KR20020084258A - 신혈관 생성 및 종양 성장의 억제 방법 - Google Patents

신혈관 생성 및 종양 성장의 억제 방법 Download PDF

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Abstract

신혈관 생성, 종양 성장, 및 인테그린(integrin) αvβ3와의 메탈로프로테인아제 2(MMP2)와의 상호작용이 화학식 I의 억제제 화합물에 의해 억제된다.
화학식 I
상기식에서,
G1및 G2는 각각 독립적으로 -NH-C(O)-0-R1, -NH-C(O)-O-(CH2)V-(C6H4)-X3, -NH-C(O)-NH-(CH2)V-(C6H4)-X3, -O-C(O)-NH-(CH2)V-(C6H4)-X3, -O-C(O)-0-(CH2)V-(C6H4)-X3또는 -NH-C(O)-CH2-(C6H4)-X3이고,
Y1및 Y2는 각각 독립적으로 -OH, C1-C4알킬, C1-C4하이드록시알킬, C1-C4알콕시, 페닐, 벤질 또는 NH2이며,
R1은 C1-C4알킬이고,
X1및 X2는 각각 독립적으로 할로 또는 C1-C4알콕시이며,
X3은 할로, 니트로, C1-C4알킬, C1-C4알콕시 또는 C1-C4퍼플루오로알킬이고,
Z는 -C≡C-, -C6H4-, 시스-CH=CH-, 트랜스-CH=CH-, 시스-CH2-CH=CH-CH2-, 트랜스-CH2-CH=CH-CH2-, 1,4-나프틸, 시스-1,3-사이클로헥실, 트랜스-1,3-사이클로헥실, 시스-1,4-사이클로헥실 또는 트랜스-1,4-사이클로헥실이며,
A는 H 또는 공유 결합이고,
m 및 n은 각각 독립적으로 0 또는 1의 값인 정수이며,
t는 0 또는 1의 값인 정수이고,
p, r 및 v는 각각 독립적으로 1 또는 2의 값인 정수이며,
단, A가 H인 경우, t는 0이고; A가 공유 결합인 경우, t는 1이며; m이 0인 경우, Y1은 C1-C4하이드록시알킬이고; n이 0인 경우, Y2는 C1-C4하이드록시알킬이다.

Description

신혈관 생성 및 종양 성장의 억제 방법{Methods for inhibiting angiogenesis and tumor growth}
혈관 세포가 조직내로 침입하기 위해서는, 세포외 매트릭스 구조뿐만 아니라 이러한 일시적인 매트릭스를 인지하는 세포 접착 분자를 재형성하는 프로테인아제를 포함한 다수의 인자들의 협력된 상호작용이 필요하다. 최근에는 72kDa의 매트릭스 메탈로프로테인아제 2(MMP2)가 혈관 발생 및 신혈관 생성에 있어 중요한 역할을 한다는 것이 보고되었다. 예를 들면, 키토 등[참조: Kitoh et al., J. Cell Sci., 109, 953-8(1996)]은 MMP2 및 이의 활성자 막 유형 1-매트릭스 메탈로프로테인아제(MT1-MMP)가 배아 발생중에 거의 배타적으로 간엽세포에 의해서 협력적으로 발현된다고 보고하였는데, 이는 이러한 조직내에 특별한 매트릭스 재형성 제약이 있음을 암시한다. 또한, 신혈관 생성 및 상응하는 종양 성장은 MMP2녹아웃(knockout) 마우스에서 감소된다[참조: Itoh et al., Cancer Res., 58 1048-51(1998)]. 흥미롭게로, 사프터 등[참조: Saftor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 1557-61(1992)]은 그 자체가 혈관 형성의 공지된 매개체인 인테그린 αvβ3의 결합이 MMP2의 생성을 유도한다고 발표하였는데, 이는 신혈관 생성과 연관된 혈관 재형성 동안에 이러한 두가지 분자가 협력하여 상호작용한다는 것을 제시한다[참조: Bafetti et al., J. Biol. Chem., 273, 143-9(1998)]. 실제로, MMP2와 인테그린 αvβ3사이의 직접적인 상호작용은 브룩스 등[참조: Brooks et al., Cell, 85, 683-93(1996)]에 의해서 증명되었다. 브룩스 등은 혈관 침입 및 성숙 동안에 MMP2의 음성적인 조절이 αvβ3의 발현에 의존한다는 것을 이후에 밝혀내었다[참조: Cell, 92, 391-400(1998)].
MMP2를 포함한 MMP의 천연 및 합성 억제제에 의해 신혈관 생성 및 이와 공존하는 종양 성장이 억제된다는 것이 밝혀졌지만, 일차적으로는 방대한 범위의 억제제의 유해한 부작용으로 인해 이러한 전략을 임상적인 양식으로 전환시키는데는 제한이 있다. 일반적으로 성인에 있는 많은 생물학적 과정에 MMP 작용이 필요하기 때문에, 효소적 작용의 활성 부위 억제는 조직 재형성(예: 상처 치료)을 포함한 다양한 생물학적 과정에 보다 많은 영향을 미칠 수 있다. 실제로, 여러 종류의 암의 임상 연구에 있어서, 방대한 범위의 MMP 억제제를 사용한 치료는, 용량을 제한하고 치료 중단 후에도 종종 지속되는 염증성 건염, 다발성 관절염 및 뮤스코스켈렉탈 통증 증후군(muscoskeletal pain syndrome)을 포함한 심한 부작용을 유발한다. 그러나, 성인의 인테그린 αvβ3의 분포는 제한되어 있어서, 혈관신생 또는 세포 침입 영역에 대한 MMP2와 αvβ3사이의 상호작용을 표적으로 하여 상기한 치료 관련 독성의 영향을 상응하게 제한해야함을 예상할 수 있을 것이다. 실제로, 인테그린 αvβ3에 대한 MMP2 결합을 매개하는 MMP2의 재조합 비촉매성 카복시 말단 헤모펙신 도메인(PEX)은 생체내 항신혈관 생성 및 항암 활성을 나타낸다. 수반되는 단점들(예: 대량 생산 문제, FDA 품질 및 안전성 통제 문제 및 항원성)과 함께 이러한 거대 단백질 단편의 잠재적 유용성은 상기한 문제에 대한 보다 실용적인 해법을 요구한다.
따라서, 체내의 다른 지역에서 MMP의 미세한 억제를 갖는 종양 성장 위치에 MMP 활성을 선택적으로 억제하는 화학적 화합물을 사용하여 신혈관 생성 및 종양 성장을 억제하는 방법이 필요하다. 또한, 특히 인테그린 αvβ3의 MMP2 결합 위치에 결합시키는 방법이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 인테그린 αvβ3과 MMP2와의 상호작용의 억제방법 및 인테그린 αvβ3을 포함하는 세포에서 신혈관 생성의 억제 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 MMP2-αvβ3의 상호작용 억제제를 투여하여 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 하기의 화학식 I에 나타낸 활성 억제제 화합물은 바꾸어 말하면, 세포 상에서 αvβ3에 대한 MMP2의 결합을 억제하는 인테그린 αvβ3과 접촉한다. 본 발명의 방법에 의한 αvβ3에 MMPS의 결합의 억제는 신혈관 생성을 억제하여 종양 성장을 억제하는 결과를 가져온다. 또한, αvβ3은 염증에 관련되어 있고, 따라서 본 발명의 방법에 따라 사용된 화학식 I의 화합물은 또한 염증성 이벤트(event)를 억제할 수 있다.
상기식에서,
G1및 G2는 각각 독립적으로 -NH-C(O)-0-R1, -NH-C(O)-O-(CH2)V-(C6H4)-X3, -NH-C(O)-NH-(CH2)V-(C6H4)-X3, -O-C(O)-NH-(CH2)V-(C6H4)-X3, -O-C(O)-0-(CH2)V-(C6H4)-X3또는 -NH-C(O)-CH2-(C6H4)-X3이고,
Y1및 Y2는 각각 독립적으로 -OH, C1-C4알킬, C1-C4하이드록시알킬, C1-C4알콕시, 페닐, 벤질 또는 NH2이며,
R1은 C1-C4알킬이고,
X1및 X2는 각각 독립적으로 할로 또는 C1-C4알콕시이며,
X3은 할로, 니트로, C1-C4알킬, C1-C4알콕시 또는 C1-C4퍼플루오로알킬이고,
Z는 -C≡C-, -C6H4-, 시스-CH=CH-, 트랜스-CH=CH-, 시스-CH2-CH=CH-CH2-, 트랜스-CH2-CH=CH-CH2-, 1,4-나프틸, 시스-1,3-사이클로헥실, 트랜스-1,3-사이클로헥실, 시스-1,4-사이클로헥실 또는 트랜스-1,4-사이클로헥실이며,
A는 H 또는 공유 결합이고,
m 및 n은 각각 독립적으로 0 또는 1의 값인 정수이며,
t는 0 또는 1의 값인 정수이고,
p, r 및 v는 각각 독립적으로 1 또는 2의 값인 정수이며,
단, A가 H인 경우, t는 0이고; A가 공유 결합인 경우, t는 1이며; m이 0인 경우, Y1은 C1-C4하이드록시알킬이고; n이 0인 경우, Y2는 C1-C4하이드록시알킬이다.
