CN1227497A - 纯化的精子表面抗原、其单克隆抗体,以及它们的应用 - Google Patents

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Abstract

由保藏物HB12144，ATCC所表达的单克隆抗体(S19)能有效凝集一种精子表面糖蛋白－SAGA－1蛋白。该单克隆抗体可用作一种杀精子剂中的结合剂，在结合有潜能的精子方面具有高度有效性。鉴别为SAGA－1的结合蛋白质是一种避孕用疫苗中的免疫原，也是在接种时确定抗体滴度的标准。该单克隆抗体也可用作诊断剂以确定多种样品内精子的存在和量。

Description

纯化的精子表面抗原、其 单克隆抗体，以及它们的应用
发明领域
本发明涉及一种精子表面抗原、抗该抗原的一种单克隆抗体以及所述单克隆抗体和抗原的应用。具体地说，通过将该抗原用作免疫原，本发明提供了一种避孕用疫苗，以及可用于免疫测定中的一个标准，该单克隆抗体可用作杀精子剂和诊断试剂。
相关工作背景
有关较好避孕方法的开发一直受到广泛关注。一项已广泛开发的技术是使用杀精子剂，其实质上是一种化学屏障，可阻止精子穿过子宫或卵细胞，或者抑制其活性，从而避免受精。得到极广泛使用的一种杀精子剂是去污剂壬苯聚醇-9。多个报道表明，使用这种去污性杀精子剂，会提高妇女发生尿道感染和子宫颈阴道炎的机率。McGroarty等，泌尿学杂志，152(3):831-833(1994)。作为化学去污剂的另一种选择，作者已提出，单克隆抗体在局部应用中，如在局部杀精子剂的应用中可能是一种比较安全的活性剂。参见如Cone等，美国生殖免疫学杂志，32:114-131(1994)。研究结果表明，除了可降低甚至消除不需要的免疫反应外，人单克隆抗体应能作为安全的杀精子剂，因为它们的剂量和应用持续时间可很好控制，局部释放可将全身性暴露降至最低，并且可以对单克隆抗体进行选择以利于安全性和有效性。因此，作为局部杀精子剂而递送的精子活性单克隆抗体可导致期望的抗受精效果，且同时并不产生应用去污剂杀精子剂时所伴生的负面副效应。一般参见Alexander，科学美国，9月刊：136-141(1995)。因此，本领域的一个目标仍然是应用单克隆抗体提供一种安全有效的杀精子剂。
已对大量的单克隆抗体作为潜在的精子反应性试剂作了研究。其中得到研究的一种抗体是抗人精子单克隆抗体S19。这一单克隆抗体的建立参见Anderson等，生殖免疫学杂志，10:231-257(1987)。此抗体是通过用人精子匀浆物免疫小鼠而得到的。在本发明人的实验室中发现此IgG1单克隆抗体与人精子发生很强的凝集反应，随后该单克隆抗体被递交到世界卫生组织-抗精子单克隆抗体主办工作室进行进一步的鉴定。该抗人精子单克隆抗体S19很强地凝集人精子，抑制人精子和透明带之间的紧密结合，阻断精子穿过宫颈粘液。Anderson，出处同前；Cone，出处同前；Mahoney等，生殖免疫学杂志，19:269-285(1991)。在录像带中可看到该抗体对精子的强凝集作用。这些发现表明相关的S19抗原在受精过程中参与配子的相互作用，可能是导致免疫性不孕的自身抗体的靶，可作为开发避孕用疫苗的一个候选者。
然而，不管是作为研究工具，还是作为避孕剂，S19抗体都并未得到进一步的开发。迄今仍无S19抗体的保藏，它也未被“人源化”以降低免疫反应的机率。该单克隆抗体未得到详细的研究，迄今为止，它基本上仍是一个科学盲区。
还已知其它单克隆抗体和精子抗原。在美国专利5436137(Herr等)中讨论了单克隆抗体MHS-10和与其结合的抗原SP-10(一种顶体内抗原)，它是用于精子诊断和用作避孕用疫苗的用途的一个候选者，所述专利引入本文作为参考。然而，不同于SP-10抗原，与S19单克隆抗体结合的抗原-精子凝集抗原1(sperm agglutination antigen-1,SAGA-1)似乎位于人精子的整个表面。这一发现有力地暗示该单克隆抗体可结合并凝集于整个精子表面的多个位点。
应用SP-10抗原的疫苗的开发性工作正在进行中。类似地，世界上许多研究者正在分析开发出基于精子抗原的避孕用疫苗的可能性。参见如Aitken等，英国医学杂志，49:88-99(1993),Freemerman等，生物生殖，50:615-621(1994)和Herr，受精控制；pp431-452(第二版，1994)。在这一点上，有关人绒毛膜促性腺激素(hCG)用作妇女避孕用疫苗的工作仍在进行中。Talwar，免疫学现代观念(Current Opinion inImmunology),6:698-704(1994)和欧洲专利86304274.3。对此潜在疫苗正在进行临床疫苗试验，而hCG免疫原早已用作堕胎药，也就是说，接种该疫苗而引起的免疫响应会导致早期胚胎或胎儿的流产。对许多人来说，这可能是一种不能接受的避孕药。
