JP2902115B2 - 新規アミリン作動薬ペプチドおよびその使用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 背景 本発明は、ここに参照して一体化させる、1991年３月
８日付け出願の米国特許出願第07/667040号の一部継続
出願である。

発明の分野 本発明の分野は医療、特に、低血糖症、その他糖尿病
のごときインスリン要求性状態を始め、促進されたアミ
リンの作用が有益な疾患の治療および防止である。さら
に詳しくは、本発明は、ペプチドホルモン・アミリンの
作動薬アナログ類の製造および使用に関する。

本発明の関連技術および導入の記載 糖尿病は、血中グルコースの臨床的に上昇したレベル
（高血糖症）の存在によって定義される深刻な代謝病で
ある。高血糖症のこの状態はペプチドホルモンであるイ
ンスリンの活性の相対的もしくは絶対的欠乏の結果であ
る。インスリンは膵臓のβ細胞によって産生され、分泌
される。インスリンはグルコースの利用、蛋白の合成、
および中性脂質の形成および貯蔵を促進すると報告され
ている。グルコース、すなわち炭水化物エネルギーの主
要源は、身体中でグリコーゲン、すなわち、代謝要件に
適合させるべくグルコースに変換され得る重合したグル
コースの形態で貯蔵される。通常の条件下では、インス
リンは基礎速度およびグルコース刺激による促進速度の
双方にて分泌されて、グルコースのグリコーゲンへの変
換によって代謝の恒常性を維持する。

糖尿病なる語は数個の異なる高血糖症状態を含む。こ
れらの状態はタイプ１（インスリン−依存性糖尿病また
はIDDM）およびタイプ２（インスリン非依存性糖尿病ま
たはNIDDM）の糖尿病を包含する。タイプ１糖尿病を持
つ個体に存在する高血糖症は、生理学的範囲にある血中
グルコースレベルを維持するのに十分な、インスリンの
欠乏した、減少した、または存在しないレベルと関連し
ている。タイプ１糖尿病の治療は、一般に、非経口経路
による、インスリンの置換用量の投与を含む。タイプII
糖尿病を持つ個体に存在する高血糖症は、まず、インス
リンの通常または上昇したレベルに関連する；しかしな
がら、これらの個体は、抹消組織および肝臓におけるイ
ンスリン耐性の状態のたるめおよび、病気の進行として
の、インスリンの分泌の原因となる膵臓β細胞の進行性
悪化のため、代謝的恒常性を維持することができない。
かくして、タイプ２糖尿病の最初の治療は、ダイエット
や、スルホニル尿素のごとき経口血糖低下剤での治療に
よってなされる生活スタイルの変化に基づくものであり
得る。しかしながら、特に、高血糖症をいくらか制御
し、糖尿病合併症を最小化する試みにおける、糖尿病の
後者の段階においては、インスリン療法がしばしば必要
である。かくして、多くのタイプ２糖尿病は生存のため
には究極的にインスリンを必要とする。

アミロイドは、β−シート蛋白フィラメントの細胞外
沈積物に与えられた名称である。アミロイド物質の沈積
物はタイプ２糖尿病を持つ患者の膵臓で発見されたと報
告されている。他の研究は、アミロイド沈積の程度はヒ
トにおける高血糖症の程度およびタイプ２糖尿病の重症
度に伴い増大することを示している。膵臓アミロイドの
化学分析は、ペプチドホルモンアミリンの驚くべきかつ
予期せぬ発見に導いた。クラーク・エイ（Clark,A.）
ら、ランセット（Lanscet）ii:231−234（1987）。この
ペプチドは37個のアミノ酸よりなることが発見されてお
り、そのいずれも酸性残基でなく、２位および７位にお
けるシステイン残基の間にジスルフィド結合を有し、Ｃ
−末端がアミド化されている。アミリンは、タイプ２糖
尿病を持つ患者の膵臓ランゲルハンス島で発見されたア
ミロイドの主要蛋白構成物であると報告されている。

合成分子のペプチド構造において、分子内システイン
架橋およびカルボキシル末端アミド基の双方の存在が、
骨格筋でグリコーゲン合成を阻害する最大の生物学的活
性の増大をもたらしたと報告されている。例えば、クー
パー，ジイ・ジェイ・エス（Cooper,G.J.S.）ら、プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）（USA）84:862
8−8632（1987）：クーパー，ジイ・ジェイ・エスら、
ダイアベーテス（Diabetes）、1988、ラーキンス・アー
ル、ツィメット・ピイおよびチショルム・ディ（Larkin
s.R.,Zimmet,P.＆ Chisholm,D.）（エルセビエ（Elsevi
er）、アムステルダム、496−496頁（1989））。アミリ
ンのアミノ酸配列（図１参照）は、ヒト・カルシトニン
遺伝子関連ペプチド２（CGRP−２）と46％の相同性を有
する。

１つの報告は、アミリン分子の限定されたセグメン
ト、残基20−29は、タイプ２糖尿病でのランゲルハンス
島におけるアミロイドフィブリル形成への可能な寄与体
であると述べている。グレナー（Glenner）ら、バイオ
ケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミ
ューニケーションズ（Biochem.Biophys.Res.Commun.）1
55:608−614（1988）。また、ある哺乳動物種からのア
ミリン間のアミノ酸配列の相違がこの領域で起こってい
ると報告されており、さらなる研究は、アミロイド形成
に関連した残基の同定に焦点を当ててきた。ウェスター
マーク（Westermark）ら、プロシーディングズ・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.N
atl.Acad.Sci.）（USA）87:5036−5040（1990）。ウェ
スターマーク（Westermark）らの研究は、異なる種から
のアミリン配列の種々の20−29アミノ酸ゼグメントを合
成し、続いてアミロイドフィブリルを形成するその能力
を比較する試みを報告している。ヒト・アミリンの残基
25−29は最も強力なアミロイド形成性であり、いくつか
の囓歯類種におけるごとく、28位におけるセリンの代わ
りのプロリン置換は研究したデカペプチドにおいてフィ
ブリル形成を有意に阻害することが提案されている。

アミリンは複雑なペプチドであり、アミリンの生物活
性調整物の合成は骨が折れる。また、アミリンは溶液中
で限定的な溶解度および限定的な安定性を有することが
判明している。本発明者らは、ラット・アミリンはヒト
・アミリンよりも高い溶液中溶解度および安定性を有す
ることを見い出した。これは知られていなかったにも拘
わらず、これは、幾分、異なる種からのアミリンの異な
る凝集特性によるものであろう。ヒト、非ヒト霊長類、
およびネコ類のアミリンのみが、in vivoに凝集して島
アミロイドを形成すると報告されている。今回、多数の
種から単離されたと報告されているアミリンの配列を図
２に記載する。

タイプＩ糖尿病において、アミリンのレベルは通常の
対照と比較してひどく減少しているか、あるいは存在し
ない。タイプＩ糖尿病の疾患状態において、インスリン
およびアミリンの生産者であるβ−細胞が自己免疫プロ
セスによって破壊されている。アミリンは、インスリン
誘導低血糖症を含めた、糖尿病および低血糖症の治療で
有効であることが提案されている。また、アミリンと一
緒でのインスリンの共投与は、インスリン単独の現行投
与よりも優れた療法であり、低血糖症の治療のためのグ
ルカゴンと一緒でのアミリンの共投与はグルカゴン単独
の現行投与よりも優れた療法であると提案されている。
かかる目的やその他の目的で、天然ヒト・アミリンの活
性を有するより複雑でない化合物、ならびに天然ヒト・
アミリンよりも促進された溶解度および／または安定性
を示す化合物を提供するのは有用であろう。かかる化合
物を記載し特許請求をする。

発明の概要 本発明は、ペプチドホルモン・アミリンの新規アナロ
グに指向される。これらの化合物はアミリンの効果を模
倣しており、アミリン作動薬またはアミリンの作動薬ア
ナログという。

また、本発明は、本発明の作動薬アナログよりなる医
薬組成物、およびアミリンの作動薬アナロウを（単独で
またはインスリンもしくはグルカゴンと組み合わせて）
動物に投与することを特徴とする、糖尿病のごときイン
スリン要求性状態を含めた、促進されたアミリン作用が
有益である低血糖症および他の疾患の治療法および防止
法に指向される。

定義 本明細書で用いる以下の用語は、特に断りのない限り
以下の意味を有する： 「アルキル」なる語は直鎖および分岐鎖のアルキル基
双方をいう。「低級アルキル」なる語は合計１〜６個の
炭素原子を有する直鎖および分岐鎖のアルキル基双方を
いい、第一級、第二級および第三級アルキル基を包含す
る。典型的な低級アルキルは、例えば、メチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブ
チル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンテル、ｎ−ヘキシル等を包
含する。

