PL207121B1

PL207121B1 - Związek kahalalidowy, zastosowanie związku, kompozycja farmaceutyczna oraz sposób wytwarzania związku kahalalidowego

Info

Publication number: PL207121B1
Application number: PL356800A
Authority: PL
Inventors: Fernando Albericio; Ernest Giralt; José Carlos Jimenez; Angel Lopez; Ignacio Manzanares; Ignacio Rodrigues; Miriam Royo
Original assignee: Pharma Mar
Priority date: 2000-02-09
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2010-11-30
Also published as: CA2399187A1; HUP0301817A2; DK1254162T3; AU783542B2; US7482429B2; NZ520488A; KR20020092951A; UA76949C2; IL150981A; EP1829889A3; HK1047290A1; BG107020A; WO2001058934A2; AU3208601A; CY1106992T1; DE60130192T2; EP1829889A2; ATE371667T1; PT1254162E; SK11242002A3

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest związek kahalalidowy, zastosowanie związku, kompozycja farmaceutyczna oraz sposób wytwarzania związku kahalalidowego, zwłaszcza kahalalidu F. W szczególności, przedmiotem wynalazku są nowe pokrewne kahalalidu F oraz sposób wytwarzania tych nowych pochodnych jak też kahalalidu F.

Kahalalid F jest czynnym biologicznie, cyklicznym depsypeptydem, izolowanym z mięśnia języka mięczaka Elysia rufescens oraz z jego pożywienia, zielenicy (zielonej algi) Bryopsis sp. Po raz pierwszy kahalalid F wyizolowali Hamman i Scheuer, zobacz Hamman, M.T.; Scheuer, P.J., J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 5825-5826. W publikacji tej nie określono absolutnej stereochemii poszczególnych reszt waliny (3 D-Val oraz 2 L-Val) ani treoniny (L-Thr oraz D-allo-Thr). W późniejszej publikacji Scheuer i in. (Goetz, G., Yoshida, W.Y.; Scheuer, P.J., Tetrahedron 1999, 55, 7739-7746) wyznaczyli położenie 5 Val oraz 2 Thr w cząsteczce.

Struktura kahalalidu F według Scheuerera i in. była zatem następująca:

Tymczasem prof. Reinhart również przypisał poszczególne położenia 5-Val oraz 2-Thr (K.L. Reinhart, prywatna informacja). O ile w przypadku 2 Thr oraz 3 Val jego ustalenia zgadzają się z ustaleniami prof. Scheuera, to w przypadku ostatniej 2 Val występuje rozbieżność. Mianowicie w ustaleniach Reineharta dwie kolejne Val w bocznym łańcuchu są zamienione miejscami i struktura ta odpowiada wzorowi (I):

PL 207 121 B1

Obecnie przyjmuje się i ponownie dowodzi w tym tekście, że prawidłowym wzorem kahalalidu F jest wzór (I).

Struktura ta jest złożona i zawiera sześć aminokwasów we fragmencie cyklicznym oraz egzocykliczny łańcuch złożony z siedmiu aminokwasów z terminalną grupą acylową. Kahalalid F (I) jest nadzwyczaj silnym i rzadkim środkiem przeciwnowotworowym pochodzenia morskiego, ale brak wystarczającej jego ilości spowolnił plany badań klinicznych.

Znane są też inne związki kahalalidowe i dla przykładu przytoczymy publikację Hamanna, M.T. i in., J. Org. Chem., 1996, “Kahalalides: Bioactive Peptides from Marine Mollusk Elypsia refescens and its Algal Diet Bryopsis sp.”, tom 61, strony 6594-6660. W publikacji tej podano struktury zarówno kahalalidu F, jak i kahalalidów od A do E. Kahalalid K przedstawiono w J. Nat. Prod., 1999, 62, 1169, a kahalalid O przedstawiono w J. Nat. Prod., 2000, 63, 152.

Struktury tych kolejnych związków kahalalidowych przedstawiają następujące wzory:

PL 207 121 B1

Te cykliczne kahalalidy zawierają pierścień złożony aminokwasów oraz boczny łańcuch zakończony grupą acylową.

Kahalalidy wykazują szereg biologicznych działań, w szczególności działanie przeciwnowotworowe i przeciwgruźlicze.

Celem wynalazku jest dostarczenie związków imitujących naturalne kahalalidy, które mogą różnić się jednym lub większą liczbą aminokwasów oraz jednym lub większą liczbą elementów składowych bocznego łańcucha. Ponadto, celem wynalazku jest opracowanie syntetycznego sposobu wytwarzania związków o strukturze kahalalidu F i pokrewnych.

PL 207 121 B1

Według wynalazku, związek kahalalidowy stanowi związek o wzorze (II)

w którym, w cyklicznej części struktury, podstawniki R1, R2, R3, R4, R5, R6, X1 oraz X2, niezależnie od siebie są wybrane tak, że Aaa-1 oznacza D-allo-Thr, Aaa-2 oznacza D-allo-lle, Aaa-3 oznacza D-Val, Aaa-4 oznacza L-Phe, Aaa-5 oznacza Z-Dhb, oraz Aaa-6 oznacza L-Val; R7 jest wybrane z grupy obejmującej H, lub grupę alkilową, arylową lub aryloalkilową ewentualnie podstawioną przez grupę hydroksylową, grupę merkaptanową, grupę aminową, grupę guanidynową, lub halogenem; tak że

Aaa-7 oznacza aminokwas o konfiguracji L lub D, jeśli stosowne; zaś R8 jest wybrane spośród wzoru III, IV lub V:

w których każda grupa R9, R10 oraz R11 niezależnie od siebie oznacza H lub grupę alkilową, arylową lub aryloalkilową ewentualnie podstawioną przez grupę hydroksylową, grupę merkaptanową, grupę aminową, grupę guanidynową, grupę karboksylową, grupę karboksyamidową lub halogenem; przy czym R9 oraz R10 mogą tworzyć część tego samego pierścienia; zaś n wynosi od 0 do 6; pod warunkiem, że związek o wzorze II nie jest 5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-L-Orn-D-allo-llecyclo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-L-Phe-Z-Dhb-L-Val).

Korzystnie, R7 oznacza ewentualnie podstawioną grupę alkilową.

Korzystnie, R9 oznacza ewentualnie podstawioną grupę alkilową.

Korzystnie, R11 oznacza ewentualnie podstawioną grupę C1-C20alkilową.

Korzystnie, część cykliczna i łańcuch boczny są jak podano

PL 207 121 B1

część cykliczna	łańcuch boczny**
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe- Z-Dhb-Val)	Grupa terminalna: palmitoil (Palm)
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-L-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr- D-Val-L-Val-D-Pro-L-Orn-D-allo-lle-
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Grupa terminalna: heptanoil (Hep)
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val	Grupa terminalna: 3,3-dimetylobutyryl (3,3-DiMeBut)
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Grupa terminalna: 4-metylopentanoil (4-MePen)
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Grupa terminalna: 3-metylobutyryl (3-MetBut)
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Grupa terminalna: butyryl (But)
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-D-allo-lle-
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Allo-lle-
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-D-allo-lle-
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-allo-lle-
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-D-allo-lle-

** związek, w których łańcuch boczny jest określony grupą terminalną ma łańcuch 5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-L-Orn-D-allo-lle, lecz ze wskazaną grupą terminalną zamiast podstawnika 5-MeHex.

Korzystnie, część cykliczna i łańcuch boczny są jak podano

część cykliczna	łańcuch boczny**
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	IBut-D-allo-lle-D-Val-L-Thr-L-Val- D-Val-D-Pro-L-Orn-D-allo-lle-
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Tico-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-L-Orn-D-allo-lle-
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-allo-lle-
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Grupa terminalna: N,N-dimetylo-4-aminobutyryl (4-DiMeABut)
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Grupa terminalna: trifluoroacetyl (TFA)
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Grupa terminalna: 4-hydroksybutyryl
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Grupa terminalna: acetyl

Korzystnie, część cykliczna i łańcuch boczny są jak podano

część cykliczna	łańcuch boczny**
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Grupa terminalna: TFA-Lit-
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Grupa terminalna: litocholoil (Lit)
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Grupa terminalna: 4-(4-acetoksybutanoiloksy)butyryl (AcButBut)
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Grupa terminalna: 4-acetoksybutyryl (4AcBut)
cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Grupa terminalna: 2,4-heksadienoil (Hedo)

PL 207 121 B1

Korzystnie, związkiem kahalalidowym jest H-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyclo(Dallo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val).

Korzystnie, związkiem kahalalidowym jest Pal-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyclo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val).

Korzystnie, związkiem kahalalidowym jest TFA-Lit-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-llecyclo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val).

Według wynalazku, kompozycja farmaceutyczna, charakteryzuje się tym, że zawiera związek określony powyżej łącznie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem.

Według wynalazku, związek określony powyżej stosuje się do wytwarzania leku do leczenia nowotworu.

Według wynalazku, sposób wytwarzania związku kahalalidowego o wzorze (II)

PL 207 121 B1 w których każda grupa R9, R10 oraz R11 niezależ nie od siebie oznacza H lub grupę alkilową, arylową lub aryloalkilową ewentualnie podstawioną przez grupę hydroksylową, grupę merkaptanową, grupę aminową, grupę guanidynową, grupę karboksylową, grupę karboksyamidową lub halogenem; przy czym

R9 oraz R10 mogą tworzyć część tego samego pierścienia; zaś n wynosi od 0 do 6; charakteryzuje się tym, że prowadzi się zamknięcie pierścienia zgodnie z poniższym schematem

Rg—Aa a₇—Aa a -ι —Aa a 2—Aa a 3—O H

R2—Χ1—Aaa₆—Aa 35—Aaa4—H

R₈-Aaa₇-Aaa₁-Aaa₂-Aaa₃

R2—X1 —Aa a θ—Aa a 5—Aa 34

Związki o wzorze (II), imitujące kahalalid naturalny, wykazują jedną z następujących cech różniących je od macierzystego, występującego w naturze kahalalidu:

od 1 do 7, korzystnie od 1 do 3, jeszcze korzystniej 1 lub 2, a najkorzystniej 1 aminokwas nie jest taki sam, jak aminokwas występujący w macierzystym związku;

od 1 do 10, korzystnie od 1 do 6, jeszcze korzystniej od 1 do 3, a najkorzystniej 1 lub 2 dodatkowe grupy metylenowe występują w grupie acylowej bocznego łańcucha macierzystego związku;

od 1 do 10, korzystnie od 1 do 6, jeszcze korzystniej od 1 do 3, a najkorzystniej 1 lub 2 grupy metylenowe są usunięte z grupy acylowej bocznego łańcucha macierzystego związku;

od 1 do 6, korzystnie od 1 do 3, a jeszcze korzystniej 1 lub 3 podstawniki są dodane do grupy acylowej bocznego łańcucha macierzystego związku lub są z niej wyeliminowane.

W przypadku cyklicznych kahalalidów dodanie lub usunięcie aminokwasu może nastąpić w pierś cieniu makrocyklicznym lub w bocznym ł a ń cuchu.

W modyfikacji usuwa się jeden lub wię cej aminokwasów Aaa-6 oraz Aaa-5 z pierś cienia heksaaminokwasowego, albo dodaje aminokwas Aaa-7 między Aaa-6 i Aaa-1 w celu uzyskania pierścieni zawierających cztery, pięć lub siedem aminokwasów w pierścieniu. Korzystnie w pierścieniu występuje sześć aminokwasów.

Związki pokrewne kahalalidowi F (I), stanowią związki o wzorze (II), w którym Aaa-1 oznacza D-allo-Thr (X1 = O, R1 = CH3), Aaa-2 oznacza D-allo-lle (izoleucynę) (R3 = 1-metylopropyl), Aaa-3 oznacza D-Val (R4 = izopropyl), Aaa-4 oznacza Phe (fenyloalaninę) (R5 = benzyl), Aaa-5 oznacza Z-Dhb (X2 = C=CHCH3 o konfiguracji Z), Aaa-6 oznacza L-Val (R6 = izopropyl), Aaa-7 oznacza D-allolle (R7 = 1-metylopropyl), zaś R8 zawiera pochodną sześciopeptydową o następującym wzorze (wzór VI):

PL 207 121 B1

Szczególnie korzystne są związki, które zawierają takie same aminokwasy, jakie znajdują się w naturalnym cyklicznym związku kahalalidowym, ale róż nią się bocznym łańcuchem, zwłaszcza w części acylowej. Takie różnice mogą obejmować większą lub mniejszą liczbę grup metylenowych, najczęściej zmianę co najwyżej o dwie grupy metylenowe, oraz większą lub mniejszą liczbę podstawników, w szczególności dodanie halogenu, jak np. podstawników fluorowych.

Stosowane w niniejszym opisie pojęcie „grupa alkilowa” oznacza nasyconą, liniową lub rozgałęzioną grupę węglowodorową, obejmującą np. metyl, etyl, izopropyl, izobutyl, tert-butyl, heptyl, dodecyl, oktadecyl, pentyl, 2-etyloheksyl, 2-metylobutyl, 5-metyloheksyl, 9-metylo-3-decyl itp., zwłaszcza grupy alkilowe, które zawierają pojedynczą odgałęzioną grupę metylową. Korzystnie grupa alkilowa jest długa i zawiera od 1 do 20 atomów węgla, zazwyczaj od 1 do 15 lub od 1 do 10 atomów węgla, albo może być krótka i zawierać od 1 do 6, albo od 1 do 3 atomów węgla. Na grupę R11 nadają się długie łańcuchy węglowe, ale zwykle wszystkie pozostałe grupy alkilowe korzystnie są krótkie.

Pojęcie „grupa alkenylowa” oznacza nienasyconą, liniową lub rozgałęzioną grupę węglowodorową z jednym lub większą liczbą podwójnych wiązań węgiel-węgiel, taką jak np. grupa winylowa. Korzystnie grupa alkenylowa zawiera od 2 do 8 lub od 2 do 4 atomów węgla.

Pojęcie „grupa alkinylowa” oznacza nienasyconą, liniową lub rozgałęzioną grupę węglowodorową z jednym lub większą liczbą potrójnych wiązań węgiel-węgiel. Korzystnie grupa alkinylowa zawiera od 2 do 8 lub od 2 do 4 atomów węgla.

