NO324405B1

NO324405B1 - Agonistanalog av amylin og preparat omfattende denne.

Info

Publication number: NO324405B1
Application number: NO19932603A
Authority: NO
Inventors: Elisabeth Albrecht; Howard Jones; Laura S L Gatea
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1991-11-19
Filing date: 1993-07-19
Publication date: 2007-10-08
Also published as: FI933252A0; AU3075392A; AU1245697A; NO932603L; ES2161697T3; FI118601B; EP0567626B1; FI933252A; SK88793A3; NO932603D0; HK1041891A1; JP2902115B2; CA2100745C; EP1162207A1; WO1993010146A1; GR3036794T3; AU714439B2; RU2130463C1; AU673147B2; CA2100745A1

Description

Området for oppfinnelsen er medisin, særlig behandling og forhindring av hypoglykemiske tilstander og andre tilstander hvori forbedret amylinvirkning er av fordel, inkluderende insulinkrevende tilstander som f.eks. diabetes mellitus.

Mere spesifikt vedrører oppfinnelsen en agonistanalog av peptidhormonet amylin og et preparat omfattende denne analog.

Diabetes mellitus er en alvorlig metabolsk sykdom som defineres ved nærvær av kronisk forhøyede nivåer av blodglukose (hyperglykemi). Denne tilstand med glykemi er resultatet av en relativ eller absolutt mangel på aktivitet av peptidhormonet insulin. Insulin fremstilles og utskilles av p-cellene i pankreas. Insulin er rapportert til å fremme glukoseutnyttelse, proteinsyntese og dannelse og lagring av nøytrale lipider. Glukose, den prinsipale kilde for karbohydratenergi, lagres i kroppen som glykogen, en form av polymerisert glukose, som kan omdannes tilbake til glukose for å møte metabolismekravene. Under normale tilstander utskilles insulin i en basal takt og i forhøyede takter etter glukosestimulering, alt for å opprettholde metabolsk homeostase ved omdannelsen av glukose til glykogen.

Betegnelsen diabetes mellitus omfatter flere forskjellige hyperglykemiske tilstander. Disse tilstander inkluderer type 1 (insulinavhengig diabetes mellitus eller IDDM) og type 2 ikke-insulinavhengig diabetes mellitus eller NIDDM) diabetes. Hyperglykemien tilstede i individer med type 1 diabetes er assosiert med defisiente, reduserte eller ikke-eksisterende nivåer av insulin som er utilstrekkelige til å opprettholde blodglukosenivåer innenfor det fysiologiske området. Behandling av type 1 diabetes involverer tilførsel av erstat-ningsdoser av insulin, generelt ved parenteral tilførsel. Hyperglykemien tilstede i individer med type 2 diabetes er initialt assosiert med normale eller forhøyede nivåer av insulin, men disse individer er ikke i stand til å opprettholde metabolsk homeostase som skyldes en tilstand av insulinresistens i perifere vev og lever og, ettersom sykdommen utvikler seg, pga en progressiv ødeleggelse av pankreatiske p-celler som er ansvarlige for sekresjonen av insulin. Således kan initial terapi av type 2 diabetes baseres på diett og livsstilendringer støttet med terapi med orale hypoglykemiske midler som sulfonylureaforbindelser. Insulinterapi er imidlertid ofte nødvendig, særlig i de senere trinn av sykdommen, i forsøk på å frembringe noen kontroll av hyperglykemi og nedsette komplikasjoner av sykdommen til et minimum. Således krever mange type 2 diabetikere til slutt insulin for å overleve.

Amyloid er det navn som er gitt ekstracellulære avsetninger av p-ark-proteinfilamenter. Avsetninger av amyloid material er rapportert funnet i pankreas av pasienter med type 2 diabetes mellitus. Andre undersøkelser har indikert at graden av amyloidavsetninger øker med graden av hyperglykemi 1 mennesker og alvorligheten av type 2 diabetes. Kjemisk analyse av pankreatisk amyloid førte til den overraskende og uventede oppdagelse av peptidhormonet amylin. Clark A; et al., Lancet ii: 231-234 (1987). Dette peptid ble funnet å bestå av 37 aminosyrer, hvorav ingen var sure rester, til å ha en disulfid-binding mellom cysteinrestene ved posisjonene 2 og 7, og til å være C-terminalt amidert. Amylin er hoved-proteinbestanddelen av det amyloid som er rapportert til å være funnet i de pankreatiske Langerhanske øyer i pasienter med type 2 diabetes mellitus.

Det er rapportert at nærværet av både den intramolekylære cysteinbro og den karboksyterminale amidgruppe i peptid-strukturen av det syntetiske molekyl gir den største biologiske aktivitet til å inhibere glykogensyntese i skjelettmuskel. F.eks., Cooper, G.J.S, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 84:8628:8632 (1987); Cooper G.J.S, et al., i Diabetes 1988, utgiver Larkins, R., Zimmet, P. & Chisholm, D.

(Elsevier, Amsterdam), pp. 493-496 (1989). Aminosyresekvensen av amylin (se fig. 1) har 46% homologi med humant kalsitoningenrelatert peptid 2 (CGRP-2).

En rapport angir at et begrenset segment av amylinmolekylet, restene 2 0-29, er en potensiell bidragsgiver mot amyloidfibrildannelse i de Langerhanske øyer i type 2 diabetes mellitus. Glenner et al, Biochem. Biophys. Res Commun. 155:608-614 (1988). Det er også rapportert at aminosyresekvensforskjellene mellom amyliner fra visse mammale arter forekommer i denne region, og videre undersøkelser er fokusert på identifisering av rester forbundet til amyloiddannelse. Westermark et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 87: 5036-5040 (1990). Undersøkelsene til Westermark et al. rapporterte forsøk på syntetisering av forskjellige 2 0-29 aminosyresegmenter av amylinsekvensene fra forskjellige arter etterfulgt av en sammenligning av deres evne til å danne amyloidfibriler. Det ble foreslått at restene 25-29 i humant amylin var de mest sterke amyloidgeniske og at prolin-for-serin substitusjon i posisjon 28, som i forskjellige gnagerarter, signifikant inhiberte fibrildannelse i de undersøkte dekapeptider.

Amylin er et komplekst peptid, og syntesen av bioaktive preparater av amylin er arbeidskrevende. Amylin er også funnet til å ha begrenset oppløselighet og begrenset stabilitet i oppløsning. Det er funnet at rotteamylin har en høyere oppløselighet og stabilitet i oppløsning enn humant amylin. Dette kan i noen grad skyldes, selv om dette ikke er kjent, de forskjellige aggregasjonsegenskaper til amylinene fra forskjellige arter. Bare den humane, ikke-humane primat, og kattearten av amylin er blitt rapportert til å aggregere for å danne øy-amyloid in vivo. Sekvensene av amylin som nå er rapportert til å være blitt isolert fra et antall arter er angitt i fig. 2.

I type I diabetes, er amylinnivåer kraftig redusert eller er ikke-eksisterende når de sammenlignes med normale kontroller. I sykdomstilstanden av type I diabetes mellitus er p-cellene, som er produsentene av insulin og amylin, blitt ødelagt ved hjelp av en autoimmun prosess. Amylin er foreslått å være nyttig ved behandling av diabetes mellitus og hypoglykemi, inkluderende insulinindusert hypoglykemi. Det er også foreslått at kotilførsel av insulin med amylin er en overlegen terapi i forhold til den eksisterende tilførsel av insulin alene, og at kotilførsel av amylin med glukagon for behandling av hypoglykemi er en overlegen terapi i forhold til den eksisterende tilførsel av glukagon alene. Det ville for slike og andre formål vare nyttig å bringe tilveie mindre kompliserte forbindelser som har aktivitetene av nativt humant amylin, så vel som forbindelser som kan vise økt oppløselighet og/eller stabilitet fremfor nativt humant amylin. Slike forbindelser er beskrevet og angitt heri.

