KR100513186B1 - 정제된정자표면항원,그의모노클로날항체및응용 - Google Patents

정제된정자표면항원,그의모노클로날항체및응용 Download PDF

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Abstract

기탁물 HB 12144에 의해 발현되는 본 발명의 모노클로날 항체 (S19)는 정자 표면 당단백질인 SAGA-1 단백질을 효과적으로 응집시킨다. 상기 mAB는 매우 높은 정자 결합 효능을 보이기 때문에 살정제에서 결합제로서 유용성을 갖는다. SAGA-1로서 확인된 결합되는 단백질은 백신 처리시의 항체 역가를 결정하는 표준 물질일 뿐만 아니라 피임 백신의 면역원이다. 또한, 상기 모노클로날 항체는 상이한 시료 내의 정자의 존재 및 양을 결정하기 위한 진단제로서 사용될 수 있다.

Description

정제된 정자 표면 항원, 그의 모노클로날 항체 및 응용{Purified Sperm Surface Antigen, Monoclonal Antibody Therefor and Applications Therefor}
본 발명은 정자 표면 항원, 그의 모노클로날 항체, 및 상기 모노클로날 항체 및 항원 모두에 대한 응용분야에 관한 것이다. 구체적으로, 면역 분석을 위한 표준물질로서, 뿐만 아니라 면역원으로서 상기 항원을 사용하는 피임 백신이 제공되며, 모노클로날 항체는 살정제 및 진단 시약으로서 사용될 수 있다.
개선된 피임 방법을 개발하기 위한 관심이 지속적으로 계속되었다. 널리 활용되는 한가지 기술은 정자의 자궁 또는 난자로의 침투를 억제하여 수정을 방해하는 본질적으로 정자의 활성을 억제하는 화학적 장애물인 살정제를 사용하는 것이다. 가장 널리 사용되는 살정제 중의 하나는 세정제인 논옥시놀(Nonoxynol)-9이다. 상기 세정제로 이루어진 살정제를 사용하는 여성의 비뇨생식기 감염 및 질경부 염증의 발생율이 증가함을 보여주는 보고가 있다 (McGroarty et al, Journal of Urology, 152(3):831-833 (1994)). 화학적 세정제에 대한 대안으로서, 일부 문헌은 국소적 살정제에서 사용하는 것과 같은 국소 적용을 위한 안전한 활성 물질로서 모노클로날 항체의 사용을 제안하고 있다 (예를 들어, Cone et al, Am. J. Reprod. Immunol., 32:114-131 (1994)). 이러한 연구는 원치않는 면역 반응의 저하 또는 제거 외에, 인간 모노클로날 항체의 투여량 및 적용 기간이 용이하게 조절될 수 있고, 국소 전달이 전신 노출을 최소화시키고, 모노클로날 항체를 안전하고 효율좋게 선별할 수 있기 때문에 인간 모노클로날 항체가 안전한 살정제를 제공하여야 한다고 결론지었다. 따라서, 국소적 살정제로서 전달된, 정자에 대해 활성을 갖는 모노클로날 항체는 세정제로 이루어진 살정제에 의해 발생하는 부작용 없이 목적하는 수정 억제 효과를 나타낼 수 있다 (Alexander, Scientific American, Sept.:136-141 (1995)). 따라서, 당업계의 목적은 모노클로날 항체를 사용하여 안전하고 효과적인 살정제를 제공하는 것이다.
매우 다양한 모노클로날 항체가 효능있는 정자 반응 물질로서 연구되어 왔다. 이들 연구된 물질 중에 항인간 정자 모노클로날 항체 S19가 있다. 상기 모노클로날 항체의 개발은 문헌에 기재되어 있다 (Anderson et al, J. Reprod. Immunol., 10:231-257 (1987)). 이 항체는 인간 정자 균질물을 사용하여 마우스를 면역처리시킴으로써 수득되었다. IgG1 모노클로날 항체는 본 발명자들의 연구에서 인간 정자를 강하게 응집시키는 것으로 밝혀졌고, 보다 자세한 특성화를 위해 세계 보건 기구(WHO)의 Sponsored Workshops on Anti-Sperm Monoclonal Antibodies에 제출하였다. 항인간 정자 모노클로날 항체 S19는 인간 정자를 강하게 응집시키고, 인간 정자와 난자의 투명대 사이의 강한 결합을 억제하고, 정자의 경부 점액 침투를 차단한다 (Anderson, 상기 문헌, Cone, 상기 문헌, Mahoney et al, J. Reprod. Immunol., 19:269-285 (1991)). 상기 항체에 의한 정자의 강한 응집은 비디오테이프 상에서 가시적으로 입증되었다. 이러한 발견은 동족의 S19 항원이 수정 동안 배우체(gamete)의 상호작용에 관련되고, 면역학적 불임에 작용하는 자기항체의 표적으로 작용할 수 있고, 피임 백신으로서 개발하기 위한 후보 물질일 수 있다는 것을 시사한다.
그러나, S19 항체는 연구 도구 또는 피임 시약으로서 개발되지 않았다. 지금까지 S19 항체는 기탁되거나, 면역학적 반응의 가능성을 저하시키기 위해 "인간화"되지도 않았다. 모노클로날 항체에 대한 상세한 연구도 아직 수행되지 않았고, 현재까지 과학적 탐구의 대상으로 남아있다.
다른 모노클로날 항체 및 정자 항원이 알려져 있다. 모노클로날 항체 MHS-10 및 이에 의해 결합되는 항원인 SP10 (정자 진단제에서 그리고 피임 백신으로서 사용하기 위한 후보물질인 정자의 첨단체내(intraacrosomal) 항원임)이 본원에 참고로 포함된 헤르(Herr) 등의 미국 특허 제5,436,137호에서 논의되었다. 그러나, S19 모노클로날 항체에 의해 결합되는 항원인 정자 응집 항원-1 (SAGA-1)은 SP-10 항원과는 달리 인간 정자의 전체 표면 상에 위치하는 것으로 보인다. 이것은 모노클로날 항체가 전체 정자 표면상의 여러 부위에 결합하여 응집할 것이라는 것을 강하게 시사한다.
SP-10 항원을 사용한 백신 개발 연구가 계속되었다. 유사하게, 세계의 많은 연구자들은 정자 항원을 기초로 한 피임 백신의 개발 가능성을 찾고 있다 (예를 들어 Aitken et al, British Medical Journal, 49:88-99 (1993), Freemerman et al, Biol. Reprod., 50:615-621 (1994) 및 Herr, Fertility Control, pp.431-452 (Second Edition 1994). 이와 관련하여, 여성의 피임 백신으로서의 인간 융모막 고나도트로핀 (hCG)에 대한 연구가 계속되고 있다 (Talwar, Current Opinion in Immunology, 6:698-704 (1994) 및 유럽 특허 제86304274.3호). 임상 백신 시험이 상기 잠재적인 백신에 대해 진행중이지만, 사용된 hCG 면역원은 낙태제로서 기능한다. 즉, 상기 백신의 접종에 의해 유도되는 면역 반응은 초기 엠브리오 또는 태아의 유산을 유도한다. 이것은 많은 개인들에 대한 원치않는 형태의 피임을 제공할 수 있다.
