PL186809B1 - Oczyszczony antygen powierzchniowy nasienia, przeciwciało monoklonalne dla niego i zastosowania z nim związane - Google Patents
Oczyszczony antygen powierzchniowy nasienia, przeciwciało monoklonalne dla niego i zastosowania z nim związaneInfo
- Publication number
- PL186809B1 PL186809B1 PL97330842A PL33084297A PL186809B1 PL 186809 B1 PL186809 B1 PL 186809B1 PL 97330842 A PL97330842 A PL 97330842A PL 33084297 A PL33084297 A PL 33084297A PL 186809 B1 PL186809 B1 PL 186809B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sperm
- monoclonal antibody
- protein
- antibody
- saga
- Prior art date
Links
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title description 41
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title description 41
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 239000000934 spermatocidal agent Substances 0.000 claims abstract description 18
- 229940124462 contraceptive vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 14
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 10
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 10
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 17
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 abstract description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 18
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 15
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 14
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 11
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 9
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 9
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 6
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 6
- 230000002254 contraceptive effect Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 5
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 101100310691 Rattus norvegicus Spata6 gene Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000469 anti-sperm effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 229940127234 oral contraceptive Drugs 0.000 description 3
- 239000003539 oral contraceptive agent Substances 0.000 description 3
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=CC=C1OCCO IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 2
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 230000001150 spermicidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 101100462495 Caenorhabditis elegans rsa-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 206010046914 Vaginal infection Diseases 0.000 description 1
- 201000008100 Vaginitis Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000004015 abortifacient agent Substances 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229960004407 chorionic gonadotrophin Drugs 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000009223 counseling Methods 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000687 effect on sperms Effects 0.000 description 1
- -1 either ejaculate Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 231100000502 fertility decrease Toxicity 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000011809 primate model Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 description 1
- 210000004267 spermatic cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 238000007879 vasectomy Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000010865 video microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/16—Masculine contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/18—Feminine contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
- G01N2800/367—Infertility, e.g. sperm disorder, ovulatory dysfunction
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Przeciwcialo monoklonalne, podlegajace ekspresji przez depozyt hybrydomy do- stepny pod numerem dostepu ATCC HB 12144. 2. Oczyszczony preparat glikoproteiny powierzchniowej nasienia zwiazany przez przeciwcialo monoklonalne wedlug zastrz. 1. 3. Szczepionka antykoncepcyjna, obejmujaca ilosc glikoproteiny powierzchniowej nasienia wedlug zastrz. 2 w ilosci skutecznej do indukcji wytwarzania przeciwcial wobec niego, po podaniu samicy ssaka, w farmaceutycznie dopuszczalnym nosniku. 6. Srodek plemnikobójczy, zawierajacy jako czynnik aktywny przeciwcialo mono- klonalne wedlug zastrz. 1, w farmaceutycznie dopuszczalnym nosniku. PL PL PL PL
Description
Dziedzina wynalazku:
Wynalazek ten odnosi się do antygenu powierzchniowego spermy, przeciwciała monoklonalnego wytworzonego dla niego, oraz zastosowań zarówno przeciwciała monoklonalnego jak i antygenu. Konkretnie, zapewnia się szczepionkę antykoncepcyjną, wykorzystującą antygen jako immunogen, jak również standard dla testów odpornościowych, a przeciwciało monoklonalne znajduje zastosowanie jako środek plemnikobójczy i odczynnik diagnostyczny.
Tło prac pokrewnych:
Zasadniczo stała uwaga skupia się na rozwoju ulepszonych metod antykoncepcyjnych. Jedną z szeroko wykorzystywanych technologii jest stosowanie środków plemnikobójczych, w istocie bariery chemicznej, która zapobiega penetracji nasienia do macicy lub komórki jajowej, albo hamuje jego aktywność, uniemożliwiając przez to zapłodnienie. Jednym z najpowszechniej stosowanych środków plemnikobójczych jest detergent, Nonoxylonol-9. Raporty wskazuj ją na zmniejszenie występowania infekcji dróg moczowo-płciowych oraz zapalenia pochwy i szyjki macicy u kobiet, stosujących ten detergentowy środek plemnikobójczy.
186 809
McGroarty i in., Journal of Urology, 152 (3): 831-833 (1994). Jako alternatywę wobec detergentów chemicznych, autorzy zasugerowali stosowanie przeciwciał monoklonalnych, jako najbardziej odpowiednich, bezpiecznych środków aktywnych do zastosowań miejscowych, takich jak stosowanie w miejscowych środkach plemnikobójczych. Patrz np. Cone i in., Am. J. Reprod. Immunol., 31: 114-131 (1994). Badania konkludują, że oprócz zmniejszenia lub wykluczenia niechcianych reakcji immunologicznych, ludzkie przeciwciała monoklonalne powinny przedstawiać bezpieczne środki plemnikobójcze, ponieważ ich dawka i czas zastosowania można łatwo kontrolować, dostarczanie miejscowe minimalizuje ekspozycje układową, a przeciwciało monoklonalne można wybrać pod względem bezpieczeństwa i skuteczności. Zatem, przeciwciało monoklonalne aktywne wobec spermy, dostarczane w postaci miejscowego środka plemnikobójczego może wytwarzać pożądane skutki zapobiegające zapłodnieniu, bez ujemnych skutków ubocznych, towarzyszących środkom detergentowym. Patrz ogólnie Alexander, Scientific American, Sept.: 136-141 (1995). W związku z tym, celem w dziedzinie jest wciąż zapewnienie bezpiecznego i skutecznego środka plemnikobójczego, wykorzystującego przeciwciała monoklonalne.
Badano wiele różnych przeciwciał monoklonalnych jako potencjalnych czynników reagujących z nasieniem. Wśród badanych znajduje się przeciwciało monoklonalne antyludzkie S19. Wykorzystanie tego przeciwciała monoklonalnego odzwierciedlono u Andersona i in., J. Reprod. Immunol., 10: 231-257 (1987). Przeciwciało to otrzymano przez immunizację myszy homogenatami ludzkiego nasienia. Okazało się, że przeciwciało monoklonalne IgGi silnie aglutynuje ludzkie nasienie w laboratorium Wynalazców, a następnie przedłożono je do dalszej charakteryzacji na warsztaty na temat przeciwciał monoklonalnych antyspermowych, sponsorowanych przez Światową Organizację Zdrowia. Anty-spermowe przeciwciało monoklonalne S19 silnie aglutynuje ludzkie nasienie, hamuje mocne wiązanie między ludzkim nasieniem i warstwą przejrzystą jaja oraz blokuje penetrację nasienia w śluzie szyjkowym. Andersen jak wyżej, Mahoney i in., J. Reprod. Immunol., 19: 269-285 (1991). Silną aglutynację nasienia przez to przeciwciało pokazano wizualnie na taśmie wideo. Te odkrycia wskazują, że pokrewny antygen S19 wiąże się z interakcjami gamet podczas zapłodnienia, i może służyć jako cel dla autoprzeciwciał, nadających niepłodność immunologiczną, oraz może być kandydatem do wykorzystania w postaci szczepionki antykoncepcyjnej.
Jednak przeciwciało S19 nie zostało dalej wykorzystane ani jako narzędzie badawcze, ani jako odczynnik antykoncepcyjny. Nie uczyniono depozytu przeciwciała S19, ani nie „humanizowano” go w celu zmniejszenia możliwości reakcji immunologicznej. Nie przeprowadzono szczegółowych badań na temat przeciwciała monoklonalnego, i do dzisiaj pozostaje ono zasadniczo osobliwością naukową.
Znane są inne przeciwciała monoklonalne i antygeny nasienia. Przeciwciało monoklonalne MHS-10 i antygen, który się z nim wiąże, SP-10, antygen wewnątrzakrosomowy, który jest kandydatem do stosowania zarówno w diagnostyce nasienia jak jako szczepionka antykoncepcyjna, omawia się w zgłoszeniu patentowym U.S. 5 436 137, Herr i in., załączonym niniejszym jako odnośnik. Jednakże odmiennie niż antygen SP-10, antygen wiązany przez przeciwciało monoklonalne S19, antygen-1 aglutynacji nasienia (SAGA-1) okazuje się być zlokalizowany na całej powierzchni ludzkiego plemnika. Sugeruje to mocno, że przeciwciało monoklonalne będzie wiązać i aglutynować w wielu miejscach na całej powierzchni nasienia.
Trwają prace rozwojowe nad szczepionkami, wykorzystującymi antygen SP-10. Podobnie, wielu badaczy na całym świecie poszukuje możliwości wykorzystania szczepionek antykoncepcyjnych opartych o antygeny nasienia. Patrz np. Aitken i in., British Medical Journal, 49: 88-99 (1993), Freemerman i in., Biol. Reprod., 50: 615-621 (1994) oraz Herr, Fertility Control, strony 431-452 (drugie wydanie 1994). W tym połączeniu, trwają prace nad ludzką gonadotropiną kosmówkową (hCG) jako szczepionką antykoncepcyjną dla kobiet. Talwar Current Opinion in Immunology, 6: 698-704 (1994) oraz europejskie zgłoszenie patentowe 86304274.3. Chociaż próby kliniczne nad tą potencjalną szczepionką są w toku, immunogen hCG wykorzystuje działanie jako środka aborcyjnego, czyli odpowiedzi immunologiczne indukowane przez zaszczepienie tą szczepionką indukują aborcję wczesnego zarodka lub płodu. Może to stanowić niedopuszczalną postać środka antykoncepcyjnego dla wielu osób.