Den foreliggende oppfinnelse er rettet på nye analoger av peptidhormonet amylin. Disse forbindelser etterligner virkningene av amylin og er benevnt heri som amylinagonister eller som agonistanaloger av amylin.

Oppfinnelsen er også rettet på farmasøytiske preparater omfattende agonistanalogene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en agonistanalog av amylin som har aminosyresekvensen: <1>A1<->X-Asn-Thr-<5>Ala-Thr-Y-Ala-Thr-<10>Gln-Arg-Leu-B1-Asn-15Phe-Leu-C1-D1-E1<20>F1-G1-Asn-H1-Gly-25Pro-I1-Leu-Pro-J1-<30>Thr-K1-Val-Gly-Ser-<35>Asn-Thr-Tyr-Z

hvori

A-l er Lys, Ala, Ser eller hydrogen,

B-l er Ala, Ser eller Thr,

C± er Val, Leu eller Ile,

Dx er His eller Arg,

Ex er Ser eller Thr,

F-l er Ser, Thr, Gin eller Asn,

Gi er Asn, Gin eller His,

Hx er Phe, Leu eller Tyr,

I-l er Ile, Val, Ala eller Leu,

Jx er Ser, Pro eller Thr,

Kx er Asn, Asp eller Gin,

X og Y er uavhengig valgte aminosyrerester med sidekjeder som er kjemisk bundet til hverandre til å danne en intramolekylær binding hvor nevnte intramolekylære binding er en disulfid-binding, en laktam- eller en tioeterbinding, og Z er amino, alkylamino, dialkylamino, cykloalkylamino, arylamino, aralkylamino, alkyloksy, aryloksy eller aralkyloksy, og med den betingelse at når A-l er Lys, Bx er Ala, C1 er Val, B1 er Arg, E-l er Ser, F± er Ser, G± er Asn, Hx er Leu, I1 er Val, Jx er Pro og Kx er Asn da er en eller flere av Ax til Kx en D-aminosyre og Z er valgt fra gruppen bestående av alkylamino, dialkylamino, cykloalkylamino, arylamino, aralkylamino, alkyloksy, aryloksy eller aralkyloksy;

og hvori nevnte analog fremviser amylinagonistaktivitet.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en agonistanalog av amylin som har aminosyresekvensen: <1>A1-X-Asn-Thr-5Ala-Thr-Y-Ala-Thr-10Gln-Arg-Leu-B1-Asn-<15>Phe-Leu-C1-D1-E1<20>F1-G1-Asn-H1-Gl<y-25>Pro-I1-Leu-J1-Pro-<30>Thr-K1-Val-Gly- Ser - 3 5Asn - Thr - Tyr - Z

hvori

Ax er Lys, Ala, Ser eller hydrogen,

B1 er Ala, Ser eller Thr,

C-l er Val, Leu eller Ile,

Dx er His eller Arg,

Ex er Ser eller Thr,

Fx er Ser, Thr, Gin eller Asn,

Gx er Asn, Gin eller His,

H-l er Phe, Leu eller Tyr,

I-l er Ile, Val, Ala eller Leu,

Jx er Ser, Pro, Leu, Ile eller Thr,

K;l er Asn, Asp eller Gin,

X og Y er uavhengig valgte aminosyrerester med sidekjeder som er kjemisk bundet til hverandre til å danne en intramolekylær binding hvor nevnte intramolekylære binding er en disulfid-binding, en laktam- eller en tioeterbinding, og Z er amino, alkylamino, dialkylamino, cykloalkylamino, arylamino, aralkylamino, alkyloksy, aryloksy eller aralkyloksy, og med den betingelse at når

(a) Aj er Lys, B± er Ala, Cx er Val, D-l er Arg, E1 er Ser, F1

er Ser, Gx er Asn, % er Leu, Ix er Val, J± er Pro og Kx er Asn, eller

(b) Ax er Lys, B1 er Ala, C-l er Val, Dx er His, Ex er Ser, F1

er Asn, Gx er Asn, % er Leu, Ij er Val, Jx er Ser og Kx

er Asn,

da er en eller flere av A1 til Kx en D-aminosyre og Z er valgt fra gruppen bestående av alkylamino, dialkylamino, cykloalkylamino, arylamino, aralkylamino, alkyloksy, aryloksy eller aralkyloksy;

og hvori nevnte analog fremviser amylinagonistaktivitet.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en agonistanalog av amylin som har aminosyresekvensen: <1A>1<->X-Asn-Thr-5Ala-Thr-Y-Ala-Thr-<10>Gln-Arg-Leu-B1-Asn-15Phe-Leu-C1-D1-E1-<20F>1<->G1-Asn-H1-Gly-25Pro-I1-Leu-Pro-Pro-30Thr-J1-Val-Gly-Ser-<35>Asn-Thr-Tyr-Z

hvori

Ax er Lys, Ala, Ser eller hydrogen,

Bx er Ala, Ser eller Thr,

Cj er Val, Leu eller Ile,

D1 er His eller Arg,

E1 er Ser eller Thr,

Fx er Ser, Thr, Gin eller Asn,

Gx er Asn, Gin eller His,

Hx er Phe, Leu eller Tyr,

I-l er Ile, Val, Ala eller Leu,

Jx er Asn, Asp eller Gin,

X og Y er uavhengig valgte aminosyrerester med sidekjeder som er kjemisk bundet til hverandre til å danne en intramolekylær binding hvor nevnte intramolekylære binding er en disulfid-binding, en laktam- eller en tioeterbinding, og Z er amino, alkylamino, dialkylamino, cykloalkylamino, arylamino, aralkylamino, alkyloksy, aryloksy eller aralkyloksy, og med den betingelse at når Ax er Lys, Bx er Ala, Cx er Val, Dj er Arg, Ex er Ser, Fx er Ser, Gx er Asn, Hx er Leu, Ix er Val, J1 er Asn da er en eller flere av Ax til Jx en D-aminosyre og Z er valgt fra gruppen bestående av alkylamino, dialkylamino, cykloalkylamino, arylamino, aralkylamino, alkyloksy, aryloksy eller aralkyloksy;

og hvori nevnte analog fremviser amylinagonistaktivitet.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et preparat som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en agonistanalog av amylin ifølge oppfinnelsen og et insulin blandet i en farmasøytisk aksepterbar bærer.

Endelig tilveiebringer oppfinnelsen et preparat som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en agonistanalog av amylin ifølge oppfinnelsen i en farmasøytisk aksepterbar bærer.

Definisjoner

Som anvendt heri har de følgende betegnelser de etterfølgende betydninger med mindre det motsatte uttrykkelig er angitt: Betegnelsen "alkyl" refererer til både rettkjedede og forgrenede alkylgrupper. Betegnelsen "lavere alkyl" refererer til både rettkjedede og forgrenede alkylgrupper med totalt fra 1 til 6 karbonatomer og inkluderer primære, sekundære og tertiære alkylgrupper. Typiske lavere alkyler inkluderer f.eks. metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, t-butyl, n-pentyl, n-heksyl og lignende.

Betegnelsen "aryl" refererer til karbosykliske aromatiske grupper med 6 til 14 karbonatomer som fenyl og naftyl, så vel som heterosykliske aromatiske grupper inneholdende 1 til 3 heteroatomer (nitrogen, oksygen, svovel, etc.) som pyridyl, triazolopyrazin, pyrimidin og lignende.

Betegnelsen "aralkyl" refererer til en "aryl"-gruppe med 6 til 10 karbonatomer direkte knyttet til en "alkyl"-gruppe med 1 til 4 karbonatomer og inkluderer f.eks. benzyl, p-klorobenzyl, p-metylbenzyl og 2-fenyletyl.

Betegnelsen "sykloalkyl" refererer til sykliske alkylgrupper med 5 til 8 karbonatomer.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 avbilder aminosyresekvensen av humant amylin.