대안으로서, 다양한 정자 표면 항원이 영장류 및 설치류 모델을 이용한 연구에서 사용되었다. 따라서, 수정율의 저하는 LDH-C4 (O'Hern et al, Biol. Reprod., 52:331-339 (1995)), PH-20 (Primakoff et al, Nature, 335:543,546 (1988)), RSA-1 (O'Rand et al, J. Reprod. Immunol., 25:89-102 (1993)) 및 페르틸린(fertilin) (Ramarao et al, Mol. Reprod. Dev., 43:70-75 (1995))과 같은 정자 표면 항원을 사용한 시험 동물의 면역화에 기인한 것이다. 실망스럽게도, 영장류에서 정자 항원 사용시에 관찰된 효율의 가장 높은 비율은 약 75%의 수정 억제율이었다 (O'Hern et al, 상기 문헌). 따라서, 현재까지 경구 피임약의 효능에 비견할만한 효능 수준을 갖는 피임 백신으로서 기능하는 인간 정자 항원은 확인되지 않았다. 따라서, 경구 피임약이 제공하는 효율 수준과 비슷하게 높은 수정 억제율을 갖는 안전하고 효과적인 피임 백신을 제공하는 것은 당업계의 숙련가의 과제로 남아 있다.
추가로, 피임 백신을 투여한 사람들은 "안전"한지를 결정하기 위해 혈청 항체를 주기적으로 모니터링할 필요가 있기 때문에, 백신이 투여된 개체에서의 항체 농도를 측정하는 분석에서 표적으로서 SAGA-1 항원을 사용하는 것이 바람직하다.
임신에 관련된 호르몬 (hCG 및 기타 호르몬)의 검출을 위한 "처방전 없는 자체" 분석 또는 진단 키트는, 난처하고, 불편하고 비용이 많이 소요되는 병원에서의 진찰에 대한 대안 또는 제1 단계로서 널리 시판에 성공한 제품이다. 최근 몇 년 동안, 사용자의 사정액내 정자의 존재 및 농도 분석에 대한 관심이 집중되었다. 강간에 있어서의 임상 진단 뿐만 아니라 임신 상담의 측면으로부터, 또는 정관 절제의 존재 또는 유효성을 분석할 목적으로, 가정에서 안전하고 신뢰성있게 사용할 수 있는 편리한, 시료 내의 정자 검출용 시험 키트가 점점 더 바람직하게 생각되고 있다. 정자의 첨단체내 항원인 SP-10에 대한 MHS-10 모노클로날 항체를 사용하는 상기 시험 키트는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 번호 제08/231,675호에 개시되어 있다. S19 항체는 인간 정자 진단에 사용하기 위한 MHS-10 항체에 대한 효과적인 결합 대안물로서 제시된다.
발명의 요약
상기 목적은 모노클로날 S19 항체의 "인간화" 재조합 변형체의 사용, 및 상기 항체가 결합하는 대응하는 항원인, 활성 물질로서의 SAGA-1의 정제 및 이용을 통하여 충족된다. 적합한 비히클을 통하여 이동하는 모노클로날 항체는 살정제로서 및 인간 정자 진단제로서의 효과적인 결합제를 제공한다. 인간 정자의 표면 전체에 걸쳐 분포하는 인간 정자 당단백질인 SAGA-1 항원은 백신 요법을 받고 있는 대상에서의 피임 항체의 생성 분석을 위한 표준물질 뿐만 아니라 효과적인 면역원을 제공한다.
효과적인 살정제 겔 또는 크림을 제공하기 위해서, 모노클로날 항체는 효과적인 비히클 중에 제공되어야 한다. 연구에 사용할 수 있는 다른 비히클 중에는 항원 또는 항체 전달을 위해 특이적으로 제제화된 비인지질 리포좀이 있다. 시판되는 한 형태는 미국 메릴랜드주 록빌 소재의 노바박스사(Novavax, Inc.)에서 시판하는 등록상표명 노바좀(NOVASOME)이다. S19 모노클로날 항체는 상기 양하전 리포좀의 표면에 결합할 수 있다. 다른 정자 응집 비히클 및 조성물도 제조할 수 있다.
SAGA-1 항원의 정제는 효과적인 백신 제조의 제1단계이다. 제약상 허용되는 담체에 혼입된 정제된 항원은 피임용 백신을 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 백신 처리를 반복하면 정자에 매우 효과적으로 결합하는, 정자에 대한 항체를 생성시킨다. 효과적인 수준의 항체 발생을 모니터링하기 위해서, 정제된 항원을 시험 표준 시약으로 사용하여 통상의 진단법을 통하여 환자의 항체 존재 여부 및 존재량을 결정할 수 있다.
도 1은 S19 mAB와 SAGA-1의 반응에 의해 수득된 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 SAGA-1의 트리톤(Triton)-X-114 상 분할의 SDS-page 면역블롯의 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 서열 분석에 의해 수득한 S19 mAB의 카파(Kappa) 경쇄의 뉴클레오티드 염기 서열이다.
도 4는 S19 mAB 면역매트릭스 칼럼에 결합된 SAGA-1 제제의 웨스턴 블로팅 분석 사진이다.
도 5는 서열 분석에 의해 수득한 S19 mAB의 중쇄의 뉴클레오티드 염기 서열이다.
본 발명은 모노클로날 항체 S19, 이 항체가 결합하는 항원인 SAGA-1, 제약상 허용되는 비히클 중의 상기 모노클로날 항체를 사용한 살정제, 면역원으로서 SAGA-1을 사용하는 피임 백신, 및 결합된 S19를 정자의 농도를 검출하기 위한 진단제로 사용하고 SAGA-1을 그를 사용한 면역처리에 반응하여 항체가 생성되는지를 결정하기 위한 표준 시약으로 사용하는 진단 분석 및 키트, 및 관련된 응용을 포함한다. 이들 각각은 아래에 설명된다.
항체, 단백질 및 그의 응용이 각각 별개로 기술되지만, 본 발명은 SAGA-1 단백질이 정자 표면에 걸쳐 널리 분포하고, 정자 운동성 및 배우체 상호작용의 억제를 포함하여 수정 과정의 여러 단계에서 정자의 기능을 차단하는 S19 모노클로날 항체에 의해 강력하게 결합된다는 공통된 인식으로부터 달성된 것이다.
모노클로날 항체 S19
상기한 바와 같이, 과거에 어디에서도 공개적으로 사용되지 않았지만, S19 모노클로날 항체는 연구 및 선행 기술 문헌의 주제이었다. 처음에 S19 항체는 마우스를 인간 정자 균질물로 면역처리함으로써 수득하였다. 상기 항인간 정자 모노클로날 항체는 인간 정자를 강하게 응집시키고, 인간 정자와 난자의 투명대 사이의 강한 결합을 억제하고, 정자의 경부 점액 침투를 차단하여 정자의 흔들림(shaking) 현상을 유도한다.
S19 모노클로날 항체는 부다페스트 조약 하에 1996년 6월 26일자로 ATCC에 수탁번호 HB 12144로 기탁되었다. 본 출원인이 아는 바로는, 상기 기탁은 최초로 이루어진 것이다.
인간 정자를 강하게 응집시키는 S19 모노클로날 항체의 능력은 시험관 내에서 입증되었다. 이러한 응집을 비디오 현미경 검사에 의해 분석하였다. 이에 대한 비디오 영상을 준비하였다.