화학식 I의 범위 내에 바람직한 화합물을 화학식 II로 나타낸다.
상기식에서,
R2및 R3은 각각 독립적으로 H, C1-C4알킬, 페닐, 또는 벤질이고,
X1및 X2는 각각 독립적으로 할로 또는 C1-C4알콕시이며,
X4및 X5는 각각 독립적으로 할로, 니트로, C1-C4알콕시, C1-C4알킬 또는 C1-C4퍼플루오로알킬이고,
A는 H 또는 공유 결합이며.
p 및 r은 각각 독립적으로 1 또는 2의 값인 정수이고,
t는 0 또는 1의 값인 정수이며,
단, A가 H인 경우, t는 0이고; A가 공유 결합인 경우, t는 1이다.
A가 공유 결합이고 t가 1인 경우, 이미노디아세트아미드 유도체 잔기는 오르토(ortho), 메타(meta) 또는 파라(para) 위치로 벤젠 연결 그룹에 부착될 수 있다.
화학식 I 및 화학식 II의 화합물을 αvβ3을 포함한 세포와 접촉시키는 경우, αvβ3와 MMP2와의 결합이 억제되어 신혈관 생성에 필수적인 기전이 차단된다. 신혈관 생성 차단은 또한 종양의 혈관신생을 방지하여 종양이 양분을 섭취하지 못하도록 하여 종양 성장을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 신혈관 생성 및 종양 성장 억제 화합물은 종양 및 신혈관 생성 질환이 있는 환자 치료에 유용한 치료제이다. 본 발명의 화합물이 αvβ3에 결합하기 때문에, 이들 화합물은 염증 반응을 억제하는데도 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 적합한 약제학적으로 허용할 수 있는 매트릭스로 제형화될 수 있다. 활성 화합물의 약제학적 조성은 종양 환자에게 종양 성장을 감소시키거나 제거하기 위해 투여된다. 활성 화합물은 주사 또는 장시간에 걸친 점차적 주입에 의해 비경구 투여하거나, 특수한 투여 형태에 적합한 임의의 다른 방법에 의해 투여할 수 있다.
본 발명은 신혈관 생성 및 종양 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 선택적으로 인테그린(integrin) αvβ3에 결합하여 인테그린 αvβ3과 메탈로프로테인아제 2(metalloproteinase 2; MMP2)의 상호작용을 차단하는 화합물을 사용하는 신혈관 생성 및 종양 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다.
첨부한 도면에 있어서,
도 1은 인테그린 αvβ3과 MMP2의 상호작용 및 신혈관 생성에서 이의 역할을 나타낸 개략도이다.
도 2는 문헌[참조: Boger et al., Bioorg. Med. Chem, 6, 1347-1378(1998)]에 기재된 600 개의 화합물의 조합적 라이브러리(combinatorial library)의 구조적인 아단위 A, B 및 C를 나타낸다.
도 3은 MMP2와 비교하여 인테그린 αvβ3을 갖는 화합물의 60개의 조합적 혼합물의 결합을 도표로 나타낸다.
도 4는 인테그린 αvβ3과 혼합물 AxB10의 결합과 A6B10C4의 10개의 독립적인 결합을 나타낸다.
도 5는 A6B10C4의 유사체의 구조를 나타낸다.
도 6A는 MMP2와 비교하여 인테그린 αvβ3을 갖는 A6B10C4(화합물 1)의 유사체(화학식 2 - 26)의 결합을 도표로 나타낸다.
도 6B는 MMP2와 비교하여 인테그린 αvβ3을 갖는 화학식 9 및 화학식 19의 결합을 도표로 나타낸다.
도 7은 [14C]-표지 화합물 19가 특히 αvβ3에 결합하고, 비표지된 화합물 19의 25배의 과량에 의해 αvβ3으로부터 경쟁적으로 치환될 수 있으나, 과량의 화합물 9, RGD 펩타이드 또는 c(RGDfV) 펩타이드에 의해 치환될 수 없음을 나타낸다.
도 8은 화합물 19가 인테그린 αvβ3에 대한 MMP2의 결합을 차단하지만, 인테그린 αvβ3에 결합하는 비트로넥틴을 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.
도 9는 화합물 19가 직접적으로 순수한 활성 MMP2 단백질 분해를 억제하지 않는다는 것을 나타낸다.
인테그린 αvβ3에 대한 MMP2의 결합은 신혈관 생성 과정에서 중요한 기전이다. 이러한 결합 상호작용을 특이적으로 억제하면, 종양과 같은 성장 조직에서의 혈관신생이 감소되어 종양 성장이 지연된다. MMP2와 인테그린 αvβ3의 상호작용은 도 1에 도면으로 나타내었다. 새로운 부류의 신혈관 생성 및 종양 성장 억제제는 하기한 바와 같이 MMP2와의 경쟁에서 인테그린 αvβ3에 특이적으로 결합하므로 중요한 치료 수단이 될 수 있다.
본 발명의 특정 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 포함할 수 있으며 광학 활성형으로 존재할 수 있다. 추가의 비대칭 중심이 알킬 그룹과 같은 치환 그룹에 존재할 수 있다. 순수한 S-이성체 및 순수한 R-이성체, 이성체의 라세미 혼합물 및 이들의 혼합물이 본 발명의 범주내에 포함된다. 본 발명의 특정 화합물의 키랄형도 고려되며 특별하게 본 발명의 범주내에 포함된다.
용어 "알콕시"는 산소 원자가 에테르 결합에 의해 하기하는 바와 같은 일정 크기의 알킬 그룹에 연결되어 있음을 의미한다. 알콕시의 예로는 메톡시, 에톡시, t-부톡시 등이 있다. 용어 "알킬"은 일정 크기의 직쇄 또는 측쇄 탄소 라디칼을 의미한다. 알킬 라디칼의 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 2급-부틸, 이소부틸, t-부틸, 2-에틸헥실, n-옥틸, 2,4-디메틸펜틸 등이 있다. 용어 "하이드록시알킬"은 상기한 일정 크기의 알킬 그룹이 하이드록시 그룹에 연결되어 있음을 의미한다. 이의 예에는 하이드록시메틸, 2-하이드록시에틸, 3-하이드록시-1-프로필, 2-하이드록시-1-프로필, 4-하이드록시부틸 등이 있다.
용어 "퍼플루오로알킬"은 하기하는 바와 같이 일정 크기의 알킬 그룹 각각의 수소 위치에 플루오로 치환체가 있음을 의미하며, 이의 예로는 트리플루오로메틸 및 펜타플루오로에틸이 있다.
용어 "할로" 또는 "할로겐"은 브로모, 클로로, 플루오로 및 요오도를 의미한다.
본 발명의 방법에 유용한 화합물은 화학식 I로 나타내어지고, 연결 그룹에 화학적으로 부착된 이미노디아세트아미드 유도체를 포함한다.
화학식 I
상기식에서,
G1및 G2는 각각 독립적으로 -NH-C(O)-0-R1, -NH-C(O)-O-(CH2)V-(C6H4)-X3, -NH-C(O)-NH-(CH2)V-(C6H4)-X3, -O-C(O)-NH-(CH2)V-(C6H4)-X3, -O-C(O)-0-(CH2)V-(C6H4)-X3또는 -NH-C(O)-CH2-(C6H4)-X3이고,
Y1및 Y2는 각각 독립적으로 -OH, C1-C4알킬, C1-C4하이드록시알킬, C1-C4알콕시, 페닐, 벤질 또는 NH2이며,
R1은 C1-C4알킬이고,
X1및 X2는 각각 독립적으로 할로 또는 C1-C4알콕시이며,
X3은 할로, 니트로, C1-C4알킬, C1-C4알콕시 또는 C1-C4퍼플루오로알킬이고,
Z는 -C≡C-, -C6H4-, 시스-CH=CH-, 트랜스-CH=CH-, 시스-CH2-CH=CH-CH2-, 트랜스-CH2-CH=CH-CH2-, 1,4-나프틸, 시스-1,3-사이클로헥실, 트랜스-1,3-사이클로헥실, 시스-1,4-사이클로헥실 또는 트랜스-1,4-사이클로헥실이며,
A는 H 또는 공유 결합이고,
m 및 n은 각각 독립적으로 0 또는 1의 값인 정수이며,
t는 0 또는 1의 값인 정수이고,
p, r 및 v는 각각 독립적으로 1 또는 2의 값인 정수이며,
단, A가 H인 경우, t는 0이고; A가 공유 결합인 경우, t는 1이며; m이 0인경우, Y1은 C1-C4하이드록시알킬이고; n이 0인 경우, Y2는 C1-C4하이드록시알킬이다.
화학식 I의 범위 내에 바람직한 화합물은 화학식 II로 나타내어지고, 오르토, 메타 또는 파라 중의 하나의 위치로 벤젠 연결 그룹에 부착된 이미노디아세트아미드 유도체를 포함한다.