Fig. 2 avbilder en sammenligning av aminosyresekvensene av amyliner isolert fra forskjellige pattedyr. Fig. 3 avbilder aminosyresekvensen av nye amylinagonist-peptider.

Egnede sidekjeder for X og Y inkluderer grupper avledet fra alkylsulfhydryler som kan danne disulfidbindinger, alkylsyrer og alkylaminer som kan danne sykliske laktamer eller sidekjeder som kan være forbundet til å danne en tioeterbinding. Foretrukne alkylkjeder inkluderer lavere alkylgrupper med fra omtrent 1 til omtrent 6 karbonatomer.

X og Y er foretrukket Cys-rester bundet ved hjelp av en disulfidbinding.

Biologisk aktive derivater av agonist-analogene er også inkludert innenfor oppfinnelsens ramme hvori stereokjemien av individuelle aminosyrer kan være invertert fra (L)/S til (BJ /R ved ett eller flere spesifikke seter.

Også inkludert innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse er agonistanalogene modifisert ved glykosylering av Asn, Ser og/eller Thr rester.

Biologisk aktive agonistanaloger av amylin er inkludert innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse med mindre peptidkarakter. Slike peptidetterligninger kan f.eks. inkludere en eller flere av de følgende substitusjoner for -CO-NH- amidbindinger: depsipeptider (-C0-0-), iminometylener (-CH2-NH-), trans-alkener (-CH=CH-), p<->enaminonitriler (-C(=CH-CN)-NH-), tioamider (-CS-NH-), tiometylener (-S-CH2-eller -CH2-S-) , metylener (-CH2-CH2-) , og retro-amider (-NH-C0-) .

Forbindelser i samsvar med foreliggende oppfinnelse danner salter med forskjellige uorganiske og organiske syrer og baser. Slike salter inkluderer salter fremstilt med organiske og uorganiske syrer, f.eks. HC1, HBr, H2S04, H3P04,trifluoro-eddiksyre, eddiksyre, maursyre, metansulfonsyre, toluensulfonsyre, maleinsyre, fumarsyre og kamfersulfonsyre. Salter fremstilt med baser inkluderer f.eks. ammoniumsalter, alkali-metallsalter (som natrium- og kalium-salter) og jordalkali-metallsalter (som f.eks. kalsium- og magnesium-salter). Acetat-, hydroklorid- og trifluoroacetat-salter foretrekkes.

Saltene kan tildannes ved hjelp av konvensjonelle midler, som ved å omsette de frie syreformer eller baseformer av produktet med en eller flere ekvivalenter av den passende base eller syre i et løsningsmiddel eller medium hvori saltet er uoppløselig, eller i et løsningsmiddel som f.eks. vann som deretter fjernes under vakuum eller ved frysetørking eller ved ionebytting av et eksisterende salt med et ytterligere ion på en passende ionebytterharpiks.

Forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen inkluderer forskjellige stereoisomerer. I de foretrukne forbindelser i samsvar med oppfinnelsen er de kirale sentre på peptidhovedkjeden samtlige S.

Forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved å anvende visse konvensjonelle koblings-reaksjoner kjent på peptidområdet. Analogene i samsvar med oppfinnelsen fremstilles ved i rekkefølge å addere den ønskede aminosyre til en voksende peptidkjede. Typisk blir en cc-N-karbamoylbeskyttet aminosyre og en aminosyre knyttet til den voksende peptidkjede på en harpiksbærer omsatt ved romtemperatur i et inert løsningsmiddel som f.eks. N-metylpyrrolidon, dimetylformamid eller metylenklorid i nærvær av koblingsmidler som f.eks. disykloheksylkarbodiimid eller 1-hydroksybenzotriazol i nærvær av en base som diisopropyl-etylamin. Den ot-N-karbamoylbeskyttende gruppe fjernes fra det resulterende peptid med et reagens som f.eks. trifluoreddiksyre eller piperidin, og koblingsreaksjonen gjentas med den neste ønskede N-beskyttede aminosyre. Egnede N-beskyttende grupper er kjent på området med t-butyloksy-karbonyl foretrukket heri.

Visse foretrukne syntesernetoder er beskrevet i den felles overdratte samtidige og felles overdratte patentsøknad nr.

667.040 ("Synthetic Preparation of Amylin and Amylin Analogs", inngitt 8 mars, 1991). Disse metoder tilveiebringer fastfasesyntese av et peptid som omfatter amylin eller en amylinanalog som har økt biologisk aktivitet og er: hovedsakelig fri for delesjon og andre forurensende peptider hvori det nevnte peptid syntetiseres under anvendelse av suksessive syntesesykluser, hvori en designert aminosyre i hver slik syntesesyklus adderes til en voksende peptidkjede knyttet til en uoppløselig harpiksbærer ved dannelse av en peptidbinding mellom en cc-aminogruppe i den voksende peptid-kjede og en o-karboksyl på den designerte aminosyre; og hvori hver syntesesyklus omfatter: (a) behandling av en voksende peptidkjede under cc-amino-avbeskyttende betingelser for å fjerne en a-aminogruppe; (b) aktivering av a-karboksylgruppen i den a-aminobeskyttede designerte aminosyre; (c) bringe den voksende peptidkjede og den designerte aminosyre i kontakt under koblingsbetingelser til å danne en peptidbinding mellom det fri cc-amino for peptidkjeden og det aktiverte (a-,karboksyl av den designerte aminosyre; og (d) gjentagelse av trinnene (b) og (c) hvis koblingseffektiviteten av trinn (c) er mindre enn omtrent 97%. Det er foretrukket å gjenta trinnene (b) og (c) hvis koblingseffektiviteten er mindre enn omtrent 99%. Ved et ytterligere foretrukket aspekt gjentas trinnene (b) og (c) i hver syntesesyklus. Eventuelt måles koblingseffektiviteten etter hvert koblingstrinn.

Egnede koblingsbetingelser inkluderer bruk av et løsnings-middelsystem som maksimaliserer svelling av den faste bærer, minimaliserer sekundære strukturelementer i peptidkjeden under syntesesyklusene, og nedsetter intrapeptid og inter-peptid hydrogenbinding til et minimum. Foretrukket inkluderer syntesesyklusen et beskyttelsestrinn etter koblingstrinnet eller trinnene hvori ureagerte oc-aminogrupper i peptidkjeden gjøres ureaktive. Syntesesyklusen gjentas suksessivt under anvendelse av passende beskyttede cc-aminosyrer til å gi amylin eller en amylinanalog med spesifikk sekvens. Etter fullføringene av de suksessive syntesesykluser blir amylinet eller amylinanalogen spaltet fra den faste bærer. Det er foretrukket at cysteinrestene i peptidkjeden blir selektivt avbeskyttet og en intramolekylær disulfidbinding dannes før peptidbindingen spaltes fra den faste bærer.

Egnede a-aminobeskyttende grupper inkluderer t-butoksykarbonyl og 9-fluorenylmetoksykarbonyl. Ved et foretrukket aspekt, når t-butoksykarbonyl anvendes som den a-aminobeskyttende gruppe, blir oc-karboksylgruppene aktivert under anvendelse av disykloheksylkarbodiimid og 1-hydroksy-benzotriazol til å danne 1-hydroksybenzotriazolestere. Et særlig foretrukket løsningsmiddelsystem omfatter N-metyl-pyrrolidon.

Fremstillingen av visse agonistanaloger av amylin innenfor oppfinnelsens ramme er beskrevet i eksemplene 1 til 10 heri. I tillegg er andre agonistanaloger som kan fremstilles i samsvar med de ovennevnte prosedyrer angitt i tabell II heri. Forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen kan også fremstilles under anvendelse av rekombinante DNA-metoder under anvendelse av metoder som nå er kjent på området. Se f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave Cold

Spring Harbor (1989) .

