FI118601B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen amyliiniagonistianalogin tai sen suolan valmistamiseksi - Google Patents

Description

118601

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen amylllniagonis-tianalogin tai sen suolan valmistamiseksi

Keksinnön tausta 5 Tämä patenttihakemus on jatkohakemus US-patentti hakemukselle 07/667040, joka on jätetty 8.3.1991. US-hakemus on etuoikeuden perusteena hakemusjulkaisulle WO 92/15317 (tullut julkiseksi 17.9.1992).

Keksinnön ala 10 Tämän keksinnön ala on lääketiede ja erityisesti hypoglykemisten ja muiden sellaisten tautitilojen hoito ja ehkäisy, joissa amyliinin vaikutuksen vahvistamisesta on hyötyä ja joihin kuuluvat tautitilat, kuten diabetes mellitus, joissa tarvitaan insuliinia. Tarkemmin sanottuna 15 keksintö liittyy terapeuttisesti käyttökelpoisten amyliini-peptidihormonin agonistianalogien ja niiden suolojen valmistukseen.

Tekniikan tason kuvaus ja johdanto keksintöön

Diabetes mellitus on vakava aineenvaihduntatauti, 20 jossa taudinmääritys perustuu kroonisesti korkeiden glu-koosipitoisuuksien esiintymiseen veressä (hyperglykemia).

• · *· " Tämän hyperglykemisen tautitilan aiheuttaa insuliini- • · : peptidihormonin aktiivisuuden puutos, joka voi olla suh- • · ·,*·· teellistä tai absoluuttista. Insuliinia tuottavat ja sitä • · · j 25 erittävät haiman β-solut. Insuliinin on raportoitu edistä- **·': vän glukoosin hyväksikäyttöä, proteiinisynteesiä ja neut- • · raalien lipidien muodostumista ja varastoitumista. Glukoo- si, hiilihydraattienergian pääasiallisin lähde, varastoi- ;·, tuu ruumiiseen glykogeeninä, joka on eräs polymeroituneen • ** ]... 30 glukoosin muoto ja joka voidaan muuntaa takaisin glukoo- e · *1’ siksi metabolian tätä vaatiessa. Normaaliolosuhteissa in- ··· suliinia erittyy sekä perusnopeudella että nousseilla no-*:*" peuksilla glukoosistimulaation jälkeen, mitkä kaikki täh- täävät aineenvaihdunnan homeostaattisen tilan säilyttämi- • *♦ [ . 35 seen glukoosin muuntamisella glykogeeniksi.

• · 2 118601

Termi diabetes mellitus käsittää useita eri hyper-glykemisiä tautitiloja. Näihin tautitiloihin kuuluvat tyypin 1 diabetes (insuliinista riippuvainen diabetes mellitus eli IDDM) ja tyypin 2 diabetes (insuliinista riippuma-5 ton diabetes mellitus eli NIDDM). Tyypin 1 diabeteksen saaneissa potilaissa oleva hyperglykemia liittyy vaillinaisiin, vähentyneisiin tai kokonaan puuttuviin insuliinipitoisuuksiin, jotka eivät riitä ylläpitämään veren glukoosipitoisuuksia fysiologisella alueella. Tyypin 10 1 diabeteksen hoitoon kuuluu korvaavien insuliiniannosten antaminen tavallisesti parenteraalista tietä käyttäen. Tyypin II diabeteksen saaneilla potilailla esiintyvä hyperglykemia liittyy aluksi tavallisiin tai kohonneisiin insuliinipitoisuuksiin; nämä potilaat eivät kuitenkaan 15 kykene ylläpitämään metabolista homeostaasia, minkä syinä ovat perifeerisissä kudoksissa ja maksassa oleva insulii-niresistentti tila sekä sairauden edetessä tapahtuva insuliinia erittävien haiman β-solujen etenevä vaurioituminen. Tyypin 2 diabetes mellituksen hoito voi perustua siihen, 20 että se aloitetaan ruokavalion ja elämäntapojen muutoksilla, joita tukevana hoitona käytetään oraalisia hypoglykee- .*. : misiä aineita, kuten sulfonyyliureoita. Taudin myöhemmissä • ·· : .·. vaiheissa tarvitaan kuitenkin usein insuliinihoitoa eri- • · · V | tyisesti pyrittäessä jossain määrin säännöstelemään hyper- * ·· .1 .* 25 glykemiaa ja minimoimaan sairauden komplikaatioita. Usei- ♦ · · I. *’ den tyypin 2 diabeetikkojen eloonjäämiseen tarvitaan siten • · · • ·* lopulta insuliinia.

• · · V * β-levyproteiinisäikeiden muodostamille solunulkoi- sille kerääntymille on annettu nimitys amyloidi. Amyloidi- • *·· 30 materiaalin kerääntymiä on raportoitu löydetyn tyypin 2 : diabetes mellituksen saaneiden potilaiden haimasta. Muissa ··« y.,m tutkimuksissa on saatu viitteitä siitä, että amyloidike- • * *'*. rääntymien määrä nousee samanaikaisesti potilaiden hyper- , * glykemia-asteen ja tyypin 2 diabeteksen vakavuuden kanssa.

• 35 Haiman amyloidin kemiallinen analyysi johti yllättäen ja • · 118601 3 odottamatta peptidihormonin, amyliinin, löytöön. Clark, A., et ai., Lancet ii (1987) 231 - 234. Tämän peptidin havaittiin koostuvan 37 aminohaposta, joista mikään ei ollut hapan ryhmä, ja siinä havaittiin disulfidisidos ase-5 missä 2 ja 7 olevien kysteiiniryhmien välillä ja se oli C-terminaalisesta päästä amidoitu. Amyliini on amyloidin pääasiallisin proteiiniosa, jota on raportoitu esiintyvän tyypin 2 diabetes mellituksen saaneiden potilaiden haiman Langerhansin saarekkeissa.

10 On raportoitu, että synteettisen molekyylin pepti- dirakenteessa esiintyvä molekyylin sisäinen kystiinisilta ja karboksiterminaalinen amidiryhmä tuottavat yhdessä esiintyessään voimakkaimman glykogeenisynteesiä inhiboivan biologisen aktiivisuuden luurankolihaksessa. Esimerkiksi 15 Cooper, G. J. S., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei, (USA) 84 (1987) 8628 - 8632, Cooper, G. J. S-, et ai., teoksessa Diabetes 1988, toim. Larkins, R., Zimmet, P. & Chisholm, D. (Elsevier, Amsterdam), s. 493 - 496 (1989). Amyliinin aminohappojaksolla (katso kuvio 1) on 46-%:inen homologia 20 humaanikalsitoniinigeeniin liittyvä peptidi 2:n (CGRP-2:n) kanssa.

:\J Yhdessä julkaistussa tutkimuksessa on mainittu, • · : .·. että ryhmät 20 - 29 käsittävä pieni amyliinimolekyylin · segmentti on mahdollinen myötävaikuttava tekijä amyloidi- • · · 25 säikeen muodostumisessa Langerhansin saarekkeissa tyypin 2 l, * diabetes mellituksessa. Glenner et ai., Biochem. Biophys.

• · · ·*,.;· Res Commun. 155 (1988) 608 - 614. On myös raportoitu, että • · · V * tällä alueella esiintyy aminohappojakson eroavuuksia tie tyistä nisäkäslajeista peräisin olevien amyliinien välillä • · • *·· 30 ja jatkotutkimuksissa on kiinnostus kohdistettu niiden ryhmien tunnistamiseen, jotka liittyvät amyloidin muodos- .···. tumiseen. Westermark et ai-, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) * 87 (1990) 5036 - 5040. Westermark et ai.:n tutkimuksessa • · . oli yritetty syntetisoida eri lajeista peräisin olevien j *·· 35 amyliinijaksojen erilaisia 20 - 29 -alueen aminohappo- • l , 118601 4 segmenttejä, jonka jälkeen oli vertailtu niiden kykyä muodostaa amyloidisäikeitä. Tehtiin se ehdotus, että humaani-amyliiniryhmät 25 - 29 olivat voimakkaimmin amyloidogeeni-siä ja seriinin substituutio proliinilla asemassa 28, ku-5 ten on asianlaita useissa jyrsijälajeissa, inhiboi huomattavasti säikeiden muodostusta tutkituissa dekapeptideissä.

Amyliini on monimutkainen peptidi ja amyliinin biologisesti aktiivisten preparaattien synteesi on hankalaa. Amyliinin on myös havaittu olevan niukkaliukoinen ja pysy-10 vän liuoksessa heikosti. Olemme havainneet, että rotan amyliinin liukoisuus on suurempi ja sen pysyvyys liuoksessa parempi kuin ihmisen amyliinin. Tämä voi johtua jossakin määrin eri lajeista peräisin olevien amyliinien erilaisista aggregaatio-ominaisuuksista, vaikkakaan tästä ei 15 ole olemassa mitään tietoa. Ainoastaan ihmisellä, ei-hu-maani-kädellisillä ja kissalla olevien amyliinityyppien on raportoitu aggregoituvan siten, että ne muodostavat saarekkeiden amyloidia in vivo -olosuhteissa. Amyliinijaksot, jollaisten eristyksestä useista lajeista on tähän mennessä 20 raportoitu, on esitetty kuvassa 2.

Tyypin I diabeteksessa ovat amyliinipitoisuudet : voimakkaasti pienentyneet tai olemattoman pienet normaa- • ·· :leihin verrokkeihin verrattuna. Kun potilaalla on tyypin I • · *** 1 diabetes mellitus, on autoimmuunisuusilmiö aiheuttanut • * * .* .* 25 insuliinia ja amyliinia tuottavien β-solujen tuhoutumisen.

• · · ·* On ehdotettu, että amyliini voisi olla käyttökelpoinen • · * • .* diabetes mellituksen ja hypoglykemian, mukaan lukien insu- ··· V: liinin aiheuttaman hypoglykemian, vaatimassa hoidossa. On myös tehty se ehdotus, että insuliinin antaminen yhtä :*·.. 30 aikaa amyliinin kanssa olisi ylivoimainen hoitomuoto ver- :***; rattuna nykyisen käytännön mukaiseen pelkän insuliinin • · * antamiseen ja että amyliinin ja glukagonin antaminen yh- • · ***\ dessä hypoglykemian hoitoon olisi ylivoimainen hoitomuoto verrattuna nykyisen käytännön mukaiseen pelkän glukagonin :**.. 35 antamiseen. Olisi käyttökelpoista, että tämän tyyppisiin * · 5 118601 ja muunkinlaisiin tarkoituksiin saataisiin käyttöön vähemmän monimutkaisia yhdisteitä, joilla on natiivin humaani-amyliinin aktiivisuuksia, sekä yhdisteitä, joiden liukoisuus ja/tai stabiilisuus olisivat mahdollisesti parempia 5 kuin natiivin humaaniamyliinin vastaavat ominaisuudet. Tässä keksinnössä on kuvattu tällaisia yhdisteitä ja esitetty näitä koskevat patenttivaatimukset.

