SK14842002A3

SK14842002A3 - Inhibícia angiogenézy a rastu tumoru

Info

Publication number: SK14842002A3
Application number: SK1484-2002A
Authority: SK
Inventors: Dale L. Boger; David A. Cheresh
Original assignee: The Scripps Research Institute
Priority date: 2000-03-27
Filing date: 2001-03-27
Publication date: 2003-04-01
Also published as: HUP0301621A3; AU5101801A; ZA200208626B; PL366316A1; CZ20023509A3; KR20020091156A; AU2001249499B2; CA2403630A1; EP1276713A4; RU2002128751A; CN1245967C; HUP0301797A2; NO20024578D0; JP2003528140A; AU4949901A; CA2403630C; NO20024576D0; CA2403871A1; RU2276133C2; WO2001072699A1

Description

Tento vynález sa týka zlúčenín na inhibíciu angiogenézy a rastu tumoru. Obzvlášť sa vynález týka zlúčenín, ktoré sa viažu na integrín α_νβ3 a blokujú interakciu integrínu α_νβ3 s matrixovou metaloproteinázou 2 (MMP2). Vynález sa týka aj spôsobov inhibície angiogenézy a rastu tumoru s využitím selektívnych inhibítorov väzby integrínu α_νβ3 s MMP2.

Doterajší stav techniky

Invázia vaskulárnych buniek do tkanív vyžaduje koordinovanú súhru mnohých faktorov vrátane proteináz, ktoré pretvárajú architektúru extracelulárneho matrixu, ako aj bunkových adhéznych molekúl, ktoré rozpoznávajú tento prechodný matrix. Najnovšie práce uvádzajú, že 72 kDa matrixová metaloproteináza 2 (MMP 2) má kľúčovú úlohu vo vaskulárnom vývoji a angiogenéze. Napríklad Kitoh a kol. (J. Celí Sci., 109, 953-958 (1996)), uvádzajú, že MMP2 a jej aktivátor, matrixová metaloproteináza membránového typu 1 (MT1-MMP), sú koordinovane exprimované mezenchýmovými bunkami takmer výlučne počas embryonálneho vývoja, čo poukazuje na obmedzenia pretvárania špecifickej matrix v týchto' tkanivách. Okrem toho angiogenéza a zodpovedajúci rast tumoru sú u MMP2 knockout myší redukované (pozri Itoh a kol., Cancer Res., 58, 1048-1051 (1998)). Pre zaujímavosť, Saftor a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1557-1561 (1992)), zistili, že ligácia integrínu α_νβ3, známeho ako mediátor angiogenézy, indukuje produkciu MMP2, čo naznačuje koordinovanú súhru týchto dvoch molekúl počas vaskulárneho pretvárania spojeného s tvorbou krvných ciev (pozri aj Bafetti a kol., J. Biol. Chem., 273, 143-149 (1998)). Skutočne, priamu interakciu medzi MMP2 a integrínom α_νβ₃ demonštrovali Brooks a kol. (Celí, -85, 683-693 (1996)). Ako neskôr ukázali Brooks a kol. (Celí, 92, 391-400 (1998)), negatívna regulácia MMP2 v priebehu vaskulárnej invázie a maturácie je závislá od expresie integrínu α_νβ3·

Hoci inhibícia angiogenézy a sprievodné potláčanie rastu tumoru tak prírodnými, ako aj syntetickými inhibítormi MMP, zahŕňajúcimi MMP2, sa už dokumentovala, prenos takýchto stratégií do klinických metód bol spojený' len s čiastočným úspechom, hlavne kvôli škodlivým účinkom takéhoto širokého spektra inhibítorov. Keďže vo všeobecnosti sa funkcia MMP môže vyžadovať pri mnohých procesoch v dospelom organizme, aktívne miesto inhibície enzymatickej funkcie má pravdepodobne účinky so vzdialeným dosahom na rozličné biologické procesy zahŕňajúce pretváranie tkaniva, ako je hojenie rán. Skutočne je dokumentované, že terapie so širokým spektrom inhibítorov MMP v klinických štúdiách rôznych typov rakoviny spôsobujú vážne vedľajšie účinky zahŕňajúce zápalovú tendinitídu, polyartritídu a syndrómy muskoskeletárnej bolesti, ktoré obmedzujú dávku a často pretrvávajú po prerušení terapie. Vzhladom na obmedzenú distribúciu integrínu α_νβ3 v dospelom organizme by sa však mohlo predpovedať, že zacielenie interakcie medzi MMP2 a α_νβ3 do oblastí neovaskularizácie alebo bunkovej invázie by mohlo zodpovedajúco limitovať účinky takejto toxicity súvisiacej s liečbou. Skutočne, rekombinantná nekatalytická karboxyterminálna hemopexínová doména MMP2 (PEX), ktorá sprostredkuje väzbu MMP2 na, integrín α_νβ3, sa vyznačovala antiangiogenetickou a antitumorovou aktivitou in vivo. Potenciálna užitočnosť takéhoto veľkého proteínového fragmentu, ktorá je ale spojená so sprievodnými nedostatkami (napríklad problémy s produkciou vo velkom meradle, otázky FDA kvality a kontroly bezpečnosti a antigenicita), naznačuje potrebu praktickejšieho riešenia tohto problému.

Preto existuje potreba chemických zlúčenín, ktoré selektívne inhibujú aktivitu MMP v miestach rastu tumoru s minimálnou inhibíciou MMP v iných oblastiach tela.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález poskytuje nové zlúčeniny užitočné ako inhibítory angiogenézy a rastu tumoru. Vynález poskytuje aj spôsob inhibície interakcie MMP2 s integrínom α_νβ3 a spôsob inhibície angiogenézy v bunkách obsahujúcich integrín a_vp3- Ďalej vynález poskytuje spôsob inhibície rastu tumoru pomocou podávania inhibítorov interakcie MMP2 s integrínom a_vp3.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sú reprezentované všeobecným vzorcom I a zahŕňajú glycyllyzínové deriváty chemicky naviazané na spojovaciu skupinu

(I) kde

G¹ a G² sú každý nezávisle skupina -NH-C (0)-0-R¹, skupina -NH-C (0) -0- (CH2) v- (C6H4) -X¹, skupina -NH-C (0)-NH-(CH2) _v-(C_SH₄)-X¹, skupina -0-C (0)-NH-(CH2) v-(C6H4)-X¹, skupina -0-C (0)-0-(CH2) _v-(CgHU-X¹ alebo skupina -NH-C (0)-CH₂-(C₆H₄)-X¹;

Y¹ a Y² sú každý nezávisle hydroxyskupina, Ci~C₄ alkylová skupina, Ci~C₄ hydroxyalkylová skupina, Ci~C₄ alkoxyskupina, fenylová skupina, benzylová skupina alebo aminoskupina;

R¹ je Ci-C₄ alkylová skupina;

X¹ je atóm halogénu, nitroskupina, Ci-C₄ alkylová skupina, Ci~C₄alkoxyskupina alebo Ci~C₄ perfluóralkylová skupina;

Z je skupina -C=c-, skupina -C6H₄-_Z skupina cis-CH=CH-, skúpi4 na trans-CH=CH-, skupina cis-CH₂-CH=CH-CH2-, skupina trans-CH₂-CH=CH-CH₂-, 1,4-naftylová skupina, cis-1,3-cyklohexylová skupina, trans-1,3-cyklohexylová skupina, cis-1,4-cyklohexylová skupina alebo trans-1, 4-cyklohexylová skupina;

A je atóm vodíka alebo kovalentná väzba;

I m a n sú každý nezávisle celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1;

t je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1; a v je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 1 alebo 2;

s výhradou, že keď A je atóm vodíka, t je 0; keď A je kovalentná väzba, t je 1; keď m je 0, Y¹ je C1-C4 hydroxyalkylová skupina; á keď n je 0, Y² je Ci~C₄ hydroxyalkylová skupina. Tieto zlúčeniny

I sa viažu na integrín α_νβ₃ a inhibujú interakciu MMP2 s integrínom α_νβ₃.

Výhodné zlúčeniny všeobecného štruktúrneho vzorca I sú reprezentované všeobecným štruktúrnym vzorcom II

kde

R² a R³ sú každý nezávisle atóm vodíka, C1-C4 alkylová skupina, fenylová skupina alebo benzylová skupina;

X² a X³ sú každý nezávisle atóm halogénu, nitroskupina, Ci-C₄alkoxyskupina, Ci~C₄ alkylová skupina alebo Ci-C₄ perfluóralkylová skupina;

A je atóm vodíka alebo kovalentná väzba; a t je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1;

s výhradou, že keď A je atóm vodíka, t je 0; a keď A je kovalentná väzba, t je 1. Keď A. je kovalentná väzba a t je 1, zvyšky glycyllyzínového derivátu môžu byť naviazané na benzénovú spojovaciu skupinu v polohe orto, metá alebo para.

Keď sa zlúčeniny všeobecného vzorca I a II podajú do buniek obsahujúcich integrín α_νβ₃, väzba integrínu α_νβ₃ s MMP2 sa inhibuje, a teda interferujú s podstatným mechanizmom angiogenézy. Interferencia s angiogenézou môže tiež inhibovať rast tumoru pomocou prevencie vaskularizácie tumoru, a teda jeho odstavením od výživy. Zlúčeniny podía predkladaného vynálezu, ktoré inhibujú angiogenézu a rast tumoru, sú teda užitočnými terapeutickými činidlami na liečenie pacientov s tumormi alebo angiogénnymi chorobami. Keďže zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sa viažu na integrín α_νβ₃, tieto zlúčeniny sa môžu použiť aj na potlačenie zápalových prípadov.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sa môžu formulovať do vhodných farmaceutický prijatelných médií, pričom poskytnú farmaceutické kompozície užitočné pri liečení tumorov a ďalších chorôb zahŕňajúcich nežiaducu angiogenézu.

Podľa metodického aspektu predkladaného vynálezu, farmaceutické kompozície obsahujúce zlúčeniny všeobecného vzorca I a II sa pripravujú formuláciou zlúčeniny do farmaceutický prijateľnej matrice. Farmaceutickékompozície aktívnych zlúčenín sa podávajú pacientovi s tumorom s cieľom redukovať alebo eliminovať rast tumoru. Aktívne zlúčeniny sa môžu podávať parenterálne pomocou injekcie alebo pomocou postupnej infúzie v čase (over time), alebo akýmkoľvek ďalším spôsobom vhodným na podanie konkrétnej dávkovej formy.

Prehľad obrázkov na výkresoch

V sprievodných nákresoch

Obr. 1 je schematická ilustrácia znázorňujúca interakciu MMP2 s integrinom α_νβ3 a jej úlohu v angiogenéze, ako aj inhibíciu interakcie MMP2 s integrinom α_νβ3 antagonistom, ako sú zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu.

Obr. 2A graficky ilustruje účinok inhibičných zlúčenín všeobecného vzorca I na interakciu MMP2 s integrinom α_νβ3 v teste väzby v tuhej fáze.

Obr. 2B ilustruje väzbu zlúčeniny všeobecného vzorca I na integrín α_νβ3 a α₅βι.

Obr. 2C porovnáva účinok zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu s kontrolnou zlúčeninou pri väzbe na integrín α_νβ3·

Obr. 2D porovnáva účinok aminokyselinových zvyškov RGD na väzbu zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu na integrín α_νβ3 s účinkom RGD na väzbu bVN na integrín α_νβ3·

Obr. 3A graficky ilustruje aktivitu proteinázy v β₃ pozitívnych bunkách a v β₃ negatívnych bunkách.

Obr. 3B ilustruje väzbu MMP2 v β₃ pozitívnych bunkách a v β3 négatívnych bunkách. '

Obr. 4A je mikroskopické znázornenie inhibície angiogenézy v tkanive kuracej CAM.

Obr. 4B je grafická ilustrácia inhibície angiogenézy v tkanive kuracej CAM.

Obr. 4C znázorňuje hladinu MMP2 v liečených a neliečených bunkách.

Obr. 5A je mikroskopické znázornenie rastu tumoru a vaskulatúry v tkanive kuracej CAM.

Obr. 5B je mikroskopické znázornenie hustoty krvných ciev v tkanive kuracej CAM.

Obr. 5C je grafická ilustrácia hmotnosti tumoru v tkanive kuracej CAM.

Obr. 5D je grafická ilustrácia vaskularizácie v tkanive kuracej CAM.

Obr. 5D je mikroskopické znázornenie hustoty buniek tumoru v tkanive kuracej CAM.

Podrobný opis vynálezu

Väzba MMP2 na integrín α_νβ3 je dôležitým mechanizmom v procese angiogenézy. Špecifická inhibícia tejto väzbovej interakcie má za následok redukciu vaskularizácie v rastúcich tkanivách, ako sú tumory, a teda spomaľuje rast tumoru. Interakcia MMP2 s integrínom α_νβ3 sa ilustruje na obr. 1. Novou triedou inhibítorov angiogenézy a rastu tumoru sú antagonisty s veľkosťou malých molekúl (small molecule antagonists) opísané v ďalšej časti predkladaného vynálezu, ktoré špecificky interferujú s väzbou MMP2 na integrín α_νβ3, a teda poskytujú dôležitý nový nástroj na liečenie.

Určité zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu obsahovať jedno alebo viacero asymetrických centier a môžu existovať v opticky aktívnych formách. Ďalšie asymetrické centrá môžu byť prítomné v substituentoch, ako je napríklad alkylová skupina. Čisté S-izoméry a čisté P-izoméry, racemické zmesi izomérov a ich zmesi sú mienené ako neoddeliteľná súčasť rozsahu tohto vynálezu. Chirálne formy určitých zlúčenín podľa predkladaného vynálezu sú zamýšľané a sú špecificky zahrnuté do rozsahu tohto vynálezu.

Výraz „alkoxyskupina znamená atóm kyslíka pripojený éterovou väzbou na alkylovú skupinu, ako sa bude definovať v ďalšej časti opisu, s naznačenou veľkosťou. Príkladmi alkoxyskupín sú metoxyskupina, etoxyskupina, terc-butoxyskupina a podobne.

Výraz „alkylová skupina znamená uhľovodíkový zvyšok s priamym alebo rozvetveným reťazcom s naznačenou veľkosťou. Reprezentatívnymi príkladmi alkylových skupín sú metylová skupina, etylová skupina, n-propylová skupina, izopropylová skupina, n-butylová skupina, sek-butylová skupina, izobutylová skupina, terc-butylová skupina, 2-etylhexylová skupina, n-oktylová skupina, 2,4-dimetylpentylová skupina a podobne.

