptyd 1 typu glukagonu. Liczby pomiędzy nawiasami odnoszą się do ilości aminokwasów obecnych w peptydzie (np. hGLP-1(7-36) oznacza reszty aminokwasowe 7 do 36 sekwencji peptydowej dla ludzkiego GLP-1). Sekwencja dla hGLP-1(7-37) została przedstawiona w pracy Mojsov, S., Int. J. Peptide Protein Res,. 40, 1992, str. 333-342. Określenie „NH2” w hGLP-1(7-36)NH2 wskazuje, że koniec C peptydu jest amidowany. hGLP-1(7-36) oznacza, że koniec C jest wolnym kwasem.

PL 208 751 B1

Związki według wynalazku mogą być otrzymywane standardową metodą syntezy peptydów na stałym nośniku, patrz np. Stewart, J. M. i wsp., Solid Phase Synthesis (Pierce Chemical Co., II wydanie. 1984). Podstawniki R² i R³ w powyższym ogólnym wzorze mogą być przyłączane do wolnej aminy N-końcowego aminokwasu standardowymi sposobami znanymi w stanie techniki, na przykład grupy alkilowe, np. (C1-C30)alkil. Mogą być przyłączane stosując alkilowanie redukcyjne. Grupy hydroksyalkilowe, np. hydroksy(C1-C30)alkil, mogą być również przyłączane stosując alkilowanie redukcyjne, w którym wolna grupa hydroksylowa jest zabezpieczona estrem t-butylowym. Grupy acylowe, np. COE¹, mogą być przyłączane przez sprzęganie wolnego kwasu, np. E¹OOH, z wolną aminą N-końcowego aminokwasu przez mieszanie całej żywicy z 3 molowymi równoważnikami zarówno wolnego kwasu, jak i diizopropylokarbodiimidu w chlorku metylenu przez jedną godzinę. Jeżeli wolny kwas zawiera wolne grupy hydroksylowe, np. kwas p-hydroksyfenylopropionowy, to sprzęganie powinno być prowadzone w dodatkowymi 3 molowymi równoważnikami HOBT.

Jeśli przy C-końcu peptydu występuje grupa NH-X²-CH2-CONH2, synteza peptydu rozpoczyna się od Boc-HN-X²-CH2-COON, związanego z żywicą MBHA. Jeśli przy C-końcu peptydu występuje grupa NH-X²-CH2-COON synteza peptydu rozpoczyna się od Boc-HN-X²-CH2-COON związanego z ż ywicą PAM.

Poniżej opisano sposób syntetycznego otrzymywania peptydów według wynalazku, który to sposób jest dobrze znany specjalistom z dziedziny. Inne sposoby również są znane specjalistom z dziedziny.

Żywicę benzhydryloamino-polistyrenową (Advanced ChemTech, Inc., Louisville, KY) (0,9 g, 0,3 mmole) w formie z jonami chlorkowymi umieszczono w naczyniu reakcyjnym aparatu Advanced ChemTech Peptide Synthetizer Model 200 zaprogramowanym tak, aby przeprowadzał następujący cykl reakcji:

(a) chlorek metylenu;

(b) 33% kwas trifluorooctowy w chlorku metylenu (2 razy po 1 i 15 min każdy);

(c) chlorek metylenu;

(d) etanol;

(e) chlorek metylenu;

(f) 10% diizopropyloetyloamina w chlorku metylenu.

Zneutralizowaną żywicę mieszano z aminokwasem zabezpieczonym przez Boc, który będzie stanowił C-końcowy aminokwas żądanego peptydu, który ma zostać zsyntetyzowany i diizopropylokarbodiimidem (3 mmole każdy) w chlorku metylenu przez 1 godzinę. Otrzymaną żywicę aminokwasową poddano następnie cyklowi reakcji w etapach (a) do (f) według powyższego programu przemywania. Inne aminokwasy (3 mmole) żądanego peptydu następnie sprzęgano kolejno stosując tą samą procedurę. Peptyd po zakończonej syntezie jest odcinany od żywicy przez zmieszanie z anizolem (5 ml), ditiotreitolem (100 mg) i bezwodnym fluorowodorem (35 ml) w temperaturze około 0°C i mieszanie przez około 45 min. Nadmiar fluorowodoru szybko odparowano w strumieniu suchego azotu i wolny peptyd wytrącono i przemyto eterem. Nieczyszczony peptyd nastę pnie rozpuszczono w minimalnej ilości rozcieńczonego kwasu octowego i eluowano w kolumnie (2,5 x 25 cm) VYDAC^® oktadecylosilano-krzemionkowej (10 mM) i wymywano liniowym gradientem 20-60% acetonitrylu przez około 1 h w 0,1% kwasie trifluorooctowym w wodzie. Frakcje badano przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej i analitycznej wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (40-70% B przy 1%/min, roztwór B jest to 80% acetonitryl/woda zawierający 0,1% TFA) i połączono aby otrzymać maksymalną czystość, nie biorąc pod uwagę wydajności. W wyniku powtórzonej liofilizacji roztworu z wody otrzymano produkt w postaci białego, puszystego proszku.

Otrzymany peptyd analizowano metodą HPLC. Analiza aminokwasowa kwaśnego hydrolizatu otrzymanego peptydu może potwierdzić skład peptydu. Aby otrzymać masę cząsteczkową peptydu stosowano spektrometrię masową z desorpcją laserową.

