PL207755B1

PL207755B1 - Bicykliczny związek heteroaromatyczny, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna i jego zastosowania

Info

Publication number: PL207755B1
Application number: PL360675A
Authority: PL
Inventors: Cornelis Marius Timmers; Willem Frederik Johan Karstens
Original assignee: N V Organon
Priority date: 2000-09-22
Filing date: 2001-09-17
Publication date: 2011-01-31
Also published as: MXPA03002478A; RU2271360C2; NO20031314D0; IL154624A0; ATE384726T1; SK287554B6; ES2299524T3; US20070197527A1; PL360675A1; DE60132607D1; HRP20030220B1; DE60132607T2; US20030225113A1; NO328683B1; WO2002024703A1; ZA200301588B; EP1322651A1; CN1462273A; PE20020537A1; HUP0302648A2

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest bicykliczny związek heteroaromatyczny, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna i jego zastosowania.

Wynalazek niniejszy dotyczy związków o aktywności agonistycznej lub antagonistycznej wobec receptora hormonu glikoproteinowego, a zwłaszcza związku o aktywności agonistycznej wobec hormonu luteinizującego (LH).

Gonadotropiny pełnią ważne role w różnych funkcjach organizmu, obejmujących metabolizm, regulację temperatury i proces rozrodczy. Przykładowo, gonadotropina przysadki FSH odgrywa kluczową rolę w stymulowaniu rozwoju i dojrzewania pęcherzyka, zaś LH indukuje owulację (R.M. Sharp, Glin. Endocrinol. 33:787-807; Dorrington i Armstrong, Recent Prog. Horm. Res. 35:301-342, 1979). Obecnie LH stosuje się klinicznie, w kombinacji z FSH, do stymulacji jajników, np. do hiperstymulacji jajników w zapłodnieniu in vitro (IVF) oraz do indukowania jajeczkowania u bezpłodnych kobiet z anowulacją (V. Insler, Int. J. Fertility 33:85-97, 1988, Navot i Resenwaks, J. Vitro Fert. Embryo Transfer 5:3-13, 1988), jak również w hipogonadyzmie i bezpłodności u mężczyzn.

Gonadotropiny działają na konkretne typy komórek gonadowych, inicjując różnicowanie i steroidogenezę w komórkach jajników i jąder. W działaniu tych hormonów przysadkowych i łożyskowych pośredniczą pewne receptory błonowe osocza, które należą do dużej rodziny receptorów sprzężonych białek G. Obejmują one pojedynczy polipeptyd z siedmioma domenami transbłonowymi i są zdolne do oddziaływania z białkiem Gs, co prowadzi do aktywacji cyklazy adenylowej.

Gonadotropiny przeznaczone do celów terapeutycznych można wyodrębnić z ludzkiego moczu, ale mają one niską czystość (Morse i in., Amer. J. Reproduct. Immunol. and Microbiology 17:143, 1998). Alternatywnie, można je wytworzyć jako gonadotropiny rekombinantowe.

Jak w przypadku innych białek, konieczne jest podawanie gonadotropin przez wstrzykiwanie podskórne albo domięśniowe. Jednakże, korzystne byłoby aktywowanie receptora małą cząsteczką, która można podawać, np. drogą doustną lub przezskórną.

W wynalazku niniejszym opisano wytwarzanie takich analogów hormonów o małym ciężarze cząsteczkowym, które selektywnie aktywują jeden z receptorów gonadotropinowych. Należy to uważać za jedną z głównych korzyści z niniejszego wynalazku.

A zatem, przedmiotem wynalazku jest bicykliczny heteroaromatyczny związek wybrany z grupy obejmującej tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-(alliloksykarbonyloamino)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid, tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-((morfolin-4-ylo)-karbonyloamino)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid i tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-(1,2,3,6-tetrahydropirydynokarbonyloamino)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid i jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.

Związki według wynalazku przedstawione są wzorem ogólnym I

5 5 R¹ oznacza fenyl podstawiony w pozycji meta grupą NHR⁵, w której R⁵ oznacza alliloksykarbonyl, morfolinokarbonyl lub tetrahydropirydynokarbonyl;

R² oznacza metyl;

R³ oznacza tert-butyl;

Y oznacza N;

Z oznacza NH2;

A oznacza S, a B oznacza N (H).

W związkach według wynalazku we wzorze I X¹-X² oznacza S.

PL 207 755 B1

Wykazano, że związki według wynalazku są zdolne do wiązania się z receptorem LH i mają aktywność agonistyczną wobec LH.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca jako substancję czynną bicykliczny związek heteroaromatyczny według wynalazku lub jego sól lub solwat w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalną substancją pomocniczą.

Tak więc, związki według wynalazku można stosować do leczenia. Wynalazek niniejszy dotyczy też zastosowania bicyklicznego związku heteroaromatycznego według wynalazku do wytwarzania leku do kontrolowania płodności. Korzystnie, związki według wynalazku stosuje się do aktywowania receptora LH.

Solami związków według wynalazku do zastosowania terapeutycznego są sole zawierające farmaceutycznie dopuszczalny przeciwjon. Jednakże, sole addycyjne zasad według wynalazku z kwasami mogą również znaleźć zastosowanie do wytwarzania lub oczyszczania farmaceutycznie dopuszczalnego związku.

Przykłady soli addycyjnych z kwasami obejmują sole utworzone z kwasami mineralnymi takimi, jak kwas solny, kwas fosforowy, kwas siarkowy, a korzystnie z kwasem solnym, oraz z kwasami organicznymi, takimi jak kwas cytrynowy, kwas winowy, kwas octowy, kwas mlekowy, kwas maleinowy, kwas malonowy, kwas fumarowy, kwas glikolowy, kwas bursztynowy, itp.