화학식 II
상기식에서,
R2및 R3은 각각 독립적으로 H, C1-C4알킬, 페닐, 또는 벤질이고,
X1및 X2는 각각 독립적으로 할로 또는 C1-C4알콕시이며,
X4및 X5는 각각 독립적으로 할로, 니트로, C1-C4알콕시, C1-C4알킬 또는 C1-C4퍼플루오로알킬이고,
A는 H 또는 공유 결합이며.
p 및 r은 각각 독립적으로 1 또는 2의 값인 정수이고,
t는 0 또는 1의 값인 정수이며,
단, A가 H인 경우, t는 0이고; A가 공유 결합인 경우, t는 1이다.
바람직하게는, 치환체 X1및 X2는 CH2그룹에 비하여 페닐링의 4- 위치에 부착된다(즉, 파라 치환체). 바람직하게는, X1및 X2중의 하나 이상이 플루오로이고, 가장 바람직하게는, X1및 X2는 둘 다 파라-플루오로이다. 바람직하게는, r 및 p는 2이다. X4및 X5는 C1내지 C4퍼플루오로알킬이 바람직하고, 가장 바람직하게는, 파라-트리플루오로메틸이다. 바람직한 R2및 R3그룹은 수소 및 메틸이다. 치환체 X2및 X3은 동일하거나 상이할 수 있고, 또한 치환체 R2및 R3은 동일하거나 상이할 수 있다.
화학식 I 및 화학식 II의 화합물은 본원에 참조 문헌으로 인용된 문헌[참조: Boger et al., Bioorg. Med. Chem, 6, 1347-1378(1998)]의 합성 방법에 따라 상세하게 기재되어 있다.
화학식 II를 나타내는 화합물 집합의 특히 활성 구성원은, A가 공유 결합이고 t는 1인 경우, 하기 반응식 1의 화합물 19이다.
화합물 19의 합성은 보거 등(Boger et al.)에 의해 기재된 화학식 I 및 화학식 II를 제조하는 일반적인 방법으로 예시된다. 화합물 19는 시판되는 N- ε-BOC-L-라이신 메틸 에스테르를 사용하여 출발하는 세 단계로 합성하였다. 카르바메이트는, 4-(트리플루오로메틸)벤질 알콜을 N,N-디석신이미딜 카보네이트와 함께 반응시키고, 중간 화합물 27을 제공하는 α-아미노 그룹과 함께 활성화된 생성물에 후속적으로 가하여 99%의 수율을 획득하였다. 이어서, 이 라이신 유도체는 N-BOC 보호기 제거(deprotection)(HCl)가 일어나고, 브로모 트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스포네이트(PyBrOP, 74%)를 사용하여, 디아미드 화합물 29를 제공하는 이미노디아세트산 모노아미드 화합물 28의 유리 카복실산 관능기에 커플링(coupling)시켰다. N-BOC 보호기 제거(HCl) 후에, 이를 이소프탈로일 디클로라이드와 함께 반응시켜 이량체화하고 합성을 완료하고 수율이 60%인 화합물 19를 수득하였다. 방사성 동위 원소를 미량 혼입하여 두 개의 메틸 에스테르(LiOH, 95%)를 사포닌화하여 디카복실산 화합물 30을 생성하고, 이어서 1-(3-(디메틸아미노)프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDCI)와 촉매적 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)에 의해 매개된 [14C]-메탄올을 에스테르화하여 수율이 35%인 [14C]-화합물 1을 회득하였다.
화학식 I 및 화학식 II의 화합물의 약제학적 제제는 약제학적으로 허용할 수 있는 담체 매트릭스 내에 이 화합물을 제형화하여 제조될 수 있다. 화학식 I 및 화학식 II의 활성 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 종양에 걸린 숙주에 투여되어 종양 성장을 감소하거나 억제한다. 활성 화합물은 주사에 의해 또는 장시간에 걸친 점차적 주입에 의해 비경구 투여할 수 있다. 처리된 조직은 매우 빈번하게 복강내 또는 피하 투여로 처리되지만, 또한 이 활성 화합물은 안내, 정맥내, 근육내, 활막내, 관강내 또는 경피로 투여될 수 있고, 또한 연동 수단으로 전달될 수 있다.
본원에서 본 발명의 화합물 또는 조성물의 "투여"는, 통상의 비독성인 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 및 경우에 따라 비히클(vehicle)을 포함하는 용량형 단위 제형으로서 경구, 또는 흡입 스프레이, 비강, 직장 또는 협측 경로에 의한 비경구, 또는 국소적으로 전신계에 사용함을 의미한다. 본원에서 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피 및 관절내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
"약제학적으로 허용되는"은, 예기치못한 독성, 자극, 알레르기 반응 등을 일으키지 않으면서 의학적으로 합당하게 판단되는 범위내에서 사람 및 하등 동물의 조직과 접촉시켜 사용하기에 적합하며, 종양 및 신혈관 생성 관련 질환의 치료에 사용하는 경우 효과적이고 합리적인 이익/손해 비가 균형을 이루는 염, 아미드 및 에스테르 등을 의미한다.
약제학적으로 허용되는 염은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들면, 다음 문헌에는 약제학적으로 허용되는 염이 상세하게 기술되어 있다[참조: S. M Berge, et al., J. Pharmaceutical Sciences, 66, 1-19 (1977)]. 대표적인 산 부가염에는 염산염, 브롬화수소염, 황산염, 황산수소염, 아세테이트, 옥살레이트, 발레레이트, 올레에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 보레이트, 벤조에이트, 락테이트, 인산염, 톨루엔설포네이트, 메탄설포네이트, 시트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 아스코르베이트, 글루코헵토네이트, 락토바이오네이트, 라우릴 설페이트 염 등이 포함된다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염에는 나트륨 염, 칼슘 염, 칼륨 염, 마그네슘 염 등이 포함된다.
본원에서 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 비독성의 불활성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 임의 유형의 제형 보조제를 의미한다. 약제학적으로 허용되는 담체로서 작용할 수 있는 물질의 몇몇 예에는 당, 예를 들면 락토스, 글루코스 및 슈크로스; 전분, 예를 들면 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예를 들면 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 탈크; 부형제, 예를 들면 코코아 버터, 및 좌제 왁스; 오일, 예를 들면 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유, 대두유; 글리콜, 예를 들면 폴리프로필렌 글리콜; 폴리올, 예를 들면 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예를 들면 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충제, 예를 들면 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 발열성 물질 제거 증류수; 등장성 염수; 링거액(Ringer's solution); 에틸 알콜 및 인산염 완충액뿐만 아니라 약제학적 제형에 사용하기에 적합한 다른 비독성 물질을 의미한다.
제형자의 판단에 따라, 습윤제, 유화제 및 윤활제(예: 나트륨 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트)뿐만 아니라 발색제, 방출제, 피복제, 감미제, 향미제, 방향제, 방부제 및 산화방지제를 본 조성물에 사용할 수도 있다. 약제학적으로 허용되는 산화방지제의 예에는, 수용성 산화방지제, 예를 들면, 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 아황산수소나트륨, 메타아황산수소나트륨, 아황산나트륨 등; 유용성 산화방지제, 예를 들면, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 금속 킬레이트제, 예를 들면, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등이 포함된다.
본 발명의 제제 또는 화합물의 "치료학적 유효량"은 어떠한 의학적 치료에 적용할 수 있는 합리적인 이익/손해 비로 종양 및 신혈관 생성 관련 질환을 치료하기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. 그러나, 본 발명의 화합물 및 조성물의 1일 총 용량은 적절한 의학적 판단 범위내에서 담당 의사의 판단에 따라 결정됨을 이해할 것이다. 특정 환자에게 있어 특별한 치료학적 유효량 수준은 치료할 질환 및 질환의 중증도; 사용되는 특이적 화합물의 활성; 사용되는 특이적 조성물; 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별 및 섭생; 사용되는 특이적 화합물의 투여 기간, 투여 경로 및 배출율; 치료 기간; 사용되는 특이적 화합물과 혼합되어 사용하거나 동시에 사용하는 약물; 및 의학 분야에서 익히 공지된 인자들을 포함한 다양한 인자에 따라 좌우된다.
또한 본 발명은, 통상의 약제학적 담체와 혼합되는 본 발명의 화합물(또는 화합물들)의 치료학적 유효량을 포함한 단위 용량형으로 약제학적 조성물을 제공한다. 주사제, 예를 들면 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁제는 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 당해 분야 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다. 멸균 주사제는 1,3-부탄디올중 용액과 같이 비독성의 비경구적으로 허용되는 담체 또는 용매중 멸균 주사액, 현탁액 또는 에멀젼일 수도 있다. 사용가능한 허용되는 비히클 및 용매중에서는 물, 링거액, U.S.P. 및 등장성 염화나트륨 수용액이 있다. 또한, 멸균 경화유를 용매 또는 현택 매질로서 통상 사용한다. 이러한 목적으로합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함한 임의의 블랜드 경화유를 사용할 수 있다.