Zabezpieczony aminokwas kwas 1-[N-tertbutoksykarbonyloamino]-1-cykloheksanokarboksylowy (Boc-A6c-OH) zsyntetyzowano następująco. 19,1 g (0,133 mola) kwasu 1-amino-1-cykloheksanokarboksylowego (Acros Organics, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) rozpuszczono w 200 ml dioksanu i 100 ml wody. Do tego dodano 67 ml 2N NaOH. Roztwór schłodzono w łaźni wodno-lodowej. Do tego roztworu dodano 32,0 g (0,147 mola) diwęglanu di-tert-butylu. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Dioksan następnie usuwano pod zmniejszonym ciśnieniem. 200 ml octanu etylu następnie dodano do pozostałego roztworu wodnego. Mieszaninę schłodzono w łaźni wodno-lodowej. pH warstwy wodnej doprowadzono do około 3 dodając 4N HCI. Fazę organiczną od6

PL 208 751 B1 dzielono. Warstwę wodną ekstrahowano octanem etylu (1 x 100 ml). Dwie warstwy organiczne połączono i przemyto wodą (2 x 150 ml), wysuszono w obecności bezwodnego MgSO4, odsączono i zatężono do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rekrystalizowano w octanie etylu/heksanie. Otrzymano 9,2 g czystego produktu. Wydajność 29%.

Boc-A5c-OH zsyntetyzowano w sposób analogiczny do opisanego dla Boc-A6c-OH. Inne zabezpieczone aminokwasy Acc mogą być otrzymywane w sposób analogiczny przez osobę o zwykłej wiedzy w dziedzinie, zgodnie ze wskazówkami zawartymi w niniejszym opisie.

W syntezie peptydu wedł ug wynalazku zawierają cego A5c, A6c i/lub Aib, czas sprzę gania wynosił około 2 godzin dla tych reszt i reszt, które następowały bezpośrednio po nich. Do syntezy [Tma-His⁷]hGLP-1(7-36)NH2, zastosowano HBTU (2 mmoli) i DIEA (1,0 ml) w 4 ml DMF aby przeprowadzić reakcję z wolną aminą na końcu N żywicy peptydowej w ostatniej reakcji sprzęgania; czas łączenia wynosił około 2 godzin.

Wspomniane powyżej podstawniki R² i R³ mogą być przyłączane do wolnej aminy N-końcowego aminokwasu standardowymi sposobami znanymi w stanie techniki. Na przykład, grupy alkilowe, np. alkilo(C1-C30), mogą być przyłączane stosując alkilowanie redukcyjne. Grupy hydroksyalkilowe, np. hydroksy(C1-C30)alkil, mogą być również przyłączane stosując alkilowanie redukcyjne w którym wolne grupy hydroksylowe są zabezpieczane estrem t-butylowym. Grupy acylowe, np. COX¹, mogą być przyłączane przez sprzęganie wolnego kwasu, np. X¹OOH, z wolną aminą N-końcowego aminokwasu przez zmieszanie całkowitej żywicy z 3 molowymi równoważnikami zarówno wolnego kwasu jak i diizopropylokarbodiimidu w chlorku metylenu przez jedną godzinę. Jeżeli wolny kwas zawiera wolne grupy hydroksylowe, np. kwas p-hydroksyfenylopropionowy, to sprzęganie powinno być prowadzone z dodatkowymi 3 molowymi równoważ nikami HOBT.

Związek według wynalazku może być badany pod kątem aktywności jako związek wiążący GLP-1 według poniższej procedury.

Hodowle komórkowe: RIN 5F szczurze komórki gruczolaka wysepkowatokomórkowego (ATCC # CRL-2058, American Type Culture Collection, Mantissas, VA), wyrażające receptora GLP-1, hodowano w pożywce Eagle'a zmodyfikowanej według Dulbecco'a (DMEM) zawierającej 10% płodową surowicę cielęcą i utrzymywano w temperaturze około 37°C w nawilżanej atmosferze 5% CO2/95% powietrza.

Wiązanie znakowanego radioaktywnie ligandu

Błony otrzymywano do badań wiązania znakowanego radioaktywnie ligandu przez homogenizację komórek RIN w 20 ml schłodzonego w lodzie 50 mM Tris-HCI za pomocą aparatu Brinkman Polytron (Westbury, NY) (ustawienie 6,15 sek.). Homogenaty przemywano dwukrotnie wirując (39000 g/10 min) i końcowy osad ponownie przeprowadzono w zawiesinę w 50 mM Tris-HCI, zawierającym 2,5 mM MgCI2, 0,1 mg/ml bacytracyny (Sigma Chemical, St. Louis, MO) i 0,1% BSA. Do pomiarów, próbki (0,4 ml) inkubowano z 0,05 nM [¹²⁵I]GLP-1(7-36) (-2200 Ci/mmol, New England Nuclear,

Boston, MA), z i bez 0,05 ml nie znakowanych badanych peptydów w testach kompetycji. Po 100 min 125 inkubacji (25°C), związany [¹²⁵I]GLP-1(7-36) oddzielono od wolnego ligandu przez szybką filtrację przez filtry GF/C (Brandel, Gaithersburg, MD), które były wstępnie moczone w 0,5% polietylenoiminie. Filtry przemyto następnie trzykrotnie 5 ml schłodzonego lodem 50 mM Tris-HCI i zatrzymaną na filtrach związaną radioaktywność zliczano za pomocą spektrometrii gamma (Wallac LKB, Gaithersburg,

125

MD). Specyficzne wiązanie określano jako całkowite wiązanie [¹²⁵I]GLP-1(7-36) minus to, które było związane w obecności 1000 nM GLP1(7-36) (Sachem, Torrence, CA).