186 809
Jako alternatywę, wykorzystano różne antygeny powierzchniowe nasienia, w badaniach, wykorzystujących modele naczelnych i gryzoni. Tak więc, zmniejszony współczynnik płodności, wynikał z immunizacji zwierząt testowych antygenami powierzchniowymi nasienia, takimi jak LDH-C4, O'Hern i in., Biol. Reprod., 52: 331-339 (1995), PH-20, Primakoff i in., Naturę 335 : 543, 546 (1988), RSA-1 O'Rand i in., J. Reprod. Immunol., 25: 89-102 (1993) oraz fertyliną Ramarao i in., Mol. Reprod. Dev., 43: 70-75 15 (1995). Ku rozczarowaniu, u naczelnych najwyższym obserwowanym współczynnikiem skuteczności przy antygenie nasienia jest około 75% inhibicji płodności, O'Hern i in., jak wyżej. Tak więc, do dziś nie zidentyfikowano ludzkiego antygenu nasienia, który funkcjonuje jako szczepionka antykoncepcyjna o poziomie skuteczności porównywalnym z doustnymi środkami antykoncepcyjnymi. Pozostaje więc przedmiotem dla fachowców, zapewnienie bezpiecznej i skutecznej szczepionki antykoncepcyjnej, której skuteczność jest na poziomie doustnych środków antykoncepcyjnych.
Poza tym, ponieważ otrzymujący szczepionkę antykoncepcyjną wymagają okresowego monitoringu przeciwciała w surowicy, w celu określenia, czy są oni „bezpieczni”, pożądane jest stosowanie antygenu SAGA-1 jako celu w testach do pomiaru stężenia przeciwciała u osób, otrzymujących szczepionkę.
Test „odręczny” lub zestawy diagnostyczne do wykrywania hormonów związanych z ciążą, (hCG lub inne) osiągnęły wielki sukces na rynku, jako alternatywne lub będące pierwszym etapem wobec potencjalnie krępujących, niewygodnych i kosztownych wizyt w placówkach medycznych. W ostatnich latach, uwagę skupiono na testach na obecność oraz stężenie nasienia w ejakulacie użytkowników. Zarówno z punktu widzenia poradnictwa płodności, jak również diagnostyki klinicznej w wypadkach gwałtu, albo w celach testowania pod względem obecności i skuteczności wazektomii, bardzo pożądany stał się wygodny zestaw testowy, który mógłby być bezpieczny i pewny do wykorzystania w domu, wykrywający nasienie w próbce. Taki zestaw testowy, wykorzystujący przeciwciało monoklonalne MHS-10 wobec antygenu wewnątrzakrosomowego nasienia SP-10 ujawnia się w zgłoszeniu patentowym U.S. numer seryjny 08/231 675, który załącza się niniejszym jako odnośnik. Przeciwciało S19 oferuje alternatywę skutecznego wiązania wobec przeciwciała MHS-10 do stosowania w diagnostyce ludzkiego nasienia.
Streszczenie wynalazku:
Powyższe cele napotyka się poprzez stosowanie „humanizowanej” rekombinowanej wersji przeciwciała monoklonalnego S19, oraz oczyszczanie, i wykorzystanie odpowiadającego antygenu przez nie związanego, SAGA-1, jako środków aktywnych. Przeciwciało monoklonalne, uruchomione przez odpowiedni nośnik, zapewnia skuteczny środek wiążący w postaci środka plemnikobójczego i w postaci środka diagnostycznego ludzkiego nasienia. Antygen SAGA-1, glikoproteina ludzkiego nasienia, zapewnia skuteczny immunogen, a także standard do testowania wytwarzania przeciwciał antykoncepcyjnych u przechodzących terapie szczepionką.
Aby zapewnić skuteczny żel lub krem plemnikobójczy, przeciwciało monoklonalne musi być dostarczone w skutecznym nośniku. Wśród innych nośników dostępnych do badań są liposomy nie-fosfolipidowe preparowane specjalnie dla dostarczania antygenu lub przeciwciała. W komercyjnej postaci dostępny jest aktualnie od Novavax, Inc. z Rockville, Maryland pod nazwąNOVASOMES®. Przeciwciała monoklonalne S19 mogą się wiązać z powierzchnią tych dodatnio naładowanych liposomów. Można wytworzyć inne nośniki i kompozycje aglutynacji nasienia.
Oczyszczanie antygenu SAGA-1 jest pierwszym etapem w wytwarzaniu skutecznej szczepionki. Oczyszczony antygen, wprowadzony w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, można podawać pacjentom przeznaczonym do szczepienia antykoncepcyjnego. Powtórzenie szczepienia daje w wyniku wytworzenie przeciwciał przeciw nasieniu, bardzo skutecznie wiążących nasienie. W celu monitoringu rozwoju skutecznego poziomu przeciwciał, oczyszczony antygen można stosować jako odczynnik testowy do określania obecności ilości przeciwciał obecnych u pacjenta, poprzez konwencjonalne procedury diagnostyczne.
186 809
Krótki opis rysunków
Figura 1 jest fotografią wyników analizy Western blot, uzyskanych przez reakcję mAB S19 z SAGA-1.
Figura 2 jest fotografią wyników odcisku immunologicznego na SDS-PAGE SAGA-1 podzielonego fazowo za pomocą Triton-X-114.
Figura 3 jest sekwencją zasad nukleotydowych dla lekkiego łańcucha Kappa mAB S19 jaką otrzymano przez analizę sekwencji.
Figura 4 jest fotografią analizy Western blotting preparatu SAGA-1 jaki związano przez mAB S19 na kolumnie z macierzą immunologiczną.
Figura 5 jest sekwencją zasad nukleotydowych dla ciężkiego łańcucha mAB S19 jaką otrzymano przez analizę sekwencji.
Szczegółowy opis wynalazku
Wynalazek Zgłaszających obejmuje niniejszym przeciwciało monoklonalne S19, antygen, który ono wiąże, SAGA-1, środek plemnikobójczy, wykorzystujący przeciwciało monoklonalne w odpowiednim farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, szczepionkę antykoncepcyjną, wykorzystującą SAGA-1 jako immunogen oraz testy diagnostyczne i zestawy, wykorzystujący związane S19 jako środek diagnostyczny do określania stężenia nasienia, oraz SAgA-1 jako standardowy odczynnik do określania rozwoju przeciwciał w odpowiedzi na zaszczepienie nim, i pokrewne zastosowania. Każde z nich omawia się poniżej.
Mimo, że przeciwciało, białko i ich zastosowania są rozważane oddzielnie, wynalazek wychodzi z powszechnego uznania, że białko SAGA-1 jest szeroko rozmieszczone na powierzchni plemnika i jest dodatnio związane z przeciwciałem monoklonalnym S19, które widocznie blokuje działanie nasienia na wielu etapach w procesie zapłodnienia, łącznie z inhibicją ruchliwości nasienia i interakcji gamet.
Przeciwciało monoklonalne S19
Jak zauważono powyżej, chociaż nigdzie wcześniej nie było publicznie osiągalne, przeciwciało monoklonalne S19 było przedmiotem badania i wcześniejszej publikacji. Początkowe przeciwciało S19 otrzymano przez immunizację myszy homogenatami ludzkiego nasienia. To anty-ludzkie przeciwciało monoklonalne silnie aglutynuje ludzkie nasienie, hamuje mocne wiązanie między ludzkim nasieniem i warstwą przejrzystą jaja, blokuje penetrację przez nasienie śluzu szyjkowego i indukuje zjawisko wytrząsania nasienia.
Przeciwciało monoklonalne S19 złożono na warunkach układu budapesztańskiego, w ATCC 26 czerwca 1996, numer depozytu HB12144. Dla większej wiedzy Zgłaszającego, jest to pierwszy raz, kiedy wykonano taki depozyt.
Zdolność przeciwciała monoklonalnego do silnej aglutynacji ludzkiego nasienia, przedstawiono in vitro. Aglutynację analizowano przez wideo mikroskopię. Wykonano film wideo. Pokaz aglutynacji
Dla każdego doświadczenia, ludzkie nasienie rozcieńczono do ostatecznego stężenia 20 milionów/plemników/ml i płyny puchlinowe rozcieńczono 1:10. Plemniki i płyn puchlinowy zmieszano w rurce Eppendorfa, a potem umieszczono na hemacytometrze. Wyniki z płynami puchlinowymi S19 notowano za pomocą fotografii z gradientem czasowym. Wyniki z pustym płynem puchlinowym zanotowano w czasie rzeczywistym.
O czasie z piemniki swobodnie pływają. Po ąO minotach, plemniki są kompletnie zaglutynowane. Jako kontrolę, wykorzystano pusty płyn puchlinowy. (Czas 0 odnosi się do umieszczenia nasienia na szkiełku i rozpoczęciu fotogrofpwoyio). Nasienie swobodnie pływa. Wyraźne są resztki i okrągłe komórki. Brak wyraźnych zmian w ruchliwości lub w stopniu aglutynacji w kontroli po 10 minutach.
Wyniki te wskazują, że przeciwciało moyokloyalye S19 wiąże i aglutynuje ludzkie nasienie, w wielu miejscach na całej powierzchni plemnika. Całkowita aglutynacja całego nasienia wskazuje, że mAB anty-SAGA-1 będzie działać jako skuteczny środek prewencyjny wobec funkcji nasienia, a zatem wobec zapłodnienia.
186 809
Preparat środka plemnikobójczego
Jak zauważono, literatura teoretyzuje wykorzystanie różnych środków plemnikobójczych opartych o przeciwciała monoklonalne. Odpowiednie nośniki opisano u Cone'a i Alexander'a jak wyżej. Zgłaszający wykorzystali poszczególne nośniki do prezentacji mAB S19 w postaci aglutynacyjnej, przez użycie komercyjnie dostępnego liposomowego układu dostarczania, osiągalnego od Novavax, Inc. z Rockville, Maryland, dostępnego w handlu pod nazwą Novas>omes®. Te liposomy są specjalnie wytwarzane dla dostarczania antygenów lub przeciwciał. Novasomes®, zawierające cząsteczkę natywnego przeciwciała monoklonalnego S19 związane z powierzchnią tych nie-fosfolipidowych dodatnio naładowanych liposomów, działają skutecznie jako środek plemnikobójczy w żelu plemnikobójczym. Preparat Novasomes® testowano przy użyciu opisanego testu aglutynacji nasienia. Przy rozcieńczeniu 1:10 nośnik S19-Novasomes® aglutynował nasienie z taką samą skutecznością jak rozcieńczony 1:20 płyn puchlinowy S19. Wyniki te wskazują, że przeciwciało monoklonalne S19 posiada taki sam skutek na funkcje nasienia po wprowadzeniu do dostępnego w handlu układu dostarczania, jak w płynie natywnym.
