CZ303399B6

CZ303399B6 - Peptidový analog GLP-1 a farmaceutický prostredek jej obsahující

Info

Publication number: CZ303399B6
Application number: CZ20120110A
Authority: CZ
Inventors: Xin Dong@Zheng; H. Coy@David
Original assignee: Ipsen Pharma S.A.S.; The Administrators Of The Tulane Educational Fund
Priority date: 1998-12-07
Filing date: 1999-12-07
Publication date: 2012-08-29
Also published as: TWI262925B; DK1137666T3; BR9916027A; ATE394423T1; HUP0104579A3; PL393611A1; PL205713B1; CA2352573A1; AU1751200A; TW200628489A; JP2002538081A; EP1137666B9; JP2006077022A; IL143481A0; NO20012787L; EP1137666B1; CA2352573C; AU770609B2; EP1992641A3; NO20100307L

Abstract

Peptidové analogy GLP-1 obecného vzorce I, kde význam substituentu je uveden v nárocích, jejich farmakologicky prijatelné soli, metody použití takových analogu pro lécení savcu a farmaceutické prostredky, které tyto analogy obsahují.

Description

Předložený vynález je zaměřen na peptidové analogy peptidu-1, který je podobný glukagonu, jejich farmako logicky přijatelné solí, způsoby použití takových analogů pro léčení savců a na vhodné farmaceutické prostředky, které tyto analogy obsahují.

Dosavadní stav techniky

Amid peptidu-1 (7-36), který je podobný glukagonu (GLP-1) (SEQ ID NO: 1) (sekvence číslo 1), je syntetizován ve střevních L-buňkách pomocí tkáňově specifického posttranslačního zpracování glukagonového prekurzoru preproglukagonu (Vamdell, J. M., a kol., J. Histochem Cytochem, 1985:33:1080 až 6) a je uvolňován do oběhu v rámci odpovědi na potravu. Koncentrace GLP-1 vzrůstá zárovně v období hladovění, která je přibližně 15 pmol/1, na vrcholnou hladinu po jídle, která je 40 pmol/1. Bylo ukázáno, že pro daný vzrůst plazmatické koncentrace glukózy je zvýšení plazmatického inzulínu, přibližně třikrát vyšší, když je glukóza podána orálně, ve srovnání s jejím podáním intravenózním (Kreymann, B. a kol., Lancet 1987:2, 1300 až 4). Toto zvýšení hladiny uvolňování inzulínu vlivem potravy, známé jako efekt na vnitřní sekreci, je primárně hormonální a GLP-1 je nyní považován za nej silnější substanci, fyziologicky ovlivňující vnitřní sekreci u člověka. Vedle účinku na inzulín GLP-1 potlačuje vylučování glukagonu, zpožďuje vyprazdňování žaludku (Wettergren A., Dig Dis Sci 1993:38:665 až 73) a může zvýšit množství periferní glukózy, která je k dispozici (D'Alessio, D. A. a kol., J. Clin Invest 1994:93:2293 až 6).

V roce 1994 bylo navrženo schéma léčebného účinku GLP-l po pozorování, že jedna podkožní (s/c) dávka GLP-1 je schopna kompletně normalizovat hladiny glukózy pojidle u pacientů s diaso betes mellitus, který není závislý na inzulínu (NIDDM) (Gutniak, Μ. K., a kol., Diabetes Care

1994:17:1039 až 44). Mělo se za to, že tento účinek je zprostředkován jak zvýšeným uvolňováním inzulínu, tak snížením vylučování glukagonu. Dále bylo ukázáno, že intravenózní infuze GLP-1 zpožďuje vyprazdňování žaludku u pacientů s NIDDM (Williams, B., a kol,, J. Clin Endo Metab 1996:81:327 až 32).

Na rozdíl od sulfonylureáz, inzulinotropní působení GLP-1 je závislé na koncentraci glukózy v plazmě (Holz, G. G. 4. a kol., Nátuře 1993:361:362 až 5). Tedy nepřítomnost uvolňování inzulínu, zprostředkované GLP-1 při nízké koncentraci glukózy v plazmě, chrání proti prudkému nástupu hypoglykémie. Tato kombinace účinků dává GLP-1 jedinečný potenciál léčebných výhod oproti jiným činidlům, nyní běžně používaných pro léčení NIDDM.

Početné studie ukázaly, že při podání zdravým pacientům GLP-1 silně ovlivňuje úrovně glykémie a rovněž koncentrace inzulínu a glukagonu (Orskov, C, Diabetologia 35:701 až 711, 1992; Holst, J. J. a kol., Možnosti uplatnění GLP-1 v zvládnutí diabetů v Glukagon III, Příručka experimentální farmakologie, Lefevbre PJ, vyd. Berlín, Springer Verlag, 1996, str. 311 až 326), jejichž účinky jsou závislé na glukóze (Keynmann, B., a kol., Lancet ii: 1300 až 1304, Weir, G. C., a kol., Diabetes 38:338 až 342, 1989). Dále je také účinný u pacientů s diabetem (Gutniak, Μ., N. Engl. J. Med. 226:1316 až 1322, 1992; Nuthan, D. M., a kol., Diabetes Care 15:270 až 276, 1992), tím, že normalizuje hladiny glukózy v krvi u pacientů s diabetem typu 2 (Nauck, M. A. a kol., Diabetologia 36:741 až 744, 1993) a zlepšuje kontrolu glykémie u pacientů s diabetem typu 1 ( Creutzfeld, W. O., a kol., Diabetes care 19:580 až 586, 1996), což zvyšuje možnost jeho použití jako terapeutického činidla.

Avšak GLP-1 je metabolicky nestabilní, jeho poločas v plazmě (ti_/2) je in vivo pouze 1 až

2 minuty. Aplikovaný GLP-1 je také rychle degradován (Deacon, C. D., a kol, Diabetes 44:1126

- 1 CZ 303399 B6 až 1131, 1995). Tato metabolická nestabilita omezuje terapeutický potenciál přirozeného GLP-1. Existuje tedy potřeba analogů GLP-1, které jsou aktivnější ajsou metabolicky stabilnější než přirozený GLP-1.

Podstata vynálezu

Vynález se týká sloučeniny obecného vzorce I,

Α⁷-Α⁸-Α⁹-Α¹⁰-Α¹¹-Α¹²-Α¹³-Α¹⁴-Α¹⁵-Α^1β-Α¹⁷-Α¹⁸-Α¹⁹-Α²⁰-Α²¹-Α²²-Α²³-Α²⁴·Α²⁵-Α²⁶-Α²⁷- A²⁸-A²⁹ -A^3O-A³¹-A³²-A³³-A³⁴-A³⁵-A³⁶-A³⁷-R¹, (I) ío kde

A⁷ je Ura, Paa nebo Pta;

A⁸ je Ala, D-Ala, Aib, Acc, N-Me-Ala, N-Me-D-Ala, Arg nebo N-Me-Gly; 15

A⁹ je Glu, N-Me-Glu, N-Me~Asp nebo Asp;

A¹⁰ je Gly, Acc, Ala, D-Ala, Phe nebo Aib;

A¹’ je Thr nebo Ser;

A¹² je Phe, Acc, Aic, Aib, 3—Pal, 4-Pal, (3-Nal, Cha, Trp nebo X-Phe;

A¹³ je Thr nebo Ser;

A¹⁴ je Ser, Thr, Ala nebo Aib;

A¹⁵ je Asp, Ala, D-Asp nebo Glu;

A¹⁶ je Val, D-Val, Acc, Aib, Leu, Ile, Tle, Nle, Abu, Ala, D-Ala, Tba nebo Cha;

A¹⁷ je Ser, Ala, D-Ala, Aib, Acc nebo Thr;

A¹⁸ je Ser, Ala, D-Ala, Aib, Acc nebo Thr;

A¹⁹ je Tyr, D-Tyr, Cha, Phe, 3-Pal, 4_Pal, Acc, β-Nal, Amp nebo X’-Phe;

A²⁰ je Leu, Ala, Acc, Aib, Nle, Ile, Cha, Tle, Val, Phe nebo X'-Phe;

A²¹ je Glu, Ala nebo Asp;

A²² je Gly, Acc, Ala, D-Ala, β-Ala nebo Aib;

A²³ je Gin Asp, Ala, D-Ala, Aib, Acc, Asn nebo Glu;

A²⁴ je Ala, Aib, Val, Abu, Tle nebo Acc;

-2CZ 303399 B6

A²⁵ je Ala, Aib, Val, Abu, Tle, Acc, Lys, Arg, hArg, Om, HN-CH((CH2)n-NR^l0R^,l))-C(O) nebo HN-CH((CH2)_e-X³>-C(O);