Związki według wynalazku mogą być dostarczane w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Przykłady takich soli obejmują między innymi sole utworzone z kwasami organicznymi (np. kwasem octowym, mlekowym, maleinowym, cytrynowym, jabłkowym, askorbinowym, bursztynowym, benzoesowym, metanosulfonowym, toluenosulfonowym lub pamoilowym), kwasami nieorganicznymi (np. kwasem chlorowodorowym, siarkowym lub fosforowym) i kwasami polimerowymi (np. kwasem taninowym, karboksymetylocelulozą, poli(kwasem mlekowym), poli(kwasem glikolowym) lub kompolimerami poli(kwasów mlekowych-glikolowych). Typowy sposób wytwarzania soli peptydu według wynalazku jest dobrze znany w stanie techniki i może być osiągnięty standardowymi sposobami wymiany soli. Zgodnie z powyższym, sól TFA peptydu według wynalazku (sól TFA otrzymuje się w wyniku oczyszczania peptydu stosując preparatywną HPLC, wymywając przy pomocy roztworów buforowych zawierających TFA) może być przekształcona w inną sól, taką jak sól octanowa przez rozpuszczanie peptydu w małej ilości 0,25N roztworu wodnego kwasu octowego. Otrzymany roztwór nanoszony jest na półpreparatywną kolumnę HPLC (Zorbax, 300 SB, C-8). Kolumnę wymywano (1) 0,1N roztworem wodnym octanu amonowego przez 0,5 godziny, (2) 0,25N roztworem wodnym kwasu octowego przez

PL 208 751 B1

0,5 godziny i (3) liniowym gradientem (20% do 100% roztworu B przez 30 min.) przy szybkości przepływu 4 ml/min (roztworem A jest 0,25N roztwór wodny kwasu octowego; roztworem B jest 0,25N kwas octowy w acetonitrylu/wodzie, 80:20). Frakcje zawierające peptyd zebrano i liofilizowano do suchości.

Zgodnie z wiedzą specjalisty w dziedzinie, znane i możliwe zastosowanie GLP-1 jest różne i złożone [See, Todd, J. F. i wsp., Clinical Science, 1998, 95, str. 325-329; i Todd, J. F. i wsp., European Journal of Clinical Investigation, 1997, 27, str. 533-536]. Zatem, podawanie związków według wynalazku w celu wywoływania aktywności agonistycznej może mieć te same skutki i zastosowania jak sam GLP-1. Te różne zastosowania GLP-1 mogą zostać podsumowane następująco: leczenie cukrzycy typu I, cukrzycy typu II, otyłości, raka trzustki, chorób wydzielniczych dróg oddechowych, chorób metabolicznych, zapalenia stawów, osteoporozy, chorób ośrodkowego układu nerwowego, restenozy i chorób neurodegeneracyjnych. Analogi GLP-1 według wynalazku, które wywołują działanie antagonistyczne u pacjenta mogą być stosowane do leczenia następujących chorób: zespołu hipoglikemicznego i zespołu złego wchłaniania związanego z operacjami żołądka lub jelit resekcją jelita cienkiego.

Dawkowanie związku aktywnego w kompozycjach według wynalazku może być różne, jednakże konieczne jest, aby ilość substancji aktywnej była taka, otrzymana postać dawkowania była dogodna. Wybrana dawka zależy od pożądanego działania terapeutycznego, od procedury podawania i od czasu trwania leczenia. Ogólnie, skuteczna dawka dla związków aktywnych według wynalazku jest w zakresie od 1 x 10^-7 do 200 mg/kg/dzień, korzystnie 1 x 10^-4 do 100 mg/kg/dzień, która może być podawana jako dawka pojedyncza lub podzielona na wiele dawek.

Związki według wynalazku mogą być podawane doustnie, pozajelitowo (np. za pomocą iniekcji lub wszczepienia domięśniowo, wewnątrzotrzewnowo, dożylnie lub podskórnie), donosowo, dopochwowo, doodbytniczo, podjęzykowo lub miejscowo i mogą być wytwarzane z zastosowaniem farmaceutycznie dopuszczalnych nośników, w celu zapewnienia odpowiednich form dawkowania dla każdego sposobu podawania.

Stałe postacie dawkowania do podawania doustnego obejmują kapsułki, tabletki, pigułki, proszki i granulki. W takich stałych postaciach dawkowania, związek aktywny jest dodawany do przynajmniej jednego obojętnego farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika, takiego jak sacharoza, laktoza lub skrobia. Takie stałe postacie dawkowania mogą również zawierać zgodnie z normalną praktyką, dodatkowe substancje inne niż takie obojętne rozcieńczalniki, np. środki smarne, takie jak stearynian magnezu. W przypadku kapsułek, tabletek i pigułek, postacie dawkowania mogą również zawierać środki buforujące. Tabletki i pigułki mogą ponadto być wytwarzane z warstwą powlekającą chroniącą przed kwasem żołądkowym.

Płynne postacie dawkowania do podawania doustnego obejmują farmaceutycznie dopuszczalne emulsje, roztwory, zawiesiny, syropy lub eliksiry zawierające obojętne rozcieńczalniki tradycyjnie stosowane w dziedzinie techniki, takie jak woda. Oprócz takich obojętnych rozpuszczalników kompozycje mogą również zawierać środki pomocnicze, takie jak środki zwilżające, emulgujące i tworzące zawiesinę oraz środki słodzące, smakowe i zapachowe.

Preparaty według wynalazku do podawania pozajelitowego obejmują sterylne wodne lub nie wodne roztwory, zawiesiny lub emulsje. Przykłady nie wodnych rozpuszczalników lub nośników obejmują: glikol propylenowy, poli(glikol etylenowy), oleje roślinne, takie jak oliwa z oliwek, olej kukurydziany, żelatyna, estry organiczne odpowiednie do iniekcji, takie jak np. oleinian etylowy. Takie formy dawkowania mogą również zawierać środki pomocnicze, takie jak środki konserwujące, zwilżające, emulgujące i dyspergujące. Mogą one być sterylizowane poprzez, na przykład, filtrację przez filtry zatrzymujące bakterie, przez wprowadzenie środków sterylizujących do kompozycji oraz przez naświetlanie kompozycji lub ogrzewanie kompozycji. Preparaty mogą również być wytwarzane w postaci sterylnych kompozycji stałych, które mogą być rozpuszczone w sterylnej wodzie lub innych sterylnych ośrodkach odpowiednich do iniekcji, tuż przed użyciem.