另外，已在灵长类和啮齿类动物模型中对多种精子表面抗原进行了研究。利用精子表面抗原如LDH-C4(O′Hern等，生物生殖，52:331-339(1995))、PH-20(Primakoff等，自然，335:543-546(1988))、RSA-1(O′Rand等，生殖免疫学杂志，25:89-102(1993))和fertilin(Ramarao等，分子生殖与发育，43:70-75(1995))等免疫实验动物，导致了受精率降低。令人失望的是，在灵长类中，利用精子抗原所观察到的最高有效率为约75％的受精抑制率，O′Hern等，出处同前。因此，迄今为止，仍未鉴定出一种有效的人精子抗原，在用作避孕用疫苗时其效力水平能与口服避孕药相当。因此，提供一种安全有效且受精抑制率较高(与口服避孕药的效力水平在同一数量级)的避孕用疫苗仍是本领域技术人员的一个课题。
此外，由于接种了避孕用疫苗的那些人有必要定期测定血清抗体以确定他们是否“安全”，因此最好是在测定中使用SAGA-1抗原作为目标来测定接受该疫苗接种的人体内的抗体浓度。
用于检测与怀孕相关的激素(hCG和其它)的“公开交易”(over thecounter)测定或诊断试剂盒在市场上已获得巨大成功，相对于到诊所进行颇为尴尬、不便且昂贵的诊治，这是另一种选择或者说是首要步骤。近年来，人们的注意力一直集中在对使用者精液中精子的存在与浓度的测定中。从受精咨询以及强奸情形下的临床诊断来看，或者是为了能够测定是否已接受了输精管切除术以及这一手术的效果，日益需求一种简便的测试试剂盒，利用这种试剂盒能在家中方便有效地进行样品中精子的检测。美国专利申请流水号08/231,675中公开了这样一种测试试剂盒，其中使用了MHS-10单克隆抗体来检测SP-10顶体内精子抗原，该专利申请引入本文作为参考。除了MHS-10抗体外，S19抗体为用于人精子诊断提供了另一种有效结合。
发明简述
通过使用“人源化”重组型单克隆S19抗体，纯化可与其结合的相应抗原-SAGA-1，并将其用作活性剂，可以达到上述目的。通过适当载体而调动的该单克隆抗体提供了一种有效的结合剂，即用作杀精子剂和人精子诊断剂。SAGA-1抗原是一种分布于精子整个表面的人精子糖蛋白，它提供了一种有效的免疫原，并且可在正进行着疫苗治疗的个体中用作测定避孕用抗体产生的标准。
为了提供一种有效的杀精子剂凝胶或乳剂，该单克隆体必须以存在于有效载体中的形式提供。可用于研究的一些载体有为抗原或抗体递送而特别配制的非磷脂类脂质体等。一种商业形式目前可从Novavax,Inc.,Rockville,Maryland购得，商标为NOVASOMES。S19单克隆抗体有可能结合到这些带正电荷的脂质体的表面。也可制备其它精子凝集载体和组合物。
制备有效疫苗的首要步骤是纯化SAGA-1抗原。掺入于药学可接受载体中的该纯化抗原可施用给期望进行避孕用接种的患者。重复接种可导致产生抗精子的抗体，能高效结合精子。为了检查抗体有效水平的情况，可利用该纯化抗原作为试验标准剂，以通过常规诊断方法，确定患者体内是否存在抗体以及抗体存在量。
附图简述
图1是S19单克隆抗体与SAGA-1反应得到的Western印迹分析结果的照片。
图2是SAGA-1的Triton-X-114相分配的SDS-PAGE免疫印迹结果的照片。
图3是通过序列分析得到的S19单克隆抗体k轻链的核苷酸碱基序列。
图4是结合于S19单克隆抗体免疫基质柱的SAGA-1制备物的Western印迹分析结果的照片。
图5是通过序列分析得到的S19单克隆抗体重链的核苷酸碱基序列。
发明详述
本文申请人的发明包括单克隆抗体S19；与它结合的抗原-SAGA-1；在适当的药学可接受载体中使用所述单克隆抗体的杀精子剂；利用SAGA-1作为免疫原的避孕用疫苗；诊断测定和试剂盒，其中利用结合的S19作为诊断剂来确定精子浓度，利用SAGA-1作为标准试剂来确定接种疫苗而导致的抗体产生情况；以及相关的应用。以上各方面在下文均有叙述。
尽管对所述抗体、所述蛋白质以及它们的应用的讨论是单独进行的，但本发明是基于这样一个共识，即SAGA-1蛋白广泛分布于精子表面，能与S19单克隆抗体积极结合，而S19单克隆抗体可在受精过程的多个步骤明显阻断精子功能，包括抑制精子活力和配子间的相互作用。单克隆抗体S19
如上所述，尽管以前一直未公开获得，但S19单克隆抗体一直是研究和现有出版物的主题。最初的S19抗体是通过用人精子匀浆物免疫小鼠而得到的。此抗人精子单克隆抗体能强烈凝集人精子，抑制人精子和透明带之间的紧密结合，阻断精子穿过宫颈粘液，并诱发精子的摇摆现象。
已按照布达佩斯条约条件，于1996年6月26日将所述S19单克隆抗体保藏于ATCC，保藏号为HB 12144。据申请人所知，这种保藏还是首次。
该S19单克隆抗体强列地凝集人精子的能力已在体外得到了证实。通过显微录像对凝集作用进行分析。已制成一部录像电影。凝集的证实
每一实验中，稀释人精液至终浓度为2×107个精子/毫升，按1∶10的比例稀释腹水。在Eppendorf管中混合精子和腹水，然后置于血细胞计数器上。用时间间隔照像术(time lapse photography)记录S19腹水的结果。
