PL205134B1 - Pochodne glicylolizyny, preparat farmaceutyczny i zastosowanie pochodnych glicylolizyny - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku są pochodne glicylolizyny, preparat farmaceutyczny i zastosowanie pochodnych glicylolizyny.

Pochodne glicylolizyny według wynalazku są wykorzystane do hamowania angiogenezy i wzrostu guza. Wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego, który wiąże się z integryną α_νβ₃ i blokuje interakcję integryny a_ve₃ z metaloproteinazą macierzy 2 (MMP2). Naciekanie tkanek przez komórki naczyniowe jest procesem wymagającym współudziału wielu czynników włączając w to zarówno proteinazy, które zmieniają architekturę macierzy zewnątrzkomórkowej, jak i cząsteczki adhezyjne rozpoznające tę tymczasową macierz. Na podstawie aktualnych doniesień można stwierdzić, metaloproteinaza macierzy 2 (MMP2) o masie cząsteczkowej 72 kDa odgrywa kluczową rolę w rozwoju i angiogenezie. Na przykład Kitoh i inni (J. Cell Sci., 109, 953-8(1996)) opisują, że MMP2 i jej błonowy aktywator, metaloproteinaza macierzy typu 1 (MT1-MMP), są wyrażane w sposób zharmonizowany przez komórki mezenchymalne prawie wyłącznie w okresie rozwoju zarodkowego, co wskazuje na konkretne ograniczenia w przebudowie macierzy w tych tkankach. Dodatkowo należy zauważyć, że angiogeneza i towarzyszący jej wzrost guza są mniejsze u myszy pozbawionej kopii genu dla MMP2 (patrz Itoh i inni, Cancer Res., 58, 1048-51(1998)). Co ciekawe, że Saftor i inni (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 1557-61(1992)) wykazali, że związanie integryny a_ve₃ będącej znanym samodzielnym mediatorem angiogenezy, indukuje wytwarzanie MMP2, sugerując współudział tych dwóch cząsteczek w procesie naczyniowej przebudowy związanej z tworzeniem naczyń krwionośnych (patrz również Bafetti i inni, J. Biol. Chem., 273, 143-9(1998)). Właściwie bezpośrednią interakcję pomiędzy MMP2 a integryną a_ve₃ wykazał Brooks i inni (Cell, 85, 683-93(1996)). Zjawisko ujemnej regulacji MMP2 podczas inwazji naczyniowej i dojrzewania naczyń zostało następnie opisane przez Brooks'a i in. jako zależne od ekspresji integryny a_ve₃ (Cell, 92, 391-400(1998)).

Jakkolwiek hamowanie angiogenezy i towarzysząca jej supresja guza zarówno przez naturalne jak i syntetyczne inhibitory enzymów MMP, włącznie z MMP2, zostały udowodnione, to jednak przeniesienie takich strategii postępowania do praktyki klinicznej przyniosło ograniczone sukcesy, głównie z powodu bardzo niebezpiecznych działań ubocznych inhibitorów o tak szerokim spektrum. Ponieważ aktywność MMP, ogólnie rzecz biorąc, jest wymagana dla wielu procesów zachodzących w dojrzałym organizmie, hamowanie jej funkcji enzymatycznej może zmieniać w daleko idący sposób różne procesy biologiczne, w tym procesy przebudowy tkanek, takie jak gojenie się ran. Rzeczywiście stwierdzono, że zastosowanie inhibitorów MMP o szerokim spektrum w badaniach klinicznych nad różnymi typami raków, powoduje ciężkie powikłania w tym zapalenie ścięgien, zapalenie wielostawowe i zespoły bólowe w obrębie układu mięśnio-szkieletowego, które ograniczają dawkę i często utrzymują się po przerwaniu terapii. Dzięki ograniczeniu występowania integryny a_ve₃ do obszarów neowaskularyzacji lub inwazji naczyniowej, można przewidywać, że zajęcie się interakcją pomiędzy MMP2 a a_ve₃ powinno ograniczać toksyczność związaną z takim leczeniem. Rzeczywiście rekombinowana, nie posiadająca właściwości katalitycznych zakończona grupą karboksylową domena hemopeksynowa MMP2 (PEX), która pośredniczy w przyłączaniu MMP2 do integryny a_ve₃, wykazała zdolność blokowania tworzenia nowych naczyń i aktywność przeciwnowotworową in vivo. Z jednej strony potencjalna użyteczność tak dużego fragmentu białka, z drugiej zaś związane z nią ograniczenia (np. duża skala problemów związanych z wytwarzaniem, wymogi stawiane przez FDA co do jakości i bezpieczeństwa oraz antygenowość) stwarzają potrzebę bardziej praktycznego rozwiązania tego problemu.

Istnieje zatem zapotrzebowanie na związki chemiczne, które selektywnie hamują aktywność MMP w miejscach wzrostu guza z minimalnym hamowaniem MMP w innych częściach ciała.

Wynalazek niniejszy dotyczy nowych związków użytecznych jako inhibitory angiogenezy i wzrostu guza. Wynalazek obejmuje pochodną glicylolizyny o wzorze (I):

PL 205 134 B1

Ponadto w zakres wynalazku wchodzi pochodna glicylolizyny o wzorze (II):

Wynalazek dotyczy również pochodnej glicylolizyny o wzorze (III):

W zakres wynalazku wchodzi też pochodna glicylolizyny o wzorze (IV):

Ponadto wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego zawierającego substancję czynną i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, który jako substancję czynną zawiera związek o wzorze (I), (II), (III) lub (IV).

Wynalazek obejmuje też zastosowanie związku o wzorze (I), (II), (III) lub (IV) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania wzrostu nowotworu u gospodarza.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania związku o wzorze (I), (II), (III) lub (IV) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania angiogenezy w tkance nowotworowej.

W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie związku o wzorze (I), (II), (III) lub (IV) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do indukowania apoptozy w komórce nowotworowej.

Korzystnie we wszystkich powyższych zastosowaniach kompozycja farmaceutyczna jest do podawania wewnątrzotrzewnowego, podskórnego, dożylnego, przezskórnego, wewnątrzmaziówkowego, domięśniowego lub doustnego.

Gdy pochodne glicylolizyny według wynalazku są podawane do komórek zawierających α_νβ₃, wiązanie a_ve₃ z MMP2 jest zablokowane i w ten sposób zaburzony jest podstawowy mechanizm angiogenezy. Zaburzenie angiogenezy może również spowodować zahamowanie wzrostu guza przez uniemożliwienie tworzenia nowych naczyń w obrębie guza, co pozbawi go substancji odżywczych. Z tego powodu związki według niniejszego wynalazku hamujące angiogenezę i wzrost guza są użytecznymi substancjami leczniczymi do leczenia pacjentów z nowotworami i zaburzeniami angiogenezy. Ponieważ związki według wynalazku wiążą się z a_ve₃, mogą być one stosowane do blokowania procesów zapalnych.

Związki według niniejszego wynalazku mogą być wprowadzone do dowolnego, farmaceutycznie dopuszczalnego podłoża w celu uzyskania kompozycji farmaceutycznych użytecznych w leczeniu nowotworów i innych schorzeń, w tym niepożądanej angiogenezy naczyń.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające związki o wzorach (I), (II), (III) lub (IV) wytwarza się przez formułowanie związku w farmaceutycznie dopuszczalnym podłożu. Kompozycje farmaceutyczne aktywnych związków podaje się pacjentom nowotworowym w celu zmniejszania lub wyeliminowania

PL 205 134 B1 wzrostu guza. Aktywne związki można podawać pozajelitowo w iniekcjach lub stopniowo w infuzji ciągłej, lub w każdy inny sposób odpowiedni dla konkretnej formy użytkowej.

Krótki opis rysunków

Na załączonych rysunkach:

Fig. 1 jest schematyczną ilustracją przedstawiającą interakcję pomiędzy MMP2 a integryną α_νβ₃ i jej rolę w angiogenezie oraz hamowanie interakcji MMP2 z a_ve₃ przez antagonistę takiego jak związki według niniejszego wynalazku.

Fig. 2A graficznie ilustruje wpływ związku hamującego o wzorze (I), związek 1 na interakcję pomiędzy MMP2 a integryną a_ve₃ w teście wiązania z użyciem fazy stałej.

Fig. 2B ilustruje wiązanie związku o wzorze (I) z integrynami a_ve₃ i α₅β₁.

Na Fig. 2C porównano wpływ związku według wynalazku z wpływem związku kontrolnego na wiązanie do a_ve₃.

Na Fig. 2D porównano wpływ reszt aminokwasowych RGD na wiązanie się związku według wynalazku do a_ve₃ z wpływem RGD na wiązanie się bVN z a_ve₃.

Fig. 3A graficznie ilustruje aktywność proteinazy w komórkach β3 pozytywnych i β3 negatywnych.

Fig. 3B ilustruje wiązanie MMP2 w komórkach β3 pozytywnych i β3 negatywnych.

Fig. 4A przedstawia obraz mikroskopowy hamowania angiogenezy w tkance pisklęcia CAM.

Fig. 4B jest graficzną ilustracją hamowania angiogenezy w tkance pisklęcia CAM.

Fig. 4C przedstawia poziom MMP2 w komórkach leczonych i nieleczonych.

Fig. 5A jest mikroskopowym obrazem wzrostu guza i układu naczyniowego w tkance pisklęcia

CAM.

Fig. 5B jest obrazem mikroskopowym gęstości naczyń krwionośnych w tkance pisklęcia CAM.

Fig. 5C jest graficzną ilustracją masy guza w tkance pisklęcia CAM.

Fig. 5d jest graficzną ilustracją układu naczyniowego w tkance pisklęcia CAM.

Fig. 5B jest obrazem mikroskopowym gęstości komórek nowotworowych w tkance pisklęcia

CAM.

Wiązanie MMP2 z integryną a_ve₃ jest istotnym elementem angiogenezy. Specyficzne hamowanie tej reakcji wiązania daje w efekcie zmniejszania unaczynienia we wzrastających tkankach, takich jak nowotwory i opóźnia wzrost guza. Interakcja między MMP2 a integryną a_ve₃ została w uproszczeniu pokazana na Fig. 1. Nową klasę inhibitorów angiogenezy i wzrostu guza stanowią małe cząsteczki, opisane poniżej, które swoiście zakłócają wiązanie MMP2 z integryną a_ve₃ i w ten sposób dostarczają nowego, ważnego środka leczniczego.

