SK88793A3

SK88793A3 - Amylin agonising peptides and their using

Info

Publication number: SK88793A3
Application number: SK887-93A
Authority: SK
Inventors: Laura S L Gaeta; Howard Jones; Elisabeth Albrecht
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1991-11-19
Filing date: 1992-11-19
Publication date: 1994-12-07
Also published as: JP2006213716A; FI933252A; JP2902115B2; EP1162207A1; GR3036794T3; NO20073265L; AU714439B2; HK1041891A1; FI933252A0; EP0567626B1; NO932603L; WO1993010146A1; JP4018116B2; RU2130463C1; JPH11152299A; CZ168993A3; NO324405B1; JPH06504794A; CA2100745A1; JP2003238594A

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka oblasti lekárstva, najmä prevencie a liečenia hypog 1 ykemických stavov a ostatných stavov, pri ktorých je žiaduci zlepšený účinok amylínu, vrátane stavov vyžadujúcich inzulín, medzi ktoré patrí diabetes mellitus. Vynález sa týka najmä prípravy a použitia agonizujuci ch analógov peptidového hormónu amylínu.

Doterajší stav techniky je vážne metabolické chronicky zvýšenej Tento hyperglykemický absolútnej absencie

Inzulín produkujú a (pankreas). Inzulín je syntézu proteínov G1ukóza, ktorá je sa v tele uk1adá ako ktorý sa môže za spätne konvertovať inzulín vylučuje rýchlosťou v v krvi, pri homeostázu

Diabetes mellitus definované existenciou v krvi (hyperglykémia). kom relatívnej alebo hormónu inzulínu, žalúdkovej žľazy je spotrebu glukózy, neutrálnych lipi dov. hydrátovej energie, polymér nej glukózy, 1 ických požiadaviek nych podmienok sa ťou, tak i zvýšenou ného množstva glukózy udržuje metabolickú na glykogén.

Výraz diabetes mellitus alykemických stavov. Tieto (inzulín-dependentný diabetes typu 2 (inzulín-nedependentný Hyperg 1ykémi u existujúcu u jedi ocnoren i e.ktoré je hladiny g 1ukózy stav je dôsledúč i nku pept i dového vylučujú beta-bunky podznámy tým, že podporua tvorbu a ukladanie hlavným zdrojom uhľoglykogén, čo je forma účelom splnenia m e t a b o na glukózu. Za norma 1jednak základnou rýchlosodozve na prítomnosť n a d m e r čom toto vylučovanie inzulínu mechanizmom konverzie glukózy zahrňuje niekoľko rôznych hyperstavy zahrňujú diabetes typu 1 mellitus alebo ID D M ) a diabetes diabetes mellitus alebo NID D M ) . n c o v trpiacich ochorením d i a b e 2 tes mellitus typu 1, sprevádza deficitná, znížená alebo neexistujúca hladina inzulínu, ktorá je neschopná udržať hladinu glukózy v krvi vo fyziologicky normálnom rozmedzí.

Liečenie diabetes mellitus typu 1 zahŕňa podávanie náhradných dávok inzulínu, obvykle parenterá 1 nou cestou.

Hyperglykémiu, ktorá existuje u jedincov trpiacich ochorením diabetes mellitus typu 2, v počiatočnom štádiu sprevádza normálna alebo zvýšená hladina inzulínu. Avšak jedinci trpiaci týmto ochorením nie sú schopní zachovať metabolickú homeostázu v dôsledku rezistencie voči inzulínu v periférnych tkanivách a pečeni a v dôsledku progresívneho zhoršenia stavu pankreatických beta-buniek zodpovedajúcich za vylučovanie inzulínu, ku ktorému dochádza takou mierou ako pokračuje choroba. Počiatočná terapia ochorenia diabetes meljitus typu 2 sa môže teda založiť na diéte a zmene životného štýlu doplnená terapiou spočívajúcou v podávaní hypog 1 ykemických činidiel, akými sú sulfonylmočoviny. Napriek tomu, najmä v neskorších štádiách choroby, je neraz nevyhnutné použiť inzulínovú terapiu za účelom určitej regulácie hyperg1ykémi e a obmedzenia komplikácií na možné minimum, sprevádzajúcich toto ochorenie. Mnoho diabetikov trpiacich diabetom typu 2 takto potrebuje inzulín, aby moh1 i prež i ť .

Amyloid je označenie, ktorým sa pomenovali extrace1 u 1 ár ne depozity beta-proteí nových vlákien. Depozity amyloidného materiálu sa našli v pankrease pacientov trpiacich diabetom mellitus typu 2. Niektoré štúdie uvádzajú, že stupeň amyloidných depozitov rastie s mierou hyper g 1ykémi e v ľudskom organizme a vážnosťou ochorenia diabetes mellitus typu 2. Chemická analýza pankreatického amyloidu viedla k prekvapivému a neočakávanému objavu peptidového hormónu amylínu (Clark A. a kol., Lancet i i: 2 3 1 -2 34 (1937)1. Zistilo sa, že tento peptid obsahuje 37 aminokyselín, z ktorých žiadne nie sú kyslými zvyškami, že má disulfidovú väzbu medzi cisteínovými zvyškami v polohe 2a 7 a že je C-termínálne amidovaný. Amylín je hlavnou proteínovou zložkou amyloidu, o ktorom sa uvádza, že sa našiel v pankreatických Langerhansových ostrovčekoch u pacientov trpiacich ochorením diabetes mellitus typu 2.

Uvádza sa, že prítomnosť intramolekulárneho cýst í nového mostíka a amidovej skupiny na terminálnej karboxylovej skupine v peptidovej štruktúre syntetickej molekuly vykazuje najväčšiu biologickú účinnosť pri inhibícii syntézy glykogénu v skeletovom svale (napr. Cooper, G.J.S. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:8628-8632 ( 1 987 ); Cooper, G.J.S. a kol., Diabetes 1988, nakl. Larkins. R., Zimmet, P. a Chisholm, D. (Elsevier, Amsterdam), str. 493-496 ( 1 989 )). Am inokyse1 i nová sekvencia amylínu (viď obr. 1) má 46 % homológiu s peptidom 2 súvisiacim s ka1 c i ton í novým génom (CGRP-2, calcitonin gene related pept i de 2 ) .

V jednej správe sa uvádza, že obmedzený segment amylínovej molekuly, t. j. zvyšky 20 až 29, je potenciálnym prispievateľom v tvorbe amyloidných fibríl v Langerhansových ostrovčekoch pri ochorení diabetes mellitus typu 2 (Glenner a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun. 155:608-614 (1988). Tiež sa uviedlo, že rozdiely am inokyse1 i novej sekvencie medzi jednotlivými amylínmi z niektorých druhov cicavcov sa vyskytujú práve v uvedenej oblasti, pričom ďalšie výskumy sa zamerali na identifikáciu zvyškov spojených s amy1 o i dnou formáciou (Westermark a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:5036-5040 (1990)). Westmarkova štúdia uvádza pokusy syntetizovať rôzne am inokyse1 i nové segmenty 20-29 amylinových sekvencií z rôznych živočíšnych druhov a porovnanie ich schopnosti tvoriť amyloidné fibrily. Zistilo sa, že zvyšky 25-29 ľudského amylínu boli najviac amy1 o i do g é n n e a že substitúcia prolínu za serín v polohe 29, ako je to pri niektorých hlodavcoch, významne inhibuje pri študovaných dekapeptidoch tvorbu fibríl.

Amylin je komplexný peptid a syntéza biologicky účinných preparátov amylínu je prácna. Tiež sa zistilo, že amylin má obmedzenú rozpustnosť a obmedzenú stabilitu v roztoku. Zistili sme, že krysí amylín má vyššiu rozpustnosť a stabilitu v roztoku než ľudský amylín. Spôsobiť to môžu odlišné agregačné vlastnosti amylínu pochádzajúce z rôznych živočíšnych druhov. Uvádza sa, že len amylíny pochádzajúce z človeka, nečlovečieho primátu a mačky sa agregujú in vivo pri tvorbe ostrovčekového amyloidu. Amylínové sekvencie izolované z rôznych živočíšnych druhov sú uvedené na obr. 2.

Pri diabete mellitus typu I je hladina amylínu veľmi obmedzená alebo vôbec neexistuje (zistené porovnaním s normálnymi jedincami, ktorí netrpia týmto ochorením). Pri ochorení diabetes mellitus typu I sa beta-bunky, ktoré sú producentami inzulínu a amylínu, zničili autoímunitným procesom. Zistilo sa, že amylín je použiteľný pri liečení ochorenia diabetes mellitus a hypog1 ykémí e, vrátane inzulínom indukovanej hypoglykémie. Tiež sa zistilo, že súčasné podávanie inzulínu s amylínom má vyšší terapeutický účinok ako samotné podávanie inzu línu a že súčasné podanie amylínu s glukagónom pre liečenie hypog1ykémí e má takisto vyšší terapeutický účinok ako dosiaľ používané podávanie samého glukagónu. Bolo by preto veľmi užitočné pre tieto a iné účely ktoré by mali účinok natívneho pustnosť alebo/a stabilitu než nájsť menej zložité zlúčeniny, ľudského amylínu a lepšiu rozuvedený natívny ľudský amylín.

Takéto zlúčeniny sú predmetom vynálezu.

Podstata vyná1ez u

Vynález je zameraný na nové analógy peptidového hormónu amylínu. Tieto zlúčeniny napodobňujú účinky amylínu a označujú sa ako agonisti amylínu alebo agonizujúce analógy amylínu.

Predmetom vynálezu je tiež farmaceutická kompozícia obsahujúca agonizujúce analógy amylínu podľa vynálezu a spôsoby prevencie a liečenia hypoglykemických stavov a iných stavov, pri ktorých je žiadúci zlepšený amylínový účinok, vrátane stavov vyžadujúcich inzulín, medzi ktoré patrí diabetes mellitus, ktorých podstata spočíva v tom, že sa živočíchovi podáva agonizujúci analóg amylínu (samotný alebo v kombinácii s inzulínom alebo glukagónom).

V rámci tejto patentovej prihlášky majú nasledovné výrazy nasledovné významy, ak sa výslovne neuvádza inak.

Výraz alkylová skupina znamená ake priamu, tak i rozvetvenú alkylovú skupinu. Výraz nižšia alkylová skupina znamená priamu alebo rozvetvenú alkylovú skupinu obsahujúcu celkom 1 až 6 uhlíkových atómov a zahrňujúcu primárne, sekundárne a terciárne alkylové skupiny. Typické nižšie alkylové skupiny zahrňujú napríklad metylovú skupinu, etylovú skupinu, n-propylovú skupinu, izopropylovú skupinu, n-butylovú skupinu, izobutylovú skupinu, ter c . buty 1 ovú skupinu., n-pentylovú skupi nu, n-hexylovú skupinu a podobne.