「アリール」なる語は、フェニルおよびナフチルのご
とき６個ないし14個の炭素原子の炭素環芳香族基、なら
びにピリジル、トリアゾロピラジン、ピリミジン等のご
とき１個ないし３個のヘテロ原子（窒素、酸素、硫黄
等）を含有する複素環芳香族基を包含する。

「アラルキル」なる語は、１個ないし４個の炭素原子
の「アルキル」基に直接結合した６個〜10個の炭素原子
の「アリール」基をいい、例えば、ベンジル、ｐ−クロ
ロベンジル、ｐ−メチルベンジル、および２−フェニル
エチルを包含する。

「シクロアルキル」とは、５ないし８個の炭素原子の
環状アルキル基をいう。

図面の簡単な説明 図１はヒト・アミリンのアミノ酸配列を示す。

図２はいくつかの哺乳動物から単離したアミリンのア
ミノ酸配列を比較したものを示す。

図３は新規アミリン動作薬ペプチドのアミノ酸配列を
示す。

発明の詳細な記載 本発明により、アミリンの新規作動薬アナログが提供
される。これらのアナログは血糖上昇薬を含めたアミリ
ンの作動薬として有用であり、図３によって示され得
る。

１の態様において、本発明は、アミノ酸配列： ［式中、 A₁はLys、Ala、Serまたは水素； B₁はAla、SerまたはThr; C₁はVal、LeuまたはIle; D₁はHisまたはArg; E₁はSerまたはThr; F₁はSer、Thr、GlnまたはAsn; G₁はAsn、GlnまたはHis; H₁はPhe、LeuまたはTyr; I₁はIle、Val、AlaまたはLeu; J₁はSer、ProまたはThr; K₁はAsn、AspまたはGln; ＸおよびＹは、独立して、相互に化学結合して分子内
架橋を形成する側鎖を有する残基から選択され、ここ
に、該分子内架橋には、ジスルフィド結合、ラクタムま
たはチオエーテル架橋が含まれ：および、Ｚはアミノ、
アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルア
ミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アルキルオ
キシ、アリールオキシまたはアラルキルオキシを意味す
る： 但し、A₁がLys、B₁がAla、C₁がVal、D₁がArg、E₁がSe
r、F₁はSer、G₁がAsn、H₁がLeu、I₁がVal、J₁がProであ
って、K₁がAsnである場合には、A₁〜K₁のうちいずれか
の１またはそれ以上はＤ−アミノ酸であって、Ｚはアル
キルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルアミ
ノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アルキルオキ
シ、アリールオキシおよびアラルキルオキシよるなる群
から選択される］ を有するアミリンの作動薬アナログ、または、治療的投
与用の形態に混合した、治療学的に有効な量の該アミリ
ンの作動薬アナログと、インスリンもしくはグルカゴン
とからなる組成物に指向される。

ＸおよびＹについての適当な側鎖は、ジスルフィド結
合を形成して得るアルキルスルフヒドリル；環状ラクタ
ムを形成し得るアルキル酸およびアルキルアミン；縮合
し、還元されてアルキルアミン架橋を形成し得るアルキ
ルアルデヒドまたはアルキルハライドおよびアルキルア
ミン；または連絡してアルキル、アルケニル、エーテル
またはチオエーテル結合を形成して得る側鎖；から由来
する基を包含する。好ましいアルキル鎖は約１個〜約６
個の炭素原子を有する低級アルキル基を包含する。

本発明の別の態様は、アミノ酸配列： ［式中、 A₁はLys、Ala、Serまたは水素； B₁はAla、SerまたはThr; C₁はVal、LeuまたはIle; D₁はHisまたはArg; E₁はSerまたはThr; F₁はSer、Thr、GlnまたはAsn; G₁はAsn、GlnまたはHis; H₁はPhe、LeuまたはTyr; I₁はIle、Val、AlaまたはLeu; J₁はSer、Pro、Leu、IieまたはThr; K₁はAsn、AspまたはGln; ＸおよびＹは、独立して、相互に化学結合して分子内
架橋を形成する側鎖を有する残基から選択され、ここ
に、該分子内架橋には、ジスルフィド結合、ラクタムま
たはチオエーテル架橋が含まれ：および、Ｚはアミノ、
アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルア
ミノ、アルールアミノ、アラルキルアミノ、アルキルオ
キシ、アリールオキシまたはアラルキルオキシを意味す
る：但し、 （ａ）A₁がLys、B₁がAla、C₁がVal、D₁がArg、E₁がSe
r、F₁はSer、G₁がAsn、H₁がLeu、I₁がVal、J₁がProであ
って、K₁がAsnである場合；または （ｂ）A₁がLys、B₁がAla、C₁がVal、D₁がHis、E₁がSe
r、F₁はAsn、G₁がAsn、H₁がLeu、I₁がVal、J₁がSerであ
って、K₁がAsnである場合には、A₁〜K₁のうちいずれか
の１またはそれ以上はＤ−アミノ酸であって、Ｚはアル
キルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルアミ
ノ、アルールアミノ、アラルキルアミノ、アルキルオキ
シ、アリールオキシおよびアラルキルオキシよるなる群
から選択される］ を有するアミリンの作動薬アナログ、または、治療的投
与用の形態に混合した、治療学的に有効な量の該アミリ
ンの作動薬アナログと、インスリンもしくはグルカゴン
とからなる組成物に指向される。

本発明のさらなる別の態様は、アミノ酸配列： ［式中、 A₁はLys、Ala、Serまたは水素； B₁はAla、SerまたはThr; C₁はVal、LeuまたはIle; D₁はHisまたはArg; E₁はSerまたはThr; F₁はSer、Thr、GlnまたはAsn; G₁はAsn、GlnまたはHis; H₁はPhe、LeuまたはTyr; I₁はAlaまたはPro; J₁はIle、Val、AlaまたはLeu; K₁はAsn、AspまたはGln; ＸおよびＹは、独立して、相互に化学結合して分子内
架橋を形成する側鎖を有する残基から選択され、ここ
に、該分子内架橋には、ジスルフィド結合、ラクタムま
たはチオエーテル架橋が含まれ：および、Ｚはアミノ、
アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルア
ミノ、アルールアミノ、アラルキルアミノ、アルキルオ
キシ、アリールオキシまたはアラルキルオキシを意味す
る：但し、A₁がLys、B₁がAla、C₁がVal、D₁がArg、E₁が
Ser、F₁はSer、G₁がAsn、H₁がLeu、I₁がPro、J₁がValで
あって、K₁がAsnである場合には、A₁〜K₁のうちいずれ
かの１またはそれ以上はＤ−アミノ酸であって、Ｚはア
ルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルアミ
ノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アルキルオキ
シ、アリールオキシおよびアラルキルオキシよるなる群
から選択される］ を有するアミリンの作動薬アナログ、または、治療的投
与用の形態に混合した、治療学的に有効な量の該アミリ
ンの作動薬アナログと、インスリンもしくはグルカゴン
とからなる組成物に指向される。

本発明のなおさらなる別の態様は、アミノ酸配列： ［式中、 A₁はLys、Ala、Serまたは水素； B₁はAla、SerまたはThr; C₁はVal、LeuまたはIle; D₁はHisまたはArg; E₁はSerまたはThr; F₁はSer、Thr、GlnまたはAsn; G₁はAsn、GlnまたはHis; H₁はPhe、LeuまたはTyr; I₁はIle、Val、AlaまたはLeu; J₁はAsn、AspまたはGln; ＸおよびＹは、独立して、相互に化学結合して分子内
架橋を形成する側鎖を有する残基から選択され、ここ
に、該分子内架橋には、ジスルフィド結合、ラクタムま
たはチオエーテル架橋が含まれ：および、Ｚはアミノ、
アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルア
ミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アルキルオ
キシ、アリールオキシまたはアラルキルオキシを意味す
る：但し、A₁がLys、B₁がAla、C₁がVal、D₁がArg、E₁が
Ser、F₁はSer、G₁がAsn、H₁がLeu、I₁がValであって、J
₁がAsnである場合には、A₁〜K₁のうちいずれかの１また
はそれ以上はＤ−アミノ酸であって、Ｚはアルキルアミ
ノ、ジアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アリー
ルアミノ、アラルキルアミノ、アルキルオキシ、アリー
ルオキシおよびアラルキルオキシよるなる群から選択さ
れる］ を有するアミリンの作動薬アナログ、または、治療的投
与用の形態に混合した、治療学的に有効な量の該アミリ
ンの作動薬アナログと、インスリンもしくはグルカゴン
とからなる組成物に指向される。

また、１またはそれを超える特定部位において個々の
アミノ酸の立体化学が（Ｌ）/Sから（Ｄ）/Rに変換され
得る前記図３作動薬アナログの生物学的活性誘導体も本
発明範囲内のものである。

