CN117987376B - 人精子顶体蛋白sp-10单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents
人精子顶体蛋白sp-10单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种人精子顶体蛋白SP‑10单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用，本发明涉及生物标记物免疫检测技术领域，特别是涉及检测人精子顶体蛋白SP‑10的单克隆抗体、杂交瘤细胞株、试纸条和检测试剂盒。本发明提供的人精子顶体蛋白SP‑10单克隆抗体的杂交瘤细胞株的保藏编号分别为：CGMCC No.45816、CGMCC No.45817。本发明取得的技术效果为：两株细胞株分泌的单克隆抗体为配对抗体，利用配对单克隆抗体制备的免疫检测试剂盒以及试纸条可用于成人精子受精能力的体外诊断，对人精子顶体蛋白SP‑10具有良好的检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于生物标志物免疫检测技术领域，具体涉及人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
SP-10是一种精子特异性抗原，在受精过程中发挥着重要作用，该抗原存在于人类、狒狒、狐狸、猕猴、牛、兔和猪的精子中。利用凝胶电泳和蛋白质免疫印迹分析等得到的研究表明，SP-10呈现多态性肽的特征，范围从18到34kDa。目前SP-10已有11种亚型，其中典型的人精子顶体蛋白SP-10基因为ACRV1型，氨基酸长度为265，其分子质量为28156Da。利用单克隆抗体(MHS-10、FSA-10)等对成熟完整的精子免疫荧光显微镜观察显示，SP-10在精子顶体内膜呈不均匀分布，精子预处理后可观察到固定精子样本中95％以上显示荧光而其他体细胞不显示荧光，说明SP-10是精子发育过程中高度保守的特异性分化标志物。另外，对男性人精子顶体蛋白活性与精液常规参数的相关性进行分析表明，人精子顶体蛋白活性与精液浓度、精子活力及精子正常形态相关。因此，通过检测顶体蛋白酶活性即可快速、客观地评估精子的受精功能。这些以SP-10为靶点的免疫学定性定量检测手段，为评估人精子受精能力和诊断不育症提供了有力支撑。
人精子顶体蛋白SP-10作为检测精子活力的特异性标志物，现有检测方法以胶体金免疫层析方法为主，包括FertilMARQ Fertility Sperm Test Kit、SpermcheckFertility Home Test Kit以及Babystart FertilCount Male Fertility Test)等。
胶体金免疫层析是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、步骤少、检测成本低而且操作简便，适用于个体现场快速检测，因此在疾病检测领域得到了广泛应用。而开发试纸条产品的前提是需要得到对人精子顶体蛋白SP-10具有高特异性和高灵敏度的配对单克隆抗体。但目前已经取得SP-10的单克隆抗体在特异性和灵敏度上仍然难以满足要求，难以快速、准确、稳定地诊断出男性精子的活力。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株分泌的抗精子蛋白SP-10的单克隆抗体具有特异性强、效价高、稳定性好等优点。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种分泌人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株已于2024年2月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为：单克隆细胞株mAb208SZ，保藏编号：CGMCCNo.45816，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明第二方面提供了一种人精子顶体蛋白SP-10的单克隆抗体，由前述的保藏编号为CGMCC No.45816的杂交瘤细胞株产生。
本发明第三方面提供了一种分泌人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株已于2024年2月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为：单克隆细胞株mAb81SZ，保藏编号为CGMCC No.45817，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明第四方面提供了一种人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体，由前述的保藏编号为CGMCC No.45817的杂交瘤细胞株产生。
本发明第五方面提供了一种试纸条，含有前述的保藏编号为保藏编号为CGM CCNo.45816或者CGMCC No.45817的杂交瘤细胞株产生的人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体。
本发明第六方面提供了一种检测试剂盒，含有前述的保藏编号为CGMCC No.45816或者保藏编号为CGMCC No.45817的杂交瘤细胞株，或者，含有前述的保藏编号为CGMCCNo.45816或者保藏编号为CGMCC No.45817的杂交瘤细胞株产生的人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体。
本发明第七方面提供了一种检测人精子顶体蛋白SP-10的双抗体夹心ELISA方法，该方法以保藏编号为CGMCC No.45816的杂交瘤细胞株所产生的人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体作为检测抗体、以保藏编号为CGMCC No.45817的杂交瘤细胞株产生的人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体作为捕获抗体，或者，保藏编号为CGMCC No.45817的杂交瘤细胞株所产生的人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体作为检测抗体、以保藏编号为CGMCC No.45816的杂交瘤细胞株产生的人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体作为捕获抗体。