Pojęcie „grupa cykliczna” oznacza zamkniętą pierścieniową grupę węglowodorową, którą klasyfikuje się jako grupę alicykliczną, grupę aromatyczną lub grupę heterocykliczną. Pojęcie „grupa alicykliczną” oznacza cykliczną grupę węglowodorową o własnościach podobnych do własności grup alifatycznych i korzystnie stanowi grupę monocykliczną lub bicykliczną o 4 do 10 atomach węgla. Pojęcie „grupa aromatyczna” lub „grupa arylowa” oznacza monocykliczną lub policykliczną aromatyczną grupę węglowodorową, korzystnie monocykliczną lub bicykliczną o 5 do 10 atomach węgla. Pojęcie „grupa heterocykliczna” oznacza zamknięty pierścień węglowodorowy, w którym jeden lub większa liczba atomów w pierścieniu stanowi pierwiastek różny od węgla (np. od 1 do 3 atomów jednego lub więcej spośród azotu, tlenu, siarki itd.), korzystnie monocykliczny lub bicykliczny o 4 do 10 atomach w pierścieniu.

Jak ogólnie wiadomo w dziedzinie techniki, wysoki stopień podstawienia jest nie tylko dopuszczalny, ale często wskazany. W związkach według niniejszego wynalazku przewiduje się podstawianie. W celu uproszczenia rozważań i cytowania określonej terminologii używanej w tym zgłoszeniu, pojęcia „grupa” oraz „fragment” stosuje się dla rozróżnienia struktur chemicznych, które mogą podstawiać lub które mogą być podstawiane, od tych, które nie mogą podstawiać lub nie mogą być podstawiane. Jeśli więc do określenia chemicznego podstawnika używa się pojęcia „grupa”, to przedstawiana substancja chemiczna obejmuje niepodstawioną grupę oraz tę grupę z atomami O, N lub S, np. w łańcuchu, jak również grupę karbonylową lub inne typowe podstawienia. Jeśli do określenia chemicznego związku lub podstawnika używa się pojęcia „fragment”, to ma ono obejmować tylko niepodstawioną substancję chemiczną. Na przykład pojęcie „grupa alkilowa” ma obejmować nie tylko wyłącznie podstawniki alkilowe nasyconych węglowodorów o otwartym łańcuchu, takie jak metyl, propyl, izobutyl itp., ale również podstawniki alkilowe zawierające dalsze podstawniki znane w dziedzinie techniki, takie jak hydroksyl, alkoksyl, grupa aminowa, karboksyl, grupa karboksyamidowa, atomy halogenów, grupa cyjankowa, grupa nitrowa, alkilosulfonyl itd. „Grupa alkilowa” obejmuje więc grupy eterowe, haloalkilowe, alkohole, tiole, grupy karboksylowe, aminowe, hydroksylkilowe, sulfoalkilowe itd. Niniejszym korzystne są grupy haloalkilowe. Z drugiej strony pojęcie „fragment alkilowy” ogranicza się do obejmowania wyłącznie tylko nasyconych węglowodorowych podstawników alkilowych o otwartym łańcuchu, takich jak metyl, etyl, propyl, izobutyl itp.

Korzystnie, związek kahalalidowy stanowi związek o ogólnym wzorze (A):

ο ο

Aa⁶-Ν-C-Aa⁵-N-C-Aa⁴

PL 207 121 B1 w którym każdy człon od Aa¹ do Aa⁶ wraz z sąsiadują cymi z nimi odpowiednio -N- oraz -CO- oznacza aminokwas α lub β, korzystnie α-aminokwas, X oznacza grupę łącznikową Aa¹, korzystnie wybraną spośród grupy aminowej, hydroksylowej lub merkaptanowej, bardziej korzystnie grupę hydroksylową, a R oznacza grupę ewentualnie zawierającą jeden lub większą liczbę aminokwasów α lub β, korzystnie α-aminokwasów. W odmianie może nie występować -CO-Aa⁶-N-, ewentualnie może równocześnie nie występować -CO-Aa⁵-N-, albo alternatywnie między Aa⁶ i Aa¹ może być wstawiona grupa -CO-Aa⁷-N-.

Aminokwasy mogą mieć konfigurację L lub D. Korzystnie konfiguracja ta jest taka sama, jak odpowiednich aminokwasów w związku kahalalidowym, zwłaszcza w kahalalidzie F. Korzystnie jeden lub większa liczba członów od Aa¹ do Aa⁷ odpowiada aminokwasowi w tym samym położeniu w naturalnym kahalalidzie lub związku jemu pokrewnym. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu każdy aminokwas jest taki sam, jak w kahalalidzie F. Korzystnie więc Aa¹ oznacza D-allo-Thr, Aa² oznacza D-allolle, Aa³ oznacza D-Val, Aa⁴ oznacza Phe, Aa⁵ oznacza Z-Dhb, Aa⁶ oznacza L-Val.

Jeśli stosuje się związki pokrewne, to odpowiednie związki pokrewne zawierają zastąpione aminokwasy tam, gdzie zastąpienie wykonuje się z uwzględnieniem struktury odpowiedniego aminokwasu w naturalnym kahalalidzie, takim jak kahalalid F. Treoninę można zastąpić seryną i dalszymi homologami, a także cysteina i jej homologami. Izoleucynę można zastąpić innymi aminokwasami z grupami niepolarnymi, w tym alaniną, waliną, leucyną i proliną, a także ich analogami i homologami. Pod tym względem przedstawienie atomów azotu -N- we wzorze (A) nie wyklucza możliwości tworzenia takiego pierścienia, jaki występuje w przypadku proliny. Walinę można zastąpić izoleucyną i innymi aminokwasami z grupami niepolarnymi obejmującymi ich analogi i homologi. Fenyloalaninę można zastąpić tryptofanem i tyrozyną. Dhb można zastąpić innymi aminokwasami z podstawnikiem alkenylidenowym, obejmującymi aminokwasy z bocznymi łańcuchami C3 lub dłuższymi, a także ich analogi i homologi.

Korzystnie Aa¹ odpowiada wzorowi:

O

-N

RAa-i w którym RAa1 oznacza boczny łańcuch niosący łącznikową grupę X. Przykłady bocznych łańcuchów obejmują alkil, aryl i aryloalkil, zwłaszcza alkil, zwykle alkil zawierający od 1 do 4, np. 2 atomy węgla. Korzystny jest alkil rozgałęziony. Łącznikowa grupa X korzystnie oznacza tlen, przy czym Aa1 korzystnie pochodzi od treoniny, ale można też stosować siarkę, grupę aminową (niepodstawioną lub podstawioną alkilem, arylem albo aryloalkilem) i inne grupy łącznikowe. Korzystnie grupa X oznacza jedyną polarną grupę w Aa¹. Aa¹ może być racemiczny, L lub D, ale korzystnie występuje w konfiguracji D.

Korzystnie Aa² odpowiada wzorowi:

O

RA32 w którym RAa2 oznacza boczny łańcuch, taki jak alkil, aryl i aryloalkil, zwłaszcza alkil, zwykle alkil zawierający od 1 do 5, np. 3 atomy węgla. Korzystny jest rozgałęziony alkil, jak w przypadku izoleucyny. Korzystnie w Aa² nie występują polarne podstawniki. Aa² może być racemiczny, L lub D, ale korzystnie występuje w konfiguracji D.

PL 207 121 B1

Korzystnie Aa³ odpowiada wzorowi:

ο

-Ν--RAa₃ w którym RAa3 oznacza boczny ła ńcuch, taki jak alkil, aryl i aryloalkil, zwłaszcza alkil, zwykle alkil zawierający od 1 do 5, np. 3 atomy węgla. Korzystny jest rozgałęziony alkil, jak w przypadku waliny. Korzystnie w Aa³ nie występują polarne podstawniki. Aa³ może być racemiczny, L lub D, ale korzystnie występuje w konfiguracji D.

Korzystnie Aa⁴ odpowiada wzorowi:

Ο

Ν

RAa₄ w którym RAa⁴ oznacza boczny łańcuch, taki jak alkil, aryl i aryloalkil, zwłaszcza aryloalkil, zwykle aryloalkil zawierający od 7 do 10, np. 7 atomów węgla. Korzystny jest benzyl, jak w przypadku fenyloalaniny. Korzystnie w Aa⁴ nie występują polarne podstawniki. Aa⁴ może być racemiczny, L lub D, ale korzystnie występuje w konfiguracji L.

Korzystnie Aa⁵ odpowiada wzorowi:

w którym każdy z RAa5a oraz RAa5b jest wybrany spoś ród wodoru lub bocznego ł a ń cucha, takiego jak alkil, aryl i aryloalkil, zwłaszcza alkil, zwykle alkil zawierający od 1 do 4, np. 1 atom węgla. Korzystnie

RAa_5a oznacza wodór, dając konfigurację Z, jak w przypadku korzystnego kwasu α,β-didehydro-a55

-aminomasłowego. Korzystnie w Aa⁵ nie występują polarne podstawniki. Aa⁵ może być racemiczny, L lub D, ale korzystnie występuje w konfiguracji L.

Korzystnie Aa⁶ odpowiada wzorowi:

O

-N

RAa₆ w którym RAa6 oznacza boczny łańcuch, taki jak alkil, aryl i aryloalkil, zwłaszcza alkil, zwykle alkil zawierający od 1 do 5, np. 3 atomy węgla. Korzystny jest rozgałęziony alkil, jak w przypadku waliny. Korzystnie w Aa⁶ nie występują polarne podstawniki. Aa⁶ może być racemiczny, L lub D, ale korzystnie występuje w konfiguracji L.

PL 207 121 B1

Aminokwasy od Aa¹ do Aa⁷ mogą być takie, jak określone dla grup od Aaa-1 do Aaa-7 we wzorze (II).

Boczny łańcuch R korzystnie oznacza 5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-L-Orn-D-allolle, albo łańcuch jemu pokrewny włącznie z analogami i homologami. Przykłady pokrewnych łańcuchów obejmują łańcuchy o ogólnym wzorze (R^t)m-(aminokwas)n-, gdzie suma m+n nie jest równa zeru, R^t oznacza grupę końcową, korzystnie alkil, alkenyl, alkinyl, aryl, aryloalkil, heteroaryl, heteroalkil, grupę alicykliczną lub inną grupę końcową, zaś -(aminokwas)n- oznacza ewentualny łańcuch aminokwasów.

Końcowa grupa alkilowa korzystnie zawiera od 1 do 12 atomów węgla, zwykle od 4 do 10 atomów węgla, i może być podstawiona oraz korzystnie rozgałęziona. Przykłady obejmują butyl, pentyl, heksyl, heptyl, oktyl oraz inne grupy alkilowe z przyłączoną 1 lub większą liczbą bocznych grup metylowych lub etylowych albo dłuższych, korzystnie zawierających od 1 do 6 atomów węgla, zwłaszcza 5-metyloheksyl i inne grupy alkilowe z rozgałęzieniem oddalonym od miejsca przyłączenia do pozostałej części cząsteczki. Odpowiednie podstawniki obejmują halogen, hydroksyl, alkoksyl, grupę aminową, karboksyl, grupę karboksyamidową, grupę cyjanową, grupę nitrową, alkilosulfonyl, alkoksyl, alkoksyalkil, aryloalkiloaryl, grupę heterocykliczną, alicykliczną, aryl, aryloalkil i inne wymienione tutaj grupy. W razie potrzeby takie podstawniki mają dalsze podstawniki, np. grupę tolilową. Zwykle najkorzystniejsze są podstawniki halogenowe, zwłaszcza 1 lub więcej, np. od 1 do 3 atomów fluoru. Inne grupy końcowe można wybierać według informacji podanych w tym tekście i obejmują one grupy alicykliczne, aryloalkilowe, arylowe, heterocykliczne oraz inne grupy, zawierające ewentualnie 1 lub więcej, zwłaszcza od 1 do 3 podstawników.

Boczny łańcuch R-CO-N- można zawierać na azocie wodór albo podstawnik, taki jak grupa alkilowa, arylowa lub aryloalkilowa.

W odpowiednich pokrewnych bocznych łańcuchach stosuje się zastępcze aminokwasy, wybrane według uprzednio podanych zasad, przy czym istnieją możliwości wyboru izoleucyny, waliny i treoniny jako tych aminokwasów w pierścieniowej części cząsteczki oraz możliwości alternatyw dla ornityny, obejmujących lizynę, histydynę, argininę, i alternatyw dla proliny, obejmujących alaninę i inne niepolarne aminokwasy, takie jak glicyna, izoleucyną oraz inne wcześniej wymienione. Najczęściej łańcuch R zawiera od 0 do 10, bardziej korzystnie od 4 do 8, np. 5, 6 lub 7, a zwłaszcza 7 reszt aminokwasów. Jeśli występuje więcej niż siedem aminokwasów, to dodatkowe aminokwasy korzystnie oznaczają naturalne aminokwasy, zwłaszcza tutaj wymienione.

Można stosować aminokwasy racemiczne, albo L lub D. Jeśli aminokwasy występują w bocznym łańcuchu R, to korzystnie jeden lub więcej spośród nich występuje w konfiguracji, podanej dla bocznego łańcucha występującego w naturze. Przy odczytywaniu tego cyklicznego heksapeptydu reszty aminokwasów układają się w konfiguracji DLDDLLD. Końcowa grupa alkilowa korzystnie zawiera od 1 do 12 atomów węgla, zazwyczaj od 4 do 10 atomów węgla, i może być podstawiona oraz korzystnie jest rozgałęziona. Odpowiednie podstawniki obejmują halogen, hydroksyl, alkoksyl, grupę aminową, karboksyl, grupę karboksyamidową, grupę cyjanową, grupę nitrową, alkilosulfonyl i inne wymienione tutaj grupy. Zwykle najkorzystniejszymi podstawnikami są halogeny.

Ogólnie biorąc boczny łańcuch R-CO-N- można określić jako boczny łańcuch R8-NH-CHR7-CO-NH- w związkach o ogólnym wzorze (II) włącznie ze związkami zawierającymi mieszaniny aminokwasów, określonych wzorami (III), (IV) i (V).

Według podanych zasad, podanych w odniesieniu do kahalalidu F, jest możliwe opracowanie związków naśladujących inne kahalalidy. Aminokwasy i boczne łańcuchy można więc zmieniać, korzystnie zachowując równowagę hydrofobowo-hydrofilową między polarnymi i niepolarnymi ugrupowaniami.

Związki według wynalazku wykazują użyteczne działania biologiczne, w tym działanie przeciwnowotworowe. A zatem, nadają się do leczenia dowolnego ssaka, w szczególności człowieka, zaatakowanego przez raka, przy czym leczenie polega na podawaniu temu zaatakowanemu osobnikowi skutecznie działającej terapeutycznie ilości związku według wynalazku albo jego farmaceutycznej kompozycji.

Farmaceutyczne kompozycje mogą być w postaci obejmującej wszelkie ciała stałe (tabletki, pigułki, kapsułki, granulaty itd.) lub ciecze (roztwory, zawiesiny lub emulsje) o odpowiednim składzie do doustnego, miejscowego lub pozajelitowego podawania i mogą one zawierać czysty związek lub w połączeniu z dowolnym nośnikiem lub innymi farmakologicznie czynnymi związkami. Kompozycje te mogą wymagać sterylności przy podawaniu pozajelitowym.