Výraz arylová skupina znamená karbocyklickú aromatickú skupinu pbsahujúcu 6 až 14 uhlíkových atómov, akou je fenylová skupina a naftylová skupina, ako i heterocyk 1 ickú aromatickú skupinu obsahujúcu 1 až 3 heteroatómy (dusík, kyslík, síra a t ď.), akou je pyridylová skupina, triazplppyrazínová skupina, pyrimidínová skupina a ppdobne. ·

Výraz aralkylová skupina znamená arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 10 uhlíkových atómov a priamo pripojenú k alkylovej skupine obsahujúcej 1 až 4 uhlíkové atómy a zahrňuje napríklad benzylovú skupinu, p-chlórbenzylpvú skupinu,p-metylbenzylovú skupinu a 2-fen y 1 e ty 1ovú skupinu.

Výraz cykloalkylová skupina znamená cyklickú alkylovú skupinu obsahujúcu 5 až 8 uhlíkových atómov.

Stručný ooois obrázkov

Ma pripojených výkresoch

- obr. 1 zobrazuje am inokyse1 i novú sekvenciu ľudského am y 1 í n u

- obr. 2 zobrazuje porovnanie am inokyse1 i nových sekvencií amylínov izolovaných z rôznych živočíšnych druhov a

- obr. 3 zobrazuje am inokyse1 i novú sekvenciu nových peptídov agonizujúci ch amylín.

Vynález poskytuje nové agonizujúce analógy amylínu. Tieto analógy sú použiteľné ako agonisti amylínu a môžu sa teda použiť tiež ako hyperalykemiká. Ich štruktúra je zobrazená na obr. 3 .

Predmetom vynálezu sú agonizujúce analógy amylínu so štruktúrou zobrazenou na obr. 3, kde

Ai znamená atóm vodíka, Lys, Ser, Ala, des-alfa-amino-Lys alebo acetylovaný Lys,

B i	znamená	Ala, Ser	alebo	Thr ,
C ,	znamená	Val ,	Leu	alebo	íle,
0 3	z namená	H í s alebo	Arg ,
Ei	znamená	Ser alebo	Thr ,
F 3	znamená	Ser ,	Thr ,	G1 n	alebo	Asn ,
G,	z namená	Asn ,	Gin	alebo	H i s ,
H 3	znamená	Phe,	Leu	alebo	Tyr,
I 3	znamená	Ala alebo	Pro ,
J 1	znamená	íle,	Val ,	A1 a	alebo	Leu ,
Kl	znamená	Ser ,	Pr o,	Leu ,	íle	alebo
L i	z namená	Ser ,	Pro	alebo	Thr ,
M 3	znamená	Asn ,	Asp	alebo	Gin,

X a Y sú nezávisle zvolené z množiny zahrňujúcej zvyšky majúce bočné reťazce, ktoré sú vzájomne spojené za vzniku intramo1eku1 ár ne j väzby, a

Z znamená hydroxy-skupinu, am í novú skupinu, alkylaminovú skupinu, d i a 1 ky 1 amínovú skupinu, cyk 1 oa 1 k y 1 am í novú skupinu,aryl am í novú skupinu, aralkylam í novú skupinu, alkyloxyskupinu.aryloxy skupinu alebo aralkyloxy-skupinu,za predpok1adu , že

a) keď Ai znamená Lys, Bi znamená Ala, Ci znamená Val, D > znamená His, Ei znamená Ser, Fi znamená Ser, Gi znamená Asn, Hi znamená Phe, I, znamená A1 a,Jί znamená íle, Kí znamená Ser, L, znamená Ser a M, znamená Asn,

b) keď Ai znamená Lys, B, znamená Ala, Ci znamená íle, Di znamená Arg, Ei znamená Ser, Fi znamená Ser, Gi znamená Asn, Hi znamená Leu, Ii znamená Ala,Ji znamená íle, Kí znamená Ser, Li znamená Pro a Mi znamená Asn,

c) keď Ai znamená Lys, Bi znamená Ala, Ci znamená Val, Di znamená Arg, Ei znamená Thr, Fi znamená Ser, Gi znamená Asn, Hi znamená Leu, Ii znamená Ala,Ji znamená íle, Kí znamená Ser, Li znamená Pro a Mi znamená Asn,

d) keď Ai znamená Lys, Bi znamená Ala, Ci znamená Val, Di znamená Arg, Ei znamená Ser, Fi znamená Ser, G, zname-

e)

f) ná Asn, Hi znamená

Leu, Ii znamená

Pro,J i znamená Val ,

Kí znamená Pro znamená Pro znamena Asn, keď Ai znamená Lys

Bi znamená

Ci znamená

Val, Di znamená

Asn , Hi z namená

His, E znamená

Ser , L keď Ai znamená znamená

H i s , Hi znamená znamená

Leu,11 znamená

Ser , F znamená znamená Asn, G

Pro, Ji znamená znamená

Val, K i

Pro a Mi znamená Asn alebo

Lys, Bi znamená Thr, Ct znamená Val, Di znamená

Leu , L i znamená

Ser, Fi znamená Ser, Gi znameLeu , 11 znamená znamená

Pro a M

Ala, Ji znamená Ala,Kí znamená Asp, potom jeden alebo niekoľko ľubovolných zvyškov zo zvyškov

Ai až Mi neznamená L-aminokyselinu a Z neznamená aminovú skupinu.

Vhodné bočné reťazce pre X od a l k ylsulfhydrylον , ktoré môžu kylkyselín a alkylam í nov, ktoré alkylaldehydov môžu kondenzovať a ho mostíka, alebo vzniku alkylovej, tioéterovej väzby, alkylové skupiny obsahujúce asi a Y zahrňujú skupiny odvodené tvoriť disulfidové väzby, almôžu tvoriť cyklické laktámy, alebo alkylhalogenidov a alkylamínov, ktoré i ku alkylaminovémôžu pripojiť za éterovej alebo zahrňujú nižšie môžu byť redukované bočné reťazce, ktoré sa alkenylovej, alkinylovej

Výhodné alkylové reťazce až asi 6 uhlíkových atómov.

za

Predmetom vynálezu sú tiež agonizujúce analógy amylínu so štruktúrou zobrazenou na obr. 3, ktoré nie sú mostíkované a v ktorých sú X a Y nezávisle zvolené z množiny zahrňujúcej Ala, Ser, Cys, Val, Leu a íle alebo alkyl-, aryl- alebo aralkylestery a étery zvyškov Ser alebo Cys.

Do rozsahu vynálezu sú tiež zahrnuté biologicky účinné deriváty agonizujúci ch analógov amylínu so štruktúrou zobrazenou na obr. 3, v ktorých sa môže stereochémia individuálnych aminokyselín na jednom alebo niekoľkých miestach invertovať z (L)/S na (D)/R.

Do rozsahu vynálezu patria tiež agonizujúce analógy amylínu modifikované g 1 y kosy 1áciou zvyškov Asn, Ser alebo/a Thr.

Vynález zahrňuje i biolocky účinné agonizujúce analógy amylínu, ktoré nemajú vyložene peptidový charakter. Také peptídové mimetiká môžu napríklad zahŕňať jednu alebo niekoľko nasledovných substitúcií -CO-NH-amidovej väzby: depsipeptidy (-C0-0-), i m inomety 1 ény (-CH--NH-), trans-alkény (-CH = CH~), beta-enami non itri 1 y (-C(=CH-CN)-NH-), tioamidy (-CS-NH-), tiometylény (-S-CHz- alebo -CH₂-S-), metylény (-CHa-CHa-) a retro-amidy (-Nh-CO-).

Zlúčeniny podľa vynálezu tvoria s rôznymi anorganickými alebo organickými kyselinami a zásadami soli. Takéto soli zahŕňajú soli pripravené s organickými alebo anorganickými kyselinami, napríklad s kyselinou chlorovodíkovou, kyselinou bromovodíkovou, kyselinou sírovou, kyselinou fosforečnou, kyselinou trí f 1uóroctovou, kyselinou octovou, kyselinou mravčou, kyselinou metánsulfónovou, kyselinou toluénfulfónovou, kyselinou maleinovou, kyselinou fumarovou a kyselinou gáfrosulfónovou.

Soli pripravené so zásadami soli alkalických kovov (akými v o v alkalických zemín (akými zahrňujú napríklad amónne soli, sú sodné a draselné soli) a kosú vápenaté a horečnaté soli).

Výhodnými so ľ am i sú acetáty, hydroch 1 or idy a tri f 1uóracetáty.

Tieto soli sa môžu pripraviť konvenčným spôsobom, napríklad reakciou produktu vo forme voľnej kyseliny alebo vo forme voľnej zásady s jedným alebo niekoľkými ekvivalentam i príslušnej zásady alebo kyseliny v rozpúšťadle alebo prostredí, v ktorom je vzniknutá soľ nerozpustná, alebo v rozpúšťadle, akým je voda, ktoré sa potom odstránia za vákua alebo lyofylizáciou alebo výmenou iónov už existujúcej soli za iný ión na vhodnej inotomeničovej živici.

Zlúčeniny podľa vynálezu zahŕňajú rôzne stereoizoméry. Vo výhodných zlúčeninách podľa vynálezu majú všetky chirálne centrá základného peptidového reťazca konfiguráciu S.

Zlúčeniny podľa vynálezu sa môžu pripraviť za použitia niektorých konvenčných kopulačných reakcií známych v chémii peptidov. Analógy podľa vynálezu sa pripravia postupným pridávaním požadovaných aminokyselín k narastajúcemu peptidovému reťazcu. Obvykle sa a 1 fa-N-karbamoy1om chránená aminokyselina a aminokyselina pripojená k rastúcemu peptidovému reťazcu na živicovom nosiči uvedú do reakcie pri okolitej teplote v inertnom rozpúšťadle, akým je N-mety1pyrro1 idón, dimetylformamid alebo mety 1énch1 or í d, v prítomnosti kopulačného činidla, akým je d icyk 1 ohexy 1 kar bod i m i d-1-hydroxybenzotr iazo 1 , a v prítomnosti zásady, akou je d i izopropy1ety 1 amín. A1 fa-N-karbamoylová ochranná skupina sa potom z rezultujúceho peptidu odstráni pôsobením reakčného činidla, akým je kyselina trifluóroctová alebo p i per i d í n , a kopulačná reakcia sa opakuje s ďalšou požadovanou N-chránenou aminokyselinou.

Vhodnými N-ochrannými skupinami sú známe ochranné skupiny, pričom výhodnou ochrannou skupinou je tu terc.buty1oxykarb o n y 1 o v á skupina.

Niektoré výhodné spôsoby syntézy sa popisujú v súvisiacej patentovej prihláške 657,040 (Synthetic Preparation of Amylin and Amylin Analogs) podanej 8. marca 1991. Tieto spôsoby za hŕňajú syntézu v pevnej fáze peptidu, ktorý zahrňuje amylín alebo analóg amylínu so zvýšenou biologickou účinnosťou a ktorý nemá deléciu, a ostatných kontaminujúcich peptidov. Pri tejto syntéze sa uvedený peptid syntetizuje za použitia postupných syntéznych cyklov, pričom v každom takom syntéznom cykle sa určená aminokyselina pridá k rastúcemu peptidovému reťazcu, pripojenému k nerozpustnému živicovému nosiču, vytvorením peptídovej väzby medzi a 1 fa-amínovou skupinou rastúceho peptidového reťazca a a 1 fa-kar boxy 1ovou skupinou určenej aminokyseliny, pričom každý uvedený syntézny cyklus zahrňuje:

a) spracovanie rastúceho peptidového reťazca za alfa-aminodeprotekčných podmienok za účelom odstránenia alfa-aminoskup i ny ,

b) aktiváciu a 1 fa-karboxy 1 ovej skupiny a 1 fa-amino-chr.ánenej určenej aminokyseliny,

c) uvedenie do styku rastúceho peptidového reťazca a určenej aminokyseliny za kopulačných podmienok za účelom vytvorenia väzby medzi voľnou am í novou skupinou pepítdového reťazca a aktivovanou a 1 fa-karboxy 1ovou skupinou určenej aminokyseliny a

d) opakovanie stupňov b) a c)' v prípade, že kopulačná účinnosť stupňa c) je menšia než asi 97 %.