Kompozycje do podawania doodbytniczego lub dopochowego są korzystnie w postaci czopków, które mogą zawierać oprócz substancji aktywnej zaróbki, takie jak na przykład masło kakaowe lub wosk do wytwarzania czopków.

Kompozycje do podawania donosowego lub podjęzykowego są również otrzymywane przy pomocy standardowych zaróbek dobrze znanych w stanie techniki.

Ponadto, związek według wynalazku może być podawany w postaci kompozycji o przedłużonym uwalnianiu, takiej jak opisano w następujących opisach patentowych i zgłoszeniach patentowych.

PL 208 751 B1

W amerykań skim opisie patentowym nr 5 672 659 przedstawiono kompozycje o przedł uż onym uwalnianiu zawierające czynnik bioaktywny i poliester. W amerykańskim opisie patentowym nr 5 595 760 przedstawiono kompozycje o przedłużonym uwalnianiu zawierające czynnik bioaktywny w postaci żelowej. W opisie amerykańskiego zgłoszenia patentowego nr 08/929 363 złożonego 9 września 1997, przedstawiono polimeryczne kompozycje o przedłużonym uwalnianiu zawierające czynnik bioaktywny i chitosan. W opisie amerykańskiego zgłoszenia patentowego nr 08/740 778 złożonego 1 listopada 1996, przedstawiono kompozycje o przedłużonym uwalnianiu zawierające czynnik bioaktywny i cyklodekstrynę. W opisie amerykańskiego zgłoszenia patentowego nr 09/015 394 złożonego 29 stycznia 1998, przedstawiono absorbowalne kompozycje o przedłużonym uwalnianiu czynnika bioaktywnego. W opisie amerykańskiego zgłoszenia patentowego nr 09/121 653 złożonego 23 lipca 1998, przedstawiono proces do wytwarzania mikrocząsteczek zawierających środek terapeutyczny taki jak peptyd w procesie olej w wodzie. W opisie amerykańskiego zgłoszenia patentowego nr 09/131 472 złożonego 10 sierpnia 1998, przedstawiono kompleksy zawierające środek terapeutyczny, taki jak peptyd i fosforylowany polimer. W opisie zgłoszenia patentowego US nr 09/184 413 złożonego 2 listopada 1998, przedstawiono kompleksy zawierające środek terapeutyczny, taki jak peptyd i polimer niosący nie polimeryzujący lakton. Wskazówki opisanych powyżej patentów i zgłoszeń patentowych są załączone jako odnośniki.

Jeśli nie stwierdzono inaczej, wszystkie techniczne i naukowe określenia mają te same znaczenia jak ogólnie zrozumiałe przez specjalistę w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek. Również wszystkie publikacje, zgłoszenia patentowe, patenty i inne odnośniki wymienione w opisie są załączone jako odnośniki.

Następujące przykłady przestawiają sposoby syntetycznego otrzymywania peptydu według wynalazku, które są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Inne metody są również znane specjalistom w dziedzinie. Przykł ady stanowi ą jedynie ilustracje i nie mają ograniczać zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d 1

[D-Ala⁸,Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]-GLP-1(7-34)NH₂

Żywicę benzhydryloamino-polistyrenową (Advanced ChemTech, Inc. Louisville, KY) (0,9 g, 0,3 mmole) w postaci z jonami chlorkowymi umieszczono w naczyniu reakcyjnym aparatu Advanced ChemTech Peptide Synthetizer Model 200 zaprogramowanym tak, aby przeprowadzał następujący cykl reakcji: (a) chlorek metylenu; (b) 33% kwas trifluorooctowy w chlorku metylenu (2 razy po 1 i 15 min każdy); (c) chlorek metylenu; (d) etanol; (e) chlorek metylenu; (f) 10% diizopropyloetyloamina w chlorku metylenu.

Zneutralizowaną żywicę mieszano z Boc-Gaba i diizopropylokarbodiimidem (3 mmole każdy) w chlorku metylenu przez 1 godzinę i otrzymaną żywicę aminokwasową poddano następnie cyklowi reakcji w etapach (a) do (f) zgodnie z powyższym programem przemywania. Następujące aminokwasy (3 mmole) następnie dołączano kolejno stosując tą samą procedurę: Boc-Val, Boc-Leu, Boc-3-Pal, Boc-Ala, Boc-Ile, Boc-Phe, Boc-Ala, Boc-Lys(2-CI-Z), Boc-Ala, Boc-Ala, Boc-Ala, Boc-Ala, Boc-Glu(Bzl), Boc-Leu, Boc-3-Pal, Boc-Ser(Bzl), Boc-Ala, Boc-Val, Boc-Asp(Bzl), Boc-Ser(Bzl), Boc-Thr(BzI), Boc-Phe, Boc-Thr(Bzl), Boc-Gly, Boc-Glu(Bzl), Boc-D-Ala, Boc-His(Bom).

Żywicę o całkowitej sekwencji peptydowej zmieszano z anizolem (5 ml), ditiotreitolem (100 mg) i bezwodnym fluorowodorem (35 ml) w temperaturze okoł o 0°C i mieszano przez okoł o 45 min. Nadmiar fluorowodoru szybko odparowano w strumieniu suchego azotu i wolny peptyd wytrącono i przemyto eterem. Nie oczyszczony peptyd następnie rozpuszczono w minimalnej ilości rozcieńczonego _® kwasu octowego i eluowano w kolumnie (2,5 x 25 cm) VYDAC^® oktadecylosilanokrzemionkowej (10 mM) i wymywano liniowym gradientem 20-60% acetonitrylu przez około 1 godz. w 0,1 kwasie trifluorooctowym w wodzie. Frakcje sprawdzano przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej i analitycznej wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (40-70% B przy 1 %/min; r.t.: 14,1 min) i połączono aby otrzymać maksymalną czystość a nie wydajność. W wyniku powtórzonej liofilizacji roztworu z wody otrzymano produkt (49,9 mg) w postaci białego, puszystego proszku.