Odpowiednimi drogami podawania związków według wynalazku lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, które określa się tu również jako składnik aktywny, są wstrzyknięcia domięśniowe, wstrzyknięcia podskórne, wstrzyknięcia dożylne lub dootrzewnowe, podawanie doustne i donosowe. Korzystnie, związki według wynalazku podaje się doustnie. Dokładna dawka oraz schemat podawania składnika aktywnego, lub zawierającej go kompozycji farmaceutycznej, są zależne od zamierzonego skutku terapeutycznego (leczenie bezpłodności; antykoncepcja) i mogą zmieniać się w zależności od konkretnego związku, drogi podawania, wieku i stanu zdrowia danego pacjenta, któremu podaje się lek.

Przy podawaniu pozajelitowym na ogół wymagane są niższe dawki niż w innych sposobach podawania, które są bardziej zależne od adsorpcji. Jednakże, dawka dla ludzi korzystnie mieści się w zakresie 0,0001-25 mg na kg ciężaru ciała. Żądaną dawkę można podawać jako jedną dawkę lub jako wiele poddawek, podawanych w odpowiednich odstępach czasowych w ciągu dnia, albo, w przypadku, gdy pacjentem jest kobieta, dawki podaje się z odpowiednimi przerwami w ciągu cyklu miesiączkowego. Dawki i schematy podawania mogą być różne dla kobiet i dla mężczyzn.

W przypadku zastosowań in vitro lub ex vivo, jak w IVF, zwią zki wedł ug wynalazku moż na stosować w ośrodku inkubacyjnym w stężeniu w zakresie około 0,01-5 μg/ml.

A zatem, wynalazek niniejszy dotyczy również kompozycji farmaceutycznych zawierających bicykliczny związek heteroaromatyczny według wynalazku w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnymi substancjami dodatkowymi. Substancje pomocnicze muszą być „dopuszczalne, co oznacza, że muszą być kompatybilne z innymi składnikami kompozycji i nieszkodliwe dla biorcy. Kompozycje farmaceutyczne obejmują kompozycje odpowiednie do podawania doustnego, doodbytniczego, do nosa, miejscowego (łącznie z przezskórnym, dopoliczkowym i podjęzykowym), dopochwowego lub pozajelitowego (obejmującego podawanie podskórne, domięśniowe, dożylne i przezskórne). Kompozycje można wytworzyć technikami znanymi w dziedzinie farmacji, na przykład stosując sposoby opisane w publikacji Gennaro i in.. Remington's Pharmaceutical Sciences (wyd. 18, Mack Publishing company, 1990, patrz zwłaszcza Część 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture).

Sposoby takie obejmują etap łączenia składnika aktywnego z dowolną substancją pomocniczą. Substancje dodatkowe, zwane również substancjami pomocniczymi, obejmują konwencjonalnie stosowane w tej dziedzinie środki (Gennaro, powyżej), takie jak wypełniacze, substancje wiążące, rozcieńczalniki, substancje ułatwiające rozpadanie, substancje poślizgowe, substancje barwiące, substancje smakowo-zapachowe oraz środki zwilżające.

Kompozycje farmaceutyczne odpowiednie do podawania doustnego mogą być w postaci odrębnych dawek jednostkowych, takich jak pigułki, tabletki lub kapsułki, albo w postaci proszków lub granulek, bądź też roztworu lub zawiesiny. Składnik aktywny może mieć również postać preparatu typu bolus lub pasty. Kompozycje można ponadto formułować w postaci czopków lub wlewów do podawania doodbytniczego.

Kompozycje odpowiednie do podawania pozajelitowego obejmują wodne i niewodne sterylne preparaty do wstrzykiwania. Kompozycje takie mogą być w pojemnikach zawierających jedną lub wie4

PL 207 755 B1 le dawek, na przykład w zamkniętych fiolkach lub ampułkach, i można je przechowywać w postaci produktu z suszenia w stanie zamrożenia (liofilizowanej), która wymaga jedynie dodania tuż przed użyciem sterylnego ciekłego nośnika, na przykład wody.

Kompozycje lub preparaty odpowiednie do inhalacji przez nos obejmują subtelnie rozdrobnione pyły lub mgły, które mogą być wytwarzane przez aerozole pod ciśnieniem w odmierzonych dawkach, rozpylacze lub insuflatory.

Bicykliczne pochodne heteroaromatyczne według wynalazku można również podawać w postaci nadających się do wszczepienia elementów farmaceutycznych, składających się z rdzenia substancji aktywnej, otoczonego błoną regulującą szybkość uwalniania. Implanty takie można stosować podskórnie lub miejscowo i uwalniają one składnik aktywny w przybliżeniu ze stałą szybkością w stosunkowo długim czasie, na przykład od tygodni do lat. Sposoby wytwarzania wszczepialnych elementów farmaceutycznych są znane w technice, na przykład jak opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym 0,303,306 (AKZO N.V.).

Tak więc, związki według wynalazku można stosować do tych samych celów klinicznych, jak natywny LH, z tą korzyścią, że wykazują one zmienioną stabilność i mogą być podawane różnymi drogami.

Związki według wynalazku, w których B = NH, przedstawione wzorem (I-a) można wytwarzać na ogół przez znaną w technice kondensację kwasu o wzorze (II) z aminą o wzorze (III).