응집의 입증
각각의 실험을 위해, 인간 정액을 2,000만개의 정자/ml의 최종 농도로 희석하고, 복수 (ascite)를 1:10으로 희석하였다. 정자 및 복수를 에펜도르프 튜브 중에서 혼합한 후, 혈구계수기 상에 위치시켰다. S19 복수를 사용한 결과를 저속도 촬영으로 기록하였다. 복수를 사용하지 않은 결과를 실시간으로 기록하였다.
시간 0에서, 정자는 유영하였다. 10분 후에 정자는 완전하게 응집되었다. 대조군으로서, 복수가 없는 유체를 사용하였다. (시간 0은 정자를 슬라이드 상에 위치시켜 촬영을 시작하는 시점을 의미한다). 정자는 유영하였다. 세포 파쇄물 및 원형 세포가 분명하게 나타났다. 10분 후에 대조군에서 운동성 또는 응집도의 어떠한 변화도 분명하게 나타나지 않았다.
이러한 결과는 S19 모노클로날 항체가 인간 정자의 표면 전체에 걸쳐 여러 부위에서 인간 정자에 결합하여 정자를 응집시킨다는 것을 나타낸다. 모든 정자의 완전한 응집은 항-SAGA-1 mAB가 정자 기능의 효과적인 저해제로서 작용하여 수정을 저해할 것이라는 것을 나타낸다.
살정제 제제
상기한 바와 같이, 문헌은 다양한 모노클로날 항체 기재 살정제의 개발을 이론화하였다. 적합한 비히클은 Cone 및 Alexander의 상기 문헌에 기재되어 있다. 본 발명자들은 미국 메릴랜드주 록빌 소재의 노바박스사(Novavax, Inc.)에서 등록상표명 노바좀로 시판하는 리포좀 전달 시스템을 사용하여 응집 형태로 mAB S19의 제공을 위한 특정 비히클을 개발하였다. 상기 리포좀은 항원 또는 항체 전달을 위해 특정하게 제조된 것이다. 상기 양하전된 비인지질 리포좀의 표면에 결합된 천연 S19 모노클로날 항체 분자를 함유하는 등록상표명 노바좀은 살정제 겔 중에서 살정제로서 효과적으로 기능한다. 상기한 정자 응집 분석법을 사용하여 노바좀 제제를 시험하였다. 1:10의 희석율에서, S19-노바좀 비히클은 S19 복수 유체의 1:20 희석물과 동일한 효율로 정자를 응집시켰다. 이러한 결과는 S19 모노클로날 항체가 시판되는 전달 시스템 중에 도입될 때 정자 기능에 대해 천연 유체와 동일한 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
당업계의 숙련가는 또다른 전달 시스템을 사용할 수 있다. 이들 중에서 지질 접합된 펩티드 (예를 들어 Deres et al, Nature, 342:561-564 (1989) 참조) 및 ISCOM (예를 들어 Takahashi, Nature, 344:873-875 (1990) 참조)가 유망하다. 과거에는, 특정 펩티드의 프로세싱 및 디스플레이를 위해 소수성 에멀젼 및 사포닌을 포함하여 다른 제제가 개발되었고, 이 제제는 본원에서 언급된 살정제의 항체와 관련하여 사용될 수 있다 (예를 들어 Raychaudhuri et al, Proceedings of the National Academy of Science, U.S.A. 89:8308-8312 (1992) 및 Newman et al, J. Immunol. 148:2357-2362 (1992) 참조). 재조합 바이러스 (즉, 항체를 코딩하는 DNA가 구조 멤브레인 단백질과 함께 재조합 세포에서 발현되는 재조합 바이러스, 하기 참조)에 의해 발현되는 것과 같은 멤브레인 상의 항체의 디스플레이를 포함하여 다른 비히클을 사용할 수 있다. 상기한 비인지질 리포좀 외에, 이용가능한 다양한 비히클 중에서 항원 디스플레이를 위한 백신에 일반적으로 사용되는 ISCOM이 바람직한 특징을 제공한다. ISCOM은 골조상의 멤브레인 구조를 형성하고, 이 구조 내부 또는 이 구조 상에 항체가 제공될 수 있다. ISCOM은 항원의 제공과 관련하여 이미 사용되었으나, 노출된 바이러스 유사 구조 중에 항체 단백질을 유사하게 제공한다. 이러한 점에서, 공중합체 스피어를 포함하는, 활성 단백질 및 바이러스 유사 입자 (VLP)의 제공하는 것으로 공지된 다른 비히클이 면역 자극 복합체 또는 ISCOM과 유사한 결과를 달성하는 것으로 알려졌다. 물론, 매우 통상적인 시스템인 커플링제를 통한 항체의 마이크로스피어 표면에 대한 부착은 상기 방법과 마찬가지로 겔 및 크림의 제조를 위해 허용되는 제조 기술과 함께 적합하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 살정제의 핵심은 사정액에 존재하는 모든 정자를 효과적으로 억제 (응집 또는 결합)하는 데 충분한 농도의 S19 mAB를 적합한 담체 중에 도입시키는 것이다.
S19 mAB의 단리, 특성화 및 클로닝
S19를 분비하는 MHS-8 하이브리도마 세포를 배양하고, 계수한 후 RNA 수거를 위해 FastTrack 2.0 키트(Invitrogen사)를 사용하여 1000만개의 세포를 처리하였다. 세정제 용해법 및 단백질 분해 완충액을 사용하여 전체 RNA를 세포로부터 직접 단리하였다. 이어서, mRNA가 올리고 dT 수지에 결합된 변형 Aviv and Leder 프로토콜을 사용하여 폴리(A) + RNA를 단리하였다. 이어서, 수지를 저염 완충액으로 세척하여 외인성 전체 RNA를 제거하고, 폴리(A) + RNA를 수지로부터 용출시켰다. 260 nm 및 280 nm에서의 분광광도계 분석은 폴리(A) + RNA의 최종 농도가 1.84 ㎍/㎕임을 보여주었다.
폴리(A) + RNA의 역전사 및 증폭
이가 항체인 S19는 정자 표면 상의 에피토프를 가교결합시키는 능력을 통하여 인간 정자 응집소로서 기능한다. 이러한 기능을 재조합 단백질에 유지시키기 위해서 항체의 에피토프 인식 영역 또는 보체 결정 영역(CDR)을 확인하였다. IgG1 특이적 중쇄 및 경쇄 (카파) 서브유닛을 위해 뮤린 올리고뉴클레오티드 4개를 제조하였다. 올리고뉴클레오티드는 CDR을 함유하는 S19의 가변 영역 (처음의 약 360 염기쌍)만을 증폭시키도록 고안되었다.
1. 중쇄 5' 말단: ACTAGTCGACATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG
2. 중쇄 3' 말단: CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG
3. 경쇄 5' 말단: CCCCCCGGGGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCT
4. 경쇄 3' 말단: CCCCCCGGGGATGGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCG
중쇄 올리고뉴클레오티드는 Ig-Prime 키트 (노바겐사)로부터 구입하였고, 뉴클레오티드 약어는 다음과 같다: R=A 또는 G, I=이노신, 및 K=G 또는 T. dH2O를 사용하여 모든 올리고뉴클레오티드의 최종 농도를 1.0 ㎍/㎕로 희석하였다.