A²⁶ je Lys, Ala, 3-Pal, 4-Pal, Arg, hArg, Om, Amp, HN-CH((CH₂)_n-NR^,0R¹¹))-C(O) nebo

HN-CH((CH₂)_e-X³)-C(O);

A²⁷ je Glu, Ala, D-Ala nebo Asp;

A²⁸ je Phe, Ala, Pal, β-Nal, X-Phe, Aic, Acc, Aib, Cha nebo Trp; to

A²⁹ je Ile, Acc, Aib, Leu, Nle, Cha, Tle, Val, Abu, Ala, Tba nebo Phe;

A³⁰ je Ala, Aib, Acc nebo chybí;

A³¹ je Trp, β-Nal, 3-Pal, 4-Pal, Phe, Acc, Aib, Cha, Amp nebo chybí;

A³² je Leu, Ala, Acc, Aib, Nle, Ile, Cha, Tle, Phe, X-Phe, Ala nebo chybí;

A³³ je Val, Acc, Aib, Leu, Ile, Tle, Nle, Cha, Ala, Phe, Abu, X-Phe, Tba, Gaba nebo chybí;

A³⁴ je Lys, Arg, hArg, Om, Amp, Gaba, HN-CH((CH2)n-NR¹⁰R^l,))-C(O), HN-CH((CH2)_cX³>-C(O) nebo chybí;

A³⁵ je Gly nebo chybí;

Λ³⁶ je L nebo D-Arg, D- nebo L-Lys, D- nebo L-hArg, D- nebo L-Om, Amp, HN-CH((CH2)n-NR^l0R^H)-C(O), HN-CH((CH2)_c-X³)-C(O) nebo chybí;

A³⁷ je Gly nebo chybí

X¹ je pro každý případ nezávisle vybrán ze skupiny zahrnující (Ci-Cé)alkyl, OH a halo;

R¹ je OH, NH2, (C,-C30)alkoxy, nebo NH-X²-CH2-Z°, kde X² je (Ci-Ci₂) uhlovodíkový zbytek a Z° je H, OH, CO₂H nebo CONH₂;

X³ je /—\ _/N—(CH,),-CH₃ nebo -C(O)-NHR¹², kde X⁴ je pro každý případ nezávisle -C(O)-, -NH-C(O)- nebo -CH₂a kde f je pro každý případ nezávisle celé číslo v rozmezí 1 až 29 včetně; a e je pro každý případ nezávisle celé číslo v rozmezí 1 až 4;

n je pro každý případ nezávisle celé číslo v rozmezí 1 až 5; a každý zR¹⁰ a R¹¹ je pro každý případ nezávisle H, (Ci-C₃₀)alkyl, (Ci-C₃₀)acyl, (C|-C₃₀)alkylsulfonyl, -C((NH)(NH₂)) nebo r~\

-C{ObCH,—N N—<CHA-CH, za předpokladu, že když R^lti je (C|-C₅₀)acyl,

-C(OJ-CH₂—ř/ (CH₂)_rCH₃ (C,-C_U))alkylsulfbnyl, -C((NH)(NH₂)), tak

R¹¹ je H nebo (C|-€i())alkyl; a

R¹² je (C|-C3o)alkyl, nebo jej í farmaceuticky přijatelná sůl.

Dále jsou popsány sloučeniny obecného vzorce 1,

Α⁷-Α⁸-Α⁹-Α¹⁰-Α¹¹-Α¹²-Α¹³-Α¹⁴-Α¹⁵-Α^1β-Α¹⁷-Α¹⁸-Α¹⁹-Α²⁰-Α²¹-Α²²-Α²³-Α²⁴-Α²⁵-Α^2β-Α²⁷ aV-a^W^-aV-r¹, (I) kde

A⁷ je Ura, Paa, Pta nebo Hppa;

A³ je Ala, D-Ala, Aib, Acc, N-Me-Ala, N-Me-D-Ala, Arg nebo N-Me-Gly;

A⁹ je Glu, N-Me-Glu, N-Me-Asp nebo Asp;

A¹⁰ je Gly, Acc, Ala, D-Ala, Phe nebo Aib;

A je Thr nebo Ser;

A¹² je Phe, Acc, Aic, Aib, 3-Pal, 4-Pal, β-Nal, Cha, Trp nebo X-Phe;

A¹³ je Thr nebo Ser;

A¹⁴ je Ser, Thr, Ala nebo Aib;

A'⁵ je Asp, Ala, D~Asp nebo Glu;

A¹⁷ je Ser, Ala, D-Ala, Aib, Acc nebo Thr;

A¹⁸ je Ser, Ala, D~Ala, Aib, Acc nebo Thr;

A¹⁹ je Tyr, D-Tyr, Cha, Phe, 3-Pal, 4-Pal, Acc, β-Nal, Amp nebo X‘-Phe;

A²⁰ je Leu, Ala, Acc, Aib, Nle, Ile, Cha, Tle, Val, Phe nebo X^!-Phe;

A²¹ je Glu, Ala nebo Asp;

A²² je Gly, Acc, Ala, D-Ala, β-Ala nebo Aib;

-4CZ 303399 B6

A²³ je Gin Asp, Ala, D-Ala, Aib, Acc, Asn nebo Glu;

A²⁴ je Ala, Aib, Val, Abu, Tle nebo Acc;

A²⁵ je Ala, Aib, Val, Abu, Tle, Acc, Lys, Arg, hArg, Om, HN-CH((CH2)n-NR¹⁰R^ll))-<(O) nebo HN-CH((CH2)_e-X³)-C(O);

A²⁶ je Lys, Ala, 3-Pal, 4-Pal, Arg, hArg, Om, Amp, HN-CH((CH2)1)-NR^,0R)>-0(0) nebo io HN-Cll((CH2)_e-X³)-C(O);

A²⁷ je Glu, Ala, D-Ala nebo Asp;

A²⁸ je Phe, Ala, Pal, β-NaI, X-Phe, Aic, Acc, Aib, Cha nebo Trp;

A²⁹ je Ile, Acc, Aib, Leu, Nle, Cha, Tle, Val, Abu, Ala, Tba nebo Phe;

A³⁰ je Ala, Aib, Acc nebo chybí;

A³¹ je Trp, β-Nal, 3-Pal, 4-Pal, Phe, Acc, Aib, Cha, Amp nebo chybí;

A³² je Leu, Ala, Acc, Aib, Nle, Ile, Cha, Tle, Phe, X^l-Phe, Ala nebo chybí;

A³⁴ je Lys, Arg, hArg, Om, Amp, Gaba, HN-CH((CH2)n-NR^I0R^,l))-C(O), HN-CH((CH2)_fiX³)-C(O) nebo chybí;

A³⁵ je Gly nebo chybí;

A³⁶ je L- nebo D-Arg, D- nebo L-Lys, D~ nebo L-hArg, D- nebo L-Om, Amp, HN-CH((CH2)n-NR¹⁰R^ll>-€(O), HN-CH((CH2)_c-X³>C(O) nebo chybí;

A³⁷ je Gly nebo chybí

X¹ je pro každý případ nezávisle vybrán ze skupiny zahrnující (Ci-C₆)alkyl, OH a halo;

R¹ je OH, NH2, (Ci-C30)alkoxy, nebo NH-X²-CH2-Z⁰, kde X² je (C,-C,2) uhlovodíkový zbytek a Z° je H, OH, CO₂H nebo CONH₂;

X³ je

X—_ H— (CHjJj-CHj nebo -C(O)-NHR¹², kde X⁴ je pro každý případ nezávisle -C(O)-, -NH-C(O)- nebo -CH₂-, a kde f je pro každý případ nezávisle celé číslo v rozmezí 1 až 29 včetně; e je pro každý případ ne závisle celé číslo v rozmezí 1 až 4;

n je pro každý případ nezávisle celé číslo v rozmezí 1 až 5; a

každý z R¹⁰ a R¹¹ je pro každý případ nezávisle H, (Ci-Cio)alkyl, (C|-C_w)acyl, (Ci-Cjojalkylsulfonyl, -€((NHXNH,)) nebo

C(O)-CH,—N

,N— za předpokladu, že když R¹⁰ je (Ci-C_w)acyl, /-\

-C(O)-CH₃— N N—(CHjVCH, (C|-C₃₀)alkylsulfonyl, -C((NH)(NH₂)), tak R¹' je H nebo (Ci-C₃₀)alkyl; a ío R¹² je (C|-C₃₀)alkyl, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

Výhodná sloučenina, která splňuje podmínky právě uvedeného obecného vzorce I je taková, kde