Przedstawioną powyżej reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej w odpowiednim rozpuszczalniku, np. w aprotonowym rozpuszczalniku, takim jak N,N-dimetyloformamid (DMF) lub dichlorometan, stosując czynnik sprzęgający, taki jak tetrafluoroboran O-(benzotriazol-1-ilo)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy (TBTU) lub heksafluorofosforan bromotripirolidynofosfoniowy (PyBrOP) i trzeciorzędową aminę, np. N,N-diizopropyloetylo-aminę (DiPEA).

Odpowiednim sposobem wytwarzania przejściowych kwasów (II) jest znane w technice zmydlanie zasadą estrów etylowych o ogólnym wzorze (VI). Zmydlanie prowadzi się w obecności zasady, takiej jak wodorotlenek litu, wodorotlenek potasu lub wodorotlenek sodu, w wodnym roztworze dioksanu, w podwyższonej temperaturze (40°C do temperatury wrzenia), a następnie prowadzi się obróbkę kwasem.

Tienopiry(mi)dyny o ogólnym wzorze (XXIV) można wytworzyć przez działanie na chlorki (XV) merkaptooctanem etylu w obecności mocnej zasady. W typowym sposobie, jeden równoważnik chlorku (XV) poddaje się reakcji z 1,5 równoważnika merkaptooctanu etylu i 2 równoważnikami tert-butanolanu potasu w THF. W tych warunkach, acykliczny sulfid ulega samoistnej cyklizacji, z wytworzeniem tienopiry(mi)dyny o ogólnym wzorze (XXIV). Gdy R¹ oznacza (hetero)aryl, podstawiony grupą odciągającą elektron, taką jak grupa nitrowa, opisaną wyżej cyklizację prowadzi się sposobem dwuetapowym, obejmującym wyodrębnienie przejściowego tioeteru, na który następnie działa się trzeciorzędową zasadą, taką jak DIPEA w układzie toluen/EtOH w temperaturze wrzenia, z wytworzeniem pierścienia tiofenowego.

PL 207 755 B1

We wzorze XV W oznacza grupę cyjanową lub grupę estru alkilowego.

Związki o wzorze (XXI), w którym Y = N, określone wzorem (XXI-a) można wytworzyć kilkoma sposobami znanymi z literatury.

₁

Przykładowo, pochodne o wzorze (XXI-a), w którym R¹ = (6-14C)aryl, można zsyntetyzować przez kondensację estrów etylowych o wzorze (XXVII), w którym W ma uprzednio podane znaczenie, z aldehydami (XXVIII) i związkami o wzorze (XXIX), którymi mogą być izotiomocznik (XXIX-a), izomocznik (XXIX-b), monopodstawione guanidyny (XXIX-c), dipodstawione guanidyny (XXIX-d) lub amidyny (XXIX-e).

R⁴

R2-‘

NH

R² ¹

NH, w

NH,

NH

RZ-

T

NH,

N. ^.NH

T

NH, (XXK-a) (XXIX-b) (XXIX-c) (XXK-d)

R<^nh nh₂ (ΧΧΣΧ-e)

W typowym sposobie, reagenty (XXVII), (XXVIII) i (XXIXa-e) zawiesza się w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak etanol, metanol, N,N-dimetyloformamid (DMF), N-metylopirolidynon, tetrahydrofuran lub pirydyna, i dodaje się zasady, takiej jak węglan potasu, octan sodu, metanolan sodu lub etanolan sodu. Reakcję prowadzi się w podwyższonej temperaturze (70°C do temperatury wrzenia). Patrz na przykład: S. Kambe, K. Saito i H. Kishi, Synthesis: 287, 1979; A.M. Abd-Elfattah, S.M. Hussain i A.M. El-Reedy, Tetrahedron 39: 3197, 1983; S.M. Hussain, A.A. El-Barbary i S.A. Mansour, J. Heterocycl. Chem. 22, 169, 1985. Gdy W = C(O)OEt, aromatyzacja zachodzi po dodaniu utleniacza, takiego jak dichlorodicyjanobenzochinon (DDQ) lub tlen. Podobne cyklizacje można również prowadzić na stałym nośniku, takim jak żywica Merrifielda, stosując odpowiedni łącznik, patrz na przykład A.L. Mrzinzik i E.R. Felder, J. Org. Chem. 63: 723, 1998; T. Masquelin, D. Sprenger, R. Baer, F. Gerber i Y. Mercadal, Helv. Chim. Acta 81: 646, 1998.

Związki o ogólnym wzorze (XX), w którym Y = N, przedstawione wzorem (XX-a), można wytworzyć przez podobną strategię kondensacji, stosując malonitryl.

Alternatywnie, związki o ogólnym wzorze (XX) można wytworzyć przez amonolizę chlorków o wzorze (XV), stosują c wodny roztwór amoniaku i odpowiedni organiczny korozpuszczalnik, taki jak

PL 207 755 B1

1,4-dioksan. Transformację tę można również prowadzić stosując chlorek amonu i trzeciorzędową aminę, taką jak diizopropyloetyloamina (DiPEA), w aprotonowym rozpuszczalniku, takim jak DMF.

Chlorki o ogólnym wzorze (XV) można zsyntetyzować przez znaną w technice reakcję laktamów (XXI) z POCI3, w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak 1,4-dioksan, w podwyższonych temperaturach (60°C do temperatury wrzenia).

W technice są dobrze znane sposoby oznaczania wią zania receptora, zarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo, w których określa się aktywność biologiczną gonadotropin. Na ogół, receptor, otrzymany przez ekspresję, kontaktuje się z badanym związkiem i mierzy się wiązanie, stymulację lub zahamowanie odpowiedzi czynnościowej.