Nomenklaturen av forbindelsene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å indikere både det peptid som sekvensen er basert på og de modifikasjoner som gjøres for hvilken som helst grunnleggende peptid-amylinsekvens, som f.eks. humant amylin. En aminosyre som foregås av et indekstall indikerer at den nevnte aminosyre erstatter amino-syren som normalt er tilstede ved aminosyreposisjonen av indekstallet i den grunnleggende aminosyresekvens. F.eks. refererer "1<8>Arg<25,28>Pro-h-amylin" til et peptid basert på sekvensen av "h-amylin" eller "human-amylin" med de følgende substitusjoner: Arg erstatter His ved resten 18, Pro erstatter Ala ved resten 25 og Pro erstatter Ser ved resten 28. Betegnelsen "des-<1>Lys-h-amylin" refererer til et peptid basert på sekvensen av humant amylin, med den første eller N-terminale aminosyre utelatt.

Agonistanalogene av amylin i samsvar med denne oppfinnelse er nyttige på bakgrunn av deres farmakologiske egenskaper. Spesielt har forbindelser i samsvar med oppfinnelsen aktivitet som amylinagonistmidler, som skal vises ved aktiviteten i reseptorbindingsanalyser og soleus muskelanalysen beskrevet i henholdsvis forsøkseksemplene 1 og 2. Amylinagonistaktivitet av forbindelsene kan også bedømmes ved evnen til å indusere hyperlaktemi og/eller hyperglykemi i pattedyr. Visse foretrukne forbindelser er angitt i tabell I. De foretrukne forbindelser <25,28>'<29>Pro-h-amylin, <18>Arg<2>5,2<8>Pro-h-amylin og des-<1>Lys<18>Arg<25,28>Pro-h-amylin viser alle amylinaktivitet in vivo i behandlede forsøksdyr, og frembringer markert hyperlaktemi etterfulgt av hyperglykemi. I tillegg til at de har aktiviteter som er karakteristiske for amylin, er visse av de foretrukne forbindelser i samsvar med oppfinnelsen også funnet å ha mer ønskelig oppløselighet og stabilitetsegenskaper når de sammenlignes med humant amylin. Disse foretrukne forbindelser inkluderer <25>Pro<26>Val<28>'<29>Pro-h-amylin, <25,>28'29Pro-h-amylin og <18>Arg<25,28>Pro-h-amylin.

Forbindelser beskrevet heri som er særlig foretrukket inkluderer <18>Arg25,2<8>Pro-h-amylin, des-<1>Lys<18>Arg<25,28>Pro-h-amylin, <18>Arg25,2<8>'<29>Pro-h-amylin, des-<1>Lys1<8>Arg<25>'<28,29>Pro-h-amylin, <25,28>'<29>Pro-h-amylin, des-<1>Lys25,28'29Pro-h-amylin, og <25>Pro<26>Val<25,28>Pro-h-amylin. Ytterligere amylinagonistpeptid-forbindelser er oppført i tabell II. De inkluderer: 23Leu25Pro26Val28,29Pro-h-amylin; . 2<3>Leu<25>Pro<26>Val<28>Pro-h-amylin; des-<1>Lys<23>Leu<25>Pro<26>Val<28>Pro-h-amylin; <18>Arg<23>Leu<25>Pro<26>Val<28>Pro-h-amylin; 18 Arg2 3Leu25'28,29Pro-h - amy 1 in ; 18 Arg2 3 Leu2 5,28Pro-h - amy 1 in ; <17>Ile<23>Leu<25>'<28>'<29>Pro-h-amylin; <17>Ile<25>'<28>'<29>Pro-h-amylin; des-<1>Lys<17>Ile<23>Leu<25>'<28>'<29>Pro-h-amylin; 1<7>Ile<18>Arg<23>Leu<25>Pro<26>Val<28>'<29>Pro-h-amylin; <13>Thr<18>Arg<21>HiS<23>Leu<25>Pro<26>Ala<28>'<29>Pro<31>Asp-h-amylin. Forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen kan kombineres med farmasøytiske bærere for å fremstille farmasøytiske former egnet for parenteral tilførsel. Eksperimentelle responser av forbindelsene understøtter den kliniske anvendelse av slike farmasøytiske preparater ved behandling av diabetes mellitus og andre insulinkrevende tilstander, så vel som forhindring og behandling av episoder med hypoglykemi. Forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen kan også kombineres med insulin for behandling av diabetes mellitus og andre insulinkrevende tilstander. Med "insulin" menes et polypeptid eller dets ekvivalent som er nyttig ved regulering av blodglukosenivåer. En generell beskrivelse av slike insuliner er gitt i Goodman og Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8. utgave, Pergamon press (1990). Slike insuliner kan være hurtigvirkende, middels hurtigvirkende, eller ha lang virkningstid. Forskjellige derivater av insulin forekommer og er nyttige ved denne oppfinnelse. Se f.eks. US patentskrift 5 049 547, 5 028 587 og 5 016 643. Insulin-peptider er også nyttige (se f.eks. US patentskrift 5 008 241) og også analoger (se f.eks. US patentskrift 4 992 417 og 4 992 418). Slike preparater kan tilføres ved hjelp av en hvilken som helst standard måte, inkluderende nasal tilførsel (se f.eks. US patentskrift 4 988 512 og 4 985 242 og 2 BioWorld Today, Nr 125 (1991)). Forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen er også anvendbare i kombinasjon med et glukagon for forhindring og behandling av hypoglykemi. Se Young et al. US patentsøknad med nr. 07/640 478, inngitt 10 januar, 1991 med tittel "Hyperglykemic Compositions".

Preparater eller produkter i samsvar med oppfinnelsen kan passende tilveiebringes i form av oppløsninger egnet for parenteral (inkluderende intravenøs, intramuskulær og sub-kutan) eller nasal eller oral tilførsel. I mange tilfeller vil det være fordelaktig å tilveiebringe en agonistanalog av amylin og et insulin eller glukagon i et enkelt preparat eller løsning for tilførsel sammen. I andre tilfeller kan det være mer fordelaktig å tilføre et insulin eller glukagon separat fra den nevnte agonistanalog. Et passende tilførselsopplegg kan best bestemmes ved hjelp av en praktiserende lege for hver pasient individuelt. Egnede farmasøytisk tålbare bærere og deres sammensetning er beskrevet i standard sammensetningsverk, f.eks. Remington's Pharmaceutical Sciences av E.W. Martin. Se også Wang, Y.J. og Hanson, M.A. "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers," Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42:2S

(1988). Egnede sammensetninger som inkluderer insulin eller glukagon er kjent på området.

Agonistpreparatene i samsvar med oppfinnelsen kan stabiliseres ved nøytral pH. Ettersom produktene i samsvar med oppfinnelsen er amfotære kan de anvendes som fri baser, som syreaddisjonssalter eller som metallsalter. Saltene må selvfølgelig være farmasøytisk tålbare, og disse vil inkludere metallsalter, særlig alkalimetallsalter og jordalkalimetallsalter, f.eks. kalium- eller natriumsalter. En rekke forskjellige farmasøytisk tålbare syreaddisjonssalter er tilgjengelige, som beskrevet i det foregående. Disse inkluderer dem som fremstilles fra både organiske og uorganiske syrer, foretrukket mineralsyre. Typiske syrer som kan nevnes som eksempel inkluderer sitronsyre, ravsyre, melkesyre, saltsyre og hydro-bromsyre. Disse produkter fremstilles lett ved hjelp av prosedyrer som er vel kjent for de fagkyndige på området.