在0时刻精子自由游动，10分钟后精子则完全被凝集了。使用空白腹水液作为对照。(0时刻是指将精子置于载玻片上并开始照相的时间点)。其中精子自由游动。可明显看到碎片和圆细胞。在10分钟后对照中精子活力或凝集程度无明显改变。
这些结果表明该S19单克隆抗体在整个精子表面的多个位点结合、凝集人精子。所有精子均完全凝集说明抗SAGA-1单克隆抗体可以作为精子功能的有效终止剂，因而也是受精的有效终止剂。杀精子剂的制备
如上所述，文献中理论上阐述了多种基于单克隆抗体的杀精子剂的开发。适用的载体在Cone和Alexander(出处同前)中有记载。申请人已开发出了一种可以凝集形式提供S19单克隆抗体的特定载体，其中使用了可从Novavax Inc.,Rockville,Maryland按商品名Novasomes购得的脂质体递送系统。这些脂质体经特殊配制以用于抗原或抗体的递送。含有天然S19单克隆抗体分子的Novasome可在杀精子剂凝胶中有效发挥杀精子剂功能，其中所述S19单克隆抗体分子结合于这些带正电的非磷脂类脂质体表面。利用上述的精子凝集测定检测Novasome制剂。1∶10稀释度的S19-Novasome载体凝集精力的效率与1∶20稀释度的S19腹水液相同。这些结果表明该S19单克隆抗体掺入到可商购的递送系统中时，其对精子功能的影响与存在于天然流体中一样。
本领域技术人员能得到其它递送系统，这些系统中较为突出的有结合了脂类的肽(参见如Deres等，自然，342:561-564(1989))和ISCOM(参见如Takahashi，自然，344:872-875)。过去已开发了其它一些制剂，包括疏水性乳剂类和皂苷类，以用于特定肽的加工和成形，这些制剂也可用于本文所述的杀精子剂抗体。参见如Raychaudhuri等，美国国家科学院院报，89:8308-8312(1992)和Newman等，免疫学杂志，148:2357-2362(1992)。同样可使用其它载体，包括在膜上展示抗体，如由重组病毒表达的那些(即采用重组病毒方案，其中编码如前所述抗体的DNA与一种结构性膜蛋白一起在重组细胞内表达)。在可获得的那些种类中，除了前述的非磷脂类脂质体之外，普遍用于疫苗中以展示抗原的ISCOM也可提供理想的性质。ISCOM形成类成骨架一样的膜结构，在其内或上面可展示抗体。以前已将ISCOM用于抗原的展示中，但它们是类似地将抗体蛋白质展示于一种暴露的、病毒样结构中。就此而言，已知可用于活性蛋白质展示的其它载体，包括共聚物球状体和病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)已知也能得到与免疫激发复合物(immune-stimulating complexes，或称ISCOMs)相似的结果。当然，一种极其常规的系统，即抗体通过耦合剂结合于微球体表面，有可能适合与可接受的生产技术一起使用以制备适于这一途径的凝胶和霜剂。
因此，本申请人的杀精子剂的实质是将含于合适载体内的足够浓度的S19单克隆抗体掺入合适的载体中以有效抑制(凝集或结合)精液中存在的所有精子。S19单克隆抗体的分离、鉴定和克隆
培养能分泌S19的MHS-8杂交瘤细胞，对细胞进行计数，以便利用Fast Track2.0试剂盒(Invitrogen)从1×107个细胞中制备RNA。利用去污剂裂解缓冲液和蛋白质降解缓冲液，直接从细胞分离总RNA。然后利用改进的Aviv和Leder方法分离poly(A)+RNA，其中mRNA结合于oligo-dT树脂上。然后用低盐缓冲液洗涤树脂以除去外部总RNA，再从树脂中洗脱出poly(A)+RNA。在260nm和280nm进行分光光度分析，结果表明poly(A)+RNA的终浓度为1.84μg/μl。poly(A)+RNA的逆转录和扩增
S19是一种二价抗体，可通过其交联精子表面的抗原表位的能力而作为人精子凝集素起作用。为了使重组蛋白质也保留这一功能，鉴定出了该抗体中可识别抗原表位的区域或者互补性决定区(complimentarydetermining regions,CDRs)。合成4种鼠寡核苷酸以用于IgG1特异性重链和轻(k)链亚基。设计的这些寡核苷酸能够仅扩增S19的可变区(大约开始的360个碱基对)，该区中含有CDR。这些寡核苷酸序列如下：
1．重链5′末端：ACTAGTCGACATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG
2．重链3′末端：CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG
3．轻链5′末端：CCCCCCGGGGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCT
4．轻链3′末端：CCCCCCGGGGATGGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCG
重链寡核苷酸得自Ig-Prime试剂盒(Novagen)，其中核苷酸的简写如下：R=A或G,I=肌苷，K=G或T。用dH2O将所有寡核苷酸稀释至终浓度为1.0μg/μl。
利用Promega的Access RT-PCR系统在一个反应中进行S19杂交瘤poly(A)+RNA的逆转录和聚合酶链反应扩增。简言之，在一个0.5ml微量离心管中混合5μg的S19杂交瘤细胞的poly(A)+RNA，每一合适引物(重链中用引物1和2，轻链中用引物3和4)各1μg,10mM dNTP混合物1μl,5×AMV逆转录缓冲液10μl,25mM MgSO4 2μl,AMV逆转录酶1μl,Tfl聚合酶1μl，和无核酸酶的dH2O 30μl。反应物于48℃保温45分钟，随后于94℃保温2分钟。反应进行40个循环，每一循环为94℃30秒，60℃1分钟，68℃2分钟。最后一个循环后于68℃保温7分钟。在2％琼脂糖凝胶上分析扩增产物(图1)。泳道1是Stratagene的1kb DNA分子量标准，泳道2是轻链片段，泳道3是重链片段。正如预期，重链和轻链条带与396bp的分子量标准的泳动率大致相同，这是因为用于轻链的引物扩增开始的384bp片段(360bp片段连同额外的限制性酶位点)，而用于重链的引物扩增的产物还有额外的60bp。将扩增的S19抗体片段克隆到载体中
从凝胶中切出图1的重链和轻链条带，用Ultrafree MC滤器(Millipore)进行洗脱。随后用Pfu聚合酶代替Tfl聚合酶，将纯化的片段再扩增40个循环。再次凝胶纯化诸片段，将它们重悬于25μldH2O中。
用pCR-Script SK(+)系统(Stratagene)进行克隆。该载体利用Pfu-c扩增的PCR片段进行钝末端连接以将cDNA插入该载体中的Srf1限制性酶位点。Srf1是一种新的、切点比较稀少的限制性酶，它识别序列5′GCCCGGGC3′。为了确保重链和轻链片段不会被Srf1所消化，将1μl每一种cDNA与1μl Srf1酶，1μl10X反应缓冲液和7μl dH2O混合，于37℃放置1小时。结果表明该酶不消化其中任何一个片段。
接着合并1μlpCR-Script载体，1μlpCR-Script 10X缓冲液，0.5μl 10mM rATP,5.5μl重链或轻链cDNA,1μlSrf1酶和1μlT4 DNA连接酶，从而进行克隆。将反应管置于室温1小时，然后于65℃加热10分钟。
冰上融化Epicurean Coli XL1-Blue MRF′Kan超感受态细胞，将40μl小份细胞加到已预冷的15ml管中。然后向细胞中加入0.7μl的1.44M β-巯基乙醇，于冰上保温10分钟。取上述每一克隆反应2μl加入到细胞中，继续置于冰上30分钟。然后在42℃浴中加热该细胞和cDNA的混合物45秒，并转移至冰上2分钟。向其中加入0.45ml SOC培养基后，在37℃水浴中振荡培养细胞1小时。再将细胞涂布于LB/氨苄青霉素/2,6-二甲氧基苯青霉素/X-gal/IPTG培养板上以筛选出抗生素抗性菌落，将细胞置于37℃培养过夜。选出每一克隆的阳性菌落，将它们分别培养于5ml SOC培养物中以进行质粒纯化。
用Qiagen-tip 20柱(Qiagen)纯化质粒。在10krpm离心该5ml细胞5分钟。吸去多余培养基，将细胞团重悬于0.3ml缓冲液P1中。加入缓冲液P2，将混合物于室温下放置5分钟，然后加入0.3ml冰冷的缓冲液P3，将混合物置于冰上10分钟。在此静置期间内，用1ml QBT缓冲液平衡Qiagen柱。然后于10krpm离心细胞样品15分钟，移出上清液，将其上样到Qiagen-tip 20柱中。上清液由于引力流动而完全进入柱树脂中后，用4ml缓冲液QC洗涤诸柱，再用0.8ml缓冲液QF进行洗脱。为了沉淀质粒DNA，向柱洗出液中加入0.56ml异丙醇，将合并物在10krpm离心30分钟。然后将所得的DNA沉淀块重悬于25μl dH2O中。
为了确证纯化质粒中cDNA存在插入片段，用两种限制酶消化每一克隆。用于消化的限制酶是NotⅠ和EcoRⅠ，它们分别在pCR-Script克隆载体的5′和3′末端具有限制位点。若存在插入片段，则用这些酶消化将会从宿主载体中切出该插入片段。将每一克隆的1.5μl DNA与0.75μlNotⅠ、0.75μl EcoRⅠ、1.5μl 10×缓冲液和10.5μl dH2O混合，于37℃保温90分钟。然后在2％琼脂糖凝胶上对消化产物进行电泳，对含有插入片段的那些克隆进行测序。重链和轻链克隆的序列分析