Stwierdzono, że produkt jest jednorodny w wyniku HPLC i TLC. Analiza aminokwasowa kwaśnego hydrolizatu potwierdziła skład peptydu. W wyniku spektrometrii masowej z desorpcją laserową otrzymano masę cząsteczkową 2880 (Oblicz. M + H 2873).

P r z y k ł a d 2

Synteza niższych alkiloamidów peptydowych

Peptydy zostały utworzone na żywicy O-benzylopolistyrenowej (często określanej jako żywica Merrifielda) stosując protokół Boc otrzymywania aminokwasów opisany w przykładzie 1, z wyjątkiem,

PL 208 751 B1 że karboksylowe łańcuchy boczne aminokwasów Asp i Glu zostały zabezpieczone grupą Fm (ester fluorenylometylowy). Całkowite żywice peptydowe przeprowadzono w zawiesinę w rozcieńczonych roztworach DMF odpowiednich niższych alkiloaminach (takich jak etyloamina, propyloamina, fenyloetyloamina, 1,2-diaminoetan, itp.) i mieszano w temperaturze około 60°C (przez około 18 godzin), następnie przesączono, usunięto rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem i roztarto na proszek olej z rozszczepionymi peptydami z eterem, otrzymano jako ciało stałe, zabezpieczony peptyd alkiloamidowy. Związek ten następnie poddano reakcji odszczepienia HF, aby usunąć dodatkowe grupy zabezpieczające łańcuchy boczne i oczyszczono metodą HPLC, jak opisano w przykładzie 1.

P r z y k ł a d y 3-48

Przykłady 3-48 przeprowadzono zasadniczo zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 1, ale stosując odpowiednie zabezpieczone aminokwasy otrzymując określone peptydy. MS otrzymano w wyniku spektrometrii masowej z desorpcją laserową (NA oznacza nie oznaczone).

P r z y k ł a d 3: [D-Ala^8,23,27,3-Pal1^9,31]hGLP-1(7-35)-NH2; MS = 2971,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2974,4.

P r z y k ł a d 4: [Ala1^8,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH2; MS = 2954,4; obliczona masa cząsteczkowa = 2958,4.

P r z y k ł a d 5: [Ala^15,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH₂; MS = 2943,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2946,3.

P r z y k ł a d 6: [Ala^14,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH₂; MS = 2956,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2958,4.

P r z y k ł a d 7: [Ala^22,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH₂; MS = 2981,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2988,4.

P r z y k ł a d 8: [Ala^15,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH₂; MS = 2928,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2930,4,

P r z y k ł a d 9: [Ala^17,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH₂; MS = 2955,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2958,4.

P r z y k ł a d 10: [Ala^22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂; MS = 2896,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2888,3.

P r z y k ł a d 11: [Ala^15,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂; MS = 2852,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2844,3.

P r z y k ł a d 12: [Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂; MS = 2880,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2872,3.

P r z y k ł a d 13: [Ala^16,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂; MS = 2870,0: obliczona masa cząsteczkowa = 2872,3.

P r z y k ł a d 14: [Ala^21,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂; MS = NA.

P r z y k ł a d 15: [Ala^22,23,26,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂; MS = 2832,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2831,2.

P r z y k ł a d 16: [Ala^22,23,27,32,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂; MS = 2855,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2846,2.

P r z y k ł a d 17: [Ala^22,23,26,27,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH₂; MS = 2729,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2732,0.

P r z y k ł a d 18: [Ala^22,23,27,31,3-Pal¹⁹,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH₂; MS = 2711,6; obliczona masa cząsteczkowa = 2712,0.

P r z y k ł a d 19: [Ala^22,23,27,29,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH₂; MS = 2712,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2713,0.

P r z y k ł a d 20: (Ala^22,23,27,29,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH₂; MS = 2746,9; obliczona masa cząsteczkowa = 2747,1.

P r z y k ł a d 21: [Ala^23,27,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH2; MS = 2777,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2775,1.

P r z y k ł a d 22: [Ala^20,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH₂; MS = 2742,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2747,1.

P r z y k ł a d 23: Ala^22-23,27,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH₂; MS = 2786,7; obliczona masa cząsteczkowa = 2789,1.

P r z y k ł a d 24: Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH₂; MS = 2771,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2773,1.

PL 208 751 B1

P r z y k ł a d 25: (D-Ala¹⁰,Ala^22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH₂; MS = 2802,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2803,2.

P r z y k ł a d 26: [D-Ala⁸,Ala^17,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-34)-NH₂; MS = 2905,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2901,3.

P r z y k ł a d 27: [Ala^17,23,27,3-Pal^19,26,31]hGLP-1(7-34)-NH₂; MS = 2920,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2921,3.

P r z y k ł a d 28: [D-Ala⁸,Aa¹⁷,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-34)-NH2; MS = 2908,0 (sól sodowa); obliczona masa cząsteczkowa = 2885,3.

P r z y k ł a d 29: [Ala^17,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-34)-NH₂; MS = 2907,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2901,3.

P r z y k ł a d 30: [D-Ala⁸,Ala^17,23,27,3-Pal^19,31,Tle²⁹]hGLP-1(7-34)-NH₂; MS = 2906;0; obliczona masa cząsteczkowa = 2901,3.

P r z y k ł a d 31: [D-Ala⁸,Ala¹masa cząsteczkowa = 2915,4.

P r z y k ł a d 32: [D-Ala⁸,Ala¹na masa cząsteczkowa = 2858,2.