本发明取得的有益效果是：本发明利用重组表达的精子顶体蛋白SP-10(奥科博泰B0609-04-01)为免疫抗原，以PEG为融合剂将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，利用HTS-ELISA方法筛选融合杂交瘤细胞，再经过多次亚克隆，最终得到两株单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体对人精子顶体蛋白SP-10具有良好的检测灵敏度，最低定量检测限达0.001ng/mL，可用于制备人精子顶体蛋白SP-10的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，用于人精子质量的临床诊断。
附图说明
图1是HTS-ELISA筛选单克隆抗体模式图；
图2是纯化的抗人精子顶体蛋白SP-10的单克隆抗体mAb208SZ与mAb81的效价图；
图3是mAb208SZ与mAb81对人精子顶体蛋白SP-10不同表位的识别图。
图4是检测人精子顶体蛋白SP-10的双抗体夹心法ELISA抑制标准曲线。
保藏菌株1：
保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.45816，分类命名为“小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14)与小鼠脾脏细胞的杂交”，保藏日期为2024年2月22日。
保藏菌株2：
保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.45817，分类命名为“小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14)与小鼠脾脏细胞的杂交”，保藏日期为2024年2月22日。
具体实施方式
本发明公开了人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中涉及的实验所需试剂耗材以及仪器设备如下表所示：
第一、免疫动物与细胞融合。
SP2/0细胞购于广州赛库生物技术有限公司，BALB/c小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK(京)2016-0009，SPF级，雄性)。
(1)动物免疫
选用8只6周龄BALB/c小鼠进行免疫，免疫抗原为重组人精子顶体蛋白SP-10(奥科博泰B0609-04-01)，每次免疫剂量为30μg/只，皮下及腹腔注射，每两周免疫一次。初次免疫采用弗氏完全佐剂乳化完全抗原，2-3次免疫采用弗氏不完全佐剂乳化完全抗原。第3次免疫10天后断尾采血，用间接ELISA法检测血清效价。
用包被液(碳酸盐缓冲液)将人精子顶体蛋白SP-10稀释到0.2ug/ml浓度后，按每孔100μl/孔包被酶标板，常温过夜后用洗涤液(含0.05％吐温20的PBS)洗板3次。加封闭液(1％牛血清蛋白液)100μl/孔，37℃温育1h，洗涤3次。待检血清样品倍比稀释后，100μl/孔，37℃温育1h，洗涤3次。酶标二抗以1：5000倍PBS稀释后加入100μl/孔，37℃温育1h，洗涤3次。加入TMB底物溶液100μl/孔，避光静置10min，加终止液(2M的H2SO4)50μl/孔,采用酶标仪测定450nm处OD值。当OD值大于或等于阴性对照OD值2倍时的最高血清稀释倍数为血清效价。经实际检测发现，第3次免疫后小鼠血清平均效价可超过1：105以上。
(2)细胞融合、筛选与克隆
SP2/O骨髓瘤细胞的准备：融合前48h将培养好处于对数生长期的骨髓瘤细胞扩大培养，融合前用弯头吸管将细胞从细胞培养瓶壁上吹下，收集于50ml离心管中，1200rpm离心4分钟，弃上清。再加入20ml的1640培养液，重悬混匀，1200rpm离心4分钟，弃上清，加10ml的1640培养液，重悬混匀。取细胞悬液0.1ml，再加入0.9ml的1％台盼兰，混匀，滴于计数板上显微镜下计数，备用。
脾细胞的准备：选择抗血清效价1：105以上的免疫BALB/c小鼠于融合前3天腹腔加强免疫1次，免疫原为人精子顶体蛋白SP-10，20ug/只，不加佐剂。融合前摘小鼠眼球放血，颈部脱臼处死，75％酒精浸泡消毒，然后将小鼠固定于生物安全柜的鼠板上。无菌打开腹腔，取出脾脏，于含10ml的1640培养液的平皿中洗涤两次，去掉周围的脂肪组织与结缔组织，置于含10ml的1640培养液的平皿中。取200目网筛放于平皿中，加1640培养液至浸没网筛，将脾脏置于网筛上培养液中，用L型棒轻轻挤压脾脏，使脾细胞完全进入培养液中。将脾细胞液吸入50ml离心管中，1400rpm离心4分钟，弃上清液，再加10ml的1640培养液，重悬混匀。同上细胞计数，备用。
细胞融合：取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞按1:1细胞数融合后，利用添加1％HAT和10％FBS的2500mL的1640培养基稀释融合细胞后240uL/孔均分到100块96孔平底细胞培养板中，在5％CO2和37℃的培养箱中封闭培养10-12天。
阳性克隆的筛选和克隆：10-12天后利用Transtar-96移液器在无菌净化操作台内分别取上清液70μL/孔，分别转移到预先准备好的与细胞培养板相对应并包被有人精子顶体蛋白SP-10的各100块ELISA板中，利用HTS-ELISA高通量检测方法筛选阳性杂交瘤细胞孔，选择阳性孔的依据是利用拖孔(Trailing)数，拖孔数指某一块板中某孔为阳性孔时其下排列的各96孔板中相对应的孔中也出现阳性孔的板数，拖孔数的多少可以作为确定筛选阳性孔的指标之一，其工作原理如图1所示，是利用了上清液的梯度稀释作用，即对每一个细胞培养板中上清液使用96孔移液器(Transtar-96)顺序转移至检测板过程中不换枪头，因此每次在转移下一个细胞培养板中上清液时会有少量的前一个细胞板中相对应孔的上清残留液，如果前一孔中的融合细胞是分泌高亲和力抗体的细胞株，由于移液器的残留液的混合作用使得下一个孔中也会出现阳性孔，往下对应的阳性孔数越多说明最初的阳性孔中融合细胞分泌的抗体亲和力越高。如图1所示的第3个板的H8孔的OD值为2.5，往下的第4、5、6、7板对应的H8均为阳性，也就是说有4个拖孔，通常枪头中残留的液体数量极为有限。即便如此，通过梯度稀释往下出现4次拖孔，可知第3版H8孔中的杂交瘤细胞分泌抗体的活性非常高。
实际试验中，选择阳性拖孔数最多的细胞孔为第一次筛选对象，利用显微操作技术分别吸取阳性孔的融合细胞集落转入新的96孔培养板中培养，培养基变色后进行Confirm-ELISA，收集确认的阳性细胞株进行培养，取细胞上清液进行抗体检测，检测结果为阳性的克隆中进行定株并继续扩大培养后分别用于冻存和制备抗体。