또한 올레산과 같은 지방산을 주사용 제제에 사용한다. 주사용 제형은, 예를 들면 세균 보유 필터를 통해 여과시키거나, 사용 직전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사용 매질중에 용해시키거나 분산시킬 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태인 멸균제를 혼입시켜 멸균시킬 수 있다.
약물의 효과를 지속시키기 위해, 피하 또는 근육내 주사로부터 약물의 흡수를 지연시키는 것이 바람직하다. 이를 수행하는 가장 일반적인 방법은 수용성이 불량한 결정 또는 비결정 물질의 현탁액을 주사하는 것이다. 약물의 흡수율은 약물의 용해률, 바꾸어 말하면 약물의 물리적인 상태(예: 결정 크기 및 결정형)에 따라 좌우된다. 약물의 흡수를 지연시키는 또다른 방법은 오일중 용액 또는 현탁액으로 약물을 투여하는 것이다. 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생분해성 중합체 및 약물의 미세캡슐 매트릭스를 형성시켜 주사 데포(depot)형을 제조할 수도 있다. 중합체에 대한 약물의 비율 및 중합체의 조성에 따라, 약물 방출률을 조절할 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예에는 폴리-오르토에스테르 및 폴리무수물이 포함된다. 데포 주사제는 신체 조직에 적합한 미세에멀젼 또는 리포좀 내에 약물을 포집시켜 제조할 수도 있다.
약물의 직장 투여용 좌제는 약물을, 통상의 온도에서는 고체이나 직장 온도에서는 액체여서 직장에서 용융되어 약물을 방출하는 적합한 비자극성 부형제(예: 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜)와 혼합하여 제조할 수 있다.
경구 투여용 고체 용량형에는 캡슐제, 정제, 환제, 산제, 프릴(prill) 및 과립제가 포함될 수 있다. 이러한 고체 용량형에서는 활성 화합물을 하나 이상의 불활성 희석제(예: 슈크로스, 락토스 또는 전분)와 혼합할 수 있다. 또한 이러한 용량형은 일반적으로 불활성 희석제 이외의 첨가 물질, 예를 들면 정제화 윤활제 및 다른 정제화 보조제(예: 마그네슘 스테아레이트 및 미세결정성 셀룰로스)를 포함할 수도 있다. 캡슐제, 정제 및 환제의 경우, 용량형은 완충제를 포함할 수도 있다. 정제 및 환제는 추가로 장용 피복 및 다른 방출 조절 피복을 사용하여 제조할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물은 연질 및 경질 충전 젤라틴 캡슐 중에 충전제로서 락토즈 또는 유당과 같은 부형제 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용하여 제조할 수 있다.
경구 투여용 액체 용량형에는 물과 같이 당해 분야에서 통상 사용되는 불활성 희석제를 포함하는, 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 미세에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽(syrup) 및 일릭서(elixir)가 포함될 수 있다. 이러한 조성물은 보조제, 예를 들면 습윤제; 유화제 및 현탁제; 감미제, 향미제 및 방향제를 포함할 수도 있다. 경우에 따라, 본 발명의 화합물은 서방성 또는 표적 전달 시스템(예: 중합체 매트릭스, 리포좀 및 미세구)으로 혼입시킬 수 있다. 이들은, 예를 들면 세균 보유 필터를 통해 여과시키거나, 사용 직전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사용 매질중에 용해시킬 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태인 멸균제를 혼입시켜 멸균시킬 수 있다. 활성 화합물은 상기한 바와 같은 하나 이상의 부형제와 함께 미세캡슐형 내에 존재할 수도 있다.
정제, 당의정, 캡슐제, 환제 및 과립제의 고체 용량형은, 피복 및 쉘(shell)(예: 장용 피복 및 약제 제형 분야에서 익히 공지된 다른 피복)을 사용하여 제조할 수 있다. 이들은 임의로 불투명화제를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 장관의 특정 부분에 임의의 지연된 방식으로 활성 성분만을 방출하는 조성물일 수 있다. 사용할 수 있는 매봉 조성물에는 중합체성 물질 및 왁스(wax)가 포함된다. 본 발명의 화합물의 국소 또는 경피 투여용 용량형에는 연고제, 페이스트(paste), 크림(cream), 로션(lotion), 겔(gel), 산제, 용액, 스프레이, 흡입제 또는 패취(patch)가 포함된다. 멸균 조건하에 활성 성분을 약제학적으로 허용되는 담체 및 임의로 요구되는 방부제 또는 완충액과 혼합할 수도 있다.
또한 본 발명의 범주내에서 안과용 제형, 귀 점적제, 안연고, 산제 및 용액을 고려할 수 있다. 연고, 페이스트, 크림 및 겔은 본 발명의 활성 성분 이외에 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀(paraffin), 전분, 트라가칸트(tragacanth), 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 탈크 및 산화아연 또는 이들의 혼합물과 같은 부형제를 포함할 수 있다.
산제 및 스프레이는 본 발명의 화합물 외에 락토스, 탈크, 규산, 수산화알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분말 또는 이들의 혼합물과 같은 부형제를 포함할 수 있다. 스프레이는 클로로플루오로하이드로카본과 같은 통상의 추진제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 패취는 신체에 화합물 전달을 조절할 수 있다는 또다른 잇점이 있다. 이러한 용량형은 화합물을 적절한 매질에 용해시키거나 분산시켜 제조할 수 있다.피부를 통한 화합물의 흡수를 증가시키기 위해 흡수 향상제를 사용할 수도 있다. 속도는 속도 조절 막을 제공하거나 중합체 매트릭스 또는 겔에 화합물을 분산시켜 조절할 수 있다.
활성 화합물을 포함하는 조성물은 용량 제형에 적합한 방식으로 치료학적 유효량을 투여할 수 있다. 투여량 및 투여 시간은 치료할 숙주, 활성 성분을 이용할 수 있는 숙주 전신계의 용량 및 목적하는 치료 효과 정도에 따라 좌우된다. 투여시 요구되는 활성 성분의 정확한 양은 실무자의 판단에 따라 좌우되며 개체에 따라 다르다.
전신 적용에 적합한 용량 범위는 본원에 기술되어 있으며 투여 경로에 좌우된다. 적합한 투여법이 여러가지일 수 있지만 초기 투여에 의해 결정되며, 이후에는 후속되는 주사 또는 다른 투여 경로에 의해 1회 이상의 예정된 간격으로 반복되는 용량에 따라 결정된다.
본 발명은 또한 본원에서 기술한 치료 방법을 실시하기에 유용한 약제학적 조성물을 제공한다. 조성물은 상기한 화합물과 함께 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명의 화합물 또는 조성물의 비경구 투여용 제제에는 멸균 수용액 또는 비수용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함된다. 비수성 용매의 예에는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 유지(예: 올리브유) 및 주사용 유기 에스테르(예: 에틸 올레에이트)가 있다. 수성 담체에는 염수 및 완충 매질을 포함하여, 물, 알콜 용액/수용액, 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다. 비경구 비히클에는 염화나트륨 용액,링거 덱스트로스, 덱스트로스, 염화나트륨, 락트화 링거액 또는 경화유가 포함된다. 정맥내 비히클에는 유동액 및 영양 보충액, 전해질 보충액(예: 링거 덱스트로스계) 등이 포함된다. 방부제, 및 항균제, 산화방지제, 킬레이트제, 불활성 기체 등과 같은 기타 첨가제가 존재할 수도 있다.
본 발명의 또다른 양태는 MMP2와 αvβ3의 상호작용을 억제하여 종양 조직에서 신혈관 생성을 억제하는 방법을 제공한다. 억제 방법은 상기한 바람직한 화합물의 신혈관 생성 억제량을 포함하는 조성물을 숙주에 투여함을 포함한다. MMP2와 αvβ3의 상호작용은 본 발명의 화합물과 αvβ3을 접촉시켜 억제한다.
신혈관 생성은 이미 존재하는 숙주 혈관으로부터 신생혈관 그물망을 형성하는 것으로, 종양 성장의 경우 1 내지 2㎣ 이상이 필요하다. 본 발명의 목적에서는, 신혈관 생성 및 신혈관 생성에 의해 매개되는 질환 증상이 완화되도록 신혈관 생성을 억제한다.
활성 화합물을 숙주에 투여하는 경우 용량의 범위는 특정 활성 화합물, 및 특정 종양 또는 인테그린에 대한 이의 효능에 좌우된다. 당해 분야의 숙련가는 불필요한 실험 없이도 특정 활성 화합물에 대해 적절한 용량을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 숙주는 어떤 동물도 가능하다. 용량은 신혈관 생성 및 신혈관 생성에 의해 매개되는 질환 증상이 완화되는 목적하는 치료 효과를 충분히 나타낼 수 있어야하며, 일반적으로는 혈장 활성 화합물의 수준을 약 0.01 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 0.2 내지 약 20μM, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 10μM로 유지하기에 충분한 양이다. 그러나, 부작용을 일으킬 만큼 용량이 많아서는 안된다. 1일 또는 수일 동안 또는 정해지지 않은 기간 동안 1일 1회 이상의 용량 투여시, 체중 1㎏당 용량이 1회 용량당 1 내지 20㎎으로 다양할 수 있다.