PL 207 121 B1

Podawanie związków lub kompozycji według niniejszego wynalazku może odbywać się dowolnym odpowiednim sposobem, takim jak wlew dożylny, preparaty doustne, podawanie dootrzewnowe lub dożylne. Korzystne jest stosowanie okresów czasu wlewu do 24 godzin, bardziej korzystne od 2 do 12 godzin, a najkorzystniej od 2 do 6 godzin. Szczególnie pożądane są krótkie okresy czasu wlewu, które umożliwiają prowadzenie leczenia bez pozostawania na noc w szpitalu. W razie potrzeby wlew może trwać jednak od 12 do 24 godzin lub nawet dłużej. Wlew można prowadzić w odpowiednich odstępach czasu, wynoszących np. od 2 do 4 tygodni. Farmaceutyczne kompozycje, zawierające związki według wynalazku, można dostarczać w kapsułkach liposomowych lub nanosferowych, w preparatach o przedł u ż onym uwalnianiu lub innymi ś rodkami standardowego dostarczania.

Prawidłowe dawkowanie tych związków będzie zmieniało się w zależności od rodzaju danego preparatu, sposobu podawania oraz leczonego miejsca, gospodarza i nowotworu. Powinno się brać pod uwagę także inne czynniki, takie jak wiek, wagę ciała, płeć, dietę, czas podawania, szybkość wydalania, stan gospodarza, zestawienia lekowe, wrażliwość reakcji oraz powagę choroby. Podawanie można prowadzić w sposób ciągły lub okresowy w granicach maksymalnej tolerowanej dawki.

Związki i kompozycje według wynalazku można stosować wraz z innymi lekami w celu zapewnienia leczenia skojarzonego. Te inne leki mogą tworzyć część tej samej kompozycji, albo można je dostarczać w postaci osobnej kompozycji, podając ją w tym samym czasie lub w innym czasie. Tożsamość tych innych leków nie jest szczególnie ograniczona, a odpowiednie leki-kandydaci obejmują:

a) leki o działaniu antymitotycznym, zwłaszcza adresowane do elementów cytoszkieletowych, w tym modulatory mikrotubuli, takie jak leki taksanowe (takie jak taksol, paklitaksel, taksoter, docetaksel), toksyny z Podophyllum pelatum lub alkaloidy barwinka (winkrystyna, winblastyna);

b) leki antymetabolitowe, takie jak 5-fluorouracyl, cytarabina, gemcytabina, analogi puryny takie jak pentostatyna, metotreksat);

c) środki alkilujące, takie jak iperyty azotowe (takie jak cyklofosfamid lub ifosfamid);

d) leki adresowane do DNA, takie jak leki antracyklinowe (adriamycyna, doksorubicyna, farmorubicyna lub epirubicyna);

e) leki adresowane do topoizomeraz, takie jak etopozyd;

f) hormony i agoniści lub antagoniści hormonów, takie jak estrogeny, antyestrogeny (tamoksyfen i pokrewne związki) oraz androgeny, flutamid, leuprolelina, goserelina, cyprotron lub oktreotyd;

g) leki adresowane do transdukcji sygnałowej w komórkach nowotworowych obejmujące pochodne przeciwciał, takie jak herceptyna;

h) środki alkilujące, takie jak leki platynowe (cis-platyna, karbonplatyna, oksaliplatyna, paraplatyna) lub nitromoczniki;

i) leki potencjalnie atakujące przerzuty nowotworów, takie jak inhibitory metaloproteaz substancji międzykomórkowej;

j) terapia genowa i środki antysensowne;

k) środki terapeutyczne zawierające przeciwciała;

I) inne biologicznie czynne związki pochodzenia morskiego, zwłaszcza ekteinascydyny, takie jak ekteinascydyna 743, lub didemniny, takie jak aplidyna;

m) analogi steroidów, w szczególności deksametazon;

n) leki przeciwzapalne, zwłaszcza deksametazon; oraz

o) leki przeciwwymiotne, zwłaszcza deksametazon.

Poza działaniem przeciwnowotworowym, oczekuje się również, iż związki według wynalazku, podobnie jak naturalny kahalalid F, będą wykazywały działanie przeciwgruźlicze.

Sposób wytwarzania związków kahalalidowych, tj. nowych związków pokrewnych oraz kahalalidu F, polega na zamykaniu pierścienia między Aaa3 i Aa4. Stwierdzono, że zamykanie pierścienia w tym położeniu prowadzi do wyjątkowo korzystnego sposobu. Zamykanie pierścienia może poprzedzać i/lub mogą po nim następować inne modyfikacje cząsteczki, obejmujące tworzenie lub powiększanie bocznego łańcucha przy Aa1 i/lub usuwanie grup zabezpieczających i/lub modyfikowanie podstawników aminokwasowych.

PL 207 121 B1

Sposób ten można zatem ilustrować następującym schematem:

w którym R' oznacza grupę R-CO albo jej prekursor, i w którym jeden lub wię ksza liczba aminokwasów może zawierać grupy zabezpieczające oraz w którym -COOH przy Aa3 i/lub -NH2 przy Aa4 mogą być ewentualnie zabezpieczone, aktywowane lub przekształcane w ich pochodne. Takie procedury stosujące prekursory albo zabezpieczanie, aktywowanie lub przekształcanie w pochodne są typowe per se i nie są konieczne dalsze szczegóły dla praktycznego zastosowania tego sposobu.

Proces syntezy według wynalazku można prowadzić z zastosowaniem wyjściowych substancji w sposób enancjo- i stereokontrolowany oraz szybko, wykorzystują c zalety metodologii syntezy w fazie stał ej, w której konstruowana czą steczka jest zwią zana na nierozpuszczalnym noś niku w trakcie wszystkich operacji syntetycznych. A zatem nadmiar reagentów i rozpuszczalne produkty uboczne można łatwo usuwać przez przemywanie cząsteczek na żywicy odpowiednimi rozpuszczalnikami. Można więc stosować duże nadmiary rozpuszczalnych odczynników w celu doprowadzenia reakcji do końca w krótkim okresie czasu, unikając racemizacji (jeśli może występować) i innych wtórnych reakcji. Sposób ten nadaje się ponadto do automatyzacji.

Korzystny przykład realizacji sposobu syntetycznego według niniejszego wynalazku najlepiej przedstawia schemat 1, który dotyczy wytwarzania związków o ogólnym wzorze (II).

PL 207 121 B1

Schemat 1

Na przedstawionym wyżej schemacie 1 pokazano, że korzystny sposób syntetycznego wytwarzania kahalalidu F (I) oraz pochodnych i analogów wykorzystuje sposób realizacji w fazie stałej, zobacz np. Lloyd-Williams, P. i in., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, Boca Raton (FL), 1997.

Sposób według schematu 1 obejmuje kolejne etapy:

(a) wprowadzenie Fmoc-aminokwasu (Aaa3) na stały nośnik (np. polistyren, polietylen szczepiony na polistyrenie itp.), zawierający labilny wobec superkwasu zaczep lub łącznik (np. chlorotrytyl, polialkoksybenzyl itp.), z utworzeniem wiązania estrowego;

(b) wydłużenie łańcucha peptydowego o trzy aminokwasy (Aaa2, Aaa1, Aaa7) z zastosowaniem strategii Fmoc/tBu; w przypadku I X1 oznacza OH i wprowadza się go bez zabezpieczenia; jeśli X1 oznacza NH2, to wprowadza się ją z zabezpieczeniem przez Alloc;

(c) wprowadzenie (Aaa6) z zastosowaniem strategii Alloc/tBu;

(d) wydłużenie łańcucha peptydowego o pozostałe aminokwasy i R11-COOH przez Aaa7 z zastosowaniem strategii Fmoc/tBu;

(e-1) wydłużenie łańcucha peptydowego o dwa aminokwasy [Aaa5 (OH,H), Aaa4] przez Aaa6 z zastosowaniem strategii Alloc/tBu; OH przyłączony do Aaa5 jest niezabezpieczony;

(e-2) odwodnienie fazy stałej w celu uzyskania peptydu z Aaa5; lub (e'-1) wprowadzenie dipeptydu Alloc-Aaa4-Aaa5-OH, który został połączony i odwodniony w roztworze;

(f) usuwanie grupy Alloc z Aaa4, podczas gdy peptyd jest nadal zakotwiczony na stałym nośniku;

(g) odszczepienie peptydu, jeśli miało to zastosowanie - zabezpieczonego w bocznym łańcuchu, od stałego nośnika;

(h) cyklizacja peptydu w roztworze;

(i) usuwanie labilnych grup TFA zabezpieczających boczny łańcuch.

PL 207 121 B1

Należy zdawać sobie sprawę, że specjalny wybór grup zabezpieczających nie jest decydujący i inne moż liwoś ci są ogólnie osią galne. Na przykład grupy typu Bz1 mogą zastę pować tBu/Boc; Boc może występować zamiast Fmoc; Fmoc zamiast Alloc; żywica Wanga zamiast chlorotrytylu.

Szczegółowy opis korzystnych realizacji sposobu

Korzystny sposób według niniejszego wynalazku ilustruje schemat

1. Sposób ten, omówiony bardziej szczegółowo w poniższych przykładach, przeprowadzono następująco:

Fmoc-Aaa3-OH korzystnie dołączono do żywicy chlorotrytylowo-polistyrenowej; zobacz Barles, K.;

Gatos, D.; Schafer, W., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991, 30, 590-593, w obecności DIEA, utrzymując poziom podstawienia, wynoszący około 0,15-0,5 mmol/g. Stosowanie wyższych poziomów sprzyja obecności terminalnych peptydów w końcowym produkcie, zobacz Chiva, C; Vilaseca, M.; Giralt, E.; Albericio, F., J. Pept. Sci., 1999, 131-140.

Usuwanie grupy Fmoc prowadzono z użyciem mieszaniny piperydyna-DMF (2:8 objętościowo) (1 x 1 min., 3 x 5 min., 1 x 10 min.). Sprzęganie Fmoc, Alloc-Aaa-OH oraz R11-COOH (5 równoważników) prowadzono z użyciem mieszaniny HATU-DIEA, zobacz Carpino, L.A.; El-Faham, A.; Minor, C.A.; Albericio, F., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1994, 201-203, (5:10) w DMF przez 90 min. Po sprzęganiu przeprowadzano test ninhydrynowy i jeśli był dodatni, to sprzęganie powtarzano w tych samych warunkach, a w przeciwnym przypadku dalej prowadzono proces. Przemywania między etapami usuwania grup zabezpieczających, sprzęgania i ponownego usuwania grup zabezpieczających prowadzono z użyciem DMF (5 x 0,5 min.) i CH2CI2 (5 x 0,5 min.), stosując za każdym razem 10 cm³rozpuszczalnika na 1 g żywicy.

Wprowadzanie Alloc-Aaa6-OH (7 równoważników), gdy X1 oznaczał O, prowadzono równomolową ilością DIPCDI i 0,7 równoważnika DMAP przez 2 godz. Sprzęganie to powtarzano dwukrotnie.

Usuwanie grupy Alloc prowadzono z użyciem Pd(PPh3)4 (0,1 równoważnika) w obecności PhSiH3 (10 równoważników) w atmosferze Ar, zobacz Gómez-Martinez, P.; Thieriet, N.; Albericio, F.; Guibe, F., J. Chem. Soc. Perkin I, 1999, 2871-2874.

Odwadnianie prowadzono w fazie stałej z użyciem EDC (rozpuszczalny w wodzie karbodiimid, 100 równoważników) w obecności CuCI (60 równoważników) w mieszaninie CH2CI2-DMF (10:2) przez 6 dni. EDC/CuCI stosowano przy odwadnianiu w roztworze pozostałości Thr we fragmencie nizyny. Fukase, K.; Kitazawa, M.; Sano, A.; Shimbo, K.; Horimoto, S.; Fujita, H.; Kubo, A.; Wakamiya, T.; Shibe, A., Bull. Chem. Soc. Jpn., 1992, 65, 2227-2240.

Dipeptyd Alloc-Aaa4-Aaa5-OH (5 równoważników), który wytworzono w roztworze Alloc-Aaa4-OH oraz H-Aaa5(OH,H)-OtBu z użyciem EDC z późniejszym odwodnieniem i działaniem TFA, sprzęgano z użyciem mieszaniny HATU-DIEA (5:10) przez 16 godz. i ponownie sprzęgano przez 3 godz. Stosowanie innych odczynników sprzęgających, bazujących na HOBt, takich jak HBTU lub DIPCDIHOBt, prowadziło do niecałkowitego przyłączania tego dipeptydu.

Odszczepianie zabezpieczonego peptydu od żywicy wykonywano z użyciem mieszaniny TFACH2CI2 (1:99) (5 x 30 s).

Etap cyklizacji prowadzono z użyciem mieszaniny DIPCDI-HOBt (3:3 równoważników) w mieszaninie CH2CI2-DMF przez 2 godz. Można też stosować inne sposoby, takie jak z użyciem mieszaniny PyBOP/DlEA (3:6 równoważników) w DMF.

Końcowe usuwanie grup zabezpieczających prowadzono z użyciem mieszaniny TFA-H2O (95:5) przez 1 godz.