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö kohdistuu menetelmään amyliini-10 peptidihormonin analogien ja niiden suolojen valmistukseen. Nämä yhdisteet ovat vaikutukseltaan amyliinia muistuttavia ja niitä nimitetään amyliiniagonisteiksi tai amy-liinin agonistianalogeiksi.

Määritelmät 15 Tässä keksinnössä on seuraavilla termeillä seuraa- vat merkityksensä, ellei toisin ole nimenomaisesti mainittu.

Termi "alkyyli" tarkoittaa sekä suora- että haara-ketjuisia alkyyliryhmiä. Termi "alempi alkyyli" tarkoittaa 20 sekä suora- että haaraketjuisia alkyyliryhmiä, joissa on kaikkiaan 1-6 hiiliatomia ja joihin kuuluvat primaari-set, sekundaariset ja tertiaariset alkyyliryhmät. Tyypil- • * * lisiin alempiin alkyyleihin kuuluvat esimerkiksi metyyli, !/*: etyyli, n-propyyli, isopropyyli, n-butyyli, isobutyyli, t- :***: 25 butyyli, n-pentyyli, n-heksyyli ja muut näitä vastaavat Φ · ·’·*. ryhmät.

• »

Termi "aryyli" tarkoittaa karbosyklisiä aromaattisia 6-14 hiiliatomia sisältäviä ryhmiä, kuten fenyyli ja .,4 naftyyli, sekä heterosyklisiä aromaattisia ryhmiä, jotka 30 sisältävät 1-3 heteroatomia (typpi, happi, rikki ja niin • · ’···* edelleen), kuten pyridyyli, triatsolopyratsiini, pyrimi- :***: diini ja muut näitä vastaavat ryhmät.

• e* ····» Termi "aralkyyli" tarkoittaa "aryyli"-ryhmää, jossa 1-4 hiiliatomia sisältävään "alkyyli"-ryhmään on kiin- * · • 35 nittynyt suoraan 6-10 hiiliatomia sisältävä "aryyli"- • · 6 118601 ryhmä ja tähän kuuluvat esimerkiksi bentsyyli, p-kloori-bentsyyli, p-metyylibentsyyli ja 2-fenyylietyyli.

Termi "sykloalkyyli" tarkoittaa syklisiä 5-8 hiiliatomia sisältäviä aikyyliryhmiä.

5 Piirrustusten kuvaus

Kuvio 1 esittää humaaniamyliinin aminohappojaksoa. Kuvio 2 esittää useista eri nisäkkäistä eristettyjen amyliinien aminohappojaksojen vertailun.

Kuvio 3 esittää uusien amyliiniagonistipeptidien 10 aminohappojaksoa.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan uusia amyliiniagonistianalogeja. Nämä analogit ovat käyttökelpoisia amyliinin agonisteina, mihin sisältyy niiden 15 käyttö hyperglykemisinä aineina ja niitä edustavat kuvion 3 mukaiset aineet.

Tämä keksintö kohdistuu menetelmään terapeuttisesti käyttökelpoisen amyliiniagonistianalogin valmistamiseksi, jolla on aminohapposekvenssi 20 , % - X - As n - Thr - 5Ala - Thr - Y - Ala - Thr - 10Gln - • · · • ·· • · • · i..: : Arg - Leu - Ala - Asn - 15Phe - Leu - Vai - Bi - Ser - Ser - • · • · * • I» • · ;*·*: 25 Asn - Asn - Phe - Gly - Ci - Da - Leu - Ei - F: - 30Thr - Asn- M · • * ♦ • ·

• S

Vai - Gly - Ser - 35Asn - Thr - Tyr - Z jossa • *< ,··. 30 Ai on Lys, Ala, Ser tai vety, * ! *:* Bi on His tai Arg; ...

·...· Ci on Ala tai Pro; *·**ί Di on Ile, Vai, Ala tai Leu; :·[ Ei on Ser, Pro, Leu, Ile tai Thr; * · · ]>tt. 35 Fi on Ser, Pro tai Thr; • « 7 118601 X ja Y ovat toisistaan riippumatta ryhmiä, joiden sivuketjut ovat sitoutuneet kemiallisesti toisiinsa ja muodostavat keskenään molekyylin sisäisen sidoksen ja Z on amino, alkyyliamino, dialkyyliamino, sykloalkyyliamino, 5 aryyliamino, aralkyyliamino, alkyylioksi, aryylioksi tai aralkyylioksi; edellyttäen, että mainittu amyliiniagonistianalogi on muu kuin 23Leu-h-amyliini, 29Pro-h-amyliini, (2-37)-h-amyliini, (1-36)-h-amyliini, syklo2,7 [2Asp, 7Lys] -h-amyliini tai 10 18Arg19Thr23Leu2 9Pro - h- amy 1 i ini, tai sen suolan valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista, että mainittu amyliiniagonistianalogi valmistetaan peptidien valmistuksessa tavanomaisella kytkentäreaktiolla ja haluttaessa saatu analogi muutetaan suolakseen.

15 Sopiviin X:n ja Y:n sivuketjuihin kuuluvat ryhmät, jotka ovat peräisin alkyylisulfhydryyleistä, jotka voivat muodostaa disulfidisidoksia; alkyylihapoista ja alkyyli-amiineista, jotka voivat muodostaa syklisiä laktaameja; alkyylialdehydeistä tai alkyylihalogenideista ja alkyyli-20 amiineista, jotka voivat kondensoitua ja jotka voidaan pelkistää alkyyliamiinisillan muodostamiseksi; tai sivu- e · V·· ketjuista, jotka voidaan yhdistää siten, että niistä muo- dostuu alkyyli-, alkenyyli-, alkynyyli-, eetteri- tai tio- :*·.· eetterisidos. Edullisiin alkyyliketjuihin kuuluvat alemmat * · 25 alkyyliryhmät, joissa on noin 1 - noin 6 hiiliatomia.

• · :v. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistet- • · tavat yhdisteet muodostavat suoloja monien erilaisten epä- • · · orgaanisten ja orgaanisten happojen ja emästen kanssa. Tällaisia suoloja ovat suolat, jotka on valmistettu käyt- • « * " 30 täen orgaanisia ja epäorgaanisia happoja, kuten HC1, HBr, H2S04, H3PO4, trifluorietikkahappo, etikkahappo, muurahais- ·***· happo, metaanisulfonihappo, tolueenisulfonihappo, maleii- ··· nihappo, fumaarihappo ja kamferisulfonihappo. Emästen avulla valmistettuja suoloja ovat esimerkiksi ammoniumsuo- : ** 35 lat, alkalimetallisuolat, (kuten natrium- ja kaliumsuolat) • · 8 118601 ja maa-alkalimetallisuolat (kuten kalsium- ja magnesium-suolat) . Asetaatti-, vetykloridi- ja trifluoriasetaatti-suolat ovat edullisia.

Suolat voidaan muodostaa tavanomaisilla keinoilla, 5 kuten saattamalla tuotteen vapaa happo- tai emäsmuoto reagoimaan yhden tai useamman ekvivalentin kanssa tarkoituksenmukaista emästä tai happoa sellaisessa liuottimessa tai väliaineessa, johon suola ei liukene, tai liuottimessa, kuten vedessä, joka reaktion jälkeen poistetaan tyhjiössä 10 tai kylmäkuivaamalla tai vaihtamalla olemassa olevan suolan ionit toiseen ioniin sopivassa ioninvaihtohartsissa.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettaviin yhdisteisiin kuuluu erilaisia stereoisomeereja. Tämän keksinnön mukaisissa yhdisteissä peptidirungon kiraa-15 liset keskukset ovat kaikki S-muotoa.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä yhdisteitä voidaan valmistaa peptidien valmistuksessa tunnetuilla tietyillä tavanomaisilla kytkentäreaktioilla. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä analogeja valmistetaan li-20 säämällä haluttuja aminohappoja toinen toisensa jälkeen kasvavaan peptidiketjuun. Tämä tapahtuu tyypillisesti si- • · ·.**: ten, että a-N-karbamoyylillä suojattu aminohappo ja kanta- • · ;.· · jahartsin pinnalla olevaan kasvavaan peptidiket juun lii- tetty aminohappo saatetaan reagoimaan huoneenlämmössä • ·*·*. 25 inertissä liuottimessa, kuten n-metyylipyrrolidonissa, di- • * metyyliformamidissa tai metyleenikloridissa, kytkentärea- • · genssien, kuten disykloheksyylikarbodi-imidi-l-hydroksi- • · « bentsotriatsolin, läsnä ollessa, emäksen, kuten di-isopro- .. pyylietyyliamiinin, läsnä ollessa. Tulokseksi saadusta • · ·„" 30 peptidistä poistetaan suojaava a-N-karbamoyyliryhmä rea- * · ’·”* genssilla, kuten trifluorietikkahapolla tai piperidiinil- lä, ja kytkentäreaktio toistetaan seuraavalla halutulla ··· •;··; suojatun N-ryhmän sisältävällä aminohapolla. Tällä alalla ..* tunnetaan sopivia N-ryhmää suojaavia ryhmiä, joista tässä • * * " 35 keksinnössä on edullista käyttää t-butyylioksikarbonyyliä.

• · 9 118601

Tiettyjä edullisia synteesimenetelmiä on kuvattu samojen patenttioikeuksien haltijoiden nimissä samanaikaisesti jätetyssä ja samojen patenttioikeuksien haltijoiden patenttihakemusjulkaisussa WO 92/15317 ("Synthetic Prepa-5 ration of Amylin and Amylin Analogs", jätetty 8.3.1991). Näistä menetelmistä saadaan käyttöön kiinteän faasin synteesimenetelmä peptidille, joka käsittää amyliinin tai amyliinianalogin, jonka biologinen aktiivisuus on aiempaa voimakkaampaa ja josta puuttuvat olennaisesti deleetiopep-10 tidit ja muut kontaminoivat peptidit, jossa menetelmässä mainittu peptidi syntetoidaan peräkkäisten synteesijakso-jen avulla, joissa näissä kussakin synteesijaksossa kasvavaan peptidiketjuun, joka on kiinnitetty liukenemattomaan kantajahartsiin, liitetään osoitettu aminohappo kasvavaan 15 peptidiketjuun antamalla peptidisidoksen muodostua kasva van peptidiketjun a-aminoryhmän ja osoitetun aminohapon a-karboksyylin välille; ja jossa kukin synteesijakso käsittää sen, että (a) käsitellään kasvavaa peptidiketjua a-aminoryhmän suojauksen poistumiseen johtavissa olosuh-20 teissä a-aminoryhmän poistamiseksi; (b) aktivoidaan osoitetun a-aminoryhmästään suojatun aminohapon a-karboksyyli- • · ·.*·: ryhmä; (c) saatetaan kasvava peptidiketju ja osoitettu • t ·,· ; aminohappo kosketukseen kytkeytymiseen johtavissa olosuh- :\j teissä peptidiketjun vapaan a-aminon ja osoitetun aminoha- 25 pon aktivoidun a-karboksyylin välisen peptidisidoksen muo- • · dostamiseksi; ja (d) toistetaan vaiheet (b) ja (c) mikäli • φ vaiheen (c) kytkentätehokkuus on pienempi kuin noin 97 %.