用Fidelity试剂盒(Oncor)对上述阳性克隆进行序列测定。每一测序反应含有5μl质粒DNA,1μlT3引物(位于pCR-Script载体上的5′克隆位点的上游)和2μl dH2O。将混合物加热到95℃5分钟，稍微离心，再加入2μl退火缓冲液，将反应物于37℃保温15分钟。然后通过加入3μl T4反应缓冲液，1μl33P-α-ATP,2μl T4 DNA聚合酶和2μldH2O对反应物进行标记。这一混合物在40℃保温15分钟，然后加入6μl T4辅助混合物。从该标记反应中分别取出5.5μl加入到各含有2μlA、C、G、T终止混合物的4个管中，在40℃保温5分钟。通过加入5μl蛋白酶K溶液从而终止反应，在上样到6％丙烯酰胺测序凝胶上之前，将其加热到95℃。凝胶在2000伏的电压下电泳2小时，置于Whatman 3MM滤纸上真空干燥，室温下对X-射线胶片曝光过夜。对胶片显影后，在一灯箱上读取凝胶上的序列。将推断的克隆序列与已知的鼠IgG1序列进行比较，发现轻链克隆代表了一种异常的轻链，它是从杂交瘤sp2/0中扩增而来的。分离重链序列，其碱基序列示于图5。对cDNA进行限制性酶消化以除去内源性抗体
为了从该异常的杂交瘤轻链中分离出S19 k轻链，重复进行RT-PCR反应。分析该异常序列，在其中一个CDR内发现了一个稀有的Van91I限制性位点(5′CCANNNNNTGG3′)。假设该S19轻链存在于从杂交瘤经RT-PCR扩增产生的cDNA混合物中，用Van91I(New England Biolabs)消化该混合物。该消化反应物由1μl Van91I、3μlcDNA、1μl10X反应缓冲液和5μl H2O组成。反应物在37℃保温过夜以确保消化完全。不能被该酶切开的任何cDNA均应是正确的S19 k轻链。
如图2所示，在2％琼脂糖凝胶上分析消化产物。(泳道1是Stratagene 1kb DNA分子量标准，泳道2是3μl未切割的cDNA，泳道3是消化反应物)。泳道3中大部分反应物已被消化成2个片段，但在396bp处有一浅带，这代表未被切开的推测的S19轻链。从凝胶中切出该带，如上述纯化，然后如前述用Pfu聚合酶经40个循环的PCR进行扩增。如前述将该cDNA克隆到pCR-Script载体中，按照同样的铺板方法，选出6个阳性菌落。同样培养这些阳性菌落，进行质粒纯化和限制性消化以证实存在插入片段。k轻链的自动测序
在弗吉尼亚大学生物分子研究所，利用ABI Prism 377自动DNA测序仪对所述新的轻链克隆进行测序。对每一克隆，均在12μl的总体积内合并100ng cDNA和3.2pmol T3引物，再输送到该仪器中。在那儿，向同一反应管内加入四种染料标记的双脱氧核苷酸和Amplitaq聚合酶FS。将整个反应物上样到一个泳道，以在36cm的易于读序的5.0％丙烯酰胺凝胶上进行电泳。用CCD摄像术通过激光扫描实时测定电泳的各个片段。由仪器上得到的测序结果与GenBank数据库中的鼠k轻链非常吻合，正确的轻链碱基序列示于图3中。可通过常规技术，利用编码抗体中S19的重链和轻链的cDNA序列制备重组型抗体，包括具有位点缺失和结构域缺失和添加的抗体。SAGA-1蛋白
我们保藏的S19单克隆抗体能有效结合和凝集人精子。已拍成照片的凝集测定的结果清楚表明结合和凝集发生在整个精子表面的多个位点。除了由S19单克隆抗体提供的有效杀精子剂之外，结合抗原SAGA-1也被明确显示是有效的疫苗原(vaccinogen)。特别地，作为抗原/免疫原产生抗SAGA-1蛋白的抗体的能力应能为妇女避免受精提供有效保障，即可提供避孕用疫苗。可将同一抗原用作标准试验试剂以检查一种疫苗方法的有效性。因此，可通过常规测定方案，包括ELISA及Western和Southern印迹测定，定期测定接种疫苗的妇女，并且检测体液样品抗已知量的SAGA-1的能力。阳性结合表明产生了可结合SAGA-1蛋白的抗体，因而可免于受精。利用SAGA-1作为标准化试验，并测定结合量，即可测出所产抗体的滴度或浓度。既然依据上述的凝集测定可建立起适当的滴度，那么利用SAGA-1蛋白作为标准的测定反应出已达适当滴度，就证实了已达到抗受精状态，仅需在所需的不孕期间内维持这种状态即可。SAGA-1蛋白的鉴别
通过Western印迹分析表明(图1)，S19单克隆抗体识别SAGA为一系列低分子量糖蛋白。在1％SDS中制备已被洗涤的人精子的提取物，通过还原性SDS-PAGE对其进行分离。该S19单克隆抗体可与一系列有所重叠的条带反应，这些条带范围在大约15～25kD(泳道3)。用10mM高碘酸处理(泳道6)，可去除S19与相关抗原的免疫反应性，而MHS-10单克隆抗体与SP-10蛋白质的肽表位之间的反应性并未受到影响(泳道2和5)。这一发现表明该S19单克隆抗体所识别的表位是一个糖类部分(图1；泳道1，酰胺黑染色；泳道2和5,MHS-10；泳道3和6,S19；泳道4和7，空载腹水；泳道2-4，未被高碘酸处理；泳道5-7，用高碘酸处理过的免疫印迹小膜片；M，用kD表示的分子量标准：97.4,68,43,29,18.4,14.3)。此外，用蛋白酶K处理SDS精子提取物会破坏S19的免疫反应性(结果未附)，这表明S19抗原很可能是一种糖蛋白。基于鉴定出来的该S19糖蛋白具有强烈凝集人精子的能力，因而将它定名为精子凝集抗原-1(Sperm Agglutination Antigen-1,SAGA-1)。高度强化SAGA-1的方法