Pochodne glicylolizyny według wynalazku mogą zawierać jedno lub więcej centrów asymetryczności i mogą występować w formach optycznie czynnych. Dodatkowe centra asymetryczności mogą być obecne w grupach, które są podstawnikami, takimi jak grupy alkilowe. Pochodne glicylolizyny mogą tworzyć czyste S-izomery i czyste R-izomery, mieszaniny racemiczne izomerów i ich mieszaniny.

Na przykład, na schemacie 1 przedstawiono syntezę związku (I) i (II), w których R oznacza, odpowiednio wodór lub metyl.

PL 205 134 B1

Związek 5, R=Me

Schemat 1

1. Węglan disukcynimidyiu

2, Ester metylowy N-s-BOC-lizyny, 99%

Związek

BOC

HCI dioksan

99%

HCI

Związek

Dichlorek izoftaloiiu

68%

93%

Związek 1, R=H

[ C]-Związek 1 wytworzono z BOC-[ C]-Gly z całkowitą wydajnością 25%

Związek 2

1. HCI - dioksan

2. BOC-Gfy EDCI 96%

PL 205 134 B1

Według schematu 1, alkohol p-trifluorometylobenzylowy poddano reakcji z weglanem disukcynymidylu z wytworzeniem aktywnego estru przejściowego, który następnie poddano reakcji z estrem metylowym Ν-ε-BOC-lizyny, w wyniku czego uzyskano związek 2 z 99% wydajnością. Po hydrolizie grupy ochronnej BOC i nastepnie sprzężeniu z BOC-glicyną, uzyskano związek 3 z 96% wydajnością. Po kwaśnej hydrolizie grupy ochronnej BOC związku 3 uzyskano związek 4 z wydajnością 99%. W wyniku sprzęgania dwóch równoważników związku z 4-dichlorkiem izoftaloilu z 68% wydajnością uzyskano związek 5 o wzorze (II), w którym oba R i R oznaczają metyl. W wyniku hydrolizy związku 5 w obecności wodorotlenku litu uzyskano związek 1 o wzorze (I) z wydajnością 93%.

Synteza związków o wzorze (III) i (IV) jest zilustrowana przez syntezę związku 6 i 7 na poniższym schemacie 2:

Na schemacie 2, związek 4 ze schematu 1 reaguje z chlorkiem benzoilu dając związek 6 (z 90% wydajnością). Hydroliza grupy estrowej związku 6 o wzorze (III) w obecności wodorotlenku litu dostarczyła związku 7 (o wzorze IV) z 88% wydajnością.

Schemat 2 ilustruje również syntezę związku 8, nieaktywnego analogu związku 6 i 7, w którym grupa benzoilowa przyłączona do jednostki glicynowej związku (II) jest zastąpiona grupą diglikoloamidową. Związek 9 wytwarza się z 77% wydajnością, przez sprzęganie związku 4 z kwasem diglikolowym.

Poniższy schemat 3 ilustruje syntezę związku 12, nieaktywnego analogu związku 1, w którym grupa p-trifluorometylobezylokarbonylowa we wzorze (II) jest zastąpiona przez benzoiloamid.

PL 205 134 B1

Preparaty farmaceutyczne związków o wzorach (I), (II), (III) i (IV) mogą być wytwarzane przez wprowadzenie tych związków do farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika. Kompozycje farmaceutyczne zawierające aktywne związki o wzorach (I), (II), (III) i (IV) są podawane osobnikom z nowotworem w celu ograniczenia lub zatrzymania wzrostu guza. Te aktywne związki mogą być podawane pozajelitowo w iniekcjach lub w infuzji ciągłej. Jakkolwiek tkanki przeznaczone do leczenia, są najczęściej leczone drogą dootrzewnową lub podskórną, te aktywne związki mogą być podawane dogałkowo, dożylnie, domięśniowo, domaziówkowo, dojamowo lub przezskórnie i mogą być podawane również za pomocą pompy perystaltycznej.

Termin „podawanie” w odniesieniu do pochodnych glicylolizyny według wynalazku lub zawierających je preparatów farmaceutycznych według wynalazku dotyczy zastosowania ogólnoustrojowego przy podawaniu doustnie, pozajelitowo, wziewnie, donosowo, doodbytniczo lub dopoliczkowo, lub miejscowo w formulacjach o konkretnych jednostkach dawkowania zawierających zależnie od potrzeb konwencjonalne, nietoksyczne farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, substancje pomocnicze i podłoża. Stosowany tutaj termin „pozajelitowe” obejmuje iniekcje dożylne, domięśniowe, dootrzewnowe, domostkowe, podskórne, dostawowe i techniki infuzyjne.

Związki według wynalazku mogą być w postaci farmaceutycznie czynnych dopuszczalnych soli, które według oceny medycznej, nadają się do zastosowania w kontakcie z tkankami ludzkimi i zwierząt niższych bez nadmiernej toksyczności, podrażnienia, odpowiedzi alergicznej i podobnych oraz których zastosowanie wiąże się z akceptowalną wartością wskaźnika zysk/ryzyko, które są skuteczne dla założonego celu w leczeniu nowotworów zaburzeń związanych z angiogenezą.

PL 205 134 B1

Farmaceutycznie dopuszczalne sole są dobrze znane w dziedzinie. Na przykład, S. M. Berge i in. opisuje dokł adnie farmaceutycznie dopuszczalne sole w J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19(1997). Reprezentatywne sole addcyjne z kwasami obejmują chlorowodorek, bromowodorek, siarczan, wodorosiarczan, octan, szczawian, walerianian, oleinian, palmitynian, stearynian, laurynian, boran, benzoesan, mleczan, fosforan, toluenosulfonian, metanosulfonian, cytrynian, maleinian, fumaran, bursztynian, winian, askorbinian, glukoheptanian, laktobionian, laurylosiarczan, itp. Reprezentatywne sole z metalami alkalicznymi lub metalami ziem alkalicznych obejmują sole sodu, wapnia, potasu, magnezu, itp.

Pod stosowanym tu pojęciem „farmaceutycznie dopuszczalnych nośników” rozumie się nietoksyczne, obojętne stałe, półstałe lub ciekłe wypełniacze, rozcieńczalniki, materiały do enkapsulacji lub jakiekolwiek inne środki pomocnicze. Przykładami substancji, które mogą być dodawane jako farmaceutycznie dopuszczalne nośniki są cukry, takie jak laktoza, glukoza i sacharoza; skrobie, takie jak skrobia kukurydziana i ziemniaczana; celuloza i jej pochodne, takie jak sól sodowa karboksymetylocelulozy, etyloceluloza i octan celulozy; sproszkowana tragakanta; słód; żelatyna; talk; zaróbki, takie jak masło kakaowe, woski czopkowe; oleje, takie jak olej z orzeszków ziemnych, z nasion bawełny, olej szafranowy, sezamowy, olej z oliwek, olej kukurydziany i sojowy; glikole, takie jak glikol propylenowy; alkohole wielowodorotlenowe, takie jak gliceryna, sorbitol, mannitol i glikol polietylenowy; estry, takie jak oleinian etylu i laurynian etylu; agar; czynniki buforujące, takie jak wodorotlenek magnezu i wodorotlenek glinu; kwas alginowy; wolna od pirogenów woda; izotoniczny roztwór chlorku sodu; płyn Ringera; alkohol etylowy i roztwory buforu fosforanowego, jak również inne nietoksyczne kompatybilne substancje stosowane w formulacjach farmaceutycznych.

W kompozycji mogą być takż e obecne substancje nawilż ają ce, emulgatory i substancje smarujące, takie jak laurylosiarczan sodu i stearynian magnezu, jak również barwniki, substancje uwalniające, substancje powlekające, substancje słodzące, substancje zapachowe i smakowe, konserwanty i przeciwutleniacze, zależnie od oceny wytwarzającego. Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych przeciwutleniaczy obejmują rozpuszczalne w wodzie przeciwutleniacze, takie jak kwas askorbinowy, chlorowodorek cysteiny, wodorosiarczyn sodu, pirosiarczyn sodu, siarczyn sodu i podobne; przeciwutleniacze rozpuszczalne w tłuszczach, takie jak palmitynian askorbylu, butylowany hydroksyanizol (BHA), butylowany hydroksytoluen (BHT), lecytyna, ester propylowy kwasu galusowego, alfa-tokoferol i podobne oraz zwią zki chelatujące metale, takie jak kwas cytrynowy, kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), sorbitol, kwas winowy, kwas fosforowy i podobne.

Przez „terapeutycznie skuteczną ilość” związku rozumie się ilość związku wystarczającą do leczenia nowotworów i zaburzeń angiogenezy, przy założeniu akceptowalnej dla dowolnego sposobu leczenia wartości stosunku zysk/ryzyko.

Jest zrozumiałe, że całkowite dzienne użycie związku i preparatu farmaceutycznego według wynalazku zależeć będzie od decyzji zalecającego je lekarza, co mieści się w zakresie kompetencji medycznej. Wielkość konkretnej, terapeutycznie skutecznej dawki dla jakiegokolwiek konkretnego pacjenta zależeć będzie od wielu różnych czynników włączając w to rodzaj leczonej choroby, stopień jej nasilenia; aktywność konkretnie zastosowanego związku; specyficzność zastosowanej kompozycji; wieku; masy ciała; płci i diety pacjenta; czasu podawania; drogi podawania; współczynnika eliminacji konkretnie zastosowanego związku; długości leczenia; leków stosowanych w kombinacji lub równocześnie z konkretnie zastosowanym związkiem i tym podobnych czynników określonych zasadami sztuki lekarskiej.

Wynalazek dotyczy również preparatu farmaceutycznego w postaci jednostek dawkowania zawierających terapeutycznie skuteczną ilość związku (lub związków) według wynalazku w kombinacji z typowymi farmaceutycznymi noś nikami. Preparaty do wstrzyknięć, na przykład sterylne wodne lub olejowe zawiesiny do wstrzyknięć mogą być wytworzone według zasad sztuki farmaceutycznej przy zastosowaniu odpowiednich substancji dyspergujących lub zwilżających i zawieszających. Jałowe preparaty do wstrzyknięć mogą również być jałowymi roztworami, zawiesinami lub emulsjami w nietoksycznych, nadających się do podawania pozajelitowego, farmaceutycznie dopuszczalnych rozcieńczalnikach i rozpuszczalnikach, na przykład, jako roztwór w 1,3-butandiolu. Spośród dopuszczalnych podłoży i rozpuszczalników można zastosować tutaj wodę, roztwór Ringera, U.S.P. i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Ponadto, zwykle jako rozpuszczalniki i fazę rozpraszającą stosuje się sterylne ciekłe oleje. Do tego celu można zastosować dowolny niedrażniący ciekły olej włączając w to syntetyczne mono- i diglicerydy.