Výraz „hydroxyalkylová skupina znamená alkylovú skupinu s naznačenou veľkosťou, ako sa už definovala, pripojenú na hydroxyskupinu. Príklady zahŕňajú hydroxymetylovú skupinu, 2-hydroxyetylovú skupinu, 3-hydroxý-l-propylovú skupinu, 2-hydroxy-1-propylovú skupinu, 4-hydroxybutylovú skupinu a podobne.

Výrazom „perfluóralkylová skupina sa rozumie alkylová skupina s naznačenou veľkosťou, ako sa už definovala, obsahujúca ako substituenty atómy fluóru miesto každého atómu vodíka, napríklad trifluórmetylová skupina alebo pentafluóretylová skupina .

Výrazom „atóm halogénu sa rozumie atóm brómu, atóm chlóru, atóm fluóru a atóm jódu.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sú reprezentované všeobecným vzorcom I a zahŕňajú glycyllyzinové deriváty chemicky naviazané na spojovaciu skupinu

¹ a G² sú každý nezávisle skupina -NH-C(O)-O-R¹, skupina -NH-C (O)-O-(CH2) v-(C6H4)-X¹, skupina -NH-C (O) -NH- (CH2) _v~ (C₅H₄) -X¹, skupina -O-C (O) -NH- (CH2) v~ (CgH4) -X¹, skupina -O-C (O)-O-(CH2) _v-(C₆H₄)-X¹ alebo skupina -NH-C (O) -CH₂- (C₆H₄) -X¹;

¹ a Y² sú každý nezávisle hydroxyskupina, Ci-C₄ alkylová skupina, Ci~C₄ hydroxyalkylová skupina, Ci-C₄ alkoxyskupina, fenylová skupina, benzyiová skupina alebo aminoskupina;

¹ je C1-C4 alkylová skupina;

¹ je atóm halogénu, nitroskupina, Ci~C₄ alkylová skupina, C3.-C4 alkoxyskupina alebo C1-C4 perfluóralkylová skupina;

je skupina -C=C-, skupina -C6H4-, skupina cis-CH=CH-, skupina trans-CH=CH-, skupina ,cis-CH₂-CH=CH-CH₂-, skupina trans-CH₂-CH=CH-CH₂ —, 1,4-naftylová skupina, cis-1,3-cyklohexylová skupina, trans-1,3-cyklohexylová skupina, cis-1, 4-cyklohexylová skupina alebo trans-1,4-cyk'lohexylová skupina;

je atóm vodíka alebo kovalentná väzba;

a n sú každý nezávisle celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1;

je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1; a je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 1 alebo 2;

výhradou, že keď A je atóm vodíka, t je 0; keď A je kovalentná väzba, t je 1; keď m je 0, Y¹ je Ci~C4 hydroxyalkylová skupina; a keď n je 0, Y² je Ci-C4 hydroxyalkylová skupina.

Výhodne G¹ a G² sú skupina -NH-C (O)-O-(CH2) v-(C6H4)-X¹, Y¹ a Y²sú hydroxyskupina, a m a n sú 1. Výhodne X¹ je Ci~C4 perfluóralkylová skupina, ešte výhodnejšie trifluórmetylová skupina. Výhodné zlúčeniny v rozsahu všeobecného štruktúrneho vzorca I sú reprezentované všeobecným štruktúrnym vzorcom II a zahŕňajú glycyllyzínové deriváty naviazané na benzénovú spojovaciu skupinu buď v polohe orto, metá alebo para.

kde

R² a R³ sú každý nezávisle atóm vodíka, Ci-C₄ alkylová skupina, fenylová skupina alebo benzylová skupina;

X² a X³ sú každý nezávisle atóm halogénu, nitroskupina, Ci-C₄ alkoxyskupina, Ci~C₄ alkylová skupina alebo Ci-C₄ perfluóralkylová skupina;

s výhradou, že keď A je atóm vodíka, t je 0; a keď A je kovalentná väzba, t je 1. Keď A je kovalentná väzba a t je 1, zvyšky glycyllyzínového derivátu môžu byť naviazané na benzénovú spojovaciu skupinu v polohe orto, metá alebo para.

Výhodne sú substituenty X¹ a X² naviazané na fenylový kruh benzylového zvyšku v polohe 4 vzhľadom na benzylovú CH? skupinu (t. j. para substituent). Výhodne sú skupiny X² a X³ C1-C4 perfluóralkylová skupina, ešte výhodnejšie para-trifiuórmetylová skupina. Preferovanými skupinami R² a R³ sú atóm vodíka a metylová skupina. Substituenty X² a X³ môžu byť rovnaké alebo odlišné a substituenty R² a R³ môžu byť takisto rovnaké alebo odlišné.

Obzvlášť aktívnym členom rodiny zlúčenín reprezentovaných všeobecným vzorcom II, kde A je kovalentná väzba a t je 1, je nasledovná zlúčenina vzorca 1.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I a II sa môžu syntetizovať z lahko dostupných materiálov pričom sa použije nie príliš vysoké množstvo syntetických krokov. Napríklad schéma 1 znázorňuje syntézu zlúčeniny 1 a je ilustratívnym príkladom všeobecnej metódy na prípravu zlúčenín všeobecného vzorca II, kde A je kovalentná väzba, R² a R³ sú rovnaké a X² a X³ sú rovnaké. Schéma 1 ďalej ilustruje syntézu zlúčenín všeobecného vzorca II, kde X² a X³ sú oba para-trif Iuórmetylová skupina a R² a R³ sú oba buď atóm vodíka alebo metylová skupina.

Schéma 1

HO.

CF₃

1. HCI-dioxán

2. BOC-GIy EDCI 96%

HCl- dioxán 99%

[ ¹⁴C]-Zlúčenina 1 sa pripravila v 25% celkovom výťažku z BOC-[¹⁴ϋ]-Gly

V schéme 1 reaguje p- (trifluórmetyl)benzylalkohol s disukcínimidyl karbonátom, pričom vznikne ako medziprodukt aktivovaný ester, ktorý postupne reaguje s Ν-ε-Boc-lyzín metylesterom, pri13 čom poskytne zlúčeninu 2 vo výťažku 99 %. Hydrolýza ochrannej skupiny Boe a následná kondenzácia s Boc-glycinom poskytne zlúčeninu 3 vo výťažku 96 %. Kyslá hydrolýza ochrannej skupiny Boe zlúčeniny 3 poskytne zlúčeninu 4 vo výťažku 99 %. Kondenzácia dvoch ekvivalentov zlúčeniny 4 s izoftaloyl dichloridom poskytne zlúčeninu 5 vo výťažku 68 %, ktorá zodpovedá všeobecnému vzorcu II, kde R² a R³ sú metylová skupina, X² a X³ sú p-trifluórmetylová skupina, a A je kovalentná väzba. Hydrolýza zlúčeniny 5 hydroxidom litnym poskytne zlúčeninu 1 vo výťažku 93 %.

Syntéza zlúčenín všeobecného vzorca I a II, ktoré sú analógmi zlúčeniny 1 a majú iné substituenty R a X, sa môže uskutočniť modifikáciou schémy 1 a bude pre odborníka v oblasti chemickej syntézy zrejmá. Použitie benzylalkoholu s iným substituentom než p-trifluórmetylová skupina (napríklad atóm halogénu, nitroskupina alebo iná C1-C4 perfluóralkylová skupina v polohe orte, metá alebo para vzhladom na benzylovú CH2 skupinu) alebo použitie chráneného esteru lyzínu, ktorý má esterovú skupinu inú než metylovú, poskytne iné zlúčeniny všeobecného vzorca II.

Syntéza zlúčenín všeobecného vzorca I, ktoré majú skupinu Z inú než 1,3-fenylovú sa môže uskutočniť nahradením izoftaloyl dichloridu v schéme 1 iným dichloridom dikyseliny, ako je bischlórkarbonylacetylén, fumaryl dichlorid alebo ftaloyl dichlorid. Alternatívne sa môžu použiť miesto chloridov kyselín zodpovedajúce kyseliny, a kondenzácia kyselín s príslušnými amínmi sa môže uskutočniť použitím štandardných techník kondenzácie peptidov dobre známych v odbore. Odborník v tomto odbore dokáže ’ lahko nahradiť aj ďalšie chemické materiály, ktoré sa môžu použiť pri syntetických metódach ilustrovaných v schémach 1 a 2 a syntetizovať ďalšie členy tejto skupiny zlúčenín reprezentovaných všeobecným vzorcom I a II. Syntézu podobných zlúčenín a užitočné chemické stratégie použitelné na syntézu zlúčenín všeobecného vzorca I a II opísali Boger a kol. v J. Am. Chem. Soc., 123, 1280-1288 (2001) .

Zlúčeniny všeobecného vzorca II, kde A je kovalentná väzba, t je 1 a buď R² je odlišné od R³ alebo X² je odlišné od X³, alebo oba R²/R³ a X²/X³ sa líšia, sa môžu syntetizovať aj modifikáciami metódy uvedenej v schéme 1, ktoré budú odborníkovi v odbore zrejmé. Napríklad jeden ekvivalent zlúčeniny 4 môže reagovať s izoftaloyl dichloridom alebo akýmkoľvek vhodným izoftaloyl halogenidom alebo aktívnym esterom, a druhá aktivovaná kyselinová skupina môže následne reagovať s analógom zlúčeniny 4, ktorý obsahuje buď odlišnú skupinu X, alebo odlišnú skupinu R, alebo obe. Podobne dva analógy zlúčeniny 4, ktoré obsahujú buď odlišné skupiny X, alebo odlišné skupiny R, alebo obe, môžu následne reagovať s izoftaloyl dichloridom alebo ekvivalentom aktivovaného izoftalátu, a poskytnúť ďalšie analógy zlúčeniny 1 s rôznymi skupinami X a R.

Syntéza zlúčenín všeobecného vzorca II, kde A je atóm vodíka a t je 0 je ilustrovaná syntézou zlúčenín 6 a 7 v nasledovnej schéme 2.

Schéma 2

V schéme 2 zlúčenina 4 zo schémy 1 reaguje s benzoylchloridom, pričom vznikne zlúčenina 6 (R² je metylová skupina, X² je p-trifluórmetylová skupina) vo výťažku 90 %. Hydrolýza esterovej skupiny zlúčeniny 6 hydroxidom lítnym poskytne zlúčeninu 7 (R² je atóm vodíka, X² je p-trifluórmetylová skupina) vo výťažku 88 %.

Benzoylácia anaiógov zlúčeniny 4 s odlišnými skupinami R (napríklad iné Ci~C₄ alkylové skupiny) a/alebo odlišnými substituentami X na benzylovej skupine vedie k ďalším zlúčeninám všeobecného vzorca II, kde A je atóm vodíka a t je 0.

V schéme 2 je ilustrovaná syntéza zlúčeniny 8, inaktívneho analógu zlúčenín 6 a 7, kde benzoylový zvyšok naviazaný na glycínovú jednotku všeobecného vzorca II je nahradený diglykolamidovou skupinou. Zlúčenina 9 sa získa vo výťažku 77 % kondenzáciou zlúčeniny 4 s kyselinou diglykolovou.

Nasledovná schéma 3 ilustruje syntézu zlúčeniny 12, inaktívneho analógu zlúčeniny 1, v ktorej je p-trifluórmetylbenzyloxykarbonylová skupina všeobecného vzorca II nahradená benzoylamidovou skupinou.

Schéma 3

Zlúčenina 12, R=H

Podía metodického aspektu predkladaného vynálezu farmaceutické prípravky zlúčenín všeobecného vzorca I a II sa môžu pripraviť formuláciou zlúčeniny do farmaceutický prijateľnej nosnej matrice. Farmaceutické kompozície obsahujúce aktívne zlúčeniny všeobecného vzorca I a II sa podávajú hostiteľovi s tumorom s cieľom redukovať alebo eliminovať rast tumoru. Aktívne zlúčeniny sa môžu podávať parenterálne pomocou injekcie alebo pomocou postupnej infúzie v čase. Hoci liečené tkanivo sa najčastejšie lieči pomocou intraperitoneálneho alebo subkutánneho podávania, aktívne zlúčeniny sa môžu podávať aj intraokulárne, intravenózne, intramuskulárne, intrasynoviálne, intrakavitálne alebo transdermálne, a tiež sa môžu podať aj pomocou peristaltických prostriedkov.

Výraz „podávanie” zlúčenín alebo kompozícií podľa predkla17 daného vynálezu, ako sa tu používa, sa týka systémového použitia zahŕňajúceho podanie perorálnou, parenterálnou, pomocou inhalačného spreja, nasálnou, rektálnou alebo bukálnou cestou, alebo topicky pomocou formulácií dávkovej jednotky obsahujúcich konvenčné netoxické, farmaceutický prijatelné nosiče, adjuvans a vehikulá, ak sa to vyžaduje.

Za „farmaceutický prijatelné sa považujú soli, amidy a estery zlúčenín podlá predkladaného vynálezu, ktoré sú, v súlade s úsudkom ošetrujúceho lekára, vhodné na použitie pri styku s tkanivami človeka a nižších zvierat bez prílišnej toxicity, podráždenia, alergickej odpovede a podobne, a sú prijatelné z hľadiska primeraného pomeru prospečh/riziko a účinné na ich zamýšľané použitie na liečenie tumorov a chorôb spojených s angiogenézou.

Farmaceutický prijatelné soli sú v tomto odbore dobre známe. Napríklad Berge a kol. detailne opisujú farmaceutický prijateľné soli v J. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977). Reprezentatívne kyslé adičné soli zahŕňajú hydrochloridy, hydrobromidy, sulfáty, bisulfáty, acetáty, oxaláty, valeráty, oleáty, palmitáty, stearáty, lauráty,. boráty, benzoáty, laktáty, fosfáty, toluénsulf onáty, metánsulfonáty, citráty, maleáty, fumaráty, sukcináty, tartaráty, askorbáty, glukoheptonáty, laktobionáty, laurylsulfáty a podobne. Reprezentatívne soli s alkalickými kovmi alebo kovmi alkalických zemín zahŕňajú sodné, vápenaté, draselné, horečnaté soli a podobne.