• · ♦

On edullista toistaa vaiheet (b) ja (c) mikäli kytkentä-tehokkuus on pienempi kuin noin 99 %. Toisessa edullisessa 30 kohteessa toistetaan vaiheet (b) ja (c) kussakin synteesi- • « *·;·* syklissä. Kytkentätehokkuus määritetään vaihtoehtoisesti kunkin kytkentäsyklin jälkeen.

*:··; Sopiviin kytkentäolosuhteisiin kuuluvat sellaisen ./ liuotinjärjestelmän käyttö, joka maksimoi kiinteän kanta- * " 35 ja-aineen turpoamisen, vähentää peptidiketjun sekundaari- • · 10 118601 siä rakenneyksiköitä synteesisyklien aikana ja minimoi peptidin sisäisten ja peptidien välisten vetysidosten muodostumista. Synteesijaksoon kuuluu edullisesti pääteryhmän muodostamisvaihe kytkentäjakson(jen) jälkeen, jos peptidi-5 ketjun reagoimattomat a-aminoryhmät tehdään reagoimattomiksi. Synteesijaksoja toistetaan toinen toisensa jälkeen käyttäen sopivasti suojattuja a-aminohappoja tietyn jakson mukaisen amyliinin tai amyliinianalogin aikaansaamiseksi. Peräkkäisten jaksojen valmistumisen jälkeen mainittu amy-10 liini tai amyliinianalogi irrotetaan kiinteästä kantaja-aineesta. On edullista, että suojaus poistetaan peptidi-ketjun kysteiiniryhmistä valikoivasti ja intramolekulaari-nen disulfidisidos muodostetaan ennen peptidin irrottamista kiinteästä kantaja-aineesta.

15 Sopiviin a-aminoa suojääviin ryhmiin kuuluvat t- butoksikarbonyyli ja 9-fluorenyylimetoksikarbonyyli. Keksinnön yhdessä edullisessa kohteessa, jossa t-butoksi-karbonyyliä käytetään a-aminoa suojaavana ryhmänä, aktivoidaan a-karboksyyliryhmät disykloheksyylikarbodi-imidil-20 lä ja 1-hydroksibentsotriatsolilla l-hydroksibentsotriat-soliesterien muodostamiseksi. Erityisen edullinen liuotin- *.**: systeemi käsittää n-metyylipyrrolidonin.

• · · Tiettyjen amyliinin agonistianalogien valmistus on ί *·: kuvattu tämän keksinnön esimerkeissä 1 - 16. Tässä keksin- • « :*·*: 25 nössä olevassa taulukossa IX on esitetty lisäksi muita ei • · ·*·*. keksinnön mukaisia agonistianalogeja, joita voidaan vai- • * mistaa edellä mainittujen menetelmien avulla. Tämän kek-* · · ^ sinnön mukaisia yhdisteitä voidaan myös valmistaa nykyisin tällä alalla tunnetuilla yhdistelmä-DNA-menetelmillä. Tätä • · * 30 kysymystä on käsitelty teoksessa Sambrook et ai., Molecu- • · *·;** lar Cloning: A Laboratory Manual, 2. painos, Cold Spring :***: Harbor (1989)).

·· ·:*·; Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmiste- tuista yhdisteistä käytetyllä nimitystavalla voidaan * " 35 osoittaa sekä se peptidi, johon jakso perustuu, että mitkä • · 11 118601 tahansa amyliinipeptidin, kuten humaaniamyliinin, perusjaksoon tehdyt modifikaatiot. Aminohappo ja sitä edeltävä yläindeksinumero tarkoittavat, että osoitettu aminohappo korvaa sen aminohapon, joka on normaalisti yläindeksin 5 osoittamassa perusaminohappojakson aminohappoasemassa. Esimerkiksi "18Arg25,28Pro-h-amyliini" tarkoittaa "h-amylii-nin" eli "humaaniamyliinin" jaksoon perustuvaa peptidiä, jossa esiintyvät substituutiot ovat ryhmän 18 kohdalla olevan His:n korvaaminen Argillä, ryhmän 25 kohdalla ole-10 van Ala:n korvaaminen Pro:11a ja ryhmän 28 kohdalla olevan Ser:n korvaaminen Pro:11a. Termi "des^Lys-h-amyliini" tarkoittaa humaaniamyliin!jaksoon perustuvaa peptidiä, josta ensimmäinen eli N-terminaalinen aminohappo on dele-toitu.

15 Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmiste tut amyliiniagonistianalogit ovat käyttökelpoisia farmakologisten ominaisuuksiensa johdosta. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuilla yhdisteillä on erityisesti aktiivisuutta amyliiniagonisteinä, mikä käy ilmi 20 niiden aktiivisuudesta reseptoriin sitoutumiseen perustuvassa määrityksessä, joka on kuvattu esimerkissä 18 ja le- * » veään kantalihakseen perustuvassa määrityksessä, joka on * · •J · kuvattu esimerkissä 19. Yhdisteiden amyliiniagonistiaktii- i\j visuus voidaan myös määrittää niiden kyvyn perusteella ai- ·**’. 25 heuttaa hyperlaktemiaa ja/tai hyperglykemiaa nisäkkäissä.

• 9

Kuvion 3 mukaisten yhdisteiden kuvauksen lisäksi on taulu- [···. kossa I esitetty tiettyjä edullisia yhdisteitä. Kaikilla • · · edullisilla yhdisteillä, des-1Lys-h-amyliinilla, 28Pro-h- .. amyliinilla, 25,28,29Pro-h-amyliinilla, 18Arg25,28Pro-h-amylii- • · 30 nilla ja des-1Lys18Arg25,28Pro-h-amyliinilla voidaan osoit- • · ’···* taa olevan amyliiniaktiivisuutta käsitellyissä koe- :***; eläimissä in vivo -olosuhteissa ja ne saavat aikaan huo- #· · ...*j mättävän hyper laktemian, jota seuraa hyperglykemia. Sen lisäksi, että tietyissä edullisissa tämän keksinnön mukai- • ♦ • ** 35 sissa yhdisteissä on amyliinille tyypillisiä aktiivisuuk- • · 12 118601 siä, niiden liukoisuus- ja stabiilisuusominaisuuksien on myös havaittu olevan haluttavampia kuin humaaniamyliinin vastaavat ominaisuudet. Näihin edullisiin yhdisteisiin kuuluvat 25Pro26Val28,29Pro-h-amyliini, 25'28,29Pro-h-amyliini 5 ja 18Ar21,28Pro-h-amyliini.

Tässä keksinnössä kuvattuihin erityisen edullisiin yhdisteisiin kuuluvat 18Arg25,28Pro-h-anyliini, des - ^ys^Arg25'28Pro-h-amyliini, 18Arg25'28,29Pro-h-amyliini, des-1Lys18Arg25'28,29Pro-h-amyliini, 25,28'29Pro-h-amyliini, des-1Lys25,28'29Pro-h-amylii-10 ni ja 25Pro26Val25,28Pro-h-amyliini. Taulukossa II on lueteltu vielä muita ei keksinnön mukaisia amyliiniagonistipep-tidiyhdisteitä. Näihin kuuluvat 23Leu25Pro26Val28,29Pro-h-amyliini; 23Leu25Pro26Val28Pro-h-amyliini; 15 des-1Lys23Leu25Pro26Val28Pro-h-amyliini; 18Arg23Leu25Pro26Val28Pro-h-amyliini; 18Arg23Leu2S,28'29Pro-h-amyliini; 18Arg23Leu25'28Pro-h-amyliini ; 17Ile23Leu25,28,29Pro-h-amyliini ; 20 17Ile25'28,29Pro-h-amyliini; des - 1Lys17Ile23Leu21'2B' 29Pro-h-amyliini; • · ·.**: 17Ile18Arg23Leu-h-amyliini ; ·.· j 17Ile18Arg23Leu26Val29Pro-h-amyliini; 17IIe18Arg23Leu25Pro26Val28,29Pro-h-amyliini; :*··· 25 13Thr21His23Leu26Ala28Leu29Pro31Asp-h-amyliini; ♦ · j V. 13Thr21His23Leu26Ala29Pro31Asp-h-amyliini ; des-1Lys13Thr21His23Leu26Ala21Pro31Asp-h-amyliini; ♦ * · 13Thr18Arg21His23Leu26Ala29Pro31Asp-h-amyliini ; 13Thr18Arg21His23Leu28,29Pro31Asp-h-amyliini; ja 30 13Thr18Arg21His23Leu25Pro26Ala28,29Pro31Asp-h-amyliini; * · *···* Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmis- tetut yhdisteet voidaan yhdistää farmaseuttisiin kantaja- ·;·· aineisiin farmaseuttisten lääkemuotojen valmistamiseksi parenteraalista annostelua varten. Yhdisteistä kokeissa • · : ** 35 saadut vasteet antavat tukea tällaisten farmaseuttisten • · 13 118601 koostumusten kliinisille sovellutuksille diabetes melli-tuksen ja muiden insuliinia vaativien sairaustilojen hoidossa sekä hypoglykemisten episodien hoidossa. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja yhdisteitä 5 voidaan myös yhdistää insuliinin kanssa diabetes mellituk-sen ja muiden insuliinia vaativien sairaustilojen hoitamiseksi. "Insuliinilla" tarkoitetaan polypeptidiä tai sitä vastaavaa yhdistettä, joka on käyttökelpoinen veren glu-koosipitoisuuden säätelyssä. Näiden insuliinien yleisesi-10 tys on löydettävissä teoksessa Goodman and Gilman's The Pharmacologigal Basis of Therapeutics, 8. painos, Pergamon Press (1990). Tällaiset insuliinit voivat olla nopeavaikutteisia, melko pitkävaikutteisia tai pitkävaikutteisia. Insuliinia on olemassa useita erilaisia johdannaisia ja 15 nämä ovat käyttökelpoisia tässä keksinnössä. Näitä on käsitelty esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa nro 5 049 547, 5 028 587 ja 5 016 643. Käyttökelpoisia ovat myös insulii-nipeptidit (tätä kysymystä on käsitelty esimerkiksi US-pa-tenttijulkaisussa nro 5 008 241), kuten myös analogit (tä-20 tä kysymystä on käsitelty esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa nro 4 992 417 ja 4 992 418) . Näitä koostumuksia • · :.*·· voidaan antaa mitä tahansa annostelutietä käyttäen, mu- • · !tj | kaanlukien nasaalinen annostelu (tätä kysymystä on käsi- :\j telty esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa nro 4 988 512 ja 25 4 985 242 ja julkaisussa 2 BioWorld Today, No. 125 • · (1991)). Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmis-,···, tettavat yhdisteet ovat myös käyttökelpoisia glukagonin • e · yhteydessä hypoglykemian ehkäisemiseen ja hoitamiseen. Tä- .. tä asiaa on käsitelty Young et ai.:n US-patenttihake- * · 30 musjulkaisussa nro 07/640 478, joka on jätetty 10.1.1991, • · *···* jonka otsikko on "Hyperglycemic Compositions" ja joka on ·*": liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten ·φ· ....| nojalla.

..· Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistet- • · : " 35 tavia amyliiniantagonisteja tai niiden suoloja voidaan • * 14 118601 saattaa tarkoituksensa mukaiseen käyttöön sellaisten liuosten muodossa, jotka soveltuvat parenteraaliseen (mukaanlukien suonensisäiseen, lihaksensisäiseen ja ihonalaiseen) tai nasaaliseen tai oraaliseen annosteluun. Useissa tapauk-5 sissa on asianmukaista saattaa amyliiniagonistianalogi ja insuliini tai glukagoni käyttöön yhdessä koostumuksessa tai liuoksessa, mikäli ne on tarkoitettu annettavaksi yhdessä. Muussa tapauksessa voi olla edullisempaa antaa insuliinia tai glukagonia erillään mainitusta agonistianalo-10 gista. Kullekin yksittäiselle potilaalle tuleva annostelu-tapa on parasta jättää hoitavan lääkärin määrättäväksi. Sopivia farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantaja-aineita ja niiden formulointia on kuvattu formuloinnin perusteoksissa, esimerkiksi teoksessa Remington's Pharmaceutical 15 Science, E.V. Martin. Tätä asiaa on myös käsitelty teoksessa Wang, Y.J. ja Hanson, M.A., "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers",

Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report nro 10, liite 42:2S (1988). Sopivat insuliinia tai glukagonia 20 sisältävät formulaatiot ovat tällä alalla tunnettuja.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistet- • t ·.1·; tavat agonistivalmisteet voidaan stabiloida neutraaliin · jj ! pH-arvoon. Koska tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavat tuotteet ovat amfoteerisia, niitä voidaan • · ·1·1· 25 käyttää vapaina emäksinä, happoadditiosuoloina tai metal- • 1 lisuoloina. Suolojen on luonnollisesti oltava farmaseutti- • · .·1·. sesti hyväksyttäviä ja näihin kuuluvat metallisuolat, eri- • 1 · tyisesti alkali- ja maa-alkalimetallisuolat, esimerkiksi „ kalium- ja natriumsuolat. Kuten edellä on kuvattu, on saa- i · tmt 30 tavilla suuri joukko erilaisia farmaseuttisesti hyväksyt-• · ’1;·1 täviä happoadditiosuoloja. Näihin kuuluvat sekä orgaani- :11.1 sista että epäorgaanisista hapoista ja edullisesti mine- •j··· raalihapoista valmistetut suolat. Tyypillisiin happoihin, .,1 jotka voidaan ottaa esimerkeiksi, kuuluvat sitruuna-, me- • · * " 35 ripihka-, maito-, suola- ja hydrobromihapot. Tällaisia • « 15 118601 tuotteita voidaan valmistaa vaivattomasti tämän alan ammattitaitoon kuuluvien menetelmien avulla.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavat tuotteet saatetaan käyttöön tavallisesti parenteraa-5 lisena injektio- tai infuusiokoostumuksina. Ne voidaan esimerkiksi suspendoida inerttiin öljyyn, joka on kulloiseenkin tarkoitukseen sopiva kasviöljy, kuten sesam-, maa-pähkinä- tai oliiviöljy. Ne voidaan vaihtoehtoisesti suspendoida vesipitoiseen isotoniseen puskuriliuokseen, jonka 10 pH-arvo on noin 5,6 - 7,4. Käyttökelpoisia puskureita ovat natriumsitraatin ja sitruunahapon seos sekä natriumfosfaa-tin ja fosforihapon seos. Voidaan käyttää lääkeaineen vapautumista pitkittävää tai tätä hitaasti vapauttavaa "depot"-valmistetta, jotta valmistetta vapautuu verenkier-15 toon terapeuttisesti tehokkaita määriä useiden tuntien tai päivien ajan valmisteen transdermaalisen injektion jälkeen.

Haluttu isotonisuus voidaan saada aikaan käyttämällä natriumkloridia tai muita farmaseuttisesti hyväksyttäviä yhdisteitä, kuten glukoosia, boorihappoa, natriumtart-20 raattia, propeeniglykolia, polyoleja (kuten mannitolia ja sorbitolia) tai muita liukoisia epäorgaanisia tai orgaani- « · siä aineita. Natriumkloridi on edullinen käytettäväksi • « Ϊ ϊ | varsinkin natriumioneja sisältävissä puskuriliuoksissa.

:1·.· Edellä mainituista koostumuksista valmistetut liu- • · !·.1. 25 okset voidaan haluttaessa paksuntaa paksunnusaineella, f · kuten metyyliselluloosalla. Ne voidaan valmistaa emulsio-[···, muotoon joko vesi-öljy- tai öljy-vesi-emulsioksi. Voidaan • · i käyttää mitä tahansa monista erilaisista farmaseuttisesti ,, hyväksyttävistä emulgointiaineista, kuten esimerkiksi ara- • · ' “ 30 bikumijauhetta, ionittumatonta pinta-aktiivista ainetta • t *...1 (kuten jokin Tween-yhdiste) tai ionittuvaa pinta-aktiivis- f ·’’1· ta ainetta (kuten alkalimetallipolyeetterialkoholisulfaat- ' ·1· teja tai -sulfonaatteja, esimerkiksi jokin Tri ton-yhdiste) .

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistet- 16 118601 tetaan sekoittamalla ainesosat keskenään yleisesti hyväksyttyjä valmistustapoja noudattaen. Valitut komponentit voidaan esimerkiksi yksinkertaisesti sekoittaa sekoitti-messa tai muussa tavallisessa laitteessa konsentroiduksi 5 seokseksi, jonka lopullinen konsentraatio ja viskositeetti voidaan sitten säätää lisäämällä vettä tai paksunnusainet-ta ja mahdollisesti pH:n säätämiseen käytettävää puskuri-liuosta tai toonisuuden säätämiseen käytettävää muuta liukoista ainetta.

10 Lääkärin käytettäväksi tarkoitetut koostumukset tulevat käyttöön kerta-annosmuodossa, joka sisältää sellaisen määrän tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettua agonistiyhdistettä sekä insuliinia ja glukago-nia, jotka voidaan myös jättää pois, jonka tehokkuus yhteis nä tai useampana annoksena annettuna on sitä luokkaa, että se saa veren sokeripitoisuuden asettumaan tai palautumaan valitulle tasolle. Terapeuttisesti tehokkaat määrät tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettua hypoglyke-mian hoitoon tarkoitettua amyliiniagonistianalogia ovat 20 sellaisia, jotka kohottavat veren sokeripitoisuutta, joka on edullisesti nostettava arvoon 80 mg/dl tai tätä suurem- • ♦ 5,*·· maksi. Tällaisten diabetes mellituksen tai muiden insuliini*: nia vaativien sairaustilojen hoitoon tarkoitettujen ago- :\j nistianalogien terapeuttisesti tehokkaat määrät ovat sei- ' · * 25 laisia riittävän suuria määriä, jotka vähentävät insulii- s · nin yliannos tus tapaus ten tai haitallisen hypoglykemian [•»n esiintymistä. Tällä alalla toimiville ammattimiehille on • · · selvää, että tehokas määrä terapeuttista ainetta vaihtelee ,, monien tekijöiden mukaan, joihin kuuluvat potilaan ikä ja t · • 30 paino, potilaan terveydentila, tavoitteeksi asetettu veren • · ‘..φ* sokeripitoisuus sekä muut tekijät. Diabetes mellituksen * hoitoon tarkoitetut tyypilliset kerta-annokset sisältävät • m noin 0,1 - 5 mg amyliiniagonistiyhdistettä ja haluttaessa noin 0,5 - noin 10 mg insuliinia. Hypoglykemian hoitoon • Φ : ** 35 tarkoitetut tyypilliset kerta-annokset sisältävät noin • · 17 118601 0,5 - 1,0 mg amyliiniagonistiyhdistettä ja haluttaessa tällä alalla hyväksyttävä määrä tai tätä määrää pienempi määrä glukagonia.

Edellä esitetyn selostuksen mukaisesti formuloi-5 daan tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut käyttökelpoiset koostumukset normaalilla formulointitavalla. Näitä koostumuksia myös annetaan normaalin antotavan mukaisesti. Tämän alan ammatinharjoittajat voivat vaikeuksitta määrätä sopivat annokset, jollaisista on edellä esi-10 tetty esimerkkejä.

Seuraavat esimerkit, joissa on kuvattu yhden koesarjan tuloksia, on liitetty mukaan helpottamaan tämän keksinnön ymmärtämistä. Seuraavia tähän keksintöön liittyviä esimerkkejä ei ole luonnollisestikaan pidettävä sel-15 Iäisinä, että ne asettaisivat erityisiä rajoituksia tälle keksinnölle ja tällaiset alan ammattimiehelle selvät ja tämän keksinnön tällä hetkellä tunnetut tai siitä myöhemmin kehitettävät muunnelmat kuuluvat tämän selityksen mukaisen keksinnön ja siitä jäljempänä esitettyjen patentti-20 vaatimusten mukaiseen suojapiiriin.