PL 205 134 B1

Ponadto przy wytwarzaniu preparatów do wstrzyknięć stosuje się kwasy tłuszczowe. Sterylizacja formulacji przeznaczonej do wstrzyknięć może, na przykład, polegać na filtrowaniu przez filtr antybakteryjny lub na włączaniu czynników sterylizujących w skład stałej jałowej kompozycji, która może być rozpuszczana lub rozpraszana w jałowej wodzie tuż przed podaniem.

Dla przedłużenia działania leku często pożądane jest spowolnienie wchłaniania leku z okolicy iniekcji podskórnej lub domięśniowej. Najczęściej stosowanym sposobem uzyskania tego efektu jest wstrzyknięcie zawiesiny substancji krystalicznej lub amorficznej o słabej rozpuszczalności w wodzie. Szybkość wchłaniania leku zaczyna zależeć od szybkości jego rozpuszczania, która z kolei zależy od stanu fizycznego leku, na przykład, od wymiaru i struktury kryształu. Innym podejściem do problemu przedłużenia uwalniania jest podawanie leku w postaci roztworu lub zawiesiny w oleju. Nadające się do wstrzyknięć postacie depot mogą być wytworzone również przez formowanie matryc mikrokapsułkowych leku i podlegających biodegradacji polimerów, takich jak polilaktyd-poliglikolid. Zależnie od stosunku leku do polimeru i składu polimeru można kontrolować szybkość uwalniania leku. Przykładami innych polimerów podlegających biodegradacji są poliortoestry i polibezwodniki. Postacie depot nadające się do wstrzyknięć mogą być również wytwarzane przez wprowadzenie leku do liposomów lub mikroemulsji, które mają powinowactwo do tkanek ciała.

Czopki, przeznaczone do podawania leku drogą doodbytniczą, mogą być wytwarzane przez zmieszanie leku z odpowiednią niedrażniącą zaróbką, taką jak masło kakaowe i glikol polietylenowy, które są stałe w zwykłej temperaturze, lecz ciekłe w temperaturze odbytnicy i z tego powodu topią się w niej, uwalniając lek.

Stałe postaci dawkowania do podawania doustnego mogą obejmować kapsułki, tabletki, pigułki, proszki, peletki i granulaty. W takich stałych postaciach dawkowania substancja czynna może być zmieszana z przynajmniej jednym obojętnym rozcieńczalnikiem, takim jak sacharoza, laktoza czy skrobia. Takie postaci dawkowania, jak to się zwykle praktykuje, mogą zawierać dodatkowe substancje inne niż obojętne rozcieńczalniki, np. tabletkowe substancje smarujące i inne tabletkowe substancje pomocnicze, takie jak stearynian magnezu i celuloza mikrokrystaliczna. W przypadku tabletek, kapsułek i pigułek postaci dawkowania mogą zawierać również czynniki buforujące. Tabletki i pigułki mogą być sporządzane z powłoką dojelitową lub innymi powłokami kontrolującymi uwalnianie. Podobnego typu stałe kompozycje mogą być stosowane również jako wypełniacze w miękkich i twardych kapsułkach żelatynowych przy zastosowaniu, takich zaróbek jak laktoza lub cukier mleczny, jak również glikole polietylenowe o wysokim ciężarze cząsteczkowym i tym podobne.

Ciekłe postaci dawkowania, nadające się do podawania doustnego, mogą obejmować farmaceutycznie dopuszczalne emulsje, mikroemulsje, roztwory, zawiesiny, syropy i eliksiry zawierające obojętne zwykle stosowane według zasad sztuki farmaceutycznej, rozcieńczalniki np. wodę. Takie kompozycje mogą również zawierać substancje pomocnicze, takie jak środki zwilżające; emulgatory i substancje zawieszające; słodziki, substancje smakowe i zapachowe. W razie konieczności, związki według wynalazku mogą zostać włączone do systemów opóźnionego uwalniania lub docelowych systemów terapeutycznych, takich jak matryce polimerowe, liposomy i mikrosfery. Mogą być one sterylizowane, na przykład, przez filtrację przez filtr antybakteryjny lub przez włączanie czynników sterylizujących do sterylnej stałej postaci, którą można rozpuścić w jałowej wodzie lub innym środowisku nadającym się do wstrzyknięć, tuż przed zastosowaniem. Substancje czynne mogą mieć również postać mikrokapsułek z jedną lub więcej zaróbką, jak opisano powyżej.

Stałe postaci dawkowania - tabletki, drażetki, kapsułki, pigułki i granulki mogą być przygotowane z powłoczkami lub otoczkami, takimi jak powłoczki dojelitowe i inne powłoczki, zgodnie ze znanymi zasadami receptury farmaceutycznej. Mogą one ewentualnie zawierać substancje zmętniające i mogą być w takiej kompozycji, że będą uwalniały tylko aktywny(e) składnik(i) lub korzystniej, będą go (je) uwalniać w pewnej części przewodu pokarmowego, ewentualnie w sposób przedłużony. Przykłady konkretnych kompozycji, które mogą być stosowane, obejmują polimery i woski. Postaci dawkowania, przeznaczone do użytku zewnętrznego lub stosowania drogą przezskórną związków według niniejszego wynalazku, dalej obejmują jeszcze maści, pasty, kremy, płyny, żele, proszki, roztwory, aerozole, środki do inhalacji lub plastry. Aktywny składnik jest mieszany w warunkach jałowych z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i w zależności od wymagań, z dowolnym potrzebnym konserwantem lub buforem.

Preparat farmaceutyczny według wynalazku może mieć postać formulacji ocznych, kropli do uszu, maści ocznych, proszku i roztworu. Maści, pasty, kremy i żele mogą zawierać, jako dodatek do substancji czynnych według wynalazku, zaróbki, takie jak tłuszcze zwierzęce i roślinne, oleje, woski,

PL 205 134 B1 parafiny, skrobię, tragakantę, pochodne celulozy, glikole polietylenowe, silikony, bentonity, kwas krzemowy, talk i tlenek cynku lub ich mieszaniny.

Proszki i aerozole mogą zawierać jako dodatek do związków według wynalazku, zaróbki, takie jak laktoza, talk, kwas krzemowy, wodorotlenek glinu, krzemian i proszek poliamidowy lub mieszaniny tych substancji. Aerozole mogą dodatkowo zawierać zwyczajowe propelenty, takie jak chlorofluorowęglowodory.

Plastry przezskórne mają dodatkową zaletę kontrolowanego dostarczania związku do organizmu. Takie postaci dawkowania mogą być wytwarzane przez rozpuszczanie lub dyspergowanie związku w odpowiednim środowisku. Mogą również być stosowane wzmacniacze absorpcji w celu zwiększenia przepływu związku przez skórę. Szybkość może być kontrolowana albo przez dodanie błony kontrolującej szybkość uwalniania, albo przez rozproszenie związku w matrycy polimerowej lub żelu.

Kompozycje zawierające substancje czynne są podawane w sposób zgodny z postacią dawkowania oraz w ilości terapeutycznie skutecznej. Ilość podawanego leku i czas podawania zależą od osobnika, który ma być leczony, zdolności jego organizmu do wykorzystania substancji czynnej i pożądanego stopnia reakcji leczniczej. Dokładne ilości substancji czynnej wymaganej do podawania zależą od oceny leczącego i są dobierane dla każdego przypadku indywidualnie.

Odpowiednie zakresy dawek przeznaczonych do stosowania ogólnego są tu ujawnione i zależą od drogi podawania. Odpowiednie reżimy dawkowania są zmienne, ale typowo opierają się na dawce wstępnej, po której następują kolejne powtarzające się dawki z jednym lub kilkoma uprzednio określonymi odstępami między kolejną iniekcją lub inną drogą podawania.

Preparaty przeznaczone do pozajelitowego podawania związków według wynalazku lub kompozycji obejmują jałowe roztwory wodne i bezwodne, zawiesiny i emulsje. Przykładami bezwodnych rozpuszczalników są: glikol propylenowy, glikol polietylenowy, oleje roślinne, takie jak olej z oliwek i nadają ce się do iniekcji organiczne estry, takie jak oleinian etylu. Noś niki wodne obejmują wodę , alkoholowo/wodne roztwory, emulsje i zawiesiny, obejmujące sól fizjologiczną i buforowane media. Pozajelitowe podłoża obejmują roztwór chlorku sodu, dekstrozę Ringera, dekstrozę i chlorek sodu, płyn Ringera z mleczanami lub ciekłe oleje. Podłoża dożylne obejmują płyn uzupełniające i uzupełniające substancje odżywcze elektrolity (takie jak płyny oparte na dekstrozie Ringera) i tym podobne. Mogą być również obecne środki konserwujące i inne dodatki, takie jak, na przykład, substancje przeciwko drobnoustrojom, przeciwutleniacze, związki chelatujące, obojętne gazy i tym podobne.

Pochodne glicylolizyny według wynalazku hamują interakcje pomiędzy MMP2 a α_νβ₃, a przez to hamują angiogenezę w tkance nowotworowej. Metoda hamowania obejmuje podawanie pacjentowi kompozycji zawierającej ilość związku opisanego powyżej, wystarczającą do zahamowania angiogenezy. Interakcja pomiędzy MMP2 i a_ve₃ jest hamowana przez kontaktowanie a_ve₃ ze związkiem według niniejszego wynalazku.

Angiogeneza polega na tworzeniu nowej sieci naczyń z wcześniej istniejących naczyń gospodarza i jest ona niezbędna dla wzrostu guza powyżej 1-2 mm³. Dla celów niniejszego wynalazku uważa się, że angiogeneza jest hamowana tak długo, jak długo ograniczeniu ulega angiogenezie i zmniejsza się nasilenie objawów choroby wywołane angiogenezą.

Zakres dawek substancji czynnej podawanej gospodarzowi zależy od tego, który konkretnie aktywny związek został zastosowany i od rodzaju konkretnego nowotworu lub integryny. Specjalista może z łatwością określić odpowiednie dawkowanie dla konkretnego aktywnego związku, bez zbędnych eksperymentów. Gospodarzem może być dowolny ssak. Dawka powinna być wystarczająco duża, aby wywołać żądany efekt terapeutyczny, przy którym angiogeneza ulegnie ograniczeniu, a objawy choroby poprawie i zwykle stanowi ilość wystarczającą do utrzymania stężenia aktywnego związku w osoczu w zakresie od około 0,01 do około 100 mikromoli ^M), korzystnie od około 0,2 do około 20 μM, bardziej korzystnie od około 1 do około 10 μM.