신혈관 생성을 억제하는 경우, 치료학적 유효량은 치료될 조직내 신혈관 생성을 측정가능한 수준으로 억제하기에 충분한 활성 화합물의 양으로, 즉 신혈관 생성 억제량 또는 MMP2-αvβ3상호작용 억제량이다. 신혈관 생성의 억제는 본원에서 기술하는 바와 같이 면역조직화학법에 의해 반응계내에서 측정하거나 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다른 방법에 의해 측정할 수 있다.
본 발명은 본원에서 기술한 치료 방법을 실시하기에 유용한 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 조성물은 상기한 활성 화합물과 함께 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명은 또한 종양 세포에서 세포자살(apoptosis)을 유도하는 방법을 제공한다. 본 방법은 종양 세포의 세포자살을 개시하기에 충분한 활성 화합물의 치료학적 유효량을 숙주에게 투여함을 포함한다.
본 발명의 목적에서, 처리한 표적 종양에서 종양 세포의 세포자살 증가가 관찰되면 종양 세포의 세포자살이 유도된 것이다. 종양 세포의 세포자살은 본원에서 기술한 방법 또는 당해 분야에서 익히 공지된 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 다양한 양태를 기술하기 위해 하기의 비제한적 실시예를 제공한다.
물질 및 방법
항체 세포 및 시약: 사람 β3-인테그린 아단위(β3CS-1 세포)로 감염시킨 CS-1 세포 및 CS-1 햄스터 흑색종 세포는 이미 기술된 바와 같다[참조: Cell, 85, 683-93(1996); Cell, 92, 391-400(1998)]. 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합 모노클로날 항체 항-바이오틴 mAb BN-34 및 항-액틴 mAb AC-40은 시그마사(Sigma, St. Louis, MO)로부터 입수한다. 항-폰 빌레브란드 인자(Anti-von Willebrand Factor; vWF) 폴리클로날 항체(pAb)는 다코사(DAKO, Glostrup, Denmark)로부터 입수한다. 사이클릭 펩타이드 cRGDfV 및 cRADfV, 및 인테그린 αvβ3은 머크 KGaA(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)로부터 입수한다. 정제된 proMMP2 및 인테그린 αvβ3은 케미콘 인터내셔널(Chemicon International, Temecula, CA)로부터 제공받는다. 정제된 활성 MMP2는 칼바이오켐(Calbiochem, La Jolla, CA)으로부터 입수한다. 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)는 시오스사(Scios, Mountain View, CA)로부터 제공받는다.
실시예 1. 고상 인테그린 결합 검정
정제된 인테그린은 카세인차단제(Caseinblocker; Pierce, Rockford, IL)로 차단시키기 전에 미세역가 웰(well)(1-5㎍/㎖, 50㎍/웰)상에 밤새 흡착시킨다. 시험 화합물 사이클릭 RGD 또는 RAD 펩타이드, 또는 완충 비히클 단독의 존재 또는 부재하에, 결합 완충액(50mM 트리스, pH 8, 150mM NaCl, 1mM MgCl2, 0.5mM MnCl2)중정제된 바이오티닐화 MMP2(bMMP2, 3-5nM)를 웰에 가한다. 대조 웰에는 인테그린이 없다. 바이오티닐화 비트로넥틴(bVN, 1㎍/㎖)을 참조 물질로 사용한다. 결합된 단백질은 HRP-항-바이오틴 mAb로 검출하고, 450㎚에서 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 용액[TMB; 퍼옥시다제의 기질; 공급원: 미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재의 바이오래드(BioRad)]을 사용하여 정량한다.
화합물 19에 의한 직접적인 인테그린 결합을 평가하기 위해, 이뮬론(Immulon)-4 미세역가 웰[공급원: 미국 버지니아주 찬틸리 소재의 다이나테크 래보러토리즈(Dynatech Laboratories)]에 αvβ3및 α5β1(10㎍/㎖, 50㎕/웰)을 피복시키고, 0.1% Tween-20을 포함한 결합 완충액 150㎕를 가하기 전에 [14C]-화합물 19를 적정하고 모든 액체를 흡인하여 실질적으로 웰을 차단시키고 항온처리한다. 정량하기 위해 건조시킨 웰을 분리하고 베타맥스(BetaMax) 액체 섬광 칵테일[공급원: 미국 캘리포니아주 코스타 메사 소재의 아이씨엔 바이오케미칼스(ICN Biochemicals)]에 침지시킨다. 이러한 결합 곡선으로부터, 25배 몰 과량(75㎕)의 비표지된 화합물 19 또는 화합물 9, 또는 100μM 사이클릭 RGD 또는 RAD 펩타이드의 존재 또는 부재하에 [14C]-화합물 19의 포화 농도(3μM)를 조사한다. 대조로는 bVN을 사용하고 상기한 바와 같이 검출한다.
실시예 2. MMP2 세포-결합 및 [ 3 H]-콜라겐 IV 분해 검정
CS-1 세포 또는 β3CS-1 세포는, 0.5% 송아지 혈청 알부민(BSA), 0.4mMMnCl2및 10㎍/㎖ 아프로티닌이 보충되고 4nM의 정제된 활성 MMP2를 단독으로 포함하거나 10μM의 화합물 19 또는 화합물 9가 혼합되어 있는 부착 완충 섬유아세포 기본 배지(FBM)중 37℃에서 45분 동안 항온처리한 다음, 세척하고 [3H]-콜라겐 IV-피복 웰에 가한다. 웰은 0.414mCi/㎖ [3H]-콜라겐 IV[공급원: 아이씨엔 바이오케미칼스] 50㎕로 밤새 피복시키고, 회수한 세척액중 방사능이 배경 방사능에 이를 때까지 세심하게 세척한다. 또한, MMP2의 부재하에 세포를 상기한 바와 같이 처리하거나, 대조로서 MMP2 용액을 세포가 없는 웰에 직접 가한다. 콜라겐 IV 분해는 액체 섬광 계수기에서 측정한 바와 같이 배양 배지 50㎕중에 방출된 방사능을 측정하여 정량한다. CS-1 세포에 대한 바이오티닐화 MMP2의 결합을 평가하기 위해, 세포를 부착 완충액에 현탁시키고, 10μM 화합물 19 또는 화합물 9의 존재 또는 부재하에 37℃에서 45분 동안 12nM bMMP2와 함께 항온처리한다. 세포를 세척하고 용해시킨 다음, SDS-PAGE를 실시하기 위해 처리하고 항-바이오틴 mAb와 면역블롯팅(immunoblotting)한다.
실시예 3. 화합물 27의 합성
아세토니트릴(150㎖)중 N,N'-디석신이미딜 카보네이트 용액(95.38g, 21mmol)을 4-(트리플루오로메틸)벤질 알콜(2.87㎖, 21mmol) 및 트리에틸아민(Et3N; 5.8㎖, 42mmol)으로 처리하고 25℃에서 교반한다. 3시간 후, 이 용액을, 아세토니트릴중 N- ε-BOC-라이신 메틸 에스테르(4.2g, 14mmol)를 포함한 플라스크에 가하고 추가로 3시간 동안 교반한다. 용매를 증발시키고, 잔사는 CH2Cl2(250㎖)에 용해시키고, 10% HCl 수용액(2×200㎖) 및 포화 NaHCO3수용액(200㎖)으로 세척한다. 섬광 크로마토그래피(SiO2, 3:1 CH2Cl2/EtOAc)로 화합물 27 6.4g(99%)을 담황색 오일로서 수득한다.
[α]D 25-8.9ⓒ5.55, CH3OH;1H NMR(CDCl3, 400㎒) δ7.57(d, J=8.1㎐, 2H), 7.39(d, J=8.1㎐, 2H), 5.70(d, J=7.9㎐), 5.13(m, 2H), 4.71(m, 1H), 4.28(m, 1H), 3.67(s, 3H), 3.03(m, 2H), 1.78(m, 1H), 1.64(m, 1H) 1.46-1.32(m, 4H) 1.35(s, 9H);13C NMR(CDCl3, 100㎒) δ172.9, 156.2, 155.8, 140.4, 130.1(q, J=32.0㎐), 127.8, 125.3, 122.9(q, J=270.0㎐), 79.05, 65.8, 53.7, 52.3, 39.8, 31.7, 29.5, 28.4, 22.2; IR(film) vmax3357, 2952, 1790, 1745, 1524㎝-1; FABHRMS(NBA-NaI) m/z 463.2044(M+H+, C21H29F3N2O6requires 463.2056)
실시예 4. 화합물 29의 합성
CH2Cl2(3㎖) 중 화합물 27(2.2g, 48.8mmol) 용액을 HCl-디옥산(10㎖) 4N으로 처리하고, 25℃에서 20분 동안 교반한다. 용매 및 과량의 산을 감압하에서 제거하고, 조 하이드로클로라이드 염을 DMF(40㎖) 중에 용해시키고, N-((3급-부틸옥시)카보닐)-N'-(2-(4-플루오로페닐)에틸)이미노디아세트산 모노아미드(화합물28)(1.68g, 4.8mmol), PyBrOP(3.3g, 7.1mmol) 및 디이소프로필에틸아민(i-Pr2NEt; 5.0㎖, 29mmol)으로 처리하고, 25℃에서 1시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 EtOAc(400㎖)로 희석시키고, 10% HCl 수용액(2 x 300㎖) 및 포화 NaHCO3수용액(300㎖)으로 세척한다. 섬광 크로마토그래피(SiO2, 1:1 CH2Cl2/EtOAc)로 화합물 29 2.47g(74%)을 백색 폼(foam)형 고체로서 수득한다.