A je Thr; A¹³ je Thr; A¹⁴ je Ser, Aib nebo Ala; A¹⁷ je Ser, Ala, Aib nebo D-Ala; A¹⁸ je Ser, Ala, Aib nebo D-Ala; A²¹ je Glu nebo Ala; A²³ je Gin, Glu nebo Ala; a A²⁷ je Glu nebo Ala; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

A⁹ je Glu, N-Me-Olu nebo N-Me-Asp; A¹² je Phe, Acc nebo Aic; A¹⁶ je Val, D-Val, Acc, Aib, Ala, Tle nebo D-AIa; A¹⁹ je Tyr, 3-Pal, 4-Pal nebo D-Tyr; A²⁰ je Leu, Acc, Cha, Ala nebo Tle; A²⁴ je Ala, Aib nebo Acc; A²⁵ je Ala, Aib, Acc, Lys, Arg, hArg, Om, HN-CH((CH₂)_n-NH-R¹⁰)C(O); A²⁸ je Phe nebo Ala; A²⁹ je Ile, Acc nebo Tle; A³°je Ala, Aib nebo chybí; A³¹ je Trp, Ala, 3-Pal, 4-Pal nebo chybí; A³² je Leu, Acc, Cha, Ala nebo chybí; A³³ je Vat, Acc, Ala, Gaba, Tle nebo chybí; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

Výhodná sloučenina, která splňuje podmínky právě uvedeného obecného vzorce I je taková, kde A je Ala, D-Ala, Aib, A6c, A5c, N-Me-AIa, N-Me-D-Ala nebo N-Me-Gly; A¹⁰ je Gly, Ala, D-AIa nebo Phe; A¹² je Phe, A6c nebo A5c; A¹⁶ je Val, Ala, Tle, A6c, A5c nebo D-Val; A²⁰ je

Leu, A6c, A5c, Cha, Ala nebo Tle; A²² je Gly, Aib, β-Ala, L-Ala nebo D-Ala; A²⁴ je Ala nebo Aib; A²⁹ je Ile, A6c, A5c nebo Tle; A³² je Leu, A6c, A5c, Cha, Ala nebo chybí; A³³ je Val, A6c, A5c, Ala, Gaba, Tle nebo chybí; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

R¹ je OH nebo NH₂; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

Nejvýhodnější sloučeninou obecného vzorce I je [Ura⁷]hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO: 125); [Paa⁷]hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO: 126); [Pta⁷]hGLP-l(7-36)-NH₂ (SEQ ID NO: 127); nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

Popsána je také sloučenina obecného vzorce I, kterou je [Hppa⁷]hGLP-1(7-36)-NH₂ (SEQ ÍD NO: 87); nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

V jiném provedení je popsán farmaceutický prostředek, který obsahuje účinné množství sloučeni45 ny obecného vzorce 1, která je zde výše definována nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.

-6CZ 303399 B6

V ještě jiném provedení je popsáno použití sloučeniny vzorce I jak definována výše, nebo její farmaceuticky přijatelné soli pro přípravu léčiva pro vyvolání agonistického účinku u receptoru GLP-l u pacienta, který to vyžaduje.

V dalším provedení je popsáno použití sloučeniny vzorce I jak definována výše, nebo její farmaceuticky přijatelné soli pro přípravu léčiva pro léčení nemoci vybrané ze skupiny obsahující diabetes typu I, diabetes typu II, obezitu, glukagonom, vylučovací potíže u dýchacích cest, metabolické poruchy, artritidu, osteoporózu, nemoc centrálního nervového systému, restenózu, neurodegenerativní nemoc, selhání ledvin, městnavé srdeční selhání, nefrotický syndrom, cirhózu, plic10 ní otok a vysoký tlak u jedince, kteiý to vyžaduje, kdy léčba spočívá v tom, že jedinci je podáno účinné množství. Výhodné onemocnění, pro které je léčivo použito, je diabetes typu I nebo diabetes typu II.

S výjimkou N-koncové aminokyseliny, všechny zkratky (např. Ala) aminokyselin v tomto popi15 su platí pro strukturu -NH-CH(R)-CO-, kde Rje postranní řetězec aminokyseliny (např. CH₃pro Ala). Pro N-koncovou aminokyselinu zkratka zastupuje strukturu (R²R³)-N-CH(R)-CO-, kde R je postranní řetězec aminokyseliny a v případě že A⁷ je Ura, Paa, Pta nebo Hppa, tak v tomto případě R² a R³ chybí, protože Ura, Paa, Pta nebo Hppa jsou zde zamýšleny jako desaminokyseliny. Zkratky: β-Nal, Nle, Cha, Amp, 3-Pal, 4-Pal a Aib jsou zkratky následujících a-aminokyselin: p-(2-naftyl)alanin, norleucin, cyklohexylalanin, 4—aminofenylalanin, β-(3pyridinyl)alanin, β-(4—pyridiny l)alanin, respektive kyselina α-aminoizomáselná. Definice jiných aminokyselin jsou: Ura je kyselina urokanová: Pta je kyselina (4-pyridylthio)octová; Paa je kyselina Zrans-3-(3-pyridyI)akrylová; Tma—His je Ν,Ν-tetra-methylamidinohÍstidin; N-MeAla je N-methylalanin; N-Me-Gly je N-methylglycin; N-Me-Glu je kyselina N-methyl25 glutamová; Tle je Zerc-butylglycin; Abu je kyselina ct-aminomáselná; Tba je Zerc-butylalanin; Orn je omitin; Aib je kyselina a-aminoizomáselná; β-Ala je β-alanín; Gaba je kyselina γaminomáselná; Ava je kyselina 5-aminovalerová a Aic je kyselina 2-aminoindan-2-karboxylová, Hppa je 3_(p-hydroxyfenyl)propionová kyselina.

Zkratka Acc představuje aminokyselinu vybranou ze skupiny zahrnující: 1-amino-l-cyklopropankarboxylovou (A3c); l-amino-l-cyklobutankarboxylovou (A4c); kyselinu 1-amino-lcykiopentankarboxylovou (A5c); kyselinu 1-amino-l-cyklohexankarboxylovou (A6c); kyselinu 1-amino-l-cykloheptankarboxylovou (A7c); kyselinu 1-amino-l-cyklooktankarboxylovou (A8c); a kyselinu 1-amino-l-cyklononankarboxylovou (A9c).

Ve výše uvedeném vzorci, hydroxyalkyl, hydroxy feny] alkyl a hydroxynaftyl alkyl mohou obsahovat 1 až 4 hydroxy substituenty. COX⁵ zastupuje -C=OX⁵. Příklady -C=OX⁵ zahrnují mimo jiné acetyl a fenylpropionyl.

Zkratkou Lys(N_e-alkanoyl) je míněna následující obecná struktura:

N

H

Zkratkou Lys(N_c-atkylsulfonyl) je míněna následující obecná struktura:

CH-,

Zkratkou Lys(N_E~(2-(4-alkyl-l-piperazin)-acetyl)) je míněna následující obecná struktura:

Zkratkou Asp( l-(4-alkylpiperazin)) je míněna následující obecná struktura:

Zkratkou Asp(1—alky lamino) je míněna následující obecná struktura:

Proměnná n v předchozích uvedených strukturách je v rozmezí 1 až 30.

Plné názvy jiných zkratek, které jsou zde použity, jsou následující: Boc pro t-buty loxy karbony I, HF pro fluorovodík, Fm pro formy 1, Xan pro xanthyl, Bzl pro benzyl, Tos pro tosyl, DPN pro 2,4-dinitrofenyl, DMF pro d i methyl formám i d, DCM pro dichlormethan, HBTU pro hexafluorofosfát, 2-(lH-benzotriazol-l-y 1)-1,1,3,3-tetramethyluronia, DIEA pro díizopropylethylamin,

HOAc pro kyselinu octovou, TFA pro kyselinu trifluoroctovou, 2CIZ pro 2-chIorbenzyloxykarbonyl a OcHex pro O-cyklohexyl.

Peptid tohoto vynálezu je zde také označován jiným formátem zápisu, např. (A5c⁸)hGLP-l{736)-NH₂ (SEQ ID NO: 130), se substituovanými aminokyselinami z přirozené sekvence, umístě20 nými v první soustavě závorek (např. A5c⁸ pro Ala⁸ vhGLP-1). Zkratka GLP-1 znamená glukagonu podobný peptid-1, hGLP-1 znamená lidský glukagonu podobný peptid-1. Čísla umís-8CZ 303399 B6 těná v závorce označují počet aminokyselin přítomných v peptidu (např. hGLP-l(7-36) (SEQ ID NO: 3) znamená aminokyseliny 7 až 36 ze sekvence peptidu lidského GLP-1). Sekvence hGLP1(7—37) (SEQ ID NO: 4) je uvedena v Mojsov, S., Int., J. Peptide Protein Res., 40, 1992, str. 333 až 342. Označení „NH₂“ v hGLP-l(7-36)NH₂ (SEQ ID NO: 1) znamená, že C-konec peptidu je ukončen amidovou skupinou. hGLP-l(7-36) (SEQ ID NO: 2) znamená, že C-konec je volná aminokyselina.