Dawki nie powinny być zbyt duże, aby nie powodować objawów ubocznych. Dawka na kilogram (kg) masy ciała może mieścić się w zakresie od 1 do 20 mg na dawkę, w jednej lub kilku dawkach podzielonych w ciągu dnia, przez jeden lub kilka dni lub dowolnie długo.

Dla zahamowania angiogenezy ilość terapeutycznie skuteczna oznacza ilość aktywnego związku wystarczającą do wytworzenia możliwego do zmierzenia ograniczenia angiogenezy w leczonej tkance, tj. ilość hamującą angiogenezę lub ilość hamującą interakcję MMP2-a_ve₃. Zahamowanie angiogenezy może być mierzone „in situ” za pomocą immunohistochemii, jak tu opisano, lub innymi metodami znanymi specjalistom.

PL 205 134 B1

Kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek według wynalazku wytworzona zgodnie z zastosowaniem według wynalazku może być stosowana do indukowania apoptozy w komórkach nowotworowych. W tym celu podaje się gospodarzowi terapeutycznie skuteczną ilość aktywnego związku w postaci kompozycji, wystarczającą do zainicjowania apoptozy komórek nowotworowych.

Dla celów niniejszego wynalazku przyjmuje się, że apoptoza komórek nowotworowych jest rozpoczęta, jeśli obserwuje się wzrost apoptozy w docelowym poddawanym leczeniu nowotworze. Apoptoza komórek nowotworowych może być mierzona opisanymi tu metodami lub typowymi metodami znanymi w tej dziedzinie.

Następujące, nieograniczone przykłady są przedstawione w celu zilustrowania różnych aspektów niniejszego wynalazku.

Materiały i Metody

Przeciwciała, Komórki i Odczynniki

Komórki czerniaka chomika CS-1 i komórki CS-1 transfekowane ludzką podjednostką β3integryny (komórki e₃CS-1) były opisane uprzednio (Cell, 85, 683-93(1996); Cell, 92, 391-400(1998)). Przeciwciała monoklonalne przeciwko biotynie mAbBN-34 i przeciwko aktynie mAbAC-40, sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) uzyskano z Sigmy (St. Louis, Missouri). Przeciwciała poliklonalne (pAb) przeciwko czynnikowi von Willebranda (vWF) uzyskano od DAKO (Glostrup, Dania). Cykliczne peptydy cRGDfV i cRADfV i integryna a_ve₃ zostały dostarczone przez Merck KGaA (Darmstadt, Niemcy). Oczyszczona proMMP2 i integryna a_ve₃ zostały dostarczone przez Chemicon International (Temecula, Kalifornia). Oczyszczoną aktywną MMP2 uzyskano od Calbiochem (La Jolla, Kalifornia). Czynnik wzrostowy fibroblastów zasadochłonnych (bFGF) uzyskano dzięki uprzejmości Scios (Mountain View, Kalifornia). Synteza związków-[C¹⁴]. Znakowany [C¹⁴] związek 1 zsyntetyzowano przez lekką modyfikację ciągu opisanego wcześniej dla materiału nieznakowanego (Schemat 1), ale wykorzystując N-BOC-[1-C¹⁴]-glicynę (55 mCi/mmol, American Radiolabeled Chemiicals, St. Louis, MO). Całkowita wydajność [C¹⁴]-związku 1 wyniósł 25% dla czterostopniowego ciągu.

P r z y k ł a d 1

Test wiązania integryny w fazie stałej

Oczyszczone integryny były adsorbowane przez noc na studzienkach płytki mikrotitracyjnej (1-5 μg/ml, 50μg/studzienkę) przed zablokowaniem blokerem kazeiny (Pierce, Rockford, Illinois). Do studzienek dodano oczyszczoną, biotynylowaną MMP2 (bMMP 2,3-5 nM) w buforze wiążącym (50mM Tris, pH=8, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0,5 mM MnCl2) w obecności lub nieobecności Związku 1, Związku 12, cyklicznych peptydów RGD lub RAD lub samego buforowanego podłoża.

Do studzienek kontrolnych nie dodawano integryny. Jako substancję odniesienia stosowano biotynylowaną witronektynę (bVN, 1 μg/ml). Związane białko wykrywano przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko biotynie skoniugowanymi z HRP i oceniano ilościowo przy długości fali 450 nm, stosując roztwór 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB; substrat dla peroksydazy) (BioRad, Hercules, Kalifornia).

W celu oszacowania bezpośredniego wiązania integryny przez związek 1, studzienki płytki mikrotitracyjnej Immulon-4 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Virginia) pokryto a_ve₃ i α₅β₁ (10 μg/ml, μl/studzienkę), przy czym studzienki zasadniczo zablokowano i inkubowano z związkiem 1 znako14 wanym izotopem [C] przed dodaniem 150 μl buforu wiążącego zawierającego 0,1% Tween-20 i odciągnięto całość płynu. Dla oceny ilościowej wysuszone studzienki oddzielono i zanurzono w płynnym koktailu scyntylacyjnym BetaMax (ICN Biochemicals, Costa Mesa, Kalifornia). Z uzyskanej w ten sposób krzywej wiązania wyznaczono minimalne wysycające stężenie (3 μM) znakowanego [¹⁴C] związku 1, które zbadano w obecności i nieobecności 25-krotnego nadmiaru molowego (75 μθ nieznakowanego związku 1 lub związku 12, lub 100 μM cyklicznych peptydów RGD lub RAD. Kontrolą był bVN stosowany i wykrywany metodą opisaną powyżej.

P r z y k ł a d 2

Test wiązania MMP2 na komórkach i degradacji kolagenu typu IV znakowanego [³H]

Komórki CS-1 lub e₃CS-1 inkubowano z buforem adhezyjnym na podłożu podstawowym dla fibroblastów (FBM) uzupełnionym 0,5% albuminą z surowicy bydlęcej (BSA), 0,4mM MnCl₂ i 10 μg/ml aprotyniny, zawierającym również 4 nM samej oczyszczonej, aktywnej MMP2 lub w kombinacji z 10 μM związku 1 lub związku 12 przez 45 minut w temperaturze 37°C przed płukaniem i dodaniem do studzienek pokrytych [³H]-kolagenem IV.

Studzienki pokryto przez noc 50 μl 0,414 mCi/ml [³H]-kolagenem IV (ICN Biochemicals, Costa Mesa, Kalifornia) i obficie płukano, aż do momentu, gdy radioaktywność w roztworze po płukaniu

PL 205 134 B1 osiągnęła tło. Alternatywnie, komórki traktowano w sposób powyższy w nieobecności MMP2 lub też roztwory MMP2 dodawano bezpośrednio do studzienek bez komórek, jako kontrolę. Degradację kolagenu IV oceniano ilościowo za pomocą cieczowego licznika scyntylacyjnego przez pomiar radioaktywności wyzwalanej do 50 μl podłoża hodowli. W celu oceny wiązania biotynylowanej MMP2 do komórek CS-1, komórki zawieszano w buforze adhezyjnym i inkubowano z 12 μM bMMP2 przez 45 minut w temperaturze 37°C w obecności i nieobecności 10 μM związku 1 lub związku 12. Komórki następnie płukano, po czym poddawano je lizie i przygotowaniu do procedury SDS-PAGE i badań typu immunoblotting z przeciwciałami mAb przeciwko biotynie.

P r z y k ł a d 3

Test angiogenezy na błonie kosmówki omoczniowej zarodka kurzego (CAM)

Angiogenezę oceniano zasadniczo według sposobu opisanego poprzednio w Cell, 85, 68393(1996); Cell, 92, 391-400(1998)). Po stymulacji 3 μg/ml podstawowego czynnika wzrostowego dla fibroblastów zasadochłonnych (bFGF), CAM 10-dniowego zarodka kurzego traktowano 20 μl 3 μM roztworu związku 1 lub związku 12. Trzy dni po indukcji CAM oceniano metodą ślepej próby. CAM z każdej grupy pulowano, rozdrabniano i ekstrahowano 50 mM Tris, 150 nM NaCl, 0,1% Tritonu X-100 zawierającego koktail inhibitora proteazy gatunku COMPLETE bez EDTA (Boehringer, Mannheim, Niemcy) przed analizą z zastosowaniem zymografii.

P r z y k ł a d 4

SDS-PAGE, Immunoblotting i Zymografia

Immunoblotting. Równe ilości białka oddzielano metodą SDS-PAGE w środowisku redukującym i poddawano elektroblottingowi na błonie Immobilon-P (Millipore, Bedford, Maryland). Błonę blokowano i unieruchomione białka wykrywano przez inkubację z przeciwciałem pierwotnym, swoistym wobec antygenu, a następnie z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z HRP, zgodnie z wymogami. Pasma wizualizowano substratami chemiluminescencyjnymi PS-3 (Lumingen, Inc., Southfield, Missouri).

Zymografia. Lizaty kurzego CAM przygotowane w sposób opisany powyżej i równe ilości białek wydzielano bez czynników redukujących lub gotowano na żelu poliakrylamidowym wbudowanym w 0,2% żelatynę. Żele płukano 2% Tritonem-100, a następnie intensywnie płukano wodą przed całonocną inkubacją w temperaturze 37°C w buforze do kolagenazy (50 mM Tris 7,4,200 mM NaCl, 10 mM CaCl2). Zdolności lityczne wobec żelatyny oceniano wizualnie przez barwienie żeli 0,5% błękitem Coomassie.

P r z y k ł a d 5

Test wzrostu guza

Nowotwory pierwotne hodowano na CAM 9-dniowego zarodka kurzego przez wysianie 5x10⁶ komórek CS-1 i 7-dniową inkubację. W tym momencie 50 mg skrawki tego nowotworu poddano podhodowli na świeżej 9-dniowej CAM i pozostawiono do implantacji przez 24 godziny przed pojedynczym dożylnym podaniem 100 μl 100 μM testowanych związków w zrównoważonym roztworze soli fizjologicznej Hanka (HBSS). Sam bufor stosowano jako kontrolę. Nowotwory inkubowano przez 10 pełnych dni, następnie zbierano oczyszczano z nadmiaru tkanki zrębowej i przygotowywano do badań histologicznych.

P r z y k ł a d 6

Test immunofluorescencji

Szybko mrożone skrawki nowotworu CS-1 utrwalano 4% paraformaldehydem i permeabilizowano 0,1% Tritonem X-100. Skrawki blokowano 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) przed barwieniem przeciwciałami pAb przeciwko vWF i wizualizacją za pomocą sprzężonych z Alexa-568 przeciwciał drugorzędowych przeciwko przeciwciałom króliczym. Próbki analizowano w mikroskopie konfokalnym MRC1024 (BioRad, Hercules, Kalifornia). Zagęszczenie naczyń obliczano w obiektywie z powiększaniem 20x w czterech polach widzenia na skrawek i czterech nowotworach na badanie.