Przykłady według wynalazku

Skróty

Skróty nazw aminokwasów oraz oznakowania peptydów stosowano według reguł Komisji Nomenklatury Biochemicznej (Commission of Biological Nomenclature) lUPAC-IUB, podanych w J. Biol. Chem., 1972, 247, 977-983. Stosowano też następujące dodatkowe skróty: 4-AcBut-OH, kwas acetoksymasłowy; AcButBut-OH, kwas 4-(4-acetoksybutanoiloksy)-masłowy; ACH, kwas a-cyjano-4-hydroksycynamonowy; Alloc, alliloksykarbonyl; Boc, tert-butyloksykarbonyl; t-Bu, tert-butyl; But-OH, kwas masłowy; CI-TrtCI-resin, chlorek 2-chlorotrytylu na żywicy; Dap, kwas 2,3-diaminopropionowy; 4-DiMeAbut-OH, kwas N,N-dimetylo-4-aminomasłowy; 3,3-DiMeBut-OH, kwas 3,3-dimetylomasłowy; DHB, kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy; Z-Dhb, kwas αβ-didehydro-aa-aminomasłowy; DIEA, N,N-diizopropyloetyloamina; DMF, N,N-dimetyloformamid; EDC, chlorowodorek 1-etylo-3-(3'-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu; Etg, etyloglicyna; ESMS, spektrometria masowa elektrospray; FABMS, spektrometria masowa bombardowania szybkimi atomami; Fmoc, 9-fluorenylometoksykarbonyl;

PL 207 121 B1

HATU, N-tlenek heksafluorofosforanu N-[(dimetyloamino)-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pirydyn-1-ylometyleno]-N-metylometanoaminiowego; HBTU, N-tlenek heksafluorofosforanu N-[(1H-benzotriazol-1-ilo)(dimetyloamino)metyleno]-N-metyIometanoaminiowego; 2-Hedo-OH, kwas 2,4-heksadienowy; Hep-OH, kwas heptanowy; HOAc, kwas octowy; HGAt, 1-hydroksy-7-azabenzotriazol (3-hydroksy-3H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pirydyna); HOBt, 1-hydroksybenzotriazol; IBut-OH, kwas izomasłowy; 3-MeButOH, kwas 3-metylomasłowy; 5-MeHex-OH, kwas 5-metyloheksanowy; MeOH, metanol; 4-MePen-OH, kwas 4-metylopentanowy; NMM, N-metylomorfolina; 4-HOBut, 4-hydroksymasłowy; (e-OH)Phe-OH, β-hydroksyfenyloalanina; Lit-OH, kwas litocholowy; Pal, kwas palmitynowy; D-Phe-OH, α,β-didehydrofenyloalanina; PyAOP, heksafluorofosforan 7-azabenzotriazol-1-ilo-N-oksy-tris(pirolidyno)fosfoniowy; PyBOP, heksafluorofosforan benzotriazol-1-ilo-N-oksy-tris(pirolidyno)fosfoniowy; SPS, synteza w fazie stałej; TFA, kwas trifluorooctowy; Tico-OH, kwas tetraeikozanowy. Symbole aminokwasów oznaczają konfigurację L, jeśli nie zaznaczono inaczej. Wszystkie proporcje rozpuszczalników są objętościowe, jeśli nie zaznaczono inaczej.

Ogólne procedury. CI-TrtCI na żywicy, zabezpieczone pochodne aminokwasowe Fmoc, HOBt, PyBOP, HATU pochodziły z firmy PerSeptive Biosystems (Framingham, USA), Bachem (Bubendorf, Szwajcaria), NovaBiochem (Laufelfingen, Szwajcaria). Aminokwasy Alloc wytwarzano zasadniczo tak, jak to opisali Dangles i in., zobacz Dangles, O.; Guibe, F.; Balavoine, G.; Lavielle, S.; Marquet, A., J. Org. Chem., 1987, 52, 4984-4993, zaś 5-MeHex-OH przez syntezę malonianową. DIEA, DIPCDI, EDC, piperydyna, TFA pochodziły z firmy Aldrich (Milwaukee, USA). DMF oraz CH2CI2 pochodziły z firmy SDS (Peypin, Francja). Acetonitryl (czystości do HPLC) pochodził z firmy ScharIau (Barcelona, Hiszpania). Wszystkie handlowe odczynniki i rozpuszczalniki używano takie, jakie otrzymano, z wyjątkiem DMF i CH2CI2, które przedmuchiwano azotem w celu usunięcia lotnych zanieczyszczeń (DMF) i przechowywano nad aktywowanymi sitami molekularnymi 4A (Merck, Darmstadt, Niemcy) (DMF) lub nad CaCl2 (CH2CI2). Roztwory reakcyjne sporządzano w kolbach okrągłodennych. Ekstrakty rozpuszczalników organicznych suszono nad bezwodnym MgSO4, a następnie usuwano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze <40°C.

Syntezy w fazie stałej prowadzono w polipropylenowych strzykawkach (20, 10 cm³), zaopatrzonych w porowaty krążek polietylenowy. Rozpuszczalniki i rozpuszczalne odczynniki usuwano przez odsysanie. Usuwanie grup Fmoc prowadzono z użyciem mieszaniny piperydyna-DMF (2:8 objętościowo) (1 x 1 min., 3 x 5 min., 1 x 10 min.). Przemywania między etapami usuwania grup zabezpieczających, sprzęgania oraz ponownego usuwania grup zabezpieczających prowadzono z użyciem DMF (5 x 0,5 min.) i CH2CI2 (5 x 0,5 min.), stosując za każdym razem 10 cm³ rozpuszczalnika na 1 g żywicy. Przekształcenia w syntezie peptydów oraz przemywania prowadzono w 25°C. Syntezy prowadzone w fazie stałej kontrolowano za pomocą HPLC półproduktów uzyskiwanych po rozszczepieniu mieszaniną TFA-H2O (9:1) przez 60 min. próbki (około 10 mg) peptydu na żywicy, na kolumnach HPLC [Kromasil C18 (warunki A-F))/C4 (warunki G, H)] w fazach odwróconych, 4,6 x 250 mm, 10 mm, pochodzących z firmy Akzo Nobel (Bohum, Szwecja). Analityczną HPLC prowadzono z użyciem aparatu Shimadzu zawierającego dwie pompy dostarczające rozpuszczalniki (model LC-6A), automatyczny zastrzykiwacz (model SIL-6B), detektor o zmiennej długości fali (model SPD-6A), układ sterujący (model SCL-6B) oraz ploter (model C-R6A). Detekcję w UV prowadzono przy 220 nm, a liniowe gradienty CH3CN (+0,036% TFA) i H2O (+0,045% TFA) prowadzono przy szybkości przepływu 1,0 cm³/min. od: (warunki A) od 1:9 do 10:0 przez 30 min.; (warunki B) od 3:7 do 10:0 przez 30 min.; (warunki C) od 1:19 do 19:1 przez 30 min.; (warunki D) od 45:55 do 90:10 przez 30 min.; (warunki E) od 45:55 do 6:4 przez 30 min.; (warunki F) izokratycznie 1:1; (warunki G) od 3:7 do 1:0 przez 30 min.; (warunki H) od 1:1 do 1:0 przez 30 min.

Analizę MALDI-TOF-MS oraz ES-MS próbek peptydów wykonywano za pomocą PerSeptive Biosystems Voyager DE RP z użyciem matryc CHCA lub DHB oraz w spektrometrze Micromass VGquattro. Próbki peptydów na żywicy hydrolizowano w 12 N wodnym roztworze HCI-kwas propionowy (1:1) w 155°C przez 1-3 godz., a próbki nie zawierające peptydów hydrolizowano 6 N wodnym roztworem HCI w 155°C przez 1 godz. Następne analizy aminokwasów wykonywano na automatycznym analizatorze Beckman System 6300. Spektroskopie ¹H-NMR (500 MHz, 200 MHz) oraz ¹³C-NMR (50 MHz) wykonywano na urządzeniach Bruker DMX-500 (11,7 T) oraz Varian Gemini 200 (4,7 T). Przesunięcia chemiczne (δ) wyrażono w częściach na milion w dół pola od sygnału TMS. Stałe sprzężenia wyrażono w hercach.

Kahalalid F (I)

P r z y k ł a d 1

H-D-Val-O-TrtCI na żywicy

PL 207 121 B1

CI-TrtCI na żywicy (1 g, 1,35 mmol) umieszczono w polipropylenowej strzykawce zaopatrzonej w polietylenowy krążek filtracyjny. Następnie żywicę przemywano CH2CI2 (5 x 0,5 min.), dodano roztwór Fmoc-D-Val-OH (92 mg, 0,27 mmol, 0,2 równoważnika) i DIEA (4,71 cm³ 2,7 mmol, 2 równoważniki) w CH2CI2 (2,5 cm³), i mieszano mieszaninę przez 1 godz. Reakcję zakończono dodając MeOH (8,00 cm³), po 15 min. mieszania. Fmoc-D-Val-O-TrtCI na żywicy poddawano następującym przemywaniem/działaniom z użyciem CH2CI2 (3 x 0,5 min.), DMF (3 x 0,5 min.), mieszaniny piperydynaCH2Cl2-DMF (1:9,5:9,5, 1 x 10 min.), mieszaniny piperydyna-DMF (1:4, 1 x 15 min.), DMF (5 x 0,5 min.), izopropanolu (2 x 1 min.), DMF (5 x 0,5 min.), MeOH (2 x 1 min.) i suszono pod próżnią. Poziom obciążenia obliczony według AAA (analiza na automatycznym analizatorze) wynosił 0,15 mmol/g.

P r z y k ł a d 2

Fmoc-D-allo-lle-D-allo-Thr(Val-Alloc)-D-allo-lle-D-Val-O-TrtCI na żywicy

Fmoc-D-allo-lle-OH (265 mg, 0,75 mmol, 5 równoważników), Fmoc-D-allo-Thr-OH (wolna grupa hydroksylowa) (256 mg, 5 równoważników) i Fmoc-D-allo-lle-OH (265 mg, 0,75 mmol, 5 równoważników) dodano kolejno do wyżej wytworzonego H-D-Val-O-TrtCI na żywicy z użyciem HATU (285 mg, 0,75 mmol, 5 równoważników) i DIEA (2,61 cm³ 1,5 mmol, 10 równoważników) w DMF (2,5 cm³). We wszystkich przypadkach po 90 min. sprzęgania test ninhydrynowy był ujemny. Usuwanie grupy Fmoc i przemywania prowadzono tak, jak to opisano w ogólnych procedurach. Alloc-Val-OH (211 mg, 1,05 mmol, 7 równoważników) sprzęgano z DIPCDI (163 mg, 1,05 mmol, 7 równoważników) w obecności DMAP (12,8 mg, 0,105 mmol, 0,7 równoważnika). Sprzęganie to powtarzano dwukrotnie w tych samych warunkach. Próbkę peptydu na żywicy poddano działaniu mieszaniny TFA-H2O (9:1) przez 60 min., a analiza HPLC (warunki A, tR 25,9 min.) surowej substancji, uzyskanej po odparowaniu, wykazała czystość >98%. ESMS, obliczono dla C45H63N5O11, 849,5. Znaleziono: m/z 850,1 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 3

5-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-Pro-Orn(Boc)-D-allo-lle-D-allo-Thr(Val-Alloc)-D-allo-lle-D-Val-O-TrtCI na żywicy

Usuwano grupę Fmoc z wyżej wytworzonego peptydu na żywicy (przykład 2) i dodawano kolejno Fmoc-Orn(Boc)-OH (341 mg, 0,75 mmol, 5 równoważników), Fmoc-D-Pro-OH (253 mg, 0,75 mmol, 5 równoważników), Fmoc-D-Val-OH (255 mg, 0,75 mmol, 5 równoważników), Fmoc-Val-OH (255 mg, 0,75 mmol, 5 równoważników), Fmoc-Thr(tBu)-OH (298 mg, 0,75 mmol, 5 równoważników), Fmoc-D-Val-OH (255 mg, 0,75 mmol, 5 równoważników) i 5 MeHex-OH (98 mg, 0,75 mmol, 5 równoważników) z użyciem HATU (285 mg, 0,75 mmol, 5 równoważników) i DIEA (2,61 cm³ 1,5 mmol, 10 równoważników) w DMF (2,5 cm³). We wszystkich przypadkach po 90 min. sprzęgania testy ninhydynowe lub chloranilowe (po przyłączeniu D-Val) były ujemne. Usuwanie grupy Fmoc i przemywania prowadzono tak, jak to opisano w ogólnych procedurach. Próbkę peptydu na żywicy poddano działaniu mieszaniny TFA-H2O (9:1) przez 60 min., a analiza HPLC (warunki B, tR 17,2 min.) surowej substancji, uzyskanej po odparowaniu, wykazała czystość >82%. EBMS, obliczono dla C66H116N12O17, 1348,9. Znaleziono: m/z 1350,0 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 4

5-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-lle-D-allo-Thr(Val-Thr-Phe-Alloc)-D-allo-lle-D-Val-O-TrtCI na żywicy

Grupę Alloc usuwano z użyciem Pd(PPh3)4 (17,3 mg, 0,015 mmol, 0,1 równoważnika) w obecności PhSiH3 (0,185 cm³, 1,5 mmol, 10 równoważników) w atmosferze Ar. Do wyżej wytworzonego peptydu na żywicy (przykład 3) dodano kolejno Fmoc-Thr-OH (wolna grupa hydroksylowa) (256 mg, 0,75 mmol, 5 równoważników) i Alloc-Phe-OH (187 mg, 0,75 mmol, 5 równoważników) z użyciem HATU (285 mg, 0,75 mmol, 5 równoważników) i DIEA (2,61 cm³, 1,5 mmol, 10 równoważników) w DMF (2,5 cm³). We wszystkich przypadkach po 90 min. sprzęgania test ninhydrynowy był ujemny. Usuwanie grupy Fmoc i przemywania prowadzono tak, jak to opisano w ogólnych procedurach. Próbkę peptydu na żywicy poddano działaniu mieszaniny TFA-H2O (9:1) przez 60 min., a analiza HPLC surowej substancji, uzyskanej po odparowaniu, wykazała czystość, według HPLC, (warunki B, tR 17,8 min.) wynoszącą >70%. ESMS, obliczono dla C79H132N14O20, 1597,0. Znaleziono: m/z 1598,2 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 5

5-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-lle-D-allo-Thr(Val-Z-Dhb-Phe-H)-D-allo-lle-D-Val-O-TrtCI na żywicy (przez odwadnianie w fazie stałej)

Wyżej wytworzony peptyd na żywicy (przykład 4) poddano działaniu EDC (2,88 g, 15 mmol, 100 równoważników), CuCI (891 mg, 9 mmol, 60 równoważników) w mieszaninie CH2CI2-DMF (10:2) (12 cm³) przez 6 dni. Po dokładnych przemyciach DMF, CH2CI2 i DMF, usuwano grupę Alloc z użyPL 207 121 B1 ciem Pd(PPhi3)4 (17,3 mg, 0,015 mmol, 0,1 równoważnika) w obecności PhSiH3 (0,185 cm³, 1,5 mmol, 10 równoważników) w atmosferze Ar. Końcowe obciążenie, obliczone według AAA, wynosiło 0,11 mmol/g (92% ogólnej wydajności). Próbkę peptydu na żywicy poddano działaniu mieszaniny TFA-H2O (9:1) przez 60 min., a analiza HPLC (warunki B, tR 17,2 min.) surowej substancji po odparowaniu, wykazała czystość >70%. ESMS, obliczono dla C75H126N14O17,1495,0. Znaleziono: m/z 1496,0 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 6

5-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-lle-D-allo-Thr(Val-Z-Dhb-Phe-H)-D-allo-lle-D-Val-OH

Zabezpieczony peptyd odszczepiano od żywicy (0,5 g, 55,9 μmol) mieszaniną TFA-CH₂CI₂ (1:99) (5 x 30 s). Połączone przesącza odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem i liofilizowano, uzyskując 80,2 mg (48,5 μmol, wydajność 87%) tytułowego związku o czystości >70%, według HPLC (warunki B, tR 25,7 min.). ESMS, obliczono dla C84H142N14O19, 1651,1. Znaleziono: m/z 1652,3 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 7

Kahalalid F (I)

Zabezpieczony peptyd (przykład 6) (40,0 mg, 24 μmol) rozpuszczono w DMF (25 cm³) i dodano PyBOP (37,8 mg, 73 μmol, 3 równoważniki) oraz DIEA (2,5 cm³ 145 μmol, 6 równoważników). Mieszaninę tę mieszano przez 1 godz., a następnie usunięto rozpuszczalnik przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem. Zabezpieczony cykliczny peptyd rozpuszczono w mieszaninie TFA-H2O (19:1, 5 cm³) i mieszaninę tę mieszano przez 1 godz. Usunięto rozpuszczalnik przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie dodano H2O (5 cm³) i przeprowadzono liofilizację. Surowy produkt oczyszczono za pomocą średniociśnieniowej chromatografii (Vydac C18 15-20 μm, 300 A, 240 x 24 mm), liniowy gradient od 20% do 60% acetonitrylu (+0,05% TFA) w wodzie (+0,05% TFA) przez 5 godz. (300 cm³ każdego rozpuszczalnika), 120 cm³/godz., detekcja przy 220 nm, uzyskując tytułowy produkt (5,0 mg, 3,4 μmol, wydajność 14%). MALDI-TOF-MS, obliczono dla C75H₁₂₄N₁₄O₁₆, 1477,9. Znaleziono: m/z 1478,7 [M+H]⁺, 1500,6 [M+Na]⁺, 1516,5 [M+K]⁺. Produkt wyeluowano w analizie HPLC [warunki D (tR 12,5 min.), E (tR 17,4 min.) oraz F (tR 12,1 min.)] łącznie z autentyczną próbką kahalalidu F. Widmo ¹H-NMR (500 MHz, d⁶-DMSO) tego związku było identyczne z produktem naturalnym (dane przedstawiono w tablicy 1).