Do pomiaru odpowiedzi czynnościowej stosuje się odpowiednie komórki gospodarza, w których wyrażany jest izolowany DNA kodujący gen receptora LH, korzystnie receptora ludzkiego. Komórkami takimi mogą być komórki jajnika chomika chińskiego, ale można stosować również inne komórki. Korzystnie, komórki te są pochodzenia ssaczego (Jia i in.. Mol. Endocrin. 5:759-776, 1991).

W technice znane są sposoby konstruowania linii komórkowych wyraż ają cych rekombinantowy LH (Sambrook i in., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, ostatnie wydanie). Wyrażanie receptora uzyskuje się przez ekspresję DNA kodującego żądane białko. W technice są już dobrze znane sposoby ukierunkowanej mutagenezy, ligacji dodatkowych sekwencji, PCR i konstrukcji odpowiednich układów ekspresji. Części lub cały DNA kodujący żądane białko można skonstruować na drodze syntezy standardowymi technikami w fazie stałej, które korzystnie, dla ułatwienia ligacji, obejmują miejsca restrykcji. Do sekwencji kodujących DNA można również wprowadzić odpowiednie składniki kontrolujące transkrypcję i translację odpowiednich sekwencji kodujących. Jak dobrze wiadomo, dostępne są układy ekspresji, które są kompatybilne z wieloma róż nymi gospodarzami, obejmującymi gospodarzy prokariotycznych, takich jak bakterie, oraz gospodarzy eukariotycznych, takich jak drożdże, komórki roślinne, komórki owadzie, komórki ssacze, komórki ptasie, itp.

Następnie, komórki wyrażające receptor kontaktuje się z badanym związkiem i obserwuje się wiązanie, albo stymulację lub zahamowanie odpowiedzi czynnościowej.

Alternatywnie do pomiaru wiązania się związku można stosować wyizolowane błony komórkowe zawierające wyrażany receptor.

Do pomiaru można stosować radioaktywnie lub fluorescencyjnie znakowane związki. Jako związek porównawczy można stosować ludzki rekombinantowy LH. W alternatywnym sposobie, można również stosować badania na wiązanie kompetycyjne.

Inne badanie obejmują skrining związków agonistycznych wobec receptora LH przez określenie akumulacji cAMP za pośrednictwem stymulacji receptora. A zatem, sposób taki obejmuje wyrażanie receptora na powierzchni komórkowej komórek gospodarza i eksponowanie komórki na badany związek. Następnie mierzy się ilość cAMP. Poziom cAMP będzie zmniejszony lub zwiększony, w zależności od działania hamującego lub stymulującego badanego związku po związaniu się z receptorem.

Oprócz bezpośredniego pomiaru np. poziomów cAMP w eksponowanych komórkach, można również stosować linie komórkowe, które oprócz transfekowania DNA kodującym receptor, transfePL 207 755 B1 kuje się również drugim DNA kodującym gen reporterowy, którego ekspresja odpowiada poziomowi cAMP. Takie geny reporterowe mogą być indukowalne przez cAMP lub można je skonstruować w taki sposób, aby były związane z nowymi elementami odpowiadającymi cAMP. Ekspresję genu reporterowego można na ogół kontrolować przez dowolny składnik odpowiedzi reagujący na zmiany poziomów cAMP. Odpowiednimi genami reporterowymi są np. LacZ, alkaliczna fosfataza, lucyferaza robaczków świętojańskich i zielone białko fluorescencyjne. W technice są dobrze znane zasady takich testów transaktywacji i opisano je na przykład w publikacjach Ch. Stratowa, A. Himmler i A.P. Czer nilofsky (1995), Curr. Opin. Biotechnol. 6:574.

Za aktywne uważa się związki, które w badaniach przy stężeniu 10^-5 M mają aktywność powyżej 20% maksymalnej aktywności, gdy jako związek porównawczy stosuje się LH. Innym kryterium jest wartość EC50, która musi być mniejsza od 10^-5 M, a korzystnie < 10^-7 M.

Dla specjalisty w tej dziedzinie oczywiste będzie, że pożądane wartości EC50 są zależne od badanego związku. Przykładowo, związek o wartości EC50 poniżej 10^-5 M uważa się na ogół za kandydata przy wyborze na lek. Korzystnie wartość ta jest niższa od 10^-7 M, a bardziej korzystnie od 10^-8 M. Jednakże, związek, którego wartość EC50 jest wyższa, ale jest on selektywny wobec konkretnego receptora, może być nawet lepszym kandydatem.

Skrining związków agonistycznych wobec receptora LH można również prowadzić stosując biologiczny test na komórkach myszy Leydig (M. Van Damme, D. Robersen i E. Diczfalusy (1974). Acta Endocrinol. 77: 655-671. B. Mannaerts, H. Kloosterboer i A. Schuurs (1987). Neuroendocrinology of reproduction. R. Roland i in., wyd. Elsevier Science Publishers B.V., str. 49-58). W badaniu tym, przy użyciu komórek Leydig wyizolowanych od samców myszy, można zmierzyć produkcję testosteronu wywołaną stymulacją receptora LH.

W celu pomiaru aktywności agonistycznej związków wobec receptora LH in vivo można badać wywoływanie owulacji u niedojrzałych myszy. W badaniu tym niedojrzałym samicom myszy wstrzykuje się FSH z moczu i po około 48 godzinach podaje się związek agonistyczny wobec LH. Po podaniu agonisty LH zwierzęta zabija się i pod mikroskopem oblicza się liczbę jajeczek w jajowodzie.