[α]D 25-7.1ⓒ4.50, CH3OH;1H NMR(CDCl3, 400㎒) δ8.23 and 7.59(m, together 1H), 7.58(d, J=8.1㎐, 2H), 7.43(m, 2H), 7.13(m, 2H), 7.06 및 6.78(m, together 1H), 6.94(m, 2H), 5.70(dd, J=12.9 및 8.2㎐, 1H), 5.11(m, 2H), 4.31(m, 1H), 3.85-3.72(m, 4H), 3.71(s, 3H), 3.49(m, 2H), 3.22(m, 2H), 2.79(m, 2H), 1.81-1.39(m, 6H), 1.38(s, 9H);13C NMR(CDCl3, 100㎒) δ172.8, 170.0, 169.9, 155.8, 154.8,161.4(d, J=242.7㎐), 140.2, 134.4, 130.1(d, J=33.4㎐), 130.0, 127.7, 125.3(q, J=3.0㎐), 123.8(q, J=299.9㎐), 115.0, 81.2, 65.7, 53.9, 53.3, 52.2, 40.8, 38.6, 34.4, 31.5, 28.0, 22.4; IR (film) vmax3267, 2935, 1708, 1657, 1151㎝-1; FABHRMS(NBA-CsI) m/z 831.2026(M+Cs+, C33H42F4N4O8requires 831.1993)
실시예 5. 화합물 19의 합성
CH2Cl2(1㎖)중 화합물 29(50㎎, 0.075mmol) 용액을 4N의 HCl-디옥산(1㎖)로 처리하고, 25℃에서 1시간 동안 교반한다. 용매 및 과량의 산을 N2증기하에서 제거하고, 조 하이드로클로라이드 염을 CH2Cl2(1㎖)에 현탁시키고, 이소프탈로일 디클로라이드(7.6㎎, 0.038mmol) 및 i-Pr2NEt(0.05㎖, 0.3mmol)로 처리하고, 25℃에서 12시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 EtOAc(50㎖)로 희석시키고, 10% 염산 수용액(3 x 30㎖), 포화 NaHCO3수용액(30㎖) 및 포화 NaCl 수용액(30㎖)으로 세척한다. 섬광 크로마토그래피(SiO2, 1:4.5:4.5 MeOH/CH2Cl2/EtOAc)로 화합물 19.30㎎(60%)을 백색 분말로서 수득한다.
1H NMR(CD3OD, 400㎒) δ7.62(m,4H), 7.52(m,4H), 7.42(m, 4H), 7.19(m,4H), 6.96(m, 4H), 5.14(m, 4H), 4.16(m, 2H), 4.13(m, 2H), 4.08(m, 2H), 3.99(m, 4H), 3.68(s, 6H), 3.45-3.35(m, 4H), 3.25-3.11(m, 4H), 2.82-2.70(m, 4H), 1.82(m, 2H), 1.69(m, 2H), 1.60-1.34(m, 8H); IR(film) vmax3291, 2936, 1725, 1651, 1326㎝-1; FABHRMS (NBA-CsI) m/z 1459.4015(M+Cs+, C64H70F8N8O14requires 1459.3938).
실시예 6. 화합물 30의 합성
3급-부탄올(0.3㎖) 중 화합물 19(13㎎, 0.01mmol) 용액을 H2O(0.15㎖)에 용해된 LiOH ·H2O(0.91㎎, 0.22mmol)로 처리하고, 0℃에서 2시간 동안 교반한다. 이어서, 반응 혼합물을 HCO2H(1㎖)를 사용하여 급냉하고, EtOAc(10㎖)로 희석하고, 포화 NaCl 수용액(2 x 10㎖)으로 세척한다. 건조(Na2SO4) 및 증발하여 화합물 30 12㎎(95%)을 백색 분말로서 수득한다.
1H NMR(DMSO-d6, 400㎒) δ12.54(br s, 2H), 8.63(m, 1H), 8.43(m, 2H), 8.30(m, 1H), 7.74(m, 4H), 7.69(m, 2H), 7.57(m, 4H), 7.40(m, 4H), 7.24(m, 4H), 7.09(m, 4H), 5.15(m, 4H), 4.14(m, 2H), 4.02-3.87(m, 8H), 3.31(m, 4H), 3.208(m, 4H), 2.74(m, 4H), 1.71(m, 2H), 1.62(m, 2H), 1.50-1.34(m, 8H); IR(film) vmax3287, 2928, 1705, 1659, 1320㎝-1; MALDIHRMS m/z 1321.4493(M+Na+, C62H66F8N8O14requires 1321.4468).
실시예 7. [ 14 C]-화합물 19의 합성
DMF(20㎖)중 화합물 27(1.7㎎, 1.3mmol) 및 EDCI(2.0㎎, 10.3mmol)의 용액을 CH2Cl2(57mCi/mmol, 5.2mmol14CH3OH)중14CH3OH 용액 0.3㎖ 및 CH2Cl2중 DMAP 스톡(stock) 용액 35㎖로 처리하고, 0℃에서 4시간 동안 교반한다. 이어서, 반응 혼합물을 EtOAc(3ℓ)로 희석하고, 10% 염산 수용액(3 x 3㎖) 및 포화 NaHCO3수용액(3㎖)으로 세척하고, Na2SO4로 건조시킨다. PTLC(SiO2, 2:3:3EtOH/CHCl3EtOAc) 상의 정화로 [14C]-화합물 19 0.6㎎(35%)을 백색 필름(film)으로서 수득한다. 이 물질은1H NMR 및 HPLC로 상응하는 비표지된 디메틸에스테르 화합물 1과 동일하다. 비 활성은 약 104Ci/mmol이다.
1H NMR(CD3OD, 400㎒) δ7.62(m, 4H), 7.52(m, 4H), 7.42(m, 4H), 6.96(m, 4H), 5.14(m, 4H), 4.16(m, 2H), 4.13(m, 2H), 4.08(m, 2H), 3.99(m, 4H), 3.68(s, 6H), 3.45-3.35(m, 4H), 3.25-3.11(m, 4H), 2.82-2.70(m, 4H), 1.82(m, 2H), 1.69(m, 2H), 1.60-1.34(m, 8H).
결과 및 논의
화학식 I 및 화학식 II의 화합물을 포함하는 조합적 라이브러리를 이의 합성 방법과 함께 문헌[참조: Boger et al., Bioorg. Med. Chem, 6, 1347-1378(1998)]에서 상세하게 기술하고 있다. 보거 등(Boger et al.)은 10개의 화합물 각각의 60개의 혼합물의 조합적 라이브러리의 제조방법을 기술하고, 여기서 혼합물중 독립적인 화합물은 도 2에 나타낸 바와 같이 함께 커플링된 3 개의 아단위를 포함한다. 화합물의 아단위는 A, B, C로 지정된다. 라이브러리는 6 개의 상이한 A 단위(A1 - A6), 10개의 상이한 B 단위(B1 - B10), 및 10개의 상이한 C 연결 그룹(C1- C10)으로부터 구성된다. 각각의 A 단위는 각각의 B 단위와 커플링되어 60개의 상이한 AB 화합물을 형성한다. 이어서, 독립적인 AB 화합물은 10개의 상이한 C 연결 그룹의 혼합물과 커플링시켜, 각각 AxBy로 지정된 10개 화합물의 60개의 혼합물을 형성하고, 여기서 x 및 y는 각각 혼합물의 화합물에 혼입된 독립적인 A 및 B의 아단위를 나타낸다. 화합물의 조합적 라이브러리의 A, B 및 C의 아단위는 도 2에 나타낸다.
MMP2 경쟁에서, 경쟁 인테그린 αvβ3결합 검정에서 상기한 60 개의 혼합물의 평가는, 수개의 혼합물이 인테그린 αvβ3과 MMP2의 결합을 억제한다는 것을 나타낸다. 평가 검정의 결과는 도 3에 나타낸다. 특히 활성 혼합물은 A1B6, A1B7, A1B8, A4B1, A5B4, A5B5, A5B6, A5B10 및 A6B10을 포함한다. 가장 활성화된 혼합물은 A6B10이고, 따라서 혼합물의 10개의 독립적인 화합물은 개별적으로 합성되고, 동일한 분석으로 조사되며, 이의 결과를 도4에 나타내었다. 검정에서 독립적인 성분 A6B10C1 내지 A6B10C10은 3μM 농도에서 활성이다.