T a b l i c a I

Reszta	N-H	Ha	He	Inne
(Z)-Dhb	9,69 (s)	-	6,34 (q, J = 7,0 Hz)	1,26 (d, J = 7,5 Hz, γ-CHa)
D-allo-lle 1	8,82 (d, J = 10,0 Hz)	4,31	1,73	1,31, 1,02, 0,77 (Y-CH2, Y-CH3, δ-CHa)
L-Phe	8,79 (d, J = 5,5 Hz)	4,42	2,93 (m)	7,20 (1H Ar, m), 7,28 (4H Ar, m)
D-allo-Thr	8,56 (d, J = 8,0 Hz)	4,53	4,96 (m)	1,07 (δ, J = 6,5 Hz, Y-CH3)
D-Val 3	8,10 (d, J = 8,5 Hz)	4,26	1,94	0,86 (2Y-CH3)
L-Om	7,95 (d, J = 8,5 Hz)	4,49	1,48 (2H)	1,67 (Y-CH2), 2,74 (szeroki s, ó-CHh), 7,69 (ε-NHs*)
D-allo-lle 2	7,90 (d)	4,37	1,69	1,30, 1,03, 0,77 (Y-CH2, Y-CH3, δ-CHs)
D-Val 5	7,88 (d)	4,23	1,96	0,84 (2-Y-CH3)
L-Thr	7,82 (d, J = 8,0 Hz)	4,26	3,97 (m)	4,88 (d, J = 5,0 Hz, OH), 0,98 (d, J = 6,5 Hz, Y-CH3)
D-Val 2	7,62 (d, J = 8,5 Hz)	4,46	2,17	0,77 (Y-CH3), 0,62 (d, J = 7,0 Hz, Y-CH3)
L-Val 4	7,57 (d, J = 8,5 Hz)	4,28	1,98	0,80 (2Y-CH3)
L-Val 1	6,76 (d, J = 9,0 Hz)	3,86	1,39	0,62 (d, J = 7,0 Hz, Y-CH3), 0,58 (d, J = 6,0 Hz, Y-CH3)
D-Pro	-	4,36	2,03, 1,87, 1,79 (β-ϋ^, Y-CH2), 3,76 (1H, m, &CH2), 3,53 (1H, m, -CH2)
5-MeHex	-	2,13 (2H)	1,47 (e-CH2, δ-CH), 1,11 (Y-CH2), 0,82 (2 ε-CHa)

PL 207 121 B1

P r z y k ł a d 7bis

5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Uzyskany jako produkt uboczny podczas wytwarzania (racemizacja podczas etapu cyklizacji) w przykładzie 7. Produkt ten scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 17,4 min., warunki B) i ESMS; obliczono dla C75H124N14O16, 1477,9. Znaleziono: m/z 1501,3 [M+Na]⁺, 1517,3 [M+K]⁺.

Kahalalid F (I)

P r z y k ł a d 8

Alloc-Phe-Thr-OtBu

H-Thr-OtBu-HCI (3,1 g, 15 mmol, 1,3 równoważnika) rozpuszczono w CH2CI2 (30 cm³) oraz dodano DIEA (2,9 cm³, 17 mmol, 1,5 równoważnika) i mieszaninę tę mieszano przez 30 min. Następnie dodano Alloc-Phe-OH (2,8 g, 1 mmol, 1 równoważnik) oraz EDC (2,8 g, 15 mmol, 1,3 równoważnika) w CH2CI2 (35 cm³) i mieszano mieszaninę reakcyjną przez 18 godzin. Organiczną mieszaninę reakcyjną przemyto H2O (3 x 25 cm³), wysuszono (MgSO4) i zatężono w próżni. Wytworzony olej (4,12 g) oczyszczono przez chromatografię flash [CHCI3-MeOH-HOAc (9:1:0,2), uzyskując tytułowy produkt (3,25 g, 8 mmol, wydajność 71%), który scharakteryzowano za pomocą analitycznej HPLC (tR 20,9 min., czystość >98%, warunki C); ESMS, obliczono dla C21H30N2O6, 406,2. Znaleziono: m/z 408,0

[M+H]⁺; ¹H-NMR (200 MHz, CDCI3): 7,1-7,3 (5H, m, Ar); 6,89 (1H, d, J = 8,8 Hz, NH); 5,7-5,9 (1H, m,

CH allil); 5,56 (1H, d, J = 8,0 Hz, OH); 5,2-5,3 (2H, m, CH₂ γ-allil); 4,52 (2H, d, J = 5,4 Hz, CH₂ α-allil); 4,45 (1H, dd, J = 8,4 Hz, 2,8 Hz, α-CH Thr); 4,22 (1H, dq, J = 6,2 Hz, J = 3,0 Hz, β-CH Phr); 3,0-3,2 (2H, m, e-CH₂ Phe); 1,47 (9H, s, tBu); 1,15 (3H, d, J = 6,6 Hz, y-CH₃ Thr); ¹³C-NMR (50 MHz CDCI₃):

172.2 (CO), 169,5 (CO); 156,0 (CO); 136,1 (Cq, Ar); 132,5 (CH, allil); 129,3 (CH, Ar); 128,5 (CH, Ar); 126,9 (CH, Ar); 117,7 (CH₂, allil); 82,7 (Cq, tBu); 68,5 (β-CH Thr); 65,9 (CH₂, allil); 58,0 (α-CH Thr);

56.2 (α-CH Phe); 38,3 (e-CH₂ Phe); 28,0 (CH3, tBu); 20,8 (γ-CH Thr).

P r z y k ł a d 9

Alloc-Phe-Z-Dhb-OtBu

Alloc-Phe-Thr-OtBu (3,25 g, 8,0 mmol), EDC (9,90 g, 52 mmol, 6,5 równoważnika) i CuCI (2,14 g, 22 mmol, 2,7 mmol, 2,7 równoważnika) rozpuszczono w mieszaninie CH2CI2 i bezwodnego DMF (65 cm³, 12:1) w atmosferze N2 i mieszaninę tę mieszano przez 2 dni w atmosferze N2. Usunięto organiczny rozpuszczalnik pod próżnią, a pozostałość rozprowadzono w nasyconym roztworze EDTA (100 cm³), który wyekstrahowano EtOAc (3 x 50 cm³). Połączone roztwory organiczne przemyto roztworem soli (3 x 60 cm³), osuszono (MgSO4) i zatężono w próżni, uzyskując jasnożółte ciało stałe (2,8 g), które oczyszczono przez chromatografię flash [CHCI3-MeOH-HOAc (9:1:0,1)], otrzymując tytułowy produkt (2,6 g, 6,7 mmol, wydajność 84%), który scharakteryzowano za pomocą analityczną HPLC (tR 23,1 min., czystość >95%; warunki B); ESMS, obliczono dla C21H28N2O5, 388,2. Znaleziono: m/z 389,6 [M+H]⁺; ¹H-NMR (200 MHz, CDCI3): 7,2-7,4 (5H, m, Ar); 6,69 (1H, q, J = 7,4 Hz, CH Dhb); 5,8-6,0 (1H, m, CH, allil); 5,2-5,3 (2H, m, CH₂ γ-allil); 4,5-4,6 (2H, m, α-CH allil); 3,1-3,3 (2H, m, β-CH Phe); 1,67 (3H, d, J = 7,2 Hz, CH3 Dhb); 1,47 (9H, s, tBu); ¹³C-NMR (50 MHz, CDCI3): 168,9 (CO);

163.1 (CO), 156,0 (CO); 136,0 (Cq, Ar); 132,6, 132,3 (CH, allil; β-CH Dhb); 129,3 (CH, Ar); 128,7 (CH, Ar); 127,0 (CH, Ar); 117,9 (CH₂, allil); 81,7 (Cq, tBu); 66,0 (CH₂, allil); 56,3 (α-CH Phe); 38,2 (e-CH₂ Phe); 28,0 (CH₃, tBu); 14,7 (CH₃ Dhb).

P r z y k ł a d 10

Alloc-Phe-Z-Dhb-OH

Alloc-Phe-Z-Dhb-OtBu (2,6 g, 6,7 mmol) rozpuszczono w mieszaninie TFA-CH2CI2-H2O (90:8:2, 5,5 cm³) i mieszaninę mieszano przez 3 godz. Organiczną mieszaninę reakcyjną zatężono w próżni, uzyskując tytułowy produkt (2,2 g, 6,6, mmol, wydajność 99%), który scharakteryzowano za pomocą analityczną HPLC (tR 17,0 min., czystość >95%; warunki C); ESMS, obliczono dla C17H20N2O5, 332,1. Znaleziono: m/z 333,7 [M+H]⁺; ¹H-NMR (200 MHz, CD3OD): 7,2-7,3 (5H, m. Ar); 6,84 (1H, q, J = 7,2 Hz, CH Dhb); 5,8-6,0 (1H, m, CH allil); 5,1-5,3 (2H, m, CH2, γ-allil); 4,4-4,5 (2H, m, α-CH allil); 3,2-3,3 (1H, m, e-CH2 Phe); 2,8-3,0 (1H, m, β-CH Phe); 1,66 (3H, d, J = 7,4 Hz, CH3 Dhb); ¹³C-NMR (50 MHz, CD3OD): 173,1 (CO); 138,5 (Cq, Ar); 136,7; 134,1 (CH, allil; β-CH Dhb); 130,3 (CH, Ar); 129,4 (CH, Ar); 127,7 (CH, Ar); 117,4 (CH₂, allil); 66,6 (CH₂, allil); 57,8 (α-CH Phe); 39,1 (β-CH Phe);

14.1 (CH3 Dhb).

P r z y k ł a d 11

5-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-lle-D-allo-Thr(Val-Alloc)-D-allo-lle-DVal-O-TrtCI na żywicy

PL 207 121 B1

CI-TrtCI na żywicy (0,45 g, 1,35 mmol/g) umieszczono w polipropylenowej strzykawce o pojemności 10 cm³, zaopatrzonej w polietylenowy krążek filtracyjny. Uzyskano peptyd na żywicy według takiej samej procedury, jak opisana w przykładach 1-3, z tym wyjątkiem, że przy sprzęganiu pierwszego aminokwasu (Fmoc-D-Val-Val-OH) z żywicą stosowano 0,3 równoważnika zamiast 0,2 równoważnika. Początkowe obciążenie, obliczone według AAA, wynosiło 0,29 mmol/g. Po sprzęganiu aminokwasów, próbkę peptydu na żywicy poddano działaniu mieszaniny TFA-H2O (9:1) przez 60 min., a analiza HPLC (warunki B, tR, 17,3 min.) surowej substancji po odparowaniu, wykazała czystość >80%. ESMS, obliczono dla C66H116N12O17, 1348,9. Znaleziono: m/z 1350,1 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 12

5-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-lle-D-allo-Thr(Val-Z-Dhb-Phe-Alloc)D-allo-lle-D-Val-O-ThrCI na żywicy (przez przyłączanie dipeptydu)

Peptyd na żywicy poddano działaniu Pd(PPh3)4 (15,1 mg, 0,013 mmol, 0,1 równoważnika) w obecności PhSiH3 (0,161 cm³, 1,3 mmol, 10 równoważników) w atmosferze Ar w celu usunię cia grupy Alloc. Alloc-Phe-Z-Dhb-OH (217 mg, 0,65 mmol, 5 równoważników) oraz HATU (249 mg, 0,65 mmol, 5 równoważników) rozpuszczono w DMF (1,25 cm³) i dodano do peptydu na żywicy, a następnie dodano DIEA (0,228 cm³ 1,3 mmol, 10 równoważników) i mieszano tę mieszaninę przez noc. Po przemyciach powtarzano sprzęganie z tą samą ilością odczynników przez 3 godz., aż test ninhydrynowy był ujemny. Po przemywaniach DMF i CH2CI2 próbkę peptydu na żywicy poddano działaniu mieszaniny TFA-H2O (9:1) przez 60 min., a analiza HPLC (warunki B, tR 18,3 min.) surowej substancji po odparowaniu, wykazała czystość >80%. MALDI-TOF-MS, obliczono dla C79H130N14O19, 1579,0. Znaleziono: m/z 1580,3 [M+H]⁺ 1602,2 [M+Na]⁺, 1618,2 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 13

5-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-Pro-Orn(Boc)-D-allo-lle-D-Allo-Thr(Val-Z-Dhb-Phe-H)-Dallo-lle-D-Val-OH

Z peptydu na żywicy (przykład 12) usunięto grupę Alloc z użyciem Pd(PPh3)4 (15,1 mg, 0,013 mmol, 0,1 równoważnika) w obecności Ph-SiH3 (0,161 cm³, 1,3 mmol, 10 równoważników) w atmosferze Ar. Końcowe obciążenie, obliczone według AAA, wynosiło 0,16 mmol/g (ogólna wydajność 79%). Zabezpieczony peptyd odszczepiano od żywicy (235 g, 37,5 mmol) mieszaniną TFA-CH2CI2 (1:99) (5 x 30 s). Połączone przesącza odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem i liofilizowano, uzyskując 40,5 mg (24,5 mmol, 65%) tytułowego związku o czystości >80%, według HPLC (warunki B, tR 24,3 min.). MALDI-TOF-MS, obliczono dla C84H142N14O19, 1651,1. Znaleziono: m/z 1674,8 [M+Na]⁺, 1690 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 14

Kahalalid F (I)

Zabezpieczony peptyd (przykład 13) (38,5 mg, 23 μmol) rozpuszczono w DMF (25 cm³) i dodano PyBOP (36,4 mg, 70 μ mol, 3 równoważniki) oraz DIEA (2,4 cm³ 140 μmol, 6 równoważników). Mieszaninę tę mieszano przez 1 godz., a następnie usunięto rozpuszczalnik przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem. Zabezpieczony cykliczny peptyd rozpuszczono w mieszaninie TFA-H2O (19:1, 5 cm³) i mieszaninę tę mieszano przez 1 godz. Usunięto rozpuszczalnik przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie dodano H2O (5 cm³) i przeprowadzono liofilizację. Surowy produkt oczyszczono tak, jak to opisano w przykładzie 7, uzyskując tytułowy produkt (3,6 mg, 2,4 ąmol, wydajność 10%), który był identyczny jak produkt otrzymany w przykładzie 7.