Alternatywne układy dostarczania są dostępne dla specjalistów. Wśród wybijających się są peptydy sprzężone z lipidami, patrz np. Deres i in., Nature, 342: 561-564 (1989) oraz ISCOM patrz np. Takahashi, Nature, 344: 873-875 (1990). Inne preparaty, włączając hydrofobowe emulsje i saponiny wykorzystywano w przeszłości do obróbki i prezentacji specyficznych peptydów i można je stosować w połączeniu z przeciwciałami środka plemnikobójczego przedłożonego niniejszym.
Patrz np. Raychaudhuri i in., Proceedings of the National Academy of Science, U.S.A. 89: 8308-8312 (1992) i Newman i in., J. Immunol. 148: 2357-2362 (1992). Można stosować inne nośniki, włączając prezentację przeciwciał na błonie, tak jak podlegające ekspresji przez rekombinowany wirus (to jest rekombinowane schematy wirusowe, w których ekspresja DNA, kodującego przeciwciało, patrz poniżej, zachodzi w rekombinowanej komórce razem z strukturalnym białkiem błonowym). Z dostępnych odmian, oprócz opisanych powyżej liposomów nie-fosfolipidowych, pożądane cechy oferują ISCOM, powszechnie stosowane w szczepionkach do prezentacji antygenów. ISCOM tworzą struktury błonowe podobne do klatki, do których lub na których przeciwciało może być prezentowane. ISCOM stosowano poprzednio w połączeniu z prezentacją antygenów, lecz podobnie prezentują one białka przeciwciał w strukturze podobnej do wirusa, podlegającej ekspozycji. Pod tym względem, inne nośniki, znane z prezentacji aktywnych białek, włączając kulki kopolimerowe, oraz cząstki podobne do wirusa (VLP) uzyskują, jak wiadomo, wyniki podobne do kompleksów immunostymulujących lub ISCOM. Oczywiście, można odpowiednio stosować układ konwencjonalny w ostateczności, przyłączanie przeciwciała poprzez czynnik sprzęgający, do powierzchni mikrokulki, w połączeniu z dopuszczalnymi technikami produkcji wytwarzania żeli i kremów zgodnych z tym podejściem.
Tak wiec, istotą środka plemnikobójczego Zgłaszającego jest wprowadzenie, w odpowiednim podłożu, wystarczającego stężenia mAB S19 w odpowiednim nośniku, w celu skutecznej inhibicji (aglutynacji lub wiązania) całego nasienia obecnego w ejakulacie. Wyodrębnianie, charakteryzacja i kloning mAB S19
Komórki hybrydomy MHS-8, wydzielające S19 hodowano i obliczono tak, że 10 milionów komórek poddano obróbce w celu zebrania RNA, wykorzystując zestaw FastTrack 2.0 (Invitrogen). Cały RNA wyodrębniono bezpośrednio z komórek, przy użyciu lizy detergentowej i buforu rozkładającego dla białek. Następnie wyizolowano poli(a) + RNA przy użyciu zmodyfikowanego protokołu Aviv i Leader, w którym mRNA wiąże się z żywicą oligo dT. Następnie żywice przemyto buforem o niskiej zawartości soli, aby usunąć całość nie związanego RNA, a poli (A) + RNA wymyto z żywicy. Analiza spektrofotometryczna przy 260 nm i 280 nm ujawniła ostateczne stężenie, wynoszące 1,84 pg/pl poli (A) + RNA.
Odwrotna transkrypcja i powielenie poli(A) + RNA S19, przeciwciało dwuwartościowe, działa jako aglutynina ludzkiego nasienia poprzez swą zdolność do sieciowania epitopów na powierzchni plemnika. Aby zapobiec temu działaniu w rekombinowanym białku, zidentyfikowano regiony rozpoznawania epitopów lub regiony determinacji komplementarnej (CDR)
186 809 przeciwciała. Wytworzono cztery mysie oligonukleotydy dla podjednostek ciężkiego łańcucha i lekkiego (kappa) łańcucha specyficznego wobec Igój. Oligonukleotydy zaplanowano tak, że powielałyby jedynie regiony zmienne (w przybliżeniu pierwsze 360 par zasad) S19, który zawiera CDR. Były one następujące:
1. Łańcuch ciężki, koniec 5': ACTAGTCGACATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG
2. Łańcuch ciężki, koniec 3': CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG
3. Łańcuch lekki, koniec 5': CCCCCCGGGGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCT
4. Łańcuch lekki, koniec 3': CCCCCCGGGGATGGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCG
Oligonukleotydy łańcucha ciężkiego otrzymano z zestawu Ig-Prime (Novagen), a skróty nukleotydowe są następujące: R=A lub G, I= inozyna i K=G lub T. Wszystkie oligonukleotydy rozcieńczono do końcowego stężenia, wynoszącego 1,0 pg/pl za pomocą dH2O.
Powielenie z użyciem reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją. poli(A) + RNA hybrydomy S19, przeprowadzono w pojedynczej reakcji przy użyciu układu Acces RT-PCR od firmy Promega. W skrócie, 5 pg poli(A)+RNA hybrydomy S19, 1 pg każdego odpowiedniego primera (primery 1i 2 dla łańcucha ciężkiego, primery 3 i 4 dla łańcucha lekkiego), 1 pl 10 mM mieszaniny dNTP, 10 pl buforu odwrotnej transkrypcji 5X AMV, 2 pl 25 mM MgSO4, 1 pl odwrotnej transkryptazy AMV, 1 pl polimerazy Tf1 oraz 30 pl dH2O pozbawionej nukleaz, połączono w 0,5 ml rurce mikrowirówki. Reakcję inkubowano w temperaturze 48°C przez 45 minut, po czym 2 minuty inkubacji w temperaturze 94°C. Reakcję przeprowadzono w 40 cyklach: 94°C przez 30 sekund, 60°C przez 1 minutę, 68°C przez 2 minuty. 7 minut inkubacji w temperaturze 68°C po czym cykl końcowy. Powielone produkty analizowano na 2% żelu agarozowym (fig. 1). Tor 1, marker DNA o 1kb od Stratagene; tor 2, fragment łańcucha lekkiego, i tor 3, fragment łańcucha ciężkiego. Wstęgi łańcucha ciężkiego i lekkiego przebiegały w przybliżeniu z taką samą ruchomością jak marker o 396 bp, tak jak oczekiwano, ponieważ primery dla łańcucha lekkiego powielają pierwsze 384 bp (360 bp z dodatkowymi miejscami enzymów restrykcyjnych), a te dla łańcucha ciężkiego powielają dodatkowe 60 bp.
Kloning powielonych fragmentów przeciwciała do wektora
Wstęgi łańcucha ciężkiego i lekkiego z fig. 1, odcięto od żelu i wymywano przy użyciu urządzeń filtrujących Ultrafree MC (Millipore). Te oczyszczone fragmenty powielono w kolejności przez następne 40 cykli albo PCR za pomocą polimerazy Pfu w miejsce polimerazy Tf1. Ponownie, fragmenty oczyszczono na żelu i zawieszono w 25 pl dH2O.
Kloning przeprowadzono przy użyciu układu pCR-Script SK(+) (Stratagene). Wektor ten stosuje ligacje lepkiego końca fragmentów PCR powielonych Pfu-c, w celu wprowadzenia cDNA do miejsca enzymu restrykcyjnego Srfi w wektorze. Srf1 jest nowym, rzadko rozszczepiającym enzymem restrykcyjnym, który rozpoznaje sekwencję 5'GCCCGGGC3'. Aby upewnić się, że fragmenty łańcuchów ciężkiego i lekkiego nie będą trawione przez Srf1, połączono 1 pl każdego cDNA z 1 pl enzymu Srf1, 1 pl 10X buforu Reaction i 7 pl dH2O przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Żaden fragment nie został strawiony przez enzym.
Kloning przeprowadzono potem przez połączenie 1 pl wektora pCR-Script, 1 pl 10X buforu pCR-Script, 0,5 pl 10 mM rATP, 5,5 pl cDNA łańcucha ciężkiego lub lekkiego, 1 pl enzymu Srf1 oraz 1 pl ligazy DNA T4. Rurki reakcyjne inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie ogrzewano w temperaturze 65°C przez 10 minut.
Superkompetentne komórki Epicurean Coli XL1-Blue MRF' Kan stopiono na lodzie i potem dodano równe ilości 40 pl do wstępnie ochłodzonych 15 ml rurek. Następnie dodano 0,7 pl 1,44 M β-merkaptoetanolu, do komórek, które inkubowano na lodzie przez 10 minut. Dla każdej z powyższych reakcji kloningu do komórek dodano 2 pl i pozostawiono na lodzie przez dodatkowe 30 minut. Komórki i mieszaninę cDNA ogrzano potem w łaźni o temperaturze 42°C przez 45 sekund i przeniesiono do lodu na 2 minuty. Po dodaniu 0,45 ml pożywki SOC, komórki wytrząsano w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Komórki te rozprowadzono następnie na płytkach Petriego z LB/ampicyliną/meticyłiną/X-gal/IPTG, w celu selekcji pod względem kolonii odpornych na antybiotyk i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Wybrano kolonie dodatnie dla każdego klonu i hodowano w kulturach z 5 ml SOC do oczyszczenia plazmidu.