Produktene i samsvar med oppfinnelsen vil vanlig tilveiebringes som parenterale preparater for injeksjon eller infusjon. De kan f.eks. suspenderes i en inert olje, passende en vegetabilsk olje som sesamolje, peanøttolje eller olivenolje. Alternativt kan de suspenderes i en vandig isotonisk bufferløsning ved pH omtrent 5,6 til 7,4. Brukbare buffere inkluderer natriumsitratsitronsyre og natriumfosfat-fosforsyre. En form av "opplags"-preparat eller preparat med sakte frigivende "depotvirkning" kan anvendes slik at de terapeutisk effektive mengder av preparatet tilføres i blodstrømmen i løpet av mange timer eller døgn etter transdermal injeksjon.

Den ønskede isotonisitet kan tilveiebringes under anvendelse av natriumklorid eller andre farmasøytisk tålbare midler som dekstrose, borsyre, natriumtartrat, propylenglykol, polyoler (som mannitol og sorbitol) eller andre uorganiske eller organiske løsningsprodukter. Natriumklorid er foretrukket spesielt for buffere inneholdende natriumioner.

Om ønsket kan oppløsninger av de ovennevnte sammensetninger fortykkes med et fortykningsmiddel som f.eks. metylcellulose. De kan fremstilles i emulgert form, enten vann i olje eller olje i vann. Hvilke som helst av en rekke forskjellige farmasøytisk tålbare emulgeringsmidler kan anvendes inkluderende f.eks. akasiepulver, et ikke-ionisk overflateaktivt middel (som f.eks. et "Tween"), eller et ionisk overflateaktivt middel (som f.eks. alkalimetall-polyeter-alkoholsulfater eller sulfonater, f.eks "Triton").

De terapeutisk anvendbare preparater i samsvar med oppfinnelsen fremstilles ved å blande bestanddelene ved å følge generelt aksepterte prosedyrer. F.eks. kan de utvalgte komponenter blandes enkelt i en blander eller annen standardinnretning for å frembringe en konsentrert blanding som så kan innstilles til den endelige konsentrasjon og viskositet ved tilsetning av vann eller fortykningsmiddel og eventuelt en buffer for å kontrollere pH eller et ytterligere løsningsprodukt for å kontrollere tonisiteten.

For bruk av legen blir preparatene tilveiebragt i enhetsdoseform inneholdende en mengde av en agonist-forbindelse med eller uten insulin eller glukagon som vil være effektiv i en eller flere doser for å styre eller reetablere blodsukkeret ved det valgte nivå. Terapeutisk effektive mengder av en agonist-analog av amylin som beskrevet heri for behandling av hypo-glykemi er dem som øker blodsukkernivåene, foretrukket til over 80 mg/dl. Terapeutisk effektive mengder av slike agonistanaloger for behandling av diabetes mellitus og andre insulinkrevende tilstander er dem som er tilstrekkelig til å besørge redusert forekomst av insulinoverdose eller uønsket hypoglykemi. Som det erkjennes av de fagkyndige på området vil en effektiv mengde av terapeutisk middel variere med mange faktorer inkluderende alderen og vekten av pasienten, pasientens fysiske tilstand, blodsukkernivået som skal oppnås, og andre faktorer. Typiske doseringsenheter for behandling av diabetes mellitus vil inneholde fra omtrent 0,1 til 5 mg av en amylinagonistforbindelse og om ønsket omtrent 0,5 til omtrent 10 mg av et insulin. Typiske doseringsenheter for behandling av hypoglykemi vil inneholde fra omtrent 0,5 til 1,0 mg av en amylinagonistforbindelse og om ønsket den mengde som på området er vanlig, eller mindre mengde av et glukagon.

Som angitt i det foregående sammensettes preparater som er anvendbare ved oppfinnelsen ved hjelp av standard prosedyrer. Disse preparater tilføres også ved hjelp av standard prosedyrer.

Egnede doser bestemmes lett av de fagkyndige på området, og eksempler er gitt i det foregående.

For å fremme forståelsen av den foreliggende oppfinnelse er de etterfølgende eksempler inkludert og beskriver resultatene av en rekke forsøk.

Eksempel 1

Fremstilling av <25>Pro<26>Val<28>'<29>Pro-h-amylin

Fastfasesyntese av denne amylinanalog under anvendelse av metylbenzhydrylamin forankringsbundet harpiks og Na<->Boc/- benzyl-sidekjedebeskyttelse ble gjennomført ved hjelp av standard peptidsyntesemetoder. 2> 1 -[disulfid]amylin-MBHA-harpiksen ble oppnådd ved behandling med tallium (III) trifluoracetat i trifluoreddiksyre. Etter at ringslutning var oppnådd ble harpiksen og sidekjedebeskyttende grupper spaltet med flytende HF i nærvær av dimetylsulfid og anisol. <25>Pro<26>Val<28,29>Pro-h-amylinet ble renset ved hjelp av preparativ HPLC. Peptidet ble funnet å være homogent ved analytisk HPLC og kapillarelektroforese og strukturen bekreftet ved hjelp av aminosyreanalyse og sekvensanalyse. Produktet ga det ønskede masseion.

FAB masse spek: (M+l)/e=3936.

Eksempel 2

Fremstilling av <25,28>Pro-h-amylin

Fastfasesyntese av 25• 28Pro-h-amylin under anvendelse av metyl-benzhydrylamin forankringsbundet harpiks og Na-Boc/benzyl-sidekjedebeskyttelse ble gjennomført ved hjelp av standard peptidsyntesemetoder. 2< 7[disulfid]amylin-MBHA-harpiksen ble oppnådd ved behandling av Acm-beskyttede cysteiner med tallium (III) trifluoracetat i trifluoreddiksyre. Etter at ringslutning var oppnådd ble harpiksen og sidekjedebeskyttende grupper spaltet med flytende HF i nærvær av dimetylsulfid og anisol. <25,28>Pro-h-amylinet ble renset hjelp av preparativ revers fase HPLC. Peptidet ble funnet å være homogent ved analytisk HPLC og kapillarelektroforese og strukturen ble bekreftet ved aminosyreanalyse og sekvensanalyse. Produktet ga det ønskede masseion.

FAB masse spek:(M+H)<+>=3939.

Eksempel 3

Fremstilling av des-<1>Lys<25,28>Pro-h-amylin

Fastfasesyntese av des-<1>Lys<25,28>Pro-h-amylin under anvendelse av metylbenzhydrylamin forankringsbundet harpiks og Na<->Boc/- benzylsidekjedebeskyttelse ble gjennomført ved hjelp av standard peptidsyntesemetoder. <2,7>[disulfid]amylin-MBHA-harpiksen ble oppnådd ved behandling av Acm-beskyttede cysteiner med tallium (III) trifluoracetat i trifluoreddiksyre. Etter at ringslutning var oppnådd ble harpiksen og sidekjedebeskyttende grupper spaltet med flytende HF i nærvær av dimetylsulfid og anisol. des-<1>Lys<25,28>Pro-h-amylinet ble renset hjelp av preparativ revers fase HPLC. Peptidet ble funnet å være homogent ved analytisk HPLC og kapillarelektroforese og strukturen ble bekreftet ved hjelp av aminosyreanalyse og sekvensanalyse. Produktet ga det ønskede masseion. FAB masse spek: (M+H)<+>=3811.

Eksempel 4

Fremstilling av 18Arg<25,18>Pro-h-amylin

Fastfasesyntese av <18>Arg<25,18>Pro-h-amylin under anvendelse av metylbenzhydrylamin forankringsbundet harpiks og Na<->Boc/- benzylsidekjedebeskyttelse ble gjennomført ved hjelp av standard peptidsyntesemetoder. <2>'<7>[disulfid]amylin-MBHA-harpiksen ble oppnådd ved behandling av Acm-beskyttede cysteiner med tallium (III) trifluoracetat i trifluoreddiksyre. Etter at ringslutning var oppnådd ble harpiksen og sidekjedebeskyttende grupper spaltet med flytende HF i nærvær av dimetylsulfid og anisol. <18>Arg<25,28>Pro-h-amylinet ble renset hjelp av preparativ revers fase HPLC. Peptidet ble funnet å være homogent ved analytisk HPLC og kapillarelektroforese og strukturen ble bekreftet ved hjelp av aminosyreanalyse og sekvensanalyse. Produktet ga det ønskede masseion.