5-MeHex-D-Val-Thr-D-Val-Val-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-DhbVal) (struktura przypisywana kahalalidowi F przez Goetza, G. i in., Tetrahedron, 1999, tom 55, strony 7739-7746).

P r z y k ł a d 15

5-MeHex-D-Val-Thr-D-Val-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) (przez odwadnianie w fazie stałej)

Prowadzono doświadczalne procedury opisane w przykładach 1-7 z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 3 przyłączono Fmoc-Val-OH do D-Pro-peptydu na żywicy, a następnie, po usunięciu grupy Fmoc, przyłączono Fmoc-D-Val-OH. Końcowe obciążenie, obliczone według AAA, wynosiło 0,106 mmol/g (ogólna wydajność 87%), wydajność rozszczepienia wynosiła 83%, i otrzymano 4,7 mg tytułowego związku, co stanowi 13% ogólnej wydajności etapów cyklizacji, usuwania grup zabezpieczających i oczyszczania. Produkt ten wymywano w HPLC 0,8-1,9 min. później niż autentyczną próbkę kahalalidu F [warunki D (tR 13,3 zamiast 12,5 min.), E (tR 18,8 zamiast 17,4 min.) i F (tR 14,0 za22

PL 207 121 B1 miast 12,1 min.)]. MALDI-TOF-MS, obliczono dla C75H124N14O16, 1477,9. Znaleziono: m/z 1478,7 [M+H]⁺, 1500,7 [M+Na]⁺, 1516,6 [M+K]⁺.

Widmo ¹H-NMR (500 MHz, d⁶-DMSO) tego związku (tablice II i III) było różne od widma uzyskanego dla autentycznej próbki kahalalidu F. Największa różnica polegała na tym, że związek wytworzony syntetycznie wykazywał dwie konformacje wynikające z równowagi cis-trans między resztami L-Val-D-Pro, czego nie obserwowano ani w naturalnym produkcie, ani w izomerze uzyskanym w przykładzie 7.

T a b l i c a II (główny izomer - trans)

Reszta	N-H	Ha	HP	Inne
(Z)-Dhb	9,67 (s)	-	6,33 (q)	1,27 (d, J = 7,0 Hz, Y-CH3)
D-allo-lle 1	8,80 (d)	4,31	1,73	1,32, 0,77 (Y-CH2, Y-CH3, S-CHe)
L-Phe	8,78 (d, J = 5,5 Hz)	4,43	2,93 (m)	7,20 (1H Ar, m) 7,28 (4H, Ar, m)
D-allo-Thr	8,58 (d, J = 9,0 Hz)	4,53	4,95 (m)	1,07 (d, J = 6,5 Hz, Y-CH3)
L-Val 3	7,97 (d, J = 8,0 Hz)	4,34	1,94	0,84 (2Y-CH3)
L-Orn	7,77 (d, J = 8,5 Hz)	4,47	1,46 (2H)	1.66 (Y-CH2), 2,72 (szeroki s, δ-C^), 7.66 (ε-Ν^+)
D-allo-lle 2	7,87 (d, J = 8,5 Hz)	4,37	1,68	0,75 (δ-CH lub δ-CH i Y-CH3)
D-Val 5	7,90	4,22	1,95	0,85 (2 Y-CH3)
L-Thr	7,90 (d)	4,24	4,02	4,98 (OH), 1,02 (Y-CH3)
D-Val 2	7,63 (d, J = 8,5 Hz)	4,45	2,18	0,77 (Y-CH3), 0,62 (Y-CH3)
D-Val 4	7,56 (d, J = 9,0 Hz)	4,34	2,02	0,84 (Y-CH3), 0,79 (γ-CHs)
L-Val 1	6,75 (d)	3,86	1,39	0,62 (2y-CH3)
D-Pro	-	4,30	2,03, 1,81, 1,73 (P-CH2, Y-CH2), 3,73 (1H, m, ó-CHh), 3,52 (1H, m, δ-C^)
5-MeHex	-	2,08 (1H) 2,15 (1H)	1,48 (b-CH2, δ-CH), 1,11 (Y-CH2), 0,82 (2 ε-CHa)

T a b l i c a III (uboczny izomer - cis)

Reszta	N-H	Ha	HP	Inne
1	2	3	4	5
(Z)-Dhb	9,63 (s)	-	6,33 (q)	1,28 (d, J = 6,5 Hz, y-CH3)
D-allo-lle1	8,76 (d)	4,30	1,71	1,33, 0,76 (y-CH2, γ-CH, δ-CH)
L-Phe	8,78 (d, J = 5,5 Hz)	4,43	2,93 (m)	7,20 (1H Ar, m) 7,28 (4H Ar, m)
D-allo-Thr	8,58 (d, J = 9,0 Hz)	4,53	4,95 (m)	1,00 (γ-CH)
L-Val 3	8,06 (d, J = 8,5 Hz)	4,11	1,81	0,71 (γ-CH), 0,60 (γ-CHa)
L-Orn	8,37 (d, J = 9,0 Hz)	4,62	1,52 (2H)	1,64 (y-CH2), 2,78 (szeroki s, δ-CH), 7,66 (ε-ΝΗ+)
D-allo-lle 2	8,09 (d, J = 9,0 Hz)	4,42	1,64	0,77 (δ-CHa lub δ-CHa i γ-CHa)
D-Val 5	7,90	4,22	1,95	0,85 (2 y-CH3)
L-Thr	7,88 (d)	4,23	3,99	4,93 (OH),1,02 (y-CH3)
D-Val 2	7,63 (d, J = 8,5 Hz)	4,45	2,18	0,77 (γ-CH), 0,62 (γ-CH)

PL 207 121 B1 cd. tablicy III

1	2	3	4	5
D-Val 4	7,49 (d, J = 9,0 Hz)	4,34	1,94	0,79 (Y-CH3), 0,73 (Y-CH3)
L-Val 1	6,72 (d)	3,84	1,38	0,62 (2Y-CH3)
D-Pro	-	4,93	2,06, 1,89, 1,75 (P-CH2, Y-CH2), 3,3 (m, δ-C^)
5-MeHex	-	2,08 (1H) 2,15 (1H)	1,48 (P-CH2, δ-CH), 1,11 (Y-CH2), 0,82 (2 s-CHs)

P r z y k ł a d 15bis

5-MeHex-D-Val-Thr-D-Val-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Uzyskany jako produkt uboczny podczas wytwarzania (racemizacja podczas etapu cyklizacji) w przykładzie 15. Produkt ten scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 17,6 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C75H124N14O16, 1477,9. Znaleziono: m/z 1479,3 [M+H]⁺, 1501,2 [M+Na]⁺, 1517,2 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 16

5-MeHex-D-Val-Thr-D-Val-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) (przez przyłączanie dipeptydu)

Prowadzono doświadczalne procedury tak, jak to opisano w przykładach 8-14, z tym tylko wyjątkiem, że, jak w przykładzie 14, Fmoc-Val-OH przyłączono do D-Pro-peptydu na żywicy, a następnie po usunięciu grupy Fmoc przyłączono Fmoc-D-Val-OH. Końcowe obciążenie, obliczone według AAA, wynosiło 0,16 mmol/g (ogólna wydajność 79%), wydajność rozszczepienia wynosiła 78%, i uzyskano

3.4 mg tytułowego związku, co odpowiadało 10% ogólnej wydajności etapów cyklizacji, usuwania grup zabezpieczających i oczyszczania. Oczyszczony produkt był identyczny z produktem wytworzonym w przykładzie 15.

Hamann i in. Kahalalid B [5-MeHex-Tyr-cyklo(D-Ser-Phe-D-Leu-Pro-Thr-Gly]

P r z y k ł a d 17

H-Thr(tBu)-O-TrtCI na żywicy

CI-TrtCI na żywicy (0,5 g, 1,35 mmol/g) umieszczono w polipropylenowej strzykawce o pojemności 10 cm³, zaopatrzonej w polietylenowy krążek filtracyjny. Następnie żywice tę przemyto CH2CI2 (5 x 0,5 min.) i dodano roztwór Fmoc-Thr(tBu)-OH (54 mg, 0,135 mmol, 0,2 równoważnika) oraz DIEA (2,35 cm³ 1,35 mmol) w CH2CI2 (1,25 cm³) i mieszano tę mieszaninę przez 1 godz. Reakcję zakończono przez dodanie MeOH (4,00 cm³), po 15 min. mieszania. Fmoc-Thr(tBu)-O-TrtCI na żywicy poddano następnie przemywaniu/działaniu CH2CI2 (3 x 0,5 min.), DMF (3 x 0,5 min.), mieszaniny piperydyna-CH2Cl2-DMF (1:9,5:9,5, 1 x 10 min.), mieszaniny piperydyna-DMF (1:4, 1 x 15 min.), DMF (5 x 0,5 min.), izopropanolu (2 x 1 min.), DMF (5 x 0,5 min.), MeOH (2 x 1 min.) i wysuszono w próżni. Obciążenie, obliczone według AAA, wynosiło 0,15 mmol/g.

P r z y k ł a d 18

5-MeHex-Tyr-Ser(Gly-H)-Phe-D-Leu-Pro-Thr-OH

Fmoc-Pro-OH (178 mg, 0,53 mmol, 7 równoważników), Fmoc-D-Leu-OH (187 mg, 0,53 mmol, 7 równoważników), Fmoc-Phe-OH (204 mg, 0,53 mmol, 7 równoważników), Fmoc-D-Ser-OH (wolna grupa hydroksylowa) (173 mg, 0,53 mmol, 7 równoważników), Fmoc-Tyr(tBu)-OH (243 mg, 0,53 mmol, 7 równoważników) i 5-MeHex-OH (69 mg, 0,53 mmol, 7 równoważników) dodano kolejno do wyżej wytworzonego H-Thr(tBu)-O-TrtCI na żywicy z użyciem DIPCDI (0,082 cm³, 0,53 mmol, 7 równoważników) i HOBt (81 mg, 0,53 mmol, 7 równoważników) w DMF (1,25 cm³). We wszystkich przypadkach z wyjątkiem D-Ser po 90 min. sprzęgania test ninhydrynowy był ujemny. Fmoc-D-Ser-OH (173 mg, 0,53 mmol, 7 równoważników) sprzęgano ponownie z użyciem HATU (201 mg, 0,53 mmol, 7 równoważników) w obecności DIEA (0,184 cm³, 1,06 mmol, 14 równoważników) w DMF przez 90 min. Usuwanie grupy Fmoc i przemywania prowadzono tak, jak to opisano w ogólnych procedurach. Boc-Gly-OH (119 mg, 0,68 mmol, 9 równoważników) sprzęgano z użyciem DIPCDI (0,105 cm³, 0,68 mmol, 9 równoważników) w obecności DMAP (8,3 mg, 68 μmol, 0,9 równoważnika) przez

2.5 godz. Sprzęganie powtarzano ze świeżymi odczynnikami przez 1,5 godz. Końcowe obciążenie wynosiło 0,10 mmol/g, co odpowiadało 77% wydajności syntezy. Niezabezpieczony peptyd odszczepiano od żywicy (525 mg, 54 μmol) mieszaniną TFA-H₂O (92:8) przez 2 godz. Połączone przesącza

PL 207 121 B1 odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem, dodano H2O (5 cm³) i liofilizowano ten roztwór, uzyskując 43,0 mg (48,0 μmol, wydajność 89%) tytułowego związku o czystości >85%, według HPLC (warunki A, tR 18,5 min.). ESMS, obliczono dla C45H65N7O12, 895,5. Znaleziono: m/z 896,6 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 19

Kahalalid B [5-MeHex-Tyr-cyklo(D-Ser-Phe-D-Leu-Pro-Thr-Gly)]

Niezabezpieczony peptyd (przykład 18) (40,5 mg, 45 μmol) rozpuszczono w DMF (48 cm³) i dodano PyBOP (70 mg, 0,135 mmol, 3 równoważniki) oraz DIEA (47 cm³, 0,271 mmol, 6 równoważników). Mieszaninę tę mieszano przez 2 godz, a następnie usunięto rozpuszczalnik przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem, dodano H2O (5 cm³) i liofilizowano ten roztwór. Surowy produkt oczyszczono przez chromatografię średniociśnieniową (Vydac C18, 15-20 um, 300 A, 240 x 24 mm), liniowy gradient od 20% do 60% acetonitrylu (+0,05% TFA) w wodzie (+0,05% TFA) przez 5 godz. (300 cm³ każdego rozpuszczalnika, 120 cm³/godz., detekcja przy 220 nm) uzyskując tytułowy produkt (8,7 mg, 9,9 umol, wydajność 22%). Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (warunki A, tR 21,6 min.) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C45H63N7O11, 877,5. Znaleziono: m/z 878,7 [M+H]⁺, 900,6 [M+Na]⁺, 916,5 [M+K]⁺. AAA: Gly 1,02 (1), Thr 0,95 (1), Phe 0,99 (1), Ser 1,00 (1), Pro 1,20 (1), Leu 1,00 (1), Tyr 0,87 (1).