SAGA-1的溶解性特征表明它是一种疏水性的膜内在蛋白质。在用高盐(1M NaCl或0.6M KCl)和/或温和的非离子型去污剂(0.1％NP-40或Triton X-100)制备的人精子提取物中检测不到S19反应性。这些结果表明利用经典用于除去膜周边蛋白质的处理方法不能将SAGA-1抽提下来。
用Bordier(1981)所述的Triton X-114相分配方法，检查SAGA-1以膜内在蛋白质形式存在的进一步证据。非离子型去污剂，如TritonX-114，能通过取代正常的脂类环境而溶解膜内在蛋白质。当Triton X-114分散于水溶液中，浓度在其临界的微胶粒浓度以上时，0℃下它形成小的微胶粒。疏水性的膜内在蛋白质会掺入到这些微胶粒中，而亲水性的蛋白质仍保留在水环境内。这样的溶液加热时，微胶粒会变大，从溶液中析出来，形成一层富含去污剂的相，该相可通过离心而与水溶液分开。Bordier(1981)曾用此方法来证明绝大多数膜内在蛋白质分配于去污剂相，而亲水性蛋白质仍保留在水相。
为了研究SAGA-1的Triton X-114相分配，在1％Triton X-114，10mM Tris-HCl,pH7.4,150mM NaCl中，于4℃提取洗涤过的人精子，离心除去碎片。经三轮相分配后，通过SDS-PAGE和免疫印迹分析等量的初始精子提取物、去污剂相和水相(图2)。人精子/精巢特异性蛋白质SP-10(一种周边的顶体膜蛋白质)作为对照；在水相中检测到了MHS-10单克隆抗体与SP-10的反应性。可在初始精子提取物和去污剂相中检测到S19反应性，而在水相中检测不到。这些结果表明S19单克隆抗体能与一种疏水性的膜内在糖蛋白反应。酰胺黑染色显示，总精子蛋白质中的大多数在水相中仍然可溶，而仅有少量蛋白质分配于TritonX-114中。因此，在天然SAGA-1的纯化中，Triton X-114相分配可用作起始步骤。必须替换去污剂以便纯化
去污剂Triton X-114的生物化学性质不利于随后的纯化方法。在该去污剂的所需浓度下，Triton X-114将蛋白质掺入到大的去污剂微胶粒中，该微胶粒会阻碍蛋白质结合到亲合基质上。而且，Triton X-114不能在室温下使用。因此，用-20℃的丙酮沉淀Triton X-114提取物中的蛋白质，并将其重悬于0.5％的辛基葡糖苷，TBS[100mM Tris-HCl(pH7.4),150mM NaCl]中。辛基葡糖苷可在室温下使用，其必需浓度不会抑制蛋白质-免疫基质间的相互作用。
将S19单克隆抗体通过二甲基庚二酰亚胺盐(dimethylpimelimidate)二氢氯化物交联到Protein G-Sepharose上，详细过程如下所述。将这种免疫基质和一个用于抗体特异性的负对照-缺乏交联的单克隆抗体的Protein G-Sepharose玻珠与辛基糖苷提取物一起保温。使用S19单克隆抗体，对结合的各级分进行Western分析(图4)。在辛基葡糖苷提取物和结合于免疫基质的级分中检测到了SAGA-1，但在从无抗体的Protein G-Sepharose玻珠中洗脱出来的级分内未检测到。这些结果表明SAGA-1特异地结合到该免疫基质上。在银染凝胶的每一泳道上观察到的大约42kD的条带已证明是凝胶上样缓冲液中存在的污染物。(图3；泳道1-3，银染；泳道4-6,Western印迹；泳道1和4，与免疫基质一起保温的辛基葡糖苷提取物；泳道2和5，结合到Protein-G-S19免疫基质上的蛋白质级分；泳道3和6，结合到单纯Protein-G-Sepharose玻珠的蛋白质级分。从人精子中免疫亲和纯化SAGA-1的方案
制备精子提取物：使20-30份人精液在室温液化，通过与用0.1MHepes(pH7.4)缓冲的Ham’s F-10培养基一起在400×g离心而洗涤两遍，冷冻贮存备用。
相分离：集中冻融过的细胞团，于4℃在含有1.7％Triton X-114的TBS(10mM Tris-HCl[pH7.4],150mM NaCl)中提取，在13,000×g离心以除去碎片。在30℃加热提取物3分钟，于300×g离心3分钟以分离去污剂相和水相。对每一相重分配两次以确保完全分离。通过在100,000×g超速离心以除去不溶的碎片，从而澄清最后的去污剂相。用S19进行免疫印迹分析应能确证SAGA-1分配到去污剂相中。
丙酮沉淀并重悬于辛基葡糖苷中：为了沉淀Triton X-114提取物中的蛋白质，加入8体积的-20℃丙酮，混匀，在-20℃放置4小时至过夜。通过在3000×g离心收集沉淀物，弃去上清液，使沉淀块风干。将该沉淀块重悬于体积两倍于该Triton X-114提取物的初体积的0.5％辛基葡糖苷，TBS中。4℃下于100,000×g超速离心1小时以除去不溶性蛋白质。取出上清液以用于亲和层析中。