Esimerkit ·,'·· Esimerkki 1 : Humaani-28Pro-amyliinin valmistus ·*·.· Tämä humaani ("h") -amyliinianalogi syntetisoitiin • · 25 tavallisilla kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmillä • · ·*.·, käyttäen peptidin sitovaa metyylibentshydryyliamiinihart- • · *.··. siä ja sivuketjujen l^-Boc/bentsyylisuojausta. 2,7- [disul- • e · fidi]amyliinin ja MBHA-hartsin yhdistelmä valmistettiin „ käsittelemällä Acm:llä suojatut kysteiinit tallium(III)- • · 30 trif luoriasetaatilla trif luorietikkahapossa. Kun rengas • e oli saatu valmiiksi, irrotettiin hartsi ja sivuketjua suo-·***; jaavat ryhmät peptidistä pilkkomalla sidokset nestemäisel- lä fluorivetyhapolla ("HF") dimetyylisulfidin ja anisolin tt" läsnä ollessa. 28Pro-h-amyliini puhdistettiin preparatii- • · ! ** 35 visella HPLC:llä. Peptidin havaittiin olevan homogeeninen • · 18 118601 analyyttisellä HPLC:llä ja kapillaarielektroforeesilla ja sen rakenne vahvistettiin arainohappoanalyysillä ja jakson analyysillä. Tuotteesta saatiin haluttu massaioni. FAB-massaspektri: (M + l)/e = 3 914.

5 Esimerkki 2 25Pro26Val28'29Pro - h- amyl iinin valmistus Tämä amyliinianalogi syntetisoitiin tavallisilla kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmillä ’ käyttäen peptidin sitovaa metyylibentshydryyliamiinihartsia ja sivu-10 ketjujen N^-Boc/bentsyylisuojausta. 2,1 -[disulfidi]amyliinin ja MBHA-hartsin yhdistelmä valmistettiin tallium(lii)-trifluoriasetaattikäsittelyllä trifluorietikkahapossa. Kun rengas oli saatu valmiiksi, irrotettiin hartsi ja sivu-ketjua suojaavat ryhmät pilkkomalla sidokset nestemäisellä 15 HF:llä dimetyylisulfidin ja anisolin läsnä ollessa.

Pro Vai ' Pro-h-amyluni puhdistettiin preparatiivisella HPLC:llä. Peptidin havaittiin olevan homogeeninen analyyttisellä HPLC:llä ja kapillaarielektroforeesilla ja sen rakenne vahvistettiin aminohappoanalyysillä ja jakson ana-20 lyysillä. Tuotteesta saatiin haluttu massaioni. FAB-massa-spektri: (M + l)/e = 3 936.

• · *.**: Esimerkki 3 (ei keksinnön mukaisesti valmistettava) j.i Ϊ 2,7syklo- (2Asp,7Lys] -h-amyliinin valmistus Tämä amyliinianalogi syntetisoitiin tavallisilla * · ♦V. 25 kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmillä käyttäen pep- • ♦ JV. tidin sitovaa metyylibentshydryyliamiinihartsia ja sivu- ,··.φ ketjujen Na-Boc/bentsyylisuojausta. 2Asp ja 7Lys lisättiin • e ·

Boc-2Asp (Fmoc)-OH:n ja Boc-7Lys (Fmoc)-OH:n avulla. Kun .. sivuketjuja suojaavat ryhmät oli poistettu valikoivasti • e 30 vaikuttavalla piperidiinillä, valmistettiin sivuketjujen *···* välinen ( Asp-Lys)-rengas käyttäen bentsotriatsol-l-yyli- ·***· oksi-tris (dimetyyliamino) fosfoniumheksaf luorifosfaattia ··» (BOP-reagenssia) . Renkaan valmistus tapahtui julkaisuissa

Di Maio, J., et ai., J. Med. Chem. 33 (1990) 661 - 667; '· *· 35 Felix, A.M., et ai., Int J. Pent. Prot. Res. 32 (1988) • · 19 118601 441, kuvatulla tavalla. Renkaan valmistamisen jälkeen saatu 2,7syklo- [2Asp-7Lys] amyliinin ja MBHA-hartsin yhdistelmä hajotettiin pilkkomalla sidos nestemäisellä HF:llä di-metyylisulfidin ja anisolin läsnä ollessa. 2,7syklo-(2Asp-5 7Lys)-h-amyliini puhdistettiin preparatiivisella HPLC:llä.

Peptidin havaittiin olevan homogeeninen analyyttisellä HPLC:llä ja kapillaarielektroforeesilla ja sen rakenne vahvistettiin aminohappoanalyysillä ja jakson analyysillä. Tuotteesta saatiin haluttu massaioni. FAB-massaspektri: 10 (M + l)/e = 3 925.

Esimerkki 4 (ei keksinnön mukaisesti valmistettava) Des-1Lys-h-amyliinin valmistus

Des^Lys-h-amyliini (josta käytetään myös nimitystä 2'37h-amyliini) syntetisoitiin tavallisilla kiinteän faasin 15 peptidisynteesimenetelmillä käyttäen peptidin sitovaa metyylibentshydryyliamiinihartsia ja sivuketjujen I^-Boc/bentsyylisuojausta. 2'7-[disulfidi]amyliinin ja MBHA-hartsin yhdistelmä valmistettiin käsittelemällä Acmrllä suojatut kysteiinit tallium(III)trifluoriasetaatilla tri-20 fluorietikkahapossa. Kun rengas oli saatu valmiiksi irro tettiin hartsi ja sivuketjua suojaavat ryhmät pilkkomalla *. " sidokset nestemäisellä HF:llä dimetyylisulfidin ja ani- • · · solin läsnä ollessa. Des ^Lys-h-amyliini puhdistettiin prepara- • · !.*·· tiivisella käänteisfaasi-HPLC: llä. Peptidin havaittiin 25 olevan homogeeninen analyyttisellä HPLC:llä ja kapillaari-;***: elektroforeesilla ja sen rakenne vahvistettiin aminohappo- • m analyysillä ja jakson analyysillä. Tuotteesta saatiin ha-luttu massaioni. FAB massaspektri: (M + H)+ = 3 775.

·· Esimerkki 5 • · ♦ ♦· j 30 ^Ala-h-amyliinin valmistus • f *;** ^la-h-amyliini syntetisoitiin tavallisilla kiinteän • · · faasin peptidisynteesimenetelmillä käyttäen peptidin sito- *:··; vaa metyylibentshydryyliamiinihartsia ja sivuketjujen ./ I^-Boc/bentsyylisuojausta. 2'7- [disulfidi] amyliinin ja MBHA- * . 35 hartsin yhdistelmä valmistettiin käsittelemällä Acm:llä • · 20 118601 suojatut kysteiinit tallium(III)trifluoriasetaatilia tri-fluorietikkahapossa. Kun rengas oli saatu valmiiksi irrotettiin hartsi ja sivuketjua suojaavat ryhmät pilkkomalla sidokset nestemäisellä HF:llä dimetyylisulfidin ja ani-5 solin läsnä ollessa, ^la-h-amyliini puhdistettiin prepara-tiivisella käänteisfaasi-HPLC:llä. Peptidin havaittiin olevan homogeeninen analyyttisellä HPLC:llä ja kapillaari-elektroforeesilla ja sen rakenne vahvistettiin aminohappo-analyysillä ja jakson analyysillä. Tuotteesta saatiin halt) luttu massaioni. FAB massaspektri: (M + H)+ = 3 847. Esimerkki 6 1Ser-h-amyliinin valmistus 1Ser-h-amyliini syntesoitiin tavallisilla kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmillä käyttäen peptidin sito-15 vaa metyylibentshydryyliamiinihartsia ja sivuketjujen N^-Boc/bentsyylisuojausta. 2'7-[disulfidi] amyliinin ja MBHA-hartsin yhdistelmä valmistettiin käsittelemällä Acm:llä suojatut kysteiinit tallium(III)trifluoriasetaatilla tri-fluorietikkahapossa. Kun rengas oli saatu valmiiksi, irro-20 tettiin hartsi ja sivuketjua suojaavat ryhmät pilkkomalla sidokset nestemäisellä HF:llä dimetyylisulfidin ja ani- • · solin läsnä ollessa. 1Ser-h-amyliini puhdistettiin prepara- • · ·.· · tiivisella käänteisfaasi-HPLC: llä. Peptidin havaittiin olevan homogeeninen analyyttisellä HPLCrllä ja kapillaari- ;*·*: 25 elektroforeesilla ja sen rakenne vahvistettiin aminohappo- • · ·*.*. analyysillä ja jakson analyysillä. Tuotteesta saatiin ha- • · luttu massaioni. FAB massaspektri: (M + H)+ = 3 863.

• *

Esimerkki 7 (ei keksinnön mukaisesti valmistettava) .. 29Pro-h-amyliinin valmistus • · • ·♦ *,,, 30 Tämä humaaniamyliinianalogi syntetisoitiin tavaili- • · *·"* silla kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmillä käyttäen peptidin sitovaa metyylibentshydryyliamiinihartsia ja ·;··· sivuketjujen Na-Boc/bentsyylisuojausta. 2,7~ (disulfidi) amy- ./ liinin ja MBHA-hartsin yhdistelmä valmistettiin käsittele- * . 35 mällä Acm:llä suojatut kysteiinit tallium(III)trifluori- • · 21 118601 asetaatilla trifluorietikkahapossa. Kun rengas oli saatu valmiiksi, irrotettiin hartsi ja sivuketjua suojaavat ryhmät pilkkomalla sidokset nestemäisellä HF:llä dimetyyli- sulfidin ja anisolm läsnä ollessa. Pro-h-amylnm puh-5 distettiin preparatiivisella HPLC:llä. Peptidin havaittiin olevan homogeeninen analyyttisellä HPLC:llä ja kapillaari-elektroforeesilla ja sen rakenne vahvistettiin aminohappo-analyysillä ja jakson analyysillä. Tuotteesta saatiin haluttu massaioni. FAB-massaspektri: (M + H)+ * 3 916.

10 Esimerkki 8 25'28Pro-h-amyliinin valmistus 25,28Pro-h-amyliini syntetisoitiin tavallisilla kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmillä käyttäen peptidin sitovaa metyylibentshydryyliamiinihartsia ja sivuketjujen 15 l^-Boc/bentsyylisuojausta. 2,1 -[disulfidi)amyliinin ja MBHA- hartsin yhdistelmä valmistettiin käsittelemällä Acmrllä suojatut kysteiinit tallium(III)trifluoriasetaatilla tri-fluorietikkahapossa. Kun rengas oli saatu valmiiksi, irrotettiin hartsi ja sivuketjua suojaavat ryhmät pilkkomalla 20 sidokset nestemäisellä HF:llä dimetyylisulfidin ja ani-solin läsnä ollessa, 25,28Pro-h-amyliini puhdistettiin pre- *.**: paratiivisella käänteisfaasi-HPLC: llä. Peptidin havaittiin • · · olevan homogeeninen analyyttisellä HPLCrllä ja kapillaa- • · rielektroforeesilla ja sen rakenne vahvistettiin aminohap- 25 poanalyysillä ja jakson analyysillä. Tuotteesta saatiin ·*·'; haluttu massaioni. FAB-massaspektri: (M + H)+ = 3 939.