FAB masse spek: (M+H)<+>=3959.

Eksempel 5

Fremstilling av des-<1>Lys<18>Arg<25,28>Pro-h-amylin

Fastf asesyntese av des-<1>Lys<18>Arg-<25,28>Pro-h-amylin under anvend-else av metylbenzhydrylamin forankringsbundet harpiks og Na<->Boc/benzylsidekjedebeskyttelse ble gjennomført ved standard peptidsyntesemetoder. <2>'<7> [disulfid]amylin-MBHA-harpiksen ble oppnådd ved behandling av Acm-beskyttede cysteiner med tallium (III) trifluoracetat i trifluoreddiksyre. Etter at ringslutning var oppnådd ble harpiksen og sidekjedebeskyttende grupper spaltet med flytende HF i nærvær av dimetylsulfid og anisol. des-<1>Lys18Arg<25,28>Pro-h-amylinet ble renset ved preparativ revers fase HPLC. Peptidet ble funnet å være homogent ved analytisk HPLC og kapillarelektroforese og strukturen ble bekreftet ved hjelp av aminosyreanalyse og sekvensanalyse. Produktet ga det ønskede masseion.

FAB masse spek: (M+H)<+>=3832.

Eksempel 6

Fremstilling av <18>Arg<25>'<28>'<29>Pro-h-amylin

Fastfasesyntese av18Arg25,28,29Pro-h-amylin under anvendelse av metylbenzhydrylamin forankringsbundet harpiks og Na<->Boc/- benzylsidekjedebeskyttelse ble gjennomført ved hjelp av standard peptidsyntesemetoder. <2-7>[disulfid]amylin-MBHA-harpiksen ble oppnådd ved behandling av Acm-beskyttede cysteiner med tallium (III) trifluoracetat i trifluoreddiksyre. Etter at ringslutning var oppnådd ble harpiksen og sidekjedebeskyttende grupper spaltet med flytende HF i nærvær av dimetylsulfid og anisol. <18>Arg<25>'<28,29>Pro-h-amylinet ble renset ved preparativ revers fase HPLC. Peptidet ble funnet å være homogent ved analytisk HPLC og kapillarelektroforese og strukturen ble bekreftet ved hjelp av aminosyreanalyse og sekvensanalyse. Produktet ga det ønskede masseion.

FAB masse spek: (M+H)+=3 971.

Eksempel 7

Fremstilling av des-<1>Lys1<8>Arg<25,28,29>Pro-h-amylin Fastf asesyntese av des-<1>Lys<18>Arg<25>'<28,29>Pro-h-amylin under anvendelse av metylbenzhydrylamin forankringsbundet harpiks og Na<->Boc/benzylsidekjedebeskyttelse ble gjennomført ved standard peptidsyntesemetoder. <2,7>[disulfid]amylin-MBHA-harpiksen ble oppnådd ved behandling av Acm-beskyttede cysteiner med tallium (III) trifluoracetat i trifluoreddiksyre. Etter at ringslutning var oppnådd ble harpiksen og sidekjedebeskyttende grupper spaltet med flytende HF i nærvær av dimetylsulf id og anisol. Des-<1>Lys1<8>Arg<25,28,29>Pro-h-amylinet ble renset ved preparativ revers fase HPLC. Peptidet ble funnet å være homogent ved analytisk HPLC og kapillarelektroforese og strukturen ble bekreftet ved hjelp av aminosyreanalyse og sekvensanalyse. Produktet ga det ønskede masseion.

FAB masse spek: (M+H)<+>=3843.

Eksempel 8

Fremstilling av <25,28,29>Pro-h-amylin

Fastfasesyntese av <25>'<28,29>Pro-h-amylin under anvendelse av metylbenzhydrylamin forankringsbundet harpiks og Na<->Boc/- benzylsidekjedebeskyttelse ble gjennomført ved hjelp av standard peptidsyntesemetoder. <2-7>[disulfid]amylin-MBHA-harpiksen ble oppnådd ved behandling av Acm-beskyttede cysteiner med tallium (III) trifluoracetat i trifluoreddiksyre. Etter at ringslutning var oppnådd ble harpiksen og sidekjedebeskyttende grupper spaltet med flytende HF i nærvær av dimetylsulfid og anisol. <25>'<28,29>Pro-h-amylinet ble renset ved hjelp av preparativ revers fase HPLC. Peptidet ble funnet å være homogent ved analytisk HPLC og kapillarelektroforese og strukturen ble bekreftet ved hjelp av aminosyreanalyse og sekvensanalyse. Produktet ga det ønskede masseion.

FAB masse spek: (M+H)<+>=3949.

Eksempel 9

Fremstillinq av des-<1>Lys<25,28,29>Pro-h-amylin

Fastf asesyntese av des-<1>Lys<25,28,29>Pro-h-amylin under anvendelse av metylbenzhydrylamin forankringsbundet harpiks og Na<->Boc/benzylsidekjedebeskyttelse ble gjennomført ved standard peptidsyntesemetoder. <2>'<7>[disulfid]amylin-MBHA-harpiksen ble oppnådd ved behandling av Acm-beskyttede cysteiner med tallium (III) trifluoracetat i trifluoreddiksyre. Etter at ringslutning var oppnådd ble harpiksen og sidekjedebeskyttende grupper spaltet med flytende HF i nærvær av dimetylsulf id og anisol. Des-^-Lys25,28,29Pro-h-amylinet ble renset ved hjelp av preparativ revers fase HPLC. Peptidet ble funnet å være homogent ved analytisk HPLC og kapillarelektroforese og strukturen ble bekreftet ved hjelp av aminosyreanalyse og sekvensanalyse. Produktet ga det ønskede masseion.

FAB masse spek: (M+H)<+>=3823.

Eksempel 10

Fremstilling av des-<1>Lys<25>Pro<26>Val<28>'<29>Pro-h-amylin Fastfasesyntese av denne h-amylinanalog under anvendelse av metylbenzhydrylamin forankringsbundet harpiks og Na<->Boc/- benzylsidekjedebeskyttelse ble gjennomført ved hjelp av standard peptidsyntesemetoder, og <2>/<7>[disulfid]amylin-MBHA-harpiksen ble oppnådd ved behandling med tallium (III) trifluoracetat i trifluoreddiksyre. Etter at ringslutning var oppnådd ble harpiksen og sidekjedebeskyttende grupper spaltet med flytende HF i nærvær av dimetylsulfid og anisol. Des-<1>Lys<25>Pro<26>Val<28,29>Pro-h-amylinet ble så renset ved hjelp av preparativ HPLC.

Forsøkseksempel 1

Reseptor-bindingsanalyse

Bedømmelse av bindingen av forbindelser i samsvar med oppfinnelsen til amylinreseptorer ble gjennomført som følger. <125>I-rotteamylin (Bolton-Hunter merket ved det N-terminale lysin) ble anskaffet fra Amersham Corporation (Arlington Heights, IL). Spesifikke aktiviteter ved brukstidspunktet var fra 1950 til 2000 Ci/mmol. Umerkede peptider ble oppnådd fra BACHEM Inc. (Torrance, CA) og Peninsula Laboratories (Belmont, CA).

Sprague-Dawley rotter (200-250) gram ble avlivet ved dekapitasjon. Hjernene ble overført til kald fosfatbufret saltløsning (PBS). Fra den ventrale overflate ble kutt foretatt rostralt til hypotalamus, bundet lateralt ved hjelp av olfaktorkanalene og forløpende ved 45° vinkel medialt fra disse kanaler. Dette basale forhjernevev, inneholdende nucleus accumbens og omgivende regioner, ble veid og homogenisert i iskald 20 mM HEPES buffer (20 mM HEPES syre, pH innstilt til 7,4 med NaOH ved 23°C). Membraner ble vasket tre ganger i nylaget buffer ved sentrifugering i 15 min. ved 48.000 x g. Den endelige membranpellet ble resuspendert i 20 mM HEPES buffer inneholdende 0,2 mM fenylmetylsulfonyl-fluorid (PMSF).