P r z y k ł a d 7 (S)-6-(((tert-butyloksy)karbonylo)amino)-2-((4-trifluorometylo)-benzyloksykarbonylo)heksanian metylu (2)

Roztwór węglanu N,N'-disukcynymidylu (5,38 g; 21 mmoli) w acetonitrylu (150 ml) traktowano alkoholem 4-(trifluorometylo)benzylowym (2,87ml; 21 mmol) i Et3N (5,8 ml, 42 mmol) i mieszano w 25°C. Po 3 godzinach mieszaninę reakcyjną dodawano do kolby zawierającej ester metylowy N-εBOC-lizyny (4,2 g; 14 mmol) w acetonitrylu i mieszano przez dodatkowe 3 godziny. Roztwór odparowano, a osad rozpuszczono w CH2CI2 (250 ml) i płukano w 10% wodnym HCl (2x200 ml) i nasyconym

PL 205 134 B1 wodnym roztworem NaHCO3, (200 ml). Po szybkiej chromatografii (SiO2, CH2Cl2/EtOAc) otrzymano

6,4 g (99%) związku 2 w postaci jasnożółtego oleju: [a]D²⁵ -8,9 (c 5,6; CH3OH); ¹H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7, 57 (d, J= 8,1 Hz; 2H) ; 7,39 (d, J= 8,1 Hz; 2 H); 5,7 (d, J= 7,9 Hz; 1H); 5,13 (m, 2H); 4,71 (m, 1H); 4,28 (m, 1H); 3,67 (s,3H); 3,03 (m, 2H); 1,78 (m,1H); 1,64 (m,1H); 1,46-1,32 (m, 4H) 1,35 (s, 9H); ¹³C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 172,9; 156,2; 155,8; 140,4; 130,1 (q, J= 32,0 Hz); 127,8; 125,3; 122,9 (q, J=270,0 Hz); 79,05; 65,8; 53,7; 52,3; 39,8; 31,7; 29,5; 28,4; 22,2; IR (film) vmax 3357; 2952; 1790; 1745; 1524cm^-1; FABHRMS (NBA-Nal) m/z 463, 2044 (M⁺ H⁺, C21H29F3N2O6 wymaga 463,2056).

P r z y k ł a d 8 (S)-6-[2(((tert-butyloksy)karbonylo)amino)-acetamido]-2-[(4-trifluorometylo)benzyloksykarbonylo] heksanian metylu (3)

Roztwór związku 2 (2,7g; 5,8 mmola) w CH2Cl2 (3 ml) traktowano 4N dioksanem-HCl (10 ml) i mieszano przez 20 minut w 25°C. Rozpuszczalnik i nadmiar kwasu usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a nieoczyszczoną sól chlorowodorkową rozpuszczano w DMF (50 ml), traktowano N-((tertbutyloksy)-karbonylo)glicyną (1,0 g; 5,8 mmol), chlorowodorkiem 1-(3-(dimetyloamino)propylo)-3-etylkarbodiimidu (EDCI) (1,2 g; 6,4 mmola) oraz i-Pr2NEt (2,0 ml; 11,6 mmola) i mieszano przez 12 godzin w temperaturze 25°C. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczano EtOAc (400 ml) i płukano 10% wodnym HCl i nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 (250 ml), odwadniano (Na2SO4) i odparowano uzyskując 2,89 g (96%) związku 3 w postaci białej, stałej piany: [a]_D ²⁵-10,4 (c 2,5; CH3OH); ¹H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7,59 (m, 2H); 7,45 (m, 2H); 6,19 (m, 1H); 5,51 (m, 1H); 5,13 (m, 2H); 4,32 (m, 2H); 3,74 (s, 3H); 3,73 (m, 2H); 3,26 (m, 2H); 1,81-1,39 (m, 6H) 1,44 (s,9H); ¹³C NMR (CD3OD, 100 MHz) δ 174,5; 172; 158,2; 158,1; 142,7; 130,8 (q, J=31,8 Hz); 128,8; 126,3; 125,5 (q, J=269, 7Hz); 80,5; 66,5; 55,3; 52,7; 44,6; 39,8; 32,1; 29,8; 24,0; IR (film) vmax 3320; 2932; 1721; 1692;1326 cm^-1; FABHRMS (NBA-CsI) m/z 652,1234 (M⁺ Cs⁺, C23H32F3N3O7 wymaga 652,1247).

P r z y k ł a d 9

Chlorowodorek 6-[2-(amino)acetamido]-2-[(4-trifluorometylo)-benzyloksykarbonylo]heksanianu (4)

Roztwór związku 3 (350mg) w CH2Cl2 (2ml) traktowano 4 N dioksanem-HCl (5,0 ml) i mieszano w 25°C. Po 0,5 godziny rozpuszczalnik i nadmiar kwasu usuwano pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 300 mg (99%) związku 4 w postaci jasnożółtego oleju: [a]_D ²⁵-10,4 (c 3,0; CH₃OH); ¹H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 7, 65 (d, J=8,2 Hz; 2H); 5,18 (d, J=13,3 Hz; 1H); 5,16 (d,J=13,3 Hz; 1H); 4,16 (m,1H); 3,70 (s, 3H);3,65 (s,2H); 3,21 (t, J=7,1 Hz, 2H) 1,84 (m,1H); 1,68 (m,1H); 1,54 (m, 2H); 1,42 (m,2H); ¹³C NMR (CD3OD, 100 MHz) δ 174,5; 167,1; 158,2; 142,8; 130,8; (q, J=31,8 Hz); 128,8; 126,3; 125,5 (q, J=270, 1 Hz); 66,5; 55,4; 52,7; 41,5; 40,2; 32,1; 29,6; 24,1; IR (film) vmax 3317; 2954; 1718; 1684; 1530; 1327 cm^-1; MALDIFTMS (DHB) m/z 4421586 (M⁺ Na⁺, C18H24F3N3O5 wymaga 442,1566).

P r z y k ł a d 10

N,N¹-Bis[(5-(S) -(metoksykarbonylo)-5[((4-trifluorometylo)-benzyloksykarbonylo)amino]pentylo)karboksyamidometylo]benzeno-1,3-dikarboksamid (5)

Roztwór związku 4 (2,05g; 4,0 mmola) w CH2Cl2 (3,0 ml) traktowano 4 N dioksanem-HCl (10 ml) i mieszano przez 20 minut w temperaturze 25°C. Rozpuszczalnik i nadmiar kwasu usuwano pod zmniejszonym ciśnieniem, a nieoczyszczoną sól chlorowodorkową zawieszano w DMF (40 ml) i traktowano dichlorkiem izoftaloilu (400 mg; 2,0 mmola) oraz i-Pr2NEt (1,4 ml; 8,0 mmola) i mieszano przez godzinę w 25°C. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczano EtOAc (400 ml) i płukano 10% wodnym roztworem HCl (3 x 200 ml) i 5% wodnym roztworem Na2CO3 (200 ml), odwadniano (Na2SO4) i odparowano. Po szybkiej chromatografii (SiO2, 1:4, 5:4,5 MeOH/CH2Cl2/EtOAc) otrzymano 1,30g (68%) związku 5 w postaci żółtego proszku: [a]_D ²⁵ -6,4(c 2,1, CH3COH); ¹H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8,29 (m, 2H); 8,11 (m, 2H); 7,87 (m, 4H); 7,53 (m, 2H); 7,39 (m, 2H); 6,88 (m, 2H); 5,94 (m, 2H); 5,08 (m 4H); 4,30 (m, 2H); 4,01 (m, 4H); 3,70 (s, 6H); 3,23 (m, 4H); 1,77 (m, 2H); 1,67 (m, 2H); 1,51 (m, 4H); 1,37 (m, 4H); ¹³C NMR (CD3OD, 100 MHz) δ 174,6; 171,5; 169,3; 158,3; 142,7; 135,5; 131,6; 30,8 (q, J=32,2); 129,8; 128,8; 127,6; 126,3; 125,5 (q, J=269,2); 66,5; 55,4; 52,7; 44,1; 40,0; 32,1; 29,8; 24,1; IR (film) vmax 3305; 2951;1716; 1651; 1538 cm^-1; FABHRMS (NBA-CsI) m/z 1101, 2398 (M⁺Cs⁺, C44H50F6N6O12 wymaga 1101, 2445).

P r z y k ł a d 11

N,N¹-Bis-[(5-(S)-karboksy-5-[((4-trifluoro-metylo)benzyloksykarbonylo)amino]-pentylo)karboksamido-metylo]benzeno-1,3-dikarboksamid (1)

PL 205 134 B1

Roztwór związku 5 (0,95 g; 0,98 mmol) w THF-MeOH (8,0 ml, 3:1) traktowano LiOH H2O (165 mg, 3,9 mmola) w H2O (2,0 ml) i mieszano w 0°C. Po 2 godzinach reakcję przerwano przez dodanie 10% wodnego roztworu HCl (20 ml) a mieszaninę ekstrahowano za pomocą EtOAc (3 x 50 ml). Warstwy organiczne łączono i płukano w nasyconym roztworze NaCl (50ml), suszono (Na2SO4) i odparowano uzyskując 0,86 g (93%) związku 1 w postaci białego proszku: [a]_D ²⁵-0,6 (c 3,2; CH₃OH); ¹H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 8,40 (m, 1H; 8,03 (dd, J=1,8; 7,8 Hz, 2H, 7,62 (d, J=8,1 Hz, 4H); 7,53 (t, J=6,1 Hz, 1H); 7,51 (d, J=8,1 Hz, 4H; 5,16 (d, J=13,3 Hz, 2H); 5,13 (d, J=13,3 Hz, 2H) 4,12 (m, 2H), 4,00 (s, 4H), 3,22 (t, J=6,6 Hz, 4H); 1,85 (m,2H); 1,70 (m, 2H); 1,55 (m, 4H; 1,37 (m, 4H); ¹³C NMR (CD3OD, 100 MHz) δ 175,9; 171,6; 169,4; 158,4; 135,4; 131,6; 30,5 (q, J=31,8); 129,8; 128,8; 127,7; 126,3; 125,6 (q, J=268,7); 66,5; 53,3; 44,2; 40,1; 32,2; 29,8; 24,2; IR(film) vmax 3334; 2933; 1718; 1646; 1631; 1528 cm^-1; MALDIFTMS (DHB) m/z 963, 2953 (M⁺Na⁺, C42H46F6N6O12 wymaga 963,2976).