• ·

Esimerkki 9 • · «

Des-1Lys25,38Pro-h-amyliinin valmistus

Des- Lys ' Pro-h-amyluni syntetisoitiin tavaili- • ·· 3 0 silla kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmillä käyttäen • · *·;** peptidin sitovaa metyylibentshydryyliamiinihartsia ja si- vuketjujen IS^-Boc/bentsyylisuojausta. 2,1 - [disulf idi] amyliinin *:*·· ja MBHA-hartsin yhdistelmä valmistettiin käsittelemällä ./ Acmrllä suojatut kysteiinit tallium(III)trifluoriasetaa- * 35 tiliä trifluorietikkahapossa. Kun rengas oli saatu vai- • · 22 118601 miiksi, irrotettiin hartsi ja sivuketjua suojaavat ryhmät pilkkomalla sidokset nestemäisellä HF:llä dimetyylisulfi-din ja anisolin läsnä ollessa. Des-1Lys25,28Pro-h-amyliini puhdistettiin preparatiivisella käänteisfaasi-HPLC:llä.

5 Peptidin havaittiin olevan homogeeninen analyyttisellä HPLC:llä ja kapillaarielektroforeesilla ja sen rakenne vahvistettiin aminohappoanalyysillä ja jakson analyysillä. Tuotteesta saatiin haluttu massaioni. FAB-massaspektri: (M + H)+ = 3 811.

10 Esimerkki 10 18Arg2S,28Pro-h-amyliinin valmistus 18Arg25,28Pro-h-amyliini syntetisoitiin tavallisilla kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmillä käyttäen peptidin sitovaa metyylibentshydryyliamiinihartsia ja sivu-15 ketjujen I^-Boc/bentsyylisuojausta. 2,1 - [disulfidi] amyliinin ja MBHA-hartsin yhdistelmä valmistettiin käsittelemällä Acm:llä suojatut kysteiinit tallium(III)trifluoriasetaa-tilla trifluorietikkahapossa. Kun rengas oli saatu valmiiksi, irrotettiin hartsi ja sivuketjua suojaavat ryhmät 20 pilkkomalla sidokset nestemäisellä HF:llä dimetyylisulfi-din ja anisolin läsnä ollessa. 18Arg25,28Pro-h-amyliini puh- *. *ϊ distettiin preparatiivisella käänteisfaasi-HPLC:llä. Pep- • · :.· * tidin havaittiin olevan homogeeninen analyyttisellä • · HPLC: llä ja kapillaarielektroforeesilla ja sen rakenne ;*·*: 25 vahvistettiin aminohappoanalyysillä ja jakson analyysillä.

;*·*· Tuotteesta saatiin haluttu massaioni. FAB-massaspektri: (M + H) + = 3 959.

*·* *

Esimerkki 11 yt Des-1Lys18Arg25,28Pro-h-amyliinin valmistus 30 Des-1Lys18Arg25,28Pro-h-amyliini syntetisoitiin ta- ·"* vallisilla kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmillä käyttäen peptidin sitovaa metyylibentshydryyliamiinihart- ·:··· siä ja sivuketjujen Na-Boc/bentsyylisuojausta. 2'7- [disul- ./ fidi]amyliinin ja MBHA-hartsin yhdistelmä valmistettiin • ·· * . 35 käsittelemällä Acm:llä suojatut kysteiinit tallium- · 23 118601 (III)trifluoriasetaatilla trifluorietikkahapossa. Kun rengas oli saatu valmiiksi, irrotettiin hartsi ja sivuketjua suojaavat ryhmät pilkkomalla sidokset nestemäisellä HF:llä dimetyylisulfidin ja anisolin läsnä ollessa.

5 18Arg25,28Pro-h-amyliini puhdistettiin preparatiivisella käänteisfaasi-HPLC:llä. Peptidin havaittiin olevan homogeeninen analyyttisellä HPLC:llä ja kapillaarielektrofo-reesilla ja sen rakenne vahvistettiin aminohappoanalyysil-lä ja jakson analyysillä. Tuotteesta saatiin haluttu mas-10 saioni. FAB-massaspektri: (M + H)+ = 3 832.

Esimerkki 12 18Arg25'28,29Pro-h-amyliinin valmistus 18Arg25,28'29Pro-h-amyliini syntetisoitiin tavallisilla kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmillä käyttäen 15 peptidin sitovaa metyylibentshydryyliamiinihartsia ja si vuketjujen I^-Boc/bentsyylisuojausta. 2'7-[disulf idi] amylii-nin ja MBHA-hartsin yhdistelmä valmistettiin käsittelemällä Acm:llä suojatut kysteiinit tallium(III)trifluoriasetaatilla trifluorietikkahapossa. Kun rengas oli saatu 20 valmiiksi, irrotettiin hartsi ja sivuketjua suojaavat ryhmät pilkkomalla sidokset nestemäisellä HF:llä dimetyyli- *· " sulfidin ja anisolin läsnä ollessa. 18Arg25'28,29Pro-h-amy- • * :.j : liini puhdistettiin preparatiivisella käänteisfaasi- • · :/·· HPLC-.llä. Peptidin havaittiin olevan homogeeninen analyyt- :***: 25 tisellä HPLC:llä ja kapillaarielektroforeesilla ja sen ra- kenne vahvistettiin aminohappoanalyysillä ja jakson ana- • · lyysillä. Tuotteesta saatiin haluttu massaioni. FAB-massaspektri: (M + H)+ 3 971.

;·, Esimerkki 13 30 Des-1LysieArg25'28'29Pro-h-amyliinin valmistus *" Des-1Lys18Arg25,28,29Pro-h-amyliini syntetisoitiin ta-

• M

ϊ.,.ϊ vallisilla kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmillä *:**: käyttäen peptidin sitovaa metyylibentshydryyliamiinihart- .·] siä ja sivuketjujen i^-Boc/bentsyylisuojausta. 2'7-[disul- • · , 35 fidi]amyliinin ja MBHA-hartsin yhdistelmä valmistettiin • s 24 118601 käsittelemällä Acm:llä suojatut kysteiinit tallium(III)-trifluoriasetaatilla trifluorietikkahapossa. Kun rengas oli saatu valmiiksi, irrotettiin hartsi ja sivuketjua suo-jaavat ryhmät pilkkomalla sidokset nestemäisellä HF:llä 5 dimetyylisulfidin ja anisolin läsnä ollessa. Des- 1Lys18Arg25'28,29Pro-h-amyliini puhdistettiin preparatiivi-sella käänteisfaasi-HPLC:llä. Peptidin havaittiin olevan homogeeninen analyyttisellä HPLC:llä ja kapillaarielektro-foreesilla ja sen rakenne vahvistettiin aminohappoanalyy-10 sillä ja jakson analyysillä. Tuotteesta saatiin haluttu massaioni. FAB-massaspektri: (M + H)+ = 3 843.

Esimerkki 14 25'28'29Pr0-h-amyliinin valmistus 25'28'29pr0-h-amyliini syntetisoitiin tavallisilla 15 kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmillä käyttäen peptidin sitovaa metyylibentshydryyliamiinihartsia ja sivu-ketjujen Na-Boc/bentsyylisuojausta. 2'7- [disulf idi] amylii-nin ja MBHA-hartsin yhdistelmä valmistettiin käsittelemällä Acm:llä suojatut kysteiinit tallium(III)trifluo-20 riasetaatilla trifluorietikkahapossa. Kun rengas oli saatu valmiiksi, irrotettiin hartsi ja sivuketjua suojaavat ryh- • · · ” mät pilkkomalla sidokset nestemäisellä HF:llä dimetyyli- • » :.j · sulfidin ja anisolin läsnä ollessa. 25,28,29Pro-h-amyliini • · ϊ,*·ϊ puhdistettiin preparatiivisella käänteisfaasi-HPLC: llä.

:***: 25 Peptidin havaittiin olevan homogeeninen analyyttisellä HPLC: llä ja kapillaarielektroforeesilla ja sen rakenne • · vahvistettiin aminohappoanalyysillä ja jakson analyysillä.

Tuotteesta saatiin haluttu massaioni. FAB-massaspektri: (M + H)+ = 3 949.

"... 3 0 Esimerkki 15 • ♦ ·"* Des-1Lys25'28,29Pro-h-amyliinin valmistus

Des- Lys ' ' Pro-h-amyliini syntetisoitiin tavalli- *:··· silla kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmillä käyttäen ./ peptidin sitovaa metyylibentshydryyliamiinihartsia ja sivu- * , 35 ketjujen N^-Boc/bentsyylisuojausta. 2'7-[disulfidi] amyliinin • · 25 118601 ja MBHA-hartsin yhdistelmä valmistettiin käsittelemällä Acm:llä suojatut kysteiinit tallium(III)trifluoriase-taatilla trifluorietikkahapossa. Kun rengas oli saatu valmiiksi, irrotettiin hartsi ja sivuketjua suojaavat ryhmät 5 pilkkomalla sidokset nestemäisellä HF:llä dimetyylisulfidin ja anisolin läsnä ollessa. Des- Lys ' ' Pro-h-amylnni puhdistettiin preparatiivisella käänteisfaasi-HPLC:llä. Peptidin havaittiin olevan homogeeninen analyyttisellä HPLC:llä ja kapillaarielektroforeesilla ja sen rakenne 10 vahvistettiin aminohappoanalyysillä ja jakson analyysillä. Tuotteesta saatiin haluttu massaioni. FAB-massaspektri: (M + H)+ = 3 823.

Esimerkki 16

De s - *Ly s25Pro26Val28'29Pro -h- amyl i inin valmistus 15 Tämä h-amyliinianalogi syntetisoitiin tavallisilla kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmillä käyttäen peptidin sitovaa metyylibentshydryyliamiinihartsia ja sivuketjujen Na-Boc/bentsyylisuojausta ja 2,1 - [disulfidi] amyliinin ja MBHA-hartsin yhdistelmä valmistettiin tallium(III)tri-20 fluoriasetaattikäsittelyllä trifluorietikkahapossa. Kun rengas oli saatu valmiiksi, irrotettiin hartsi ja sivuket- *·**: jua suoj aavat ryhmät pilkkomalla sidokset nestemäisellä • · j.j : HF:llä dimetyylisulf idin ja anisolin läsnä ollessa.