また、Asn、Serおよび／またはThr残基のグリコシル
化により修飾した作動薬アナログも本発明範囲内のもの
である。

ペプチド特性をより少なく含有するアミリンの生物学
的活性作動薬アナログも本発明の範囲内のものである。
かかるペプチド模擬体は、例えば、−CO−NH−アミド結
合についての以下の１またはそれを超える置換基：デプ
シペプチド（−CO−Ｏ−）、イミノメチレン（-CH₂-NH
-）、トランス−アルケン（−CH＝CH−）、β−エナミ
ンニトリル（−Ｃ（＝CH＝CH）−NH−）、チオアミド
（−CS−NH−）、チオメチレン（-S-CH₂-または-CH₂-S
-）、メチレン（-CH₂-CH₂-）およびレトロ−アミド（−
NH−CO−）を包含し得る。

本発明の化合物は、種々の無機および有機酸および塩
基とで塩を形成する。かかる塩は有機および無機の酸、
例えば、HCl、HBr、H₂SO₄、H₃PO₄、トリフルオロ酢酸、
酢酸、ギ酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、
マレイン酸、フマル酸およびショウノウスルホン酸とで
調製した塩を包含する。塩基とで調製した塩は、例え
ば、アンモニウム塩、（ナトリウムおよびカリウム塩の
ごとき）アルカリ金属塩、（カルシウム塩およびマグネ
シウム塩のごとき）アルカリ土類金属塩を包含する。酢
酸塩、塩酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩が好ましい。

該塩は常法、例えば、生成物の遊離酸または塩基を、
該塩が不溶な溶媒または媒質、あるいは次いで凍結乾燥
によって真空中でまたは適当なイオン交換樹脂上のもう
１つのイオンについての存在する塩のイオンを交換する
ことによって除去される水のごとき溶媒中で、１または
それを超える当量の適当な塩基または酸のと反応させる
ことによって形成し得る。

本発明の化合物は種々の立体異性体を包含する。本発
明の好ましい化合物において、ペプチド骨格上のキラル
中心はすべてＳである。

本発明の化合物は、当該分野で公知のある種の常法カ
ップリング反応を用いることによって調製し得る。本発
明のアナログは、順次、所望のアミノ酸を成長するペプ
チド鎖に付加することによって調製される。典型的に
は、α−Ｎ−カルバモイル保護アミノ酸および樹脂支持
体上の成長するペプチド鎖に付加されたアミノ酸を、ジ
イソプロピルエチルアミンのごとき塩基の存在下、ジシ
クロヘキシルカルボジイミド １−ヒドロキシベンゾト
リアゾールのごときカップリング剤の存在において、Ｎ
−メチルピロリドン、ジメチルホルムアミドまたは塩化
メチレンのごとき不活性溶媒中、室温で反応させる。該
α−Ｎ−カルバモイル保護基は、トリフルオロ酢酸また
はピペリジンのごとき薬剤で得られたペプチドから除去
し、カップリング反応を次の所望のＮ−保護アミノ酸と
で繰り返す。適当なＮ−保護基は当該分野で公知であ
り、ｔ−ブチルオキシカルボナルが好ましい。

合成のためのある好ましい方法が、通常に譲渡された
同時継続および通常に譲渡された特許出願第667040号
（「アミリンおよびアミリンアナログの合成的調製（Sy
nthetic Preparation of Amylin and Amlin Analog
s」、1991年３月８日出願）に記載されている。これら
の方法は、促進された生物学的活性を有し、実質的に欠
失および他の汚染ペプチドがないアミリンまたはアミリ
ンアナログよりなるペプチドの固相合成を提供するもの
であり、該ペプチドは連続的合成サククルを用いて合成
され、かかる各サイクルでは、成長するペプチドのα−
アミノ基と指定されたアミノ酸のα−カルボキシルとの
間にペプチド結合を形成することによって、指定された
アミノ酸を不溶性樹脂支持体に連結した成長するペプチ
ドに付加し；各合成サイクルは（ａ）α−アミノ基を除
去するためのα−アミノ脱保護条件下で成長するペプチ
ドを処理し；（ｂ）α−アミノ保護された指定アミノ酸
のα−カルボキシル基を活性化し；（ｃ）カップリング
条件下で成長するペプチド鎖と指定アミノ酸を接触させ
て、ペプチド鎖についての遊離α−アミノと指定アミノ
酸の活性化されたα−カルボキシルとの間にペプチド結
合を形成させ；（ｄ）工程（ｃ）のカップリング効率が
約97％未満であると工程（ｂ）および（ｃ）を反復する
ことよりなる。カップリング効率が約99％未満であると
きに工程（ｂ）および（ｃ）を反復するのが好ましい。
もう１つの好ましい態様において、工程（ｂ）および
（ｃ）を各合成サイクル中で反復する。所望により、カ
ップリング効率よ各カップリング工程後に測定する。

適当なカップリング条件は、合成サイクル間におい
て、固体支持体の膨潤を最大とし、ペプチド鎖の第２の
構造要素を最小とし、かつペプチド内およびペプチド間
の水素結合を最小とする溶媒系の使用を包含する。好ま
しくは、該合成サイクルはカップリング工程後のキャッ
ピング工程を包含し、そこでは、ペプチド鎖の反応しな
かったα−アミノ基を非反応性とする。適当な保護α−
アミノ酸を用いて合成サイクルを順次反復して特定配列
のアミリンまたはアミリンアナログを得る。順次の合成
サイクルの完了後、該アミリンまたはアミリンアナログ
を固体支持体から切断する。ペプチド鎖のシステイン残
基を選択的に脱保護し、ペプチド結合を固体支持体から
切断する前に分子内にジスルフィド結合を形成させるの
が好ましい。

適当なα−アミノ保護基は−ブトキシカルボニルおよ
び９−フルオレニルメトキシカルボニルを包含する。１
つの好ましい態様において、ｔ−ブトキシカルボナルを
α−アミノ保護基として用いる場合、α−カルボキシル
基はジシクロヘキシルカルボジイミドおよび１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾールを用いて活性化し、１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾールエステルを形成させる。特に好
ましい溶媒系はＮ−メチルピロリドンよりなる。

本発明の範囲内のある種の作動薬アナログの調製を実
施例１ないし17に記載する。加えて、前記手法に従って
調製され得る他の作動薬アナログを表IIに記載する。本
発明の化合物は組換えDNA技術を用い、当該分野で今日
知られている方法を用いて調製することもできる。例え
ば、サムブルック（Sambrook）ら、モレキュラー・クロ
ーニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular
Cloning:A Laboratory Manual）、第２版、コールド・
スプリンギ・ハーバー（Cpld Spring Harbor）（1989）
参照）。

本発明の化合物の命名法を用いて、ヒト・アミリンの
ごときいずれもの基本的ペプチドアミリン配列およびそ
れになされた修飾に配列が基づく双方のペプチドを示す
ことができる。添数字が先行するアミノ酸は、命名され
たアミノ酸が基本的アミノ酸配列における添字のアミノ
酸部分に通常存在するアミノ酸を置き換えることを示
す。例えば、「¹⁸Arg^25,28Pro−ｈ−アミリン」とは、
以下の置換：残基18におけるHisを置換するArg、残基25
におけるAlaを置換するProおよび残基28においてSerを
置換するProを有する「ｈ−アミリン」または「ヒト−
アミリン」の配列に基づいたペプチドをいう。「デス−
¹Lys-h-アミリン」なる語は、第１の、またＮ−末端ア
ミノ酸が欠失したヒト・アミリンの配列に基づいたペプ
チドをいう。

本発明のアミリンの作動薬アナログはその薬理学的特
性の観点より有用である。特に、本発明の化合物は、各
々、実施例18および19に記載されたレセプター結合アッ
セイおよびヒラメ筋アッセイにおける活性から明らかな
ごとく、アミリン作動剤としての活性を有する。また、
化合物のアミリン作動薬活性は、哺乳動物における高乳
酸血症および／または高血糖症を誘導する能力によって
も評価され得る。図３の化合物の記載に加えて、ある種
の好ましい化合物を表Ｉに記載する。好ましい化合物デ
ス−¹Lys-h-アミリン、²⁸Pro−ｈ−アミリン、^25,28,29
Pro−ｈ−アミリン、¹⁸Arg^25,28Pro−ｈ−アミリン、お
よびデス−¹Lys¹⁸Arg^25,28−ｈ−アミリンはすべて処理
したテスト動物ではin vivoのアミリン活性、誘因する
顕著な高血糖症、続いて高血糖症を示す。アミリンに特
徴的な活性を有するに加え、本発明のある種の好ましい
化合物は、ヒト・アミリンと比較した場合、より望まし
い溶解度および安定性を有する。これらの好ましい化合
物は²⁵Pro²⁶Val^28,29−ｈ−アミリン、^25,28,29−ｈ−
アミリン、および¹⁸Arg^25,28−ｈ−アミリンを包含す
る。