Detailní popis ίο Peptidy tohoto vynálezu mohou být připraveny pomocí standardní syntézy peptidů na pevné fázi. Viz Steward, J. M., a kol., Solid Phase Synthesis (Pierce Chemical Co., 2. vyd., 1984).

Pokud Rl je NH-X²-CH2-CONH2 (tj. Z°=CONH2), potom syntéza peptidu začíná pomocí Boc-HN-X^-CHr-COOH, která je připojena k MBHA pryskyřici. Pokud R¹ je NH-X2-CH₂15 COOH (tj. Z°=COOH), potom syntéza peptidu začíná pomocí Boc-HN-Xt-CH₂-COOH, kteráje připojena k PAM pryskyřici.

Dále je popsána syntetická metoda pro přípravu peptidu, který je předmětem tohoto vynálezu, která je dobře známa osobám se zkušeností v oboru. Osobám se zkušeností v oboru jsou také známy jiné metody.

Pryskyřice benzhydrylamin-polystyrén (Advanced ChemTech, Inc., Lousvílle, KY) (0,9 g, 0,3 mmol) ve formě s chloridovými iony je umístěna do reakční nádoby syntetizátoru peptidů Advanced ChemTech Peptide Synthetizer Model 200, který je naprogramovaný tak, aby prováděl následující reakční cyklus: a) methylenehlorid; b) 33% kyselina trifluoroctová v methyl enchloridu (2 kroky po 1 až 15 minutách každý); c) methylenchlorid; d) ethanol; e) methylenchlorid; f) 10% diizopropylethylamin v methylenchloridu.

Neutralizovaná pryskyřice byla míchána s Boc skupinou chráněnou aminokyselinou, která je

C-koncovou aminokyselinou požadovaného syntetizovaného peptidu, a diízopropylkarbodiimidem v methylenchloridu (každý 3 mmol) po dobu 1 hodiny a výsledná pryskyřice s aminokyselinou je potom cyklována kroky a) až ř) ve výše uvedeném promývacím programu. Jiné aminokyseliny (3 mmol) požadovaného peptidu jsou potom připojovány postupně stejným postupem. Po ukončení syntézy byl peptid odštěpen z pryskyřice tak, že byla smíchána s anisolem (5 ml), dithiothreitolem (100 mg) a bezvodým fluorovodíkem (35 ml) při teplotě 0 °C a míchání po dobu 45 minut. Přebytek fluorovodíku byl rychle odpařen proudem suchého dusíku a uvolněný peptid byl vysrážen a promyt éterem. Hrubý peptid byl potom rozpuštěn v minimálním objemu zředěné kyseliny octové, nalít na sloupec VYDAC® (2,5x2,5 cm) (kysličník křemičitý s oktadecylsilanem 10 mM) a vymýván lineárním gradientem 20 až 60% acetonitrilu v 0,1% kyselině trifluoroctové ve vodě po dobu asi 1 hodiny. Frakce byly testovány pomocí chromatografie na tenké vrstvě a pomocí analytické HPLC (40 až 70% B při 1 %/minutu, roztok B je 80% acetonitril ve vodě, obsahující 0,1% TFA) a spojeny tak, aby bylo dosaženo spíše maximální čistoty než výtěžku. Voda z roztoku byla odstraněna opakovanou lyofilizací a výtěžek byl získán ve formě bílého, načechraného prášku.

Získaný peptid byl analyzován pomocí HPLC. Aminokyselinová analýza kyselého hydrolyzátu získaného peptidu může potvrdit složení peptidu. Pro určení molekulové hmotnosti peptidu je použita metoda laserové desorpce MS.

Chráněná aminokyselina, kyselina l-(terc-butoxykarbonyl-amino)-l-cyklohexankarboxylová, byla syntetizována následujícím způsobem. 19,1 gramu (0,133 mol) kyseliny 1-amino-l-cyklohexankarboxylové (Acros Organics, Fisher Scientifíc, Pittsburgh, PA) bylo rozpuštěno ve 200 ml dioxanu a 100 ml vody. K tomu bylo přidáno 67 ml 2N NaOH. Roztok byl ochlazen v lázni vody s ledem. K tomuto roztoku bylo přidáno 32,0 g (0,147 mol) di-terc-butyldikarbonátu. Reakční směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Poté byl za sníženého tlaku odstraněn dioxan.

-9CZ 303399 B6

Ke zbývajícímu vodnému roztoku bylo přidáno 200 ml octanu ethylnatého. Směs byla ochlazena v lázni vody s ledem. pH vodné vrstvy bylo upraveno na asi 3 pomocí přidání 4N HCl. Organická vrstva byla oddělena. Vodná vrstva byla extrahována octanem ethylnatým (1x100 ml). Dvě organické vrstvy byly spojeny a promyty solankou (2x150 ml), sušeny nad bezvodým MgSO₄, filtrovány a za sníženého tlaku koncentrovány do suchého stavu. Výtěžek byl rekrystalován ze směsi octan ethylnatý/hexany. Bylo získáno 9,2 g čistého produktu. Výtěžek byl 29%.

Boc-A5c-OH byla syntetizována analogickým způsobem jako Boc-Ac6c-OH. Ostatní chráněné Acc aminokyseliny mohou být připraveny analogickým způsobem osobou s běžnou zkušeností v oboru podle popisů, uvedených v předloženém patentu.

Při syntéze peptidů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, a které obsahují A5c, A6c a/nebo Aib, jsou doby potřebné pro připojení těchto zbytků a zbytků, které je bezprostředně následují, 2 hodiny. Pro syntézu [Tma-His^?JhGLP-l(7-36)(SEQ ID NO: 117) byly pro reakci s N-koncovou volnou aminoskupinou na komplexu peptid-pryskyřice při poslední spojovací reakci použity HBTU (2 mmol) a DIEA (1,0 ml) v 4 ml DMF, doba připojení je asi 2 hodiny.

Plné názvy zkratek, které jsou zde použity, jsou následující: Boc pro t-butyloxykarbonyl, HF pro fluorovodík, Fm pro formyl, Xan pro xanthyl, Bzl pro benzyl, Tos pro tosyl, DPN pro 2,4-dinitrofenyl, DMF pro dimethyl formám id, DCM pro dichlormethan, HBTU pro hexafluorofosfát, 2-(lH-benzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3-tetramethyluronia, DIEA pro diizopropylethylamin, HOAc pro kyselinu octovou, TFA pro kyselinu trifluoroctovou, 2CIZ pro 2-chlorbenzyloxykarbonyl a OcHex pro G-cyklohexyl.

U sloučeniny, která je předmětem tohoto vynálezu, může být následujícím postupem testována její schopnost vázat se na GLP-1.

Buněčná kultura:

Buňky RIN 5F pocházející z krysího inzulinomu (ATCC # CRL-2058, Americká sbírka typových kultur, Manassas, VA), exprimující G LP-1 receptor, byly kultivovány v Eaglově médiu modifikovaném podle Dulbecca (DMEM), obsahujícím 10 % fetálního telecího séra a udržovány při 37 °C ve vlhké atmosféře o složení 5% CO₂/95% vzduch. Vazba radioaktivně značeného ligandu

Membrány pro studia vazby radioaktivně značeného ligandu byly připraveny homogenizací buněk RIN ve 20 ml ledového 50mM Tris-HCI pomocí zařízení Brinkman Polytron (Westbury, NY) (nastavení 6, 15 s). Homogenáty byly 2x promyty centrifugací (39 000 g/10 min) a konečné sedimenty byly resuspendovány v 50mM Tris-HCI, obsahujícím 2,5mM MgCl₂, 0,1 mg/ml bacitracinu (Sigma Chemical, St. Louis, MO) a 0,1% BSA. Pro testování byly alikvoty (0,4 ml) inkubovány s 0,05nM (^l25I)G LP-1 (7-36) (-2200 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA) buď s, anebo bez 0,05 ml neznačených kompetujících testovaných peptidů. Po inkubaci 100 min (25 °C) byl vázaný (^l25I)G LP-1 (7-36) oddělen od volného rychlou filtrací přes filtry GF/S (Brandel, Gaithersburg, MD), které byly předem nasáknuty v 0,5% polyethyleniminu. Filtry byly potom 3x promyty 5 ml alikvoty ledového 50mM Tris-HCI a vázaná radioaktivita, zachycená na filtrech, byla změřena spektrometrií gama (Wallac LKB, Gaithersburg, MD). Specifická vazba byla definována jako celkový vázaný (^l25I)GLP-l(7-36) (SEQ ID NO: 151) mínus ten, který je vázaný v přítomnosti lOOOnM GLP-1 (7-36) (SEQ ID NO: 3) (Bachem, Torrence, CA).

Peptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu mohou být poskytnuty ve formě farmaceuticky přijatelných solí. Příklady takových solí zahrnují mimo jiné takové, které jsou vytvořeny s organickými kyselinami (např. kyselina octová, kyselina mléčná, kyselina maleinová, kyselina citrónová, kyselina jablečná, kyselina askorbová, kyselina jantarová, kyselina benzoová, kyselina methan sulfon ová, kyselina toluensulfonová nebo kyselina pamoová), s anorganickými kyselinami (např. kyselina chlorovodíková, kyselina sírová nebo kyselina fosforečná) a s polymemími

- 10CZ 303399 B6 kyselinami (např. tanin, karboxymethylcelulóza, kyselina polymléčná, kyselina polyglykolová nebo kopolymery kyselin po lymléčná-gly kolová). Typický způsob pro přípravu soli peptidu, který je předmětem tohoto vynálezu, jev oboru dobře známý, a může být proveden standardními metodami výměny solí. Tedy TFA sůl peptidu, který je předmětem tohoto vynálezu (TFA sůl je výsledkem purifikace peptidu pomocí preparativní HPLC, eluování pomocí pufrů obsahujících TFA) může být převedena na sůl jinou, jako je třeba octan tím, že je peptid rozpuštěn v malém množství vodného roztoku 0,25N kyseliny octové. Výsledný roztok je nanesen na semipreparativní HPLC sloupec (Zorbax, 300 SB, C-8). Sloupec je vymýván (1) roztokem O,1N octanu amonného ve vodě po dobu 0,5 hodiny, (2) roztokem 0,25N octanu amonného ve vodě po dobu io 0,5 hodin a (3) lineárním gradientem (20 až 100% roztok B po dobu více než 30 minut) při rychlosti průtoku 4 ml/minutu (roztok A je 0,25N kyselina octová ve vodě; roztok B je 0,25N kyselina octová ve směsi aceton itri 1/voda, 80:20). Frakce obsahující peptid jsou odebírány a vysušeny do suchého stavu pomocí lyofilizace.

i5 Jak je dobře známo osobám se zkušeností v oboru, známá a potenciální použití GLP-1 jsou různá a rozmanitá (viz Todd J. F. a kol., Clinical Science, 1988, 95, str. 325 až 329; a Todd J. F. a kol., European Journal of Clinical Investigation, 1997, 27, str. 533 až 536). Tedy podání sloučenin, které jsou předmětem tohoto vynálezu za účelem vyvolání, může mít tytéž účinky a použití jako samotný GLP-1. Tato různá použití GLP-1 mohou být shrnuta následovně jako léčení: diabetů typu I, diabetů typu II, obezity, glukagonomů, vylučovacích potíží u dýchacích cest, metabolických poruch, artritidy, osteoporózy, nemocí centrálního nervového systému, restenózy, neurodegenerativních nemocí, selhání ledvin, městnavého srdečního selhání, nefrotického syndromu, cirhózy, plícního otoku, vysokého tlaku a poruch s očekávaným snížením příjmu potravy. Analogy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, které vyvolávají antagonistický efekt u jedince, mohou být použity pro léčení následujících poruch: hypoglykémie a syndromu špatného vstřebávání, spojeného s chirurgickým odnětím části žaludku a operacemi tenkého střeva.

Předložený vynálezu tedy ve svém rámci zahrnuje farmaceutické prostředky, které obsahují jako svoji aktivní složku, alespoň jednu ze sloučenin obecného vzorce I ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

Dávka aktivní složky v prostředcích, které jsou předmětem tohoto vynálezu, může být různá; je však nezbytné, aby množství aktivní složky bylo takové, aby bylo dosaženo vhodné dávky. Vybraná dávka závisí na požadovaném léčebném účinku, na způsobu podávání a na době trvání léčby. Obecně účinná dávka pro aktivity, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je v rozsahu lxlO“⁷ až 200 mg/kg/den, výhodně 1x10^* až 100 mg/kg/den, která může být podána jako jedna dávka nebo může být rozdělena do mnoha dávek.

Sloučeniny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být podávány orálně, parenterálně (např. intramuskulámí, intraperitoneální, intravenózní nebo podkožní injekcí, nebo pomocí implantátu), nazálně, vaginálně, rektálně, pod jazyk nebo místními způsoby podávání a mohou být připraveny s farmaceuticky přijatelnými nosiči tak, aby poskytly dávkové formy vhodné pro každý způsob podávání.

Pevné dávkové formy pro orální podávání zahrnují kapsle, tablety, pilulky, prášky a granule. V takových pevných dávkových formách je aktivní složka smíšena alespoň s jedním inertním farmaceuticky přijatelným nosičem jako je sacharóza, laktóza nebo škrob. Takové dávkové formy mohou také obsahovat, jako v běžné praxi, další sloučeniny, jiné než taková inertní ředidla, např. lubrikační činidla jako je stearan horečnatý. V případě kapslí, tablet a pilulek mohou dávkové formy také obsahovat pufrační činidla. Tablety a pilulky mohou být dále připraveny s enterickým povlakem.

Tekuté dávkové formy pro orální podávání zahrnují farmaceuticky přijatelné emulze, roztoky, suspenze, sirupy, tinktury obsahující inertní ředidla, obecně v oboru používaná, jako je např.

-TR voda. Vedle takových inertních ředidel mohou také prostředky zahrnovat adjuvans, jako jsou zvlhčovači činidla, emulgační a suspenzní činidla a sladidla, činidla dodávající chuť a vůni.

Prostředky pro parenterální podávání, které jsou předmětem tohoto vynálezu, zahrnují sterilní vodné a ne vodné roztoky, suspenze nebo emulze. Příklady nevod ných rozpouštědel nebo nosičů jsou propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje, jako je olivový olej a kukuřičný olej, želatina a organické estery, které je možno podávat injekčně, jako je ethylester kyseliny olejové. Takové dávkové formy mohou také obsahovat adjuvans, jako jsou konzervační, zvlhčovači, emulgační a disperzní činidla. Mohou být sterilizovány například filtrací přes filtr zachycující bakterie, přidáním steri lizačního činidla do prostředků, ozářením prostředků nebo zahřátím prostředků. Mohou být také vyrobeny ve formě sterilního pevného prostředku, který může být bezprostředně před použitím rozpuštěn ve sterilní vodě nebo v nějakém jiném sterilním injekčním médiu.

Prostředky pro rektální nebo vaginální podávání jsou s výhodou čípky, které mohou vedle aktivní složky obsahovat excipienty, jako jsou máslo z koky nebo vosk na čípky.

Prostředky pro nazální podávání nebo pro podávání pod jazyk jsou také připravovány se standardními excipienty, které jsou v oboru dobře známé.

Dále může být sloučenina, které je předmětem tohoto vynálezu, podávaná pomocí prostředků pro trvalé uvolňování, jako jsou ty, které jsou popsány v následujících patentech a patentových přihláškách. Patent US 5 672 659 popisuje prostředky pro trvalé uvolňování, které obsahují biologicky aktivní činidlo a polyester. Patent US 5 595 760 popisuje prostředky pro trvalé uvolňování, které obsahují biologicky aktivní činidlo v gelové formě. Patentová přihláška US 08/929 363, podaná 9. září 1997, popisuje polymemí prostředky pro trvalé uvolňování, které obsahují biologicky aktivní činidlo a chitosan. Patentová přihláška US 08/740 778, podaná 1. listopadu 1996, popisuje prostředky pro trvalé uvolňování, které obsahují biologicky aktivní činidlo a cyklodextrin. Patentová přihláška US 09/015 394, podaná 29. ledna 1998, popisuje absorbovatelné prostředky pro trvalé uvolňování, které obsahují biologicky aktivní Činidlo. Patentová přihláška US 09/121 653, podaná 23. července 1998, popisuje způsob přípravy mikročástic, obsahujících terapeutické činidlo jako je peptid, procesem typu olej ve vodě. Patentová přihláška US 09/131 472, podaná 10. srpna 1998, popisuje komplexy obsahující terapeutické činidlo jako je peptid a fosforylovaný polymer. Patentová přihláška US 09/184 412, podaná 2. listopadu 1998, popisuje komplexy obsahující terapeutické činidlo jako je peptid a polymer obsahující nepolymerizovatelný lakton. Obsahy předchozích patentů a patentových přihlášek jsou zde zahrnuty jako odkazy.