186 809
Następnie plazmidy oczyszczono przy użyciu kolumn Qiagen-tip 20 (Qiagen). 5 ml komórek wirowano przez 5 minut przy 10k obrotów na minutę. Aspirowano nadmiar pożywki i grudkę komórek ponownie zawieszono w 0,3 ml buforu P1. Dodano bufor P2 i mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie dodano 0,3 ml ochłodzonego buforu P3 i mieszaninę inkubowano na lodzie przez 10 minut. Podczas inkubacji zrównoważono kolumny Qiagen przez nałożenie 1 ml buforu QBT. Próbki komórkowe wirowano następnie przez 15 minut przy 10k obrotów na minutę, usunięto supernatant i załadowano na kolumny Qiagen-tip 20. Po całkowitym wejściu supematantów do żywic kolumn przez przepływ grawitacyjny, kolumny przemyto 4 ml buforu QC i wymywano 0,8 ml buforu QF. Aby wytrącić DNA plazmidu, do eluantu kolumny dodano objętość 0,56 ml izopropanolu i połączenie wirowano przy 10k obrotów na minutę przez 30 minut. Otrzymaną grudkę DNA zawieszono następnie w 25 μΐ dH2O.
Aby potwierdzić obecność insertu cDNA w oczyszczonych plazmidach, każdy klon trawiono dwoma enzymami restrykcyjnymi. Enzymami restrykcyjnymi użytymi do trawienia były Not1 i EcoR1, które posiadają miejsca restrykcji odpowiednio przy końcu 5' i 3' wektora kloningowego pCR-Script. Jeśli insert jest obecny, trawienie tymi enzymami odetnie go od wektora rodzicielskiego. 1,5 μl każdego klonu połączono z 0,75 μl Notl, 0,75 μΐ EcoR1, 1,5 μΐ 10x buforu, 10,5 μΐ dH2O i inkubowano w temperaturze 37°C przez 90 minut. Trawienie przebiegało potem na 2% żelu agarozowym, a te klony, które zawierały insert, sekwencjonowano.
Analiza sekwencji klonów łańcucha, ciężkiego i lekkiego
Powyższe klony dodatnie sekwencjonowano przy użyciu zestawu Fidelity (Oncor). Każda reakcja sekwencjonowania składała się z 5 μl DNA plazmidu, 1 μΐ primera T3 (który leży w górę od miejsca kloningowego 5 na wektorze kloningowym pCR-Script), oraz 2 μΐ dH2O. Ogrzano je do temperatury 95°C przez 5 minut, krótko wirowano, dodano 2 μl buforu, do annealingu i inkubowano reakcję w temperaturze 37°C przez 15 minut. Reakcję oznakowano następnie przez dodanie 3 μl buforu reakcyjnego T4, 1 μl 33PaATP, 2 μΐ polimerazy DNA T4 i 2μΐ dH2O. Mieszaninę tę inkubowano w temperaturze 40°C przez 15 minut a potem dodano dodatkowe 6 μΐ mieszaniny T4. Z tej reakcji znakowania, dodano 5,5 μl do każdej z 4 rurek, zawierających 2 μΐ mieszaniny terminacji albo A, C, G albo T i inkubowano w temperaturze 40°C przez 5 minut. Reakcje zatrzymano przez dodanie 5 μl roztworu Proteinase K i ogrzano do temperatury 95°C przed załadowaniem na 6% akrylamidowym żel sekwencjonujący. Następnie uruchomiono żel na 2 godziny przy 2000 woltów, wysuszono na papierze filtrowym Whatman 3MM pod zmniejszonym ciśnieniem, i poddano ekspozycji na błonę rentgenowską przez noc w temperaturze pokojowej. Po wywołaniu błony, żele odczytano na ekranie świetlnym. Porównując wnioskowane sekwencje klonów ze znanymi sekwencjami IgGj myszy, odkryto, że klony łańcucha lekkiego reprezentowały odchylający się od normy łańcuch lekki, powielony z hybrydomy sp2/0. Sekwencję łańcucha ciężkiego wyodrębniono i sekwencję zasad odzwierciedlono w fig. 5.
Enzym restrykcyjny trawi cDNA w celu usunięcia endogenicznego przeciwciała
Aby odseparować łańcuch lekki kappa S19 od nienormalnego łańcucha lekkiego hybrydomy powtórzono reakcje RT-PCR. Nienormalną sekwencję analizowano i odkryto, że ma ona rzadkie miejsce restrykcji Van91I (5'CCANNNNNTGG3') w jednym z CDR. Zakładając, że łańcuch lekki S19 był obecny w mieszaninie cDNA powielonego przez RT-PCR z hybrydom, mieszaninę tę trawiono Van91I (New England Biolabs). Reakcja trawienia składała się z 1 μl Van91I, 3 μl cDNA, 1 μl 10x buforu reakcyjnego i 5 μl dH2O. Reakcję inkubowano przez noc w temperaturze 37°C aby zapewnić całkowite trawienie. Cały cDNA nie pocięty przez enzym powinien być prawidłowym łańcuchem lekkim kappa S19.
Jak ukazano w fig. 2, produkt trawienia analizowano na 2% żelu agarozowym. (Tor 1 jest markerem Stratagene o 1 kb, tor 2 jest 3 μΐ nie pociętego cDNA i tor 3 jest reakcją trawienia). W torze 3 większość reakcji zostało strawionej na dwa fragmenty lecz jest też słaba wstęga przy 396 bp, reprezentująca nie pocięty przypuszczalny łańcuch lekki S19. Wstęgę tę odcięto od żelu i oczyszczono jak powyżej, następnie powielono przez 40 cykli PCR za pomocą polimerazy Pfu, zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie klonowano cDNA do wektora pCR-Script jak poprzednio i wybrano sześć dodatnich kolonii, tą samą metodą po186 809 wlekania. Ponownie hodowano te sześć dodatnich kolonii, plazmid oczyszczono i trawiono restrykcyjnie aby potwierdzić obecność insertu.
Automatyczne sekwencjonowanie łańcucha lekkiego kappa
Przeprowadzono sekwencjonowanie klonów nowego łańcucha lekkiego w University of Virginia Biomolecular Research Facility, przy użyciu ABI Prism 377 Automated DNA Sequencer. Dla każdego klonu, 100 ng cDNA i 3,2 pmola primera T3 połączono w całkowitej objętości 12 μΐ i dostarczono do urządzenia. Tam dodano cztery dideoksy nukleotydy znakowane barwnikiem oraz polimerazę FS AmpliTaq, do tej samej rury reakcyjnej. Całość reakcji załadowano w pojedynczym torze do elektroforezy na 36 cm 5,0% żelu akrylamidowym łatwym do odczytania. Rzeczywistą detekcję czasową poszczególnych fragmentów poddanych elektroforezie uzyskano przez analizę laserową za pomocą wytwarzania obrazu z aparatem CCD. Wyniki sekwencjonowania z urządzenia ściśle pasowały do mysich łańcuchów lekkich kappa z bazy danych GenBank, a prawidłową sekwencję zasad łańcucha lekkiego ukazuje się w fig. 3. Sekwencje cDNA dla łańcuchów ciężkiego i lekkiego S19 w AB można wykorzystać, przy użyciu konwencjonalnych technologii, do zapewnienia rekombinowanych przeciwciał, włączając przeciwciała z delecjami miejsca i delecjami domen oraz addycjami.
Białko SAGA-1:
Nowo złożone mAB S19 skutecznie wiąże i aglutynuje ludzkie nasienia. Wyniki fotografowanych testów aglutynacji wyraźnie pokazują, że wiązanie i aglutynacja występują w wielu miejscach na całej powierzchni plemnika. Oprócz skutecznego środka plemnikobójczego zapewnionego przez mAB S19, związany antygen SAGA-1 zaznacza się mocno jako skuteczne źródło szczepionki. Konkretnie, zdolność do wytwarzania przeciwciał wobec białka SAGA-1 jako antygenu/immunogenu, powinna zapewnić kobietom skuteczne zabezpieczenie przed zapłodnieniem, to jest szczepionkę antykoncepcyjną. Ten sam antygen można stosować jako standardowy odczynnik testowy do monitoringu skuteczności protokołu szczepienia. Tak więc, zaszczepione kobiety można przetestować, na podstawie okresowej, oraz próbki płynu testować przeciw znanej ilości SAGA-1, w konwencjonalnych formatach testowych, łącznie z testami ELISA i Western oraz Southern blotting. Wiązanie dodatnie odzwierciedla pokolenie przeciwciał, które wiąże białko SAGA-1, a więc zabezpieczenie przed zapłodnieniem. Przez stosowanie SAGA-1 jako standaryzowanego testu i testowania pod względem ilości wiązania, można mierzyć miano lub stężenie wytworzonych przeciwciał. Jako odpowiednie, miana można ustalić zdając się na test aglutynacji omówiony powyżej, test stosujący białko SAGA-1 jako standard, odzwierciedlający adekwatne miana jest potwierdzeniem uzyskania stanu artypłodności, który następnie wymaga tylko utrzymania przez żądany okres niepłodności.
Identyfikacja białka SAGA-1:
Przeciwciało monoklonalne S19 identyfikuje SAGA-1 jako szeregi glikoprotein o niskim ciężarze cząsteczkowym, przez analizę Western blot (fig. 1). Ekstrakt przemytej ludzkiej spermy wytworzono w 1% SDS i rozdzielono przez redukujący SDS-PAGE. Przeciwciało monoklonalne S19 reagowało z szeregami nakładających się wstęg, których ciężar wynosił od około 15 do 25 kD (tor 3). Immunoreaktywność S19 z pokrewnym antygenem zniesiono przez potraktowanie 10 mM kwasem nadjodowym (tor 6), mimo, że reaktywność przeciwciała monoklonalnego z epitopem peptydowym białka SP-10 była nie zakłócona (tory 2 i 5). Odkrycie to pokazało, że epitop rozpoznawany przez przeciwciało monoklonalne S19 jest cząstką węglowodanową. (Fig. 1; tor 1, czarne barwienie amidowe, tory 2 i 5, MHS-10; tory 3 i 6 S19; tory 4 i 7, brak płynów puchlinowych; tory 2-4, brak traktowania kwasem nadjodowym; tory 5-7, wstęgi immunoblot, traktowane kwasem nadjodowym; M, markery ciężaru cząsteczkowego w kD: 97,4, 68, 43, 29, 18,4, 14,3). Ponadto, traktowanie ekstraktu SDS nasienia proteinazą K niszczyło immunoreaktywność S19 (dane nie ukazane), wskazując, że antygen S19 jest prawdopodobnie glikoproteiną. Zidentyfikowaną glikoproteinę S19 oznaczono Sperm Agglutination antigen-1 (SAGA-1) na podstawie jego zdolności do silnej aglutynacji ludzkiego nasienia.