Výhodné je opakovať stupne b) a c) v prípade, že kopulačná účinnosť je nižšia než asi 99 %. Pri inom výhodnom uskutočnení sa stupne b) a c) opakujú v každom syntéznom cykle. Kopulačná účinnosť sa prípadne meria po každom kopulačnom stupni.

Vhodné kopulačné podmienky zahŕňajú použitie rozpúšťadlového systému, ktorý maximalizuje nabobtnanie pevného nosiča, mimalizuje sekundárne štruktúrne prvky peptidového reťazca v priebehu syntéznych cyklov a minimalizuje intrapeptidovú a interpeptidovú vodíkovú väzbu. Syntézny cyklus výhodne zahŕňa úpravu čiapočkou po kopulačnom stupni alebo kopulačných stupňoch, pri ktorom sa nezreagované alfa-amínové skupiny peptídového reťazca stanú nereaktívne. Syntézny cyklus sa postup

1 ne opakuje za použitia príslušne chránených alfa-aminokyselín za účelom získania amylínu alebo amyl í nového analógu špecifikovanej sekvencie. Po dokončení postupných syntéznych cyklov sa uvedený amylín alebo amylínový analóg odštiepi od pevného nosiča. Je výhodné, ak sa cyste í nové zvyšky peptidového reťazca selektívne zbavia ochrannej skupiny a ak sa vytvorí intramolekulárna disulfidová väzba ešte pred rozštiepením väzby spájajúcej peptid k pevnému nosiču.

Vhodné alfa-amino-ochranné skupiny zahŕňajú terc.butoxykarbonylovú skupinu a 9-fluórenylmetoxykarbonylovú skupinu.Pri jednom výhodnom uskutočnení sa ako alra-amino-ochranná skupina použije terc.butoxykarbonylová skupina, pričom sa alfa-karboxylové skupiny aktivujú za použitia d i c y k 1ohexykar bod i i m idu a 1 -hydroxyb.enzotr i azo.l u za vzniku 1 -hydroxybenzotr iazo 1 esterov . Obzvlášť výhodný rozpúšťad1 ový systém zahrňuje N-mety1pyr ro 1 i dón .

Príprava niektorých agonizujúci ch analógov amylínu podľa vynálezu sa popisuje v príkladoch 1 až 17. Okrem toho ďalšie agonizujúce analógy amylínu, ktoré sa môžu pripraviť podľa vyššie uvedených postupov, sú zahrnuté v tabuľke II. Zlúčeniny podľa vynálezu sa môžu tiež pripraviť za použitia rekombinantnej DNA techniky o sebe známymi postupmi (o tom viď Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor (1989)).

Za účelom indikácie peptidu, na ktorom je sekvencia založená, a modifikácií uskutočnených na základnej peptidovej amylínovej sekvencií, sa používa obvyklá nomenklatúra podobných zlúčenín. Exponent predchádzajúci aminokyselinu v danej aminokyselinovej sekvencií znamená, že uvedená aminokyselina nahrádza aminokyselinu normálne prítomnú v základnej aminokyse1 i novej sekvencií v polohe uvedenej zmieneným exponentom. Tak napríklad špecifikácia ' ^sArg²⁵ ^2aPro-h-amy1 í n znamená, že peptid založený na sekvencií h-amylínu alebo ľudského amylínu má nasledovné substitúcie: Arg nahrádza His vo zvyšku

2

18, Pro nahrádza Ala vo zvyšku 25 a Pro nahrádza Ser vo zvyšku

28. Výraz des- ¹ Lys-h-amylí n znamená peptíd založený na ľudskom amylíne s vypustenou prvou alebo N-terminálnou aminokyse linou.

Agonizujúce analógy amylínu sú užitočné produkty vzhľadom k ich farmakologickým vlastnostiam. Zlúčeniny podľa vynálezu sú najmä účinné ako amylín-agoni žujúce činidlá, ako sa to demonštruje účinnosťou pri teste stanovujúcom schopnosť väzby k receptoru a pri teste na lýtkovom svale, ktoré sa popisujú v príkladoch 18 a 19. Amy1 ín-agoni žujúca účinnosť zlúčenín podľa vynálezu sa môže tiež vyhodnotiť schopnosťou indukovať hyperlaktémiu alebo/a hyperg 1ykémi u u cicavcov. Okrem popisu zlúčenín podľa vynálezu uskutočneného na obr. 3, sa niektoré výhodné zlúčeniny uvádzajú v ďalej zaradenej tabuľke I. Výhodné zlúčeniny podľa vynálezu des-¹Lys~h-amylín, ^2SPro-h-amylín,

25.28.Z9p_ro-h-amy1 í n ²⁵,=^spro-h-amylí n zvieratách

Ar g pokusných 1 ak tém i e ^{1 a}Arg²⁵·^2sPro-h-amy 1 í n a des^ys¹®vykäzujú amylínovú účinnosť in vivo pri spočívajúcu vo vyvolaní výraznej hyperhyperg 1 ykémi e. Okrem charakteristickej a napokon amylínu majú niektoré z výhodných zlúčenín podľa vynálezu v porovnaním s ľudským amylinom, žiadanú lepšiu rozpusúčinnosti tnosť a stabilitu. Týmito výhodnými zlúčeninami sú ^2SPro²⁶Val²⁸-²⁹Pro-h-amylin, ^2S’^28,29Pro-h-amylín a ^ieArg^2S,2ePro-h-amy1 í n .

podľa vynálezu sú ²⁸Pro-h-amylín, ^1sArg^2S-²⁹Pro-h-amylín, des 25p_ro ^2SObzlášť výhodnými zlúčeninami '^sArg^2S’^2aPro-h-amy1ín, des-¹Lys’^iaArg^2S·

25. 2 e , in d©S^—1LyS¹⁸Arg²⁵’ ² des-‘^lLys^2S-^2S,29Pro-h-amylín a

Ešte ďalšie amy1 ín-agoni žujúce peptidové v ďalej zaradenej tabuľke II. ľieto zlú²⁹Pro-h-amyl in 25.2β.^2ap_ro-h-amyl in V a 1 ^{2 5} ²⁸Pro-h-amyl in. zlúčeniny sa uvádzajú čen i ny zahŕňajú :

²³Leu²⁵Pro^2SVal ²³·²⁹Pro-h-amylí n;

²³Leu²⁵Pro^2SVal^2SPro-h-amylín;

des-’Lys²³Leu^2SPro²⁶Val^2SPro-h-amylin;

3 ¹⁸Arg²³Leu²⁵Pro²⁶Val^2SPro-h-amylin;

¹⁸Arg²³Leu^2S ^2S·²⁹Pro-h-amylin;

-.^eArg2³Leu²⁵ - ²⁸Pro-h-amyl í n;

¹⁷Ile²³Leu²⁵’²⁸-²⁹Pro-h-amylín;

^{1 7}11 e ^{2 5} ^{2 8} · ²⁹Pro-h-amylí n; des-'^lLys¹⁷Ile²³Leu^2S-²⁸’²⁹Pro-h-amylín; ^,7Ile¹⁸Arg²³Leu-h-amylín;

^l7Ile¹⁸Arg²³Leu²®Val²⁹Pro-h-amylín;

¹⁷Ile¹⁸Arg²³Leu²⁵Pro²⁸Val²⁸’²⁹Pro-h-amylín;

¹³ľhr²'^,His²³Leu^2SAla^2SLeu²⁹Pro³¹Asp-h-amylin;

¹³ľhr²'^lHis²³Leu^2eAla²⁹Pro³¹Asp-h-amylín; des-¹Lys¹³Thr²''His²³Leu^2SAla²⁸Pro³¹Asp-h-amylin; ¹³ľhr¹⁸Arg²¹His²³Leu^2eAla²⁹Pro³‘'Asp-h-amylín;

¹³Thr¹⁸Arg²⁵His²³Leu²³-^{2 9}Pro³'’Asp-h-amylín a '³ľhr'^l8Arg²¹His²³Leu^2SPro²⁶Ala²³-²⁹Pro³¹Asp-h-amylín;

Zlúčeniny podľa vynálezu sa môžu za účelom prípravy farmaceutických foriem vhodných pre parenterálne podanie kombinovať s farmaceutickými nosičmi. Experimentálne zistené odozvy zlúčenín podľa vynálezu sa potvrdili klinickými aplikáciami takýchto farmaceutických kompozícií pri liečení diabetes mellitus a ďalších stavov vyžadujúcich inzulín, ako i pri prevencii a liečení nypog1ykemických epizód. Zlúčeniny podľa vynálezu sa môžu tiež kombinovať s inzulínom za účelom liečenia diabetes mellitus a ostatných inzu 1 in-vyžadujúci ch stavov. Pod pojmom inzulín sa rozumie polypeptid alebo jeho ekvivalent, ktorý je použiteľný pre reguláciu hladiny glukózy v krvi. Všeobecný popis takýchto inzulínov sa uvádza v Goodmanovej a Gi1— manovej publikácii ľhe Phermacological Basis of ľherapeutics, 8.vyd. Pergamon Press (1990). Také inzulíny môžu byť rýchle pôsobiace, stredne rýchlo pôsobiace alebo dlhodobo pôsobiace inzulíny. Existuje mnoho derivátov inzulínu a všetky tieto deriváty sú použiteľné v rámci vynálezu (viď napr. patentové spisy US 5,049,547, 5,028,587 a 5,016,643. ľiež sa môžu použiť inzulínové peptidy (viď napr. patent US 5,008,241), pokým sú inzulínovými analógmi v zmysle jeho charaktér istického účinku (viď napr. patent US 4,992,417 a 4,992,418). Také farmaceutické kompozície sa môžu podávať ľubovolnou štandardnou cestou, vrátane nazálneho podania (viď napr. patenty US 4,988,512 a 4,985,242 a 2 BioWorld Teday, č. 125 (1991)).

Zlúčeniny podľa vynálezu sú tiež použiteľné v kombinácii s glukagónom za účelom prevencie a liečenia hypoglykémie (viď napríklad Young a kol., patentová prihláška US 07/640,478, podaná 10. januára 1991 pod názvom Hyperglykemické kompozície.