P r z y k ł a d 12

[¹⁴C]-związek (1)

Roztwór [ 1-¹⁴C]-glicyny (American Radiolabeled Chemicals; 1,0 m Ci/mmol; 55 mCi/mmol, 0,018 mmola) w 0,1 N HCl przeniesiono do 4 ml probówki, po czym usunięto rozpuszczalnik strumieniem N2. Pozostały osad traktowano roztworem NaHCO3 (4,6 mg; 0,054 mmola) w H2O (0,25 ml) i roztworem wodorowęglanu di-tert-butylu (10,5 ml; 0,045 mmol) w THF (0,25 ml) i mieszano w temperaturze 25°C. Po 12 godzinach, gdy roztwór stał się homogenny, rozcieńczano go w w wodzie (1,0 ml) i płukano eterem dietylowym (2x 1,0 ml). Następnie roztwór wodny zakwaszano przez dodanie 10% roztworu wodnego HCl (0,5 ml) i ekstrahowano octanem etylu (4x 1,0 ml). Połączone ekstrakty suszono (Na2SO4) i odparowano w strumieniu N2 uzyskując 2,9 mg (92%) [1-¹⁴C]-N-BOC-glicyny w postaci białej błony.

Roztwór związku 2 (50 mg, 0,11 mmol) w CH2Cl2 (1 ml) traktowano 4 N HCl-dioksanem (1 ml) i mieszano przez 1 godzinę w temperaturze 25°C. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono octanem etylu (25 ml) i płukano 10% wodnym roztworem Na2CO3 (25ml) i nasyconym wodnym roztworem NaCl (25 ml), wysuszono (Na2SO4) i odparowano uzyskując lizynę bez grup ochronnych w postaci bezbarwnej błony. Porcję tej wolnej aminy (4,5 mg; 0,013 mmola) w DMF (0,2 ml) dodano do 4 ml probówki zawierającej [1-¹⁴C]-N-BOC-glicynę (1,5 mg, 0,0085 mmola) i traktowano i-Pr2NEt (2ml) i roztworem EDCI (5,0 mg; 0,026 mmola) w chlorku metylenu (0,1 ml) i mieszano przez 3 godziny w temperaturze 25°C. Mieszaninę reakcyjną rozpuszczono w EtOAc (2,0 ml), płukano 10% kwasem solnym (3x 1,0 ml) nasyconym roztworem wodnym Na2CO3 (1,0 ml) i nasyconym roztworem wodnym NaCl (1,0 ml) i odparowano. Po preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej (PTLC) (SiO2, EtOAc/CHCl3 1:1) otrzymano 1,8 mg (41%) [¹⁴C] związku 3 w postaci białej błony.

Czteromililitrową probówkę zawierającą [¹⁴C]-związek 3 (1,8 mg, 3,5 mmol) traktowano 4 N HCldioksanem (0,25 ml) i mieszano przez 0,5 godziny w temperaturze 25°C. Rozpuszczalnik i nadmiar kwasu odparowano pod strumieniem N2 i otrzymaną surową sól chlorowodorkową traktowano dichlorkiem izoftaloilu (355 mg 0,0018 mmola) w CH2Cl2 (0,1 ml) oraz i-Pr2NEt (2,4 ml; 0,014 mmola) w CH2CI2 (0,05 ml). Po 3 godzinach w temperaturze 25°C mieszaninę reakcyjną dokładnie oczyszczono metodą PTLC (SiO2, MeOH/CHCl3/EtOAc 1:9:9) uzyskując 1,2 mg (71%) [¹⁴C]-związku 5.

Roztwór [¹⁴C]-związku 5 (1,2 mg) w THF-MeOH (0,2 ml; 25 1:1) traktowano roztworem LiOH-H₂O (0,4 mg) w H₂O (0,05 ml) w temperaturze 0°C i mieszano przez godzinę. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono metanolem (1,0 ml) i traktowano kwaśną żywicą kationowymienną Dowex 50WX-8 (200 mg) i mieszano następnie przez 1 minutę. Następnie mieszaninę filtrowano przez bawełnę, a po odparowaniu filtratu otrzymano 1,1 mg (94%) [¹⁴C]-związku 1 o względnej aktywności około 110 mCi/mmol. Ten związek i wszystkie związki przejściowe były identyczne, co stwierdzono na podstawie chromatografii cienkowarstwowej (TLC) w porównaniu z odpowiadającymi nieznakowanymi materia łami.

P r z y k ł a d 13 (S)-6-[2-(benzyloamino)acetamido]-2-[(4-trifluorometylo)-benzyloksykarbonylo)heksanian metylu (6)

Roztwór związku 3 (44 mg, 0,085 mmola) w CH2Cl2 (1,0 ml) traktowano 4 N HCl-dioksanem (1,0 ml) i mieszano przez godzinę w temperaturze 25°C. Rozpuszczalnik i nadmiar kwasu usunięto strumieniem N2, a nieoczyszczoną sól chlorowodorkową zawieszono w CH2Cl2 (0,8 ml) i traktowano i-Pr₂Net (30 μ!, 017 mmola) i chlorkiem benzoilu (11 gl; 0,094 mmola) i mieszano w 25°C. Po 2 godzinach mieszaninę reakcyjną bezpośrednio oczyszczono przez szybką chromatografię (SiO2, 1:9:9 MeOH/CH₂Cl₂/EtOAc) uzyskując 40 mg (90%) związku 6 w postaci białego proszku: [a]_D ²⁵-2,7 (c 0,70; CDCl3); ¹H NMR (CD3OD; 400 MHz) δ 7,86 (m, 2H); 7,64 (m, 2H); 7,53 (m, 3H); 7,45 (m, 2H); 5,16

PL 205 134 B1 (m, 2H); 5,16 (dd; J=7,3; 3,8 Hz; 1H); 3,69 (s, 3H) ; 3,21 (t, J= 5,6 Hz; 2H);1,81 (m, 1H); 1,69 (m,1H); 1,53 (m, 2H); 1,42 (m, 2H); ¹³C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 172,8; 169,5; 168,4; 156,3; 142,3; 132,9; 131,4; 129,4 (q, J= 32,2 Hz); 128,0; 127,1; 126,7; 126,3 (q; J= 269,0 Hz); 124,8; 65,1; 53,6; 51,6; 42,6; 38,4; 30,6; 28,1; 22,2; IR (film) vmax 3303; 2923; 1713; 1651; 1533 cm^-1; FABHRMS (NBA-CsI) m/z 656,0961 (M + Cs, C25H25F3N3O6 wymaga 656,0985).

P r z y k ł a d 14

Kwas (S)-6-[2-(benzyloamino)acetamido]-2-(4-trifluorometylo)-benzyloksykarbonylo]heksanowy (7)

Roztwór związku 6 (17 mg; 0,032 mmola) w THF-MeOH (0,4 ml; 3:1) traktowano LiOH-H₂O (2,0 mg; 0,49 mmola) rozpuszczonego w H2O (0,1 ml) i mieszano przez 2 godziny w temperaturze 0°C. Mieszaninę reakcyjną zobojętniono stężonym wodnym HCl (5 μθ, rozpuszczano w EtOAc (30 ml) i płukano wodą (2x 15 ml). Suszono (Na2SO4) i odparowano i uzyskano 14,5 mg (88%) związku 7 w postaci białego proszku: [a]D²⁵ + 2,2 (c 0,6; CH3OH); ¹H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 7,86 (d, J = 7,2 Hz; 2H); 7,62 (d, J=8,2 Hz; 2H); 7,54 (d, J=8,2 Hz; 2H); 7,53 (m, 1H); 7,43 (m, 2H); 5,17 (d, J=13,2 Hz, 1H); 5,14 (d, J=13,2 Hz; 1H0; 4,14 (m, 1H); 4,04 (s, 2H); 3,25 (m, 2H);1,88 (m, 1H); 1,71 (m, 1H); 1,52 (m, 2H); 1,44 (m, 2H); ¹³C NMR (CD3OD, 125 MHz) δ 175,9; 171,7; 170,5; 158,4; 142,9; 135,1; 132,9; 130,9 (q, J=32,4 Hz); 129,5; 128,9; 128,5; 126,3; 125,7 (q, J=269,0 Hz); 66,5; 55,4; 44,1; 40,1; 32,3; 29,9; 24,2; IR (film) vmax 3318; 2935; 1713; 1644; 1538; 1326cm^-1; MALDLFTMS m/z 532,1672 (M+ Na⁺, C24H26F3N3O6 wymaga 532,1671).

P r z y k ł a d 15 (S)-6-[-[(2-((karboksymetylo)metoksy)acetamido]acetamido]-2-[(4-trifluorometylo)benzyloksykarbonylo]heksanian metylu (8)

Roztwór związku 3 (57 mg; 0,11 mmola) w CH2Cl2 (1 ml) traktowano 4 N HCl-dioksanem (2 ml) i mieszano przez godzinę w temperaturze 25°C. Rozpuszczalnik i nadmiar kwasu usuwano strumieniem N2, a osad rozpuszczano w DMF (1 ml) i traktowano kwasem diglikolowym (16 mg, 0,12 mmola), EDCI (23 mg; 0,12 mmola) oraz i-Pr2Net (42 1; 0,24 mmola) i mieszano w temperaturze 25°C. Po 4 godzinach mieszaninę reakcyjną przelano do rozdzielacza zawierającego EtOAc (50 ml) i płukano 10% wodnym HCl (3 x 30 ml) i nasyconym wodnym NaCl (30 ml), suszono (Na2SO4) i odparowano, uzyskując 45 mg (77%) kwasu monokarboksylowego - związku 8 w postaci białej substancji stałej: [a]_D ²⁵ -7,5 (c 1,8; CH3OH); ¹H NMR (CD3OD; 400 MHz) δ 7,65 (d, J=5,2 Hz; 2H); 7,54 (d, J=5,3 Hz; 2H); 5,18 (d, J=9,0 Hz; 1H) ; 5,15 (d, J=9,0 Hz; 1H); 4,42 (s, 2H); 4,16 (m, 1H);4,11 (s, 2H); 3,87 (s, 2H); 3,70 (s, 3H); 3,20 (t, J=4,5 Hz; 2H); 1,81 (m, 1H); 1,68 (m, 1H); 1,53 (m, 2H); 1,39 (m, 2H); ¹³C NMR (CD3OD, 100 MHz) δ 174,5; 173,7; 172,5; 171,2; 158,2; 142,6; 130,9 (q, J=33,2 Hz); 128,2; 126,2; 125,4 (q, J=270,1 Hz); 71,3; 69,0; 66,5; 55,3; 52,7; 42,9; 39,9; 32,0; 29,7; 23,9; IR (film) vmax 3315; 2931; 1725; 1661; 1538; 1326 cm^-1; MALDIFTMS m/z 558, 1686 (M+ Na⁺, C22H23F3N3O9 wymaga 558, 1673).