186 809
Metoda silnego wzbogacania SAGA-1:
Charakterystyka rozpuszczalności wskazuje, że jest on hydrofobowym, integralnym białkiem błonowym. Reaktywności S19 nie wykryto w ekstraktach ludzkiego nasienia wytworzonych za pomocą detergentu o wysokiej zawartości soli (1 M NaCl lub 0,6 M KCl) i/lub umiarkowanego niejonowego (0,1% NP-40 lub Triton Χ-100). Wyniki te wskazują, że SAGA-1 nie ekstrahowano przez traktowanie stosowane klasycznie w celu usunięcia białek peryferycznych.
Zbadano dodatkowy dowód, że SAGA-1 istnieje jako integralne białko błonowe, przy użyciu rozdziału fazowego z użyciem Triton Χ-114, jak opisano u Bordiera (1981). Detergenty niejonowe, takie jak Triton Χ-114 rozpuszczają integralne białka błonowe przez zmianę normalnego lipidowego środowiska. Triton Χ-114 tworzy małe micele w temperaturze 0°C po rozproszeniu w roztworze wodnym powyżej jego krytycznego stężenia miceli. Hydrofobowe integralne białka błonowe wprowadza się do tych miceli mimo, że białka hydrofilowe pozostają w środowisku wodnym. Gdy taki roztwór ogrzeje się, micele zwiększają rozmiar i wychodzą z roztworu, tworząc fazę bogatą w detergent, który można wydzielić z roztworu wodnego przez wirowanie. Bordier (1981) stosował tę metodę do pokazania, że większość integralnych białek błonowych dzieli się za pomocą fazy detergentowej, chociaż białka hydrofilowe pozostają w fazie wodnej.
Aby zbadać dzielenie fazowe z użyciem Triton Χ-5 114 SAGA-1, przemyte ludzkie nasienie ekstrahowano w 1% Triton Χ-114, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl w temperaturze 4°C i wirowano w celu usunięcia resztek komórkowych. Po trzech cyklach dzielenia fazowego, równe ilości początkowego ekstraktu nasienia, fazę detergentową i fazę wodną, analizowano przez SDS-PAGE i immunoblotting (fig. 2). Białko SP-10 specyficzne dla ludzkiego nasienia/jądra, peryferyjne, akrosomowe białko błonowe służyło jako kontrola; reaktywność przeciwciała monoklonalnego MHS-10 z SP-10 wykryto w fazie wodnej. Reaktywność S19 wykryto w początkowym ekstrakcie nasienia i w fazie detergentowej lecz nie w fazie wodnej. Wyniki te wskazują, że przeciwciało monoklonalne S19 reaguje z hydrofobową, integralną glikoproteiną błonową. Barwienie czernią amidową pokazało, że większość białek całości nasienia pozostało rozpuszczalnych w fazie wodnej, chociaż kilka białek rozdzieliło się przy użyciu Triton Χ-114. Zatem, rozdział fazowy za pomocą Triton Χ-114 będzie użyteczne jako początkowy etap w oczyszczaniu natywnego SAGA-1.
Substytucja detergentu jest wymagana przy oczyszczaniu:
Właściwości biochemiczne detergentu Triton Χ-114 nie sprzyjały następnym metodom oczyszczania. Przy wymaganym stężeniu tego odczynnika, Triton Χ-114 wprowadza białko do wielkich miceli detergentu, które maskują wiązanie białka z macierzą powinowactwa. Ponadto, Triton Χ-114 nie można stosować w temperaturze pokojowej. Dlatego białko w ekstrakcie Triton Χ-114 strącano acetonem o temperaturze -20°C i zawieszono w 0,5% oktyloglukozydzie, TBS (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl). Oktyloglukozyd można stosować w temperaturze pokojowej i wymagane stężenie nie hamuje interakcji białko-macierz immunologiczna.
Przeciwciało monoklonalne usieciowano z Protein G-Sepharose za pomocą dichlorowodorku dimetylopimelimidanu, jak wyszczególniono poniżej. Tę macierz immunologiczną i kulki Protein G-sepharose nie sieciujące przeciwciała monoklonalnego, czyli kontrolę ujemną pod względem specyficzności przeciwciała, inkubowano z ekstraktem oktyloglukozydowym. Frakcje związane poddano analizie Western z przeciwciałem monoklonalnym S19 (fig. 4). SAGA-1 zidentyfikowano w ekstrakcie oktyloglukozydowym i we frakcji, która związała się z macierzą immunologiczną, lecz nie we frakcji wymytej z kulek Protein G-Sepharose bez przeciwciała. Wyniki te wskazują, że SAGA-1 wiąże się specyficznie z macierzą immunologiczną. Wstęgi o około 42 kD obserwowane w każdym torze żelu barwionego srebrem, jak się okazało były zanieczyszczeniami obecnymi w buforze do ładowania żelu. (fig. 3; tory 1-3, barwienie srebrem; tory 4-6, Western blot; tory 1 i 4, ekstrakt oktyloglukozydowy inkubowany z macierzą immunologiczną: tory 2 i 5, frakcja białka, która związała się z macierzą immunologiczną białko-G-S19; toiy 3 i 6 frakcja białka, która związała się z samymi kulkami białko-G-Sepharose).
186 809
Protokół dla powinowactwa immunologicznego
Oczyszczanie SAGA-1 z ludzkiego nasienia:
Wytwarzanie ekstraktu nasienia: Pozostawić dwadzieścia do trzydziestu ludzkich ejakulatów do stopienia się w temperaturze pokojowej, przemyć dwukrotnie przez wirowanie przy 400 X g z pożywką Ham F-10 z 0,1 M Hepes (pH 7,4) i przechować zamrożone do czasu użycia.
Rozdzielanie faz: Zlać stopione grudki i ekstrahować w temperaturze 4°C w TBS (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl), zawierającym 1,7% Triton X-114 i wirować przy 13000 x g w celu usunięcia resztek komórek. Ogrzać ekstrakt w temperaturze 30°C przez 3 minuty i wirować przy 300 x g przez 3 minuty w celu rozdzielenia faz detergentowej i wodnej. Ponownie podzielić każdą fazę dwukrotnie w celu zapewnienia pełnego rozdziału. Sklarować ostateczną fazę detergentową przez ultrawirowanie przy 100000 x g, w celu usunięcia nierozpuszczalnych resztek komórkowych. Analiza immunoblot z S19 powinna potwierdzić, że SAGA-1 został rozdzielony za pomocą fazy detergentowej.
Wytrącanie acetonem i ponowne zawieszenie w oktyloglukozydzie: Aby wytrącić białko w ekstrakcie Triton x-114 dodać 8 objętości acetonu o temperaturze -20°C, wymieszać i przechowywać 4 godziny do nocy w temperaturze -20°C. Zebrać osad przez wirowanie przy 3000 x g, zdekantować supernatant i pozostawić grudkę do wyschnięcia na powietrzu. Ponownie zawiesić grudkę w 0,5% oktyloglukozydzie, TBS przy dwukrotnej początkowej objętości ekstraktu Triton C-114. Ultrawirować przy 100000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4°C w celu usunięcia nierozpuszczalnych białek. Usunąć supernatant do użytku w chromatografii powinowactwa.
Preparaty macierzy immunologicznej S19:
Częściowo oczyścić immunoglobuliny ze zlanych płynów puchlinowych, zawierających S19 przez wytrącenie 50% siarczanem amonowym. Przemyć osad dwukrotnie 50% siarczanem amonowym i ponownie zawiesić w PBS (20 mM NaPO4, 150 mM NaCl, pH 7,4) przy jednej-dziesiątej początkowej objętości płynu puchlinowego. Dializować przeciw PBS w celu usunięcia siarczanu amonowego. Określić stężenie białka przy użyciu BCA Reagent Assay Kit (Pierce Chemical Company). Inkubować białko wytrącone siarczanem amonu z kulkami Protein G-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) w PBS, pH 7,4 przez noc w temperaturze 4°C, co pozwala na związanie IgG. Wprowadzić 15 mg białka strąconego siarczanem amonu do każdego ml kulek Protein G-sepharose. Wlać zawiesinę kulek do kolumny chromatograficznej i przemyć PBS (pH 8,2) aż do momentu nie wykrycia białka w eluacie, monitorowanym przez absorbancję UV przy A280· Aby usieciować kowalentnie związaną IgG z kulkami Protein G, zrównoważyć kolumnę 0,2 M trietanoloaminą (pH 8,2), zawiesić macierz w 20 objętościach 20 mM dichlorowodorku dimetylopimelimidanu, 0,2 M trietanoloaminy (pH 8,2) i inkubować przez 45 minut, przy delikatnym mieszaniu w temperaturze pokojowej. Aby zatrzymać reakcję sieciowania, wirować kulki (500 x g przez 3 minuty), zawiesić kulki w równej objętości 20 mM etanoloaminy i inkubować tę zawiesinę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wlać zawiesinę kulek do kolumny chromatograficznej, zrównoważyć 0,2% azydkiem sodu, PBS (pH 8,2) i przechowywać w temperaturze 4°C do czasu użycia.