·.*·· Des-1Lys25Pro26Val28,29Pro-h-amyliini puhdistettiin sitten 25 preparatiivisella HPLC:llä.

·*·*; Esimerkki 17 • m ·*·*. Reseptoriin sitoutumiseen perustuva määritys Määritys, jolla määritettiin tämän keksinnön mu-··. kaisten yhdisteiden sitoutuminen amyliinireseptoreihin, • es 30 suoritettiin seuraavasti. Rotan 125I-amyliini (varustettu *;*’ leimalla Bolton-Hunter-reagenssilla N-terminaalisen lysii- ··· nin kohdalta) hankittiin yhtiöstä Amersham Corporation, *!··: Arlington Heights, IL) . Spesifiset aktiivisuudet olivat .·) tätä käytettäessä alueella 1 950 - 2 000 Ci/mmol. Pepti- • ·· ] . 35 dit, joita ei oltu varustettu leimalla, hankittiin yhti- e · 26 118601 öistä Bachem Inc. (Torrance, CA) ja Peninsula Laboratories (Belmont, CA).

Urospuoliset Sprague-Dawley rotat (200 - 250 g) tapettiin poistamalla pää. Aivot poistettiin kylmään fos-5 faatilla puskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen (PBS). Ventraaliselta pinnalta katsottuna tehtiin viillot hypotalamuksen etupuolisesti ja ne rajoittuivat lateraalisesti hajukäämiin ja ulottuivat 45°:een kulmassa mediaalisesti tästä käämistä eteenpäin. Tämä etuaivojen pohjan kudos, 10 joka sisälsi accumbens-tumakkeen ja tätä ympäröiviä alueita, punnittiin ja homogenoitiin jääkylmässä 20 mM HEPES-puskurissa (20 mM HEPES-happo, jonka pH oli säädetty arvoon 7,4 NaOH:lla ja jonka lämpötila oli 23 °C). Membraa-nit pestiin kolme kertaa tuoreessa puskurissa 15 minuutin 15 ajan suoritetulla sentrifugoinnilla 48 000 X G. Lopullinen membraaninappi suspendoitiin uudelleen 20 mM HEPES-puskuriin, joka sisälsi 0,2 mM fenyylimetyylisulfonyyli-fluoridia (PMSF).

I-amylnnin sitoutumisen määrittämiseksi mku-20 boitiin membraaneja, jotka olivat peräisin 4 mg:sta alkuperäistä kudosta märkäpainona ilmoitettuna, 12SI-amyliinin • · \'*j kanssa, jonka konsentraatio oli 12 - 16 pM, 20 mM HEPES- • · ; puskurissa, joka sisälsi 0,5 mg/ml basitrasiinia, • ·

Jt\: 0,5 mg/ml naudan seerumialbumiinia ja 0,2 mM PMSF:ää. Liu- :***: 25 oksia inkuboitiin 60 minuuttia 23 °C:ssa. Inkuboinnit lo- • •V, petettiin suodattamalla seokset GF/B-lasikuitusuodattimien • · (Whatman Inc., Clifton, NJ) läpi, joita oli huuhdeltu etu- • · * L· mj käteen neljän tunnin ajan 0,3-%:isessa polyeteeni- .. imiinissä radioaktiivisella leimalla varustettujen pepti- • ·· 30 dien epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi. Suodatti- • · *···* met pestiin välittömästi ennen suodatusta 5 ml :11a kylmää PBS:ää ja välittömästi suodatuksen jälkeen 15 ml:11a kyl-····· mää PBS: ää. Suodattimet poistettiin ja radioaktiivisuus ./ määritettiin gammalaskijassa 77 %:n laskentatehokkuudella.

* " 35 Kompetitiokäyrät valmistettiin määrittämällä sitoutuminen ··««· • * 118601 27 siten, että läsnä oli 10'12 - 10'6 M leimalla varustamatonta tutkittavaa yhdistettä ja ne analysoitiin ei- lineaarisen regression avulla käyttäen neliparametrista logistista yhtälöä (Inplot-ohjelmisto; GraphPAD Software, 5 San Diego).

Tässä määrityksessä tapahtui puhdistetun hu- maaniamyliinin sitoutuminen reseptoriinsa siten, että sen määritetty ICso-arvo oli noin 50 pM. Tämän keksinnön mukaisten tutkittavien yhdisteiden tulokset on esitetty tau-10 lukossa I, joka osoittaa, että kullakin näistä yhdisteistä on merkittävää sitoutumisaktiivisuutta reseptoriin.

Esimerkki 18

Leveään kantalihakseen perustuva määritys Tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden amylii-15 niagonistiaktiivisuuden määritys suoritettiin käyttäen le veään kantalihakseen perustuvaa määritystä seuraavalla tavalla. Kokeeseen käytettiin urospuolisia Harlan Sprague-Dawley -rottia, jotta halkaistun leveän kantalihaksen paino olisi saatu pidettyä alle 40 mg suuruisena. Ennen kuin 20 eläimet lopetettiin dekapitoimalla, niiden oli annettu olla ravinnotta neljä tuntia. Alaraajan nahka käännettiin sivuun ja kiinnitettiin neuloilla korkki levylle. Akilles- • · j.j j jänne leikattiin poikki juuri kantaluun yläpuolelta ja s · ί4*.ϊ kaksoiskantalihas käännettiin sivuun tibian etupäästä. Le- ·*·*: 25 veä kantalihas, joka on pieni 15 - 20 mm pituinen ja I · 0,5 mm paksuinen leveä lihas kaksoiskantalihaksen luunpuo- • m' ,·ϊ\ leisella pinnalla, puhdistettiin ja perimysium siistittiin pienillä saksilla ja atuloilla. Leveä kantalihas halkais-tiin sitten samansuuruisiin osiin veitsenkärjellä, jota 30 kuljetettiin etupäästä takapäähän lihaksen keskiosan kaut- • · *·;·* ta ja kustakin eläimestä tuli saatu yhteensä neljä lihas- :*"i suikaletta. Sen jälkeen kun lihas oli leikattu irti eläi- ····♦ mestä, sitä pidettiin lyhyen aikaa fysiologisessa suola- „* liuoksessa. Lihaksen pitäminen jännityksessä ei ollut tar- t · • ·· • · 28 118601 peellista, koska tällä ei ollut osoitettavaa vaikutusta radioaktiivisen glukoosin kerääntymiseen glykogeeniin.

Lihakset pantiin 50 ml:n erlenmeyerpulloihin, jotka sisälsivät 10 ml etukäteen ilmastettua Krebs-Ringer-5 vetykarbonaattipuskuria, joka sisälsi (litraa kohti) NaCl 118,5 mmol (6,93 g), KC1 5,94 mmol (443 mg), CaCl2 2,54 mmol (282 mg), MgS04 1,19 mmol (143 mg), KH2PO4 1,19 mmol (162 mg), NaHCC>3 25 mmol (2,1 g), 5,5 mmol glu koosia (1 g) ja yhdistelmä-humaani-insuliinia (Humulin-R, 10 Eli Lilly, IN) sekä tutkittavaa yhdistettä jäljempänä yksityiskohtaisesti esitettävällä tavalla. 37 °C:ssa määritetyn pH:n varmistettiin olevan alueella 7,1 - 7,4. Lihakset jaettiin eri pullojen kesken siten, että kustakin eläimestä peräisin olevat neljä lihaspalaa jakaantuivat 15 tasaisesti eri tutkimusolosuhteiden kesken. Inkubointime-diumeja ilmastettiin johtamalla niiden pintaan varovasti karbogeeniä (95 % O2, 5 % C02) ravistellen niitä samalla jatkuvasti 37 °C:ssa edestakaisessa liikkeessä olevassa vesihauteessa. Puolen tunnin "esi-inkubointi"-jakson jäl-20 keen kuhunkin pulloon lisättiin 0,5 μΟί U-14C-glukoosia ja pulloa inkuboitiin vielä 60 minuuttia. Kukin lihaspala • · * *. *: poistettiin sitten nopeasti, kuivattiin imupaperilla ja • · · pakastettiin nestemäisessä N2:ssa, punnittiin ja varastoi- tiin myöhemmin tehtävää C-glykogeenin määritystä varten.

Γ**: 25 14C-glykogeenin määritys suoritettiin 7 ml:n tuike- *'·*. pullossa. Kukin pakastettu lihasnäyte asetettiin pulloon S · ,*ϊ\ ja materiaali hajotettiin 1 ml:ssa 60-%;ista kaliumhydrok- sidia 70 °C:ssa 45 minuutin ajan jatkuvasti ravistellen. Liuennut glykogeeni saostettiin liuoksesta pullon sisäpin- • ·* 30 nalle lisäämällä 3 ml absoluuttista etanolia ja pitämällä * · ·;** tätä yön yli -20 °C:ssa. Supernatantti poistettiin varo- *· vasti imun avulla, glykogeeni pestiin uudelleen etanolil-·;·*· la, etanoli poistettiin imun avulla ja saostuma kuivattiin vakuumissa. Etanoli haihdutettiin kokonaan tuikelaskennas- * * • ·· * . 35 sa esiintyvän vaimennuksen välttämiseksi. Jäljelle jäänyt • ♦ 29 118601 glykogeeni liuotettiin uudelleen 1 ml:aan vettä ja 4 ml:aan tuikenestettä ja siitä tehtiin 14C-määritys.

Glukoosin kerääntymisnopeus glykogeeniin (ilmoitettuna yksiköissä μιηοΐ/g/h) saatiin 14C-glukoosin ominai-5 saktiivisuudesta inkubointimediumin 5,5-nanomolaarisessa glukoosissa ja kustakin lihaksesta eristettyyn glykogeeniin jääneestä 14C:n kokonaisiskumäärästä. Annos-vaste-käyrille suoritettiin sovitus neliparametriseen logistiseen malliin käyttäen pienimmän neliösumman iteratiivista 10 laskentarutiinia (Allfit v 2.7, NIH, MD) ECso-arvojen las kemiseksi. Koska EC5o:n jakautuma on log-normaalinen, on se ilmoitettu arvona + logaritmin keskivirhe. Parittaiset vertailut suoritettiin käyttäen t-testiä, jotka perustuivat Systatin (Wilkinson, "Systat: the system for statistics", 15 Systat Inc., Evanston IL (1989) laskentarutiineihin.

Annos-vaste-kuvaajat valmistettiin lihaksista, jotka oli lisätty liuoksiin, joiden sisältämän insuliinin konsentraatio oli 7,1 mM (1 000 μϋ/ml) ja joihin lisättyjen tutkittavien yhdisteiden lopulliset (nimelliset) kon-20 sentraatiot olivat 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300 ja 1 000 nM.