P r z y k ł a d 16 (S)-2-(benzoiloamino)-6-(((tert-butyloksy)-karbonylo)amino)heksanian metylu (9)

Roztwór chlorowodorku estru metylowego N-:;-BOC-lizyny (5,05 g; 17 mmoli) w CH₂CI₂ (100 ml) traktowano chlorkiem benzoilu (2,0 ml; 17 mmola) oraz i-Pr2Net (5,9 ml; 34 mmole) i mieszano w temperaturze 25°C. Po godzinie mieszaninę reakcyjną przemyto 10% wodnym roztworem HCl (100 ml), suszono (Na2SO4) i odparowano uzyskując biały proszek, który krystalizowano z CH2Cl2-heksanów do uzyskania 4,8 g (78%) związku 9 w postaci białego krystalicznego ciała stałego o temperaturze topnienia 108-109°C; [a]_D ²⁵-13,2 (c 5,8); CH3OH); ¹H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8,72 (d, J=7,4 Hz; 1H); 7,89 (m, 2H); 7,55 (m, 1H); 7,48 (m, 2H); 6,88 (t, J=5,2 Hz; 1H); 4,42 (m, 1H); 3,64 (s, 3H); 2,93 (m, 2H); 1,81 (m, 2H); 1,41 (m, 4H); 1,37 (s, 9H); ¹³C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ 172,9; 166,7; 155,6; 133,8; 131,5; 128,3; 127,6; 77,4; 52,8; 51,9; 40,8; 30,2; 29,2; 28,3; 23,2; IR (film) vmax 3335; 2933; 1740; 1690; 1647; 1534 cm^-1; MALDIFTMS (DHB) m/z 387,1895 (M⁺ Na⁺, C19H25N2O5 wymaga 387,1890).

P r z y k ł a d 17 (S)-2-(benzoiloamino)-6-[2-(((tert-butyloksy)karbonylo)amino]-acetamido)heksanian metylu (10)

Roztwór związku 9 (4,4 g; 12,1 mmola) w CH2CI2 (5,0 ml) traktowano 4 N HCl-dioksanem (10,0 ml) i mieszano przez 3 godziny w 25°C. Rozpuszczalnik i nadmiar kwasu usuwano pod zmniejszonym ciśnieniem, a osad rozpuszczono w DMF (150 ml) i traktowano N-((tert-butyloksy)karbonylo)glicyną (2,2 g; 12,1 mmola), PyBrOP (7,0 g; 15 mmoli), oraz i-Pr2NEt (8,4 ml, 48,4 mmola) i mieszano w temperaturze 25°C. Po 12 godzinach mieszaninę reakcyjną rozcieńczono EtOAc (500 ml) i płukano 10% wodnym roztworem HCl (3x250 ml), 5% wodnym roztworem Na2CO3 (250 ml) i nasyconym wodnym roz16

PL 205 134 B1 tworem NaCl (250 ml), suszono (Na2SO4) i odparowano. Po szybkiej chromatografii (SiO2, EtOAc) otrzymano 4,6 (90%) związku 10 w postaci bezbarwnego oleju: [a]D²⁵ -10,3 (c 0,30; CH₃OH); ¹H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7,84 (m, 2H); 7,51 (m, 1H); 7,44 (m, 2H); 6,91 (d, J=7,6 Hz; 1H); 6,35 (brt, J=5,3 Hz; 1H); 5,22 (m, 1H); 4,76 (m, 1H); 3,76 (s, 3H); 3,70 (brt, J=6,3 Hz; 4H); 3,26 (m, 2H); 1,95 (m, 1H); 1,84 (m, 1H); 1,57-1,30 (m, 4H); 1,41 (s, 9H); ¹³C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 173,0; 169,7; 167,3; 156,5; 133,7; 131,8; 128,6; 127,2; 81,8; 52,5; 52,3; 44,3; 38,7; 32,0; 28,9; 28,3; 22,4; IR (film) vmax 3318; 2954; 1718;

1647; 1535; 1491 cm^-1; MALDIFTMS m/z 444, 2108 (M+ Na⁺, C21H31N3O6 wymaga 444,2110).

P r z y k ł a d 18

N,N'-bis[N-(-5-(S)-((benzoilo)amino)-5-(metoksykarbonylo)pentylo)-karboksamidometylo]benzeno-1,3-dikarboksamid (11)

Roztwór związku 10 (4,4 g; 10,4 mmola) w CH2Cl2 (3 ml) traktowano 4,0 N dioksanem-HCl (20 ml) i mieszano przez godzinę w temperaturze 25°C. Rozpuszczalnik i nadmiar kwasu usuwano pod zmniejszonym ciśnieniem, a osad rozpuszczono w CH2Cl2 (50 ml) i traktowano Et2N (5,8 ml; 42 mmole) dichlorkiem izoftaloilu (1,06 g; 5,2 mmola), i mieszano w 25°C. Po 16 godzinach mieszaninę reakcyjną przemyto 10% wodnym roztworem HCl (50 ml) i odparowano, aż do uzyskania do żółtego oleju. Po szybkiej chromatografii (SiO2, 5:5:2 EtOAc/-CH2Cl2/MeOH) uzyskano 2,5 g (62%) związku 11 w postaci białej stałej piany: [a]D²⁵ -8,0 (c 4,8; CH3OH); ¹H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ 8,37 (s, 1H); 8,00 (m, 2H) 7,84 (m, 4H); 7,52 (m, 3H); 7,44 (m, 4H); 4,58 (m, 2W; 3,99 (two s, 4H); 3,72 (s, 6H); 3,22 (m, 4H); 1,99-1,83 (m, 4H); 1,59-1, 40 (m, 8H); ¹³C NMR (CD3OD, 100 MHz) δ 174,2; 171,5; 170,2; 169,0; 135,0; 134,8; 132,8; 131,5; 129,4; 128,4; 127,6; 54,3; 52,7; 44,2; 40,1; 31,7; 29,8; 24,3; IR (film) vmax 3304; 2950; 1738; 1650; 1644; 1538 cm^-1; MALDIFTMS m/z 795,3332 (M+ Na⁺, C40H45N6O10 wymaga 795,3330) .

P r z y k ł a d 19

N,N'-bis[N-(-5-(S)-((benzoilo)amino)-5-(karboksy)pentylo)-karboksamidometylo]benzeno-1,3-dikarboksamid (12)

Roztwór związku 11 (1,1 g; 1,4 mmola) w MeOH-THF (20 ml; 1:1) traktowano LiOH-H₂O (240 mg; 5,7 mmola) rozpuszczonego w H2O (10 ml) i mieszano przez 1 godzinę w temperaturze 0°C. Po godzinie rozpuszczalnik reakcyjny odparowano, a osad ponownie rozpuszczano w H2O (20 ml) i oziębiono do 0°C. Dodano stężonego roztworu wodnego HCl (0,47 ml; 5,7 mmola HCl) i wytrącony osad filtrowano i płukano wodą (50 ml) uzyskując 0,78 g (73%) związku 12 w postaci białego proszku: [a]_D ²⁵ 2,6 (c 0,35, CH3OH); ¹H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 8,38 (m, 1H); 8,02 (m, 2H); 7,84 (m, 4H); 7,557,48 (m, 3H); 7,42 (m, 4H); 4,56 (m, 2H); 4,00 i 3,99 (dwa s, 4H); 3,26 (m, 4H); 1,99-1,83 (m, 4H); 1, 63-1, 45 (m, 8H); 13C NMR (CD3OD, 100 MHz) δ 175,5; 171,9; 170,4; 169,2; 135,0; 134,9; 132,8; 131,7; 129,8; 129,5; 128,5; 127,7; 54,4; 44,0; 40,2; 31,7; 29,6; 24,3; IR (film) vmax 3280; 2923; 1718; 1641; 1536 cm^-1; MALDIFTMS (DHB) m/z 767,3005 (M+ Na⁺, C38H44N6O10 wymaga 767,3017).

Wyniki i dyskusja

Związek 1 przerywa zależną od RGD interakcję pomiędzy integryną a_ve₃ i MMP2. Ostatnio stwierdzono, że domena końca karboksylowego MMP2, podobna do hemopeksyny, może interferować z wiązaniem MMP2 do integryny a_ve₃ i ten sposób blokowania angiogenezy zachęcił nas do poszukiwania organicznych inhibitorów tej reakcji, które bardziej nadawałyby się do podawania w celach terapeutycznych. Celem identyfikacji specyficznych inhibitorów reakcji wiązania pomiędzy MMP2 a integryną a_ve₃, przeprowadzano testy w stałej fazie na wiązanie receptora z unieruchomioną integryną i biotynylowaną MMP2. Wiązanie czystej MMP2 okazało się całkowicie niezależne od RGD w tym układzie, co wykazano przez brak wpływu cRGDfV na wiązanie MMP2 z integryną a_ve₃, mimo, że ten peptyd hamuje interakcję a_ve₃ z jej ligandem macierzy zewnątrzkomórkowej, witronektyną (VN; Fig. 2A). Istotne jest, że wiązanie MMP2, ale nie VN, było całkowicie zniesione przez związek 1, co wykazuje specyficzność związku 1 wobec interakcji między MMP2 a a_ve₃. Ponadto, wiązanie między MMP2 a tkankowym inhibitorem metaloproteinazy 2 (TIMP2) nie było hamowane przez związek 1, co stanowi poparcie twierdzenia, że wpływ tego związku 1 jest ograniczony do interakcji wiązania między MMP2 i integryną a_ve₃ oraz wykazuje różnicę między miejscami wiązania dla domeny PEX MMP2 na TIMP2 i integrynie a_ve₃. Ważną obserwacją jest fakt, że ani związek kontrolny ani kontrolny peptyd cRADfV nie wpływają na wiązanie MMP2 z integryną a_ve₃ (Fig.2A).