Pokud není definováno jinak, všechny zde používané technické a vědecké termíny mají tentýž význam, jak je obyčejně chápán osobami s běžnou zkušeností v oboru, do něhož tento vynález spadá. Také všechny publikace, patentové přihlášky, patenty a ostatní odkazy zde zmíněné, jsou zde zahrnuty jako odkaz.

Následující příklady popisují syntetické metody pro přípravu peptidů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, tyto metody jsou dobře známy osobám se zkušeností v oboru. Osobám se zkušeností v oboru jsou také známy jiné metody. Příklady jsou poskytnuty pro účely ilustrace a nejsou míněny tak, aby v jakémkoli směru omezovaly rozsah předmětného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: (D-Ala⁸, Ala¹⁷’²²’²³’²⁷, 3-Pal¹⁹’³¹, Gaba³⁴)hGLP-l(7-34)NH₂

Pryskyřice benzhydrylamin-polystyrén (Advanced ChemTech, lne., Louisville, KY) (0,9 g, 0,3 mmol) ve formě s chloridovými ionty je umístěna do reakční nádoby syntetizátoru peptidů

- 12CZ 303399 B6

Advanced ChemTech Peptide Synthetizer Model 200, který je naprogramovaný tak, aby prováděl následující reakční cyklus: a) methylenchlorid; b) 33% kyselina trifluoroctová v methyl enchloridu (2 kroky po 1 a 15 minutách každý); c) methylenchlorid; d) ethanol; e) methylenchlorid; f) 10% diizopropylethylamin v methylenchloridu.

Neutralizovaná pryskyřice byla míchána s Boc-Gaba a diizopropylkarbodiimidem v methylenchloridu (každý 3 mmol) po dobu 1 hodiny a výsledná pryskyřice s aminokyselinou je potom cyklována kroky a) až f) ve výše uvedeném promývacím programu. Následující aminokyseliny (3 mmol) byly potom připojovány postupně stejným postupem: Boc-Val, Boc-Leu, Boc-3-Pal, Boc-AIa, Boc-Ile, Boc-Phe, Boc-Ala, Boc-Lys(2-Cl-Z), Boc-Ala, Boc-Ala, Boc-Ala, Boc-Ala, Boc-Glu(Bzl), Boc-Leu, Boc-3-Pal, Boc-Ser(Bzl), Boc-Ala, Boc-Val, Boc-Asp(Bzl), Boc-Ser(Bzl), Boc-Thr(Bzl), Boc-Phe, Boc-Thr(Bzl), Boc-Gly, Boc-Glu(Bzl), Boc-D-Ala, Boc-His(Bom).

Po ukončení syntézy byl peptid odštěpen z pryskyřice tak, že byla smíchána s ani sólem (5 ml), dithiothreitolem (100 mg) a bezvodým fluorovodíkem (35 ml) při teplotě 0 °C a míchání po dobu 45 minut. Přebytek fluorovodíku byl rychle odpařen proudem suchého dusíku a uvolněný peptid byl vysrážen a promyt éterem. Hrubý peptid byl potom rozpuštěn v minimálním objemu zředěné kyseliny octové, nalit na sloupec VYDAC® (2,5x2,5 cm) (kysličník křemičitý s oktadecylsilanem 10 mM) a vymýván lineárním gradientem 20 až 60% acetonitrilu v 0,1% kyselině trifluoroctové ve vodě po dobu asi 1. hodiny. Frakce byly testovány pomocí chromatografie na tenké vrstvě a pomocí analytické HPLC (40 až 70% B při 1%/nrunutu, vymývací doba 14,1 minuty) a spojeny tak, aby bylo dosaženo spíše maximální čistoty než výtěžku. Voda z roztoku byla odstraněna opakovanou lyofílizací a výtěžek (49,9 mg) byl získán ve formě bílého, načechraného prášku.

Pomocí HPLC a tle bylo zjištěno, že produkt je homogenní. Aminokyselinová analýza kyselého hydrolyzátu potvrdila složení peptidu. Laserová desorpce MS určila molekulovou hmotnost 2880 (vypočtená molekulová hmotnost 2873).

Příklad 2: Syntéza nižších alky lam idových derivátů peptidů

Peptidy jsou sestavovány na O-benzyl-poly styrenové pryskyřici (často označované jako Merrifieldova pryskyřice) pomocí postupu pro aminokyseliny chráněné skupinou Boc, kteiý je popsán v příkladu 1, stou výjimkou, že karboxy 1 ové skupiny na postranních řetězcích aminokyselin Asp a Glu jsou chráněny skupinou Fm (fluorenylmethylester). Po ukončení syntézy je komplex peptid—pryskyřice suspendován v zředěných roztocích vhodného nižšího alkylamidu (jako jsou ethylamin, propylamin, fenylethylamin, 1,2-diaminoethan, atd.) v DMF a míchány při teplotě 60 °C (po dobu asi 18 hodin), načež po filtraci, odstranění rozpouštědel za sníženého tlaku a rozetření otejovité hmoty odštěpeného peptidu s éterem, byl získán chráněný alkylamidový derivát peptidu v pevné formě. Ten byl potom podroben štěpení HF, aby byly odstraněny další chránící skupiny na postranních řetězcích a byla provedena purifikace pomocí HPLC, jak bylo popsáno v příkladu 1.

Příklad 11

Peptid byl připraven v podstatě podle postupu popsaného v příkladu 1 za použití vhodných chráněných aminokyselin. MS byla získána pomocí laserové desorpce MS (NA znamená, že není dostupné).

Příklad 11: [Hppa⁷]hGLP-l(7-35)-NH₂ (SEQ ID NO: 87); MS=NA.

7ΤΓCZ 303399 B6

Příklad 12

Příklad 12: (Aib\ A6c³²)hGLP-1(7-36)NH₂ (SEQ ID NO: 114)

Jmenovaný peptid byl syntetizován na syntetizátoru peptidů Applied Biosystems (Foster City, CA) model 430A, který byl modifikován tak, aby prováděl urychlenou syntézu peptidů na pevné fázi za použití Boc-chemikálií. Viz Schnolzer a kol., Int. J. Peptide Protein Res., 40:180 (1992). Byla použita pryskyřice MBHA (4-methylbenzhydrylamin) (Peninsula, Belmont, CA) se substitucí 0,91 mmol/g. Byly použity Boc aminokyseliny (Bachem, CA, Torrance, CA; Nova Biochem., LaJolla, CA) s následující ochranou postranního řetězce: Boc-Ala-OH, Boc-Arg(TOS)OH, Boc-Asp(OcHex)—OH, Boc-Tyr(2BrZ)-OH, Boc-His(DNP)-OH, Boc-Val-OH, Boc-LeuOH, Boc-Gly-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Lys(2CIZ)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, BocA6c—OH, Ser(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Aib-OH, Boc-Glu(OcHex)-OH a Boc-Trp(Fm)OH. Syntéza byla provedena v množství 0,20 mmol. Skupiny Boc byly odstraněny působením 100% TFA po dobu 2x1 minutu. Boc aminokyseliny (2,5 mmol) byl předem aktivovány pomocí HBTU (2,0 mmol) a DIEA (1,0 ml) v 4 ml DMF a byly připojeny bez předchozí neutralizace ke komplexu peptid-pryskyřice ve formě TFA soli. Doby připojení byly asi 5 minut s výjimkou zbytků Boc-Aib-OH a Boc-A6c-OH a zbytků následujících, Boc-Trp(Fm)-OH a BocHis(DNP)-OH, kde doby připojení byly asi 2 hodiny.

Po ukončení syntézy peptidového řetězce bylo na pryskyřici působeno roztokem 20% merkaptoethanol/10% DIEA v DMF po dobu 2x30 minut, aby došlo k odstranění DNP skupiny na postranním řetězci His. N-koncová Boc skupina byla potom odstraněna působením 100% TFA po dobu 2x2 minuty. Po neutralizaci komplexu peptid-pryskyřice pomocí 10% DIEA v DMF (Ixl minuta), byla formylová skupina na postranním řetězci Trp odstraněna působením roztoku 15% ethanolamin/15% voda/70% DMF po dobu 2x30 minut. Komplex peptid-pryskyřice s částečně odstraněnými chránícími skupinami byl promyt DMF a DCM a sušen za sníženého tlaku. Konečné štěpení bylo provedeno mícháním komplexu peptid-pryskyřice v 10 ml HF obsahující anisol a dithiothreitol (24 mg) při teplotě 0 °C po dobu 75 minut. HF byl odstraněn proudem dusíku. Výtěžek byl promyt éterem (6x10 ml) a extrahován 4N HOAc (6x10 ml).