Výraz „farmaceutický prijatelné nosiče, ako sa tu používa, znamená netoxické, inertné tuhé, polotuhé alebo kvapalné plnidlo, riedidlo, enkapsulačný materiál alebo pomocné činidlo akéhokoľvek typu. Niektorými príkladmi materiálov, ktoré môžu slúžiť ako farmaceutický prijatelné nosiče, sú cukry, ako je laktóza, glukóza a sacharóza; škroby, ako je kukuričný škrob a zemiakový škrob; celulóza a jej deriváty, ako je sodná sol karboxymetylcelulózy, etylcelulóza a acetát celulózy; práškový tragant; slad; želatína; sľuda; excipienty, ako sú kakaové maslo a čapíkové vosky; oleje, ako je podzemnicový olej, olej z bavlníkových semien, saflorový olej, sezamový olej, olivový olej, kukuričný olej a sójový olej; glykoly, ako je propylénglykol; polyoly, ako je glycerín, sorbitol, manitol a polyetylénglykol; estery, ako etyloleát a etyllaurát; agar; pufrovacie činidlá, ako hydroxid horečnatý a hydroxid hlinitý; kyselina algínová, voda neobsahujúca pyrogén; izotonický salin; Ringerov roztok; etylalkohol a fosfátové tlmivé roztoky, ako aj ďalšie netoxické kompatibilné substancie používané vo farmaceutických formuláciách.

V súlade s úsudkom pracovníka pripravujúceho formuláciu, v kompozíciách môžu byť prítomné aj zvlhčovacie činidlá, emulgátory a lubrikanty, ako je laurylsulfát sodný a stearát horečnatý, ako aj farbiace činidlá, rozvolňovacie činidlá, poťahovacie činidlá, sladiace, ochucovacie a vonné činidlá, konzervačné látky a antioxidanty. Príklady farmaceutický prijateľných antioxidantov zahŕňajú vo vode rozpustné antioxidanty, ako je kyselina askorbová, cysteín hydrochlorid, bisulfit sodný, metabisulfit sodný, sulfit sodný a podobne; v oleji rozpustné antioxidanty, ako je askorbylpalmitát, butylovaný hydroxyanizol (BHA), butylovaný hydroxytoluén (BHT), lecitín, propylgalát, a-tokoferol a podobne; a činidlá chelatujúce kovy, ako je kyselina citrónová, kyselina etyléndiamíntetraoctová (EDTA), sorbitol, kyselina vínna, kyselina fosforečná a podobne.

„Terapeuticky účinným množstvom činidla alebo zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sa rozumie množstvo zlúčeniny, ktoré je dostatočné na liečenie tumorov a chorôb spojených s angiogenézou z hladiska primeraného pomeru prospech/riziko použiteľné pri akomkoľvek liečebnom postupe. Rozumie sa však, že celková denná dávka zlúčeniny alebo kompozície podľa predkladaného vynálezu bude závisieť od rozhodnutia a úsudku ošetrujúceho lekára. Hladina špecifickej terapeuticky účinnej dávky pre ktoréhokolvek vybraného pacienta bude závisieť od množstva rozličných faktorov, zahŕňajúcich chorobu, ktorá sa má liečiť a závažnosť tejto choroby; aktivitu špecifickej zlúčeniny, ktorá sa použila;

špecifickú kompozíciu, ktorá sa použila; vek, telesnú hmotnosť, všeobecný zdravotný stav, pohlavie a spôsob stravovania pacienta; dĺžku podávania, spôsob podávania a rýchlosť vylučovania špecifickej zlúčeniny, ktorá sa použila; trvanie liečenia, liečivá, ktoré sa použili v kombinácii alebo súčasne so špecifickými zlúčeninami, ktoré sa použili; a podobných faktorov dobre známych v odbore lekárstva.

Tento vynález poskytuje aj farmaceutické kompozície v jednotkových dávkových formách, obsahujúcich terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny (alebo zlúčenín) podlá tohto vynálezu v kombinácii s konvenčnými farmaceutickými nosičmi. Injikovatelné prípravky, napríklad sterilné injikovatelné vodné alebo olejové suspenzie, sa môžu formulovať známym spôsobom, pričom sa použijú vhodné dispergačné alebo zvlhčovacie činidlá a suspendačné činidlá. Sterilný injikovatelný prípravok môže tiež byť sterilný injikovatelný roztok, suspenzia alebo emulzia v netoxickom parenterálne prijatelnom riedidle alebo rozpúšťadle, napríklad ako roztok v 1,3-butándiole. Spomedzi prijateľných vehikulov a rozpúšťadiel, ktoré sa môžu použiť, sa môže uviesť voda, Ringerov roztok, U. S. P. a izotonický roztok chloridu sodného. Okrem toho sa vo všeobecnosti ako rozpúšťadlo alebo suspendačné médium môžu použiť sterilné, upravené oleje. Na tento účel sa môžu použiť akékoľvek jemné upravené oleje zahŕňajúce syntetické monoalebo diglyceridy.

Okrem toho sa na prípravu injikovatelných prípravkov môžu použiť mastné kyseliny, ako je kyselina olejová. Injikovatelné formulácie sa môžu sterilizovať napríklad filtráciou cez filtre baktérie alebo inkorporáciou sterilizačných činidiel vo forme sterilných tuhých kompozícií, ktoré sa môžu rozpustiť alebo dispergovať v sterilnej vode alebo inom sterilnom injikovatelnom médiu tesne pred použitím.

S cieľom predĺžiť účinok liečiva je často žiaduce spomaliť absorpciu liečiva zo subkutánnej alebo intramuskulárnej injek20 cie. Najbežnejším spôsobom na uskutočnenie tohto cieľa je injikovanie suspenzie kryštalického alebo amorfného materiálu s nízkou rozpustnosťou vo vode. Rýchlosť absorpcie liečiva sa stáva závislou od rýchlosti rozpúšťania liečiva, ktoré na druhej strane závisí od fyzikálneho stavu liečiva, napríklad veľkosti kryštálov a kryštálovej formy. Ďalší prístup na oneskorenie absorpcie liečiva je podávanie liečiva ako roztoku alebo suspenzie v oleji. Skladovatelné in j iko'vateľné formy sa môžu pripraviť aj vytvorením mikrokapsulových matríc liečiva a biodegradovatelných polymérov, ako je poiylaktid-poiyglykolid. Rýchlosť uvolňovania liečiva sa môže kontrolovať v závislosti od pomeru liečiva k polyméru a zloženia polyméru. Príklady ďalších biodegradovatelných polymérov zahŕňajú polyortoestery a polyanhydridy. Skladovateľné injikovatelné formy sa môžu pripraviť aj zakotvením liečiva do lipozómov alebo mikroemulzií, ktoré sú kompatibilné s tkanivami tela.

Čapíky na rektálne podávanie liečiva sa môžu pripraviť zmiešaním liečiva s vhodným nedráždivým excipientom, ako je kakaové maslo a polyetylénglykol, ktoré sú tuhé pri bežnej teplote ale kvapalné pri rektálnej teplote, a teda sa v rekte roztopia a uvolnia liečivo.

Tuhé dávkové formy na perorálne podávanie môžu zahŕňať kapsule, tablety, pilulky, prášky, perličky (prills) a granule. V takýchto tuhých dávkových formách sa aktívna zlúčenina môže zmiešať s aspoň jedným inertným riedidlom, ako je sacharóza, laktóza alebo škrob. Takéto dávkové formy môžu obsahovať, ako je to pre prax bežné, okrem inertných riedidiel aj ďalšie substancie, napríklad tabletovacie lubrikanty a ďalšie tabletovacie pomocné prostriedky, ako je stearát horečnatý a mikrokryštalická celulóza. V prípade kapsulí, tabliet a piluliek, dávkové formy môžu obsahovať aj pufrovacie činidlá. Tablety a pilulky sa ďalej môžu pripraviť s enterickými poťahmi a ďalšími poťahmi kontrolujúcimi rýchlosť uvoľňovania. Tuhé kompozície podobného typu sa môžu použiť aj ako plnidlo v mäkkých alebo tvrdých želatínových kapsuliach, pričom sa použijú také excipienty, ako je laktóza alebo mliečny cukor, ako aj polyetylénglykoly s vysokou molekulovou hmotnosťou a podobne.

Kvapalné dávkové formy na perorálne podávanie môžu obsahovať farmaceutický prijateľné emulzie, mikroemulzie, roztoky, suspenzie, sirupy a elixíry obsahujúce inertné riedidlá bežne používané v odbore, ako je voda. Takéto kompozície môžu obsahovať aj adjuvans, ako sú zvlhčovacie činidlá; emulgačné a suspendačné činidlá; sladiace, ochucujúce a vonné činidlá. Ak je to potrebné, zlúčeniny podía predkladaného vynálezu sa môžu inkorporovať do systémov s pomalým uvolňovaním alebo s cieleným doručením, ako sú polymérne matrice, lipozómy a mikrosféry. Môžu sa sterilizovať napríklad filtráciou cez filtre zadržiavajúce baktérie alebo inkorporáciou sterilizačných činidiel vo forme sterilných tuhých kompozícií, ktoré sa môžu rozpustiť v sterilnej vode alebo inom sterilnom injikovatelnom médiu bezprostredne pred použitím. Aktívne zlúčeniny môžu byť aj v mikroenkapsulovanej forme s jedným alebo viacerými excipientmi, ako sa už uviedlo.

Tuhé dávkové formy na báze tabliet, dražé, kapsulí, piluliek a granúl sa môžu pripraviť poťahovaním a pokrývaním takými enterickými poťahmi a inými poťahmi, ktoré sú dobre známe v odbore farmaceutických formulácií. Prípadne môžu obsahovať kaliace činidlá a môžu byť aj, kompozíciami, ktoré uvoľňujú aktívnu zložku alebo zložky iba, alebo prednostne, v určitých častiach intestinálneho traktu, prípadne s oneskoreným účinkom. Príklady zalievacích (ukotvujúcich) kompozícií, ktoré sa môžu použiť, zahŕňajú polymérne substancie a vosky. Dávkové formy na topické alebo transdermálne podávanie zlúčeniny podía tohto vynálezu ďalej zahŕňajú masti, pasty, krémy, vodičky, gély, prášky, roztoky, spreje, inhalanty alebo náplasti. Aktívna zlúčenina sa zmieša za sterilných podmienok s farmaceutický prijateľným nosičom a podľa potreby s akýmikoľvek konzervačnými látkami alebo puframi.

Oftalmické formulácie, ušné kvapky, očné masti, prášky a roztoky tiež tvoria súčasť tohto vynálezu. Masti, pasty, krémy a gély môžu obsahovať okrem aktívnej zlúčeniny podľa tohto vynálezu aj excipienty, ako sú živočíšne alebo rastlinné tuky, oleje, vosky, parafíny, škrob, tragant, deriváty celulózy, polyetylénglykoly, šilikóny, bentonity,, kyselina kremičitá, sľuda a oxid zinočnatý, alebo ich zmesi.

Prášky a spreje môžu' okrem zlúčenín podľa tohto vynálezu obsahovať excipienty, ako je laktóza, sľuda, kyselina kremičitá, hydroxid hlinitý, silikáty vápnika a polyamidový prášok, alebo zmesi týchto substancií. Spreje okrem toho môžu obsahovať zvyčajné hnacie plyny, ako sú chlórfluóruhlovodíky.

Transdermálne náplasti sa vyznačujú zvýšenými výhodami poskytovať kontrolované doručenie zlúčeniny do tela. Takéto dávkové formy sa môžu pripraviť rozpustením alebo dispergovaním zlúčeniny vo vlastnom médiu. Môžu sa použiť aj činidlá zvyšujúce absorpciu s cieľom zvýšiť prietok zlúčeniny cez pokožku. Rýchlosť sa môže kontrolovať buď pridaním membrány kontrolujúcej rýchlosť alebo dispergovaním zlúčeniny v polymérnej matrici alebo géli.

Kompozície obsahujúce aktívne zlúčeniny sa podávajú spôsobom kompatibilným s dávkovou formuláciou a v terapeuticky účinnom množstve. Podávané množstvo a dĺžka podávania závisí od hostiteľa, ktorý sa má liečiť, kapacity hostiteľovho systému využiť aktívnu zložku a stupňa terapeutického účinku, ktorý sa požaduje. Presné množstvá aktívnej zložky, ktoré sa majú podať, závisia od rozhodnutia ošetrujúceho lekára a sú vlastné každému jednotlivcovi.

Vhodné dávkové rozsahy na systémovú aplikáciu sa tu uvádzajú a závisia od spôsobu podávania. Vhodné režimy na podávanie sú takisto premenlivé, ale sú charakteristické počiatočným podaním nasledovaným opakovanými dávkami v jednom alebo viacerých vopred určených intervaloch pomocou následnej injekcie alebo iným spô23 sobom podania.

Predkladaný vynález poskytuje aj farmaceutické kompozície užitočné pri praktickom uskutočnení tu opísaných terapeutických metód. Kompozície obsahujú aktívnu zlúčeninu, ktorá je tu už opísaná, spoločne s farmaceutický prijateľným nosičom.

Prípravky na parenterálne podávanie zlúčenín alebo kompozícií podľa predkladaného vynálezu obsahujú sterilné vodné alebo nevodné roztoky, suspenzie a emulzie. Príkladmi nevodných rozpúšťadiel sú propyiénglykol, polyetylénglykol, rastlinné oleje, ako je olivový olej, a injikovatelné organické estery, ako je etyloleát. Vodné nosiče zahŕňajú vodu, vodno-alkoholické roztoky, emulzie alebo suspenzie obsahujúce fyziologický roztok a pufrované médiá. Parenterálne vehikulá zahŕňajú roztoky chloridu sodného, Ringerovu dextrózu, dextrózu a chlorid sodný, laktátovaný Ringerov roztok alebo netuhnúce oleje. Intravenózne vehikulá zahŕňajú tekuté a výživné doplňovacie roztoky, elektrolytické doplňovacie roztoky (ako tie, ktoré sú na báze Ringerovej dextrózy) a podobne. Môžu byť prítomné aj konzervačné látky a ďalšie aditíva, ako napríklad antimikrobiálne činidlá, antioxidanty, chelatačné činidlá, inertné plyny a podobne.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu ponúka spôsob inhibície interakcie MMP2 s integrínom α_νβ3 a teda angiogenézy v tumorovom tkanive. Inhibičný spôsob zahŕňa podanie kompozície, ktorá obsahuje angiogenézu inhibujúce množstvo zlúčeniny tu už opísanej, hostiteľovi. Interakcia MMP2 s integrínom α_νβ3 sa inhibuje kontaktom integrínu α_νβ3 so zlúčeninou podľa predkladaného vynálezu.

Angiogenéza je tvorba neovaskulárnej siete z už existujúcich ciev hostiteľa a vyžaduje sa na rast tumoru s veľkosťou viac ako 1 až 2 mm³. Na účely predkladaného vynálezu sa angiogenéza inhibuje, až kým sa angiogenéza a symptómy ochorenia sprostredkované angiogenézou nezlepšia.