(3)单克隆抗体的制备
将确认的阳性细胞株扩大培养后转入1升转瓶中培养14天，收集培养液离心后1：1与PBS缓冲液混合过蛋白A/G柱，用pH3.7的洗脱液进行洗脱，通过Amicon搅拌式超滤装置、利用3万分子量的超滤膜进行浓缩，浓缩液利用GE公司的超微量紫外分光光度计定量后，命名为mAb208SZ和mAb81SZ，分析其效价结果如图2所示，以阴性小鼠血清为对照，按最高OD值一半所对应的血清的稀释倍数为效价计算，制备的2个单克隆抗体效价为1:1x107和1:2x106，制备的2个单克隆抗体均具有良好的效价。
(4)单克隆抗体表位的鉴定
将mAb208SZ进行HRP酶标记，测定其最佳工作浓度为1：1K。将SP-10蛋白包被，用mAb208SZ-HRP与mAb81SZ进行竞争ELISA反应，如图2，mAb81SZ对mAb208SZ没有竞争反应，即mAb208SZ与mAb81SZ分别抗在SP-10上的不同表位，经反复验证后最终确定mAb208SZ和mAb81SZ为检测SP-10的配对抗体。
(5)SP-10检测标准曲线及其检测限的确定
将SP-10标准品从1μg/mL开始进行梯度稀释后利用检测抗体mAb208SZ-HRP与捕获抗体mAb81SZ进行SP-10检测标准曲线的绘制，其结果如图4所示，最低检测限可达0.001ng/mL，具有很高的灵敏度。在95％置信区间进行线性拟合，定量检测范围在0.01ng/mL至10ng/mL之间具有最佳的区间线性关系，其线性计算公式为y＝0.44lg(x)+1.138(R2＝0.9845)。
为了验证建立的夹心ELISA检测体系的精确性，选择SP-10标准品三个不同浓度添加到精液中进行测定，并计算平均值、偏差、回收率等指标，其结果如表1所示，不同浓度添加回收率在99.1-106.7％之间，可用于精液中SP-10的检测。
综上可知，本发明利用SP-10作为免疫全抗原使用弗氏佐剂乳化后，注射BALB/c小鼠。经三次免疫和一次加强免疫，选血清效价高的小鼠脾细胞，通过PEG诱导融合方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，利用HTS-ELISA方法筛选出特异性识别人精子顶体蛋白SP-10的抗体分泌融合杂交瘤细胞；再经过四次亚克隆，最终得到单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体对人精子顶体蛋白SP-10具有较好的检测灵敏度，最低检测限为0.001ng/mL，适用于人精子顶体蛋白SP-10的免疫分析，进而可用于制备精子活力检测的早期诊断试剂盒。
此外，本发明还提供分别分泌前述两种人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体两株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，而利用本发明中上述方法产生的人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体或者人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体杂交瘤细胞株，制成包含该人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体杂交瘤细胞株或者其所分泌的人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体的试纸条或者检测试剂盒，或者使用该试纸条的检测试剂盒，用于对人精子顶体蛋白SP-10进行检测，都属于现有技术，且其过程、原理及结果可参考前述内容，因此在此不再赘述。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种分泌人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株已于2024年2月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为：单克隆细胞株mAb208SZ，保藏编号为CGMCC No.45816，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.45816的杂交瘤细胞株产生。
3.一种分泌人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株已于2024年2月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为：单克隆细胞株mAb81SZ，保藏编号为CGMCC No.45817，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
4.一种人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体，其特征在于，由权利要求3所述的保藏编号为CGMCC No.45817的杂交瘤细胞株产生。
5.一种试纸条，其特征在于，含有权利要求2或权利要求4所述的人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体。
6.一种检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或权利要求3所述的杂交瘤细胞株，或者，含有权利要求2或权利要求4所述的人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体。
7.一种检测人精子顶体蛋白SP-10的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于，该方法以权利要求2所述的人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体作为检测抗体、以权利要求4所述的人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体作为捕获抗体，或者，以权利要求4中所述的人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体作为检测抗体、以权利要求2所述的人精子顶体蛋白SP-10单克隆抗体作为捕获抗体。
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