Chromatografia powinowactwa: Zrównoważyć przygotowaną kolumnę powinowactwa immunologicznego 0,5% oktyloglukozydem, TBS. Prowadzić obieg roztworu oktyloglukozydu, zawierającego hydrofobowe białka nasienia przez kolumnę przy 1,3 ml/minutę, w sposób ciągły przez 16 godzin w temperaturze 4°C. Przemyć kolumnę 0,5% oktyloglukozydem, TBS, w celu usunięcia nie związanego materiału i monitorować stężenie białka w przemytym roztworze przez absorbancję UV. Po usunięciu nie związanych białek, wymyć związany materiał 0,1 M glicyną, 0,15 M NaCl (pH 2,4), 0,5% SDS. Zebrać 3 ml frakcje i monitorować w nich stężenie białka za pomocą zestawu BCA Reagent Assay i absorbancji UV. Zlać frakcje, zawierające białko i zatężyć przy użyciu urządzenia zatężającego przez filtrację błonową Amicon.
Analiza czystości próbki: Oddzielić białko oczyszczone na kolumnie powinowactwa immunologicznego S19 przez SDS-PAGE przez 15% akrylamid i zabarwić srebrem lub przenieść na nitrocelulozę. Przetestować odciski immunologiczne pod względem reaktywności z SAGA-1 przez inkubację z przeciwciałem monoklonalnym S19, po czym przez standardową
186 809 analizę Western blot. Porównać masę cząsteczkową i liczbę wstęg białkowych wykrytych przez barwienie srebrem oraz przez reaktywność S19, w celu oszacowania czystości.
Szczepionka: .
Wynalazek Zgłaszającego obejmuje szczepionkę antykoncepcyjną, wykorzystującą SAGA-1, a konkretnie każde białko, które jest związane przez mAB S19, jako immunogen. Immunizacja SAGA-1 wytworzy przeciwciała u gospodarza, wystarczające do celów inhibicji zapłodnienia. Wytworzenie samej szczepionki następuje w tradycyjnym formacie. Oczyszczony immunogen, korzystnie rekombinowany immunogen, posiadający regiony epitopowe S19, wprowadza się w odpowiednim farmaceutycznym nośniku.
Preparat dopuszczalnej szczepionki, wykorzystującej nowy immunogen Zgłaszającego, można uzyskać postępując zgodnie z tradycyjnymi metodami. Szczepionki opisane u Aitkena, Freemana i Herra, jak wyżej, można łatwo dostosować do białka SAGA-1 oraz jego pochodnych związanych przez mAB S19. W szczególności, szczepionki antykoncepcyjne, wykorzystujące białko PH-20 wykorzystane przez Primokoffa, jak wyżej oraz Primokoffo i in., oraz Primokoffa, Am. J. Reprod. Immunol., 31:208-210 (1994), odzwierciedlają powodzenie adaptacji antygenu białka nasienia do immunogenu szczepionki w odpowiednim nośniku. Chociaż białka wykorzystane u Primakoffa i innych były niestety niezdolne do inhibicji zapłodnienia w wysokim stopniu (w ponad 95%) u naczelnych, specyficzny charakter białka SAGA-1, zwłaszcza jego szerokie rozmieszczenie na całej powierzchni komórki plemnikowej oraz liczne drogi interakcji między nim i odpowiadającymi przeciwciałami monpklpnalyymi, zapewnia możliwość uzyskania inhibicji zapłodnienia rzędu doustnych środków antykoncepcyjnych (to jest 99%). Aby wywołać adekwatne miano przeciwciał, możliwe, że większość testowanych podmiotów, włączając kobiety, trzeba będzie szczepić zgodnie z protokołem, bardzo rozdzielonymi wstrzyknięciami, aby dać czas na wytworzenie odpowiedniego miana przeciwciał po każdej injekeji. fajekcję ppdowoye około raz na miesiąc, po którym następuje test, z użyciem białka SAGA-1 jako standardu do określenia miana przeciwciał, powinny być adekwatne po okresie około trzech miesięcy, aby dać wystarczającą inhibicję zapłodnienia w celu pewnego stosowania. Oczywiście, jeśli test diagnostyczny odzwierciedla niższe miano przeciwciał, tak, że nie zapewnia prawie całkowitej inhibicji zapłodnienia, powinno się przedsięwziąć dodatkowy program szczepienia lub innego testowania w celu określenia powodu niskiego miana przeciwciał.
Zastosowanie immunogenu do wytworzenia przeciwciał wobec antygenu naturalnego stanu lub antygenu rekombinowanego, z których oba obejmuje zastrzeżony wynalazek, jest jako takie, rutynowe dla przeciętnego specjalisty. Nowe wykorzystanie Zgłaszającego rozciąga się na wprowadzenie i poleganie na unikalnym białku SAGA-1, po raz pierwszy niniejszym w pełni scharakteryzowanym. Rutynowa optymalizacja dawki, nośniki, sposoby prezentacji i inne nie stanowią aspektu wynalazku, jako takie. Niemniej, sugeruje się, aby rutynową dawką była dawka rzędu 100 pg białka SAGA-1 - 500 pg białka SAGA-1 w objętości 0,5 ml, będąc odpowiednią wartością poszczególnego dawkowania. Ponieważ przeciwciała wytworzone przez program szczepienia będą aglutynować nasienie skuteczniej niż inne specyficzne przeciwciała anty-spermowe, z powodu wiązania na zwiększonym obszarze powierzchni, uzyskuje się wzmożoną skuteczność szczepionki.
Jak zwykle w większości szczepionek, szczepionka multiwalentna jest często skuteczniejsza niż pojedyncza. Jak zauważono poprzednio, znane są liczne antygeny specyficzne dla nasienia oprócz SAGA-1. Mimo, że indywidualnie antygeny te nie powoduj ą zwiększenia inhibicji zapłodnienia o wysokim stopniu pewności, można je dodać do szczepionki na bazie SAGA-1, aby zapewnić dodatkową niezawodność. W szczególności, pożądane jest połączenie SAGA-1 i SP-10 jako immunogenu dla multiwalentnej szczepionki. Ponieważ badania pokazują, że można łatwo wywołać przeciwciała wobec tych białek, możliwe jest wytworzenie połączonej zdolności wiązania wobec obu białek, jak również innych białek poznanych w tej dziedzinie, które można dodać jako immunogenicznych członków szczepionki multiwalentnej. Jednakże istotne jest, aby białko SAGA-1 lub każda odmiana białka związana przez przeciwciało S19, było centralnym elementem szczepionki, jako że przeciwciała wobec niego za186 809 pewniąją o wiele większe możliwości wiązania, a zatem większy stopień pewności inhibicji zapłodnienia.
Diagnostyka:
Właściwości białek związanych przez mAB S19, włączając białko SAGA-1, czynią możliwymi dwa różne rodzaje testów diagnostycznych. Początkowo, konieczne jest monitorowanie rozwoju przeciwciał wobec immunogenu szczepionki, białka SAGA-1 lub jej odmian. Pewne potencjalne kandydatki mogą nie posiadać odpowiedniego układu odpornościowego, a u wielu osób zmienia się miano przeciwciał wytworzony w odpowiedzi na jakikolwiek immunogen albo protokół podawania immunogenu. Wywołanie odpowiedniego miana przeciwciał można łatwo potwierdzić przy użyciu białka SAGA-1 jako standardu antygenowego. Stosując test aglutynacji opisany powyżej pod względem mAb S19, można łatwo określić stężenie niezbędne do 100% aglutynacji. To stężenie białka SAGA-1, prawidłowo unieruchomionego i prezentowanego, testuje się przeciw próbce pobranej od pacjentki. Uzyskanie 100% wiązania sugeruje odpowiednie miano przeciwciał. Ponieważ każdy taki program szczepienia musi być przeprowadzony pod kontrolą kliniczną, format testowania może być konwencjonalny, z użyciem ELISA, analizy Western blotting lub innych ustalonych w technice formatów.
Oprócz tego, wzrasta zainteresowanie łatwym do użycia, „przyjaznym dla użytkownika” komercjalnym testem diagnostycznym, to jest odręcznym testem diagnostycznym. Powody zainteresowania takim rodzajem diagnozowania oraz rozmaite zastosowania takich testów diagnostycznych, omawia się szczegółowo w zgłoszeniu patentowym 5 605 803 opublikowanym 25 lutego 1997, które załącza się niniejszym jako odnośnik. Testy diagnostyczne tam ujawnione wykorzystują przeciwciało, wiążące SP-10, MHS-10 lub przeciwciała, posiadające charakterystykę wiązania przeciwciał o ekspresji w linii komórkowej hybrydomy z ATCC dostępnych po numerem dostępu HB 10039. Jak opisano w załączonym zgłoszeniu, ten rodzaj odręcznego testu diagnostycznego znajduje zastosowanie w środowiskach sądowych, może być użyteczny w określaniu obecności linii komórkowych normalnych plemników, posiada zasadniczą wartość dla doświadczających trudności w uzyskaniu płodności, u mężczyzn po wazektomii oraz przy testowaniu mężczyzn po wazektomii, zarówno mężczyzn jak i kobiet, a także testowania mężczyzn po ponownym połączeniu nasieniowodów, aby określić powodzenie operacyjnego połączenia. Przy każdym z różnych powodów, określenie obecności nasienia w próbce biologicznej, albo ejakulacie albo próbce pochodzącej z ejakulatu lub przewodu nasiennego mężczyzny, ma istotne znaczenie medyczne. Antygen wiązany przez mAB S19, białko SAGA-1 oraz odpowiadające odmiany i rekombinowane pochodne, posiadające epitop odpowiadający na CDR S19, można wykorzystać w formatach testowych, takich jak opisane w załączonym zgłoszeniu patentowym 5 605 803 opublikowanym 25 lutego 1997.