Rozsah dávky aktívnej zlúčeniny na podanie hostiteľovi zá24 visí od aktivity vybranej zlúčeniny a sily jej účinku na určitý tumor alebo integrín. Odborník v odbore môže ľahko určiť správnu dávku vybranej aktívnej zlúčeniny bez potreby nadmerného experimentovania. Hostiteľom môže byť akýkoľvek cicavec. Dávka by mala byť dostatočne velká na to, aby zabezpečila požadovaný terapeuI tický účinok, pri ktorom sa angiogenéza a symptómy ochorenia, sprostredkované angiogenézou nezlepšia, a zvyčajne ide o množstvo dostatočné na udržiavanie hladiny aktívnej zlúčeniny v plazme v rozsahu asi 0,01 až asi 100 μΜ, výhodne asi 0,2 až 20 μΜ, ešte výhodnejšie asi 1 až 10 μΜ. Dávka by však nemala byť taká velká, aby spôsobovala nepriaznivé vedlajšie účinky. Dávka na kilogram telesnej hmotnosti sa môže pohybovať od 1 do 20 mg na dávku, v jednej alebo viacerých denných podaných dávkach, počas jedného alebo niekoľkých dní alebo neurčite.

Na inhibíciu angiogenézy je terapeuticky aktívnym množstvom množstvo aktívnej zlúčeniny dostatočné na produkciu meratelnej inhibície angiogenézy v tkanive, ktoré sa má liečiť, t. j. množstvo inhibujúce angiogenézu alebo množstvo inhibujúce interakciu MMP2 s integrínom α_νβ3· Inhibícia angiogenézy sa môže merať in situ pomocou imunohistochémie, ako je tu opísané, alebo pomocou ďalších metód známych pre odborníka v odbore.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje farmaceutické kompozície' použiteľné pri praktickom uskutočnení terapeutických metód, ktoré sa tu opisujú. Kompozície obsahujú aktívnu zlúčeninu, ktorá sa tu už definovala, spolu s farmaceutický prijateľným nosičom.

Predkladaný vynález poskytuje aj spôsob na vyvolanie apoptózy v bunkách tumoru. Tento spôsob zahŕňa podávanie terapeuticky účinného množstva aktívnej zlúčeniny, dostatočného na iniciovanie apoptózy v bunkách tumoru, hostiteľovi.

Na účely predkladaného vynálezu sa apoptóza buniek tumoru indukuje, ak sa pozoruje zvýšená apoptóza v cielovom tumore, ktorý sa má liečiť. Apoptóza buniek tumoru sa môže merať pomocou metód, ktoré sa tu opisujú alebo ktoré sú bežne známe v odbore.

Na ilustráciu rozličných aspektov predkladaného vynálezu sa uvádzajú nasledovné neobmedzujúce príklady.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Materiály a metódy

Protilátky, bunky a činidlá

Bunky škrečieho melanómu CS-1 a bunky CS-1 transfekované podjednotkou ľudského integrínu β₃ (β₃Ο3-1 bunky) sú už opísané (Celí, 85, 683-693 (1996); Celí, 92, 391-400 (1998)). Monoklonálne protilátky (mAb) konjugované s chrenovou peroxidázou (HRP) proti biotínu BN-34 a proti aktínu AC-40 sa získali od firmy Sigma (St. Louis, MO, USA). Polyklonálne protilátky (pAb) proti von Willebrandovmu faktoru (vWF) sa získali od firmy DÁKO (Glostrup, Dánsko). Cyklické peptidy cRGDV a cRADfV a integrín α_νβ3 poskytla veľkoryso firma Merck KGaA (Darmstadt, Nemecko). Prečistenú proMMP2 a integrín α_νβ₃ poskytla firma Chemicon International (Temecula, TA, USA). Prečistená aktívna MMP2 sa získala od firmy Calbiochem (La Jolla, CA, USA). Základný fibroblastový rastový faktor (bFGF) láskavo poskytla firma Scios (Mountain View, CA, USA).

Syntéza [ ¹⁴C]-značených zlúčenín [¹⁴C]-značená zlúčenina 1 sa syntetizovala miernou modifikáciou už uvedenej sekvencie pre neznačený materiál (schéma 1), pričom sa však použil N-Boc-[1-¹⁴C] glycín (55 mCi/mmol, American Radiolabeled Chemicals, St. Louis, MO, USA). Celkový výťažok značenej zlúčeniny 1 pre štvorstupňovú sekvenciu bol 25%.

Príklad 1

Väzbové testy integrínu v tuhej fáze

Prečistené integriny sa adsorbovali cez noc na mikrotitračné dosky (1 až 5 μς/σιΐ, 50 μg/doska) a potom sa blokovali kazeinovým blokátorom (Caseinblocker) (Pierce, Rockford, IL, ) . Prečistená biotinylovaná MMP2 (bMMP2, 3 až 5 nM) vo väzbovom pufri (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 0,5 mM MnCl₂) sa pridala na dosky v prítomnosti alebo v neprítomnosti testovaných zlúčenín, cyklických RGD alebo RAD peptidov alebo samotného pufrového vehikula. Kontrolné dosky neobsahovali integrín. Ako štandard sa použil biotinylovaný vitronektín (bVN, 1 μς/πιΐ) . Väzbový proteín sa detegoval pomocou monoklonálnej protilátky proti biotínu značenej HRP a kvantifikoval sa pri 450 nm roztokom 3,3',5,5'-tetrametylbenzidínu (TMB; substrát pre peroxidázu) (BioRad, Hercules, CA, USA).

Na určenie priamej väzby integrínu pomocou zlúčeniny 1 sa mikrotitračné dosky Immulon-4 (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA, USA) potiahli integrínmi a_vp3 a α₅βι, ktoré sa dôkladne blokovali a inkubovali s titráciou [¹⁴C]-značenej zlúčeniny 1 a potom sa pridalo 150 μΐ väzbového pufra obsahujúceho 0,1 % Tween-20 a všetka kvapalina sa odsala. Vysušené dosky sa separovali a na kvantifikáciu sa ponorili do kvapalného scintilačného koktailu BetaMax (ICN Biochemicals, Costa Mesa, CA, USA) . Z tejto väzbovej krivky sa zistila presaturovaná koncentrácia (3 μΜ) [¹⁴C]-značenej zlúčeniny 1 v prítomnosti a neprítomnosti 25-násobného molárneho nadbytku (75 μΐ) neznačenej zlúčeniny 1 alebo zlúčeniny 12 alebo 100 μΜ cyklického RGD alebo RAD peptidu. Kontrolou bol bVN, ktorý sa použil a detegoval tak, ako je už opísané.

Príklad 2

Degradačné testy bunkovej väzby MMP2 a [³H]-značeného kolagénu IV

Bunky CS-1 alebo bunky P3CS-1 sa inkubovali v adhéznom pufri fibroblastového základného média (FBM) doplneného 0,5 % albumínu bovinného séra (BSA), 0,4 mM MnCl2 a 10 μς/ιηΐ aprotinínu) obsahujúcom buď 4 nM prečistenej aktívnej MMP2 samotnej alebo v kombinácii s 10 μΜ zlúčeniny 1 alebo zlúčeniny 12 počas 45 minút pri teplote 37°C a potom sa premyli a pridali sa na dosky potiahnuté [³H]-značeným kolagénom IV. Dosky sa potiahli cez noc 50 μΐ 0,414 mCi/ml [³H]-značeného kolagénu IV (ICN Biochemicals, Costa Mesa, CA, USA) a premyli sa dôkladne, až kým rádioaktivita v získanom premývacom roztoku nedosiahlá pozadie. Alternatívne sa dosky ako kontrola spracovali tak, ako sa už uviedlo, v neprítomnosti MMP2 alebo roztoky MMP2 sa pridali priamo na dosky neobsahujúce bunky. Degradácia kolagénu IV sa kvantifikovala meraním rádioaktivity uvoľnenej v 50 μΐ kultivačného média, ako sa určilo pomocou kvapalného scintilačného počítača. Na určenie väzby biotinylovanej MMP2 na CS-1 bunky sa bunky suspendovali v adhéznom pufri a inkubovali sa s 12 nM bMMP2 počas 45 minút pri teplote 37°C v prítomnosti alebo neprítomnosti 10 μΜ zlúčeniny 1 alebo zlúčeniny 12. Bunky sa následne premyli, lyžovali sa a podrobili sa SDS-PAGE a imunoblottingu s monoklonálnou protilátkou proti biotínu.

Príklad 3

Test angiogenézy na kuracej chorioalontoickej membráne (CAM)

Angiogenéza sa určovala v podstate tak, ako sa už opísalo (Celí,' 85, 683-693 (1996); Celí, 92, 391-400 (1998). Po stimulácii 3 mg/ml základného fibroblastového rastového faktora (bFGF) sa CAM 10 dňového kuracieho embrya podrobila reakcii s 20 μΐ 3 μΜ zlúčeniny 1 alebo zlúčeniny 12. Tri dni po indukcii sa CAM kvantifikovali v slepom určení. CAM zo všetkých skupín sa združili, posekali nadrobno, extrahovali sa 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100 obsahujúceho proteázový inhibičný koktail značky COMPLETE bez EDTA (Boehringer, Mannheim, Nemecko) a potom sa analyzovali zymografiou.

Príklad 4

SDS-PAGE, imunoblotting a zymografia

Imunoblotting

Rovnaké množstvá proteínu sa separovali na SDS-PAGE za , ¹ >

redukujúcich podmienok a elektroblottovali sa na membránu Immobilon-P (Millipore, Bedford, MD, USA). Membrána sa blokovala a imobilizované proteíny sa detegovali inkubáciou s primárnou protilátkou špecifickou na antigén a následne sekundárnou protilátkou konjugovanou s HRP, ak je to potrebné. Pásy sa vizualizovali chemiluminiscentným substrátom PS-3 (Lumigen, Inc., Southfield, MI, USA).

Zymografia

Lyzáty kuracej CAM sa pripravili tak, ako sa už opísalo a rovnaké množstvá proteínu sa separovali v neprítomnosti redukčných činidiel alebo povarením na polyakrylamidových géloch zaliatych s 0,2 % želatínou. Gély sa premyli 2 % Tritonom X-100, následne sa dôkladne premyli vodou a cez noc sa inkubovali .pri teplote 37°C v kolagenázovom pufri (50 mM Tris, pH 7,4, 200 mM

NaCl, 10 mM CaC12). Želatinolytická aktivita sa vizualizovala vyfarbením gélov.0,5 % Coomassie modrou.

Príklad 5

Test rastu tumoru

Primárne tumory sa pestovali na CAM 9 dňových embryí implantáciou 5 x 10⁶ CS-1 buniek a inkubáciou počas 7 dní. V tomto bode sa 50 mg rezy týchto tumorov subkultivovali na čerstvých 9 dňových CAM, nechali sa implantovať 'počas 24 hodín a potom sa podrobili jednoduchej intravenóznej (IV) injekcii so 100 μΐ 100 μΜ testovanej zlúčeniny v Hankovom vyváženom fyziologickom roztoku (HBSS). Ako kontrola sa použil samotný pufor. Tumory sa inkubovali celkovo počas 10 dní, zobrali sa, upravili sa tak, aby neobsahovali nadbytočné stromálne tkanivo, určila sa hmotnosť za vlhka a podrobili sa histológii.

Príklad 6

Imunofluorescenčné testy

Náhle zmrazené CS-1 rezy tumoru sa fixovali 4 % paraformaldehydom a permeabilizovali sa 0,1 %,Tritonom X-100. Podiely sa blokovali 5 % bovinným sérovým albumínom (BSA) vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS), vyfarbili sa anti-vWF polyklonálnou protilátkou (pAb) a vizualizovali sa konjugovanou antikráličou sekundárnou protilátkou Alexa 568. Vzorky sa analyzovali na konfokálnom mikroskope MRC1024 (BioRad, Hercules, CA, USA). Hustota krvných ciev sa kvantifikovala pri 20-násobnom zväčšení na štyroch poliach na podiel a štyroch tumoroch na podmienku.

Príklad 7 (S)-Metyl 6-{[(terc-butyloxy)karbonyl]amino)-2-[4-(trifluórmetyl ) benzyioxykarbonyl ] hexanoát (zlúčenina 2)

Roztok N, N'-disukcínimidyl karbonátu (5,38 g, 21 mmol) v acetonitrile (150 ml) sa podrobil reakcii so 4-(trifluórmetyl)-benzylalkoholom (2,87 ml, 21 mmol) a Et₃N (5,8 ml, 42 mmol) a miešal sa pri teplote 25°C. Po 3 hodinách sa reakčná zmes pridala do banky obsahujúcej Ν-ε-Boc-lyzín metylester (4,2 g, 14 mmol) v acetonitrile a miešala sa počas ďalších 3 hodín. Rozpúšťadlo sa odparilo a zvyšok sa rozpustil v CH₂Cl2 (250 ml) a premyl sa 10 % vodnou HCI (2 x 200 ml) a nasýteným vodným NaHCO₃(200 ml) . Flash chromatograf ia (SiO₂, 3 : 1 CH₂Cl₂/EtOAc) poskytla 6,4 g (99 %) zlúčeniny 2 vo forme svetložltého oleja: [a]_D ²⁵-8,9 (c = 5,6, CH₃OH); ¹H-NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 7,57 (d, J = 8,1 Hz, 2H) , 7,39 (d, J = 8,1 Hz, 2H) , 5,70 (d, J = 7,9 Hz,

1H), 5,13 (m, 2H), 4,71 (m, 1H) , 4,28 (m, 1H) , 3,67 (s, 3H) ,

3,03 (m,	2H) ,	1,78 (m, 1H), 1,64	(m,	1H), 1,46-1,32 (m, 4H) ,
1,35 (s,	9H) ;	¹³C-NMR (CDCI3, 100	MHz)	δ 172,9, 156,2, 155,8,
140,4, 130,1	(q, J = 32,0 Hz),	127	,8, 125,3, 122,9 (q,
J = 270,0	Hz) ,	79,05, 65,8, 53,7,	52,3,	39,8, 31,7, 29,5, 28,4,
22,2; IR	(film)	v_raax 3357, 2952, 1790,	1745, 1524 cm'¹; FABHRMS
(NBA-Nal)	m/ z	463,2044 (M+H)⁺,	pre	C21H29F3N2O6 vypočítané

463,2056.