Kompozície alebo produkty podľa vynálezu sa môžu formulovať vo forme roztokov vhodných pre parenterálne (vrátane intravenózneho, intramusku1 ár neho a subkutánneho podania), nazálne alebo perorálne podanie. V mnohých prípadoch môže byť vhodné formulovať agonizujúci analóg amylínu a inzulín, resp. glukagón v jednej a tej istej kompozícii alebo roztoku pre spoločné podanie oboch týchto účinných látok. V iných prípadoch môže byť výhodnejšie podávať inzulín alebo glukagón oddelene od uvedeného agoni žujúceho analógu amylínu. Vhodný aplikačný formát najlepšie stanoví ošetrujúci lekár individuálne pre každého pacienta. Vhodné farmaceutický prijateľné nosiče a ich formulácie sú popísané v štandardných odborných publikáciách, napríklad v Remington's Pharmaceutica1 Sciences, E.W. Martin (viď tiež napríklad Wang, Y.J. a Hanson, M.A. Parenteral Formulations or Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers, Journal o f Parenteral Science and Technology, T e c h nical Report č. 10, Supp.42:2S (1988). Vhodné formulácie zahrňujúce inzulín alebo glukagón sú veľmi dobre známe.

Agonizujúce preparáty podľa vynálezu sa môžu stabilizovať pri neutrálnom pH. Keďže zlúčeniny podľa vynálezu majú amfot é r n y charakter, môžu sa použiť ako voľné zásady, adičné soli s kyselinami alebo ako soli kovov. Tieto soli musia byť samozrejme farmaceutický prijateľné, pričom tieto soli budú zahŕňať soli kovov, osobitne soli alkalických kovov a kovov alkalických zemín, napríklad draselné alebo sodné soli. Ako sa už uviedlo vyššie, existuje široké spektrum farmaceutický pri ja

5 teľných adičných solí s kyselinami. Tieto soli zahŕňajú soli pripravené s organickými i anorganickými kyselinami, výhodne s minerálnymi kyselinami. Typickými kyselinami, ktoré sa môžu uviesť ako príklad, sú kyselina citrónová, kyselina jantárová, kyselina mliečna, kyselina chlorovodíková a kyselina bromovodíková. Také zlúčeniny sa môžu pripraviť postupmi, ktoré sú pre pracovníkov v danom odbore veľmi dobre známe.

Zlúčeniny podľa vynálezu sa budú normálne formulovať ako parenterálne kompozície pre injekciu alebo infúziu. Tieto zlúčeniny sa môžu napríklad suspendovať v inertnom oleji, akým je vhodne rastlinný olej, ako je sezamový olej, arašídový olej alebo olivový olej. Alternatívne sa môžu tieto zlúčeniny suspendovať vo vhodnom izotonickom pufrovom rpztoku o pH asi 5,6 až 7,4. Zvyčajne použiteľné pufrové roztoky zahrňujú pufrové roztoky citran sodný/kyse1 i na citrónová a fosfát sodný/kyse1ina fosforečná. Tiež sa môžu použiť prípravky s pomalým uvoľňovaním účinnej látky, pomocou ktorých sa terapeuticky účinné množstvo účinnej látky alebo kompozícia, ktorá ju obsahuje, uvoľňuje do krvného riečišťa po dobu mnoho hodín alebo dní po transdermá1 ne j injekcii.

Požadovaná izotonita sa môže dosiahnuť použitím chloridu sodného alebo iného farmaceutický prijateľného činidla, akým je dextróza, kyselina boritá, vínan sodný, propy 1 éng 1 yko 1 , polyoly (ako manit alebo sorbit) alebo iných anorganických alebo organických rozpustených látok. Pre pufrové roztoky obsahujúce sodné ióny je osobitne výhodný chlorid sodný.

V prípade potreby sa môžu roztoky vyššie uvedených kompozícií zahustiť zahusťovad1om, akým je mety 1ce1 u 1óza. Môžu sa pripraviť v emulgovateľnej forme a to vo forme emulzií voda-v-oleji alebo olej-vo-vode. Pritom sa môže použiť ľúbovolné emulgačné činidlo zo širokého spektra farmaceutický prijateľných emulgačných činidiel, medzi ktoré napríklad patria akáciový prášok, n.eionogénne povrchovo aktívne činidlá (akým je Tween) alebo ionogénne povrchovo aktívne činidlá (akými sú

6 po 1yétera1 koho 1su 1 f i ty alebo sulfonáty alkalických kovov, napríklad Triton).

Terapeuticky použiteľné kompozície podľa vynálezu sa pripravia zmiešaním jednotlivých zložiek za použitia obvyklých postupov. Tak sa môžu napríklad zvolené zložky jednoducho zmiešať v miešači alebo inom štandardnom zariadení, ktoré sa používa na tento účel, pričom sa získa koncentrovaná zmes, ktorá sa môže potom nastaviť na finálnu požadovanú koncentráciu a viskozitu pridaním vody alebo zahusťovadia a pridadne pufrového roztoku za účelom regulácie pH alebo dodatočnej rozpustenej látky za účelom regulácie tonie i ty.

Za účelom praktického použitia ošetrujúcim lekárom sa bude kompozícia podľa vynálezu formulovť v jednotkovej dávkovacej forme, obsahujúcej množstvo agonizujúcej zlúčeniny s inzulínom alebo glukagónom alebo bez inzulínu alebo glukagónu, ktoré bude účinné v jednej alebo násobnej dávke pri kontrole alebo opätovnom nastavení cukru v krvi na zvolenú hladinu. Terapeuticky účinné množstvá agoni žujúceho analógu amylínu na liečenie hypoglykémie sú také množstvá, ktoré zvýšia hladinu cukru v krvi, výhodne nad 80 mg/dl. Terapeuticky účinné množstvá takých agonizujúci ch analógov amylínu na liečenie diabetes mellitus alebo ostatných stavov'vy zadujúc i ch inzulín sú množstvá, ktoré sú dostatočné pre obmedzenie predávkovania inzulínu alebo nežiadúcej hypoglykémie. Pre pracovníkov v danom odbore je samozrejmé, že účinné množstvo terapeutického činidla sa mení v závislosti na mnohých činidlách, medzi ktoré patrí najmä vek a hmotnosť pacienta, pacientov fyzický stav, hladina krvného cukru, ktorá sa má dosiahnuť. Typickými dávkovými jednotkami sú pri liečení diabetes mellitus dávky obsahujúce asi 0,1 až 5 mg zlúčeniny agonizujúcej amylín a prípadne asi 0,5 až asi 10 mg inzulínu. Typickými dávkovacími jednotkami sú pri liečení hypoglykémie dávky obsahujúce asi 0,5 až 1,0 mg zlúčeniny agonizujúcej amylín a prípadne obvykle používané množstvo alebo menšie množstvo glukagónu.

Ako sa už vyššie uviedlo, kompozície použiteľné v rámci

7 vynálezu sa formulujú štandardnými postupmi. Tieto kompozície sa tiež podávajú štandardnými postupmi. Vhodné dávky týchto kompozícií sú pre pracovníkov v danom odbore rutinnou záležitosťou, pričom sa môžu použiť napríklad dávky vyššie uvedené.

V nasledovnej časti popisu sa vynález bližšie objasní pomocou konkrétnych príkladov jeho uskutočnenia, ktoré však majú len ilustračný charakter a nijak neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený formuláciou patentových nárokov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava ^2SPro-h-amylínu

Syntéza v pevnej fáze tohoto analógu ľudského (-h-) amylínu za použitia mety 1benzhydry1amínovej živicovej kotvy a N^a-Boc/benzy1-ochrany bočných reťazcov sa uskutočňuje štandardnou metódou syntézy peptidov.. Komplex ² ⁷-/d i s u 1 f i d/amy1 í n -MBFA-ži v i ce sa získa reakciou Acm-chránených cyste í nov s t r i f 1uóracetátom tálitým v kyseline tri f 1uóroctovéj . Po dokončení cyklizácie sa živica a ochranné skupiny bočných reťazcov odštiepia kvapalnou kyselinou fluorovodíkovou v prítomnosti dimetylsulfidu a anizolu. Získaný ²⁰Pro-h-amy1 í n sa prečistí vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou. Analýzou uskutočnenou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou a kapilárnou e 1ektroforézou sa zistilo. že získaný peptid je homogénny, pričom jeho štruktúra sa potvrdila am inokyse1 i novou analýzou a sekvenčnou analýzou. Produkt poskytuje ión s požadovanou hmotou.

Hmotnostné spektrum ( FAB , ionizáci a rýchlymi a tómami):(M+1)/e = 3914.

Príklad 2

Príprava ²Pro²⁶Val^2S,29Pro-h-amylínu

Syntéza v pevnej fáze tohoto amylínového analógu za použitia mety 1benthydry 1 am í novej kotvy v živici a N^a-Boc/benzy1 ochrany bočných reťazcov sa uskutočnila štandardnou metódou syntézy peptidov. Komplex ²·⁷-/disu1 f i d/amy1 ín-MBHA-ži v ice sa získal reakciou s tri f 1 uóracetátom tálitým v kyseline trif luóroctovej. Po dokončení cyklizácie sa živica a ochranné skupiny bočných reťazcov odštiepia kvapalnou kyselinou fluorovodíkovou v prítomnosti dimety1su1 f idu a anizolu. Získaný ^2sPro²⁶Val-^2a-²⁹Pro-h-amylín sa prečistí vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou. Analýzou uskutočnenou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou a kapilárnou e 1ektroforézou sa stanovilo, že získaný peptid je homogénny, pričom jeho štruktúra sa potvrdila am inokyse1 i novou analýzou a sekvenčnou analýzou. Produkt poskytuje ión s požadovanou hmotou.

Hmotnostné spektrum (FAB): ( M+1 )/e = 3 9 3 6 .

Príklad 3

Príprava ²-⁷cyklo-/²Asp,⁷Lys/-h-amylínu

Syntéza v pevnej fáze tohoto amylínového analógu za použitia väzby so živicou tvorenej mety 1benzhydry1amínovou kotvou a N^a-Boc/benzyl-ochrany bočných reťazcov sa uskutočnila štandardnou metódou syntézy peptidov. ²Asp a ⁷Lys sa zaviedli pomocou Boc-²Asp-(Fmoc)-OH a Boc-⁷Lys(Fmoc)-OH. Po selektívnom odstránení ochranných skupín bočných reťazcov piperidínom sa uskutoční cyklizácia bočný reťazec k bočnému reťazcu (²Asp-⁷Lys) za použitia benzotriazol-1-yloxy-tris(dimetylamino)fosfóniumhexaf 1 uórfosfátu (reakčné činidlo BOP). Cyklizácia sa uskutoční postupom popísaným v 0 i M a i o, J. a k o 1. , J. Med. Chem. 33:661-567 (1990) a vo Felix, A.M. a kol. Int. J. Pent. Prot. res. 32:441 ( 1 988 ). Komplex ²·⁷ c y k 1 o-/²A s p-⁷ L y s/amy1 ínMBHA-živice, získaný po cyklizácii, sa rozštiepi kvapalnou ky selinou chlorovodíkovou v prítomností d i mety 1 su1 f idu a anizolu. Získaný ²·⁷cyk 1 o-(²Asp,⁷Lys)-h-amy1 í n sa prečistí preparatívnou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou . Analýzou uskutočnenou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou a kapilárnou e 1ektroforézou sa stanovilo, že získaný peptid je homogénny, pričom jeho štruktúra sa potvrdila am inokyse 1 i novou analýzou a sekvenčnou analýzou.