Kukin määritys sisälsi myös sisäiset positiiviset kontrol- ft m *.*·; lit, jotka käsittivät yhden erän varastoitua rotan amylii- • · ·.; · nia, joka oli lyofilisoitu ja säilytetty -70 °C:ssa.

Humaaniamyliini on tunnettu hyperglykeminen pepti- ·*·*: 25 di ja amyliinipreparaattien ECso-määritykset ovat tyypil- • · **·*. lisesti leveää kantalihasta käyttäen tehdyssä määritykses- ft · .··*. sä alueella noin 1 - 10 nM, vaikkakin joidenkin alle ft ft · 90-%:isesti puhtaiden kaupallisten preparaattien EC5o-arvot ovat korkeampia niissä esiintyvien sellaisten konta- *..!* 30 minanttien johdosta, jotka pienentävät määritettyä aktii- • · **··* visuutta. Tutkittavista yhdisteistä saadut tulokset on esitetty taulukossa I, josta käy ilmi, että kullakin yh- ····; disteistä on amyliiniaktiivisuutta.

# • ft • · ft ·· « f ft 118601 30

TAULUKKO I

Resepto- Leveä kan-riinsitou- ta-tumismääri- lihas-tys määritys IC50 (pM) ECso (nM) 1) 28Pro-h-amyliini 15,0 2,64 2) 25Pro26Val28,29Pro-h-amyliini 18,0 4,68 3) 2'7Syklo[2Asp,7Lys]-h-amyliini (1310,0 6,62 4) 2"37h-amyliini (1 236,0 1,63 5) ^la-h-amyliini 148,0 12,78 6) 1Ser-h-amyliini 33,0 8,70 7) 29Pro-h-amyliini (1 64,0 3,75 8) 25,28Pro-h-amyliini 26,0 13,20 9) des-1Lys25,28Pro-h-amyliini 85,0 7,70 • · • · · // 10) 18Arg25,28Pro-h-amyliini 32,0 2,83 • · · ♦ · · j 11) des-1Lys18Arg25,28Pro-h-amyliini 82,0 3,77 • · Γ·/ 12) 18Arg25,28'29Pro-h-amyliini 21,0 1,25 • · · i 1.·1 13) 21,0 1,86 \1 : des-1Lys18Arg25,28'29Pro-h-amyliini .. 14) 25'28'29Pro-h-amyliini 10,0 3,71 « · • ·· .·1·. 15) des-1Lys25'28,29Pro-h-amyliini 14,0 4,15 ··· *·· • 1 • ♦ ·1 « • · yhdiste ei keksinnön mukainen e· • · e ♦· 1 1 8601 N N n M rl <S Π CH M CH <N Ci M Ci es <s ΗΜΜΙ7<ΜΜΜΗΗΜΜΜηΗΜΗΜΜΜΜ

ZZ2ZZZZ2iZÄZZZZZZZ;Z

I I I I I I I I I I I.....Il CGöpöGciceGeCQ.a.Q.a.ci.o, . t? CO ΙΛ «Λ cö V) CO to Vi (Λ t/3 </} , «Λ C/J CO C/l UJ &G (Λ

SI

0»~it-il-iOMOOOl-POOOi-iOOp — l-i<Ut>OI-iiDI-il-4l-i<UUI-il-<l-.pUt-.C< ►J! ΟιΜΜΜΑΜΙΟίαιΑιΜΟιΡ^ΙΙι&ι^ΐίιΛ&ι 00000000pt-iu03i^0l-i00 Ml ρ,α,αιαιΡ^αιρ^αιαιεοΐραιι-ΐςοαιεορΗΡ) 3 3 u <L> PO P W 3 3 T ^ T -Ί U -¾ ι-ϊϊ >>>>pspnfla>><i<<ca< POOOOOOOOrtnJP(UnjK(ta«p ^ o^a^CL(a(pHoupHai(Xi<.<.eu<<.<<.<(ii t. tä 2,3,3 2 S .3 2(5.3.3.3 2 2 22 2 22 (N - S 8 if S S £ S S 8 S S £ -52 .52 . 52 . 52 . 52 . 52 0 oi <<<<<<<<<<<<χχπχ&ΐΰ w w η ΙηΙηΙη^^^41η(-«ΜΜ{-ιΜ^Ι-ιΜΙη^{-ι

*-i - 4)4)4)4)U04)V0tJtJUU04)U4)U

H U-if WtOtOMWWMWWtOWWMMWWCOW

§ • · .· HJ| WtOWMWWWWWtflWWMWMWWW ,3 * 1 2 .3 • · cj • ' w«n|iOWIpOMMwMl®MK)«iM6l)Mbll -¾ ·· m 17 m ·ρ1 U U ·rt «rt ·μ Ui U H «c1 »rH >n Ui Ci U p3 • · · " • ·· e *· ,1 =o • · ui 1§ ·1 · Ώ

• · · 1JC

• · 1)

·"·. 1 555555555555-^^^-¾ S

« V) 4J VJ Ifl Λ (fl Mp M M VI b) U9 4J www oJ

*· JJ7 ?ίΓ» ^ Φ ^ (U ^ ^ ^ ^ <D

*·„ <1 iJiJ:>JJiJJiJ>1J,J>Jh4iJ>»J»JJ ts # ^3 »it ΪΖ * · 5?

• · I /"% ^ i^S /“\ /-> y1> /^S

·»· MaoHotn^mOt'MoiOHDrt'iin ^ * I H<-iMMMNNN(Srl(S(S(0|f|(flt0mm 1 ««· « · • ·

·· ΙΠ O LO O

....; H H fN

• 1

• S

2 • i • ··

Claims (18)

118601

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen amy-liiniagonistianalogin valmistamiseksi, jolla on aminohappo-5 sekvenssi % - X - Asn - Thr - 5Ala - Thr - Y - Ala - Thr - 10Gln -Arg - Leu - Ala - Asn - 15Phe - Leu - Vai - Bi - Ser - Ser - 10 Asn - Asn - Phe - Gly - Ci - Dj - Leu - Ej - Fj - 30Thr - Asn- Val - Gly - Ser - 35Asn - Thr - Tyr - Z 15 jossa Aj on Lys, Ala, Ser tai vety, Bj on His tai Arg; Ci on Ala tai Pro; Di on Ile, Vai, Ala tai Leu;

20 Ei on Ser, Pro, Leu, Ile tai Thr; Fi on Ser, Pro tai Thr; t · ·.*·· X ja Y ovat toisistaan riippumatta ryhmiä, joiden • m ·.· : sivuketjut ovat sitoutuneet kemiallisesti toisiinsa ja muo- dostavat keskenään molekyylin sisäisen sidoksen ja Z on ·*·’; 25 amino, alkyyliamino, dialkyyliamino, sykloalkyyliamino, • · aryyliamino, aralkyyliamino, alkyylioksi, aryylioksi tai • · aralkyylioksi; i « * edellyttäen, että mainittu amyliiniagonistianalogi .. on muu kuin 23Leu-h-amyliini, 29Pro-h-amyliini, (2-37) -h-amyliini, • * 30 (1-36)-h-amyliini, syklo2,7 [2Asp, 7Lys]-h-amyliini tai *·;·* 18Arg19Thr23Leu29Pro-h-amyliini, tai sen suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, • · · .;··· että mainittu amyliiniagonistianalogi valmistetaan peptidi- en valmistuksessa tavanomaisella kytkentäreaktiolla ja ha- • · • “ 35 luttaessa saatu analogi muutetaan suolakseen. • · 118601

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan amyliiniagonistianalogi, jossa X:n ja Y:n sivuketjut ovat sellaisia, että ne muodostavat molekyylin sisäisen sidoksen, joka käsittää disulfi- 5 disidoksen, laktaamin, alkeenisidoksen, alkenyylisidoksen, alkynyylisidoksen, eetterisidoksen tai tioeetterisidoksen.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan amyliiniagonistianalogi, jossa X ja Y käsittävät Cys-ryhmät, jotka ovat sitoutuneet 10 disulfidisidoksella.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan amyliiniagonistianalogi, jossa ainakin yksi ryhmistä Clf Ei ja Fi on Pro-ryhmä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tun- 15 nettu siitä, että valmistetaan amyliiniagonistianalogi, jossa kaksi ryhmistä Ci, Ei ja Fx ovat Pro-ryhmiä.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan amyliiniagonistianalogi, jossa Ci, Ei ja Fi ovat Pro-ryhmiä.

7. Patenttivaatimuksen 4, 5 tai 6 mukainen menetel mä, tunnettu siitä, että valmistetaan amyliiniagonis- • · tianalogi, jossa Bi on Arg. : 8. Patenttivaatimuksen 4, 5 tai 6 mukainen menetel- ··· · :*·.· mä, tunnettu siitä, että valmistetaan amyliiniagonis- • · 25 tianalogi, jossa Di on Vai. • ·

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tun- • · |..*t nettu siitä, että valmistetaan amyliiniagonistianalogi, • · · * jossa Ai on Lys.

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, • · : 30 tunnettu siitä, että valmistetaan amyliiniagonistiana- ··· ·...* logi, jossa Ai on vety. ·***· 11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, • · ··* tunnettu siitä, että valmistetaan amyliiniagonistiana- • · • logi, jossa Ai on Lys. F" 35 Φ • · 34 1 1 8 6 01

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan amyliiniagonistiana-logi, jossa mainittu molekyylin sisäinen sidos käsittää laktaami-, aikeeni-, alkenyyli-, alkynyyli-, eetteri- tai 5 tioeetterisidoksen.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan amyliiniagonistiana-logi, jossa ainakin yksi ryhmistä C1# Ei ja Fj on Pro-ryhmä.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että valmistetaan amyliiniagonistiana- logi, jossa kaksi ryhmistä Ci, Εχ ja Fi ovat Pro-ryhmiä.

15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan amyliiniagonistiana-logi, jossa Ci, Ex ja Ρχ ovat Pro-ryhmiä.

16. Patenttivaatimuksen 13, 14 tai 15 mukainen me netelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan amyliiniago-nistianalogi, jossa Bi on Arg.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan amyliiniagonistiana- 20 logi, jossa Ax on Lys.

18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, • * *. ·; tunnettu siitä, että valmistetaan amyliiniagonistiana- • t ·.· · logi, jossa Ax on vety. • · • * · • ·· • · ·· · • · · • · • · M · • · · • · • f • · · • · · • « * ·· • » • M ··· • 4 • · ··· ·«· • · • « *·· • ♦ • · * · : ·· • · 35 1 1 8601