Príklad 8 (S)-Metyl 6-(2-{[(terc-butyloxy)karbonyl]amino}acetamido)-2-[4-(trifluórmetyl)benzyloxykarbonyl]hexanoát (zlúčenina 4)

Roztok zlúčeniny 2 (2,7 g, 5,8 mmol) v CH2CI2 (3 ml) sa podrobil reakcii so 4 N HCl/dioxán (10 ml) a miešal sa počas 20 minút pri teplote ·25°Ο. Rozpúšťadlo a nadbytok kyseliny sa odstránili pri zníženom tlaku a surová hydrochloridová sol sa rozpustila v DMF (50 ml), podrobila sa reakcii s N- [(terc-butyloxy) karbonyl]glycínom (1,0 g, 5,8 mmol) 1-[3-(dimetylamino)-propyl]-3-etylkarbodiimid hydrochloridom (EDCI) (1,2 g, 6,4 mmol) a i-Pr2Net (2,0 ml, 11,6 mmol) a miešala sa počas 12 hodín pri teplote 25°C. Reakčná zmes sa zriedila EtOAc (400 ml) a premyla sa 10 % vodnou HCl (3 x 250 ml) a nasýteným vodným NaHCO₃ (250 ml), vysušila sa (Na2SO₄) a odparila sa, pričom vzniklo 2,89 g (96 %) zlúčeniny 3 vo forme bielej tuhej peny: [ct]_D ²⁵ -10,4 (c = 2,5, CH3OH) ; ¹H-NMR (CDC13, 400 MHz) δ 7,59 (m, 2H), 7,45 (m, 2H), 6,19 (m, 1H), 5,51 (m, 1H), 5,13 (m, 2H), 4,32 (m, 2H), 3,74 (s, 3H), 3,73 (m, 2H) , 3,26 (m, 2H),

1,81-1,39 (m, 6H) , 1,44 (s, 9H) ; ¹³C-NMR (CD3OD, 100 MHz) δ 174,5, 172,0, 158,2, 158,1, 142,7, 130,8 (q, J= 31,8 Hz), 128,8,

126,3, 125,5 (q, J = 269,7 Hz), 80,5, 66, 5, 55, 3, 52,7, 44,6,

39,8, 32,1, 29, 8, 24,0; IR (film) v_max 3320, 2932, 1721, 1692, 1326 cm^-1; FABHRMS (NBA-CsI) m/z 652,1234 (M+Cs)⁺, pre C23H32F3N3O7 vypočítané 652,1247.

Príklad 9

6-[2-(Amino)acetamido]-2-[4-(trifluórmetyl)benzyloxykarbonyl]hexanoát hydrochlorid (zlúčenina 4)

Roztok zlúčeniny 3 (350 mg) v CH₂C1₂ (2 ml) sa podrobil reakcii so 4 N HCl/dioxán (5,0 ml) a miešal sa počas pri teplote 25°C. Po 0,5 hodine sa rozpúšťadlo a nadbytok kyseliny odstrá-

nili pri zníženom tlaku,	pričom vzniklo	300	mg (99%)	zlúčeniny
4 vo forme svetložltého	oleja: [a]_D ²⁵ -	10,4	(c = 3,0	, CH3OH) ;
¹H-NMR (CD₃OD, 400 MHz) δ	> 7,65 (d, J =	8,2	Hz, 2H),	5,18 (d,
J = 13,3 Hz, 1H), 4,16 (m,	1H), 3,70 (s,	3H) ,	3,65 (s,	2H), 3,21
(t, J = 7,1 Hz, 2H) , 1,84	(m, 1H)., 1,68	(m,	1H), 1,54	(m, 2H),

1,42 (m, 2H); ¹³C-NMR (CD₃OD, 100 MHz) δ 174,5, 167, 1, 158,2,

142,8, 130,8 (q, J = 31,8 Hz), 128,8, 126, 3, 125,5 (q, J = 270,1 Hz), 66, 5, 55,4, 52,7, 41,5, 40,2, 32,1, 29, 6, 24,1;

IR (film) v_max 3317, 2954, 1718, 1684, 1530, 1327 cm'¹; MALDIFTMS (DHB) m/z 442,1586 (M+Na)⁺, pre Ci₈H₂₄F3N₃O5 vypočítané 442,1566.

Príklad 10

N,N¹-Bis{ [5 — (S) — (metoxykarbonyl)-5-( [4- (trifluórmetyl)benzyloxykarbonyl] aminojpentyl]karboxamidometyl}benzén-l,3-dikarboxamid (zlúčenina 5)

Roztok zlúčeniny 4 (2,05 g, 4,0 mmol) v CH₂C1₂ (3,0 ml) sa podrobil reakcii so 4 N HCl/dioxán (10,0 ml) a miešal sa počas 20 minút pri teplote 25°C. Rozpúšťadlo a nadbytok kyseliny sa odstránili pri zníženom tlaku a surová hydrochloridová sol sa suspendovala v DMF (40 ml), podrobila sa reakcii s izoftaloyl dichloridom (400 mg, 2,0 mmol) a i-Pr₂NEt (1,4 ml, 8,0 mmol) a miešala sa počas 1 hodiny pri teplote 25°C. Reakčná zmes sa zriedila EtOAc (400 ml) a premyla sa 10 % vodnou HCI (3 x 200 ml) a 5 % vodným Na₂CO₃ (200 ml), vysušila sa (Na₂SO₄) a odparila sa. Flash chromatografia (SiO2, 1 ; 4,5 : 4,5 MeOH/CH₂Cl₂/EtOAc) poskytla 1,30 g (68 %) zlúčeniny 5 vo forme žltého prášku: [a] _D ²⁵ -6,4 (c = 2,1, CH₃OH) ; ^-NMR (CDC1₃, 400 MHz) δ 8,29 (m, 2H) , 8,11 (m, 2H) , 7,87 (m, 4H) , 7,53 (m,

2H), 7,39 (m, 2H) , 6,88 (m, 2H) , 5,94 (m, 2H) , 5,08 (m, 4H) ,

4,30 (m, 2H), 4,01 (m, 4H) , 3,70 (s, 6H), 3,23 (m, 4H), 1,77 (m, 2H), 1,67 (m, 2H) , 1,51 (m, 4H) , 1,37 (m, 4H) ; ⁿC-NMR (CD₃OD,

100 MHz) δ 174,6, 171,5, 169,3, 158,3, 142,7, 135,3, 131,6, 130,8

(Ψ	J =	32,2	Hz) ,	129,8,	128,	8, 127	,6, 126,3,	125,5 (q,
J =	269,2	Hz) ,	66,5,	55,4,	52,7,	44,1,	40,0, 32,1,	29,8, 24,1;
IR	(film)	^vmax	3305,	2951,	1716,	1651,	1538, 1327 cm'¹; FABHRMS
(NBA-CsI)	m/ Z	1101	, 2398	(M+Cs)	pre	C₄₄H₅oFgN60i2	vypočítané

1101,2445.

Príklad 11

N,N¹-Bis{[5-(S)-karboxy-5- { [4 -(trifluórmetyl)benzyloxykarbonyl]aminojpentyl]karboxamidometyl}benzén-l,3-dikarboxamid (zlúčenina 1).

Roztok zlúčeniny 5 (0,95 g, 0,98 mmol) v zmesi THF/MeOH (8,0 ml, 3 : 1) sa podrobil reakcii s LiOH.H₂O (165 mg, 3,9 mmol) v H₂O (2,0 ml) a miešal sa pri teplote 0°C. Po 2 hodinách sa reakčná zmes rozložila pridaním 10 % vodnej HCl (20 ml) a zmes sa extrahovala EtOAc (3 x 50 ml) . Organické vrstvy sa spojili a premyli sa nasýteným vodným NaCl (50 ml), vysušili sa (Na₂SO₄) a odparili sa, čím vzniklo 0,86 g (93 %) zlúčeniny 1 vo forme bieleho prášku. [a]_D ²⁵. -0,6 (c = 3,2, CH3OH) , . ¹H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 8,40 (m, 1H) , 8,03 (dd, J = 1,8 a 7,8 Hz, 2H) , 7,62 4H) , 7,53 (t, J = 6, 1 Hz, 1H) , 7,51 (d, J = 13,3 Hz, 2H), 5,13 (m, 2H), 4,00 (s, 4H) , 3,22

J = 6,6 Hz, 4H), 1,85 (m, 2H) , 1,70 (m, 2H), 1,55 (m, 4H) , 1,37 (m, 4H) ; ¹³C-NMR (CD₃OD, 100 MHz) δ 175,9, 171,6, 169, 4, 158,4, 135,4, 131,6, 130,5 (q, J =31,8 Hz), 129,8, 128,8, 127,7,

126,3, 125,6 (q, J = 268,7), 66, 5, 53, 3, 44,2, 40, 1, 32,2, 29,8, (d, (d, (t, (d, J = 8, 1 Hz,

J = 8,1 Hz, 4H), 5,16 J = 13,3 Hz, 2H), 4,12

24,2; IR (film)

3334, 2933, 1718, 1646, 1631, 1528 cm

MALDIFTMS (DHB) m/z 963,2953 (M+Na)⁺, pre C₄₂H₄₆F₆N₆O₁₂ vypočítané

963,2976.

Príklad 12

Syntéza [¹⁴C]-značenej zlúčeniny 1

Roztok [1—¹⁴C]glycínu (American Radiolabeled Chemicals, 10 mCi, 55 mCi/mmol, 0,018 mmol) v 0,1 N HCl sa preniesol do 4 ml fiolky a rozpúšťadlo sa odparilo prúdom N₂. Výsledný zvyšok sa podrobil reakcii s roztokom NaHCO3 (4,6 mg, 0,054 mmol) v H₂O (0,25 ml) a roztokom di-terc-butyl dikarbonátu (10,5 ml, 0,045 mmol) v THF (0,25 ml) a miešal sa pri teplote 25°C. Po 12 hodinách, kedy sa roztok stal homogénnym,, sa zriedil H₂O (1,0 ml) a premyl sa dietyléterom (2 x 1,0 ml). Vodný roztok sa potom okyslil pridaním 10 % vodnej HCl (0,5 ml) a extrahoval sa etylacetátom (4 x 1,0 ml). Spojené extrakty sa vysušili (Na₂SO₄) a odparili sa prúdom N₂, pričom vzniklo 2,9 mg (92 %) [1-¹⁴C]-N-Boc-glycínu vo forme bieleho filmu.

Roztok zlúčeniny 2 (50 mg, 0,11 mmol) v CH₂C1₂ (1 ml) sa podrobil reakcii so 4 N HCl/dioxán (1 ml) a miešal sa 1 hodinu pri teplote 25°C. Reakčná zmes sa zriedila etylacetátom (25 ml) a premyla sa 10 % vodným Na₂CO₃ (25 ml) a nasýteným vodpým NaCl (25 ml), vysušila sa (Na₂SO₄) a odparila sa, pričom vznikol deprotegovaný lyzín vo forme bezfarebného filmu. Časť tohto voľného amínu (4,5 mg, 0,013 mmol) v DMF (0,2 ml) sa pridala do 4 ml fiolky obsahujúcej [1-¹⁴C]-N-Boc-glycín (1,5 mg, 0,0085 mmol) a podrobila sa reakcii s í-Pr₂Net (2 ml) a roztokom EDCI (5,0 mg, 0,026 mmol) v dichlórmetáne (0,1 ml) a miešala sa počas 3 hodín pri teplote 25°C. Reakčná zmes sa zriedila EtOAc (2,0 ml), premyla sa 10 % kyselinou chlorovodíkovou (3 x 1,0 ml), nasýteným vodným Na₂CO₃ (1,0 ml) a nasýteným vodným NaCl (1,0 ml) a odparila sa. Preparatívna tenkovrstvová chromatografia (PTLC) (Sio2, EtOAc/CHCl₃ 1 : 1) poskytla 1,8 mg (41 %) [¹⁴C]-značenej zlúčeniny vo forme bieleho filmu.

[¹⁴C]-Značená zlúčenina 3 (1,8 mg, 3,5 μπιοί) v 4 ml fiolke sa podrobila reakcii o 4 N HCl/dioxán (0,25 ml) a reakčná zmes sa miešala počas 0,5 hodiny pri teplote 25°C. Rozpúšťadlo a nadbytok kyseliny sa odparili prúdom N₂ a zvyšná surová hydrochloridová sol sa podrobila reakcii s izoftaloyl dichloridom (0,355 mg, 0,0018 mmol) v CH₂C1₂ (0,1 ml) a i-Pr₂NEt (2,4 ml, 0,014 mmol) v CH₂C1₂ (0,05 ml). Po 3 hodinách pri teplote 25°C sa reakčná zmes priamo prečistila pomocou PTLC (SiO₂, MeOH/CHCl₃/EtOAc 1:9:9), pričom vzniklo 1,2 mg (71 %) Poznačenej zlúčeniny 5.

Roztok [¹⁴C]-značenej zlúčeniny 5 (1,2 mg) v zmesi THE/MeOH (0,2 ml, 1 : 1) sa podrobil reakcii s roztokom LiOH.H₂O (0,4 mg) v H₂O (0,05 ml) pri teplote 0°C a miešal sa 1 hodinu. Reakčná zmes sa zriedila metanolom (1,0 ml) a podrobila sa reakcií s kyslou katiónovou výmennou živicou Dowex 50WX-8 (200 mg) a miešala sa 1 minútu. Zmes sa potom prefiltrovala cez vatu a filtrát sa odparil, pričom vzniklo 1,1 mg (94 %) [¹⁴C]-značenej zlúčeniny 1 s relatívnou aktivitou približne 110 mCi/mmol. Táto zlúčenina a všetky jej syntetické intermediáty boli podlá tenkovrstvovej chromatografie (TLC) identické so zodpovedajúcim neznačeným materiálom.

Príklad 13 (S) -Metyl 6- [2- (benzoylamino) acetamido] -2- [4- (trifluórmetyl) benzyloxykarbonyl]hexanoát (zlúčenina 6)

Roztok zlúčeniny 3 (44 mg, 0,085 mmol) v CH₂C1₂ (1,0 ml) sa podrobil reakcii so 4 N HCi/dioxán (1,0 ml) a miešal sa počas 1 hodiny pri teplote 25°C. Rozpúšťadlo a nadbytok kyseliny sa odstránili prúdom N₂ a surová hydrochloridová sol sa suspendovala v CH₂C1₂ (0,8 ml) a podrobila sa reakcii s i-Pr₂NEt (30 μΐ, 0,17 mmol) a benzoylchloridom (11 μΐ, 0,094 mmol) a miešala sa pri teplote 25°C. Po 2 hodinách sa reakčná zmes priamo prečistila flash chromatografiou (SiO₂, 1:9:9 MeOH/CH₂Cl₂/EtOAc), pričom vzniklo 40 mg (90 %) zlúčeniny 6 vo forme bieleho prášku: [a]_D ²⁵ 2,7 (c = 0,70, CHC13), ^XH-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 7,86 (m, 2H), 7,64 (m, 2H) , 7,53 (m, 3H) , 7,45 (m, 2H) , 5,16 (m, 2H) , 5,16 (dd, J = 7,3 a 3,8 Hz, 1H) , 3,69 (s, 3H), 3,21 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 1,81 (m, 1H), 1,69 (m, 1H) , 1,53 (m, 2H), 1,42 (m, 2H) ; ¹³C-NMR (CDC13, 100 MHz) δ 172,8, 169,5, 168,4, 156\ 3, 142,3, 132,9, 131,4, 129,4 (q, J =32,2 Hz), 128,0, 127,1,

126,7, 126,3 (q, J = 269,0), 124,8, 65, 1, 53,6, 51,6, 42,6,

38,4, 30,6, 28,1, 22,2; IR (film) v_max 3303, 2923, 1713, 1651, 1533 cm'¹; FABHRMS (NBA-CsI) m/z 656, 0961 (M+Cs)⁺, pre C₂₅H25F3N₃O₆ vypočítané 656,0985.