特に好ましいものである本明細書に記載の化合物は¹⁸
Arg^25,28−ｈ−アミリン、デス−¹Lys¹⁸Arg^25,28Pro−
ｈ−アミリン、¹⁸Arg^25,28,29Pro−ｈ−アミリン、デス
−¹Lys¹⁸Arg^25,28,29Pro−ｈ−アミリン、^25,28,29Pro
−ｈ−アミリン、デス−¹Lys^25,28,29Pro−ｈ−アミリ
ンおよび²⁵Pro²⁶Val^25,28Pro−ｈ−アミリンを包含す
る。さらに好ましい作動薬ペプチド化合物は表IIにリス
トする。それらは、²³ Leu²⁵Pro²⁶Val^28,29Pro−ｈ−アミリン；²⁵ Leu²⁵Pro²⁶Val²⁸Pro−ｈ−アミリン； デス−¹Lys²³Leu²⁵Pro²⁶Val²⁸Pro−ｈ−アミリン；¹⁸ Arg²³Leu²⁵Pro²⁶Val²⁸Pro−ｈ−アミリン；¹⁸ Arg²³Leu^25,28,29Pro−ｈ−アミリン；¹⁸ Arg²³Leu^25,28Pro−ｈ−アミリン；¹⁷ Ile²³Leu^25,28,29Pro−ｈ−アミリン；¹⁷ Ile^25,28,29Pro−ｈ−アミリン； デス−¹Lys¹⁷Ile²³Leu^25,28,29Pro−ｈ−アミリン；¹⁷ Ile¹⁸Arg²³Leu−ｈ−アミリン；¹⁷ Ile¹⁸Arg²³Leu²⁶Val²⁶Peo−ｈ−アミリン；¹⁷ Ile¹⁸Arg²³Leu²⁵Pro²⁹Val^28,29Peo−ｈ−アミリン；¹³ Thr²¹His²³Leu²⁶Ala²⁸Leu²⁹Pro³¹Asp−ｈ−アミリ
ン；¹³ Thr²¹His²³Leu²⁶Ala²⁹Pro³¹Asp−ｈ−アミリン； デス−¹Lys¹³Thr²¹His²³Leu²⁶Ala²⁸Pro³¹Asp−ｈ−アミ
リン；¹³ Thr¹⁸Arg²¹His²³Leu²⁶Ala²⁹Pro³¹Asp−ｈ−アミリ
ン；¹³ Thr¹⁸Arg²¹His²³Leu²⁶Ala^28,29Pro³¹Asp−ｈ−アミリ
ン；¹³ Thr¹⁸Arg²¹His²³Leu²⁵Pro²⁶Ala^28,29Pro³¹Asp−ｈ−
アミリン； を包含する。

本発明の化合物は医薬上許容される賦形剤と組み合わ
せて、非経口投与に適した医薬形態を調製することがで
きる。化合物の実験的応答は、糖尿病および他のインス
リン−要求性状態の治療、ならびに低血糖症の偶発の防
止および治療におけるかかる医薬組成物の臨床的適用を
支持する。本発明の化合物は糖尿病および他のインスリ
ン−要求状態の治療につきインスリンと組み合わせるこ
ともできる。「インスリン」とは、血中グルコースレベ
ルの調節に有用なポリペプチドまたはその同等物を意味
する。かかるインスリンの一般的記載は、グッドマンお
よびギルマン（Goodman and Gillman）のザ・ファルマ
コロジカル・ベイシス・オブ・セラピューティックス
（The Pharmacological Basis of Therapeutics）、第
８版、ペルガモン（Pergamon Press）（1990）に提供さ
れている。かかるインスリンは速攻性、中間作用性、ま
たは遅効性であり得る。インスリンの種々の誘導体が存
在し、本発明で有用である。例えば、米国特許第504954
7号、第5028587号、および5016643号、インスリンペプ
チドもまた有用であり（例えば、米国特許第5008241号
参照）、アナログも同様である（例えば、米国特許第49
92417号および4992418号参照）。かかる組成物は、鼻孔
内投与（例えば、米国特許第4988512号および第4985242
号、ならびに２バイオワールド・トゥデイ（BioWord To
day）、125号（1991）参照）を含めたいずれの標準的に
よっても投与できる。また、本発明の化合物は低血糖症
の防止および治療用にグルカゴンと組み合わせても有用
である。ヤング（Young）ら、ここに参照して一体化さ
せる、「血糖上昇剤組成物（Hyperglycemic Comppositi
on）なる発明の名称の、1991年１月10日付は出願の米国
特許出願第07/640478号参照。

本発明の組成物または生成物は、便宜には、（静脈
内、筋肉内および皮下を含めた）非経口投与または鼻孔
内あるいは経口投与に適当した液剤の形態で提供する。
多くの場合、一緒に投与するための単一の組成物または
液剤中のアミリンの作動薬アナログおよびインスリンま
たはグルカゴンにて提供するのが便宜である。他の場
合、該作動薬アナログとは別にしたインスリンまたはグ
ルカゴンを投与するのがより便宜である。適当な投与フ
ォーマトは、個々に、各患者の医療実施者によって決定
されるのが最良である。適当な医薬上許容される賦形剤
およびその処方は標準的な処方論文、例えば、イー・ダ
ブリュー・マーチン（E.W.Martin）によるレミントンズ
・ファルマシューティカル・サイエンシズ（Remington'
s Pharmaceutical Sciences）に記載されている。ま
た、ワング，ワイ・ジェイおよびハンソン・エム・エイ
（Wang,Y.J.and Hanson.M.A.）、「蛋白およびペプチド
の非経口処方：安定性および安定剤（Parenteral Formu
lation of Proteins and Peptides:Stability and Stab
ilizers）、ジャーナル・オブ・パレンテラル・サイエ
ンス・アンド・テクノロジー（Jouenal of Parenteral
Sciensce and Technology）、テクニカル・レポート（T
echnical Report）10号、補選42:2S（1988）参照。イン
スリンまたはグルカゴンを包含する適当な処方は当該分
野で公知である。

本発明の作動薬調製物は中性のpHで安定化され得る。
本発明の生成物は両親媒性であるので、遊離塩基、酸付
加塩または金属塩として利用され得る。勿論、該塩は医
薬上許容される塩でなければならならず、これらは、金
属塩、特にアルカリおよびアルカリ土類金属塩、例え
ば、カリウムまたはナトリウム塩を包含する。前記した
ごとく、広範囲の医薬上許容される酸付加塩が利用可能
である。これらは、有機および無機酸、好ましくは鉱酸
から調製したものである。例示し得る典型的な酸はクエ
ン酸、コハク酸、乳酸、塩酸および臭化水素酸を包含す
る。かかる生成物は当該分野でよく知られた手法によっ
て容易に調製される。

本発明の生成物は通常注射または注入用の非経口組成
物として提供される。それらは、例えば、不活性油、適
当には、ゴマ油、落下性油、またはオリーブ油のごとき
植物油に懸濁させる。別法として、それらは、pH約5.6
ないし7.4の水性等張緩衝液に懸濁させることができ
る。有用な緩衝液はクエン酸ナトリウム−クエン酸およ
びリン酸ナトリウム−リン酸を包含する。容器または
「貯蔵器（depot）」遅延放出調製物は、調製物の治療
上有効量を、経皮注射に続き長い時間または日にわたっ
て血流に送達させるように使用され得る。

所望の等張性は、塩化ナトリウムまたはデキストロー
ス、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコー
ル、（マンニトールおよびソルビトールのごとき）ポリ
オール、または他の無機もしくは有機溶質のごとき他の
試薬上許容される剤を用いる達成され得る。塩化ナトリ
ウムはナトリウムイオンを含有する緩衝液で特に好まし
い。

所望ならば、前記組成物の溶液はメチルセルロースの
ごとき濃厚剤で濃厚とすることもできる。それらは、エ
マルジョン化形態、油中水、水中油の形態で調製でき
る。広範囲の医薬上許容される乳化剤のいずれも使用す
ることができ、例えば、アカシア粉末、（ツイーン（Tw
een）のごとき）非イオン性界面活性剤、または（アル
カリポリエーテルアルコールサルフェートまたはスルホ
ネート、例えば、トリトン（Triton）のごとき）イオン
性界面活性剤を包含する。

本発明の治療上有用な組成物は、一般的に許容される
手法により成分を混合することによって調製される。例
えば、選択された成分をブレンダーまたは他の標準的な
装置で単に混合し、濃縮された混合物が得られ、次い
で、水または濃厚剤およびある場合はpH調整用の緩衝液
または等張性を制御するための付加溶質の添加によって
最終濃度および粘度を調整することができる。