프로메가사(Promega)의 Access RT-PCR 시스템을 사용하여 S19 하이브리도마 폴리(A) + RNA의 역전사 및 중합효소 연쇄 반응 증폭을 단일 반응으로 수행하였다. S19 하이브리도마 폴리(A) + RNA 5 ㎍, 각각의 적합한 프라이머 (중쇄용 프라이머 1 및 2, 경쇄용 프라이머 3 및 4) 1 ㎍, 10 mM dNTP 믹스 1 ㎕, 5X AMV 역전사 완충액 10 ㎕, 25 mM MgSO4 2 ㎕, AMV 역전사효소 1 ㎕, Tfl 폴리머라제 1 ㎕ 및 뉴클레아제 비함유 dH2O 30 ㎕을 0.5 ml 마이크로퓨지 튜브 중에서 혼합하였다. 반응물을 48℃에서 45분, 이어서 94℃에서 2분 인큐베이션하였다. 반응물에 대해 94℃에서 30초, 60℃에서 1분, 68℃에서 2분의 싸이클을 40회 반복하였다. 최종 싸이클 후에 68℃에서 7분 인큐베이션하였다. 증폭 생성물을 2% 아가로스겔 상에서 분석하였다 (도 1). 레인 1은 스트라타젠(Stratagene)사의 1kb DNA 마커이고, 레인 2는 경쇄 단편, 레인 3은 중쇄 단편에 대한 결과이다. 경쇄용 프라이머가 처음 384 bp (추가의 제한 효소 부위를 갖는 360 bp)를 증폭시키고 중쇄용 프라이머는 추가의 60 bp를 증폭시키기 때문에 중쇄 및 경쇄 밴드는 예상한 바와 같이 396 bp 마커와 거의 동일한 이동 속도로 이동하였다.
증폭된 S19 항체 단편의 벡터로의 클로닝
도 1의 중쇄 및 경쇄 밴드를 겔로부터 절제하여 Ultrafree MC 여과 장치 (Millipore사)를 사용하여 용출시켰다. 이와같이 정제한 단편을, Tfl 폴리머라제 대신에 Pfu 폴리머라제를 사용한 PCR을 40회 반복하여 증폭하였다. 다시, 단편을 겔 정제하고, dH2O 25 ㎕ 중에 재현탁시켰다.
pCR-Script SK(+) 시스템 (스트라타젠사)을 사용하여 클로닝을 수행하였다. 상기 벡터는 cDNA를 벡터 내의 Srfl 제한 효소 부위에 도입시키기 위해서 Pfu-c 증폭 PCR 단편의 블런트(blunt) 말단 라이게이션을 이용한다. Srfl은 서열 5'GCCCGGGC3'을 인식하는 신규한 희귀 제한 효소이다. 중쇄 및 경쇄 단편이 Srfl에 의해 분해되지 않도록 하기 위해서, 각각의 cDNA 1 ㎕를 Srfl 효소 1 ㎕, 10x 반응 완충액 1 ㎕ 및 dH2O 7 ㎕와 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 어느 단편도 효소에 의해 분해되지 않았다.
이어서, pCR-Script 벡터 1 ㎕, pCR-Script 10x 완충액 1 ㎕, 10 mM rATP 0.5 ㎕, 중쇄 또는 경쇄 cDNA 5.5 ㎕, Srfl 효소 1 ㎕ 및 T4 DNA 리가제 1 ㎕를 합하여 클로닝을 수행하였다. 반응 튜브를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 65℃에서 10분 동안 가열하였다.
에피쿠레안 콜리(Epicurean Coli) XL1-Blue MRF' Kan 수퍼컴피턴트 세포를 빙상에서 해동시키고, 40 ㎕씩 예비 냉각시킨 15 ml 튜브에 나누었다. 1.44 M β-메르캅토에탄올 0.7 ㎕을 세포에 첨가하고, 빙상에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 상기 각각의 클로닝 반응물 2 ㎕를 세포에 첨가하고, 추가로 30분 동안 빙상에 위치시켰다. 세포와 cDNA 믹스를 42℃조에서 45초 동안 가열한 후 2분 동안 얼음위에 놓았다. SOC 배지 0.45 ml을 첨가한 후, 세포를 37℃ 수조에서 1시간 동안 진탕하였다. 항생제 내성 콜로니를 선발하기 위해서 이들 세포를 LB/암피실린/메티실린/X-gal/IPTG 페트리 플레이트 상에 도막하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 각각의 클론의 양성 콜로니를 선별하여 플라스미드 정제를 위해 SOC 배양액 5 ml 중에서 성장시켰다.
Qiagen-tip 20 칼럼 (Qiagen)을 사용하여 플라스미드를 정제하였다. 세포 5 ml을 10k rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 과량의 배지를 흡출시키고, 세포 펠렛을 완충액 P1 0.3 ml 중에 재현탁시켰다. 완충액 P2를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 냉각시킨 완충액 P3 0.3 ml을 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 빙상에서 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션 기간 동안, QBT 완충액 1 ml을 인가하여 Qiagen 칼럼을 평형화시켰다. 이어서, 세포 시료를 10 k rpm에서 15분 동안 원심분리시키고, 상등액을 제거하여 Qiagen-tip 20 칼럼 상에 로딩하였다. 중력 유동에 의해 상등액이 칼럼 수지에 충분히 유입된 후에, 칼럼을 완충액 QC 4 ml로 세척하고, 완충액 QF 0.8 ml로 용출시켰다. 플라스미드 DNA를 침전시키기 위해서, 이소프로판올 0.56 ml을 칼럼 용출액에 첨가하고, 혼합물을 10 k rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 생성 DNA 펠렛을 dH2O 25 ㎕ 중에 재현탁시켰다.
정제된 플라스미드 내에 cDNA 삽입체의 존재 여부를 확인하기 위해서, 각각의 클론을 2개의 제한효소로 분해하였다. 분해에 사용된 제한 효소는 각각 pCR-Script 클로닝 벡터의 5' 및 3' 말단에 제한 부위를 갖는 NotI 및 EcoRI이었다. 삽입체가 존재한다면, 상기 효소로 분해할 경우 숙주 벡터로부터 삽입체가 절단될 것이다. 각각의 클론 1.5 ㎕을 NotI 0.75 ㎕, EcoRI 0.75 ㎕, 10x 완충액 1.5 ㎕, dH2O 10.5 ㎕과 합하고, 37℃에서 90분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 분해물을 2% 아가로스겔 상에서 이동시키고, 삽입체를 함유하는 클론의 서열을 결정하였다.
중쇄 및 경쇄 클론의 서열 분석
상기로부터의 양성 클론은 피델리티(Fidelity) 키트(Oncor사)를 사용하여 서열분석을 하였다. 각 시퀀싱 반응물은 플라스미드 DNA 5 ㎕, T3 프라이머(pCR-Script 벡터 상에 5개의 클로닝 부위의 업스트림에 놓임) 1 ㎕ 및 dH2O 2 ㎕로 구성되어 있다. 이들을 95℃로 5분 동안 가열하고, 간단히 원심분리하여, 어닐링 완충액 2 ㎕를 가한 후, 반응물을 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 반응물에 T4 반응 완충액 3 ㎕, 33PαATP 1 ㎕, T4 DNA 폴리머라제 2 ㎕ 및 dH2O 2 ㎕를 가하여서 표지시켰다. 이 혼합물을 40℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후, T4 악세사리 혼합물 6 ㎕을 가하였다. 이 표지용 반응물 5.5 ㎕을, A, C, G 또는 T 종결 혼합물 2 ㎕ 중 하나를 함유하는 4개의 튜브에 각각 가하고, 40℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 프로테인아제 K 용액 5 ㎕을 가하여서 반응을 중단시키고, 6% 아크릴아미드 시퀀싱겔 상에 로딩하기 전에 95℃로 가열하였다. 이어서, 겔을 2시간 동안 2000 볼트에서 런닝시키고, 진공 하에 와트만 3mm 여과지 상에서 건조시키고, 실온에서 X-선 필름에 밤새 노출시켰다. 필름을 현상시킨 후, 겔을 라이트박스 상에 놓고 판독하였다. 유추된 클론 서열과 공지된 뮤린의 IgG1 서열을 비교하여서, 경쇄 클론이 하이브리도마 sp2/0으로부터 증폭된 비정상적 경쇄임을 발견하였다. 중쇄 서열을 단리하고, 염기 서열을 도 5에 나타내었다.