Tak więc przeciwciało S19 można związać ze stałym podłożem i stosować do wychwytu białka SAGA-1. Rozpoznawanie obecności antygenu SAGA-1 można zakończyć przez użycie drugiego odczynnika monoklonalnego lub poliklonalnego. Patrz np. Shen i in., Am. J. Reprod. Immunol., 29: 231-240 (1993). Inne formaty testowe mogłyby wykorzystywać wskaźnik knotowy lub prętowy oraz barwne kulki kodowane przeciwciałem. We wszystkich tych odmianach, zasadniczym odczynnikiem jest mAB S19, lub podobne przeciwciało wobec białka SAGA-1. Każde białko obecne w testowanej próbce wiąże się lub jest wychwytywane przez unieruchomione przeciwciało. Tak wiec, w teście diagnostycznym przeznaczonym do monitorowania rozwoju odpowiedniego miana przeciwciał, stosuje się białko SAGA-1 lub podobne białko jako standardowy odczynnik testowy. W „domowym zestawie testowym”, w którym pożądana jest weryfikacja obecności antygenu, przez którą weryfikuje się obecność nasienia, odczynnikiem odpowiadającym jest przeciwciało monoklonalne.
Zgłaszający ujawnił swój wynalazek w kategoriach zarówno ogólnych jak i konkretnych. Odmiany ujawnią się fachowcom, a przykłady i konkretne postacie realizacji nie ograniczają w zamierzeniu, chyba, że zaznaczono tak w wykazie. Odmiany ujawnią się fachowcom w tej dziedzinie bez ćwiczenia zdolności. W szczególności fachowcom ujawnią się poziomy stężeń, protokoły podawania, praktyki rekombinacyjne oraz odmiany i temu podobne, i pozostaną w zakresie wynalazku, chronione jako wytyczone przez zastrzeżenia przedłożone poniżej.
186 809
Μ 1 2 3 4 5 5 7
FIG. 1
186 809
Czerń amidowa S19 kD E D A~ ~E D A
MHS-10 E D~A
18.4-
'•JH»·
14.3E = Cały ekstrakt nasienia D = Faza detergentowa A = Faza wodna
FIG.2
186 809
CD
FIG. 3
OU
CD
UD
| 1_ | CD | <— | ||
| CU | ru | 1- | 00 | c |
| CU | — | c | — | CS |
| CD | CJ | CJ | ||
| <E | c | CU | ||
| CU | F— | c | ||
| CU | F— | <c | ||
| |— | F— | CU | ||
| <C | c | CU | ||
| CD | F— | 1- |
CD m
O
OS
| <c | CD | CU | CD | I- |
| CD | —< | CU | f— | |
| CD | —> | <E | — | CD |
| CU | C | |||
| 1- | c | CD | ||
| CU | CD | C | ||
| <r | CJ | |||
| CD | CD | <c | ||
| <r | c | 1— | ||
| CU | u_ | |||
| CD | c | CD | __ | |
| CD | CD | c | sO | c |
| ί- | — | c | — | : D |
| ου | CD | i— | ||
| CU | c | CU | ||
| CD | CU | CU | ||
| CD | 1— | |||
| CU | CU | CU | ||
| CU | <£ | CD | ||
| CU | I— | C | ||
| ,_ | CD | CD | CD | CD |
| CU | CDO | I— | LTD | <r |
| 1— | 1— | --- | CU | |
| 1— | CU | CU | ||
| CU | h— | 1— | ||
| CD | CD | CU | ||
| C | <C | 1- | ||
| CU | CD | CD | ||
| «· \ | <C | <E |
CC 'TT
| C | <E | — 'CD |
| C | I— | <C |
| CU | CU | CU |
| CU | I— | CU |
| CU | <C | CD |
| <r | CD | <E |
| CD | C | <E |
| l— | CU | CD |
α
CU o
CD <c
CU c
CD
CD
C
CU t—
| CD | <E | CD | CU | CD | CD |
| CD | CD | — | Γ- | 1— | |
| OJ | <C | on | — | on | CU |
| <E | CD | <c | |||
| CU | 1- | <E | |||
| 1— | <E | CJ | |||
| CU | CU | CU | |||
| <E | <c | <c | |||
| O | CU | CU | |||
| <L | c | CD | |||
| CD | CJ | CD | CD | h— | |
| on | I— | CTS | CD | UD | CU |
| CU | CU | C | on | CD | |
| F—- | C | 1— | |||
| <r | <r | <r | |||
| CD | CU | cs | |||
| <3Z | 1— | 1— | |||
| CU | CU | CU | |||
| <c | r— | CS | |||
| CD | cs | ||||
| CD | CD | CD | CD | CD | CS |
| ou | CD | CC | — | un | CJ |
| ou | <£ | ou | CU | on | <c |
| CU | b— | <E | |||
| I— | i- | <E | |||
| <C | 1- | <C | |||
| CD | c | 1— | |||
| CD | t— | c | |||
| 1— | l— | c | |||
| CD | <c | ||||
| CD | <£ | CD | CD | CD | CJ |
| CU | O- | <C | •«3- | CD | |
| CU | CD | OJ | CD | on | t— |
| CD | CD | I— | |||
| 1- | CD | CS | |||
| CD | 1— | c | |||
| <r | CU | c | |||
| CU | »— | c | |||
| |- | <£ | CJ | |||
| 1- | CD | c | |||
| CD | CD | CD | CD | CD | CD |
| CD | CD | CD | <£ | OU | CJ |
| OU | <C | OU | CD | on | CS |
| CU | I— | CS | |||
| <c | CJ | CJ | |||
| CD | CS | 1— | |||
| <c | CD | CJ | |||
| CU | <c | CS | |||
| CU | CD | CS | |||
| CU | CS | CJ | |||
| CD | CD | ,_ | CD | 1— | |
| CD' | CD | LD | 'CD | .—· | 1- |
| --1 | CD | OU | C | on | CS |
| CD | CD | CU | |||
| CD | <C | c | |||
| 1- | CU | CU | |||
| CU | CD | 1- | |||
| 1- | <c | 1- | |||
| 1- | CU | c | |||
| 1- | — |
CD
CD
1ATCCA1C
186 809 kD 1 2 3 4 5 6
FIG. 4
186 809
FIG. 5
GGGAATTCAT GGAATGGAGC TGGGTTTTCC TCTTCTTGGT AGCAACAGCC
CAGGTGTCC ACTCCCAGGT CCAATTGCAG CAACCTGGGT CTGAACCGGT
GAGGCCTGGA GCTTCAGTGA AGGTGTCCTG CAGGGCTTCT GGCTACAAAT
TCACCACCTA CTGGATGCAC TGGGTGAGGC AGAGGCCTGG ACAAGGCCCT
GAGTGGATTG GAGATATTTA TCCTGGiAGT GGTGATTCTA ACTACGATGT
GAAGFTCAAG AACAAGGCCA CACTGACTGT AGACACATCC TCCAGCACAG
TTTACATACA ACTCAGCAGC CTGACATCTG AGGACTCCGC GGTCTATTAC
TGTGCAAGAA GGGACTATGG TTGCCCTTTT GTTTACTGGG GCCAAGGGAC
TCTGGTCACT GTCTCTGCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCC GTTTATCCCC tggcccclag aacttggg
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.
Claims (9)
- Zastrzeżenia patentowe1. Przeciwciało monoklonalne, podlegające ekspresji przez depozyt hybrydomy dostępny pod numerem dostępu ATCC HB 12144.
- 2. Oczyszczony preparat glikoproteiny powierzchniowej nasienia związany przez przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1.
- 3. Szczepionka antykoncepcyjna, obejmująca ilość glikoproteiny powierzchniowej nasienia według zastrz. 2 w ilości skutecznej do indukcji wytwarzania przeciwciał wobec niego, po podaniu samicy ssaka, w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.
- 4. Szczepionka według zastrz. 3, znamienna tym, że wymieniona glikoproteina jest obecna w wystarczających ilościach tak, że po zakończeniu protokołu szczepienia, wymieniona samica ssaka wykazuje miano przeciwciał wystarczające do zapewnia co najmniej 95% inhibicji zapłodnienia.
- 5. Sposób określania miana przeciwciał u szczepionej pacjentki, otrzymujące szczepionkę według zastrz. 3, obejmujący mieszanie próbki od wymienionej szczepionej pacjentki ze związaną glikoproteiną, przy czym wymieniona glikoproteina jest białkiem według zastrz. 2, oraz wykrywanie wiązania między wymienioną związaną glikoproteiną i przeciwciałem obecnym w wymienionej próbce, znamienny tym, że ilość związanej glikoproteiny jest znana, a stopień związania związanej glikoproteiny jest wskaźnikiem miana przeciwciał w wymienionej próbce, wystarczającego do inhibicji zapłodnienia u wymienionej pacjentki.
- 6. Środek plemnikobójczy, zawierający jako czynnik aktywny przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.
- 7. Środek plemnikobójczy według zastrz. 6, znamienny tym, że wymieniony środek plemnikobójczy zawiera stężenie przeciwciał monoklonalnych wystarczające na tyle, że jedna dawka wymienionego środka plemnikobójczego skutecznie wiąże 100·% wszystkich komórek plemnikowych obecnych w ejakulacie.
- 8. Środek plemnikobójczy według zastrz. 7, znamienny tym, że wymienione przeciwciała monoklonalne są obecne na powierzchni liposomów.