⁷,3-Pal^19,31,Tle¹⁶]hGLP-1(7-34)-NH2; MS = 2914,0; obliczona ⁷,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; MS = 2856,8; obliczoP r z y k ł a d 34: [D-Ala²²,Ala^17,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂; MS = 2871,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2872,3.

P r z y k ł a d 35: [Aib⁸,Ala^17,masa cząsteczkowa = 2872,3.

P r z y k ł a d 36: [D-Ala⁸,Ala¹sa cząsteczkowa = 2787,2.

P r z y k ł a d 37: [Aib⁸,Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-33)-NH₂; MS = 2800,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2801,2.

P r z y k ł a d 38: [Ala^17,18,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂; MS = 2842,5; obliczona ⁷,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; MS = 2875,0; obliczona ^,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-33)-NH₂; MS = 2786,0; obliczona mamasa cząsteczkowa = 2842,2.

P r z y k ł a d 39: [Ala^17,23,27 masa cząsteczkowa = 2872,3.

P r z y k ł a d 40: [Tle¹⁶,Ala masa cząsteczkowa = 2872,3.

,3-Pal^19,31,Tle³³,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; MS = 2871,0; obliczona ^7,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂; MS = 2870,0; obliczona

P r z y k ł a d 41: (N-Me-D-Ala⁸,Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-33)-NH₂; MS = 2795,0; obliczona masa cząsteczkowa = 2801,2.

P r z y k ł a d 42: [Aib⁸,Ala¹ sa cząsteczkowa = 2785,2.

P r z y k ł a d 43: [Ala^17,18,22 czona masa cząsteczkowa = 2870,3.

^22,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-33)-NH2; MS = 2784,2; obliczona ma,3-Pal^19,31,Tle^16,20,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; MS = 2871,9; obliP r z y k ł a d 44: [D-Ala⁸,Ala^{17,18,22,23,27},3-Pal^19,31,Tle¹⁶,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH₂; MS = 2870,0;

obliczona masa cząsteczkowa = 2870,3.

P r z y k ł a d 45: [D-Ala⁸,22,Ala^17,18 liczona masa cząsteczkowa = 2856,3.

P r z y k ł a d 46: [D-Ala^8,18,Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴P r z y k ł a d 47: [D-Ala^8,17,Ala^18,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴P r z y k ł a d 48: [D-Ala⁸,Ala^{17,18,22,23,27},3-Pal^19,31,Gaba³⁴ czona masa cząsteczkowa = 2856,3.

P r z y k ł a d 49 ,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; MS = 2856,3: obhGLP-1(7-34)-NH2; MS = NA. hGLP-1(7-34)-NH2; MS = NA. ]hGLP-1(7-34)-NH2; MS = 2861,6; obli[Aib⁸,A6c³²]hGLP-1(7-36)NH2

Peptyd tytułowy zsyntetyzowano na urządzeniu do syntezy peptydów Applied Biosystems (Foster City, CA) model 430A, który został zmodyfikowany, aby przeprowadzać przyśpieszoną syntezę peptydów Boc na stałym nośniku, patrz Schnolzer i wsp., Int. J. Peptide Protein Res., 40: 180 (1992). Stosowano żywicę 4-metylobenzohydryloaminową (MBHA) (Peninsula, Belmont, CA) z podstawieniem 0,91 mmol/g. Stosowano aminokwasy Boc (Bachem, CA, Torrance, CA; Nova Biochem.; LaJolla, CA) z nastę pują cym zabezpieczeniem dla ł a ń cuchów bocznych: Boc-Ala-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Tyr(2BrZ)-OH, Boc-His(DNP)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gly-OH, Boc-GIn-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Lys(2CIZ)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-A6c-OH, Ser(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Aib-OH, Boc-Glu(OcHex)-OH i Boc-Trp(Fm)-OH. Syntezę prowadzono w skali 0,20 mmola. Grupy Boc usuwano działając 100% TFA przez 2 x 1 min. Aminokwasy Boc (2,5 mmol) wstępnie akPL 208 751 B1 tywowano HBTU (2,0 mmol) i DIEA (1,0 ml) w 4 ml DMF i sprzęgano bez wstępnej neutralizacji soli TFA żywicy peptydowej. Czasy łączenia wynosiły około 5 min z wyjątkiem dla reszt Boc-Aib-OH i Boc-A6c-OH i następujących reszt Boc-Trp(Fm)-OH i Boc-His(DNP)-OH, w których czasy łączenia wynosiły około 2 godzin.

Na zakończenie składania łańcucha peptydowego, żywicę poddano działaniu roztworu 20% merkaptoetanolu/10% DIEA w DMF przez 2 x 30 min, aby usunąć grupę DNP na łańcuchu bocznym His. N-końcową grupę Boc następnie usuwano działając 100% TFA przez 2 x 2 min. Po neutralizacji żywicy peptydowej 10% DIEA w DMF (1 x 1 min), grupę formylową łańcucha bocznego Trp usuwano działając roztworem 15% etanolamina/15% woda/70% DMF przez 2 x 30 min. Częściowo pozbawiona grup zabezpieczających żywica peptydowa została przemyta DMF i DCM i wysuszona pod zmniejszonym ciśnieniem. Końcowe cięcie zostało przeprowadzone przez mieszanie żywicy peptydowej w 10 ml HF zawierającego 1 ml anizolu i ditiotreitolu (24 mg) w temperaturze 0°C przez około 75 min. HF usuwano za pomocą przepuszczania azotu. Pozostałość przemyto eterem (6 x 10 ml) i ekstrahowano 4N HOAc (6 x 10 ml).