내인성 항체를 제거하기 위한 cDNA의 제한 효소 분해
S19 카파 경쇄를 비정상적 하이브리도마 경쇄로부터 분리하기 위하여, RT-PCR 반응을 반복하였다. 비정상적 서열을 분석하고, 하나의 CDR에 희귀한 Van91I 제한 부위 (5'CCANNNNNTGG3')를 갖는다는 것을 발견하였다. S19 경쇄가 하이브리도마로부터 RT-PCR 증폭된 cDNA 혼합물에 존재한다고 가정하면서 이 혼합물을 Van91I(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 분해시켰다. 분해 반응물은 Van91I 1 ㎕, cDNA 3 ㎕, 10× 반응 완충액 1 ㎕ 및 dH2O 5 ㎕로 구성되어 있다. 반응물을 37℃에서 밤새 인큐베이션하여서 분해를 완결하였다. 효소에 의해 절단되지 않은 임의의 cDNA는 정확한 S19 카파 경쇄이어야 한다.
도 2에 도시된 바와 같이, 분해물을 2% 아가로스겔 상에서 분석하였다 (레인 1은 스트라타겐 1kb DNA 마커이고, 레인 2는 절단되지 않은 cDNA 3 ㎕이고, 레인 3은 분해된 반응물임). 레인 3에서, 대다수의 반응물은 분해되어서 2개의 단편이되나, 396 bp에서 존재하는 흐릿한 밴드는 절단되지 않은 S19 경쇄로 추정된다. 이 밴드를 겔로부터 잘라내고, 상기와 같이 정제한 후, 상기된 바와 같이 Pfu 폴리머라제를 사용하여 PCR을 40회 반복하여서 증폭시켰다. 이어서, cDNA를 상기와 같이 pCR-Script 벡터 내로 클로닝하고, 6개의 양성 콜로니를 동일한 평판배지법에 의해 선택하였다. 다시 상기 양성 콜로니를 증식시키고, 플라스미드를 정제하고, 제한부위를 분해시킴으로써 삽입물이 존재하는 것을 확인하였다.
카파 경쇄의 자동화 시퀀싱
신규한 경쇄 클론의 시퀀싱은 더 유니버시티 오브 버지니아 바이오몰레큘러 리써치 기관에서 ABI 프리즘 377 자동화 DNA 시퀀서를 사용하여 수행하였다. 각 클론마다, cDNA 100 ng 및 T3 프라이머 3.2 피코몰을 총부피가 12 ㎕가 되도록 혼합하고, 시퀀서가 있는 시설로 옮겼다. 4개의 염료 표지된 디데옥시 뉴클레오타이드 및 앰플리태그 폴리머라제 FS를 동일한 반응 튜브에 가하였다. 용이하게 판독가능한 36㎝의 5.0% 아크릴아미드 겔 상에서 전기영동을 하기 위해 단일 레인에 전체 반응물을 로딩하였다. 전기영동된 각각의 단편의 실시간 검출을 CCD 카메라 화상 생성과 함께 레이저 스캐닝으로 수행하였다. 시퀀서로부터 얻은 시퀀싱 결과는 젠 뱅크 데이터베이스로부터 얻은 뮤린 카파 경쇄와 유사하게 일치하였고, 정확한 경쇄 염기 서열은 도 3에 도시하였다. AB 중 S19의 중쇄 및 경쇄의 cDNA의 서열은, 통상의 기술을 사용하여 부위 결실, 도메인 결실 및 도메인 부가를 지닌 항체를 비롯하여, 재조합 항체를 제공하는 데 사용될 수 있다.
SAGA-1 단백질
현재 수탁된 S19 mAB는 효과적으로 결합하여서 사람의 정자를 응집시킨다. 사진화된 응집 분석의 결과는 전체 정자 표면 상의 다중 부위에서 결합 및 응집이 일어남을 명확히 입증하고 있다. S19 mAB에 의해 제공되는 효과적 살정자 효과 외에, 결합되는 항원, SAGA-1은 효과적 백신원임을 강하게 암시하고 있다. 특히, 항원/면역원으로서 SAGA-1 단백질에 대한 항체를 생성하는 능력은 여성에게 수정을 효과적으로 방지하는 것, 즉 피임용 백신을 제공할 것이다. 동일한 항원은 표준 시험 시약으로서 백신 사용법의 효능성을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 백신 투여된 여성을 주기적으로 분석하고, ELISA, 및 웨스턴 및 서던 블롯팅 분석을 비롯한 통상의 분석 양식으로, 체액 시료를 공지된 양의 SAGA-1에 대해 시험하였다. 양성 결합은 SAGA-1 단백질과 결합하는 항체를 생성하여서 수정을 방지할 수 있음을 나타내고 있다. SAGA-1을 표준화된 시험물로 사용함으로써, 항체의 결합량, 역가 또는 농도에 대한 시험을 측정할 수 있다. 적절한 역가는 상기된 바와 같은 응집 분석에 따라 얻어질 수 있기 때문에, SAGA-1 단백질을 적절한 역가를 반영하는 표준물로서 사용하는 분석은 항-수정 상태가 달성됨을 확인시켜주고, 이 상태는 목적하는 기간 동안만 유지될 필요가 있다.
SAGA-1 단백질의 확인
S19 모노클로날 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 SAGA-1이 일련의 저분자량 당단백임을 확인하였다 (도 1). 세척된 사람의 정자 추출물을 1% SDS에서 제조하고, 환원된 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. S19 모노클로날 항체는 약 15 내지 25 kD 범위의 일련의 중첩 밴드와 반응하였다 (레인 3). 10 mM 과요오드산 처리에 의해 S19와 동족 항원과의 면역반응은 중단되면서(레인 6), MHS-10 모노클로날 항체와 SP-10 단백질의 펩티드 에피토프의 반응에는 영향을 주지 않았다 (레인 2 및 5). 이러한 발견은 S19 모노클로날 항체에 의해 인지되는 에피토프가 탄수화물 잔기임을 나타낸다 (도 1, 레인 1, 아미도 흑색 염색; 레인 2 및 5, MHS-10; 레인 3 및 6, S19; 레인 4 및 7, 복수(ascites) 없음; 레인 2-4, 과요오드산 처리하지 않음; 레인 5-7, 과요오드산으로 처리된 면역블롯 스트립; M, 97.4, 68, 43, 29, 18.4, 14.3 kD의 분자량 마커). 더욱이, SDS 정자 추출물을 프로테인아제 K로 처리하여 S19 면역반응을 파괴하는 것은(데이타는 도시되지 않음) S19 항원이 당단백질일 수 있음을 의미한다. 확인된 S19 당단백질은 강하게 사람의 정자를 응집시키는 능력을 근거로 정자 응집 항원-1(SAGA-1)으로 명명되었다.