医者による使用には、該組成物は、インスリンまたは
グルカゴンと共にあるいはそれ無しで、選択されたレベ
ルで血糖を制御しあるいは再確立する単一または複数投
与量にて有効な作動薬化合物の量を含有する投与単位に
て提供される。低血糖症の治療のために記載するアミリ
ンの作動薬アナログの治療上有効量は、血糖レベルを好
ましくは80mg/dlを超えて増加させるものである。糖尿
病および他のインスリン−要求性状態の治療用のかかる
作動薬アナログの治療上有効量はインスリン過剰用量ま
たは望まない低血糖症の減少確率に十分なものである。
当業者に認識されるように、治療剤の有効量は、患者の
年令および体重、患者の身体の状態、得るべき血糖レベ
ル、および他の因子を含めた多くの因子で変動する。糖
尿病の治療のための典型的な用量単位は、アミリン作動
薬化合物の薬0.1ないし5mgおよび、所望ならば、インス
リンの約0.5ないし約10mgを含有する。低血糖症の治療
のための典型的な用量単位は、アミリン作動薬化合物の
約0.5ないし約1.0mgおよび、所望ならば、グルカゴンの
当該分野で認識されている量またはそれ未満を含有す
る。

前記したごとく、本発明では有用な組成物は標準的な
手法によって調整される。また、これらの組成物は、標
準的な手法によって投与される。適当な用量は当業者に
よって容易に決定され、その例は前記した通りである。

本発明の理解のために、以下の実施例は一連の実験の
結果を記載するものを含む。本発明に関する以下の実施
例は、勿論、本発明を限定するものと理解されるべきで
ない。今知られ、あるいは後に開発される、当業者の意
識内にある本発明のかかる変形も、後に特許請求する本
発明の範囲内にあるものと考えられる。

実施例 実施例１²³ Pro−ヒト−アミリンの製造 このヒト（「ｈ−」）アミリンの類似体の固相合成
を、メチルベンズヒドリルアミンアンカー結合樹脂およ
びN_a-Boc／ベンジル側鎖保護を用い、標準ペプチド合成
法に従って実施した。トリフルオロ酢酸中、Acm−保護
システインをタリウム（III）トリフルオロアセタート
と反応させることにより、^2,7−［ジスルフィド］アミ
リン−MBHA−樹脂を得た。環化がなされた後、該樹脂お
よび側鎖保護基を、硫化ジメチルおよびアニソールの存
在下、液体フッ化水素酸（「HF」）で切断した。²⁸Pro
−ｈ−アミリンを分取用HPLCにより精製した。該ペプチ
ドは分析用HPLCおよび界面電気泳動によって均質である
ことが判明し、その構造をアミノ酸分析および配列分析
により確認した。その生成物は所望の質量イオンを付与
した。FAB質量スペクトル：（Ｍ＋１）/e＝3914。

実施例２²⁵ Pro²⁶Val^28,29Pro−ｈ−アミリンの製造 このアミリンの類似体の固相合成を、メチルベンズヒ
ドリルアミンアンカー結合樹脂とN_a-Boc／ベンジル側鎖
保護を用い、標準ペプチド合成法に従って実施した。ト
リフルオロ酢酸中、タリウム（III）トリフルオロアセ
タートと反応させることにより、^2,7−［ジスルフィ
ド］アミリン−MBHA−樹脂を得た。環化がなされた後、
該樹脂および側鎖保護基を、硫化ジメチルおよびアニソ
ールの存在下、液体HFを用いて切断した。²⁵Pro²⁶Val
^28,29Pro−ｈ−アミリンを分取用HPLCにより精製した。
該ペプチドは分析用HPLCおよび界面電気泳動によって均
質であることが判明し、その構造をアミノ酸分析および
配列分析により確認した。その生成物は所望の質量イオ
ンを付与した。

FAB質量スペクトル：（Ｍ＋１）/e＝3936。

実施例３^2,7 シクロ−［²Asp,⁷Lys］−ｈ−アミリンの製造 このアミリンの類似体の固相合成を、メチルベンズヒ
ドリルアミンアンカー結合樹脂とN_a-Boc／ベンジル側鎖
保護を用い、標準ペプチド合成法に従って実施した。²A
spおよび⁷Lysを、Boc-²Asp（Fmoc）−OHおよびBoc-⁷Lys
（Fmoc）−OHを用いて導入した。ピペリジンで選択的に
側鎖を脱保護し、側鎖と側鎖（²Asp-⁷Lys）の環化をベ
ンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチ
ルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート
（BOP試薬）を用いて行った。環化は、ジマイオ．ジェ
イ（Di Maio,J.）ら、ジャーナル・オフ・メディシナル
・ケミストリー（J.Med.Chem.）33:661−667（1990）；
フェリックス・エイ・エム（Felix,A.M.）ら、イント・
ジェイ・ペント・プロト・レス（Int.J.Pent.Prot.Re
s.）32:441（1988）の記載に従った。環化後に得られた
^2,7シクロ−［²Asp,⁷Lys］アミリン−MBHA−樹脂を：硫
化ジメチルおよびアニソールの存在下、液体HFで切断し
た。該^2,7シクロ−［²Asp,⁷Lys］−ｈ−アミリンを分取
用HPLCにより精製した。該ペプチドは分析用HPLCおよび
界面電気泳動によって均質であることが判明し、その構
造をアミノ酸分析および配列分析により確認した。FAB
質量スペクトル：（Ｍ＋１）/e＝3925。

実施例４ デス−¹Lys-h−アミリンの製造 デス−¹Lys-h−アミリン（または^2-37h−アミリンと
称される）の固相合成を、メチルベンズヒドリルアミン
アンカー結合樹脂とN_a-Boc／ベンジル側鎖保護を用い、
標準ペプチド合成法に従って実施した。トリフルオロ酢
酸中、Acm−保護システインをタリウム（III）トリフル
オロアセタートと反応させることにより、^2,7−［ジス
ルフィド］アミリン−MBHA−樹脂を得た。環化がなされ
た後、該樹脂および側鎖保護基を、硫化ジメチルおよび
アニソールの存在下、液体HFを用いて切断した。デス−
¹Lys-h−アミリンを分取用HPLCにより精製した。該ペプ
チドは分析用HPLCおよび界面電気泳動によって均質であ
ることが判明し、その構造をアミノ酸分析および配列分
析により確認した。その生成物は所望の質量イオンを付
与した。FAB質量スペクトル：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝3,775。

実施例５¹ Ala-h−アミリンの製造 ¹Ala-h−アミリンの固相合成を、メチルベンズヒドリ
ルアミンアンカー結合樹脂とN_a-Boc／ベンジル側鎖保護
を用い、標準ペプチド合成法に従って実施した。トリフ
ルオロ酢酸中、Acm−保護システインをタリウム（III）
トリフルオロアセタートと反応させることにより、^2,7
−［ジスルフィド］アミリン−MBHA−樹脂を得た。環化
がなされた後、該樹脂および側鎖保護基を、硫化ジメチ
ルおよびアニソールの存在下、液体HFを用いて切断し
た。¹Ala-h−アミリンを分取用逆相HPLCにより精製し
た。該ペプチドは分析用HPLCおよび界面電気泳動によっ
て均質であることが判明し、その構造をアミノ酸分析お
よび配列分析により確認した。その生成物は所望の質量
イオンを付与した。FAB質量スペクトル：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝
3,847。

実施例６¹ Ser-h−アミリンの製造 ¹Ser-h−アミリンの固相合成を、メチルベンズヒドリ
ルアミンアンカー結合樹脂とN_a-Boc／ベンジル側鎖保護
を用い、標準ペプチド合成法により実施した。トリフル
オロ酢酸中、Acm−保護システインをタリウム（III）ト
リフルオロアセタートと反応させることにより、^2,7−
［ジスルフィド］アミリン−MBHA−樹脂を得た。環化が
なされた後、該樹脂と側鎖保護基を、硫化ジメチルおよ
びアニソールの存在下、液体HFを用いて切断した。¹Ser
-h−アミリンを分取用逆相HPLCにより精製した。該ペプ
チドは分析用HPLCおよび界面電気泳動によって均質であ
ることが判明し、その構造をアミノ酸分析および配列分
析により確認した。その生成物は所望の質量イオンを付
与した。FAB質量スペクトル：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝3,863。

実施例７²⁹ Pro-h−アミリンの製造 このヒトアミリン類似体の固相合成を、メチルベンズ
ヒドリルアミンアンカー結合樹脂とN_a-Boc／ベンジル側
鎖保護を用い、標準ペプチド合成法に従って実施した。
トリフルオロ酢酸中、Acm−保護システインをタリウム
（III）トリフルオロアセタートと反応させることによ
り、^2,7−（ジスルフィド）アミリン−MBHA−樹脂を得
た。環化がなされた後、該樹脂と側鎖保護基を、硫化ジ
メチルおよびアニソールの存在下、液体HFを用いて切断
した。²⁹Pro-h−アミリンを分取用HPLCにより精製し
た。該ペプチドは分析用HPCLおよび界面電気泳動によっ
て均質であることが判明し、その構造をアミノ酸分析お
よび配列分析により確認した。その生成物は所望の質量
イオンを付与した。FAB質量スペクトル：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝
3916。