Hmotnostné spektrum (FAB): (M+1)/e=3925.

Príklad 4

Príprava des-¹Lys-h-amylínu

Syntéza v pevnej fáze des-¹Lys-h-amy1 ínu (tiež uvádzaného ako ^2-37h-amy1 í n) za použitia väzby so živicou tvorenej metylbenzhydry 1aminovou kotvou a N^a-Boc/benzy1-ochrany bočných reťazcov sa uskutočnila štandardnou metódou syntézy peptidov. Komplex ²·⁷-/disu1 f id/amy1 ín-MBHA-ži v ice sa získal Acm-chránených cysteínov s tri f 1 uóracetátom tálitým v kyseline trifluóroctovej. Po dokončení cyklizácie sa živica a ochranné skupiny bočných reťazcov odštiepia kvapalnou kyselinou fluorovodíkovou v prítomnosti dimetylsulfidu a anizolu. Získaný des-¹Lys-h-amy1 í n sa prečisti preparatívnou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou s reverznou fázou. Analýzou uskutočnenou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou a kapilárnou e 1ektroforézou sa stanovilo, že získaný peptid je homogénny, pričom jeho štruktúra sa potvrdila am inokyse1 i novou analýzou a sekvenčnou analýzou. Produkt poskytuje ión s požadovanou hmotnosťou.

Hmotnostné spektrum (FAB): (M+H)*: 3,775.

Príklad 5

Príprava 'Ala-h-amylínu

Syntéza v pevnej fáze ¹ A1a-h-amylínu za použitia väzby ku živici tvorenej mety 1benzhyd r y 1 am í novou kotvou a N^a-Boc/benzy1 -ochrany bočných reťazcov sa uskutočnila štandardnou metódou syntézy peptidov. Komplex ²’⁷-/d i s u 1 f i d/amy1 ín-MBHA-ž i v ice sa získal reakciou Acm-chránených cyste i nov s trifluóracetátom tálitým v kyseline trifluóroctovej. Po dokončení cyklizácie sa živica a ochranné skupiny bočných reťazcov odštiepia kvapalnou kyselinou fluorovodíkovou v prítomnosti dimety1su1 f idu a anizolu. Získaný ¹A 1a-h-amy1 í n sa prečistil preparát ívnou vysokotlakovou chromatografiou s reverznou fázou. Analýzou uskutočnenou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou a kapilárnou e 1ektroforézou sa stanovilo, že získaný peptid je homogénny, pričom jeho štruktúra sa potvrdila am inokyse 1 i novou analýzou a sekvenčnou analýzou. Produkt poskytuje ión s požadovanou hmotnosťou.

Hmotnostné spektrum (FA8): (M + H)* - 3,847.

Príklad 6

Príprava ¹Ser-h-amylínu

Syntéza v pevnej fáze ¹ Se'r-h-amy 1 í nu za použitia väzby k živici tvorenej mety 1benzhydry1amínovou kotvou a N^a-Boc/benzyl-ochrany bočných reťazcov sa uskutočnila štandardnou metódou syntézy peptidov. Komplex ² ⁷-/d isu1 f i d/amy1 ín-MBHA-ži v ice sa získal reakciou Acm-chránených cysteínov s tri f 1uóracetátom tálitým v kyseline trifluóroctovej. Po dokončení cyklizácie sa živica a ochranné skupiny bočných reťazcov odštiepia kvapalnou kyselinu fluorovodíkovou v prítomnosti d imet y 1 s u 1 f i d u a anizolu. Získaný ^ΊSer-h-amy1 í n sa prečistí preparatívnou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou s reverznou fázou. Analýzou uskutočnenou vysokotlakovou kvapalinovou chromatoarafiou a kapilárnou e 1ektroforézou sa stanovilo, že získaný peptid je homogénny, pričom jeho štruktúra sa potvrdila am inokyse 1 i novou analýzou a sekvenčnou analýzou. Produkt poskytuje ión s požadovanou hmotnosťou.

Hmotnostné spektrum (FAB): (M+H)*=3,863.

Príklad 7

Príprava ²⁹Pro-h-amylinu

Syntéza v pevnej fáze tohoto analógu ľudského amylínu za použitia väzby k živici tvorenej metylbenzhydrylamínovou kotvou a N^a-Boc/benzyl-ochrany bočných reťazcov sa uskutočnila štandardnou metódou syntézy peptidov. Komplex ⁼·⁷-(d i s u 1 f i d)amy1 ín-MBHA-ži v ice sa získal reakciou Acm-chránených cysteínov s tri f 1uóracetátom tálitým v kyseline tri f 1uóroctovej. Po dokončení cyklizácíe sa živica a ochranné skupiny bočných reťazcov odštiepia kvapalnou kyselinou fluorovodíkovou v prítomnosti d i mety 1su1 f idu a anizolu. Získaný ²⁹Pro-h-amy 1 i n sa prečistí preparatívnou vysokotlakovou kvapa1 i novou chromatografíou. Analýzou uskutočnenou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou a kapilárnou e 1 ektroforézou sa stanovilo, že získaný peptíd je homogénny, pričom jeho štruktúra sa potvrdila aminokyselinovou analýzou a sekvenčnou analýzou. Produkt poskytuje ión s požadovanou hmotnosťou.

Hmotnostné spektrum (FAB): (M+H) - 3916.

Príklad 8

Príprava ^2S-^2SPro-h-amylínu

Syntéza v pevnej fáze ²⁵ · ^2SPro-h-amy1 ínu za použitia väzby k živici tvorenej metylbenzhydrylamínovou kotvou a N^-Boc/ benzy1-ochrany bočných reťazcov sa uskutočnila štandardnou metódou syntézy pepti dov . Kômp 1 ex ² ⁷-/d isu1 f i d/amy1 ín-MBHA-ži v ica sa získa reakciou Acm-chránených cysteínov s trifluóracetátom tálitým v kyseline tri f 1 uóroctovej. Po dokončení cyklízácie sa živica a ochranné skupiny bočných reťazcov odštiepia kvapalnou kyselinou fluorovodíkovou v prítomnosti dimetylsul f i d u a anizolu. Získaný ^2S-^2QPro-h-amylín sa prečistí preparatívnou kvapalinovou vysokotlakovou chromatografiou s reverznou fázou. Analýzou uskutočnenou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografi o u a kapilárnou e 1 ektroforézou sa stanovilo, že získaný peptíd je homogénny, pričom jeho štruktúra sa potvrdila aminokyse1 i novou analýzou a sekvenčnou analýzou. Produkt poskytuje ión s požadovanou hmotnosťou.

Hmotnostné spektrum (FAB): (M+H)“ = 3,939.

Príklad 9

Príprava des-¹Lys^2S'²°Pro-h-amylinu

Syntéza v pevnej fáze des-¹Lys²⁵·²°Pro-h-amy 1 inu za použitia väzby k živici tvorenej mety 1benzhydry1aminovou kotvou a N^a-Boc/benzy1-ochrany bočných reťazcov sa uskutočnila štandardnou metódou syntézy pepti dov.Kômp 1 ex ²’⁷-/a isu1 f i d/amy1 ínMBHA-živica sa získal reakciou Acm-chránených cysteínov s trif1uóracetátom tálitým v kyseline tri f 1 uóroctovéj. Po dokončení cyklizácie sa živica a ochranné skupiny bočných reťazcov odštiepia kvapalnou kyselinou fluorovodíkovou v prítomnosti dimetylsulfidu a anizolu. Získaný desN-ys^’^Pro-h-amylín sa prečistí preparatívnou kvapalinovou vysokotlakovou cnromatografiou s reverznou fázou . Ana1ýzou uskutočnenou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou a kapilárnou elektroforézou sa stanovilo, že získaný peptíd je homogénny, pričom jeho štruktúra sa potvrdila aminokyselínovou analýzou a sekvenčnou analýzou. Produkt poskytuje ión s požadovanou hmotnosťou.

Hmotnostné spektrum (FAB): (M+H)“ - 3,811.

Príklad 10

Príprava ¹°Arg²⁵ ²°Pro-h-amy 1 inu

Syntéza v pevnej fáze ^Ί°Arg ²⁵ ²°Pro-h-amy1 í n u za použitia väzby k živici tvorenej met y 1benz h y d r y 1 am i novou kotvou a N~ Boc/benzy1-ochrany bočných reťazcov sa uskutočnila štandardnou metódou syntézy pepti d ov.Komplex ²·⁷ -/a i s u 1 f i d/amy1 í n-MBHA-ž i vica sa získal reakciou Acm-chranených cysteinov s trifluóracetátom tálitým v kyseline tri f 1uóroctovej. Po dokončení cyklizácie sa živica a ochranné skupiny bočných reťazcov odštiepia kvapalnou kyselinou fluorovodíkovou v prítomnosti dimetylsulfidu a anizolu. Získaný ^1sArg²⁵·^2SPro-h-amylí n sa prečistí preparát ívnou kvapalinovou vysokotlakovou chromatografiou s reverznou fázou. Analýzou uskutočnenou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou a kapilárnou e l ektroforézou sa stanovilo, že získaný peptid je homogénny, pričom jeho štruktúra sa potvrdila am i no k y s eli novou analýzou a sekvenčnou analýzou. Produkt poskytuje ión s požadovanou hmotnosťou, Hmotnostné spektrum (FAB): (M+H)* = 3,959.

Príklad 11

Príprava des-¹Lys^1sArg^25,2sPro~h-amylínu

Syntéza v pevnej fáze des-¹Lys^ΊsArg²⁵·^2sPro-h-amy1 ínu za použitia väzby k živici tvorenej metylbenzhydrylamínovou kotvou a N^a-Boc/benzyl-ochrany bočných štandardnou metódou syntézy peptidov. mylín-MBHA-živica s tri f 1uóracetátom reťazcov sa uskutočnila sa získa končení cyklizácie tálitým v sa živica reakc iou

Komplex ²·⁷-/d isu1 f i d/aAcm-chránených cysteinov kyseline tri f 1uóroctovej. Po doa ochranné skupiny bočných reťazcov odštiepia kvapalnou kyselinou fluorovodíkovou v prítomnosti dimety1su1 f idu a anizolu. Des-¹ Lys^1sArg²⁵·^2ePro-h-amy1 í n sa prečisti preparatívnou kvapalinovou vysokotlakovou chromatografiou s reverznou fázou. Analýzou uskutočnenou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou a kapilárnou e 1ektroforézou sa stanovilo, že získaný peptid je homogénny, pričom jeho štruktúra sa potvrdila aminokyselinovou analýzou a sekvenčnou analýzou. Produkt poskytuje ión s požadovanou hmotnosťou. Hmotnostné spektrum (FAB): (M + H ) * = 3,532.