SAGA-1을 풍부하게 하는 방법
SAGA-1의 가용성은 소수성의 막내 단백질(integral membrame protein)을 나타낸다. S19 반응성은 고장액(1M NaCl 또는 0.6M KCl) 및(또는) 순한 비이온성 세정제(0.1% NP-40 또는 트리톤 X-100)을 사용하여 제조된 사람의 정자 추출물에서 검출되지 않았다. 이 결과는 SAGA-1이 막주변 단백질(peripheral protein)을 제거하기 위하여 통상적으로 사용되는 처리에 의해 추출되지 않음을 나타내었다.
또한, SAGA-1이 막내 단백질로서 존재한다는 증거는 보르저(Bordier, 1981)에 의해 기재된 바와 같이 트리톤 X-114 상분배를 사용하여 관찰되었다. 트리톤 X-114와 같은 비이온성 세정제는 정상적인 지질 환경을 대체함으로써 막내 단백질을 가용화시킨다. 트리톤 X-114는 0℃에서 상기 임계적 마이셀 농도를 초과하는 수용액에서 분산되는 경우에 작은 마이셀을 형성한다. 친수성 단백질은 수성 환경에 남아있으면서, 소수성의 막내 단백질은 이 마이셀로 혼입된다. 상기 용액을 가열하는 경우, 마이셀은 크기가 증가되고, 원심분리에 의해 수용액으로부터 분리될 수 있는 세정제가 풍부한 상을 형성하는 용액으로부터 나온다. 보르저 (1981)는 이 방법을 사용하여서 친수성 단백질이 수상에 남아 있는 동안, 대부분의 막내 단백질이 세정제상에 분배됨을 입증한다.
SAGA-1의 트리톤 X-114 상분배를 연구하기 위하여, 세척된 사람의 정자를 4℃에서 1% 트리톤 X-114, 10 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl에서 추출하고, 원심분리하여 세포 파쇄물을 제거하였다. 상분배를 3회 반복한 후, 동일한 양의 초기 정자 추출물, 세정제상 및 수상을 SDS-PAGE 및 면역블롯팅에 의해 분석하였다 (도 2). 사람의 정자/고환 특이적 단백질 SP-10 (첨체형의 막주변 단백질)은 대조구로서 작용하였고, MHS-10 모노클로날 항체와 SP-10의 반응성을 수상에서 검출하였다. S19 반응성을 초기의 정자 추출물 및 세정제 상에서는 검출하였으나, 수상에서는 검출되지 않았다. 이러한 결과는 S19 모노클로날 항체가 소수성의 막내 당단백질과 반응한다는 것을 암시한다. 아미도 블랙 염색은 대부분의 총 정자 단백질이 수상에서는 가용성이나, 트리톤 X-114에 분배되는 단백질은 거의 없다는 것을 보여주었다. 따라서, 트리톤 X-114 상분배는 무손상 SAGA-1 정제의 초기 단계에서 유용할 것이다.
세정제 대체는 정제를 요한다
세정제 트리톤 X-114의 생화학적 특성은 후속 정제법과 함께 병행될 수 없었다. 이 세정제의 목적하는 농도에서, 트리톤 X-114는 친화성 매트릭스에 결합되는 단백질을 차폐하는 큰 세정제 마이셀 내로 단백질을 혼입시킨다. 또한, 트리톤 X-114는 실온에서 사용될 수 없다. 따라서, 트리톤 X-114 추출물에서의 단백질을 -20℃의 아세톤으로 침전시키고, 0.5% 옥틸글루코사이드, TBS (10 mM 트리스-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl)에 재현탁시켰다. 옥틸글루코사이드는 실온에서 사용될 수 있고, 목적하는 농도는 단백질-면역매트릭스의 상호작용을 억제하지 않는다.
S19 모노클로날 항체는 하기되는 디메틸 피멜리미데이트 디히드로클로라이드를 사용하여 단백질 G 세파로스와 가교결합되었다. 상기 면역매트릭스와, 항체 특이성에 대한 음성 대조구인, 가교결합된 모노클로날 항체가 없는 단백질 G-세파로스 비드를 옥틸글리코사이드 추출물과 함께 인큐베이션하였다. 결합된 분획물을 S19 모노클로날 항체를 사용하여 웨스턴 분석을 하였다 (도 4). SAGA-1은 옥틸글리코사이드 추출물 및 면역매트릭스가 결합되어 있는 분획물에서는 확인되었으나, 항체가 없는 단백질 G-세파로스 비드로부터 용출된 분획물에서는 확인되지 않았다. 이러한 결과는 SAGA-1이 면역매트릭스에 특이적으로 결합됨을 의미한다. 은으로 염색된 겔의 각 레인에서 관찰되는 대략 42 kD 밴드는 겔 로딩 완충액에 존재하는 오염물질을 나타내었다 (도 3; 레인 1-3, 은 염색; 레인 4-6, 웨스턴 블롯; 레인 1 및 4, 면역매트릭스와 함께 옥틸글루코사이드 추출물을 배양함; 레인 2 및 5, 단백질-G-S19 면역매트릭스에 결합된 단백질 분획물; 레인 3 및 6, 단백질-G-세파로스 구슬에 결합된 단백질 분획물).
사람의 정자로부터 SAGA-1의 면역흡착 정제 방법
정자 추출물의 제조: 20 내지 30명의 사람이 사정하여서 실온에서 액화하도록 하고, 400×g에서 0.1M 헤페스(pH 7.4)로 완충된 햄(Ham)의 F-10 배지로 원심분리하여서 2회 세척하고, 사용하기 전까지 동결 보관하였다.
상 분리: 해동된 펠렛을 모으고, 4℃에서 1.7% 트리톤 X-114를 함유하는 TBS (10 mM 트리스-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl)에서 추출하고, 13,000×g에서 원심분리하여서 세포 파쇄물을 제거하였다. 30℃에서 추출물을 3분 동안 가열하고, 300×g에서 3분 동안 원심분리하여서 세정제와 수상을 분리하였다. 각 상을 2회 재분배하여서 분리를 완결하였다. 100,000×g에서 초원심분리로 불용성 세포 파쇄물을 제거하여서 최종 세정제상을 세정하였다. S19를 사용한 면역블롯 분석은 SAGA-1이 세정제상에 분배됨을 확인시켜 준다.
아세톤 침전 및 옥틸글루코사이드에서의 재현탁: 트리톤 X-114 추출물에서 단백질을 침전시키기 위하여, -20℃의 아세톤 8 부피를 가하고, 혼합하고, -20℃에서 4시간 내지 밤새 보관하였다. 3000×g에서 원심분리하여서 침전물을 수거하고, 상등액을 기울여 따라내고, 펠렛을 공기건조시켰다. 펠렛을 0.5% 옥틸글루코사이드, 트리톤 X-114 추출물의 원래 분피의 2배의 TBS에 재현탁시켰다. 100,000×g에서 1시간 동안 4℃에서 초원심분리하여서 불용성 단백질을 제거하였다. 흡착 크로마토그래피에 사용하기 위하여 상등액을 제거하였다.