Mieszaninę peptydową w ekstrakcie wodnym oczyszczono za pomocą preparatywnej wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej o odwróconej fazie (HPLC) stosując kolumnę o odwróconej fazie VYDAC^® C18 (Nest Group, Southborough, MA). Kolumnę wymywano liniowym gradientem (20% do 50% roztworu B przez 105 min) przy szybkości przepływu 10 ml/min (roztwór A = woda zawierająca 0,1% TFA; roztwór B = acetonitryl zawierający 0,1% TFA). Frakcje zbierano i sprawdzano metodą analitycznej HPLC. Frakcje zawierające czysty produkt sprzęgano i liofilizowano, aż były suche. Otrzymano 92 mg białego ciała stałego. Czystość wynosiła > 99% w oparciu o analizę metodą analitycznej HPLC. W wyniku analizy spektrometrycznej masowej w strumieniu elektronów uzyskano masę cząsteczkową 3324,2 (obliczona masa cząsteczkowa wynosi 3323,7).

Synteza innych związków według wynalazku może być prowadzona w ten sam sposób jak opisano dla syntezy [Aib⁸,A6c³²]hGLP-1(7-36)NH2 w przykładzie 49 powyżej, lecz stosując odpowiednie zabezpieczone aminokwasy w zależności od żądanego peptydu.

[(Na-HEPES-His)7]hGLP-1(7-36)NH2 [HEPES oznacza (4-(2hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy acid)] mogą być zsynetyzowane następująco: po złożeniu długiego łańcucha peptydowego na żywicy MBHA (0,20 mmola), żywicę peptydową poddano działaniu 100% TFA (2 x 2 min.) i przemyto DMF i DCM. Ż ywicę następnie neutralizowano 10% DIEA w DMF przez okoł o 2 min. Po przemyciu DMF i DCM, żywicę poddano działaniu 0,23 mmola chlorku 2-chloro-1-etanosulfonylu i 0,7 mmola DIEA w DMF przez okoł o 1 godzinę . Ż ywicę przemyto DMF i DCM i poddano dział aniu 1,2 mmola 2-hydroksyetylopiperazyny przez około 2 godziny. Żywicę przemyto DMF i DCM i poddano działaniu różnych odczynników [(1) 20% merkaptoetanol/10% DIEA w DMF i (2) 15% etanoloamina/15% woda/70% DMF] aby usunąć grupę DNP z łańcucha bocznego His i grupy formylowej z bocznego łańcucha Trp, jak opisano powyżej, zanim przeprowadzono końcowe cięcie HF peptydu z żywicy.

[(N^a-HEPA-His)⁷]hGLP-1(7-36)NH2 ([(4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazynoacetylo)-His⁷]hGLP-1(7-36)NH2) może być otrzymany zasadniczo według procedury opisanej powyżej dla otrzymania [(N^a-HEPES-His)7]hGLP-1(7-36)NH2 z wyjątkiem, że bezwodnik 2-bromooctowy został zastosowany zamiast chlorku 2-chloro-1-etanosulfonylu.

P r z y k ł a d y 50-78

Przykłady 50-78 przeprowadzono zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 49, lecz stosując odpowiednie zabezpieczone aminokwasy.

P r z y k ł a d 50: [A6c^20,32]hGLP-1(7-36)-NH2; MS =3322,3; obliczona masa cząsteczkowa =

3321.7.

P r z y k ł a d 51: [A6c⁸]hGLP-1(8-36)-NH2; MS = 3214,5; obliczona masa cząsteczkowa =

3214.7.

P r z y k ł a d 52: [A6c⁸]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3351,5; obliczona masa cząsteczkowa =

3351.8.

P r z y k ł a d 53: [A6c^16,20]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3335,9; obliczona masa cząsteczkowa =

3335.8.

P r z y k ł a d 54: [A6c^29,32]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3321,7; obliczona masa cząsteczkowa =

3321,7.

P r z y k ł a d 55: [A6c²⁰,Aib²⁴]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3323,6; obliczona masa cząsteczkowa = 3323,7.

PL 208 751 B1

P r z y k ł a d 56: [Aib²⁴,A6c^29,32]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3335,7; obliczona masa cząsteczkowa = 3335,8.

P r z y k ł a d 57: [A6c^16,29,32]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3347,7; obliczona masa cząsteczkowa =

3347.8.

P r z y k ł a d 58: [A5c⁸]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3337,3; obliczona masa cząsteczkowa =

3337.8.

P r z y k ł a d 59: [A5c⁸,A6c^20,32]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3361,4 obliczona masa cząsteczkowa = 3361,8.

P r z y k ł a d 60: [Aib⁸,A6c³²]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3323,2; obliczona masa cząsteczkowa = ib^8,25]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3325,8; obliczona masa cząsteczkowa = ib^8,24]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3325,8; obliczona masa cząsteczkowa =

8,30

3323,7.
P	r z	y	k ł	a	d	61
3325,7.
P	r z	y	k ł	a	d	62
3325,7.
P	r z	y	k ł	a	d	63
3325,7.
P	r z	^y	k ł a d	64:

= 3351,8.

P r z y k ł a d 65: [Aib8,Cha32]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3352,0; obliczona masa cząsteczkowa = 3351,8.

P

3312.7.

P

3323.7.

P r z y k ł a d 68: [Aib⁸,A6c^20,32]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3335,3; obliczona masa cząsteczkowa = 3335,7.

P r z y k ł a d 69: [Aib^8,22]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3339,8; obliczona masa cząsteczkowa =

3339.8.

P r z y k ł a d 70: [Aib⁸,e-Ala²²]hGLP-1 (7-36)-NH₂; MS = 3325,6; obliczona masa cząsteczkowa

P r z y k ł a d 66: [Aib⁸,Glu²³]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3311,7; obliczona masa cząsteczkowa = P r z y k ł a d 67: [Aib⁸,A6c²⁰]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3323,6; obliczona masa cząsteczkowa = = 3325,8.

P

3368,8.

P

3289.7.

P

3323.7.

P r z y k ł a d 74: [Aib⁸,A6c³³]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3338,0; obliczona masa cząsteczkowa =

3337.8.