Związki według wynalazku można stosować klinicznie w tych schematach leczenia, w których stosuje się LH lub hCG. Leczenie takie obejmuje terapię zastępczą LH u pacjentów, zarówno u mężczyzn jak i kobiet, z hipogonadalnym hipogonadyzmem, podawanie w środku cyklu w celu wywołania owulacji (wywoływanie owulacji (OI) lub kontrolowana hiperstymulacja (COH) albo stymulacja ciałka żółtego).

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1 tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-(metoksykarbonyloksy)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid (a) . 5-cyjano-4-(3-metoksyfenylo)-metylotio-6-hydroksypirymidyna

Mieszaninę siarczanu S-metyloizotiomocznika (139 mg), 3-metoksybenzaldehydu (243 ul), cyjanooctanu etylu (112 μΐ) i węglanu potasu (145 mg) w absolutnym etanolu (2 ml) mieszano w temperaturze 60°C przez 5 godzin. Mieszaninę reakcyjną oziębiono do temperatury 0°C w łaźni lodowej, przesączono i pozostałość ogrzewano w wodzie (H2O) aż uzyskano klarowny roztwór. Roztwór ten zakwaszono stosując 2N wodny roztwór HCl do pH 2 i oziębiono do temperatury 0°C w łaźni lodowej. Otrzymane kryształy zebrano przez odsączenie i wysuszono pod próżnią.

Wydajność: 186 mg

MS-ESI: [M+H]⁺ = 274,2

Rf = 0,50, żel krzemionkowy, dichlorometan (CH2Cl2/metanol (CH3OH) = 9/1 (obj./obj.) (b) . 6-chloro-5-cyjano-4-(3-metoksyfenylo)-2-metylotiopirymidyna

Do roztworu 5-cyjano-4-(3-metoksyfenylo)-2-metylotio-6-hydroksy-pirymidyny (przykład 1a, 305 mg) w suchym 1,4-dioksanie (1 ml) podczas mieszania dodano tlenochlorku fosforu (0,75 ml). Dodano kroplę N,N-dimetyloaniliny. Po 3 godzinach w temperaturze 80°C mieszaninę oziębiono do temperatury 0°C w łaźni lodowej i powoli dodano pokruszonego lodu. Gdy reakcja przestała być egzotermiczna, dodano H2O (3 ml). Substancje stałe zebrano przez odsączenie i wysuszono pod próżnią.

Wydajność: 244 mg

MS-ESI: [M+H]⁺ = 292,2

TLC: Rf 0,86, żel krzemionkowy, CH2CI2 (c) . 5-amino-4-(3-metoksyfenylo)-2-metylotio-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksylan etylu

PL 207 755 B1

Do roztworu 2-merkaptooctanu etylu (92 μΐ) i 6-chloro-5-cyjano-4-(3-metoksyfenylo)-2-metylotiopirymidyny (przykład 1b, 244 mg) w suchym tetrahydrofuranie (THF) (4 ml) podczas mieszania dodano tert-butanolanu potasu (150 mg). Po 1 godzinie mieszaninę oziębiono do temperatury 0°C w łaźni lodowej rozcieńczono H2O (10 ml). Substancje stałe zebrano przez odsączenie i wysuszono pod próżnią.

Wydajność: 260 mg

MS-ESI: [M+H]⁺ = 376,2

TLC: Rf = 0,44, żel krzemionkowy, CH2CI2 (d) Kwas 5-amino-4-(3-metoksyfenylo)-2-metylotio-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksylowy

5-amino-4-(3-metoksyfenylo)-2-metylotio-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksylan etylu (przykład 1c, 9,27 g) rozpuszczono w mieszaninie 1,4-dioksanu (270 ml) i H2O (30 ml). Dodano wodorotlenku litu (10 g) i mieszaninę mieszano w temperaturze 80°C przez 48 godzin. 1,4-dioksan usunięto z mieszaniny przez odparowanie i pozostałość pochłonięto w H2O. Otrzymany roztwór zakwaszono do pH 2 dodatkiem 3N wodnego roztworu HCl. Wytworzony osad odsączono i przemyto H2O. Ślady wody w osadzie usunięto przez odparowanie z 1,4-dioksanem, a następnie z eterem dietylowym i wysuszono pod próżnią w temperaturze 50°C przez noc.

Wydajność: 8,45 g

MS-ESI: [M+H]⁺ = 348,0

TLC: Rf = 0,2, żel krzemionkowy, CH2CI2/CH3OH = 9/1 (obj./obj.) (e) . 5-amino-2-metylotio-4-(3-metoksyfenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksylan tert-butylu

Kwas 5-amino-4-(3-metoksyfenylo)-2-metylotio-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksylowy (przykład 1d,

7,0 g) rozpuszczono w suchym CH2CI2 (100 ml). Dodano tetrafluoroboranu benzotriazol-1-ilo-N,N,N,N'-tetrametylouroniowego (TBTU) (8,0 g), N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA) (6.6 ml) i tert-butyloaminy (4,0 ml) i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 godzin. Mieszaninę reakcyjną przemyto 5% wodnym roztworem NaHCO3 (2 x 100 ml) i 1M wodnym roztworem HCl (2 x 100 ml). Warstwę organiczną wysuszono (MgSO4) i zatężono pod próżnią. Związek tytułowy oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z układem heptan/octan etylu (EtOAc) = 1/0 do 3/2 (obj./obj.) jako eluentem.

Wydajność: 6,5 g

MS-ESI: [M+H]⁺ = 403,0

HPLC: R_t = 33,56 min., kolumna 3 μm Luna C-18(2) 100 x 2,0 mm, przepływ 0,25 ml/min., temperatura pieca 40°C, wykrywanie: 210 nm + 254 nm, eluent H2O/acetonitryl (CH3CN)/CH3OH) = 70/28, 5/1,5 do 0/95/5 (obj./obj.) w ciągu 50 minut.