Príklad 12

Príprava ¹⁸Arg-⁵'-^a’²³Pro-h-amylínu

Syntéza v pevnej fáze ^{1 8}Arg^2S ²⁸ ²⁹Pro-h-amy1 ínu za použitia väzby so živicou tvorenej mety 1benzhydry1amínovou kotvou a N^a-Boc/benzy1-ochrany bočných reťazcov sa uskutočnila štandardnou metódou syntézy .peptidov.Kômp 1 ex ² ⁷-/disu1 f i d/amy1 ínMBHA-živica sa získal reakciou Acm-chránených cyste í nov s tri f 1uóracetátom tálitým v kyseline tri f 1 uóroctovej. Po dokončení cyklizácie sa živica a ochranné skupiny bočných reťazcov odštiepia kvapalnou kyselinou fluorovodíkovou v prítomnosti d i mety 1 su 1 f i du a anizolu. Získaný ^{1 8}Arg^2S·²³·²⁹Pro-h-amy1 í n sa prečistí preparatívnou kvapalinovou vysokotlakovou chromatografiou s reverznou fázou. Analýzou uskutočnenou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou a kapilárnou e 1ektroforézou sa stanovilo, že získaný peptid je homogénny, pričom jeho štruktúra sa potvrdila am inokyse1 i novou analýzou a sekvenčnou analýzou. Produkt poskytuje ións požadovanou hmotnosťou. Hmotnostné spektrum (FAB): (M+H)* = 3,971.

Príklad 13

Príprava des - ¹ Lys ^{1 s}Arg²⁵·⁹⁹ ²⁹Pro-h-amylí nu .Syntéza v pevnej fáze des-¹ L y s ¹⁸Arg ²⁵·²⁸·²⁹Pro-h-amyI ínu za použitia väzby k živici tvorenej met y 1 benzhydry1 am í novo u kotvou a N^a-Boc/be n z y 1-och rany bočných reťazcov sa uskutočnila štandardnou metódou syntézy peptidov. Komplex ²·⁷-/d isu1 f i d/amy1 ín-MBHA-ž i v ica sa získal reakciou Acm-chránených cysteínov s trifl uóracetátom tálitým v kyseline trifluór'octovej. Po dokončení cyklizácie sa živica a ochranné skupiny bočných reťazcov odštiepia kvapalnou kyselinou fluorovodíkovou v pri tomnos ti dimetylsulfidu a anizolu. Získaný des-¹l_ys^iaArg^2S-^2e-²⁹Proh-amylín sa prečistí preparatívnou kvapalinovou vysokotlakovou chromatografiou s reverznou fázou. Analýzou uskutočnenou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou a kapilárnou elektroforézou sa stanovilo, že získaný peptid je homogénny, pričom jeho štruktúra sa potvrdila am ínokyse1 i novou analýzou a sekvenčnou analýzou. Produkt poskytuje ión s požadovanou hmotnosťou .

Hmotnostné spektrum (FAB): (M+H)* = 3,843.

Príklad 14

Príprava ²⁵-²³-²⁹Pro-h-amylínu

Syntéza v pevnej fáze ²⁵ · ²⁸ · ²⁹Pro-h-amy1 ínu za použitia väzby k živici tvorenej mety 1 benzhydry1amínovou kotvou a N^aBoc/benzy1-ochrany bočných reťazcov sa uskutočnila štandardnou metódou syntézy peptidov.Kômp 1 ex ²·⁷-/disu1 fid/amy1 ín-MBHA-ži vĺča sa získal reakciou Acm-chránených cyste í nov s trifluóracetátom tálítým v kyseline trí f 1uóroctové j. Po dokončení cyklizácie sa živica a ochranné skupiny bočných reťazcov odštiepia kvapalnou kyselinou fluorovodíkovou v prítomnosti dimetylsulfidu a anizolu. Získaný ²⁵ · ²⁸ · ²⁹Pro-h-amy1 í n sa prečistil preparát ívnou kvapalinovou vysokotlakovou chromatografiou s reverznou fázou. Analýzou uskutočnenou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou a kapilárnou elektroforézou sa stanovilo, že získaný peptid je homogénny, pričom jeho štruktúra sa potvrdila aminokyselinovou analýzou a sekvenčnou analýzou. Produkt poskytuje ión s požadovanou hmotnosťou.

Hmotnostné spektrum (FAB): (M+H)* - 3,949.

Príklad 15

Príprava des-¹Lys²⁵-²³-²⁹Pro-h-amylínu

Syntéza v pevnej fáze des-¹Lys²⁵·²³-²⁹Pro-h-amylínu za použitia väzby k živici tvorenej metylbenzhydrylamínovou kotvou a N^a-Boc/benzyl-ochrany bočných reťazcov sa uskutočnila štandardnou metódou syntézy peptidov. Komplex ² · ⁷-/d i s u l f i d zdarný l í n-MBHA-ž i v i ca sa získal reakciou Acm-chránených cysteínov s trifluóracetátom tálitým v kyseline trifluóroctovej. Po dokončení cyklizácie sa živica a ochranné skupiny bočných reťazcov odštiepia kvapalnou kyselinou fluorovodíkovou v prítomnosti dimetylsulfidu a anizolu. Získaný des-¹Lys^2s-²⁸-²⁹Pro-h-amylín sa prečistí preparát ívnou kvapalinovou vysokotlakovou chromatografiou s reverznou fázou. Analýzou uskutočnenou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou a kapilárnou elektroforézou sa stanovilo, že získaný peptid je homogénny, pričom jeho štruktúra sa potvrdila aminokyselinovou analýzou a sekvenčnou analýzou. Produkt poskytuje ión s požadovanou hmotnosťou.

Hmotnostné spektrum (FAB): (M+H)* = 3,823.

Príklad 16

Príprava des-'^,Lys^2SPro^2eVal^2e,29Pro-h-amylínu

Syntéza v pevnej fáze tohoto h-amy1 í nového analógu za použitia väzby k živici tvorenej mety 1benzhydry1amínovou kotvou a N^a-Boc/ben z y 1-och rany bočných reťazcov sa uskutočnila štandardnou metódou syntézy peptidov a komplex ² · ⁷-/d i s u 1 f i d zdarný 1 í n-MBHA-ž i vi ca sa získal reakciou s trifluóracetátom tálitým v kyseline trifluóroctovej. Po dokončení cyklizácie sa živica a ochranné skupiny bočných reťazcov odštiepia kvapalnou kyselinou fluorovodíkovou v prítomnosti dimetylsulfidu a anizolu. Získaný des-¹Lys²⁵Pro^2SVal²⁵’^2SPro-h-amylín sa potom prečistí preparát ívnou kvapalinovou vysokotlakovou chromatografiou s reverznou fázou.

Príklad 17

Príprava /(O ) - ¹¹Arg/-amy1 ínu

Syntéza v pevnej fáze tohoto amy1 í nového analógu za použitia väzby k živici tvorenej mety 1bezhydry 1amínovou kotvou a N“Boc/benzyl-ochrany bočných reťazcov sa uskutoční štandardnou metódou syntézy peptidov. (Dj-^Arg sa zavedie prostredníctvom (D)- ¹¹Arg(Mt r)-OH. Komplex ²·⁷-/d i s u 1 f i d/amy1 ín-MBHAživica sa získa reakciou s tri f 1uóracetátom tálitým v kyseline tri f 1 uóroctovej . Po dokončení cyklizácie sa živica a ochranné skupiny bočných reťazcov odštiepia kvapalnou kyselinou fluorovodíkovou v prítomnosti d í met y 1 s u 1 f i d u a anizolu. Získaný /(D)- ^1ΊArg/-amy1 í n sa potom prečistí preparatívnou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou.

Príklad 18

Test stanovujúci väzbu k receptoru

Vyhodnotenie väzby zlúčenín podľa vynálezu k amylí novým receptorom sa uskutočňuje nasledovným spôsobom. Pri tomto teste sa používa ^12SJ-krysí amylín (Bo 1ton-Hunter, značený na N-ter m i ná 1 r.om lyzíne), ktorý je komerčne prístupný u firmy Amersham Corporation (Arlington Heights, IL). Špecifická aktivita v okamihu použitia činila 1950 až 2000 Ci/mmol. Neznačené peptidy sa získali od firmy Bachem Inc. (Torrance, CA) a Peninsula Laboratories (Belmont, CA).

Krysí samčekovia Sprague-Daw1ey s telesnou hmotnosťou 200 až 250 g sa usmrtili oddelením hlavy. Krysí mozog sa vypreparoval a uložil do chladného fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) . Z ventrálneho povrchu sa viedli rezy rostrálne k hyothalamu laterárne spojené s čuchovými traktami a vybiehajúce v uhle 45* mediálne z týchto traktov. Toto bazálne tkanivo predného mozgu, obsahujúce nucleus accumbens a priľahlé oblasti, sa odváži a homogenizuje v ľadovo chladnom 20 mM pufrovom roztoku Hepes (20 mM Hepes-kyseliny, pH nastavené na 7,4 použitím hydroxidu sodného pri teplote 23 ' C) . Membrány sa trikrát premyjú čerstvým pufrovým roztokom, pričom medzi jednotlivými suspendovaniami v uvedenom pufrovom roztoku sú zaradené 15 minútové odstredenia pri 48 000 x g. Finálna membránová peleta sa opätovne suspenduje v 20mM pufrovom roztoku Hepes, ktorý obsahuje 0,2 mM feny Imety1sulfony 1 f 1uoridu (PMSF).

Za účelom zmerania ^12sJ-amy1 í nove j väzby sa membrány zo 4 g pôvodného vlhkého tkaniva inkubujú so ¹²⁵J-amy1 ínom pri 12-16 pM v 20mM pufrovom roztoku Hepes, ktorý obsahuje 0,5 mg/ml bacitracínu, 0,5 mg/ml albumínu z bovinného séra a 0,2 nM PMSF. Roztoky sa inkubujú po dobu 60 minút pri teplote 23 ’C. Inkubácia sa ukončí filtráciou cez filter zo sklenených vlákien GF/B (Whatman Inc., Clifton, NJ), ktorý sa predbežne vlhčil po dobu 4 hodín v 0,3 % po 1yety1éni m í ne za účelom redukcie nešpecifickej väzby radiačné značených peptidov. Filtre sa bezprostredne pred filtráciou premyli 5 ml chladného PBS a bezprostredne po filtrácii 15 ml chladného PBS. Filtre sa oddelili a ich rádioaktivita sa zmerala gamma-počítačom s účinnosťou 77 %. Meraním väzby v prítomnosti 10~ ^{1 2} až 10 “⁶M radiačné neznačenej testovanej zlúčeniny sa získali kompetičné krivky, ktoré sa analyzovali nelineárnou regresiou za použitia 4-parametrových logaritmických rovníc (program Impot, GraphPAD Software, San Diego).

Pri tomto teste sa purifikovaný ľudský amylín viaže ku svojmu receptoru mierou vyjadrenou ako ICso, ktorá sa rovná asi 50 pM. Výsledky tohtoto testu získané pre testované zlúčeniny podľa vynálezu sa uvádzajú v ďalej zaradenej tabuľke I, z ktorej je zrejmé, že každá z uvedených zlúčenín má významnú schopnosť väzby k amylínovému receptoru.