Směs peptidů ve vodném extraktu byl purifikován pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC) v reverzní fázi za pomoci sloupce VYDAC® Ct₈ pro reverzní fázi (Nést Group, Southborough, MA). Sloupec byl vymýván lineárním gradientem (20 až 50% roztok B po dobu 105 minut) při rychlosti průtoku 10 ml/minutu (roztok A ~ voda obsahující 0,1% TFA; roztok B = acetonitril obsahující 0,1% TFA). Odebírané frakce byly testovány pomocí analytické HPLC. Ty frakce, které obsahovaly čistý produkt byly spojeny a lyofilizovány do suchého stavu. Na základě analytické HPLC byla čistota >99%. Analýzou pomocí hmotové spektrometrie byla určena molekulová hmotnost 3324,2 (vypočtená molekulová hmotnost je 3323,7).

Syntéza jiných sloučenin, které jsou předmětem tohoto vynálezu, může být provedena stejným způsobem, jaký je popsán pro syntézu (Aib⁸, A6c³²)hGLP-l(7-36)NH₂ (SEQ ID NO: 114) v příkladu 12, avšak za použití vhodných chráněných aminokyselin v závislosti na požadovaném peptidů.

[(N^a-HEPES-His)⁷hGLP-l(7-36)NH₂ (SEQ ID NO: 152) {HEPES je kyselina (4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinethansulfonová)} může být syntetizován následujícím způsobem: po sestavení dlouhého řetězce peptidů na MBHA pryskyřicí (0,20 mmol), je na komplex peptid-pryskyřice působeno 100% TFA (2x2 minuty) a promyt DMF a DCM. Pryskyřice je potom neutralizována 10% DIEA v DMF po dobu 2 minut. Po promytí DMF a DCM je na piyskyřici působeno 0,23 mmol 2-chlor-l-ethansulfonylchloridem a 0,7 mmol DIEA v DMF po dobu asi 1 hodiny. Pryskyřice je promyta DMF a DCM a je na ni působeno 1,2 mmol 2-hydroxyethylpiperazinem po dobu 2 hodin. Pryskyřice je promyta DMF a DCM a je na ni působeno různými reagenciemi ((l) 20% merkaptoethanol/10% DIEA v DMF a (2) 15% ethanolamin/ 15% voda/ 70% DMF),

- 14CZ 303399 B6 aby došlo k odstranění DNP skupin z postranního řetězce His a formylové skupiny z postranního řetězce Trp, jak bylo popsáno výše, to vše před konečným štěpením peptidu z pryskyřice pomocí HF.

[(N^a-HEPA-His)⁷hGLP-l(7-36)NH2 (SEQ ID NO: 153) ([(4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinacetyl)-His⁷]hGLP-l(7-36)NH2) může být připraven v podstatě podle postupu popsaného bezprostředně výše pro přípravu [(N^a-HEPES-His)⁷hGLP-l(7-36)NH₂ (SEQ ID NO: 152) s tou výjimkou, že na místo 2-chlor-l-ethansulfonylchloridu je použit anhydrid kyseliny 2-bromoctové.

Příklady 13 až 15

Byly připraveny v podstatě podle příkladu 12, pouze s použitím vhodných chráněných aminokyselin.

Příklad 13: [Uta⁷]hGLP-l(7-36)-NH₂ (SEQ ID NO: 125); MS=3279,5; Vypočtená molekulová hmotnost = 3280,7.

Příklad 14: [Paa⁷]hGLP-l(7-36)-NH₂ (SEQ ID NO: 126); MS=3290,9; Vypočtená molekulová hmotnost = 3291,8.

Příklad 15: [Pta⁷]hGLP-l(7-36)-NH₂ (SEQ ID NO: 127); MS=3311,2; Vypočtená molekulová hmotnost ~ 3311,8.

Příklad 16: [Aib⁸, A5c³², Lys³⁶(N^e-tetradekanoyl)]hGLP-l(7-36)NH₂ (SEQ ID NO: 155)

Použité Boc aminokyseliny jsou tytéž jako aminokyseliny, které jsou použity při syntéze [Aib⁸, A6c³²]hGLP—1(7-36)NH2 (SEQ ID NO: 114) (příklad 12) stou výjimkou, že pro zbytek Lys³⁶(N^e-tetradekanoyl) je zde použita Fmoc-Lys(Boc)-OH. První aminokyselinový zbytek je k pryskyřici připojen manuálně na třepačce. 2,5 mmol Fmoc-Lys(Boc)-OH je rozpuštěno ve 4 ml 0,5N HBTU v DMF. K roztoku je přidán 1 ml DIEA. Směs je třepána asi 2 minuty. Potom je k roztoku přidáno 0,2 mmol MBHA pryskyřice (substituce = 0,91 mmol/g). Směs je třepána po dobu 1 hodiny. Pryskyřice je promyta DMF a je na ni působeno 100% TFA po dobu 2x2 minuty, aby došlo k odstranění chránících skupin Boc. Pryskyřice je promyta DMF. Kyselina myristylová (2,5 mmol) je předem aktivována s HBTU (2,0 mmol) a DIEA (1,0 ml) ve 4 ml DMF po dobu 2 minut a je připojena ke komplexu Fmoc-Lys-pryskyřice. Doba použitá pro připojení je 1 hodina. Pryskyřice je promyta DMF a je na ni působeno 25% piperidinem v DMF po dobu 2x20 minut, aby došlo k odstranění chránící skupiny Fmoc. Pryskyřice je promyta DMF a přenesena do reakční nádoby syntetizátoru peptidů. Zbytek syntetického a purifikačního postupu u peptidu jsou tytéž jako při syntéze [Aib⁸, A6c³²]hGLP-l(7-36)NH2 (SEQ ID NO: 114).

Syntézy jiných sloučenin obsahujících zbytek Lys(N^e-tetradekanoyl) jsou provedeny analogickým způsobem, jaký je popsán pro syntézu [Aib⁸, A6c³², Lys ’⁶(N^K-tetradekanoyl)hGLP-l (7-36)NH₂ (SEQ ID NO: 155). V peptidu je pro zbytek Lys(N -alkanoyl) použita aminokyselina Fmoc-Lys(Boc)-OH, zatímco pro zbytek Lys je použita aminokyselina Lys(2ClZ)-OH. Pokud zbytek Lys(N^e-alkanoyl) není na C-konci, je fragment peptidu, nacházející se bezprostředně před zbytkem Lys(N^e-alkanoyl) sestaven napřed na pryskyřici syntetizátoru peptidů.

- 15CZ 303399 B6

Příklad 17: [Aib*, Arg²⁶'³⁴, A6c³², Lys³⁶(N^E-tetradekanoyl)]hGLP-l(7-36)-OH (SEQ ID NO: 161)

Použité Boc aminokyseliny jsou tytéž jako aminokyseliny, které jsou použity při syntéze [Alb*. A6c’², Lys’⁶(N^e-tetradekanoyl)]hGLP-l(7-36)NH₂ (SEQ ID NO: 162) (příklad 16). Fmoc-Lys(Boc)-OH (2,5 mmol) je předem aktivována s HBTU (2,0 mmol), HOBt (2,0 mmol) a DIEA (2,5 ml) v DMF (4 ml) po dobu 2 minut. Tato aminokyselina je ručně na třepačce připojena k 235 mg PAM pryskyřice (Chem-Impex, Wood Dále, IL; substituce = 0,85 mmol/g). Doba použitá pro připojení je asi 8 hodin. Zbytek syntetického a purifikačního postupu při přípravě peptidu jsou tytéž jako jsou popsány v příkladu 12.

Syntézy jiných analogů hGLP-l(7-36)-OH (SEQ ID NO: 3) a hGLP-l(7-37)-OH (SEQ ID NO: 4), které obsahující zbytek Lys(N^£-tetradekanoyl) jsou provedeny analogickým způsobem, jaký je popsán pro syntézu (Aib⁸, Arg²⁶’³⁴, A6c³², Lys³⁶(N^e-tetradekanoyl)]hGLP-l(7-36)-OH (SEQ ID NO: 161). V peptidu je pro zbytek Lys(N^€-alkanoy1) použita aminokyselina FmocLys(Boc)-OH, zatímco pro zbytek Lys je použita aminokyselina Lys(2ClZ)~OH.