Príklad 14

Kyselina (S) -6-[2-(benzoylamino) acetamido]-2-[4-(trifluórmetyl)-benzyloxykarbonyl]hexánová (zlúčenina' 7)

Roztok zlúčeniny 6 (17 mg, 0,032 mmol) v zmesi THF/MeOH (0,4 ml, 3:1) sa podrobila reakcii s LiOH.H₂O (2,0 mg, 0,49 mmol) rozpusteného v H₂O (0,1 ml) a miešal sa počas 2 hodín pri teplote 0°C. Reakčná zmes sa rozložila pridaním koncentrovanej vodnej HCI (5 μΐ) , zriedila sa EtOAc (30 ml) a premyla sa

vodou	(2	x 15 ml). Vysušenie	(Na₂SO₄) a odparenie	poskytlo
14,5 mg	(	88 %) zlúčeniny 7 vo	forme bieleho prášku: [	a]_c ²⁵ +2,2
(c = 0,	6,	CH3OH), ^-NMR (CD3OD,	, 400 MHz) Ô 7,86 (d, J	= 7,2 Hz,
2H), 7,	62	(d, J = 8,2 Hz, 2H),	7,54 (d, J = 8,2 Hz,	2H) , 7,53
(m, 1H)	/	7,43 (m, 2H), 5>17	(d, J = 13,2 Hz, 1H) ,	5,14 (d,
J = 13,:	2 Hz, 1H), 4,14 (m, 1H),	4,04 (s, 2H), 3,25 (m,	2H), 1,88
(m, 1H)	1	1,71 (m, 1H), 1,52	(m, 2H), 1,44 (m, 2H)	) ; ¹³C-NMR

(CD3OD, 125 MHz) δ 175,9, 171,7, 170,5, 158,4, 142,9, 135,1,

132,9, 130,9 (q, J = 32,4 Hz), 129,5, 128,9, 128,5, 126,3, 125,7 (q, J = 269,0), 66,5, 55, 4, 44, 1, 40, 1, 32,3, 29,9, 24,2; IR (film) v_max 3318, 2935, 1713, 1644, 1538, 1326 cm'¹; MALDIFTMS (DHB) m/z 532,1672 (M+Na)⁺, pre C₂4H₂₆F₃N₃O6 vypočítané 532, 1671.

Príklad 15 (S)-Metyl 6-(2-{2—[(karboxymetyl)metoxy]acetamido}acetamido)]-2-[4-(trifluórmetyl)benzyloxykarbonyl]hexanoát (zlúčenina 8)

Roztok zlúčeniny 3 (57 mg, 0,11 mmol) v CH₂CÍ2 (1 ml) sa podrobil reakcii so 4 N HCl/dioxán (2 ml) a miešal sa počas 1 hodiny pri teplote 25°C. Rozpúšťadlo a nadbytok kyseliny sa odstránili prúdom N2 a zvyšok sa rozpustil v DMF (1 ml) a podrobil sa reakcii s kyselinou glykolovou (16 mg, 0,12 mmol), EDCI (23 mg, 0,12 mmol) a i-Pr₂NEt (42 μΐ, 0,24 mmol) a miešal sa pri teplote 25°C. Po 4 hodinách sa reakčná zmes vyliala do oddeiovacieho lievika obsahujúceho EtOAc (50 ml) a premyla sa 10 % vodnou HCI (3 x 30 ml) a nasýteným vodným NaCl (30 ml), vysušila sa (Na2SO4) a odparila sa, pričom vzniklo 45 mg (77 %) monokyselinovej zlúčeniny 8 vo forme bieleho prášku: [a]_D ⁵ -7,5 (c = 1,8, CH₃OH) , ¹H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 7,65 (d, J = 5,2 Hz,

2H), 7,54 (d, J = 5,3 Hz, 2H) , 5,18 (d, J = 9,0 Hz, 1H) , 5,15 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 4,42 (s, 2H) , 4,16 (m, 1H) , 4,11 (s, 2H) , 3,87 (s, 2H) , 3,70 (s, 3H) , 3,20 (t, J = 4,5 Hz, 2H) , 1,81 (m, 1H), 1,68 (m, 1H), 1,53 (m, 2H) , 1,39 (m, 2H) ; ¹³C-NMR (CD3OD, 100 MHz) δ 174,5, 173,7, 172,5, 171,2, 158,2, 142,6, 130,9 (g,

J = 33,2 Hz), 128,2, 126,2, 125,4 (q, J = 270,1 Hz), 71,3, 69,0,

66,5, 55,3, 52,7, 42,9, 39,9, 32,0, 29,7, 23,9; IR (film) v_ma;í3315,' 2931, 1725, 1661, 1538, 1326 cm'¹; MALDIFTMS m/z 558, 1686 (M+Na)⁺, pre C₂₂H₂₃F₃N3O₉ vypočítané 558,1673.

Príklad 16 (S)-Metyl 2-(benzoylamino)-6-{[(terc-butyloxy)karbonyl]amino}hexanoát (zlúčenina 9)

Roztok Ν-ε-Boc-lyzín metylester hydrochloridu (5,05 g, 17 mmol) v CH₂C1₂ (100 ml) sa podrobil reakcii s benzoylchloridom (2,0 ml, 17 mmol) a i-Pr₂NEt (5,9 ml, 34 mmol) a miešal sa pri teplote 25°C. Po 1 hodine sa reakčná zmes premyla 10 % vodnou

HCI (100 ml), vysušila sa (Na₂SO₄) a odparila sa na biely prášok, ktorý sa prekryštalizoval z CH₂Cl2/hexány, pričom vzniklo 4,8 g (78 %) zlúčeniny 9 vo forme bielej kryštalickej látky s t. t. 108-109°C: [a]_D ²⁵ -13,2 (c = 5,8, CH₃OH) , ^-NMŔ (DMSO-d₆,

400 MHz) δ 8,72 (d, J = 7,4 Hz, 1H) , 7,89 (m, 2H), 7,55 (m, 1H),

7,48 (m, 2H), 6,88 (t, J = 5,2 Hz, 1H) , 4,42 (m, 1H) , 3,64 (s,

3H), 2,93 (m, 2H) , 1,81 (m, 2H) , 1,41 (m, 4H) , 1,37 (s, 9H);

¹³C-NMR (DMSO-de, 100 MHz) δ 172,9, 166, 7, 155,6, 133,8, 131,5,

128,3, 127,6, 77,4, 52,8, 51,9, 40,8, 30,2, 29,2, 28,3, 23,2; IR (film) v_max 3335, 2933, 1740, 1690, 1647, 1534 cm^-1; MALDIFTMS (DHB) m/z 387,1895 (M+Na)⁺, pre C19H25N2O5 vypočítané 387,1890.

Príklad 17 (S)-Metyl 2-(benzoylamino)-6-(2-([(terc-butyloxy)karbonyl]-amino}acetamido)hexanoát (zlúčenina 10)

Roztok zlúčeniny 9 (4,4 g, 12,1 mmol) v CH₂C1₂ (5,0 ml) sa podrobil reakcii so 4 N HCl/dioxán (10,0 ml) a miešal sa počas 3 hodín pri teplote 25°C. Rozpúšťadlo a nadbytok kyseliny sa odstránili pri zníženom tlaku a zvyšok sa rozpustil v DMF (150 ml) a podrobil sa reakcii s N-[(terc-butyloxy)karbonyl]-glycínom (2,2 g, 12,1 mmol), PyBrOP (7,0 g, 15 mmol) a i-Pr₂NEt (8,4 ml, 48,4 mmol) a miešal sa pri teplote 25°C. Po 12 hodinách sa reakčná zmes zriedila EtOAc (500 ml) a premyla sa 10 % vodnou HCI (3 x 250 ml), 5 % vodným Na₂CO₃ (250 ml) a nasýteným vodným NaCl (250 ml) , vysušila sa (Na₂SO₄) a odparila sa. Flash chromatografia (Sio2, EtOAc) poskytla 4,6 g (90 %) zlúčeniny 10

vo	forme bezfarebného oleja:	[a]_D ²⁵ -10,3	(c =	0,30, CH₃OH),
^ľH-	NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 7,84	(m, 2H) ,	7,51	(m,	1H) , 7,44 (m,
2Hj	, 6,91 (d, J = 7,6 Hz, 1H),	6,35 (br	t, J	= ⁵'	3 Hz, 1H), 5,22
(m,	1H), 4,76 (m, 1H) , 3,76	(s, 3H),	3,70	(br	t, J = 6,3 Hz,
4H)	, 3,26 (m, 2H) , 1,95 (m,	1H), 1,84	(m,	1H) ,	1, 57-1,30 (m,

4H), 1,41 (s, 9H); ¹³C-NMR (CDCI3, 100 MHz) δ 173,0, 169,7, 167,3,

156,5, 133,7, 131,8, 128,6, 127,2, 81,8, 52,5, 52,3, 44,3, 38,7,

32,0, 28,9, 28,3, 22,4; IR (film) v_raax 3318, 2954, 1718, 1647,

1535, 1491 cm’¹; MALDIFTMS m/z 444,2108 (M+Na)⁺, pre C₂iH₃₁N₃O₆ vypočítané 444,2110.

Príklad 18

N, N¹-Bis(N-{5-(S)-[(benzoyl)amino]-5-(metoxykarbonyl)pentyl}-karboxamidometyl)benzén-1,3-dikarboxamid (zlúčenina 11)

Roztok zlúčeniny 10 (4,4 g, 10,4 mmol) v CH2CI2 (3 ml) sa podrobil reakcii so 4 N HCl/dioxán (20 ml) a miešal sa počas 1 hodiny pri teplote 25°C. Rozpúšťadlo a nadbytok kyseliny sa odstránili pri zníženom tlaku a zvyšok sa rozpustil v CH₂C1₂(50 ml) a podrobil sa reakcii s Et₃N (5,8 ml, 42 mmol) a izoftaloyl dichloridom (1,06 g, 5,2 mmol) a miešal sa pri teplote 25°C. Po 16 hodinách sa reakčná zmes premyla 10 % vodnou HCl (50 ml) a odparila sa na žltý olej. Flash chromatografia (SiO₂, 5:5:2 EtOAc/CH₂Cl₂/MeOH) poskytla 2,5 g (62 %) zlúčeniny 11 vo forme bielej tuhej peny: [ct]_D ²⁵ -8,0 (c = 4,8, CH₃OH), ^ľH-NMR (CD3OD, 500 MHz) δ 8,37 (s, 1H) , 8,00 (m, 2H) , 7,84 (m, 4H) , 7,52 (m, 3H) , 7,44 (m, 4H) , 4,58 (m, 2H) , 3,99 (dva s, 4H) , 3,72 (s, 6H), 3,22 (m, 4H) , 1,99-1,83 (m, 4H) , 1,59-1,40 (m, 8H) ; ¹³C-NMR (CD₃OD, 100 MHz) δ 174,2, 171,5, 170,2, 169,0, 135,0, 134,8,

132.8, 131,5, 129,4, 128,4, 127,6, 54,3, 52,7, 44,2, 40,1, 31,7,

29.8, 24,3; IR (film) v_maz 3304, 2950, 1738, 1650, 1644, 1538 cm'¹; MALDIFTMS m/z 795,3332 (M+Na)⁺, pre C^oHísNeOio vypočítané

795,3330.

Príklad 19

N,N¹-Bis(N-{5-(S)-[(benzoyl)amino]-5-(karboxy)pentyl}karboxamidometyl )benzén-1,3-dikarboxamid (zlúčenina 12)

Roztok zlúčeniny 11 (1,1 g, 1,4 mmol) v zmesi MeOH/THF (20 ml, 1:1) sa podrobil reakcii s LiOH.H₂O (240 mg, 5,7 mmol) rozpusteného v H₂0 (10 ml) a miešal sa počas 1 hodiny pri teplote

0°C. Po 1 hodine sa reakčné rozpúšťadlo odparilo a zvyšok sa opakovane rozpustil v H₂0 (20 ml) a ochladil sa na teplotu 0°C.

Pridala sa koncentrovaná vodná HCI (0,47 ml, 5,7 mmol) a vylúčená tuhá látka sa odfiltrovala a premyla sa vodou, pričom vzniklo 0,78 g (73 %) zlúčeniny 12 vo forme bieleho prášku:

[a]_D ²⁵ -2,6	(c = 0, 35, CH₃OH),	^XH-NMR (CD3OD, 400 MHz)	δ 8,38 (m,
1H), 8,02	(m, 2H) , 7,84 (m,	4H), 7,55-7, 48 (m, 3H) ,	7,42 (m,
4H) , 4,56	(m, 2H), 4,00 a	3,99 (dva s, 4H) , 3,26	(m, 4H),
1,99-1,83	(m, 4H) , 1,63-1,45	(m, 8H) ; ¹³C-NMR (CD₃OD,	100 MHz) δ
175,5, 171	,9, 170,4, 169,2,	135,0, 134,9, 132,8, 131	,7, 129,8,
129,5, 128	,5, 127,7, 54,4,	44,0, 40,2, 31,7, 29,6,	24,3; IR
(film) v_max	3280, 2923, 1718,	1641, 1536 cm^-1; MALDIFTMS	(DHB) m/z

767,3005 (M+Na)⁺, pre C38H₄₄N₆Oio vypočítané 767,3017.