(f) . tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-hydroksyfenylo)tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid

5-amino-2-metylotio-4-(3-metoksyfenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksylan tert-butylu (przykład 1 e, 1,8 g) rozpuszczono w suchym CH2CI2 (30 ml) i wytworzony roztwór oziębiono do temperatury 0°C. Wkroplono roztwór tribromku boru (1,28 ml) w suchym CH2CI2 (30 ml) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez noc. Do mieszaniny reakcyjnej wkraplano nasycony wodny roztwór NaHCO3, aż reakcja przestała być egzotermiczna. Następnie, CH2CI2 usunięto z mieszaniny przez odparowanie i dodano dużą ilość EtOAc. Warstwę organiczną przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3, wysuszono (MgSO4) i zatężono pod próżnią.

Wydajność: 1,3 g

MS-ESI: [M+H]⁺ = 389,2

HPLC: Rt = 17,44 min., kolumna Luna C-18 (patrz przykład 1e) eluent H2O/CH3CN/CH3OH = 90/9,5/0,5 do 0/95/5 (obj./obj.) w ciągu 50 minut.

(g) . tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-(metoksykarbonyloksy)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-hydroksyfenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid (przykład 1f, 100 mg) rozpuszczono w suchym CH2CI2 (5 ml). Do mieszaniny reakcyjnej dodano DIPEA (500 μθ i chloromrówczanu metylu (199 μθ i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez noc. Mieszaninę reakcyjną przemyto H2O. Warstwę organiczną wysuszono (MgSO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Związek tytułowy oczyszczono metodą HPLC na kolumnie Luna C-18, stosując następujący gradient rozpuszczalników: CH3CN/H2O = 10/90 do 90/10 (obj./obj.) w ciągu 30 minut. Następnie związek tytułowy liofilizowano z mieszaniny 1,4-dioksanu i H2O.

Wydajność: 93 mg

MS-ESI: [M+H]⁺ = 447,4

PL 207 755 B1

HPLC: Rt = 17,56 min., kolumna Luna C-18 (patrz przykład 1e) eluent H2O/CH3CN = 40/60 do 0/100 (obj./obj.) w ciągu 25 minut.

P r z y k ł a d 2 tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-(p-nitro-fenoksykarbonyloksy)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid

Reakcję tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-hydroksyfenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamidu (przykład 1f, 400 mg) z chloromrówczanem p-nitrofenylu (207 mg) prowadzono sposobem opisanym w przykładzie Ig. Po odparowaniu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano surowy związek tytułowy.

Wydajność: 569 mg

MS-ESI: [M+H]⁺ = 554, 6

TLC: Rf = 0,5, żel krzemionkowy, heptan/EtOAc (obj./obj.)

P r z y k ł a d 3 tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-(1,2,3,6-tetrahydropirydynokarbonyloksy)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid

Tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-(p-nitro-fenoksykarbonyloksy)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid (przykład 2, 142 mg) rozpuszczono w CH₂CI₂. Dodano 1,2,3,6-tetrahydropirydyny (117 μΐ) i DIPEA (224 μl i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez noc. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono CH2CI2 i przemyto H2O. Warstwę organiczną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Związek tytułowy oczyszczono metodą HPLC na kolumnie Luna C-18, stosując następujący gradient rozpuszczalników: CH3CN/H2O = 20/80 do 100/00 (obj./obj.) w ciągu 45 minut. Następnie związek tytułowy liofilizowano z mieszaniny 1,4-dioksanu i H2O.

Wydajność: 76 mg

MS-ESI: [M+H]⁺ = 498,2

HPLC: R_t = 13,90 min., kolumna 5 μm Luna C-18 (2) 150 x 4,60 μm, przepływ 1 ml/min., wykrywanie: 210 nm, eluent H2O/CH3CN = 40/60 do 0/100 (obj./obj.) w ciągu 15 minut

P r z y k ł a d 4 tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-(p-toluenosulfonamido)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-3-karboksamid (a) . 5-cyjano-4-(3-nitrofenylo)-2-metylotio-6-hydroksypirymidyna

Mieszaninę siarczanu S-metyloizotiomocznika (69,0 g), 3-nitrobenzaldehydu (75,0 g), cyjanooctanu etylu (56,0 ml) i węglanu potasu (72,5 g) w absolutnym EtOH (1500 ml) mieszano w temperaturze 60°C przez 16 godzin. Mieszaninę reakcyjną oziębiono do temperatury 0°C w łaźni lodowej. Wytworzony osad odsączono, przemyto absolutnym EtOH i rozpuszczono w gorącej wodzie (100°C). Roztwór oziębiono do temperatury pokojowej, zakwaszano do pH 2, stosując 2N HCl i oziębiono do temperatury 0°C w łaźni lodowej. Wytworzony osad odsączono i przemyto wodą z lodem. Resztkową wodę usunięto z osadu przez odparowanie z 1,4-dioksanem.

Wydajność: 54,0 mg

MS-ESI: [M+H]⁺ = 289,0

TLC: Rf = 0,3, żel krzemionkowy, DCM/MeOH = 9/1 (obj./obj.) (b) . 6-chloro-5-cyjano-4-(3-nitrofenylo)-2-metylotio-pirymidyna

Do roztworu 5-cyjano-4-(3-nitrofenylo)-2-metylotio-6-hydroksy-pirymidyny (przykład 4a, 25,0 g) w suchym 1,4-dioksanie (300 ml) podczas mieszania dodano POCI3 (100 ml). Po 3 godzinach w temperaturze 90°C mieszaninę oziębiono do temperatury pokojowej i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 1,4-dioksanie (100 ml) i otrzymany roztwór oziębiono do temperatury 0°C. Ostrożnie dodano wody z lodem. Wytworzony osad odsączono i przemyto wodą. Resztkową wodę usunięto z osadu przez odparowanie z 1,4-dioksanem.