Claims

1. Sloučenina obecného vzorce I,

Α⁷-Α⁸-Α⁹-Α¹⁰-Α¹¹-Α¹²-Α¹³-Α¹⁴-Α¹⁵-Α¹⁶-Α¹⁷-Α¹⁸-Α¹⁹-Α²⁰-Α²¹Ά^22_Α²³Ά²⁴-Α²⁵-Α^2θΆ²⁷- a²⁸-A²⁹ -A^3O-A³¹-A³²-A³³-A³⁴-A^3S-A^3e-A³⁷-R¹, (l) kde

A⁷ je Ura, Paa nebo Pta;

A⁸ je Ala, D-Ala, Aib, Acc, N-Me-Ala, N-Me-D-Ala, Arg nebo N-Me-Gly; A⁹ je Glu, N-Me-Glu, N-Me-Asp nebo Asp;

A¹⁰ je Gly, Acc, Ala, D-Ala, Phe nebo Aib;

A je Thr nebo Ser;

A¹² je Phe, Acc, Aic, Aib, 3-Pal, 4-Pal, β-Nal, Cha, Trp nebo X^!-Phe;

A¹³ je Thr nebo Ser,

A¹⁴ je Ser, Thr, Ala nebo Aib;

A¹⁵ je Asp, Ala, D-Asp nebo Glu;

A¹⁶ je Val, D-Val, Acc, Aib, Leu, Ile, Tle, Nle, Abu, Ala, D-Ala, Tba nebo Cha; A¹⁷ je Ser, Ala, D-Ala, Aib, Acc nebo Thr;

- 16CZ 303399 B6

A¹⁸ je Ser, Ala, D-Ala, Aib, Acc nebo Thr;

A¹⁹ je Tyr, D-Tyr, Cha, Phe, 3-PaI, 4-Pal, Acc, β-Nal, Amp nebo X'-Phe;

A²⁰ je Leu, Ala, Acc, Aib, Nle, Ile, Cha, Tle, Val, Phe nebo X^l-Phe;

A²¹ je Glu, Ala nebo Asp;

to A²² je Gly, Acc, Ala, D-Ala, β-AIa nebo Aib;

A²³ je Gin Asp, Ala, D-Ala, Aib, Acc, Asn nebo Glu;

A²⁴ je Ala, Aib, Val, Abu, Tle nebo Acc;

A^2J je Ala, Aib, Val, Abu, Tle, Acc, Lys, Arg, hArg, Om, HN-CH((CH2)n-NR¹⁰R^u))-C(O) nebo HN-CH((CH2)_e-X³)-C(O);

A²⁶ je Lys, Ala, 3-Pal, 4-Pal, Arg, hArg, Om, Amp, HN^CH((CH2)n-NR¹⁰R^H))-C(O) nebo 20 HN-CH((CH2)_c-X³)-C(O);

A²⁷ je Glu, Ala, D-Ala nebo Asp;

A²⁸ je Phe, Ala, Pal, β-Nal, X^l-Phe, Aic, Acc, Aib, Cha nebo Trp;

A²⁹ je Ile, Acc, Aib, Leu, Nle, Cha, Tle, Val, Abu, Ala, Tba nebo Phe;

A³⁰ je Ala, Aib, Acc nebo chybí;

30 A³¹ je Trp, β-Nal, 3-Pal, 4-Pal, Phe, Acc, Aib, Cha, Amp nebo chybí;

A³² je Leu, Ala, Acc, Aib, Nle, Ile, Cha, Tle, Phe, X*-Phe, Ala nebo chybí;

A³³ je Val, Acc, Aib, Leu, Ile, Tle, Nle, Cha, Ala, Phe, Abu, X’-Phe, Tba, Gaba nebo chybí;

A³⁴ je Lys, Arg, hArg, Om, Amp, Gaba, HN-CH((CH2)n-NR¹⁰R^ll))-C(O), HN-CH((CH2)_eX³)-C(O) nebo chybí;

A³⁵ je Gly nebo chybí;

A³⁶ je L- nebo D-Arg, D- nebo L-Lys, D- nebo L-hArg, D- nebo L-Orn, Amp, HN-CH((CH2)„-NR¹⁰R¹¹)-C(O), HN-CH((CH2)_e-X³>-C(O) nebo chybí;

A³⁷ je Gly nebo chybí

X¹ je pro každý případ nezávisle vybrán ze skupiny zahrnující (C]-C₆)alkyl, OH a halo;

R¹ je OH, NH2, (C,-C30)alkoxy, nebo NH-X²-CH2-Z°, kde X² je (C,-C₁₂) uhlovodíkový zbytek a Z° je H, OH, CO₂H nebo CONH₂;

X³ je

-17CZ 303399 B6

4 /λ

X—N N—(CHA-CH, \_/ nebo -C(O)-NHR¹², kde X⁴ je pro každý případ nezávisle -C(O)-, -NH-C(O)- nebo -CH₂-, a kde f je pro každý případ nezávisle celé číslo v rozmezí 1 až 29 včetně; a e je pro každý případ nezávisle celé číslo v rozmezí 1 až 4;

n je pro každý případ nezávisle celé číslo v rozmezí 1 ^až 5; a každý zR^lfl a R¹' je pro každý případ nezávisle H, (C|-C₃₀)alkyl, (C|-C₃₀)acyl, (Ci-C₃₀)alkylsulfonyl, -C((NH)(NH₂)) nebo

-C(O}-CH₂—

N— za předpokladu, že když R¹⁰ je (C|-C₃₀)acyl, (C|-C₃₀)alkylsulfonyl, -C((NH)(NH₂)), tak

R¹¹ je H nebo (C|-C₃o)alkyl; a

R¹² je (C|-C₃₀)alkyl, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

2. Sloučenina podle nároku 1, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, kde A¹¹ je Thr; A¹³ je Thr; A¹⁴ je Ser, Aib nebo Ala; A¹⁷ je Ser, Ala, Aib nebo D-Ala; A¹⁸ je Ser, Ala, Aib nebo D-AIa; A²¹ je Glu nebo Ala; A²³ je Gin, Glu nebo Ala; a A²⁷ je Glu nebo Ala.

3. Sloučenina podle nároku 2, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, kde A⁹ je Glu, N-Me-Glu nebo N-Me-Asp; A¹² je Phe, Acc nebo Aic; A¹⁶ je Val, D-Val, Acc, Aib, Ala, Tle nebo D-AIa; A¹⁹ je Tyr, 3-Pal, 4-Pal nebo D-Tyr; A^2Ď je Leu, Acc, Cha, Ala nebo Tle; A²⁴ je Ala, Aib nebo Acc; A²⁵ je Ala, Aib, Acc, Lys, Arg, hArg, Om, HN-CH((CH2)_n“NH-R^l0)-C(O); A²⁸ je Phe nebo Ala; A²⁹ je Ile, Acc nebo Tle; A³⁹ je Ala, Aib nebo chybí; A³¹ je Trp, Ala, 3-Pal, 4-Pal nebo chybí; A³² je Leu, Acc, Cha, Ala nebo chybí; A³³ je Val, Acc, Ala, Gaba, Tle nebo chybí.

4. Sloučenina podle nároku 4, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, kde A⁸ je Ala, D-Ala, Aib, A6c, A5c, N-Me-Ala, N-Me-D-Ala nebo N-Me-Gly; A¹⁰ je Gly, Ala, D-Ala nebo Phe; A¹² je Phe, A6c nebo A5c; A¹⁶ je Val, Ala, Tle, A6c, A5c nebo D-Val; A²⁰ je Leu, A6c, A5c, Cha, Ala nebo Tle; A²² je Gly, Aib, β-Ala, L-Ala nebo D-Ala; A²⁴ je Ala nebo Aib; A²⁹ je Ile, A6c, A5c nebo Tle; A³² je Leu, A6c, A5c, Cha, Ala nebo chybí; A³³ je Val, A6c, A5c, Ala, Gaba, Tle nebo chybí.

5. Sloučenina podle nároku 4, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, kde R¹ je OH nebo NH₂.

6. Sloučenina podle nároku 1, kterou je [Ura⁷]hGLP-l(7-36)-NH₂ (SEQ ID NO: 125);

- 18CZ 303399 B6 [Paa⁷]hGLP-l(7-36)-NH₂ (SEQ ID NO: 126);

[Pta⁷]hGLP-l(7-36)-NH₂ (SEQ ID NO: 127);

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

7. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředicí látku.

io

8. Použití sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli pro přípravu léčiva pro vyvolání agonistického účinku receptoru GLP-1 u jedince, který to vyžaduje.

9. Použití sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli pro přípravu léčiva pro léčení nemoci vybrané ze skupiny zahrnující diabetes typu l, diabetes typu II, obezitu, gluka15 gonom, vylučovací potíže u dýchacích cest, metabolické potíže, artritidu, osteoporózu, nemoci centrálního nervového systému, restenózu, neurodegenerativní nemoci, selhání ledvin, městnavé srdeční selhání, nefrotický syndrom, cirhózu, plicní otok a vysoký tlak u jedince, který to vyžaduje.

20 10. Použití podle nároku 9, kdy nemocí je diabetes typu I nebo diabetes typu II.