P r z y k ł a d 20

5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Etg-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-4 oraz 6-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 4 Fmoc-Thr-OH zastąpiono przez Fmoc-Etg-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 16,8 min., warunki B) oraz MALDITOF-MS; obliczono dla C75H126N14O16, 1479,0. Znaleziono: m/z 1480,2 [M+H]⁺, 1502,2 [M+Na]⁺, 1518,0 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 20b

5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-D-Etg-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-4 oraz 6-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 4 Fmoc-Thr-OH zastąpiono przez Fmoc-Etg-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 17,0 min., warunki B) oraz MALDITOF-MS; obliczono dla C75H126N14O16, 1479,0. Znaleziono: m/z 1501,0 [M+Na]⁺, 1517,9 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 20c

5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-D-Thr-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-4 oraz 6-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 4 Fmoc-Thr(tBu)-OH zastąpiono przez Fmoc-D-Thr(tBu)-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 19,9 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C75H126N14O17, 1494,9. Znaleziono: m/z 1517,4 [M+Na]⁺, 1533,4

[M+K]⁺.

P r z y k ł a d 20d

5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-D-allo-Thr-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-4 oraz 6-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 4 Fmoc-Thr(tBu)-OH zastąpiono przez Fmoc-D-allo-Thr-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 18,0 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C75H126N14O17, 1474,9. Znaleziono: m/z 1496,6 [M+H]⁺, 1518,6 [M+Na]⁺, 1534 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 20e

5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-DPhe-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 4 Fmoc-Thr-OH zastąpiono przez Fmoc-D/L(b-OH)Phe-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 22,2 min., warunki B) oraz MALDITOF-MS; obliczono dla C80H126N14O16, 1538,95. Znaleziono: m/z 1540,3 [M+H]⁺, 1562,4 [M+Na]⁺, 1578,3 [M+H]⁺.

PL 207 121 B1

P r z y k ł a d 21

5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-Dpa-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tymi tylko wyjątkami, że w przykładzie 2 Fmoc-D-allo-Thr-OH zastąpiono przez Fmoc-D-Dpa(Alloc)-OH i że przed przyłączeniem Alloc-Val-OH, który przyłączano jako resztę zabezpieczonych aminokwasów, usuwano grupę Alloc z Dpa, jak to pokazano wyżej. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC oraz ESMS, obliczono dla C74H123N15O15,1461,9. Znaleziono: m/z 1463,3 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 22

But-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 3 5-MeHex zastąpiono przez But-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 14,7 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS, obliczono dla C72H118N14O16, 1435,9. Znaleziono: m/z 1459,6 [M+Na]⁺, 1475,6 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 22bis

But-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Uzyskany jako produkt uboczny podczas wytwarzania (racemizacja podczas etapu cyklizacji) w przykładzie 22. Produkt ten scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 16,0 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C72H118N14O16, 1435,9. Znaleziono: m/z 1459,5 [M+Na]⁺, 1475,5

[M+K]⁺.

P r z y k ł a d 23

3-MeBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 3 5-MeHex zastąpiono przez 3-MeBut-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 15,9 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C73H120N14O16, 1449,9. Znaleziono: m/z 1473,2 [M+Na]⁺, 1489,2 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 23bis

3- MeBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Uzyskany jako produkt uboczny podczas wytwarzania (racemizacja podczas etapu cyklizacji) w przykładzie 23. Produkt ten scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 17,0 min., warunki B) oraz ESMS; obliczono dla C73H120N14O16, 1449,9. Znaleziono: m/z 1473,3 [M+Na]⁺, 1489,4 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 24

3.3- DiMeBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 3 5-MeHex zastąpiono przez 3,3-DiMeBut-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 16,3 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C74H122N14O16, 1463,9. Znaleziono: m/z 1487,4 [M+Na]⁺, 1503,6 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 24bis

3.3- DiMeBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Uzyskany jako produkt uboczny podczas wytwarzania (racemizacja podczas etapu cyklizacji) w przykładzie 24. Produkt ten scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 17,6 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C74H122N14O16, 1463,9. Znaleziono: m/z 1487,3 [M+Na]⁺, 1503,3

[M+K]⁺.

P r z y k ł a d 25

4- MePen-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 3 5-MeHex zastąpiono przez 4-MePen-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 16,5 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C74H122N14O16, 1463,9. Znaleziono: m/z 1487,7 [M+Na]⁺, 1503,6 [M+K]⁺.

PL 207 121 B1

P r z y k ł a d 25bis

4-MePen-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Uzyskany jako produkt uboczny podczas wytwarzania (racemizacja podczas etapu cyklizacji) w przykładzie 25. Produkt ten scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 17,8 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C74H122N14O16, 1463,9. Znaleziono: m/z 1487,8 [M+Na]⁺, 1503,6

[M+K]⁺.

P r z y k ł a d 26

Hep-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 3 5-MeHex zastąpiono przez Hep-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 17,5 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C75H124N14O16, 1477,9. Znaleziono: m/z 1501,4 [M+Na]⁺, 1517,5 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 26bis

Hep-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Uzyskany jako produkt uboczny podczas wytwarzania (racemizacja podczas etapu cyklizacji) w przykładzie 26. Produkt ten scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 18,9 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C75H124N14O16, 1477,9. Znaleziono: m/z 1501,6 [M+Na]⁺, 1517,7

[M+K]⁺.

P r z y k ł a d 27

Pal-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 3 5-MeHex zastąpiono przez Pal-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 22,1 min., warunki G) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C84H142N14O16, 1603,1. Znaleziono: m/z 1626,9 [M+Na]⁺, 642,9 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 27bis

Pal-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Uzyskany jako produkt uboczny podczas wytwarzania (racemizacja podczas etapu cyklizacji) w przykładzie 27. Produkt ten scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 23,2 min., warunki G) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C84H142N14O16, 1603,1. Znaleziono: m/z 1626,8 [M+Na]⁺, 1642,8

[M+K]⁺.

P r z y k ł a d 27a

4-DiMeABut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 3 5-MeHex zastąpiono przez 4-DiMeABut-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 12,0 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C74H123N15O16, 1477,9. Znaleziono: m/z 1478,6 [M+H]⁺, 1500,6 [M+Na]⁺, 1516,6 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 27b

2-Hedo-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 3 5-MeHex zastąpiono przez 2-Hedo-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 15,8 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C74H118N14O16, 1458,9. Znaleziono: m/z 1460,0 [M+H]⁺, 1482,0 [M+Na]⁺, 1497,9 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 27c

4-AcBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 3 5-MeHex zastąpiono przez 4-AcBut-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 18,2 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C74H120N14O18, 1492,9. Znaleziono: m/z 1493,7 [M+H]⁺, 1515,8 [M+Na]⁺, 1531,7 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 27d

4-HOBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

PL 207 121 B1

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 3 5-MeHex zastąpiono przez 4-HOBut-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 16,6 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C72H118N14O17, 1450,9. Znaleziono: m/z 1451,6 [M+H]⁺, 1473,6 [M+Na]⁺, 1489,6 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 27e

Ac-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 3 5-MeHex zastąpiono przez HOAc. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 17,0 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C70H114N14O16, 1406,9. Znaleziono: m/z 1407,8 [M+H]⁺, 1429,8 [M+Na]⁺.

P r z y k ł a d 27f

TFA-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Uzyskany jako produkt uboczny podczas wytwarzania (trifluoroacetylowanie podczas etapu cyklizacji) w przykładzie 27e. Produkt ten scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 14,7 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C70H111F3N14O16, 1460,8. Znaleziono: m/z 1462,0 [M+n]⁺, 1484,1 [M+Na]⁺, 1500,0 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 27g

AcButBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 3 5-MeHex zastąpiono przez AcButButOH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 14,1 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C78H126N14O20, 1578,9. Znaleziono: m/z 1581,2 [M+H]⁺, 1602,2 [M+Na]⁺, 1618,2 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 27h

IBut-D-allo-lle-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tymi tylko wyjątkami, że w przykładzie 3 5-MeHex zastąpiono przez Fmoc-D-allo-lleOH, usunięto grupę Fmoc i acylowano z użyciem IBut-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 15,3 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C78H129N15O17, 1548,0. Znaleziono: m/z 1548,8 [M+H]⁺, 1570,8 [M+Na]⁺, 1586,8 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 27i

Lit-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 3 5-MeHex zastąpiono przez Lit-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 13,1 min., warunki H) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C92H150N14O17, 1723,1. Znaleziono: m/z 1724,6 [M+H]⁺, 1746,6 [M+Na]⁺, 1761,5 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 27j

TFA-Lit-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Uzyskany jako produkt uboczny podczas wytwarzania (przyłączanie jonu trifluoroacetylowego podczas etapu cyklizacji) w przykładzie 27i. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 17,1 min., warunki H) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C94H159N14O18, 1819,1. Znaleziono: m/z 1820,6 [M+H]⁺, 1842,6 [M+Na]⁺, 1858,6 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 27k

Tlco-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tym tylko wyjątkiem, że w przykładzie 3 5-MeHex zastąpiono przez Tlco-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 16,8 min., warunki H) oraz ESMS; obliczono dla C92H158N14O16, 1715,2. Znaleziono: m/z 858,2 [M+H]⁺, 1171,8 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 28

H-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury prowadzono tak, jak to opisano w przykładach 1-7, rozpoczynając od 200 mg żywicy, z tymi tylko wyjątkami, że w przykładzie 3 nie przyłączano 5-MeHex. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 11,6 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C68H112N14O15, 1364,8. Znaleziono: m/z 1388,3 [M+Na]⁺, 1404,3 [M+K]⁺.

PL 207 121 B1

P r z y k ł a d 28bis

H-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) Uzyskany jako produkt uboczny podczas wytwarzania (racemizacja podczas etapu cyklizacji) w przykładzie 28. Produkt ten scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 12,9 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C68H112N14O15, 1364,8. Znaleziono: m/z 1388,4 [M+Na]⁺, 1404,4

[M+K]⁺.

P r z y k ł a d 29

5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) Doświadczalne procedury zasadniczo takie, jak opisane w przykładach 1-7, ale według schematu 2.

Schemat 2

Syntezę rozpoczynano od 200 mg żywicy i nie przyłączano Fmoc-Orn(Boc)-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 23,9 min., warunki A) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C70H114N12O15, 1362,9. Znaleziono: m/z 1386,4 [M+Na]⁺, 1402,4 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 29bis

5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Uzyskany jako produkt uboczny podczas wytwarzania (racemizacja podczas etapu cyklizacji) w przykładzie 29. Produkt ten scharakteryzowano za pomocą HPLC oraz MALDI-TOF-MS.

P r z y k ł a d 30

5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury zasadniczo takie, jak opisane w przykładach 1-7, ale według schematu 2. Syntezę rozpoczynano od 200 mg żywicy i nie przyłączano Fmoc-Orn(Boc)-OH ani Fmoc-DPro-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 20,3 min., warunki B) oraz MALDI-TOFMS; obliczono dla C65H107N11O14, 1265,8. Znaleziono: m/z 1288,5 [M+Na]⁺, 1304,5 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 31

5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury zasadniczo takie, jak opisane w przykładach 1-7, ale według schematu 2. Syntezę rozpoczynano od 200 mg żywicy i nie przyłączano Fmoc-Orn(Boc)-OH, Fmoc-D-ProPL 207 121 B1

OH, ani Fmoc-D-Val-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 20,0 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C60H98N10O13, 1166,7. Znaleziono: m/z 1190,9 [M+Na]⁺, 1206,9

[M+K]⁺.

P r z y k ł a d 32

5-MeHex-D-Val-Thr-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury zasadniczo takie, jak opisane w przykładach 1-7, ale według schematu 2. Syntezę rozpoczynano od 200 mg żywicy i nie przyłączano Fmoc-Orn(Boc)-OH, Fmoc-D-ProOH, Fmoc-D-Val-OH, ani Fmoc-Val-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 24,6 min., warunki A) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C55H89N9O12, 1067,7. Znaleziono: m/z 1068,7 [M+H]⁺, 1090,6 [M+Na]⁺, 1106,5 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 33

5-MeHex-D-Val-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury zasadniczo takie, jak opisane w przykładach 1-7, ale według schematu 2. Syntezę rozpoczynano od 200 mg żywicy i nie przyłączano Fmoc-Orn(Boc)-OH, Fmoc-D-ProOH, Fmoc-D-Val-OH, ani Fmoc-Thr(tBu)-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 19,8 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C51H82N8O10, 966,6. Znaleziono: m/z 990,7 [M+Na]⁺, 1007,2 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 34

5-MeHex-D-allo-lle-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury zasadniczo takie, jak opisane w przykładach 1-7, ale według schematu 2. Syntezę rozpoczynano od 200 mg żywicy i nie przyłączano Fmoc-Orn(Boc)-OH, Fmoc-D-ProOH, Fmoc-D-Val-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, ani Fmoc-D-Val-OH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 22,0 min., warunki B) oraz MALDI-TOF-MS; obliczono dla C46 H73N7O9,

867,6. Znaleziono: m/z 890,6 [M+Na]⁺, 906,6 [M+K]⁺.

P r z y k ł a d 35

5-MeHex-cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)

Doświadczalne procedury zasadniczo takie, jak opisane w przykładach 1-7, ale według schematu 2. Syntezę rozpoczynano od 200 mg żywicy i nie przyłączano Fmoc-D-allo-lle-OH, FmocOrn(Boc)-OH, Fmoc-D-Pro-OH, Fmoc-D-Val-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, ani Fmoc-D-ValOH. Produkt scharakteryzowano za pomocą HPLC (tR 17,1 min., warunki B) oraz ESMS; obliczono dla C40H62N6O8, 754,5. Znaleziono: m/z 755,7 [M+H]⁺, 777,7 [M+Na]⁺, 793,7 [M+K]⁺.

Czynność biologiczna

Biologiczne działanie związków według wynalazku udowadniają wyniki, zamieszczone w następujących tablicach, uzyskane według metodologii Berjerona i in., Biochem, and Bioph. Res. Comm., 1984, 121, 3, 848-854. Liniami komórkowymi są: P388, chłoniak mysi; A549, rak płuc człowieka; HT29, rak okrężnicy człowieka; MEL-28, czerniak człowieka; DU-145, rak gruczołu krokowego człowieka.