S19免疫基质制备物：从汇集的含有S19的腹水中通过用50％的硫酸铵进行沉淀，从而部分纯化免疫球蛋白。用50％硫酸铵洗涤沉淀两次，将沉淀重悬于体积为腹水初体积1/10的PBS(20mM NaPO4；150mMNaCl,pH7.4)中。对PBS进行透析以除去硫酸铵。利用BCA ReagentAssay试剂盒(Pierce化学公司)确定蛋白质浓度。将经硫酸铵沉淀的蛋白质与PBS(pH7.4)中的Protein G-Sepharose玻珠(Pharmacia,Piscataway,NJ)在4℃共置过夜以使IgG结合上去。每毫升Protein G-Sepharose玻珠包含15mg经硫酸铵沉淀的蛋白质。将玻珠悬浮液倒入层析柱中，用PBS(pH8.2)洗涤，直至通过测定A280的紫外吸收在洗出液中不再能检测到蛋白质为止。用0.2M三乙醇胺(pH8.2)平衡该柱，将基质重悬于20体积的20mM二甲基庚二酰亚胺盐二氢氯化物，0.2M三乙醇胺(pH8.2)中，在室温下放置45分钟并温和搅拌，以使结合的IgG共价交联到诸Protein G玻珠上。为了终止该交联反应，离心玻珠(500×g离心3分钟)，将玻珠重悬于等体积的20mM乙醇胺中，并在室温下静置该悬浮液5分钟。将玻珠悬浮液倒入一个层析柱中。用0.2％的叠氮化钠、PBS(pH8.2)平衡，置于4℃备用。
亲和层析：用0.5％的辛基葡糖苷，TBS平衡已制好的免疫亲和柱。4℃下，在柱中以1.3ml/min的速率对含有疏水性的精子蛋白质的该辛基葡糖苷溶液进行再循环，一直持续16小时。用0.5％辛基葡糖苷，TBS洗涤该柱以除去未结合的物质，通过UV吸收检查洗涤液中的蛋白质浓度。除去未结合的蛋白质后，用0.1M甘氨酸、0.15M NaCl(pH2.4)、0.1％SDS洗脱被结合的物质。收集3ml各级分，用BCA Reagent Assay试剂盒和UV吸收检查它们的蛋白质浓度。合并含有蛋白质的诸级分，用Amicon膜滤浓缩器进行浓缩。
样品纯度分析：在15％丙烯酰胺上进行SDS-PAGE，从而对经S19免疫亲和层析柱纯化的蛋白质进行分离，并进行银染或转移到硝酸纤维素膜上。与S19单克隆抗体一起共保温，并随后进行标准的Western印迹分析，从而测定免疫印迹对SAGA-1的反应性。比较由银染和由S19反应性测得的分子量和蛋白质条带数，估计纯度。疫苗：
本申请人的发明包括应用SAGA-1，并且更具体地说应用可被单克隆抗体S19结合的任何一种蛋白质作为免疫原的一种避孕用疫苗。SAGA-1免疫接种将在宿主内产生抗体，这足以达到抑制受精的目的。疫苗本身的制备遵循传统的模式。将该已纯化的免疫原，最好是具有诸S19表位区的一种重组免疫原掺入到合适的药用载体中。
可按照传统方法，利用申请人的新型免疫原制备一种可接受的疫苗。Aitken,Freemerman和Herr等人(出处同前)所述的疫苗可很方便地用于SAGA-1蛋白，及其能被S19单克隆抗体结合的衍生物。具体地说，应用了由Primakoff(出处同前)和Primakoff等人，以及Primakoff(美国生殖免疫学杂志，31:208-210(1994))所开发的PH-20蛋白的避孕用疫苗反应了一种精子蛋白质抗原可成功改造为合适载体中的疫苗免疫原。Primakoff和其他人所应用的蛋白质不幸地不能在灵长类中达到高程度的受精抑制(超过95％)，而SAGA-1蛋白的特性，特别是它完全分布于精子细胞的整个表面上，以及它与对它响应的单克隆抗体之间相互作用的多种途径，为在口服避孕药的量级(即99％)上达到受精抑制效果提供了可能性。为了建立起适当的抗体滴度，很有可能大多数的受测者(包括妇女)都需要按照一个方案，间隔时间较长地进行多次疫苗接种，以使得他们在每一次注射后都有时间来产生适当的抗体滴度。大约每隔一个月注射一次，随后利用SAGA-1蛋白作为标准进行测定，以确定抗体滴度，在经过大约三个月的时间后，应当是合适的，即能为可靠使用提供足够的受精抑制。当然，若诊断测定反映抗体滴度较低，使得不能提供近乎完全的受精抑制，则应采用进一步的接种程序，或进行其它测定以找出造成抗体滴度较低的原因。
利用免疫原产生抗天然态抗原或重组抗原(二者均包括在所要求的本发明内)的抗体对本领域普通技术人员来说本来就是常规的。本申请人新的发展延伸到独特的SAGA-1蛋白的掺入和依靠上，该SAGA-1蛋白在本文得以首次完全鉴定。对剂量、载体、展示模式等的常规优化并不构成本发明本身的一个方面。不过，作为常规剂量，对一个个体的剂量值来说，剂量范围为0.5ml体积内100μgSAGA-1蛋白到500μgSAGA-1蛋白应是合适的。因为由该疫苗接种程序产生的抗体将比其它特异的抗精子抗体更有效地凝集精子(这是由于前者能结合到精子更多的表面区域上)，所以能得到更强的疫苗效力。
如同大多数疫苗中常见的那样，一种多价疫苗常常要比一种单价疫苗更为有效。正如前面已提到，除了SAGA-1之外，已知还有多种精子特异性抗原。虽然这些抗原各自不能达到高可信度的受精抑制，但它们可添加到一种基于SAGA-1的疫苗中，以进一步提高可信度。具体地说，SAGA-1和SP-10的组合作为多价疫苗的免疫原是理想的。既然研究表明抗这些蛋白质的抗体很容易制备，因此有可能得到具有对两种蛋白质的合并结合能力，以及对可作为一种多价疫苗的免疫原成员而添加的本领域所知的其它蛋白质的结合能力。然而，必不可少的是，SAGA-1蛋白，或S19抗体结合的任何变体蛋白质应是该疫苗的中心要素，因为抗这类蛋白质的抗体使结合机会大大增强，故而使受精抑制更加可信。诊断：