S19 면역매트릭스 침전: S19를 함유하는 집합된 복수로부터 50% 황산암모늄을 사용한 침전화로 면역글로불린을 부분적으로 정제하였다. 침전물을 50% 황산암모늄으로 2회 세척하고, 복수의 원래 부피의 1/10의 PBS(20 mM NaPO4, 150 mM NaCl, pH 7.4)에 재현탁시켰다. PBS에 대해 투석하여 황산암모늄을 제거하였다. BCA 시약 분석 키트(피어스 케미칼 캄파니)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 황산암모늄으로 침전된 단백질을 단백질 G-세파로스 비드(파마시아, 미국 뉴저지주 피스캐타웨이 소재)와 함께 PBS(pH 7.4)에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하여서 IgG가 결합되도록 하였다. 단백질 G-세파로스 구슬의 각 ㎖마다 황산암모늄으로 침전된 단백질 15 ㎎을 함유시켰다. 비드 슬러리를 크로마토그래피 칼럼에 붓고, A280에서의 UV 흡광에 의해 모니터링할 때 단백질이 더 이상 용출물에서 검출되지 않을 때까지 PBS(pH 8.2)로 세척하였다. 단백질 G 비드에 IgG를 공유적으로 가교결합시키기 위하여, 칼럼을 0.2M 트리에탄올아민 (pH 8.2)으로 평형화하고, 매트릭스를 20 mM 디메틸피멜리미데이트 디히드로클로라이드 20 부피, 0.2M 트리에탄올아민 (pH 8.2)에서 재현탁시키고, 45분 동안 실온에서 부드럽게 교반하면서 인큐베이션하였다. 가교결합 반응을 중단하기 위하여, 비드를 500×g에서 3분 동안 원심분리하고, 비드를 동일 부피의 20 mM 에탄올아민에 재현탁시키고, 이 현탁물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 비드 슬러리를 크로마토그래피 칼럼에 붓고, 0.2% 아지드화나트륨, PBS (pH 8.2)으로 평형화하여서 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
흡착 크로마토그래피: 제조된 면역흡착 칼럼을 0.5% 옥틸글루코사이드, TBS로 평형화하였다. 소수성의 정자 단백질을 함유하는 옥틸글루코사이드 용액을 칼럼 상에서 1.3 ㎖/분의 속도로, 4℃에서 16시간 동안 계속적으로 재순환시켰다. 칼럼을 0.5% 옥틸글루코사이드, TBS로 세척하여서 결합되지 않은 물질을 제거하고, UV 흡광을 이용해 세척액 중의 단백질 농도를 모니터하였다. 결합되지 않은 단백질을 제거한 후, 결합된 물질을 0.1M 글리신, 0.15M NaCl (pH 2.4), 0.5% SDS로 용출시켰다. 분획물 3 ㎖을 수거하고, BCA 시약 분석 키트 및 UV 흡광을 사용하여 그의 단백질 농도를 모니터하였다. 단백질을 함유하는 분획물을 모으고, 아미콘 막 여과 농축기를 사용하여 농축하였다.
시료 정제의 분석: 15% 아크릴아미드를 통해 SDS-PAGE에 의해 S19 면역흡착 칼럼 상에서 정제된 단백질을 분리하고, 은 염색을 하거나 또는 니트로셀룰로오즈로 옮긴다. S19 모노클로날 항체와 인큐베이션한 후 표준 웨스턴 블롯 분석을 통하여 SAGA-1과의 반응성에 대한 면역블롯을 시험하였다. 은 염색 및 S19 반응성에 의해 검출된 단백질의 분자량과 단백질 밴드수를 비교하여서 순도를 추정하였다.
백신
본 출원인의 발명은 SAGA-1을 사용한 피임 백신, 더 구체적으로 면역원으로서, mAB S19에 의해 결합되는 임의의 단백질을 포함한다. SAGA-1 면역화는 숙주에서 수정을 억제하기에 충분한 항체를 생성할 것이다. 백신 자체의 제조법은 통상적 양식을 따른다. 정제된 면역원, 바람직하게는 S19 에피토프 영역을 갖는 재조합 면역원은 적절한 제약학적 캐리어에 혼입된다.
본 출원인의 신규한 면역원을 사용한 허용가능한 백신의 제조는 통상적인 방법에 따라 얻어질 수 있다. 애이트켄, 프리머만 및 헤르 등의 상기 문헌에 기재된 백신은 SAGA-1 단백질, 및 S19 mAB에 의해 결합된 그의 유도체에 쉽게 적용될 수 있다. 특히, 프리마코프의 상기 문헌 및 프리마코프 등의 문헌 [Am. J. Reprod. Immunol., 31:208-210(1994)]에 의해 개발된 PH-20 단백질을 사용하는 피임 백신은 적절한 캐리어 중의 백신 면역원으로 정자 단백질 항원을 성공적으로 사용할 수 있음을 반영하고 있다. 프리마코프에 의해 사용된 단백질 및 다른 것들은 불행히도 영장류에서 높은 수정 억제도를 얻지 못했으나, SAGA-1 단백질의 특이성, 특히 정자 세포의 전체 표면 상에서의 완전한 분포, 및 SAGA-1 단백질과 그에 대응하는 모노클로날 항체 간의 수많은 상호작용 방법은 경구적 피임약만큼의 수정 억제도(즉, 99%)를 얻을 수 있는 기회를 제공한다. 적절한 항체 역가를 개발하기 위하여, 여성을 포함하는 대부분의 시험 피검체의 백신 접종은 각각의 주사 후에 적절한 항체 역가를 생성할 시간을 갖기 위하여, 간격을 길게 두고 주사하는 방법에 따라 투여될 필요가 있다. 약 3달 동안의 기간 후에, 믿을 수 있는 충분한 수정 억제 효과를 얻기 위해서는 약 1달 간격으로 투여하는 것이 적절하며, 그 후 항체 역가를 측정하기 위하여 SAGA-1 단백질을 표준물로 사용하여 분석한다. 물론, 진단 분석은 낮은 항체 역가를 반영하고 있어서, 거의 완전한 수정 억제가 제공되지는 않고 있어, 추가의 백신화 프로그램 또는 낮은 항체 역가에 대한 원인을 알아내기 위한 다른 시험이 수반되야 한다.
천연 상태의 항원에 대한 항체를 생성하기 위한 면역원, 재조합 항원, 또는 이들 둘다의 사용은 본 발명에 포함되며, 그 자체가 당업자에게는 통상적인 것이다. 본 출원인의 신규한 개발은 본원에서 처음으로 완전히 규명된 독특한 SAGA-1 단백질의 도입 및 신뢰까지 확장된다. 투여량, 비히클, 투여 방법 등의 통상적인 최적화 방법은 그 자체로 본 발명의 한 측면을 구성하지 않는다. 그럼에도 불구하고 통상적 투여량으로서 0.5 ㎖ 부피의 100 ㎍ 내지 500 ㎍ SAGA-1 단백질이 각 투여량값으로 적절하다. 백신화 프로그램에 의해 생성된 항체가 증가된 표면적 상에서의 결합으로 인해 다른 특이적 항-정자 항체보다 효과적으로 정자를 침전시키기 때문에 증가된 백신의 효율성을 얻을 것이다.