Wydajność: 26,0 mg

MS-ESI: [M+H]⁺ = 307,0

TLC: Rf = 0,5, żel krzemionkowy, heptan/EtOAc = 3/2 (obj./obj.) (c) . Etylo-5-cyjano-4-(3-nitrofenylo)-2-metylotio-6-(etoksykarbonylometylotio)pirymidyna

Do roztworu 2-merkaptooctanu etylu (9,3 ml) i 6-chloro-5-cyjano-4-(3-nitrofenylo)-2-metylotiopirymidyny (przykład 4b, 26,0 g) w mieszaninie EtOH (250 ml) i DCM (250 ml) podczas mieszania dodano DIPEA (15,7 ml). Po 1 godzinie w temperaturze pokojowej do mieszaniny dodano 0,1N wodnego roztworu HCl (500 ml), a następnie mieszaninę ekstrahowano DCM (3 x 500 ml), wysuszono (MgSO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem.

PL 207 755 B1

Wydajność: 28,0 mg

MS-ESI: [M+H]⁺ = 390,4

TLC: Rf = 0,5, żel krzemionkowy, heptan/EtOAc = 3/2 (obj./obj.) (d) . 5-amino-4-(3-nitrofenylo)-2-metylotio-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksylan etylu

Mieszaninę etylo-5-cyjano-4-(3-nitrofenylo)-2-metylotio-6-(etoksykarbonylometylotio)pirymidyny (przykład 4c, 28,0 g) i DIPEA (30 ml) w mieszaninie toluenu (150 ml) i EtOH (150 ml) mieszano w temperaturze wrzenia (100°C) przez 16 godzin. Następnie mieszaninę oziębiono do temperatury pokojowej i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Resztkową DIPEA usunięto przez odparowanie z toluenem.

Wydajność: 28,0 mg

MS-ESI: [M+H]⁺ = 391,2

TLC: Rf = 0,6, żel krzemionkowy, heptan/EtOAc = 3/2 (obj./obj.) (e) . tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-aminofenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid

5-amino-2-metylotio-4-(3-nitrofenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksylan etylu (przykład 4d, 780 mg) rozpuszczono w 1,4-dioksanie (10 ml). Dodano etanolu (10 ml) i chlorku cyny (II) (1,1 g) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 90°C przez noc. Po zatężeniu mieszaniny reakcyjnej pod próżnią pozostałość rozpuszczono w EtOAC (50 ml) i przemyto 4M wodnym roztworem NaOH (10 ml), wysuszono (MgSO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Sposobem opisanym w przykładzie 1d, grupę estru etylowego w wytworzonej pochodnej 5-amino-2-metylotio-4-(3-nitrofenylo)tieno[2,3-d]-pirymidyno-6-karboksylanu etylu (558 mg) zmydlono do odpowiedniego kwasu (430 mg), a następnie poddano reakcji z tert-butyloaminą (200 ul) i otrzymano odpowiedni tert-butyloamid (zgodnie z przykładem 1e). Związek tytułowy oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z układem heptan/EtOAc = 3/1 (obj./obj.) jako eluentem.

Wydajność: 391 mg

MS-ESI: [M+H]⁺ = 388,0

TLC: Rf = 0,43, żel krzemionkowy, heptan/EtOAc = 3/2 (obj./obj.) (f) . tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-(p-toluenosulfonamido)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid

Tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-aminofenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid (przykład 4e, 100 mg) rozpuszczono w suchej pirydynie (5 ml). Dodano chlorku p-toluenosulfonylu (70 mg) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono CH2CI2 i przemyto 0,1M wodnym roztworem HCl. Warstwę organiczną wysuszono (MgSO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Związek tytułowy oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z układem heptan/EtOAc = 3/1 (obj./obj.) jako eluentem.

Wydajność: 63 mg

MS-ESI: [M+H]⁺ = 542,4

HPLC: Rt = 23,46 min., kolumna Luna C-18 (patrz przykład 1e) eluent: 50 mM bufor fosforanowy, pH 2,1/H2O/CH3CN/CH3OH = 10/72/17/1 do 10/18/68/4 (obj./obj.) w ciągu 50 minut.

P r z y k ł a d 5 tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-(metoksykarbonyloamino)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid

Tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-aminofenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid (przykład 4e, 100 mg) rozpuszczono w suchym CH₂CI₂ (5 ml). Dodano chloromrówczanu metylu (199 μΐ) i DIPEA (500 μθ i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez noc. Mieszaninę reakcyjną przemyto H2O. Warstwę organiczną wysuszono (MgSO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Związek tytułowy oczyszczono metodą HPLC na kolumnie Luna C-18 z następującym gradientem rozpuszczalników: CH3CN/10% wodny CH3CN = 10/90 do 90/10 (obj./obj.) w ciągu 30 minut. Następnie związek tytułowy liofilizowano z mieszaniny 1,4-dioksanu i H2O.

Wydajność: 80 mg

MS-ESI: [M+H]⁺ = 446,2

HPLC: Rt = 20,44 min., kolumna Luna C-18 (patrz przykład 1e), eluent: 50 mM bufor fosforanowy, pH 2,1/H2O/CH3CN = 10/72/18 do 10/18/72 (obj./obj.) w ciągu 20 minut.