Príklad 19

Test s lýtkovým svalom

Vyhodnotenie amy1 in-agonizujúcej účinnosti zlúčenín podľa vynálezu sa uskutočňuje za použitia nasledovného testu s lýtkovým svalom. Pri tomto teste sa použili krysí samčekovia Marian Sprague-Oaw1ey s približnou telesnou hmotnosťou 200 g, aby sa získala hmotnosť oddeleného lýtkového svalu nižšia ako 40 mg. Pokusné zvieratá sa po dobu 4 hodín pred usmrtením oddelením hlavy udržujú v režime pôstu. Zo zadnej okončatiny sa stiahne koža a okončantina sa fixuje na korkovej doštičke. Achillova šľacha sa nareže tesne nad pätovou kosťou a musculus gastrocnemius sa odchýli od zadnej častí holene. Lýtkový sval, ktorý je malý 15 až 20 mm a 0,5 mm silný plochý sval na kostnom povrchu privrátenom k musculus gastrocnemius, sa potom stiahne z kostného povrchu a obal svalových snopcov (per i myši um ) sa zo svalu odstráni použitím jemných nožničiek a lekárskych klieští. Lýtkový sval sa potom rozreže na štyri rovnaké diely použitím žiletky, ktorá sa vedie spredu dozadu cez bruško svalu, pričom sa získajú celkom 4 svalové prúžky od každého pokusného zvieraťa. Po odrezaní svalu od pokusného zvieraťa sa sval udržoval po krátku dobu vo fyziologickom roztoku. Nebolo nevyhnutné, aby sa sval udržoval pod napätím, pretože toto napätie nemalo demonštrovateľný účinok na inkorporovan.ie radiačné značenej glukózy do glykogénu.

Uvedené svaly sa potom zaviedli do 50 ml Er1 enmayerových baniek obsahujúcich 10 ml predp 1 yneného Krebs-Ringerovho hydrogénuh1 i č itanového pufrového roztoku obsahujúceho (v litri): chlorid sodný - 118,5 mmolu (6,93 g), chlorid draselný - 5,94 mmolu (443 mg), chlorid vápenatý - 2,54 mmolu (282 mg), síran horečnatý - 1,19 mmolu (143 mg) d ihydroaénfosforečnan draselný

- 1,19 mmolu (162 mg), hydrogénuh1 i č itan sodný - 25 mmolov (2,1 g), 5,5 mmolu glukózy (1 g) a rekombínantný ľudský inzulín (Humulin-R, E 1 i testovanú zlúčeninu, leží v rozmedzí medzi

Lilly, IN), ako i nižšie špecifikovanú

Skontroluje sa, či pH pri teplote 37 C 7,1 a 7,4. Svaly sa do jednotlivých ba niek rozmiestnia tak, že sa 4 svalové diely od každého pokusného zvieraťa rovnomerne rozdelia medzi odlišné testové podmienky.Inkubačné prostredia sa plynili vháňaním mierneho prúdu plynu s obsahom 95 povrch za súčasného mocou oscilujúceho pred inkubačnej periódy sa % kyslíka a 5 % miešania vodného prostredia kúpeľa. Po do každej oxidu uhličitého nad ich pri tep lote 37 ’C pouplynutí polhodinovej banky pridá 0,5 /uCi

U - ^{1 Λ} C - g 1 u k ó z y a obsahy baniek sa inkubujú po dobu ďalších 60 minút. Každý svalový prúžok sa potom z banky rýchlo odstráni, zbaví tekutiny vysatí m, zmrazí sa v kvapalnom dusíku, odváži a uloží za účelom následného stanovenia ^1ztC-glykogénu.

Stanovenie ¹⁴C-g 1 ykogénu sa uskutočňuje v 7 ml scintilačnej nádobky. Každá zmrazená vzorka svalu sa umiestni do uvedenej nádobky a digeruje 1 ml 60 % hydroxidu draselného pri teplote 70 'C po dobu 45 minút pri ’kontinuálnom miešaní. Rozpustený glykogén sa potom vyzráža v nádobke pridaním 3 ml absolútneho etanolu a chladí sa cez noc pri teplote -20 ’C. Supernatant sa potom opatrne odsaje, glykogén sa opätovne premyje etanolom, supernatant sa znovu odsaje a zvyšná zrazenina sa za vákua vysuší. Odparí sa všetok etanol, aby sa zabránilo zhášaniu v priebehu scinti 1ačného merania. Zvyšujúci glykogén sa znovu rozpustí, tentoraz v 1 ml vody a 4 ml scintilačnej tekutiny a potom sa meria rádioaktivita ¹⁴C.

Miera inkorporácie glukózy do glykogénu (vyjadrená v /mol/g/h) sa stanoví zo špecifickej aktivity ¹⁴C-g 1 ukózy v 5,5 nM glukózy inkubačného prostredia a z celkovej rádioaktivity ^{1 4}C, ktorá zostala v glykogéne extrahovanom z každého svalu. Krivky odozva/dávka sa spracujú 4-parametrovým logaritmickým modelom použitím rutinnej metódy najmenších štvorcov (A 11 f í t, v 2,7, NIH , MO) za účelom získania hodnôt ECso. Pretože ECso sa log-normálne distribuuje, je vyjadrená ± štandardnou odchýlkou logaritmu. Párové porovnanie sa uskutočňuje použitím rutinnej metódy na báze t-testu Systat (Wilkinson, Systat: the systém for statistics, Systat I n c., Evanston IL (1989)).

Krivky dávka/odozva sa získali pridaním svalu k prostrediu, ktoré obsahuje 7,1 nM (1000 zuU/ml) inzulínu a každú testovanú zlúčeninu pridanú vo finálnych (nominálnych) koncentráciách 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300 a 1000 nM. Pri každom teste sa tiež zahrnul vnútorný pozitívny kontrolný pokus tvorený šaržou krysieho amylínu, ktorý sa lyofilizoval a uložil pri teplote -70 ’C.

Ľudský amylin je známy ako hyperg 1 ykemický peptid a meranie ECso amylí nových preparátov pri teste s lýtkovým svalom obvykle poskytuje hodnoty asi 1 až 10 nM, i keď niektoré komerčné preparáty, ktoré majú nižšiu čistotu ako 90 %, majú hodnoty ECso pri teste s hladkým svalom vyššie ako hodnoty v uvedenom rozmedzí, a to dôsledkom prítomnosti kontaminujúcich látok, ktoré znižujú hodnotu nameranej ECso. Výsledky toho t o testu pre testované zlúčeniny podľa vynálezu, ktoré sa uvádzajú v nasledovnej tabuľke I, ukazujú, že každá z testovaných zlúčenín podľa vynálezu má amylínovú účinnosť.

Tabuľka I ľest na väzbu k receptoru ICso(pM)

Test s hladkým svalom ECso(nM)

1)	²⁸Pro-h-Amylín	15.0	2 . 64
2)	²⁵Pro^2SVal²⁸ · ²⁹Pro-h-Amy1 í n	13.0	4.68
3)	²-⁷Cyclo-[²Asp,⁷Lys]-h- A m y 1 í n	3 10.0	6 .62
4)	^{2-3 7}h-Amy 1 í n	2 36.0	1 .63
5)	¹A 1a-h-Amy1 í n	148.0	12.78
6)	¹Ser-h-Amylí n	33.0	8 . 70
7)	²⁹Pro-h-Amylín	64.0	3.75
8)	^2S-^2SPro-h-Amylín	26.0	13.20
9 )	des-^ys²⁵ · ^2SPro-h-Amyl í n	85.0	7 . 70
10)	¹⁸Arg²⁵’²³Pro-h-Amylín	32.0	2 .83
1 1 )	des-¹Lys^{1 8} A r g ^{2 5} ²⁸Pro-hA m y 1 í n	82.0	3.77
012)	^{1 8}Arg^2S ²⁸ · ²⁹Pro-h-Amylin	2 1.0	1.25
13)	des-¹Lys^iaArg²⁵'²⁸'²⁹Pro-h- Amy 1 í n	2 1.0	1.86
14)	²⁵’²⁸’²⁹Pro-h-Amylín	10.0	3.71
15)	des-¹Lys²⁵-^2S,29Pro-h-Amylín	14.0	4.15

a

X *—) — X (X· X« X« K—< X. 2-í X. Xt X< *—— X· X- X-· —zzzzzzzzzzzzzzzzzz

I , > I I I > < I I I < I I I I I

CZ CZ < <

CX CX

CX

CZ

CX

CZ <:

cx

CZ) <

cx cz <

o xxxOxOOOxOOOOxOOO '— OÍJ4J'— 4JX^-X4JXI-‘XXO’“XX XZ«!ZXcrC.XXCOC-XXXWXXX

0000c0000xx0³x0i-.00

- x — ·— — ·— t- i- u- u <u 5J x 4J 4J L. 4J x x t>; c. C. C. ii. c. C. C. G. w « C. J w ft.)W £.· &.

'.I

CCCCCCPCO_2JJO«_«_<3^= (Ξ££££ρ££Ζ<<£<<<<

Tabuľka

I

ci

o 1 g tň <

S tn <

s 1 tn <

5 T tn <

•ύ i v* <

5 1 tn <

5 íň <

GJ /* /-· tn <

<υ 1 tn <

3 p* tn <

2 J c CZ <

M <

á tn

H tn

5 tn

O l ►—4 tn

S u tn

5 tn

u.

i—

L-

u

u.

U.

u

L-

U.

L.

u.

—-

o

GJ

U

GJ

<u

o

GJ

dj

o

dj

dJ

4J

gj

O

U

tx|

CO

cn

OO

CC

OQ

OO

00

oo

00

CO

00

CO

oo

L-

L·.

t—

u.

U

í—

L-

u.

—

<υ

U

o

<υ

GJ

u

GJ

v

<u

•v

<u

GJ

o

dj

t-;l

cn

CC

CO

CC

oc

CC

oo

oc

oo

CO

oo

CO

CC

oo

CO

CC

tn

ea

co

00

tn

CO

00

oo

tn

CO

00

u*

L·.

·—.

Ql

—

<

Z

<

—

í)

G)

d)

1)

_

3Í

CC

<JI

>

> >

> > >

>

¢5

c:

-

.

cí

c:

λ

L·.

t-.

C|

<

x.

—

r .

H

ŕ-

H

x:

<%

x:

tn

'

tn

nr

tn

Ή_#

tn

V]

tn

—

>s

>>

Ή

>%

>.

>>

>.

H

>%

>»

>s

>>

>s

<1

-J

B

?