T a b l i c a

Związki pokrewne kahalalidowi F

Związek	Pierścień	Łańcuch**	MW
1	2	3	4
27j	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: TFA-Lit-	1820
27i	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: litocholil (Lit.)	1724
27	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: palmitoil Palm	1604
27bis	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: palmitoil Palm	1604
27g	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: 4-(4-acetoksybutanoiloksy)-butyryl (AcButBut-)	1579
27h	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	IBut-D-allo-lle-D-Val-L-Thr-L-Val-D- Val-D-Pro-L-Orn-D-allo-lle-	1548
20e	cykIo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-D-Phe-ValD-Phe: a,P-didehydrofenyloalanina	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D- Pro-L-Orn-D-allo-lle-	1539

PL 207 121 B1 cd. tablicy

1	2	3	4
20c	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Thr-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D- Pro-L-Orn-D-allo-lle-	1495
27c	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: 4-acetoksybutyryl (4-AcBut)	1493
20	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-L-Etg-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D- Pro-L-Orn-D-allo-lle-	1479
20b	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-D-Etg-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D- Pro-L-Orn-D-allo-Ile-	1479
27a	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: N,N-dimetylo-4-aminobutyryl (4-DiMeABut)	1478
(w/g Scheu- era)	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-D-Val-L-Val-D- Pro-L-Orn-D-allo-lle-	1477
15bis	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-D-Val-L-Val-D- Pro-L-Orn-D-allo-lle-	1477
26	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: heptanoil (Hep)	1477
26bis	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: heptanoil (Hep)	1477
(Reinhart)	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-VaI-D- Pro-L-Orn-D-allo-lle-	1477
7bis	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D- Pro-L-Orn-D-allo-lle-	1477
24	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: 3,3-dimetylobutyryl (3,3-DiMeBut)	1463
24bis	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: 3,3-dimetylobutyryl (3,3-DiMeBut)	1463
25	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: 3-metylopentanoil (4-MePen)	1463
25bis	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: 3-metylopentanoil (4-MePen)	1463
27f	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: trifluoroacetyl (TFA)	1461
27b	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: 2,4-heksadienoil (Hedo)	1459
27d	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: 4-hydroksybutyryl	1451
23	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: 3-metylobutyryl (3-MetBut)	1451
23b	cyklo(D-alIo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: 3-metylobutyryl (3-MetBut)	1451
22	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: butyryl (But)	1435
22b	cykIo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: butyryl	1435
27c	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: acetyl	1407
28	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: bez kwasu tłuszczowego	1365
28bis	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	Zakończenie: bez kwasu tłuszczowego	1365
29	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-VaI-D- Pro-D-allo-lle-	1363

PL 207 121 B1 cd. tablicy

1	2	3	4
29bis	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D- Pro-D-allo-lle-	1363
31	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-allo-lle-	1167
32	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-VaI-L-Thr-D-allo-lle-	1068
19	L-Phe-D-Leu-L-Pro-_-Thr-Gly-D-Ser	5-MeHex-L-Tyr-	878
34	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-D-allo-lle-	868
35	cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)	5-MeHex-	754

** Związki, dla których podano zakończenie łańcucha zawierają taki sam łańcuch, jaki występuje w związku 7, ale z podanym zastąpieniem 5-MeHex.

T a b l i c a

Cytotoksyczność związków pokrewnych kahalalidowi F Wartości IC50 (molowe) dla pochodnych

Związek	A549M	DU145M	HT29M	MEL28M	p388M
1	2	3	4	5	6
27j	5,49E-08	5,49E-08	5,49E-08	5,49E-08	2,75E-06
27i	5,80E-07	5,80E-07	2,90E-08	1,45E-07	1,45E-06
27	1,56E-07	3,12E-08	6,23E-08	6,23E-08	3,12E-06
27bis	>3,12E-06	1,56E-06	6,23E-07	6,23E-07	>3,12E-06
27g	>6,33E-07	>6,33E-07	1,58E-06	3,17E-06	>3,17E-06
27h	NA	NA	NA	NA	NA
20e	3,25E-06	6,50E-07	NA	NA	NA
20c	NA	NA	NA	NA	NA
27c	NA	NA	6,70E-07	3,35E-06	NA
20	>3,38E-06	>3,38E-06	>3,38E-06	>3,38E-06	>3,38E-06
20b	>3,38E-06	>3,38E-06	>3,38E-06	>3,38E-06	>3,38E-06
27a	NA	NA	NA	NA	NA
(w/g Scheuera) 15	>3,39E-06	3,39E-06	3,39E-06	>3,39E-06	>3,39E-06
15bis	>3,39E-06	>3,39E-06	>3,39E-06	>3,39E-03	>3,39E-06
26	3,39E-07	3,39E-06	6,77E-07	1,69E-03	3,39E-06
26bis	>3,39E-06	>3,39E-06	3,39E-07	1,69E-03	>3,39E-06
(Reinhart) 7	3,39E-07	1,69E-07	3,39E-08	3,39E-04	>3,39E-06
7bis	>3,39E-06	>3,39E-06	>3,39E-06	>3,39E-03	>3,39E-06
24	1,71 E-06	3,42E-07	3,42E-07	3,42E-03	>3,42E-06
24bis	>3,42E-06	>3,42E-07	3,42E-07	>3,42E-03	>3,42E-06
25	3,42E-07	3,42E-07	>3,42E-06	>3,42E-03	>3,42E-06
25bis	>3,42E-06	>3,42E-06	>3,42E-06	>3,42E-06	>3,42E-06

PL 207 121 B1 cd. tablicy

1	2	3	4	5	6
27f	NA	3,42E-06	>3,42E-06	3,42E-06	3,42E-06
27b	3,42E-06	6,85E-07	3,43E-06	NA	NA
27d	NA	NA	NA	NA	NA
23	>3,45E-06	>3,45E-07	>3,45E-08	>3,45E-07	>3,45E-06
23b	>3,45E-06	>3,45E-06	>3,45E-06	>3,45E-06	>3,45E-06
22	>3,48E-06	1,74E-06	NA	NA	NA
22b	>3,48E-06	>3,48E-06	1,74E-06	>3,48E-06	>3,48E-06
27c	NA	>3,55E-06	>3,55E-06	>3,55E-06	>3,55E-06
28	>3,66E-06	>3,66E-06	>3,66E-06	>3,66E-06	>3,66E-06
28bis	>3,66E-06	>3,66E-06	NA	NA	NA
29	>3,67E-06	>3,67E-06	>3,67E-06	>3,67E-06	>3,67E-06
29bis	>3,67E-06	>3,67E-06	>3,67E-06	>3,67E-06	>3,67E-06
31	>4,28E-07	>4,28E-08	>4,28E-06	>4,28E-06	>4,28E-06
32	NA	NA	4,68E-08	4,68E-08	>4,68E-06
19	>5,69E-06	>5,69E-06	NA	NA	NA
34	NA	NA	>5,76E-06	>5,76E-06	>5,76E-06
35	>5,76E-06	>5,76E-06	>5,76E-06	>5,76E-06	>5,76E-06

Bibliografia

Hamann, M.T.; Scheuer, P.J., J. Am. Chem. Soc, 1993, “Kahalalide F: a Bioactive Depepsipeptide from the Sacoglossan Mollusk Elysia refescens and the Green Alga Bryopsis sp.”, tom 115, strony 5825-5826.

Hamann, M.T. i in. J. Org. Chem., 1996, “Kahalalides: Bioactive Peptides from Marinee Mollusk Elysia rufescens and its Algal Diet Bryopsis sp.”, tom 61, strony 6594-6660.

Garcia-Rocha, M. i in., Cancer Lett., 1996 “The Antitumoral Compounds Kahalalide F Acts on Cell Lysosomes”, tom 99, strony 43-50.

Hamann, M.T. i in., J. Org. Chem., 1998, “Kahalalides: Bioactive Peptides from Marine Mollusk Elysia refescens and its Algal Diet Bryopsis sp.”, tom, 63, strona 485 (poprawka artykułu z J. Org. Chem., 1996, tom 61, strony 6594-6660).

Llyod-Williams, P. i in., Chemical Approaches to the Synthiesis of Peptides and Proteins, CRC Press, Boca Raton (USA), 1997.

Goetz, G i in., J. Nat. Prod., 1997, “Two Acyclic Katalalides from the Sacoglossan Mollusk Elysia rufescens”, tom 60, strony 562-567.

Goetz, G. i in., Tetrahedron, 1999, “The Absolute Stereochemistry of Kahalalide F”. tom 55, strony 7739-7746.

Kan, Y. i in., J. Nat. Prod., 1999, tom 62, strony 1169-1172.

Horgen, F.D. i in., J. Nat. Prod., 2000, tom 63, strony 152-154.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Związek kahalalidowy o wzorze (II) w którym, w cyklicznej części struktury, podstawniki R1, R2, R3, R4, R5, R6, X1 oraz X2, niezależnie od siebie są wybrane tak, że Aaa-1 oznacza D-allo-Thr, Aaa-2 oznacza D-allo-lle, Aaa-3 oznacza D-Val, Aaa-4 oznacza L-Phe, Aaa-5 oznacza Z-Dhb, oraz Aaa-6 oznacza L-Val; R7 jest wybrane z grupy obejmującej H, lub grupę alkilową, arylową lub aryloalkilową ewentualnie podstawioną przez grupę hydroksylową, grupę merkaptanową, grupę aminową, grupę guanidynową, lub halogenem; tak że Aaa-7 oznacza aminokwas o konfiguracji L lub D, jeśli stosowne; zaś R8 jest wybrane spośród wzoru III, IV lub V:

w których każda grupa R9, R10 oraz R11 niezależnie od siebie oznacza H lub grupę alkilową, arylową lub aryloalkilową ewentualnie podstawioną przez grupę hydroksylową, grupę merkaptanową, grupę aminową, grupę guanidynową, grupę karboksylową, grupę karboksyamidową lub halogenem; przy czym R9 oraz R10 mogą tworzyć część tego samego pierścienia; zaś n wynosi od 0 do 6; pod warunkiem, że związek o wzorze II nie jest 5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-L-Orn-D-allo-llecyclo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-L-Phe-Z-Dhb-L-Val).
2. Związek według zastrz. 1, w którym R7 oznacza ewentualnie podstawioną grupę alkilową.
3. Związek według zastrz. 1, w którym R9 oznacza ewentualnie podstawioną grupę alkilową.
4. Związek według zastrz. 1, w którym R11 oznacza ewentualnie podstawioną grupę C1-C20alkilową.

PL 207 121 B1
5. Związek według zastrz. 1, w którym część cykliczna i łańcuch boczny są jak podano część cykliczna łańcuch boczny** cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) Grupa terminalna: palmitoil (Palm) cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-L-Dhb-Val) 5-MeHex-D-Val-L-Thr-D-Val-L-Val-D-Pro-L-Orn-D-allo-lle- cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) Grupa terminalna: heptanoil (Hep) cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val Grupa terminalna: 3,3-dimetylobutyryl (3,3-DiMeBut) cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) Grupa terminalna: 4-metylopentanoil (4-MePen) cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) Grupa terminalna: 3-metylobutyryl (3-MetBut) cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) Grupa terminalna: butyryl (But) cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) 5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-D-allo-lle- cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) 5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Allo-lle- cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) 5-MeHex-D-Val-L-Thr-D-allo-lle- cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) 5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-allo-lle- cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) 5-MeHex-D-Val-D-allo-lle- ** związek, w których łańcuch boczny jest określony grupą terminalną ma łańcuch 5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-LOrn-D-allo-lle, lecz ze wskazaną grupą terminalną zamiast podstawnika 5-MeHex.
6. Związek według zastrz. 1, w którym część cykliczna i łańcuch boczny są jak podano część cykliczna łańcuch boczny** cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) IBut-D-allo-lle-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-L-Orn-D-allo-lle- cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) Tico-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-L-Orn-D-allo-lle- cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) 5-MeHex-D-allo-lle- cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) 5-MeHex- cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) Grupa terminalna: N,N-dimetylo-4-aminobutyryl (4-DiMeABut) cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) Grupa terminalna: trifluoroacetyl (TFA) cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) Grupa terminalna: 4-hydroksybutyryl cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) Grupa terminalna: acetyl ** związek, w których łańcuch boczny jest określony grupą terminalną ma łańcuch 5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-LOrn-D-allo-lle, lecz ze wskazaną grupą terminalną zamiast podstawnika 5-MeHex.
7. Związek według zastrz. 1, w którym część cykliczna i łańcuch boczny są jak podano część cykliczna łańcuch boczny** cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) Grupa terminalna: TFA-Lit- cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) Grupa terminalna: litocholoil (Lit) cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) Grupa terminalna: 4-(4-acetoksybutanoiloksy)butyryl (AcButBut) cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) Grupa terminalna: 4-acetoksybutyryl (4AcBut) cyklo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val) Grupa terminalna: 2,4-heksadienoil (Hedo) ** związek, w których łańcuch boczny jest określony grupą terminalną ma łańcuch 5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-LOrn-D-allo-lle, lecz ze wskazaną grupą terminalną zamiast podstawnika 5-MeHex.

PL 207 121 B1
8. Związek według zastrz. 1, którym jest H-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyclo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val).
9. Związek według zastrz. 1, którym jest Pal-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-lle-cyclo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val).
10. Związek według zastrz. 1, którym jest TFA-Lit-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-llecyclo(D-allo-Thr-D-allo-lle-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val).
11. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera związek określony w zastrz. 1-10 łącznie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem.
12. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1-10 do wytwarzania leku do leczenia nowotworu.
13. Sposób wytwarzania związku kahalalidowego o wzorze (II) w którym, w cyklicznej części struktury, podstawniki R1, R2, R3, R4, R5, R6, X1 oraz X2, niezależnie od siebie są wybrane tak, że Aaa-1 oznacza D-allo-Thr, Aaa-2 oznacza D-allo-lle, Aaa-3 oznacza D-Val, Aaa-4 oznacza L-Phe, Aaa-5 oznacza Z-Dhb, oraz Aaa-6 oznacza L-Val; R7 jest wybrane z grupy obejmującej H, lub grupę alkilową, arylową lub aryloalkilową ewentualnie podstawioną przez grupę hydroksylową, grupę merkaptanową, grupę aminową, grupę guanidynową, lub halogenem; tak że Aaa-7 oznacza aminokwas o konfiguracji L lub D, jeśli stosowne; zaś R8 jest wybrane spośród wzoru III, IV lub V:

PL 207 121 B1 w których każda grupa R9, R10 oraz R11 niezależnie od siebie oznacza H lub grupę alkilową, arylową lub aryloalkilową ewentualnie podstawioną przez grupę hydroksylową, grupę merkaptanową, grupę aminową, grupę guanidynową, grupę karboksylową, grupę karboksyamidową lub halogenem; przy czym R9 oraz R10 mogą tworzyć część tego samego pierścienia; zaś n wynosi od 0 do 6;

znamienny tym, że prowadzi się zamknięcie pierścienia zgodnie z poniższym schematem

Rg—Aa 3γ—As 3 ί —Aa a A—Aa a 3—O H

I

RA—Χ1—Aaa₆—Aa 35—Aaaą—H

Rg-Aaay-Aaa^AaaA-Aaas

RA—X1 —Aa a θ—Aa a 5—Aa 34