Związek 1 przyłącza się bezpośrednio do integryny a_ve₃, ale nie do MMP2. Dla określenia dalszego mechanizmu działania związku 1, przeprowadzono dalsze badania w stałej fazie nad wiązaniem receptora z zastosowaniem unieruchomionej a_ve₃ i znakowanego [¹⁴C] związku 1 lub biotynyPL 205 134 B1 lownej VN jako kontroli. Jak widać na Figurze 2B, związek 1 wiąże się bezpośrednio z integryną α_νβ₃ w teście na wiązanie receptora w fazie stałej. Ta intereakcja była zależna od dawki, nasycająca i specyficzna, wykazując minimalną interakcję pomiędzy związkiem 1 a niespokrewnioną, kontrolną integryną α5β1 (Fig. 2B). Rzeczywiście, przy wysokich stężeniach związku, zauważono nieistotne wiązanie z integryną α5β1 (dane nie przedstawione). Dodatkowo, nie zaobserwowano wiązania związku 1, gdy studzienki płytki mikrotitracyjnej pokryto MMP2 (dane nie przedstawione) sugerując, że efekt obserwowany w teście wiązania MMP2/integryna α_νβ₃, jest spowodowany wiązaniem się związku 1 z integryną α_νβ₃. Istotne jest, że reakcja ta była hamowana przez 25-krotny nadmiar molowy nieznakowanego związku 1, a nie przez odpowiedni związek kontrolny 12 (Fig. 2C). Ponadto, związek 1 wiąże się z integryną α_νβ₃ w sposób niezależny od RGD, co zademonstrowano przez niezdolność peptydu cRGDfV do hamowania reakcji znakowanego znacznikiem radioaktywnym związku 1 z integryną α_νβ₃, nawet jeśli cRGDfV całkowicie blokuje reakcję wiązania bVN do unieruchomionej integryny w tym samym układzie (Fig. 2D). Peptyd cRADfV został wybrany jako kontrola ze względu na swoją specyficzność w hamowaniu wiązania. Zatem, związek 1 wiążąc się z integryną α_νβ₃ wykazuje porównywalną do MMP2 specyficzność, selektywność i brak podatności na hamowanie przez RGD.

Interesujące, że związek 6 o wzorze (III), był nieco mniej aktywny niż związek 1 w teście wiązania w fazie stałej, podczas gdy związek 8 pozbawiony grupy fenylowej sprzężonej z jednostką glicyny był nieaktywny. Ten wynik wykazuje, że pierścień fenylowy jest najistotniejszą cechą związków o wzorze (III) i (IV), jeśli chodzi o ich zdolność do hamowania i ponadto wykazuje, że obecność przynajmniej jednej podstawionej jednostki glicylolizyny jest niezbędna dla aktywności antyangiogennej tej klasy inhibitorów.

Komórkowa degradacja kolagenu typu IV poprzez MMP2 jest blokowana przez związek 1. Zapobieganie wiązaniu MMP2 z integryną α_νβ₃ na komórkach czerniaka w celu zahamowania komórkowej, zależnej od α_νβ₃ degradacji kolagenu typu IV zostało wykazane uprzednio. Zatem, zbadano czy komórki czerniaka, wyrażające lub niewyrażające α_νβ₃, mogą wykorzystywać aktywowaną MMP2 do degradacji unieruchomionego, [³H] kolagenu. Istotne jest, że żadna z tych komórek nie wytwarza endogennie wykrywalnych ilości MMP2. O ile oba rodzaje komórek były zdolne do pewnej podstawowej degradacji kolagenu, tylko komórki CS-1 transfekowane β3 były zdolne do wykorzystywania egzogennej MMP2, demonstrując istotne zwiększenie uwalniania radioaktywnego substratu do podłoża po preinkubacji z oczyszczoną MMP2 (Fig. 3A). Ta zwiększona degradacja substratu po traktowaniu MMP2 była specyficznie hamowana przez dodanie związku 1, podczas gdy związek 12 nie wykazywał istotnego działania. Istotne jest, że wpływ związku 1 na komórkową degradacje kolagenu nie był spowodowany bezpośrednim hamowaniem aktywności MMP2, ponieważ oczyszczona MMP2, przy nieobecności komórek, była nadal zdolna do degradacji unieruchomionego [³H]kolagenu IV, niezależnie od obecności związku 1 lub 12. Aby wykazać, że obniżenie komórkowej degradacji kolagenu na Fig. 3A było wynikiem hamowania interakcji MMP2 z integryna α_νβ₃ na powierzchni komórek przez związek 1, komórki CS-1 i ich odpowiedniki zawierające α_νβ₃ badano w teście wiązania biotynylowanej MMP2. Jak należało się spodziewać, komórki β₃-negatywne CS-1 były zdolne do wiązania pewnych ilości MMP2, jakkolwiek ich zdolność nie była zmniejszona przez obecność któregoś z dwóch związków (Fig. 3B). Przeciwnie, komórki β₃CS-1 wiązały istotnie większe ilości MMP2 i ich zwiększone wiązanie MMP2 było specyficznie hamowane przez związek 1. Rzeczywiście, gdy zmodyfikowany do wprowadzenia na ścieżki elektroforetyczne, jak wykazano znakując przeciwciałami mAb przeciwko aktynie związek 1 skutecznie redukował wiązanie MMP2 z komórkami β₃CS-1 do poziomu obserwowanego przy braku α_νβ₃ (np.: rodzicielskie komórki CS-1) (Fig. 3B, ścieżka 2).

Związek 1 przerywa angiogenezę in vivo, nie hamując aktywacji MMP2. Pierwotnie ujawniono w modelach zwierzęcych hamowanie interakcji MMP2/α_vβ₃ przez podanie egzogennej, rekombinowanej domeny PEX MMP2. Dlatego, zbadaliśmy wpływ związku 1 na zaindukowaną czynnikiem wzrostowym angiogenezę w CAM 10-dniowego zarodka kurzego. Podanie związku 1 do CAMu, stymulowanego czynnikiem wzrostu fibroblastów zasadochłonnych (bFGF) zniosło prawie całkowicie rozwój nowych naczyń krwionośnych w odpowiedzi na ten bodziec (Fig. 4A i 4B), tymczasem kontrolny związek 12 był nieskuteczny w tym teście. Istotne jest, że zniesienie nacieku naczyniowego w odpowiedzi na związek 1 nie było związane z hamowaniem aktywacji MMP, ponieważ podobne poziomy aktywnego MMP2 (62 kDa) zostały wykryte w tkankach CAM zarodków traktowanych i nietraktowanych związkiem 1 (Fig.4C). To stanowi całkowity kontrast w stosunku do wpływu egzogennej domeny PEX MMP2, która układowo blokuje aktywację MMP2. Te dane są zgodne z założeniem, że związek 1 specyficznie przeszkadzają w wiązaniu MMP2 z integryną α_νβ₃, nie wpływając bezpośrednio na akty18

PL 205 134 B1 wację MMP2. Rzeczywiście, ogólne poziomy MMP2 obserwowane w lizatach CAMów były niezaburzone przez traktowanie związkiem 1, co wyklucza potencjalny wpływ na ekspresję MMP2 w tkankach tworzących naczynia (Fig.4C). Te wyniki sugerują, że działanie związku 1 przeciwko angiogenezie wynika z hamowania przez związek 1 wiązania MMP2 z integryną α_νβ₃ na powierzchni komórki, jak przedstawiono na Fig. 3B. Te dane wskazują dodatkowo, że MMP2, która jest w pełni aktywna, nie jest wykorzystywana do angiogenezy w tym układzie, dopóki nie zostanie związana z integryną ανβ3 na powierzchni komórki. Związek 1 znosi wzrost guza in vivo. W wielu układach wykazano, że przerwanie angiogenezy hamuje wzrost guza. Na tej podstawie można twierdzić, że zablokowanie właściwości inwazyjnych komórek śródbłonka przez hamowanie MMP2 tłumi angiogenezę i wzrost guza w modelach zwierzęcych. Rzeczywiście, okazało się, że kilka inhibitorów MMP2 jest obiecującymi czynnikami przeciwangiogennymi dla ludzi. Z tego powodu, oceniliśmy, czy hamowanie angiogenezy związane z zablokowaniem interakcji MMP2/a_ve₃, zaobserwowane w tym badaniu, może być wystarczające do tłumienia wzrostu ανβ3 ujemnych nowotworów. Wykorzystanie nowotworu nieposiadającego α_νβ₃ pozwoliło na ocenę wpływu związku 1 na naczyniową α_νβ₃ selektywność. Jak to pokazano na Fig. 5A, wzrost komórek czerniaka CS-1, ujemnych pod względem α_νβ₃, przeniesionych na tkankę CAM był istotnie ograniczony przez pojedynczą iniekcję dożylną (IV) związku 1, w odniesieniu do ciężaru guzów (Fig. 5B). Prawdopodobnie, ten efekt nie był spowodowany bezpośrednim wpływem związku 1 na guz, ponieważ zastosowane w tym badaniu komórki czerniaka nie zawierały ανβ3. W rzeczywistości, wzrost tych komórek in vitro nie jest zaburzony przez wspólną hodowlę ze związkiem (dane nieujawnione). Największą redukcję powierzchniowego unaczynienia (Fig. 5A) jak też ogólnej gęstości naczyń wykazano w guzach traktowanych związkiem 1. Istotne jest, że tej redukcji unaczynienia guza towarzyszył istotny wzrost śmierci komórek w masie guza, gdy tymczasem kontrolne guzy wykazywały nawet 6-krotny wzrost masy podczas 10-dniowego badania.

Powyższy opis i przykłady ilustrują, ale nie ograniczają niniejszego wynalazku. Nadal istnieje możliwość innych wariantów w zakresie niniejszego wynalazku, które specjaliści łatwo mogą przedstawić.

Claims (11)

1. Pochodna glicylolizyny o wzorze (I):

2. Pochodna glicylolizyny o wzorze (II):

PL 205 134 B1

3. Pochodna glicylolizyny o wzorze (III) ο

ο

4. Pochodna glicylolizyny o wzorze (IV) .Η

Ο

5. Preparat farmaceutyczny zawierają cy substancję czynną i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, znamienny tym, że zawiera jako substancję czynną związek o wzorze (I), (II), (III) lub (IV).

6. Zastosowanie związku o wzorze (I), (II), (III) lub (IV) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania wzrostu nowotworu u gospodarza.

7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, ż e kompozycja farmaceutyczna jest do podawania wewnątrztrzewnowego, podskórnego, dożylnego, przezskórnego, wewnątrzmaziówkowego, domięśniowego lub doustnego.

8. Zastosowanie związku o wzorze (I), (II), (III) lub (IV) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania angiogenezy w tkance nowotworowej.

9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, ż e kompozycja farmaceutyczna jest do podawania wewnątrztrzewnowego, podskórnego, dożylnego, przezskórnego, wewnątrzmaziówkowego, domięśniowego lub doustnego.

10. Zastosowanie związku o wzorze (I), (II), (III) lub (IV) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do indukowania apoptozy w komórce nowotworowej.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest do podawania wewnątrzotrzewnowego, podskórnego, dożylnego, przezskórnego, wewnątrzmaziówkowego, domięśniowego lub doustnego.