1

Ί

Í5

J

t

i

)

.J

1

CG

o

O

—

CM

ΓΊ

L/—}

M3

Γ

CO

o

—

CM

m

*·*

1

—·

CM

ΓΊ

cn

m

σΊ

m

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1 . Agon i z u júc i analóg amylínu majúci venciu definovanú na obr. 3, kde A , znamená Lys , Ala, Ser alebo vodík , B i znamená Ala, Ser alebo Thr, C 1 znamená Val , Leu alebo íle, D i znamená H i s alebo Arg, E i znamená Ser alebo Thr , F 1 znamená Ser , Thr, Gin alebo Asn, G 1 znamená Asn , Gin alebo His, H i znamená Phe , Leu alebo Ťyr, I 1 znamená A1 a a lebo Pro, J 1 znamená íle, Val, Ala alebo Leu , K 1 znamená Ser , Pro, Leu, íle alebo Thr L i znamená Ser , Pro alebo Thr, Mi znamená Asn , Asp, Gin a 1ebo Asn ,

am inokyse1 i nov ú sek1 x

a

Y sú nezávisle zvolené zvyšky majúce sa chemicky viažu jeden k druhému za lárnej väzby a znamená am í novú skupinu, alkylamínovú skupinu, dialkylamínovú skupinu, cyk1oa1ky1amínovú skupinu, arylaminovú skupinu, ara 1ky1amínovú skupinu, a 1 ky 1 oxy-skupinu , aryloxy-skupinu alebo ara 1 k y 1oxy-skúp i n u, výhradou spočívajúcou v tom, že keď

a) keď Ai znamená Lys, Bi znamená Ala, Ci znamená Val, D, bočné reťazce, ktoré vzniku intramolekuznamená His, Ei znamená Ser, Fi znamená Ser, G, znamená Asn, Hi znamená Phe, I, znamená Ala,Ji znamená íle, Kí znamená Ser, Li znamená Ser a Mi znamená Asn,

b) keď A, znamená Lys, Bi znamená Ala, C i znamená íle, D -> znamená Arg, Ei znamená Ser, Fi znamená Ser, Gi znamená Asn, Hi znamená Leu, Ii znamená Ala,Ji znamená íle,

Kí znamená Ser, L> znamená Pro a Mi znamená Asn,

c) keď Ai znamená Lys, Bi znamená Ala, Ci znamená Val, Di znamená Arg, Ei znamená Thr, F > znamená Ser, Gi znamená Asn, Hi znamená Leu, I, znamená A l a, J > znamená íle, K-i znamená Ser, L· znamená Pro a Mi znamená Asn,

d) keď Ai znamená Lys, Bi znamená Ala, Ci znamená Val, D i znamená Arg, Ei znamená Ser , F i znamená Ser, Gi známe- n á Asn, H i znamená Leu , Ii znamená Pro,Ji znamená Val, Kí znamená Pro, Li znamená Pro a Mi znamená Asn, e) keď A i z namená Lys, Bi znamená Ala, Ci znamená Val, D i znamená H i s , E i znamená Ser, F i znamená Asn, Gi znamená Asn, H i znamená Leu , 11 znamená Pro, J i znamená Val, Kí znamená Ser, L i znamená Pro a M i znamená Asn alebo f) keď A i znamená Lys, Bi znamená Thr, Ci znamená Val, Di znamená Arg, Ei znamená Ser , F i znamená Ser, Gi zname- H i s , Hi znamená Leu, 11 znamená A1 a, J i znamená A 1 a,K 1 znamená Leu, L i znamená Pro a M i znamená Asp,

potom jeden alebo niekoľko ľubovolných zvyškov z Ai až Mi neznamená, príp. neznamenajú L-aminokyselinu a Z neznamená amínovú skupinu.

nej

Agoni žujúci

Y majú bočné väzby , ktorá väzbu , akenylovú analóg reťazce zahŕňa väzbu, amylínu podľa nároku zvolené na vytvorenie

1 , v ktorom i ntramo lekulárdisulfidovú väzbu, laktám, alkylénovú alkinylovú väzbu, éterovú väzbu alebo t i oéterovú väzbu .

3 . Agoni žujúci a n a 1 ó g a m y 1 í n u podľa nároku 2, v ktorom X a Y obsahujú zvyšky Cys spojené disulfidovou väzbou, 4 . Agon i zujúc i ana 1 óg amylínu podľa nároku 3 , v ktorom aspoň jeden z I i , K , a L i znamená Pro, 5 . Agonizujúci a n a i ó g amylínu podľa nároku 4, , v ktorom dva

z Ιι, Κι a Li znamenajú Pro.

6 . K 1 Agon i zujúc i analóg a L i znamenajú Pro. amylínu podľa nároku 4, v ktorom In, 7 . Agonizujúci analóg amy 1 i nu podľa nároku 4, 5 alebo 6, v ktorom Di znamená Arg. 8 . Agonizujúci analóg amylínu podľa nároku 4 , 5 alebo 6, v

ktorom Ji znamená Val.

9. Agon i zujúc i znamená Lys. analóg amylínu podľa nároku 7. > v ktorom Ai 10. Agonizujúci znamená vodík. analóg amy 1 í n u podľa nároku 7. , v ktorom A i 11. Agonizujúci znamená Lys. analóg amylínu podľa nároku 8. , V ktorom A 1 12. Agon i zujúc i analóg amylínu podľa nároku 1 , v ktorom intramolekulárna väzba z ahrňuje 1 aktám, alkylénovú väzbu , al- keny1ovú väzbu , alkinylovú väzbu, éterovú väzbu alebo tioéte-

r o v ú väzbu.

13. Agonizujúci analóg amylínu podľa nároku 12, v ktorom aspoň jeden z Ii, Kí a Li znamená Pro.

1 4 . Agon i zujúc i analóg amy1 í nu podľa nároku 13, v ktorom as- poň dva z 11, Kí a L i z namenajú Pro. 1 5 . Agonizujúci analóg a m y 1 í n u podľa nároku 13, v ktorom Ii, K i ä L i znamenajú Pro . 16. Agon i zujúc i analóg amy1 í nu podľa nároku 13, 14 alebo 15,

v ktorom Di znamená Arg.

17. Agon i z u júci znamená Leu.

18. Agonizujúci znamená Lys.

19. Agon izu júc i znamená Lys.

analóg amylínu analóg amylínu analóg amylínu

20 .

Agonizujúci podľa nároku podľa nároku podľa nároku analóg amy1 ínu podľa

16, v ktorom Hi

17, v ktorom A i

16, v ktorom Ai nároku 16, v ktorom Ai znamená vodík.

Agonizujúci analóg amylínu majúci aminokyselinovú s e k v e nciu definovanú na obr. 3, ktorá neobsahuje mostík a v ktorej

A i znamená Lys, Ala, Ser alebo bo acetylovaný Lys, vodík B i znamená Ala, Ser alebo Thr, C 1 znamená Val, Leu alebo íle, D i znamená His alebo Arg, E i znamená Ser alebo Thr, r 1 znamená Ser, Thr, Gin alebo Asn ,

des-alfa-amino-Lys ale-

G , znamená Asn , Gin alebo H i s , H , znamená Phe , Leu alebo Ty r , I n znamená A 1 a alebo Pro, J 1 znamená íle , Va 1 , Ala alebo Leu, K t znamená Ser , Pro , Leu, íle alebo Thr, L i znamená Ser , Pro a 1ebo Thr, M i znamená Asn , Asp , Gin alebo Asn, X a Y sú nezávisle zvolené z množiny zahrňujúcej Ala, Ser, Cys , Val, Leu, íle a alkyl-, aryl- alebo aralkylester Ser alebo Cy s , a Z znamená am í novú skupinu, alkylaminovú s kupinu,d i a 1ky1 am í -

novú skupinu, cyk 1 oa1ky1amínovú skupinu, arylamínovú skupinu, aralkylamí novú skupinu, a 1ky1oxy-skupinu , ary 1oxy-skupinu a aralkyloxy-skupinu.

22. Spôsob liečenia diabetes mellitus a jeho symptómov, vyznačený tým, že sa podá terapeuticky účinné množstvo agoni žujúceho analógu amylínu podľa nároku 1.

23. Spôsob liečenia diabetes mellitus a jeho symptómov, vyznačený tým, že sa podá terapeuticky účinné množstvo agoni žujúceho analógu amylínu podľa nároku 3.

24. Spôsob liečenia diabetes mellitus a jeho symptómov, vyznačený tým, že sa podá terapeuticky účinné množstvo ago n i z u j úceho analógu amylínu podľa nároku 21.

25. Spôsob podľa nároku 22, vyznačený tým, že sa naviac podá terapeuticky účinné množstvo inzulínu.

26. Spôsob podľa nároku 23, v y z n a č e n ý t ý m , že sa naviac podá terapeuticky účinné množstvo inzulínu.

27. Spôsob podľa nároku 24, v y načsný tým že sa naviac podá terapeuticky účinné množstvo inzulínu.

28 .

Spôsob liečenia hypog1 ykemického stavu u cicavca, vyznačený tým že sa podá terapeuticky účinné množstvo agoni žujúceho amylínu podľa nároku 1.

29. Spôsob liečenia hypog1 ykemického stavu u cicavca, vyznačený tým, že sa podá terapeuticky účinné množstvo agoni žujúceho amylínu podľa nároku 3.

30. Spôsob liečenia hypog1 ykemického stavu u cicavca, vyznačený ť ý m , že sa podá terapeuticky účinné množstvo agoni žujúceho amylínu podľa nároku 21.

31. Spôsob naviac podá podľa nároku terapeut i cky

28, vyznač účinné množstvo e n ý g 1ukagónu.

že sa

32. Spôsob naviac podá podľa nároku terapeut i cky

29, vyznač účinné množstvo e n ý t ý g 1ukagónu .

že sa

33. Spôsob podľa nároku 30, v y z n a č e n ý t ý m že sa naviac podá terapeuticky účinné množstvo glukagónu.

34. Kompozícia, vyznačená tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo agoni žujúceho analógu amylínu podľa nároku 1 .

35. Kompozícia, v y n a č e n á tým že obsahuje tera39 peut i cky účinné množstvo agoni žujúceho analógu amylínu podľa nároku 3.

Kompozícia, vyznačená tým že obsahuje terapeuticky účinné množstvo agonizujúceho analógu amylínu podľa nároku 2 1 .

37. Kompozícia, vyznačená tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo agonizujúceho analógu amylínu podľa nároku 1 a inzulín primiešaný vo forme vhodnej pre terapeutické podan i e .

38. Kompozícia, vyznačená tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo agonizujúceho analógu amylínu podľa nároku 3 a inzulín primiešaný vo forme vhodnej pre terapeutické podan i e.

39. Kompozícia, vyznačená tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo agonizujúceho analógu amylínu podľa nároku 21 a inzulín primiešaný vo forme vhodnej pre terapeutické podanie.

40. Kompozícia, vyznačená tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo agonizujúceho analógu amylínu podľa nároku 1 a glukagón primiešaný vo forme vhodnej pre terapeutické podan i e .

41. Kompozícia, vyznačená tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo agonizujúceho analógu amylínu podľa nároku 3 a glukagón primiešaný vo forme vhodnej pre terapeutické podanie.

42. Kompozícia, vyznačená tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo agoni žujúceho analógu amylínu podľa nároku 21 a glukagón primiešaný vo forme vhodnej pre terapeutické podanie.

43. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 34, 37 alebo 40, vyznačená tým, že uvedeným agonizujúcim analógom amylínu je ^2S-²⁸-²³Pro-h-amylín.

44. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 34, 37 alebo 40, v y z n a č e n á t ý m , že uvedeným agonizujúcim analógom amylínu je des-^ΊLys²⁵·²⁸ ²⁹Pro-h-amy1 í n.

45. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 34, 37 alebo 40, v y z n a č e n á t ý m , že uvedeným agonizujúcim analógom amylínu je ¹⁸Arg²⁵-^2ePro-h-amylín.

46. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 34, 37 alebo 40, v y z n a č e n á t ý m , že uvedeným agonizujúcim analógom amylínu je des-¹Lys’^ieArg^25,2ePro-h-amylín.

OBR.