도 5에 나타낸 A6B10C4(화합물 1)의 유사한 화합물(2 - 26)은 또한 평가된다. 화합물 2 - 26의 결합 검정의 결과는 도 6A에 나타낸다. 화합물 8, 화합물 9 및 화합물 23 전부는 인테그린에 대한 MMP2의 결합을 억제한다.
본 발명의 활성 MMP2/인테그린-αv-β3결합 억제제는 화학식 I 및 화학식 II를 포함한다.
화합물 19는 이의 특수한 목적을 결정하고 이의 생물학적 특성을 정의하기 위해 상세하게 조사된다. 결합 검정에서 길항제 활성이 부족하다는 것이 밝혀진 이래로, 이의 전체 구조의 유사성 및 유사한 물리적 특성(예: 용해도 및 소수성)에도 불구하고, 벤조일 아미드 화합물 9는 다수의 이러한 연구를 위한 적절한 음성적 대조 화합물로서 선택되었다. 화합물 19는 도 6B에 나타낸 바와 같이 인테그린에대한 MMP2의 결합 억제는 농도에 의존한다는 것을 나타낸다.
방사성 동위원소(14C)를 에스테르 치환체(비활성도 약 104mCi/mmol)중 화합물 19로 혼입하였다. 고정된 αvβ3로 배양(3μM)하고 후속적으로 세척한 후에, 이 화합물이 도 7에서 입증된 바와 같이 인테그린에 부착된다는 것을 밝혔다. 25배 몰 과량의 냉각된 화합물 19의 존재하의 배양을 실질적으로 관찰된 결합제의 양을 감소시킨 반면, 25배 몰 과량의 (냉각된) 대조 화합물 9의 존재하의 배양은 [14C]-화합물 19의 결합에 영향을 주지 않는다. 고정된 MMP2에 대한 [14C]-화합물 19의 상호작용을 측정하는 유사한 실험에서, 어떠한 결합도 관찰되지 않았다. 이들 결과는 MMP2-αv-β3결합 검정에서 관찰되는 길항제 활동의 발생은 αvβ3에 대하여 화합물 19가 특수하게 결합되는 것으로부터 유도된다. 화합물 19-αv-β3의 상호작용의 성질은 Arg-Gly-Asp 서열을 인식하는 인테그린 위치로부터 독립적이다. 사이클릭 RGD 펩타이드 사이클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)는 [14C]-화합물 19의 결합에 효과가 없다(도 7). 실제로, 도 8에서 나타낸 바와 같이, 화합물 19는 인테그린에 대한 비트로넥틴, αvβ3의 전형적인 고 친화성 리간드의 결합을 억제하지 않고, 화합물 19의 결합 위치가 RGD-리간드를 결합하는 위치와 상이하다는 개념과 일치한다.
또한, 화합물 19에서, 내피 세포가 신혈관 생성의 주요한 단계에서 MMP2를이용하여 단백질 매트릭스를 분해하는 능력을 측정하는 세포 검정을 연구하였다. αvβ3에 대한 MMP2의 결합을 방해하는 것은 [3H]-콜라겐 IV 분해를 억제한다는 것은 이미 공지되어 있다. αvβ3로 형질감염된 CS-1 흑색종 세포는, β3음성 CS-1 세포(αvβ3이 부족함)을 분해하지 않고, 고정된 [3H]-콜라겐 IV를 분해하는 것으로 밝혀졌다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 이들 세포를 화합물 19와 처리하는 것은 매트릭스 분해의 증가를 상당히 감소시키고, 인테그린 표면에 결합되지 않는 MMP2를 사용할 수 없는 세포와 일치한다. 그러나, 세포의 부재하에 순수한 (활성) 효소는 화합물 19의 존재 또는 부재하에서 유사한 정도까지 [3H]-콜라겐 IV를 분해할 수 있기 때문에 화합물 19는 직접적으로 MMP2의 단백질 분해 활성을 억제하지는 못한다.
이들 결과는 화학식 I의 화합물이 MMP2를 사용하여 PEX와 유사한 방법으로 EMC 단백질을 분해하는 능력을 방해한다는 제안을 뒷받침한다. 화학식 I의 화합물은 이의 전형적인 RGD 리간드에 대한 αvβ3의 결합을 방해하지 않고, 이들은 직접적인 프로테이나제 억제제로서 기능하지 않다.
상기의 기술 및 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 나타낸 것이며 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 본 발명의 정신 및 범위에 내의 다른 변형은 가능할 수 있고, 당해 분야의 숙련가에게 용이하게 할 수 있다.

Claims (37)

  1. 인테그린 αvβ3을 화학식 I의 화합물의 상호작용 억제량과 접촉시킴을 포함하여, 숙주 세포에서 MMP2와 인테그린 αvβ3과의 상호작용을 억제하는 방법.
    화학식 I
    상기식에서,
    G1및 G2는 각각 독립적으로 -NH-C(O)-0-R1, -NH-C(O)-O-(CH2)V-(C6H4)-X3, -NH-C(O)-NH-(CH2)V-(C6H4)-X3, -O-C(O)-NH-(CH2)V-(C6H4)-X3, -O-C(O)-0-(CH2)V-(C6H4)-X3또는 -NH-C(O)-CH2-(C6H4)-X3이고,
    Y1및 Y2는 각각 독립적으로 -OH, C1-C4알킬, C1-C4하이드록시알킬, C1-C4알콕시, 페닐, 벤질 또는 NH2이며,
    R1은 C1-C4알킬이고,
    X1및 X2는 각각 독립적으로 할로 또는 C1-C4알콕시이며,
    X3은 할로, 니트로, C1-C4알킬, C1-C4알콕시 또는 C1-C4퍼플루오로알킬이고,
    Z는 -C≡C-, -C6H4-, 시스-CH=CH-, 트랜스-CH=CH-, 시스-CH2-CH=CH-CH2-, 트랜스-CH2-CH=CH-CH2-, 1,4-나프틸, 시스-1,3-사이클로헥실, 트랜스-1,3-사이클로헥실, 시스-1,4-사이클로헥실 또는 트랜스-1,4-사이클로헥실이며,
    A는 H 또는 공유 결합이고,
    m 및 n은 각각 독립적으로 0 또는 1의 값인 정수이며,
    t는 0 또는 1의 값인 정수이고,
    p, r 및 v는 각각 독립적으로 1 또는 2의 값인 정수이며,
    단, A가 H인 경우, t는 0이고; A가 공유 결합인 경우, t는 1이며; m이 0인 경우, Y1은 C1-C4하이드록시알킬이고; n이 0인 경우, Y2는 C1-C4하이드록시알킬이다.
  2. 제1항에 있어서, G1및 G2가 -NH-C(O)-O-(CH2)V-(C6H4)-X3이고, A가 공유 결합이며, v가 1인 방법.
  3. 제2항에 있어서, X3이 트리플루오로메틸인 방법.
  4. 제2항에 있어서, Y1및 Y2가 OH이고, m이 1이며, n이 1인 방법.
  5. 제2항에 있어서, X1및 X2중의 하나 이상이 파라-플루오로인 방법.
  6. 제2항에 있어서, m이 1이고, n이 1이며, R2및 R3중의 하나 이상이 메틸인 방법.
  7. 제2항에 있어서, R2및 R3가 H이고, m 및 n이 1이며, X1및 X2가 플루오로이고, X3이 트리플루오로메틸인 방법.
  8. 인테그린 αvβ3을 화학식 II의 화합물의 상호작용 억제량과 접촉시킴을 포함하여, 숙주 세포에서 MMP2와 인테그린 αvβ3과의 상호작용을 억제하는 방법.
    화학식 II
    상기식에서,
    R2및 R3은 각각 독립적으로 H, C1-C4알킬, 페닐, 또는 벤질이고,
    X1및 X2는 각각 독립적으로 할로 또는 C1-C4알콕시이며,
    X4및 X5는 각각 독립적으로 할로, 니트로, C1-C4알콕시, C1-C4알킬 또는 C1-C4퍼플루오로알킬이고,
    A는 H 또는 공유 결합이며.
    p 및 r은 각각 독립적으로 1 또는 2의 값인 정수이고,
    t는 0 또는 1의 값인 정수이며,
    단, A가 H인 경우, t는 0이고; A가 공유 결합인 경우, t는 1이다.
  9. 제8항에 있어서, X4및 X5중의 하나 이상이 C1-C4퍼플루오로알킬이고, A가 공유 결합인 방법.
  10. 제8항에 있어서, R2및 R3중의 하나 이상이 H이고, A가 공유 결합인 방법.
  11. 제8항에 있어서, R2및 R3중의 하나 이상이 메틸이고, A가 공유 결합인 방법.
  12. 제8항에 있어서, X4및 X5이 트리플루오로메틸이고, R2및 R3이 각각 메틸이며, A가 공유 결합인 방법.