実施例８^25,29 Pro-h−アミリンの製造 ^25,28Pro-h−アミリンの固相合成を、メチルベンズヒ
ドリルアミンアンカー結合樹脂とN_a-Boc／ベンジル側鎖
保護を用い、標準ペプチド合成法に従って実施した。ト
リフルオロ酢酸中、Acm−保護システインをタリウム（I
II）トリフルオロアセタートと反応させることにより、
^2,7−（ジスルフィド）アミリン−MBHA−樹脂を得た。
環化がなされた後、該樹脂と側鎖保護基を、硫化ジメチ
ルおよびアニソールの存在下、液体HFで切断した。
^25,28Pro-h−アミリンを分取用逆相HPLCにより精製し
た。該ペプチドは分析用HPLCおよび界面電気泳動によっ
て均質であることが判明し、その構造をアミノ酸分析お
よび配列分析により確認した。その生成物は所望の質量
イオンを付与した。FAB質量スペクトル：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝
3,939。

実施例９ デス−¹Lys^25,28Pro-h−アミリンの製造 デス−¹Lys^25,28Pro-h−アミリンの固相合成を、メチ
ルベンズヒドリルアミンアンカー結合樹脂とN_a-Boc／ベ
ンジル側鎖保護を用い、標準ペプチド合成法に従って実
施した。トリフルオロ酢酸中、Acm−保護システインを
タリウム（III）トリフルオロアセタートと反応させる
ことにより、^2,7−（ジスルフィド）アミリン−MBHA−
樹脂を得た。環化がなされた後、該樹脂と側鎖保護基
を、硫化ジメチルおよびアニソールの存在下、液体HFを
用いて切断した。デス−¹Lys^25,28Pro-h−アミリンを分
取用HPLCにより精製した。該ペプチドは分析用HPLCおよ
び界面電気泳動によって均質であることが判明し、その
構造をアミノ酸分析および配列分析により確認した。そ
の生成物は所望の質量イオンを付与した。FAB質量スペ
クトル：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝3,811。

実施例10¹⁸ Arg^25,28Pro-h−アミリンの製造 ¹⁸Arg^25,28Pro-h−アミリンの固相合成を、メチルベ
ンズヒドリルアミンアンカー結合樹脂とN_a-Boc／ベンジ
ル側鎖保護を用い、標準ペプチド合成法に従って実施し
た。トリフルオロ酢酸中、Acm−保護システインをタリ
ウム（III）トリフルオロアセタートと反応させること
により、^2,7−［ジスルフィド］アミリン−MBHA−樹脂
を得た。環化がなされた後、該樹脂と側鎖保護基を、硫
化ジメチルおよびアニソールの存在下、液体HFで切断し
た。¹⁸Arg^25,28Pro-h−アミリンを分取用逆相HPLCより
精製した。該ペプチドは分析用HLPCおよび界面電気泳動
によって均質であることが判明し、その構造をアミノ酸
分析および配列分析により確認した。その生成物は所望
の質量イオンを付与した。FAB質量スペクトル：（Ｍ＋
Ｈ）⁺＝3,959。

実施例11 デス−¹Lys¹⁸Arg^25,28Pro-h−アミリンの製造 デス−¹Lys¹⁸Arg^25,28Pro-h−アミリンの固相合成
を、メチルベンズヒドリルアミンアンカー結合樹脂とN_a
-Boc／ベンジル側鎖保護を用い、標準ペプチド合成法に
従って実施した。トリフルオロ酢酸中、Acm−保護シス
テインをタリウム（III）トリフルオロアセタートと反
応させることにより、^2,7−［ジスルフィド］アミリン
−MBHA−樹脂を得た。環化がなされた後、該樹脂と側鎖
保護基を、硫化ジメチルおよびアニソールの存在下、液
体HFを用いて切断した。デス−¹Lys¹⁸Arg^25,28Pro-h−
アミリンを分取用逆相HPLCより精製した。該ペプチドは
分析用HLPCおよび界面電気泳動によって均質であること
が判明し、その構造をアミノ酸分析および配列分析によ
り確認した。その生成物は所望の質量イオンを付与し
た。FAB質量スペクトル：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝3,832。

実施例12¹⁸ Arg^25,28,29Pro-h−アミリンの製造 ¹⁸Arg^25,28,29Pro-h−アミリンの固相合成を、メチル
ベンズヒドリルアミンアンカー結合樹脂とN_a-Boc／ベン
ジル側鎖保護を用い、標準ペプチド合成法に従って実施
した。トリフルオロ酢酸中、Acm−保護システインをタ
リウム（III）トリフルオロアセタートと反応させるこ
とにより、^2,7−［ジスルフィド］アミリン−MBHA−樹
脂を得た。環化がなされた後、該樹脂と側鎖保護基を、
硫化ジメチルおよびアニソールの存在下、液体HFを用い
て切断した。¹⁸Arg^25,28,29Pro-h−アミリンを分取用逆
相HPLCより精製した。該ペプチドは分析用HLPCおよび界
面電気泳動によって均質であることが判明し、その構造
をアミノ酸分析および配列分析により確認した。その生
成物は所望の質量イオンを付与した。FAB質量スペクト
ル：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝3,971。

実施例13 デス−¹Lys¹⁸Arg^25,28,29Pro-h−アミリンの製造 デス−¹Lys¹⁸Arg^25,28,29Pro-h−アミリンの固相合成
を、メチルベンズヒドリルアミンアンカー結合樹脂とN_a
-Boc／ベンジル側鎖保護を用い、標準ペプチド合成法に
より実施した。トリフルオロ酢酸中、Acm−保護システ
インをタリウム（III）トリフルオロアセタートと反応
させることにより、^2,7−［ジスルフィド］アミリン−M
BHA−樹脂を得た。環化がなされた後、該樹脂と側鎖保
護基を、硫化ジメチルおよびアニソールの存在下、液体
HFを用いて切断した。デス−¹Lys¹⁸Arg^25,28,29Pro-h−
アミリンを分取用逆相HPLCより精製した。該ペプチドは
分析用HLPCおよび界面電気泳動によって均質であること
が判明し、その構造をアミノ酸分析および配列分析によ
り確認した。その生成物は所望の質量イオンを付与し
た。FAB質量スペクトル：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝3,843。

実施例14^25,28,29 Pro-h−アミリンの製造 ^25,28,29Pro-h−アミリンの固相合成を、メチルベン
ズヒドリルアミンアンカー結合樹脂とN_a-Boc／ベンジル
側鎖保護を用い、標準ペプチド合成法により実施した。
トリフルオロ酢酸中、Acm−保護システインをタリウム
（III）トリフルオロアセタートと反応させることによ
り、^2,7−［ジスルフィド］アミリン−MBHA−樹脂を得
た。環化がなされた後、該樹脂と側鎖保護基を、硫化ジ
メチルおよびアニソールの存在下、液体HFで切断した。
^25,28,29Pro-h−アミリンを分取用逆相HPLCより精製し
た。該ペプチドは分析用HLPCおよび界面電気泳動によっ
て均質であることが判明し、その構造をアミノ酸分析お
よび配列分析により確認した。その生成物は所望の質量
イオンを付与した。FAB質量スペクトル：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝
3,949。

実施例15 デス−¹Lys^25,28,29Pro-h−アミリンの製造 デス−¹Lys^25,28,29Pro-h−アミリンの固相合成を、
メチルベンズヒドリルアミンアンカー結合樹脂とN_a-Boc
／ベンジル側鎖保護を用い、標準ペプチド合成法に従っ
て実施した。トリフルオロ酢酸中、Acm−保護システイ
ンをタリウム（III）トリフルオロアセタートと反応さ
せることにより、^2,7−［ジスルフィド］アミリン−MBH
A−樹脂を得た。環化がなされた後、該樹脂と側鎖保護
基を、硫化ジメチルおよびアニソールの存在下、液体HF
を用いて切断した。デス−¹Lys^25,28,29Pro-h−アミリ
ンを分取用逆相HPLCより精製した。該ペプチドは分析用
HLPCおよび界面電気泳動によって均質であることが判明
し、その構造をアミノ酸分析および配列分析により確認
した。その生成物は所望の質量イオンを付与した。FAB
質量スペクトル：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝3,823。