For å måle <125>I-amylinbindingen ble membraner fra 4 mg opprin-nelig våtvekt av vev inkubert med 125I-am<y>lin ved 12-16 pM i 20 mM HEPES buffer inneholdende 0,5 mg/ml bacitracin, 0,5 mg/ml bovint serumalbumin og 0,2 mM PMSF. Oppløsninger ble inkubert i 60 min. ved 23°C. Inkubasjoner ble avsluttet ved filtrering gjennom GF/B glassfiberfiltere (Whatman Inc., Clifton, NJ) som på forhånd var blitt bløtlagt i 4 timer i 0,3 % polyetylenimin for å redusere ikke-spesifikk binding av radioaktivt merkede peptider. Filtere ble vasket umiddelbart for filtrering med 5 ml kald PBS og umiddelbart etter filtrering med 15 ml kald PBS. Filteret ble fjernet og radioaktiviteten bedømt i en gamma-teller med en telle-effektivitet på 77%. Konkurransekurver ble utviklet ved å måle bindingen i nærvær av IO"<12> til IO"<6> M umerket testforbindelse og ble analysert ved hjelp av ikke-lineær regresjon under anvendelse av en 4-parameter logistisk ligning (Inplot program; GraphPAD Software, San Diego).

Ved denne analyse binder renset humant amylin til sin reseptor med en målt I50 på omtrent 50 pM. Resultater for testforbindelsene i samsvar med oppfinnelsen er angitt i tabell I, og viser at hver av forbindelsene hadde signifikant reseptorbindende aktivitet.

Forsøkseksempel 2

Soleusmuskelanalyse

Bedømmelse av amylinagonistaktiviteten til forbindelser i samsvar med oppfinnelsen ble gjennomført under anvendelse av soleusmuskelanalyse som følger. Harlan Sprague-Dawley hann-rotter med vekt på omtrent 2 00 g ble anvendt for å opprettholde massen av den splittede soleusmuskel på mindre enn 4 0 mg. Dyrene ble fastet i 4 timer for avlivning ved dekapitasjon. Huden ble strippet fra bakbenene som deretter ble nålet fast på korkplate. Akillessenen ble kuttet rett over os calcis og m. gastrocnemius ble reflektert ut fra det posterior aspekt av skinnebenet. M. soleus, en liten 15-2 0 mm lang, 0,5 mm tykk flat muskel på benoverflaten av m. gastrocnemius ble så strippet løs og perimysium ble renset av under anvendelse av fine sakser og tenger. M. soleus ble så splittet i like deler under anvendelse av et blad ført antero-posteriært gjennom det tykkeste av muskelen for å oppnå totalt 4 muskelstrimler fra hvert dyr. Etter disseksjon av muskel fra dyret ble den holdt for en kort periode i fysiologisk saltløsning. Det var ikke nødvendig at muskelen ble holdt under strekk ettersom dette ikke hadde noen påvisbare virkninger på radioglukoseinnlemelse i glykogen.

Muskler ble tilsatt til 50 ml Erlenmeyer-kolber inneholdende 10 ml av en forhåndsgasset Krebs-Ringer bikarbonatbuffer inneholdende (hver liter) NaCl 118,5 mmol (6,93 g), KC1 5,94 mmol (443 mg),CaCl2 2,54 mmol (282 mg), MgS04 1,19 mmol (143 mg), K2P04 1,19 mmol( 162 mg), NaHC03 25 mmol (2,1 g), 5,5 mmol glukose (lg) og rekombinant humant insulin (Humulin-R, Eli Lilly, IN) og testforbindelsen, som detaljert fremstilt i det følgende. pH ved 3 7°C ble bekreftet til å være mellom 7,1 og 7,4. Muskler ble fordelt i forskjellige kolber slik at fire muskelstykker fra hvert dyr ble jevnt fordelt blant de forskjellige analysebetingelser. Inkubasjonsmedier ble gasset ved forsiktig å blåse karbogen (95% 02, 5% C02) over overflaten mens denne kontinuerlig ble omrørt ved 37°C i et oscillerende vannbad. Etter en halv times "forinkubasjons" periode ble 0,5/iCi av U-<14>C-glukose tilført til hver kolbe som så ble inkubert i ytterligere 60 minutter. Hvert muskel-stykke ble så hurtig fjernet, avdekket og frosset i flytende N2, veid og lagret for etterfølgende bestemmelse av <14>C-glykogen.

<14>C-glykogenbestemmelse ble gjennomført i et 7 ml scintilla-sjonshetteglass. Hver frosset muskelprøve ble anbragt i et hetteglass og behandlet i 1 ml 60% kaliumhydroksyd ved 70°C i 45 min. under kontinuerlig omrøring. Oppløst glykogen ble felt ut på hetteglasset ved tilsetning av 3 ml absolutt etanol og avkjøling over natten ved -2 0°C. Supernatanten ble forsiktig sugd opp, glykogenet ble på nytt vasket med etanol, sugd opp og utfellingen tørket under vakuum. All etanol avdampes for å unngå avkjøling under scintillasjonstellingen. Det resterende glykogen ble oppløst på nytt i 1 ml vann og

4 ml seintillasjonsvæske og underkastet <14>C telling.

Graden av glukoseinnlemmelse i glykogen (uttrykt i gmol/g/- time) ble oppnådd fra den spesifikke aktivitet av <14>C-glukose i 5,5 mM glukose av inkubasjonsmediet og de totale <14>C impuls-tall tilbake i glykogenet ekstrahert fra hver muskel. Dose/responskurver ble tilpasset en 4-parameter logistikk-modell under anvendelse av minste kvadraters repeterende rutine (ALLFIT, v2,7, NIH, MD) for å utlede EC50-verdier. Ettersom EC50 er log-normalfordelt uttrykkes den som + standard feil av logaritmen. Parvise sammenligninger ble gjennomført under anvendelse av t-test baserte rutiner av SYSTAT (Wilkinson, "SYSTAT: the system for statistics," SYSTAT Inc. Evanston IL (1989)).

Dose/responskurver ble utviklet med muskler tilsatt medier inneholdende 7,1 nM (1000/xU/ml) insulin og hver testforbindelse ble tilsatt i endelige (nominelle) konsentra-sjoner på 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300 og 1000 nM. Hver analyse inneholdt også interne positive kontroller bestående av en enkelt porsjon av arkivert rotteamylin, frysetørket og lagret ved -70°C.

Humant amylin er et kjent hyperglykemisk peptid, og EC50-målinger av amylinpreparater i soleus muskelanalysen er typisk fra omtrent 1-10 nM, selv om mere kommersielle preparater som er mindre enn 90% rene har høyere EC50-verdier pga nærvær av forurensninger som resulterer i en lavere målt aktivitet. Resultater for testforbindelser er angitt i tabell I som viser at hver av forbindelsene har amylinaktivitet.