Výsledky a diskusia

Zlúčenina 1 preruší interakciu medzi integrinom α_νβ3 a MMP2 nezávislú od RGD

Nedávny objav, že karboxyterminálna hemopexínu podobná doména MMP2 môže interferovať s MMP2 viažucim sa na integrín α_νβ₃, a teda blokovať angiogenézu, nás inšpiroval k hľadaniu organických inhibítorov tejto interakcie, ktoré by mohli byť viac prístupné terapeutickému podaniu. S cieľom identifikovať špecifický inhibítor väzbovej interakcie medzi MMP2 a integrinom α_νβ₃ sa uskutočnili väzbové testy s receptorom v tuhej fáze s imobilizovanými integrínmi a biotinylovanou MMP2. Zistilo sa, že väzba prečistenej MMP2 v tomto systéme je úplne nezávislá od RGD, ako sa potvrdilo neprítomnosťou účinku cRGDfV na väzbu MMP2 na integrín α_νβ3, dokonca aj keď tento peptid inhibuje interakciu integrínu α_νβ3 s jeho extracelulárnym matrixovým ligandom, vitronektínom (VN; obr. 2A). Dôležité je, že väzba MMP2, nie však VN, sa kompletne zruší zlúčeninou 1, čo demonštruje špecifickosť zlúčeniny 1 na interakciu medzi MMP2 a integrinom α_νβ3· Okrem toho väzba medzi MMP2 a tkanivovým inhibítorom metaloproteinázy (ΤΙΜΡ2) sa zlúčeninou' 1 neinhibuje, čo podporuje tvrdenie, že účinok tejto zlúčeniny 1 je obmedzený na väzbovú interakciu medzi MMP2 a integrínom a_vp3, a demonštruje rozdiel medzi väzbovými miestami pre doménu MMP2 PEX na TIMP2 a integrín α_νβ3· Je dôležité poznamenať, že ani kontrolná zlúčenina, ani kontrolný peptid ČRADfV neinterferujú s väzbou MMP2 na integrín α_νβ3· (obr. 2A).

Zlúčenina 1 sa priamo viaže na integrín α_νβ3 a nie na MMP2

Na ďalšie pochopenie mechanizmu akcie zlúčeniny 1, uskutočnili sa dodatočné väzbové testy s receptorom na tuhej fáze s imobilizovaným integrínom a [¹⁴C]-značenou zlúčeninou 1 alebo biotinylovaným VN ako kontrolou. Ako je zrejmé z obr. 2B, zlúčenina 1 sa priamo viaže na integrín α_νβ3 vo väzbovom teste s receptorom v tuhej fáze. Táto interakcia závisí od dávky, je saturovatelná a špecifická, demonštrujúc minimálnu interakciu zlúčeniny 1 s nepríbuzným kontrolným integrínom α₅βι (obr. 2B) . Skutočne sa pozorovala nepatrná väzba na integrín αββι pri vyšších koncentráciách zlúčeniny (údaje sa neuvádzajú) . Okrem toho sa nepozorovala žiadna väzba zlúčeniny 1, keď sa mikrotitračná doska potiahla s MMP2 (údaje sa neuvádzajú), čo naznačuje, že účinky pozorované pri väzbovom teste MMP2/integrín α_νβ3 sú spôsobené väzbou zlúčeniny 1 na integrín α_νβ3· Dôležité je, že táto interakcia bola inhibovaná v prítomnosti 25-násobného molárneho nadbytku neznačenej zlúčeniny 1, ale nie v prítomnosti podobnej kontrolnej zlúčeniny 12 (obr. 2C). Okrem toho zlúčenina 1 sa viazala na integrín α_νβ3 RGD-nezávislým spôsobom, ako je preukázané neschopnosťou cRGDfV peptidu inhibovať interakciu rádioznačenej zlúčeniny 1 s integrínom α_νβ3, aj keď cRGDfV kompletne odstraňuje väzbu bVN na imobilizovaný integrín v tom istom systéme (obr. 2D) . Kontrolný peptid cRADfV sa ukázal ako kontrola pre špecifickosť väzbovej inhibície. Teda zlúčenina 1 viazaná na integrín α_νβ3 sa vyznačuje porovnateľnou špecifickosťou, selektivitou a nedostatkom citlivosti na inhibíciu RGD než na MMP2.

Je zaujímavé, že zlúčenina 6, zlúčenina všeobecného vzorca II, kde Ά je atóm vodíka, n je 0, X¹ je p-trifluórmetylová skupina, a R¹ je metylová skupina, bola vo väzbovom teste v tuhej fáze o niečo menej aktívna než zlúčenina 1, zatiaľ čo zlúčenina 8, ktorá neobsahuje fenylovú skupinu kondenzovanú s glycínovou jednotkou, bola inaktívna. Tento výsledok demonštruje, že fenylový kruh je hlavným rysom inhibičnej aktivity inhibičných zlúčenín všeobecného vzorca II, a ďalej demonštruje, že aspoň jedna substituovaná glycyllyzínová jednotka je nevyhnutná na antiangiogenetickú aktivitu tejto triedy inhibítorov.

Bunkou sprostredkovaná degradácia kolagénu IV prostredníctvom MMP2 je blokovaná zlúčeninou 1

Prevencia väzby MMP2 na integrín a_vp3 na melanómových bunkách sa už dokázala s cielom inhibovať bunkou sprostredkovanú degradáciu kolagénu IV spôsobom závislým od integrínu α_νβ3· Preto sme určili, či by melanómové bunky exprimujúce alebo postrádajúce integrín α_νβ3 mohli využiť aktivovanú MMP2 na degradáciu imobilizovaného [³H]-značeného kolagénu IV. Dôležité je, že ani bunka neprodukuje detegovatelné množstvá MMP2 endogénne. Kým oba typy buniek boli schopné určitej hladiny bazálnej degradácie kolagénu, iba B₃-transfekované CS-1. bunky boli schopné využiť exogénnu MMP2, pričom sa demonštrovalo významne väčšie uvoľnenie rádioaktivity substrátu do kultivačného média po preinkubácii s prečistenou MMP2 (obr. 3A) . Táto zvýšená degradácia substrátu ako odpoveď na liečbu s MMP2 sa špecificky odstránila inkiúziou zlúčeniny 1, zatiaľ čo zlúčenina 12 mala nepatrný účinok (obr. 3A). Významné je, že účinok zlúčeniny 1 na bunkou sprostredkovanú degradáciu kolagénu nebol spôsobený priamou inhibiciou aktivity MMP2, pretože prečistená aktívna MMP2 v neprítomnosti buniek je stále schopná degradovať imobilizovaný [³H]-značený kolagén IV bez ohľadu na prítomnosť alebo neprítomnosť buď zlúčeniny 1 alebo zlúčeniny 12. Na demonštráciu, že redukovaná bunkou sprostredkovaná degradácia kolagénu pozorovaná na obr. 3A bola výsledkom inhibície interakcie MMP2 s integrínom α_νβ₃ zlúčeninou 1 na povrchu bunky, CS-1 bunky a ich proťajšok obsahujúci integrín α_νβ₃ sa preskúmali vo väzbovom teste biotinylovanej MMP2. Ako sa očakávalo, β₃-ηβς3ίίνηθ CS-1 bunky boli schopné viazať určitú hladinu MMP2, avšak ich kapacita pritom nebola znížená prítomnosťou . jednej alebo druhej zlúčeniny, (obr. 3B) . Naproti tomu β₃0δ-1 bunky viazali významne väčšie množstvá MMP2, a táto zvýšená väzba MMP2 sa špecificky potlačila zlúčeninou 1. Skutočne, po upravení pre nanášanie dráh, ako sa demonštrovalo farbením s monoklonálnou protilátkou proti aktínu, zlúčenina 1 efektívne znížila väzbu MMP2 na β^Ξ-1 bunky na hladinu pozorovanú v neprítomnosti α_νβ₃ (napríklad parentálne CS-1 bunky) (obr. 3B, dráha 2).

Zlúčenina 1 prerušuje angiogenézu in vivo bez potlačenia aktivácie MMP2. Potlačenie interakcie integrín α_νβ₃/ΜΜΡ2 exogénne aplikovanou rekombinantnou MMP2 PEX doménou sa už ukázalo v minulosti s cieľom oslabiť angiogenézu vo zvieracích modeloch. Preto sme preskúmali účinok zlúčeniny 1 na rastovým faktorom indukovanú angiogenézu na 10 dňovom kuracom CAM. Aplikácia zlúčeI niny 1 na CAM, ktorá bola stimulovaná základným fibroblastovým rastovým faktorom (bľGF) takmer úplne zrušila vývoj nových krvných ciev ako odpoveď na tento stimul (obr. 4A a 4B) , zatial čo kontrolná zlúčenina 12 bola z tohto hľadiska neefektívna. Dôležité je, že zrušenie angiogenetickej infiltrácie ako odpoveď na zlúčeninu 1 nebolo spojené s potlačením aktivácie MMP2, keďže sa v tkanivách CAM z liečených a neliečených embryí detegovali ekvivalentné hladiny aktívnej MMP2 (62 kDa) (obr. 4C) . To je v silnom kontraste s účinkom exogénnej MMP2 PEX domény, ktorá potláča aktiváciu MMP2 v tomto systéme. Tieto údaje sú zhodné s predstavou, že zlúčenina 1. špecificky interferuje s väzbou MMP2 na integrín α_νβ₃ bez toho, aby mala dopad na priamu aktiváciu MMP2. Skutočne, celkové hladiny MMP2 pozorované v lyzátoch CAM tiež neboli ovplyvnené liečením zlúčeninou 1, s vylúčením poten43 ciálneho účinku na hladinu expresie MMP2 v angiogenetických tkanivách (obr. 4C). Tieto výsledky naznačujú, že antiangiogenetické účinky zlúčeniny 1 sú pravdepodobne spôsobené potlačením väzby MMP2 na integrín α_νβ3 na povrchu bunky, ako je znázornené na obr. 3B. Tieto údaje takisto indikujú, že MMP2, ktorá je úplne aktivovaná, sa nedá využiť na angiogenézu v tomto systéme, iba ak by bola spojená s integrínom α_νβ₃ na povrchu bunky.

Zlúčenina 1 ruší rast tumoru in vivo

Zistilo sa, že prerušenie angiogenézy inhibuje rast tumoru , v mnohých systémoch. Výsledné, blokovanie invazívnych vlastností endotelových buniek inhibíciou MMP potláča angiogenézu ako aj rast tumoru vo zvieracích modeloch. Veľa inhibítorov MMP sa ukázalo sľubných ako antiangiogenetické činidlá u človeka. Preto sme stanovili či inhibícia angiogenézy asociovaná s blokádou interakcií MMP2/integrín α_νβ3 pozorovaná v tejto štúdii mohla byť dostatočná na potlačenie rastu G^3-negatívneho tumoru. Použitie c^3-negatívneho tumoru dovoľuje selektívne stanovenie účinku zlúčeniny 1 na vaskulárny α_νβ3· Ako je ukázané na obr. 5A, rast transplantovaných c^3-negatívnych ' tumorov CS-1 melanómu nakuracom CAM bol významne spomalený jednoduchou intravenóznou (IV) injekciou zlúčeniny 1, ako bola hmotnosť tumoru (obr. 5B) . Je pravdepodobné, že tento účinok nebol spôsobený priamym vplyvom zlúčeniny 1 na tumor, pretože melanómovým bunkám použitým v tomto teste chýba integrín α_νβ3· Skutočne, ich rast in vitro nie, je ovplyvnený kokultiváciou so zlúčeninou (údaje sa neuvádzajú). Výrazné zníženie povrchovej vaskulatúry (obr. 5A) , ako aj celkovej hustoty krvných ciev (obr. 5C) bolo v tumore, ktorý sa liečil zlúčeninou 1, zrejmé. Dôležité je, že toto zníženie vo vaskulatúre tumoru bolo spojené s preukaznou bunkovou smrťou vo vnútri hmoty tumoru, dokonca aj keď kontrolné tumory prejavovali 6-násobný prírastok hmoty v priebehu 10 dňového časového vymedzenia testu.

Uvedený opis a príklady sú ilustratívne a nie Možné sú ďalšie varianty v rámci podstaty a rozsahu ho vynálezu a pre odborníka v odbore budú zrejmé a točniteľné.

obmedzujúce. predkladanélahko ušku-

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY kde

G¹ a G² sú každý nezávisle skupina -NH-C(O)-O-R¹, skupina -NH-C (O) -O- (CH2) v- (C6H4) -X¹, skupina -NH-C (O)-NH-(CH2) _v-(C₅H₄)-X¹, skupina -O-C (O) -NH- (CH2) v- (CgH4) -X¹, skupina -O-C (O) -O- (CH2) _v-(CgHJ-X¹ alebo skupina -NH-C (O)-CH₂-(C₆H₄)-X¹;

Y¹ a Y² sú každý nezávisle hydroxyskupina, C1-C4 alkylová skupina, C1-C4 hydroxyalkylová skupina, C1-C4 alkoxyskupina, fenylová skupina, benzylová skupina alebo aminoskupina;

R¹ je C1-C4 alkylová skupina;

X¹ je atóm halogénu, nitroskupina, C1-C4 alkylová skupina, C1-C4 alkoxyskupina alebo C1-C4 perfluóralkylová skupina;

Z je skupina -C=C-, skupina -C₆H₄-, skupina cis-CH=CH~, skupina trans-CH=CH-, skupina cis-CH₂-CH=CH-CH₂-, skupina trans-CH₂-CH=CH-CH₂-, 1,4-naftylová skupina, cis-1,3-cyklohexylová skupina, trans-1,3-cyklohexylová ·skupina, cis-1,4-cyklohexylová skupina alebo trans-1,4-cyklohexylová skupina;

A je atóm vodíka alebo kovalentná väzba;

m a n sú každý nezávisle celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1;

t je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1; a v je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 1 alebo 2;

s výhradou, že keď A je atóm vodíka, t je 0; keď A je kovalentná väzba, t je 1; keď m je 0, Y¹ je Ci~C4 hydroxyalkylová skupina; a keď n je 0, Y² je Ci~C4 hydroxyalkylová skupina.
2. Zlúčenina podľa nároku 1, kde G¹ a G² sú skupina -NH-C(O)-0-(CH2) v^-(ΟδΗ4)-X¹, A je kovalentná väzba, a v je 1.
3. Zlúčenina podľa nároku 2, kde X¹ je trifluórmetylová skupina .
4. Zlúčenina podľa nároku 2, kde Y¹ a Y² sú hydroxyskupina, m je 1, a n je 1.
5.