実施例16 デス−¹Lys²⁵Pro²⁶Val^28,29-h−アミリンの製造 このｈ−アミリン類似体の固相合成を、メチルベンズ
ヒドリルアミンアンカー結合樹脂とN_a-Boc／ベンジル側
鎖保護を用い、標準ペプチド合成法により実施した。ト
リフルオロ酢酸中、タリウム（III）トリフルオロアセ
タートと反応させることにより、^2,7−［ジスルフィ
ド］アミリン−MBHA−樹脂を得る。環化が得れた後、該
樹脂と側鎖保護基を、硫化ジメチルおよびアニソールの
存在下、液体HFを用いて切断する。ついで、デス−¹Lys
²⁵Pro²⁶Val^28,29Pro-h−アミリンを分取用逆相HPLCより
精製する。

実施例17 ［（Ｄ）−¹¹Arg］−アミリンの製造 このアミリン類似体の固相合成を、メチルベンズヒド
リルアミンアンカー結合樹脂とN_a-Boc／ベンジル側鎖保
護を用い、標準ペプチド合成法に従って実施する。
（Ｄ）−¹¹ArgをBoc−（Ｄ）¹¹Arg（Mtr）−OHを用いて
導入する。トリフルオロ酢酸中、タリウム（III）トリ
フルオロアセタートと反応させることにより得られた
^2,7−［ジスルフィド］アミリン−MBHA−樹脂を環化
し、該樹脂と側鎖保護基を、硫化ジメチルおよびアニソ
ールの存在下、液体HFを用いて切断する。ついで、
［（Ｄ）−¹¹Arg］−アミリンを分取用逆相HPLCより精
製する。

実施例18 受容体結合検定 本発明の化合物のアミリン受容体に対する結合評価を
以下のように行った。¹²⁵I−ラットのアミリン（Ｎ−末
端のリジンで標識化したボルトン−ハンター（Bolton−
Hunter））をアメルシャム・コーポレーション（Amersh
am Corporation）（アーリントン・ハイツ，イリノイ州
（Arlington Heights,IL））より購入した。使用時間で
の比活性度は1950〜2000Ci/mmolであった。未標識化ペ
プチドをバチャム・インコーポリテッド（BACHEM In
c.）（トランス、カリフォルニア州）（Torrance,C
A））およびペニンスラ・ラボラトリース（Peninsula L
aboratories）（ベルモント、カリフォルニア州）から
入手した。

雄のスプラギュレー−ダウレイ・ラット（200−250
g）を断頭にとり殺した。脳の冷却したリン酸塩−緩衝
食塩水（PBS）中に摘出した。腹部面より、切断部を視
床下部までくちばし状にし、嗅索により側部方向に結合
させ、これらの嗅索から中央方向に45°の角度で伸張さ
せた。その側座核および周辺領域を含むこの基底前脳組
織を秤量し、氷冷した20mM HEPES緩衝液（20mM HEPES
酸、pHを23℃でNaOHで7.4に調整）中で均質化した。新
たな緩衝液中にて３回、48,000×ｇで15分間遠心分離に
付すことにより膜を洗浄した。最終の膜ペレットを0.2m
Mフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）含有の2
0mM HEPES緩衝液に再度懸濁さえた。

¹²⁵I−アミリン結合を測定するのに、4mgの原型湿式
重量の組織からの膜を、バシトラン0.5mg/ml、ウシ血清
アルブミン0.5mg/mlおよび0.2mMのPMSFを含有する20mM
のHEPES緩衝液中、12−16pMで¹²⁵I−アミリンと一緒に
インキュベートした。溶液を23℃で60分間インキュベー
トした。ラジオ標識化したペプチドの非特異的結合を減
少させるために、0.3％ポリエチレンイミン中に４時間
予め浸漬したGF/Bガラス繊維フィルターを通して濾過
し、インキュベートを終えた。濾過の直前に冷PBS5mlを
用い、濾過の直後に冷PBS15mlを用いてフィルターを洗
浄した。フィルターを取り外し、γ−カウンターにて77
％の計数効率で放射能を評定した。10^-12〜10^-6Ｍの未
標識化試験化合物の存在下での結合を測定することによ
り競合曲線を作製し、４−パラメーターのロジスティッ
ク方程式（インプロットプログラム；グラフパッド・ソ
フトウエア，サンディエゴ（Inplot program;GraphPAD
Sofware,San Diego）を用いる非線状回帰線により解析
した。

この検定において、精製したヒトアミリンは約50pMの
IC₅₀測定値でその受容体に結合する。本発明の試験化合
物についての結果を表Ｉに示す。その結果は、該化合物
が、各々、有意な受容体結合活性を有することを示す。

実施例19 ヒラメ筋アッセイ 本発明の化合物のアミリン作動剤活性の評価を以下の
ヒラメ筋アッセイを用いて行った。ヒラメ筋の質量を40
mg以下に維持するのに、約200gの雄のハーラン・スプラ
ギュレー−ダウレイ（Harlan Sprague−Dawley）ラット
を用いた。断頭により殺す前の４時間、動物を絶食させ
た。下部の脚より皮膚を除去し、ついでそれをコクル板
にピンで留めた。アキレス腱を前記のように切断し、踵
骨および腓腹筋（os calcisおよびm.gastrocnemius）を
脛骨の後部面よりリフレクトさせた。ついで、腓腹筋の
骨面にある、ヒラメ筋、15−20mm長、0.5mm厚のフラッ
トな筋をきれいに剥がし、細いはさみおよ鉗子を用いて
筋周膜を除去した。ついで、ヒラメ筋をブレードを用
い、該筋のベリーを介して前−後方向に突き通して均等
に分配し、各動物より合計４つの筋ストリップを得た。
動物から筋を切開した後、短期間、生理食塩水中に保持
した。この筋はラジオグリコースをグリコーゲン中に取
り込むことについて明白な効果を有しないため、該筋を
張力下に保持する必要はなかった。

以下に詳説するように、１リットル当たり、NaCl 11
8.5ミリモル（6.93g）、KCl5.94ミリモル（443mg）、Ca
Cl₂ 2.54ミリモル（282mg）、MgSO₄ 1.19ミリモル（143
mg）、KH₂PO₄ 1.19ミリモル（162mg）、NaHCO₃ 25ミリ
モル（2.1g）、5.5ミリモルのグリコース（1g）および
組換えヒトインスリン（Humulin−R.Eli Lilly,IN）お
よび試験化合物を含有する予めガス処理したクレーブス
−リンガー（Krebs−Riger）炭酸水素塩緩衝液10mlを含
む50mlのエルレマイヤー（Erlenmeyer）フラスコに筋を
加えた。37℃でのpHが7.1と7.4の間にあることを確認し
た。各動物からの４つの筋片が種々のアッセイ条件間で
均一に分配されるように、筋を異なるフラスコに割り当
てた。振動型水浴中、37℃で連続的に攪拌しながら、カ
ーボゲン（95％O₂、５％CO₂）をその面全体に穏やかに
ブローすることによりインキュベート培地をガス処理し
た。「プレインキュベーション」を半時間行った後、0.
5μCiのU-¹⁴C−グリコースを各フラスコに加え、それを
さらに60分間インキュベートした。ついで、各筋片を速
やかに取り出し、プロットし、液体N₂中で凍結させ、秤
量し、その後の¹⁴C−グリコーゲンの測定用に貯蔵し
た。

¹⁴C−グリコーゲン測定は7mlのシンチレーションバイ
アル中で行った。凍結した各筋試験片をバイアルに入
れ、連続攪拌下、70℃で45分間、60％水酸化カリウム1m
lにて消化した。3mlの無水エタノールを添加し、−20℃
で一夜冷却することにより溶解したグリコーゲンをバイ
アル中に沈殿させた。上澄液をアスピレートし、その沈
殿物を真空下で乾燥させた。エタノールをすべて蒸発さ
せ、シンチレーション計数の間のクエンチを回避した。
残りのグリコーゲンを水1mlおよびシンチレーション液4
ml中に再度溶かし、¹⁴Cを計数した。

グリコースのグリコーゲンへの取り込み速度（μmol/
g/時間で表す）を、5.5mMのインキュベート培地におけ
る¹⁴C−グリコースの特異活性、および各筋から抽出し
たグリコーゲン中に残っている合計¹⁴C数より得た。用
量／応答曲線を、最小二乗式繰り返しルーチンを用いる
４パラメーター・ロジスティック・モデル（ALLFIT,v2.
7,NIH,MD）に適合させてEC₅₀を得た。EC₅₀は対数が正規
的に分布しているため、それは対数の±標準誤差で表さ
れる。SYSTAT（ウィルキルソン（Willkinson）、“SYST
AT:統計のためのシステム",シスタット・インコーポレ
イデッド（SYSTAT Inc.）,Evanston IL（1989））のル
ーチンに基づくｔ−試験を用いてペアーワイス（Pairwi
se）比較を行った。