Claims

1. Agonistanalog av amylin, karakterisert ved at den har aminosyresekvensen:<1>A1-X-Asn-Thr-5Ala-Thr-Y-Ala-Thr-<10>Gln-Arg-Leu-B1-Asn-<15>Phe-Leu-C1-D1-E1<20>F1-G1-Asn-H1-Gly-25Pro-I1-Leu-Pro-J1-<30>Thr-K1-Val-Gly-Ser-<35>Asn-Thr-Tyr-Z hvori Ax er Lys, Ala, Ser eller hydrogen, Bj er Ala, Ser eller Thr, C± er Val, Leu eller Ile, Dx er His eller Arg, Ex er Ser eller Thr, Fj er Ser, Thr, Gin eller Asn, G± er Asn, Gin eller His, Hj er Phe, Leu eller Tyr, I-l er Ile, Val, Ala eller Leu, J-l er Ser, Pro eller Thr, K-l er Asn, Asp eller Gin, X og Y er uavhengig valgte aminosyrerester med sidekjeder som er kjemisk bundet til hverandre til å danne en intramolekylær binding hvor nevnte intramolekylære binding er en disulfid-binding, en laktam- eller en tioeterbinding, og Z er amino, alkylamino, dialkylamino, cykloalkylamino, arylamino, aralkylamino, alkyloksy, aryloksy eller aralkyloksy, og med den betingelse at når A-l er Lys, B1 er Ala, C-l er Val, D± er Arg, E-l er Ser, Fx er Ser, Gx er Asn, Hx er Leu, I± er Val, J-l er Pro og Kj er Asn da er en eller flere av Ax til Kx en D-aminosyre og Z er valgt fra gruppen bestående av alkylamino, dialkylamino, cykloalkylamino, arylamino, aralkylamino, alkyloksy, aryloksy eller aralkyloksy; og hvori nevnte analog fremviser amylinagonistaktivitet.

2. Agonistanalog av amylin, karakterisert ved at den har aminosyresekvensen:<1>A1-X-Asn-Thr-<5>Ala-Thr-Y-Ala-Thr-<10>Gln-Arg-Leu-B1-Asn-<15>Phe-Leu-C1-D1-E1<20>F1-G1-Asn-H1-Gly-<25>Pro-I1-Leu-J1-Pro-<30>Thr-K1-Val-Gly-Ser-<35>Asn-Thr-Tyr-Z hvori Aj er Lys, Ala, Ser eller hydrogen, B1 er Ala, Ser eller Thr, C-l er Val, Leu eller Ile, D-l er His eller Arg, Ex er Ser eller Thr, Fj er Ser, Thr, Gin eller Asn, Gx er Asn, Gin eller His, H1 er Phe, Leu eller Tyr, Ix er Ile, Val, Ala eller Leu, J1 er Ser, Pro, Leu, Ile eller Thr, Kx er Asn, Asp eller Gin, X og Y er uavhengig valgte aminosyrerester med sidekjeder som er kjemisk bundet til hverandre til å danne en intramolekylær binding hvor nevnte intramolekylære binding er en disulfid-binding, en laktam- eller en tioeterbinding, og Z er amino, alkylamino, dialkylamino, cykloalkylamino, arylamino, aralkylamino, alkyloksy, aryloksy eller aralkyloksy, og med den betingelse at når (a) Aj er Lys, Bx er Ala, Cx er Val, Dx er Arg, Ex er Ser, Fx er Ser, Gx er Asn, Hj er Leu, I1 er Val, Jx er Pro og Kj er Asn, eller (b) Aj er Lys, Bj er Ala, C1 er Val, Dj er His, Ej er Ser, Fx er Asn, Gx er Asn, Hx er Leu, Ix er Val, Jx er Ser og Kx er Asn, da er en eller flere av Ax til Kj en D-aminosyre og Z er valgt fra gruppen bestående av alkylamino, dialkylamino, cykloalkylamino, arylamino, aralkylamino, alkyloksy, aryloksy eller aralkyloksy; og hvori nevnte analog fremviser amylinagonistaktivitet.

3. Agonistanalog av amylin, karakterisert ved at den har aminosyresekvensen:<1>A1-X-Asn-Thr-<5>Ala-Thr-Y-Ala-Thr-10Gln-Arg-Leu-B1-Asn-15Phe-Leu-C1-D1-E1-<20>P1-G1-Asn-H1-Gly-25Pro-I1-Leu-Pro-Pro-30Thr-J1-Val-Gly-Ser-<35>Asn-Thr-Tyr-Z hvori Ax er Lys, Ala, Ser eller hydrogen, Bx er Ala, Ser eller Thr, Cx er Val, Leu eller Ile, Dj er His eller Arg, Ej er Ser eller Thr, Fj er Ser, Thr, Gin eller Asn, Gx er Asn, Gin eller His, Hj er Phe, Leu eller Tyr, Ix er Ile, Val, Ala eller Leu, Jx er Asn, Asp eller Gin, X og Y er uavhengig valgte aminosyrerester med sidekjeder som er kjemisk bundet til hverandre til å danne en intramolekylær binding hvor nevnte intramolekylære binding er en disulfid-binding, en laktam- eller en tioeterbinding, og Z er amino, alkylamino, dialkylamino, cykloalkylamino, arylamino, aralkylamino, alkyloksy, aryloksy eller aralkyloksy, og med den betingelse at når Ax er Lys, B1 er Ala, C1 er Val, Dx er Arg, E-l er Ser, F1 er Ser, G1 er Asn, Kx er Leu, Ij er Val, Jx er Asn da er en eller flere av Ax til J1 en D-aminosyre og Z er valgt fra gruppen bestående av alkylamino, dialkylamino, cykloalkylamino, arylamino, aralkylamino, alkyloksy, aryloksy eller aralkyloksy; og hvori nevnte analog fremviser amylinagonistaktivitet.

4. Agonistanalog av amylin som angitt i ett eller flere av kraven 1-3, hvori X og Y er Cys-rester bundet ved hjelp av en disulfidbinding.

5. Agonistanalog av amylin som angitt i krav 4, hvori Z er amino.

6. Agonistanalog av amylin som angitt i ett eller flere av kravene 1-5, hvori Dx er Arg.

7. Agonistanalog av amylin som angitt i ett eller flere av kravene 1-5, hvori Ix er Val.

8. Agonistanalog av amylin som angitt i ett eller flere av kravene 1-5, hvori Ax er hydrogen.

9. Agonistanalog av amylin som angitt i ett eller flere av kravene 1-8, som er et salt valgt fra et acetatsalt, et trifluoracetatsalt eller et hydrokloridsalt.

10. Agonistanalog av amylin som angitt i ett eller flere av de foregående krav som er 18Arg2<5,28>Pro-h-amylin.

11. Agonistanalog av amylin som angitt i ett eller flere av de foregående krav som er des-<1>Lys<18>Arg25,28Pro-h-amylin.

12. Agonistanalog av amylin som angitt i ett eller flere av de foregående krav som er 25'28' 29Pro-h-amylin.

13. Agonistanalog av amylin som angitt i ett eller flere av de foregående krav som er des-<1>Lys<25,28,29>Pro-h-amylin.

14. Agonistanalog av amylin som angitt i ett eller flere av de foregående krav som er 18Arg<2>5,28'29Pro-h-amylin.

15. Agonistanalog av amylin som angitt i ett eller flere av de foregående krav som er des-<1>Lys<18>Arg<25,2>8,<29>Pro-h-amylin.

16. Agonistanalog av amylin som angitt i ett eller flere av de foregående krav som er <25>Pro<26>Val<28,29>Pro-h-amylin.

17. Agonistanalog av amylin som angitt i ett eller flere av kravene 10-16, som er et salt valgt fra et acetatsalt, et trifluoracetatsalt eller et hydrokloridsalt.

18. Preparat, karakterisert ved at det omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en agonistanalog av amylin som angitt i ett eller flere av kravene 1-17 og et insulin blandet i en farmasøytisk aksepterbar bærer.

19. Preparat som angitt i krav 18 som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av <25,28,29>Pro-h-amylin og et insulin blandet i en farmasøytisk aksepterbar bærer.

20. Preparat, karakterisert ved at det omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en agonistanalog av amylin som angitt i ett eller flere av kravene 1 - 17 i en farmasøytisk aksepterbar bærer.

21. Preparat som angitt i krav 20 hvori agonistanalogen av amylin er <25,28>'<29>Pro-h-amylin.