  13. 제8항에 있어서, A가 공유 결합이고, R2및 R3이 메틸이며, X4및 X5가 트리플루오로메틸이고, X1및 X2가 플루오로이며, m이 1이고, n이 1인 방법.
  14. 신혈관 생성을 억제하는데 유효한 양의 화학식 I의 화합물을 숙주에 투여함을 포함하여, 숙주에서 신혈관 생성을 억제하는 방법.
    화학식 I
    상기식에서,
    G1및 G2는 각각 독립적으로 -NH-C(O)-0-R1, -NH-C(O)-O-(CH2)V-(C6H4)-X3, -NH-C(O)-NH-(CH2)V-(C6H4)-X3, -O-C(O)-NH-(CH2)V-(C6H4)-X3, -O-C(O)-0-(CH2)V-(C6H4)-X3또는 -NH-C(O)-CH2-(C6H4)-X3이고,
    Y1및 Y2는 각각 독립적으로 -OH, C1-C4알킬, C1-C4하이드록시알킬, C1-C4알콕시, 페닐, 벤질 또는 NH2이며,
    R1은 C1-C4알킬이고,
    X1및 X2는 각각 독립적으로 할로 또는 C1-C4알콕시이며,
    X3은 할로, 니트로, C1-C4알킬, C1-C4알콕시 또는 C1-C4퍼플루오로알킬이고,
    Z는 -C≡C-, -C6H4-, 시스-CH=CH-, 트랜스-CH=CH-, 시스-CH2-CH=CH-CH2-, 트랜스-CH2-CH=CH-CH2-, 1,4-나프틸, 시스-1,3-사이클로헥실, 트랜스-1,3-사이클로헥실, 시스-1,4-사이클로헥실 또는 트랜스-1,4-사이클로헥실이며,
    A는 H 또는 공유 결합이고,
    m 및 n은 각각 독립적으로 0 또는 1의 값인 정수이며,
    t는 0 또는 1의 값인 정수이고,
    p, r 및 v는 각각 독립적으로 1 또는 2의 값인 정수이며,
    단, A가 H인 경우, t는 0이고; A가 공유 결합인 경우, t는 1이며; m이 0인 경우, Y1은 C1-C4하이드록시알킬이고; n이 0인 경우, Y2는 C1-C4하이드록시알킬이다.
  15. 제14항에 있어서, G1및 G2가 -NH-C(O)-O-(CH2)V-(C6H4)-X3이고, A가 공유 결합이며, v가 1인 방법.
  16. 제15항에 있어서, X3이 트리플루오로메틸인 방법.
  17. 제15항에 있어서, Y1및 Y2가 OH이고, m이 1이며, n이 1인 방법.
  18. 제15항에 있어서, X1및 X2중의 하나 이상이 파라-플루오로인 방법.
  19. 제15항에 있어서, m이 1이고, n이 1이며, R2및 R3중의 하나 이상이 메틸인 방법.
  20. 제15항에 있어서, R2및 R3가 메틸이고, m 및 n이 1이며, X1및 X2가 플루오로이고, X3이 트리플루오로메틸인 방법.
  21. 제14항에 있어서, 투여 방법이 복강내, 피하, 정맥내, 경피, 활막내, 근육내 또는 경구 투여를 포함하는 방법.
  22. 화학식 I의 화합물의 치료학적 유효량을 숙주에 투여함을 포함하여, 숙주에서 종양 성장을 억제하는 방법.
    화학식 I
    상기식에서,
    G1및 G2는 각각 독립적으로 -NH-C(O)-0-R1, -NH-C(O)-O-(CH2)V-(C6H4)-X3, -NH-C(O)-NH-(CH2)V-(C6H4)-X3, -O-C(O)-NH-(CH2)V-(C6H4)-X3, -O-C(O)-0-(CH2)V-(C6H4)-X3또는 -NH-C(O)-CH2-(C6H4)-X3이고,
    Y1및 Y2는 각각 독립적으로 -OH, C1-C4알킬, C1-C4하이드록시알킬, C1-C4알콕시, 페닐, 벤질 또는 NH2이며,
    R1은 C1-C4알킬이고,
    X1및 X2는 각각 독립적으로 할로 또는 C1-C4알콕시이며,
    X3은 할로, 니트로, C1-C4알킬, C1-C4알콕시 또는 C1-C4퍼플루오로알킬이고,
    Z는 -C≡C-, -C6H4-, 시스-CH=CH-, 트랜스-CH=CH-, 시스-CH2-CH=CH-CH2-, 트랜스-CH2-CH=CH-CH2-, 1,4-나프틸, 시스-1,3-사이클로헥실, 트랜스-1,3-사이클로헥실, 시스-1,4-사이클로헥실 또는 트랜스-1,4-사이클로헥실이며,
    A는 H 또는 공유 결합이고,
    m 및 n은 각각 독립적으로 0 또는 1의 값인 정수이며,
    t는 0 또는 1의 값인 정수이고,
    p, r 및 v는 각각 독립적으로 1 또는 2의 값인 정수이며,
    단, A가 H인 경우, t는 0이고; A가 공유 결합인 경우, t는 1이며; m이 0인 경우, Y1은 C1-C4하이드록시알킬이고; n이 0인 경우, Y2는 C1-C4하이드록시알킬이다.
  23. 제22항에 있어서, G1및 G2가 -NH-C(O)-O-(CH2)V-(C6H4)-X3이고, A가 공유 결합이며, v가 1인 방법.
  24. 제23항에 있어서, X3이 트리플루오로메틸인 방법.
  25. 제23항에 있어서, Y1및 Y2가 OH이고, m이 1이며, n이 1인 방법.
  26. 제23항에 있어서, X1및 X2중의 하나 이상이 파라-플루오로인 방법.
  27. 제23항에 있어서, m이 1이고, n이 1이며, R2및 R3중의 하나 이상이 메틸인 방법.
  28. 제23항에 있어서, R2및 R3가 메틸이고, m 및 n이 1이며, X1및 X2가 플루오로이고, X3이 트리플루오로메틸인 방법.
  29. 제22항에 있어서, 투여 방법이 복강내, 피하, 정맥내, 경피, 활막내, 근육내 또는 경구 투여를 포함하는 방법.
  30. 화학식 I의 화합물의 치료학적 유효량을 종양 세포에 투여함을 포함하여, 종양 세포에서 세포 소멸을 유도하는 방법.
    화학식 I
    상기식에서,
    G1및 G2는 각각 독립적으로 -NH-C(O)-0-R1, -NH-C(O)-O-(CH2)V-(C6H4)-X3, -NH-C(O)-NH-(CH2)V-(C6H4)-X3, -O-C(O)-NH-(CH2)V-(C6H4)-X3, -O-C(O)-0-(CH2)V-(C6H4)-X3또는 -NH-C(O)-CH2-(C6H4)-X3이고,
    Y1및 Y2는 각각 독립적으로 -OH, C1-C4알킬, C1-C4하이드록시알킬, C1-C4알콕시, 페닐, 벤질 또는 NH2이며,
    R1은 C1-C4알킬이고,
    X1및 X2는 각각 독립적으로 할로 또는 C1-C4알콕시이며,
    X3은 할로, 니트로, C1-C4알킬, C1-C4알콕시 또는 C1-C4퍼플루오로알킬이고,
    Z는 -C≡C-, -C6H4-, 시스-CH=CH-, 트랜스-CH=CH-, 시스-CH2-CH=CH-CH2-, 트랜스-CH2-CH=CH-CH2-, 1,4-나프틸, 시스-1,3-사이클로헥실, 트랜스-1,3-사이클로헥실, 시스-1,4-사이클로헥실 또는 트랜스-1,4-사이클로헥실이며,
    A는 H 또는 공유 결합이고,
    m 및 n은 각각 독립적으로 0 또는 1의 값인 정수이며,
    t는 0 또는 1의 값인 정수이고,
    p, r 및 v는 각각 독립적으로 1 또는 2의 값인 정수이며,
    단, A가 H인 경우, t가 0이고; A가 공유 결합인 경우, t는 1이며; m이 0인 경우, Y1은 C1-C4하이드록시알킬이고; n이 0인 경우, Y2는 C1-C4하이드록시알킬이다.
  31. 제30항에 있어서, G1및 G2가 -NH-C(O)-O-(CH2)V-(C6H4)-X3이고, A가 공유 결합이며, v가 1인 방법.
  32. 제31항에 있어서, X3이 트리플루오로메틸인 방법.
  33. 제31항에 있어서, Y1및 Y2가 OH이고, m이 1이며, n이 1인 방법.
  34. 제31항에 있어서, X1및 X2중의 하나 이상이 파라-플루오로인 방법.
  35. 제31항에 있어서, m이 1이고, n이 1이며, R2및 R3중의 하나 이상이 메틸인 방법.
  36. 제31항에 있어서, R2및 R3가 메틸이고, m 및 n이 1이며, X1및 X2가 플루오로이고, X3이 트리플루오로메틸인 방법.
  37. 제30항에 있어서, 투여 방법이 복강내, 피하, 정맥내, 경피, 활막내, 근육내 또는 경구 투여를 포함하는 방법.
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