- 9. Środek plemnikobójczy według zastrz. 8, znamienny tym, że wymienione liposomy są liposomami nie-fosfolipidowymi dodatnio naładowanymi.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/671,622 US5830472A (en) | 1996-06-28 | 1996-06-28 | Purified sperm surface antigen, monoclonal antibody therefor and applications therefor |
| PCT/US1997/010813 WO1998000164A1 (en) | 1996-06-28 | 1997-06-30 | Purified sperm surface antigen, monoclonal antibody therefor and applications therefor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL330842A1 PL330842A1 (en) | 1999-06-07 |
| PL186809B1 true PL186809B1 (pl) | 2004-02-27 |
Family
ID=24695254
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL97330842A PL186809B1 (pl) | 1996-06-28 | 1997-06-30 | Oczyszczony antygen powierzchniowy nasienia, przeciwciało monoklonalne dla niego i zastosowania z nim związane |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5830472A (pl) |
| EP (1) | EP0964696A4 (pl) |
| JP (1) | JP2001506841A (pl) |
| CN (1) | CN1227497A (pl) |
| AU (1) | AU722559B2 (pl) |
| BR (1) | BR9710089A (pl) |
| CA (1) | CA2258717A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ293040B6 (pl) |
| EA (1) | EA003531B1 (pl) |
| HU (1) | HUP9904620A3 (pl) |
| IL (1) | IL127764A (pl) |
| NO (1) | NO986050L (pl) |
| PL (1) | PL186809B1 (pl) |
| SK (1) | SK281505B6 (pl) |
| UA (1) | UA74765C2 (pl) |
| WO (1) | WO1998000164A1 (pl) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1162880A1 (en) * | 1999-03-23 | 2001-12-19 | University of Virginia | Human sperm surface antigens |
| GB9913556D0 (en) * | 1999-06-11 | 1999-08-11 | Zeneca Ltd | Assays |
| AU6227800A (en) * | 1999-07-23 | 2001-02-13 | University Of Virginia Patent Foundation | Recombinant antibody directed against human sperm antigen |
| US20020151089A1 (en) * | 1999-09-15 | 2002-10-17 | Chapman William H. | Separating components of biological samples |
| AU1778701A (en) * | 1999-11-17 | 2001-05-30 | University Of Virginia Patent Foundation | Sperm cell selection system |
| JP2003520594A (ja) | 2000-01-19 | 2003-07-08 | ユニバーシティ オブ バージニア パテント ファウンデーション | 精子特異的タンパク質 |
| US7125550B2 (en) * | 2000-01-19 | 2006-10-24 | University Of Virginia Patent Foundation | Human sperm specific lysozyme-like proteins |
| US6962988B2 (en) | 2000-01-20 | 2005-11-08 | University Of Virginia Patent Foundation | Egg specific surface proteins |
| US6541206B1 (en) * | 2000-06-19 | 2003-04-01 | Gabor B. Huszar | Objective biochemical method for assessment of sperm quality |
| US20030207393A1 (en) * | 2001-01-19 | 2003-11-06 | Herr John C. | Cbp86, a sperm specific protein |
| US20080318250A1 (en) * | 2004-02-06 | 2008-12-25 | Linda Gilmer | Compositions and Methods for Identifying Sperm for Forensic Applications |
| US8817965B2 (en) | 2006-07-21 | 2014-08-26 | Bce Inc. | Method, system and apparatus for handling establishment of a communication session |
| US20080187549A1 (en) * | 2007-02-07 | 2008-08-07 | Morey William A | Polyantigenic-based (multiple antigens) modi or set of methods for developing infertility vaccines |
| US20080290037A1 (en) * | 2007-05-23 | 2008-11-27 | Applera Corporation | Methods and Apparatuses for Separating Biological Particles |
| US20090136962A1 (en) * | 2007-11-27 | 2009-05-28 | Herr John C | Diagnostic markers for cancer |
| WO2009126648A1 (en) * | 2008-04-07 | 2009-10-15 | Auburn University | Zona pellucida binding peptides, expression vectors, compositions, and methods for species-specific immunocontraception of animals |
| GB0911885D0 (en) * | 2009-07-08 | 2009-08-19 | Oxford Biodynamics Ltd | Screening method for cell aging |
| IL208820A0 (en) | 2010-10-19 | 2011-01-31 | Rachel Teitelbaum | Biologic female contraceptives |
| WO2014202978A1 (en) | 2013-06-18 | 2014-12-24 | Isis Innovation Limited | Method of detecting the presence or absence of autoantibodies |
| CN103852583A (zh) * | 2014-03-18 | 2014-06-11 | 南京医科大学 | 一种快速检测Boule蛋白的胶体金试剂条及检测方法 |
| CN106153938B (zh) * | 2015-04-09 | 2018-05-11 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 抗ACTL7a和GAPDH-2抗体的检测方法、试剂盒及其用途 |
| KR101916959B1 (ko) * | 2015-07-13 | 2018-11-08 | 김동구 | 정자의 성 감별용 항체 및 이의 용도 |
| CN106526162A (zh) * | 2016-11-03 | 2017-03-22 | 天津市宝坻区人民医院 | 一种抗精子抗体检测方法 |
| CN117987376B (zh) * | 2024-03-26 | 2024-06-25 | 玛特瑞尔(吉林)生物技术有限公司 | 人精子顶体蛋白sp-10单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5227160A (en) * | 1988-07-15 | 1993-07-13 | The Biomembrane Institute | Monoclonal antibody nuh2 capable of inactivating motility of human sperm, antigen defined by said monoclonal antibody and methods of using said monoclonal antibody and antigen |
| US5605803A (en) * | 1989-03-03 | 1997-02-25 | University Of Virginia Alumni Patents Foundation | Human sperm diagnostic |
| US5436157A (en) * | 1989-03-03 | 1995-07-25 | The University Of Virginia Alumni Patents Foundation | Human intra-acrosomal sperm antigen |
-
1996
- 1996-06-28 US US08/671,622 patent/US5830472A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-06-30 PL PL97330842A patent/PL186809B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-06-30 CN CN97197175A patent/CN1227497A/zh active Pending
- 1997-06-30 SK SK1795-98A patent/SK281505B6/sk unknown
- 1997-06-30 HU HU9904620A patent/HUP9904620A3/hu unknown
- 1997-06-30 AU AU34071/97A patent/AU722559B2/en not_active Ceased
- 1997-06-30 UA UA99010427A patent/UA74765C2/uk unknown
- 1997-06-30 WO PCT/US1997/010813 patent/WO1998000164A1/en not_active Application Discontinuation
- 1997-06-30 EA EA199900067A patent/EA003531B1/ru unknown
- 1997-06-30 BR BR9710089-7A patent/BR9710089A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-06-30 CZ CZ19984284A patent/CZ293040B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-06-30 CA CA002258717A patent/CA2258717A1/en not_active Abandoned
- 1997-06-30 EP EP97930179A patent/EP0964696A4/en not_active Withdrawn
- 1997-06-30 IL IL12776497A patent/IL127764A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-06-30 JP JP50421698A patent/JP2001506841A/ja not_active Ceased
-
1998
- 1998-12-22 NO NO986050A patent/NO986050L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SK281505B6 (sk) | 2001-04-09 |
| UA74765C2 (en) | 2006-02-15 |
| PL330842A1 (en) | 1999-06-07 |
| CA2258717A1 (en) | 1998-01-08 |
| US5830472A (en) | 1998-11-03 |
| CZ428498A3 (cs) | 1999-06-16 |
| EP0964696A4 (en) | 2005-01-05 |
| BR9710089A (pt) | 2000-06-06 |
| AU3407197A (en) | 1998-01-21 |
| IL127764A0 (en) | 1999-10-28 |
| CZ293040B6 (cs) | 2004-01-14 |
| CN1227497A (zh) | 1999-09-01 |
| EP0964696A1 (en) | 1999-12-22 |
| HUP9904620A3 (en) | 2001-08-28 |
| SK179598A3 (en) | 2000-04-10 |
| AU722559B2 (en) | 2000-08-03 |
| IL127764A (en) | 2001-11-25 |
| EA003531B1 (ru) | 2003-06-26 |
| NO986050D0 (no) | 1998-12-22 |
| JP2001506841A (ja) | 2001-05-29 |
| NO986050L (no) | 1999-02-08 |
| EA199900067A1 (ru) | 1999-08-26 |
| WO1998000164A1 (en) | 1998-01-08 |
| HUP9904620A2 (hu) | 2000-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL186809B1 (pl) | Oczyszczony antygen powierzchniowy nasienia, przeciwciało monoklonalne dla niego i zastosowania z nim związane | |
| JP2935846B2 (ja) | 不妊と避妊のための透明帯抗原と抗体の調製法及び使用 | |
| EP0876612B1 (en) | Method for identifying sex specific and species specific molecules, molecules identified using the method, and uses of the molecules | |
| JP2001503601A (ja) | 前立腺特異的膜抗原の細胞外ドメインに対して特異的なモノクローナル抗体 | |
| WO2018081074A1 (en) | Neutralizing anti-tl1a monoclonal antibodies | |
| Naz | Vaccine for human contraception targeting sperm Izumo protein and YLP12 dodecamer peptide | |
| EP1784209A1 (en) | Contraceptives based on sp22 and sp22 antibodies | |
| JPH09512338A (ja) | ヒト精子診断薬 | |
| US6258364B1 (en) | Purified sperm surface antigen, monoclonal antibody therefor and application therefor | |
| JPH10501970A (ja) | 避妊ワクチン | |
| Khan et al. | Evaluation of contraceptive potential of a novel epididymal sperm protein SFP2 in a mouse model | |
| US20150087000A1 (en) | Diagnostic kits to detect sp22 and sp22 antibodies | |
| JP2003520594A (ja) | 精子特異的タンパク質 | |
| US7897355B2 (en) | Gene expressed in prostate cancer and methods of use | |
| KR100513186B1 (ko) | 정제된정자표면항원,그의모노클로날항체및응용 | |
| AU782467B2 (en) | Egg specific surface proteins | |
| MXPA99000257A (en) | Superficial antigen of purified esperam, your monoclonal antibody and its application | |
| Shibahara | Development of Immunocontraceptives in Female | |
| JP2001514743A (ja) | 細胞表面タンパク質に対するワクチンの製造方法 | |
| Mukherjee et al. | Anti-sperm Antibodies as an Increasing Threat to Male Fertility: Immunological Insights, Diagnostic and Therapeutic Strategies | |
| JP2003502028A (ja) | 乳癌の治療、診断およびモニタリングのための組成物および方法 | |
| WO2003062446A2 (en) | Mrp9 and its use detecting and treating cancer | |
| Diekman | Identification and characterization of a human sperm auto-, isoantigen | |
| Norton | Monoclonal antibody S19 and its cognate antigen, SAGA-1: A model antigen-antibody system for contraceptive development | |
| JPH0670775A (ja) | ヒト精子膜抗原ペプチド及びそれをコードするｄｎａ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20070630 |