P r z y k ł a d 75: [Aib^8,14]hGLP-1(7-36)NH2; MS = 3309,8; obliczona masa cząsteczkowa =

3309,7.

P r z y k ł a d 76: [Aib^8,18]hGLP-1(7-36)NH2; MS = 3309,7; obliczona masa cząsteczkowa =

3309,7.

P r z y k ł a d 77: [Aib^8,17]hGLP-1(7-36)NH2; MS = 3309,4; obliczona masa cząsteczkowa =

3309,7.

P r z y k ł a d 78: [Aib⁸,D-Arg²⁶]hGLP-1(7-36)NH2; MS - 3310,7; obliczona masa cząsteczkowa

P r z y k ł a d 71: [Aib⁸,Lys²⁵]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3369,0; obliczona masa cząsteczkowa =

P r z y k ł a d 72: [Aib⁸,A6c¹²]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3289,8; obliczona masa cząsteczkowa =

P r z y k ł a d 73: [Aib⁸,A6c²⁹]hGLP-1(7-36)-NH2; MS = 3323,9; obliczona masa cząsteczkowa = = 3311,73.

Claims

1. Związek wybrany z grupy obejmującej [D-Ala⁸, Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]-GLP-1(7-34)NH₂;

[D-Ala^8,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH2;

[Ala^18,23,27, 3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH2; [Ala^16,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH2; [Ala^14,23,27,3-Pal^19,31)hGLP-1(7-35)-NH2; [Ala^22,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH2; [Ala^15,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH2; [Ala^17,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-35)-NH2; [Ala^22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [Ala^15,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [Ala^18,20,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [Ala^21,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [Ala^22,23,26,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [Ala^22,23,27,32,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [A|a^22,23,26,27,3Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH2; [Ala^22,23,27,31,3-Pal¹⁹,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH2; [Ala^22,23,27,28,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH2; [Ala^22,23,27,29,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH2; [Ala^23,27,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH2; [Ala^20,22,23,27,3-Pal1^9,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH2; [Ala^22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH2; [Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH2; [D-Ala¹⁰,Ala^22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³³]hGLP-1(7-33)-NH2; [D-Ala⁸,Ala^17,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-34)-NH2; [Ala^17,23,27,3-Pal^19,26,31]hGLP-1(7-34)-NH2; [D-Ala⁸,Ala¹⁷,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-34)-NH2; [Ala^17,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-34)-NH2; [D-Ala⁸,Ala^17,23,27,3-Pal^19,31,Tle²⁹]hGLP-1(7-34)-NH2; [D-Ala⁸,Ala^17,23,27,3-Pal^19,31,Tle¹⁶]hGLP-1(7-34)-NH2; [D-Ala⁸,Ala^17,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [D-Ala²²,Ala^17,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [Alb⁸,Ala^17,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [D-Ala⁸,Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-33)-NH2; [Alb⁸,Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-33)-NH2; [Ala^17,18,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [Ala^17,23,27,3-Pal^19,31,Tle³³,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [Tle¹⁶,Ala^17,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [N-Me-D-Ala⁸,Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31]hGLP-1(7-33)-NH2; [Alb⁸,Ala^{17,18,22,23,27},3-Pal^19,31]hGLP-1(7-33)-NH2; [Ala^{17,18,22,23,27},3-Pal^19,31,Tle^16,20,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [D-Ala⁸,Ala^{17,18,22,23,27},3-Pal^19,31,Tle¹⁶,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [D-Ala^8,22, Ala^17,18,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [D-Ala^8,18, Ala^17,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [D-Ala^8,17,Ala^18,22,23,27,3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; [D-Ala⁸,Ala^{17,18,22,23,27},3-Pal^19,31,Gaba³⁴]hGLP-1(7-34)-NH2; oraz farmaceutycznie dopuszczalne sole tych związków.

2. Związek wybrany z grupy obejmującej:

[Aib⁸,A6c³²]hGLP-1(7-36)NH2;

[A6c^20,32]hGLP-1(7-36)-NH₂;

[A6c⁸]hGLP-1(8-36)-NH2;

[A6c⁸]hGLP-1(7-36)-NH2;

[A6c^16,20]hGLP-1(7-36)-NH₂;

PL 208 751 B1 [A6c^29,32]hGLP-1(7-36)-NH₂;

[A6c²⁰,Aib²⁴]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib²⁴,A6c^29,32]hGLP-1(7-36)-NH₂;

[A6c^16,29,32]hGLP-1(7-36)-NH₂;

[A5c⁸]hGLP-1(7-36)-NH2;

[A5c⁸,A6c^20,32]hGLP-1(7-36)-NH₂;

[Aib⁸,A6c³²]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib^8,25]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib^8,24]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib^8,30]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib⁸,Cha²⁰]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib⁸,Cha³²]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib⁸,GIu²³]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib⁸,A6c²⁰]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib⁸,A6c^20,32]hGLP-1(7-36)-NH₂;

[Aib^8,22]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib⁸,e-Ala²²]hGLP-1 (7-36)-NH₂;

[Aib⁸,Lys²⁵]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib⁸,A6c¹²]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib⁸,A6c²⁹]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib⁸,A6c³³]hGLP-1(7-36)-NH2;

[Aib^8,14]hGLP-1(7-36)NH2;

[Aib^8,18]hGLP-1(7-36)NH2;

[Aib^8,17]hGLP-1(7-36)NH2;

[Aib⁸,D-Arg;²⁶]hGLP-1(7-36)NH2;

oraz farmaceutycznie dopuszczalne sole tych związków.

3. Kompozycja terapeutyczna, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość związku określonego w zastrz. 1 albo 2 oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik lub rozcieńczalnik.

4. Zastosowanie skutecznej ilości związku określonego w zastrz. 1 albo 2 do wytwarzania leku do leczenia choroby wybranej z grupy obejmującej cukrzycę typu I i cukrzycę typu II.