与S19单克隆抗体结合的蛋白质，包括SAGA-1蛋白，它们的性质使得有可能进行两种不同类型的诊断试验。开始时，有必要检查抗该疫苗免疫原-SAGA-1蛋白或其变体的抗体的发展情况。某些潜在候选者可能缺乏合适的免疫响应系统，许多个体在响应于任何免疫原而产生的抗体滴度或者免疫原施用的方案方面各不相同。利用SAGA-1蛋白作为抗原标准，就可以简便地证实适当抗体滴度的发展。利用上面针对S19单克隆抗体而叙述的凝集测定，就可以很方便地确定为达到100％凝集所需的浓度。SAGA-1蛋白的这一浓度被适当固定和给出后，被用来对取自患者的样品进行测定。达到100％结合表明已具有合适的抗体滴度。由于任何一种这样的接种程序都必须在临床的监督下进行，因此测定模式可以是常规的，即可利用ELISA、Western印迹分析或者其它已建立的领域内形式。
此外，人们对使用简单、舒适的商业诊断剂即可公开交易的诊断剂越来越感兴趣。对这种类型的诊断剂感兴趣的原因，以及这类诊断剂的多种用途被详细陈述于1997年2月25日授予的美国专利5,605,803中，该专利引入本文作为参考。该专利中所公开的诊断剂应用了SP-10结合性抗体，MHS-10，或者具有ATCC中保藏号为No.HB10039的杂交瘤细胞系中所表达的那些抗体的结合特征的抗体。正如引入的该专利申请中所述的那样，这种类型的公开交易诊断剂在法医工作中能够得到应用，它们可用于确定正常精子细胞系的存在，在难于怀孕的那些人中，在已切除输精管的男性中，和由男性与女性对已切除输精管的男性进行的测定中，以及对做过输精管吻合术的男性进行测定用以确定外科重连接的成功时，这种诊断剂都具有实质价值。不管从哪条原因上说，确定一种生物样品-精液或来源于精液或男性生殖道的样品中精子的存在都具有显著的医学重要性。具有S19 CDR响应性表位的由S19单克隆抗体结合的抗原，SAGA-1蛋白和相应的变体以及重组衍生物可应用于诸如引入的1997年2月25日授予的美国专利5,605,803中所述的测定模式中。
因此，可以将S19抗体结合到固相上，用于捕获SAGA-1蛋白。通过用另一种单克隆试剂或多克隆试剂，可识别SAGA-1抗原是否存在。参见如Shen等，美国生殖免疫学杂志，29:231-240(1993)。其它测定模式中可使用灯芯或量尺，以及抗体编码的彩色玻珠。在所有这些变更方法中，最基本的试剂是S19单克隆抗体，或抗SAGA-1蛋白的类似抗体。受测样品中存在的任何一种蛋白质被固定化的抗体所结合或捕获。因此，在意欲检查适当抗体滴度发展情况的诊断中，可使用SAGA-1蛋白或类似的蛋白质作为标准测定试剂。在期望证实存在该抗原由此核实存在精子的“家用测定试剂盒”中，该试剂是对其有响应的单克隆抗体。
本申请人以一般和特定术语公开了本发明。本领域技术人员很容易联想到各种交更，除说明书中明确指出外，诸实施例和特定实施方案并不是用来限制本发明。各种变更对本领域内未受创造研究训练的普通技术人员来说是可以联想得到的。具体地说，除了下文示出的权利要求所界定的之外，浓度水平、施药方案、重组操作以及种类等对本领域技术人员来说是显见的，也在本发明的范围内。

Claims (9)

1．一种单克隆抗体，它由保藏号ATCC HB 12144的杂交瘤保藏物所表达。
2．被权利要求1的单克隆抗体结合的一种精子表面糖蛋白的纯化制剂。
3．一种避孕用疫苗，它含有在药学可接受载体中的权利要求2的精子表面糖蛋白的一定量，当该糖蛋白以该量施用于一只雌性哺乳动物时能有效地诱导产生抗该糖蛋白的抗体。
4．权利要求3的疫苗，其中所述糖蛋白存在的量足以使所述雌性哺乳动物在完成接种方案后，能表现出足以提供至少95％的受精抑制的抗体滴度。
5．一种确定接受了权利要求3的疫苗的接种患者内抗体滴度的方法，它包括：混合来自所述接种患者的一个样品与被结合的糖蛋白，所述糖蛋白是权利要求2的蛋白质，检测所述被结合的糖蛋白与所述样品中存在的抗体之间的结合情况，其中该被结合的糖蛋白的量是已知的，并测定被结合的糖蛋白的结合程度，其中全部所述被结合的糖蛋白的完全结合表明所述样品中的抗体滴度足以抑制所述患者体内的受精。
6．一种杀精子剂，它含有于一种药学可接受的载体内的权利要求1的单克隆抗体作为活性剂。
7．权利要求6的杀精子剂，其中所述杀精子剂含有的单克隆抗体的浓度足以使所述杀精子剂的一个剂量可有效地结合一份精液中存在的所有精子细胞的100％。
8．权利要求7的杀精子剂，其中所述单克隆抗体存在于脂质体的表面上。
9．权利要求8的杀精子剂，其中所述脂质体是非磷脂类的带正电的脂质体。
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