대부분의 백신에서와 마찬가지로, 다가의 백신은 단일 백신보다 효율적이다. 상기된 바와 같이, SAGA-1 외에 수많은 정자-특이적 항원이 공지되어 있다. 비록 개별적으로 이 항원들은 높은 신뢰도의 수정 억제를 일으키지 못하나, 이들은 SAGA-1를 기재로하는 백신에 첨가되어서 신뢰도를 더 높일 수 있다. 특히, SAGA-1과 SP-10의 조합은 다가 백신에 대한 면역원으로서 바람직하다. 연구를 통해 이러한 단백질에 대한 항체가 쉽게 개발되는 것이 입증하였기 때문에, 상기 2개의 단백질 뿐만 아니라 다가 백신의 면역원으로서 가해질 수 있는 다른 공지된 단백질에 대한 조합된 결합능을 얻을 수 있다. 그러나, SAGA-1 단백질, 또는 S19 항체에 의해 결합되는 임의의 변형 단백질에 대한 항체가 크게 증대된 결합 기회를 제공함에 따라 수정 억제의 신뢰도가 더욱 증가되기 때문에 이들이 핵심 요소라는 것은 당연하다.
진단
SAGA-1 단백질을 비롯한, S19 mAB에 의해 결합되는 단백질의 특성은 2개의 상이한 유형의 진단 시험을 가능하게 한다. 처음에는 백신 면역원, SAGA-1 단백질 또는 그의 변형체에 대한 항체의 생성을 모니터하는 것이 필요하다. 특정 잠재적 후보들에는 적절한 면역 반응계가 결여될 수 있으며, 이들은 개별적으로 임의의 면역원에 대한 반응으로 생성되는 항체 역가 또는 면역원 투여 방법에 있어서 다양하다. SAGA-1 단백질을 항원 표준물로 사용하여 적절한 항체 역가의 발생을 쉽게 확인할 수 있다. S19 mAB에 대해 기재된 응집화 분석을 사용하여, 100% 응집화에 필요한 농도를 쉽게 측정할 수 있다. 적절히 고정화되고 존재하는 SAGA-1 단백질의 상기 농도를 환자로부터 얻은 시료에 대해 시험한다. 100% 결합능은 적절한 항체 역가를 암시한다. 임의의 상기 백신화 프로그램이 임상적 감독 하에 수행되야 하기 때문에, 시험 양식은 ELISA, 웨스턴 블롯팅 분석 또는 다른 확립된 당업계의 양식을 사용한 통상적인 것일 수 있다.
또한, 사용법이 간단한, "사용자에게 친숙한" 시판 진단제, 즉 처방전 없이 진단하는 것에 대한 관심이 증가되고 있다. 이러한 유형의 진단제에 대한 관심의 원인 및 상기 진단제의 다양한 용도는 본원에 참고문헌으로 인용된 1997년 2월 25일에 허여된 미국 특허 제5605803호에 기재되어 있다. 상기 문헌에 개시된 진단제는 SP-10 결합 항체, MHS-10, 또는 수탁 번호 제HB 10039호 하에 ATCC에서 분양되는 하이브리도마 세포주에 의해 발현되는 것의 결합 특징을 갖는 항체를 사용한다. 상기 문헌에 기재된 바에 따라, 처방전 없이 자체 사용가능한 상기 유형의 진단제는 합법적으로 사용할 수 있고, 정상적 생식세포 계통의 존재를 확인하는 데 유용하고, 임신하기에 어려운 남성 및 여성, 정관절제된 남성에서, 정관절제된 남성의 시험, 수술하여 정관을 다시 연결시키는 성공률을 측정하기 위한 정관절제된 남성의 시험에서 실질적으로 가치가 있다. 임의의 다양한 이유로, 생물학적 시료, 즉 사정액, 또는 사정액 또는 남성의 재생관으로부터 유래된 시료 중 정자의 존재의 검출은 의학적으로 중요하다. S19 mAB에 의해 결합되는 항원, SAGA-1 단백질 및 S19 CDR-반응성 에피토프를 갖는 상응하는 변형체 및 재조합 유도체는 1997년 2월 25일에 허여된 미국 특허 제5605803호에 기재된 분석에 사용될 수 있다.
따라서, S19 항체는 고체상에 결합하여 SAGA-1단백질을 포획하는 데 사용될 수 있다. SAGA-1 항원의 존재를 인지하는 것은 2차 단일클론 또는 다클론 시약을 사용하여 완결될 수 있다. 예를 들어 쉔 (Shen) 등의 문헌[Am. J. Reprod. Immunol. 29; 231-240(1993)]을 참조한다. 다른 분석 양식은 심지 또는 계심봉 및 착색 구슬에 결합된 항체를 이용할 수 있다. 모든 변형법에서, 필수적 시약은 S19 mAB, 또는 SAGA-1 단백질에 대한 유사 항체이다. 시료에 존재하는 임의의 단백질은 고정화된 항체에 결합되거나 또는 포획된다. 따라서, 적절한 항체 역가를 생성하는 것을 모니터하려는 진단제에서, SAGA-1 단백질 또는 유사한 단백질은 표준 시험 시약으로 사용된다. 항원의 존재를 확인하여서 정자가 존재함을 확인하고자 하는 "가정용 시험 키트"에서는 정자의 항원에 반응하는 모노클로날 항체가 시약이다.
본 출원인은 본 발명을 일반적 용어 및 구체적 용어로 개시하고 있다. 당업자에 의해 변형될 수 있으며, 실시예 및 특정 실시양태는 명세서에 언급되어 있지 않는 한 본 발명을 제한하려는 것은 아니다. 당업자는 과도한 실험 없이도 변형이 가능할 것이다. 특히, 농도 수준, 투여 방법, 재조합법 및 변형법 등은 당업자에게 가능하며, 본 발명의 범위 내에서 하기 첨부된 청구범위에 의해 한정된 범위 내에 있다.

Claims (9)

  1. 수탁 번호 ATCC HB 12144로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 발현되는, 정자 응집 항원-1(SAGA-1) 단백질에 결합하는 모노클로날 항체.
  2. 제1항의 모노클로날 항체에 의해 결합되는 SAGA-1 단백질의 정제된 피임용 제제.
  3. 암컷 포유동물에 투여시에 SAGA-1 단백질에 대한 항체의 생성을 유도하기에 유효한 양으로 제2항의 상기 단백질을 제약상 허용되는 담체 중에 포함하는 피임 백신.
  4. 제3항에 있어서, 상기 단백질이, 백신 처리 프로토콜의 종료 시에 상기 암컷 포유동물이 95% 이상의 수정 억제를 제공하는 항체 역가를 보일 정도로 충분한 양으로 존재하는 것인 백신.
  5. 제2항의 공지된 양의 결합되는 단백질, 및 백신 접종 대상체로부터 얻은 시료에 존재하는 항체와 상기 결합되는 단백질 사이의 결합을 검출하는 수단을 포함하며, 상기 모든 단백질이 완전히 결합하는 것이 대상체에서의 수정을 억제하기에 충분한 항체 역가를 표시하는 것인, 제3항의 백신을 투여받은 백신 접종 대상체의 항체 역가를 측정하기 위한 진단 키트.
  6. 제약상 허용되는 담체 중에 활성 물질로서 제1항의 모노클로날 항체를 포함하는 살정제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 살정제의 1회 투여가 사정액에 존재하는 100%의 모든 정자 세포에 효과적으로 결합할 정도로 충분한 농도의 모노클로날 항체를 포함하는 것인 살정제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 리포좀의 표면에 존재하는 것인 살정제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 리포좀이 양 하전된 비인지질 리포좀인 살정제.
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