Zlúčenina všeobecného vzorca II (II)

R² a R³ šú každý nezávisle atóm vodíka, Ci~C₄fenylová skupina alebo benzylová skupina;

alkylová skupina,

X² a X³ sú každý nezávisle atóm halogénu, nitroskupina, Ci-C₄‘ alkoxyskupina, Ci~C₄ alkylová skupina alebo Ci~C₄ perfluóralkylová skupina;

A je atóm vodíka alebo kovalentná väzba; a t je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1;

s výhradou, že keď A je atóm vodíka, t je 0; a keď A je kovalentná väzba, t je 1.
6. Zlúčenina podľa nároku 5 kde aspoň jeden z X² a X³ je p-trifluórmetylová skupina, a A je kovalentná väzba.
7. Zlúčenina podlá nároku 5, kde aspoň jeden z R² a R³ je atóm vodíka, a A je kovalentná väzba.
8. Zlúčenina podlá nároku 5, kde aspoň jeden z R² a R³ je metylová skupina, a A je kovalentná väzba.
9. Zlúčenina podlá nároku 5, kde X² a X³ sú každý para-trifluórmetylová skupina, R² a R³ sú každý metylová skupina,' a A je kovalentná väzba.
10. Zlúčenina podľa nároku 5, kde R² je atóm vodíka, a A je atóm vodíka.
11. Zlúčenina podľa nároku 5, kde R² je metylová skupina, a A je atóm vodíka.
12. Zlúčenina podlá nároku 5, kde X² je para-trifluórmetylová skupina, Rl je atóm vodíka, a A je atóm vodíka.
13. Zlúčenina so štruktúrou
14. Farmaceutický prípravok obsahujúci zlúčeninu všeobecného vzorca I

G¹ a G² sú každý nezávisle skupina -NH-C (0)-0-R¹, skupina -NH-C(O)-O-(CH2)V-(C6H4)-X¹, skupina -NH-C (0)-NH-(CH2) _v-(C-;H₄)-X¹, skupina -0-C (0) -NH- (CH2) v- (CgH4) -X¹, skupina -0-C (0)-0-(CH2) _v-(C₆H₄)-X¹ alebo skupina -NH-C (0) -CH₂-(C₆H₄) -X¹;

Y¹ a Y² sú každý nezávisle hydroxyskupina, Ci~C₄ alkylová skupina, Ci~C₄ hydroxyalkylová skupina, Ci~C₄ alkoxyskupina, fenylová skupina, benzylová skupina alebo aminoskupina;

R¹ je Ci~C₄ alkylová skupina;

X¹ je atóm halogénu, nitroskupina, Ci-C₄ alkylová skupina, Ci~C₄alkoxyskupina alebo Ci~C₄ perfluóralkylová skupina;

Z je skupina -C=C-, skupina -C₆H₄-·, skupina cis-CH=CH-, skupina trans-CH=CH-, skupina - cis-CH₂-CH=CH-CH₂-, skupina trans-CH₂-CH=CH-CH₂-, 1,4-naftylová skupina, cis-1,3-cyklohexylová skupina, trans-1,3-cyklohexylová skupina, cis-1,4-cyklohexylová skupina alebo trans-1,4-cyklohexylová skupina;

A je atóm vodíka alebo kovalentná väzba;

m a n sú každý nezávisle celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1;

t je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1; a v je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 1 alebo 2;

s výhradou, že keď A je atóm vodíka, t je 0; keď A je kovalentná väzba, t je 1; keď m je 0, Y¹ je Cx-C4 hydroxyalkylová skupina; a keď n je 0, Y² je Cx-C₄ hydroxyalkylová skupina;

vo farmaceutický prijateľnom nosiči. ¹
15. Farmaceutický prípravok podľa nároku 14, kde G¹ a G² sú skupina -NH-C (O)-O-(CH₂) _v-(CgH₄)-X¹, A je kovalentná väzba, a v je

1.
16. Farmaceutický prípravok podľa nároku 15, kde X¹ je trifluórmetylová skupina.
17. Farmaceutický prípravok podlá nároku 15, kde Y¹ a Y² sú hydroxyskupina, m je 1, a n je 1.
18. Farmaceutický prípravok podľa nároku 15, kde X² je para-trifluórmetylová skupina, R¹ je atóm vodíka, a A je atóm vodíka.
19. Farmaceutický prípravok obsahujúci zlúčeninu so štruktúrou vo farmaceutický prijateľnom nosiči.
20. Spôsob inhibície rastu tumoru v hostiteľovi, ktorý zahŕňa podávanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny reprezentovanej všeobecným vzorcom I kde

G¹ a G² sú každý nezávisle skupina -NH-C(O)-O-R¹, skupina -NH-C (O) -O- (CH2) v- (C6H4) -X¹, skupina -NH-C (O)-NH-(CH2) _v-(C₆H₄)-X¹, skupina -O-C (O)-NH-(CH?) v-(C5H4)-X¹, skupina -O-C (O)-O-(CH2) _v-(C₆H₄)-X¹ alebo skupina -NH-C (O)-CH₂-(C₆H₄)-X¹;

Y a Y sú každý nezávisle hydroxyskupina, Ci~C₄ alkylová skupina, Ci-C₄ hydroxyalkylová skupina, C1-C4 alkoxyskupina, fenylová skupina, benzylová skupina alebo aminoskupina;

R¹ je Ci-C₄ alkylová skupina;

X¹ je atóm halogénu, nitroskupina, C1-C4 alkylová skupina, C1-C4 alkoxyskupina alebo C1-C4 perfluóralkylová skupina;

Z je skupina -C=C-, skupina -C6H4-, skupina cis-CH=CH-, skupina trans-CH=CH-, skupina cis-CH₂-CH=CH-CH₂-, skupina trans-CH₂-CH=CH-CH₂-, 1,4-naftylová skupina, cis-1,3-cyklohexylová skupina, trans-1,3-cyklohexylová skupina, cis-1,4-cyklohexylová skupina alebo trans-1,4-cyklohexylová skupina;

A je atóm vodíka alebo kovalentná väzba;

m a n sú každý nezávisle celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1;

t je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1; a v je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 1 alebo 2;

s výhradou, že keď A je atóm vodíka, t je 0; keď A je kovalentná väzba, t je 1; keď m je O, Y¹ je C1-C4 hydroxyalkylová skupina; a keď n je 0, Y² je C1-C4 hydroxyalkylová skupina, hostiteľovi, ktorý takúto inhibíciu potrebuje.
21. Spôsob inhibície rastu tumoru podľa nároku 20, kde G¹ a G²sú skupina -NH-C (O) -O- (CH₂) _v ^_ (C6H4) -X³, A je kovalentná väzba, a v je 1.
22. Spôsob inhibície rastu tumoru podlá nároku 21, kde X¹ je trifluórmetylová skupina.
23. Spôsob inhibície rastu tumoru podľa nároku 21, kde Y¹ a Y²sú hydroxyskupina, m je 1, a n je 1.
24. Spôsob inhibície rastu tumoru podľa nároku 20, kde podávanie zahŕňa intraperitoneálne, subkutánne, intravenózne, transdermálne, intrasynoviálne, intramuskulárne alebo perorálne podávanie.
25. Spôsob inhibície rastu tumoru v hostiteľovi, ktorý zahŕňa podávanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny reprezentovanej vzorcom hostiteľovi, ktorý takúto inhibíciu potrebuje.
26. Spôsob inhibície rastu tumoru podľa nároku 25, kde podávanie zahŕňa intraperitoneálne, subkutánne, intravenózne, transdermálne, intrasynoviálne, intramuskulárne alebo perorálne podávanie.
27. Spôsob inhibície angiogenézy v tkanive tumoru, ktorý zahŕňa podávanie angiogenézu inhibujúceho účinného množstva zlúčeniny reprezentovanej všeobecným vzorcom I kde

G¹ a G² sú každý nezávisle skupina -NH-C(0)-0-R¹, skupina -NH-C (0) -0- (CH2) v- (C6H4) -X¹, skupina -NH-C (0)-NH-(CH2) _v-(CgH₄)-X¹, skupina -0-C (0)-NH-(CH2) v-(C6H4)-X¹, skupina -0-C (0)-0-(CH2) _v-(CsH₄)-X¹ alebo skupina -NH-C (0)-CH₂-(CgH₄)-X¹;

Y¹ a Y² sú každý nezávisle hydroxyskupina, Ci~C₄ alkylová skupina, Ci-C₄ hydroxyalkylová skupina, Ci~C₄ alkoxyskupina, fenylová skupina, benzylová skupina alebo aminoskupina;

R¹ je Ci-C₄ alkylová skupina;

X¹ je atóm halogénu, nitroskupina, Ci-C₄ alkylová skupina, Ci~C₄alkoxyskupina alebo Ci-C₄ perfluóralkylová skupina;

Z je skupina -C=C-, skupina -C₆H₄-, skupina cis-CH=CH-, skupina trans-CH=CH-, skupina cis-CH₂-CH=CH-CH₂-, 'skupina, trans.-CH₂-CH=CH-CH₂-, 1, 4-naftylová skupina, cis-1,3-cyklohexylová skupina,, trans-1,3-cyklohexylová skupina, cis-1,4-cyklohexylová skupina alebo trans-1,4-cyklohexylová skupina;

A je atóm vodíka alebo kovalentná väzba;

m a n sú každý nezávisle celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1;

t je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1; a v je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 1 alebo 2;

s výhradou, že keď A je atóm vodíka, t je 0; keď A je kovalentná väzba, t je 1; keď m je 0, Y¹ je Ci~C4 hydroxyalkylová skupina; a keď n je 0, Y² je Ci-C4 hydroxyalkylová skupina, do tkaniva tumoru.
28. Spôsob podľa nároku 27, kde G¹ a G² sú skupina -NH-C(O)-0- (CH2) v^- (C6H₄) -X¹, A je kovalentná väzba, a v je 1.
29. Spôsob podlá nároku 28, kde X¹ je trifluórmetylová skupina.
30. Spôsob podľa nároku 28, kde Y¹ a Y² sú hydroxyskupina, m je 1, a n je 1.
31. Spôsob inhibície rastu tumoru podľa nároku 27, kde podávanie zahŕňa intraperitoneálne, subkutánne, intravenózne, transdermálne, intrasynoviálne, intramuskulárne alebo perorálne podávanie.
32. Spôsob indukcie apoptózy v bunkách tumoru, ktorý zahŕňa podávanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny reprezentovanej všeobecným vzorcom I kde

G¹ a G² sú každý nezávisle skupina -NH-C(0)-0-R¹, skupina -NH-C (O) -O- (CH2) v- (C6H4) -X¹, skupina -NH-C (O)-NH-(CH2) _v-(C₆H₄)-X¹, skupina -O-C (O) -NH- (CH2) v- (C6H4) -X¹, skupina -O-C (O)-O-(CH2) _v54

- (C₆H₄) - X¹ alebo skupina -NH-C (0) -CH₂- (C₆H₄) -X¹;

Y¹ a Y² sú každý nezávisle hydroxyskupina, C_x-C₄ alkylová skupina, C_x-C₄ hydroxyalkylová skupina, C_x-C₄ alkoxyskupina, fenylová skupina, benzylová skupina alebo aminoskupina;

R¹ je C_x-C₄ alkylová skupina;

X¹ je atóm halogénu, nitroskupina, C1-C4 alkylová skupina, C_x-C₄alkoxyskupina alebo C1-C4 perfluóralkylová skupina;

Z je skupina -C=C~, skupina -C₆H₄-, skupina cis-CH=CH-, skupina trans-CH=CH-, skupina cis-CH₂-CH=CH-CH₂-, skupina trans-CH₂-CH=CH-CH₂-, 1,4-naftylová skupina, cis-1, 3-cyklohexylová skupina, trans-1,3-cyklohexylová skupina, cis-1,4-cyklohexylová skupina alebo trans-1,4-cyklohexylová skupina;

A je atóm vodíka alebo kovalentná väzba;

m a n sú každý nezávisle celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1;

t je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1; a v je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 1 alebo 2;

s výhradou, že keď A je atóm vodíka, t je 0; keď A je kovalentná väzba, t je 1; keď m je 0, Y¹ je Cx-C4 hydroxyalkylová skupina; a keď n je 0, Y² je Cx-C₄ hydroxyalkylová skupina, do buniek tumoru.
33. Spôsob podlá nároku 32, kde G¹ a G² sú skupina -NH-C(O)-0- (CH₂) v- (C_sH₄) -X¹, A je kovalentná väzba, a v je 1.
34. Spôsob podlá nároku 33, kde X¹ je trifluórmetylová skupina.
35. Spôsob podía nároku 33, kde Y¹ a Y² sú hydroxyskupina, m je

1, a n je 1.
36. Spôsob inhibície rastu tumoru podľa nároku 32, kde podávanie zahŕňa intraperitoneálne, subkutánne, intravenózne, transdermálne, intrasynoviálne, intramuskulárne alebo perorálne podávanie.

I
37. Spôsob inhibície interakcie MMP2 s integrínom α_νβ₃ v hostiteľskej bunke, ktorý zahŕňa kontakt integrínu s takým množstvo zlúčeniny všeobecného vzorca I, ktoré inhibuje túto interakciu

G¹ a G² sú každý nezávisle skupina -NH-C(0)-0-R¹, skupina -NH-C (0) -0- (CH2) v (C6H4) -X¹, skupina -NH-C (0) -NH- (CH2) _v- (C₆H₄) -X¹, skupina -O-C (0)-NH-(CH2) v-(C6H4)-X¹, skupina -O-C (0)-0-(CH2) _v-(CgHJ-X¹ alebo skupina -NH-C (0) -CH₂- (CgH₄) -X¹;

Y¹ a Y² sú každý nezávisle hydroxyskupina, Ci-C₄ alkylová skupina, Ci-C₄ hydroxyalkylová skupina, Ci~C₄ alkoxyskupina, fenylová skupina, benzyiová skupina alebo aminoskupina;

R¹ je Ci-C₄ alkylová skupina;

X¹ je atóm halogénu, nitroskupina, C1-C4 alkylová skupina, C1-C4 alkoxyskupina alebo C1-C4 perfluóralkylová skupina;

Ž je skupina -C=C-, skupina -C₆H₄-, skupina cis-CH=CH-, skupina trans-CH=CH-, skupina cis-CH₂-CH=CH-CH₂-, skupina trans-CH₂-CH=CH-CH₂-, 1, 4-naftylová skupina, cis-1,3-cyklohexylová skupina, trans-1,3-cyklohexylová skupina, cis-1,4-cyklo56 hexylová skupina alebo trans-1,4-cyklohexylová skupina;

A je atóm vodíka alebo kovalentná väzba;

m a n sú každý nezávisle celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1 ;

t je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 0 alebo 1; a v je celé číslo nadobúdajúce hodnoty 1 alebo 2;

s výhradou, že keď A je atóm vodíka, t je 0; keď A je kovalentná väzba, t je 1; keď m je 0, Y¹ je Ci-C4 hydroxyalkylová skupina; a keď n je 0, Y² je Ci-C4 hydroxyalkylová skupina.
38. Spôsob podľa nároku 37, kde G¹ a G² sú skupina -NH-C(O)-0- (CH2) v^- (CgH₄) -X¹, A je kovalentná väzba, a v je 1.
39. Spôsob podlá nároku 38, kde X¹ je trifluórmetylová skupina.
40. Spôsob podlá nároku 38, kde Y¹ a Y² sú hydroxyskupina, m je