P r z y k ł a d 6 tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-(alliloksykarbonyloamino)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid

PL 207 755 B1

Reakcję tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-aminofenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamidu (przykład 4e, 100 mg) z chloromrówczanem allilu (274 μΐ) prowadzono sposobem opisanym w przykładzie 5. Związek tytułowy oczyszczono metodą HPLC na kolumnie Luna C-18 z następującym gradientem rozpuszczalników: CH3CN/10% wodny CH3CN = 10/90 do 90/10 (obj./obj.) w ciągu 30 minut. Następnie związek tytułowy liofilizowano z mieszaniny 1,4-dioksanu i H2O.

Wydajność: 66 mg

MS-ESI: [M+H]⁺ = 472,2

HPLC: Rt = 22,37 min., kolumna Luna C-18 (patrz przykład 1e), eluent 50 mM bufor fosforanowy, pH 2,1/H2O/CH3CN = 10/72/18 do 10/18/72 (obj./obj.) w ciągu 20 minut.

P r z y k ł a d 7 tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-(p-nitro-fenoksykarbonyloamino)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid

Tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-aminofenylo)tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid (przykład 4e, 1 g) rozpuszczono w suchym CH2CI2 (10 ml). Następnie wkroplono roztwór chloromrówczanu p-nitro-fenylu (520 mg) w suchym CH2CI2 (10 ml) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej. Po 1 godzinie mieszaninę reakcyjną przemyto H2O. Warstwę organiczną wysuszono (MgSO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem.

Wydajność: 1,42 g

MS-ESI: [M+H]⁺ = 553,6

TLC: Rf = 0,7, żel krzemionkowy, heptan/EtOAc = 3/2 (obj./obj.)

P r z y k ł a d 8 tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-((morfolin-4-ylo)-karbonyloamino)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid

Tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-(p-nitro-fenoksy-karbonyloamino)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid (przykład 7, 142 mg) rozpuszczono w suchym CH2CI2 (5 ml). Dodano morfoliny (112 μβ i DIPEA (225 μθ i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez noc. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono CH2CI2 i przemyto H2O. Warstwę organiczną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Związek tytułowy oczyszczono metodą HPLC na kolumnie Luna C-18 z następującym gradientem rozpuszczalników: H2O/CH3CN = 80/20 do 0/100 (obj./obj.) w ciągu 45 minut. Następnie związek tytułowy liofilizowano z mieszaniny 1,4-dioksanu i H2O.

Wydajność: 22 mg

MS-ESI: [M+H]⁺ = 501,2

HPLC: Rt = 8,62 min., kolumna Luna C-18 (patrz przykład 3), eluent H2O/CH3CN = 40/60 do 0/100 (obj./obj.) w ciągu 15 minut.

P r z y k ł a d 9 tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-(1,2,3,6-tetrahydropirydynokarbonyloamino)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid

Tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-(p-nitrofenoksykarbonyloamino)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid (przykład 7, 142 mg) sprzęgano z tetrahydropirydyną (118 μβ, stosując mocznik, sposobem opisanym w przykładzie 8. Związek tytułowy oczyszczono metodą HPLC na kolumnie Luna C-18 z następującym gradientem rozpuszczalników: H2O/CH3CN = 80/20 do 0/100 (obj./obj.) w ciągu 45 minut. Następnie związek tytułowy liofilizowano z mieszaniny 1,4-dioksanu i H2O.

Wydajność: 18 mg

MS-ESI: [M+H]⁺ = 497,2

HPLC: Rt = 11,19 min., kolumna Luna C-18 (patrz przykład 3), eluent H2O/CH3CN = 40/60 do 0/100 (obj./obj.) w ciągu 15 minut.

P r z y k ł a d 10

Bioaktywność wobec CHO-LH i CHO-FSH in vitro

Aktywność agonistyczną związków wobec LH badano na komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) stabilnie transfekowanych ludzkim receptorem LH i kotransfekowanych składnikiem odpowiedzi cAMP (CRE)/promotorem kierującym ekspresją genu reporterowego lucyferazy robaczków świętojańskich. Związanie się ligandu z receptorem LH sprzężonym z Gs spowoduje wzrost cAMP, co z kolei wywoła zwiększoną transaktywację reporterowego konstruktu lucyferazy. Sygnał lucyferazy obliczono stosując licznik luminescencyjny. Dla badanych związków obliczono wartości EC50 (stężenie badanego związku powodujące połowę wartości maksymalnej (50%) stymulacji). Do tego celu stosowano

PL 207 755 B1 program GraphPad PRISM, version 3.0 (GraphPad software Inc., San Diego). Wyniki wskazują, że wartości EC50 dla związków z przykładów 6, 8 i 9 były niższe od 10^-8 M.

Claims

1. Bicykliczny heteroaromatyczny związek wybrany z grupy obejmującej tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-(alliloksykarbonyloamino)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid, tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-((morfolin-4-ylo)-karbonyloamino)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid i tert-butylo-5-amino-2-metylotio-4-(3-(1,2,3,6-tetrahydropirydynokarbonyloamino)-fenylo)-tieno[2,3-d]pirymidyno-6-karboksamid i jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

2. Związek według zastrz. 1 do stosowania w terapii.

3. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalną substancją pomocniczą, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera bicykliczny związek heteroaromatyczny określony w zastrz. 1 lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól albo solwat.

4. Zastosowanie bicyklicznych pochodnych heteroaromatycznych określonych w zastrz. 1, lub ich farmaceutycznie dopuszczalnej soli albo solwatu, do wytwarzania leku do kontrolowania płodności.