用量−応答曲線を、7.1nM（1000μU/ml）インスリン
および０、１、３、10、30、100、300および1000nMの最
終濃度で添加された各試験化合物を含有する培地に加え
た筋で作成した。各アッセイはまた、単一バッチのラッ
トアミリンからなる内部陽性対照を含み、凍結乾燥して
−70℃で貯蔵した。

ヒトアミリンは公知の血糖上昇ペプチドであり、ヒラ
メ筋アッセイにおけるアミリン調整物のEC₅₀測定値は、
純度が90％以下の市販の調整物では不純物が存在するた
め高いEC₅₀を有し、その結果として低い測定活性を示す
が、典型的には、約１〜10nMの範囲にある。試験化合物
の結果を表Ｉに示す。その結果は各化合物がアミリン活
性を有することを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アルブレヒト，エリザベス アメリカ合衆国カリフォルニア州92126、 サンディエゴ、バニスター・ウェイ 10540番 (56)参考文献 特表 平５−505626（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−504558（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−500688（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/575 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (39)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アミノ酸配列： ［式中、 A₁はLys、Ala、Serまたは水素； B₁はAla; C₁はVal; D₁はHisまたはArg; E₁はSer; F₁はSer; G₁はAsn; H₁はPhe; I₁はIleまたはVal; J₁はSerまたはPro; K₁はAsn; ＸおよびＹは、独立して、相互に化学結合して分子内架
   橋を形成する側鎖を有する残基から選択され、ここに、
   該分子内架橋は、２つのCysアミノ酸残基から形成され
   たジスルフィド結合、またはAspおよびLysアミノ酸残基
   から形成されたラクタムを意味し；および、Ｚはアミノ
   を意味する］ を有するアミリンの作動薬アナログ。
2. 【請求項２】ＸおよびＹが、ジスルフィド結合により架
   橋したCys残基である請求項１記載のアミリンの作動薬
   アナログ。
3. 【請求項３】アミノ酸配列： ［式中、 A₁はLys、Ala、Serまたは水素； B₁はAla; C₁はVal; D₁はHisまたはArg; E₁はSer; F₁はSer; G₁はAsn; H₁はPhe; I₁はIleまたはVal; J₁はSerまたはPro; K₁はAsn; ＸおよびＹは、独立して、相互に化学結合して分子内架
   橋を形成する側鎖を有する残基から選択され、ここに、
   該分子内架橋は、２つのCysアミノ酸残基から形成され
   たジスルフィド結合、またはAspおよびLysアミノ酸残基
   から形成されたラクタムを意味し；および、Ｚはアミノ
   を意味する］ を有するアミリンの作動薬アナログ。
4. 【請求項４】ＸおよびＹが、ジスルフィド結合により架
   橋したCys残基である請求項３記載のアミリンの作動薬
   アナログ。
5. 【請求項５】アミノ酸配列： ［式中、 A₁はLys、Ala、Serまたは水素； B₁はAla; C₁はVal; D₁はHisまたはArg; E₁はSer; F₁はSer; G₁はAsn; H₁はPhe; I₁はAlaまたはPro; J₁はIleまたはVal; K₁はAsn; ＸおよびＹは、独立して、相互に化学結合して分子内架
   橋を形成する側鎖を有する残基から選択され、ここに、
   該分子内架橋は、２つのCysアミノ酸残基から形成され
   たジスルフィド結合、またはAspおよびLysアミノ酸残基
   から形成されたラクタムを意味し；および、Ｚはアミノ
   を意味する］ を有するアミリンの作動薬アナログ。
6. 【請求項６】ＸおよびＹが、ジスルフィド結合により架
   橋したCys残基である請求項５記載のアミリンの作動薬
   アナログ。
7. 【請求項７】アミノ酸配列： ［式中、 A₁はLys、Ala、Serまたは水素； B₁はAla; C₁はVal; D₁はHisまたはArg; E₁はSer; F₁はSer; G₁はAsn; H₁はPhe; I₁はIleまたはVal; J₁はAsn; ＸおよびＹは、独立して、相互に化学結合して分子内架
   橋を形成する側鎖を有する残基から選択され、ここに、
   該分子内架橋は、２つのCysアミノ酸残基から形成され
   たジスルフィド結合、またはAspおよびLysアミノ酸残基
   から形成されたラクタムを意味し；および、Ｚはアミノ
   を意味する］ を有するアミリンの作動薬アナログ。
8. 【請求項８】ＸおよびＹが、ジスルフィド結合により架
   橋したCys残基である請求項７記載のアミリンの作動薬
   アナログ。
9. 【請求項９】D₁がArgである請求項１〜８いずれか１項
   記載のアミリンの作動薬アナログ。
10. 【請求項１０】I₁がValである請求項１〜４、７または
    ８のいずれか１項記載のアミリンの作動薬アナログ。
11. 【請求項１１】J₁がValである請求項５または６いずれ
    か１項記載のアミリンの作動薬アナログ。
12. 【請求項１２】A₁が水素である請求項１〜８いずれか１
    項記載のアミリンの作動薬アナログ。
13. 【請求項１３】¹⁸Arg^25,28Pro−ｈ−アミリン。
14. 【請求項１４】デス−¹Lys¹⁸Arg^25,28Pro−ｈ−アミリ
    ン。
15. 【請求項１５】^25,28,29Pro−ｈ−アミリン。
16. 【請求項１６】デス−¹Lys^25,28,29Pro−ｈ−アミリ
    ン。
17. 【請求項１７】¹⁸Arg^25,28,29Pro−ｈ−アミリン。
18. 【請求項１８】デス−¹Lys¹⁸Arg^25,28,29Pro−ｈ−アミ
    リン。
19. 【請求項１９】²⁵Pro²⁶Val^28,29Pro−ｈ−アミリン。
20. 【請求項２０】酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、または塩
    酸塩である請求項１〜12いずれか１項記載のアミリンの
    作動薬アナログ。
21. 【請求項２１】酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、または塩
    酸塩である請求項13〜19いずれか１項記載のアミリンの
    作動薬アナログ。
22. 【請求項２２】治療学的に有効な量の請求項２に記載の
    アミリンの作動薬アナログを含む組成物。
23. 【請求項２３】治療学的に有効な量の請求項４に記載の
    アミリンの作動薬アナログを含む組成物。
24. 【請求項２４】治療学的に有効な量の請求項６に記載の
    アミリンの作動薬アナログを含む組成物。
25. 【請求項２５】治療学的に有効な量の請求項８に記載の
    アミリンの作動薬アナログを含む組成物。
26. 【請求項２６】治療的投与用に適した形態に混合した、
    治療学的に有効な量の請求項２に記載のアミリンの作動
    薬アナログと、インスリンとを含む組成物。
27. 【請求項２７】治療的投与用に適した形態に混合した、
    治療学的に有効な量の請求項４に記載のアミリンの作動
    薬アナログと、インスリンとを含む組成物。
28. 【請求項２８】治療的投与用に適した形態に混合した、
    治療学的に有効な量の請求項６に記載のアミリンの作動
    薬アナログと、インスリンとを含む組成物。
29. 【請求項２９】治療的投与用に適した形態に混合した、
    治療学的に有効な量の請求項８に記載のアミリンの作動
    薬アナログと、インスリンとを含む組成物。
30. 【請求項３０】アミリンの作動薬アナログが^25,28,29Pr
    o−ｈアミリンである請求項22〜29のいずれか１項記載
    の組成物。
31. 【請求項３１】アミリンの作動薬アナログがデス−¹Lys
    ^25,28,29Pro−ｈ−アミリンである請求項22〜29のいず
    れか１項記載の組成物。
32. 【請求項３２】アミリンの作動薬アナログが¹⁸Arg^25,28
    Pro−ｈ−アミリンである請求項22〜29のいずれか１項
    記載の組成物。
33. 【請求項３３】アミリンの作動薬アナログがデス−¹Lys
    ¹⁸Arg^25,28Pro−ｈ−アミリンである請求項22〜29のい
    ずれか１項記載の組成物。
34. 【請求項３４】以下のアミノ酸配列： で示されるアミリンの作動薬アナログ。
35. 【請求項３５】以下のアミノ酸配列： で示される、治療学的に有効な量のアミリンの作動薬ア
    ナログを含む組成物。
36. 【請求項３６】治療的投与用に適した形態に混合した、
    以下のアミノ酸配列： で示される、治療学的に有効な量のアミリンの作動薬ア
    ナログとインスリンとを含む組成物。
37. 【請求項３７】以下のアミノ酸配列： で示されるアミリンの作動薬アナログの酢酸塩。
38. 【請求項３８】以下のアミノ酸配列： で示されるアミリンの作動薬アナログの塩酸塩。
39. 【請求項３９】以下のアミノ酸配列： で示されるアミリンの作動薬アナログのトリフルオロ酢
    酸塩。