PL183705B1 - Sposób wytwarzania immunomodulatora z surowca roślinnego - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania immunomodulatora z surowca roślinnego, polegający na wielokrotnej, wieloetapowej ekstrakcji surowca rozpuszczalnikami, a następnie usuwaniu białek z ekstraktu, wytrąceniu surowych frakcji polisacharydowych, ich oczyszczeniu i chromatograficznym rozdzieleniu, znamienny tym, że jako surowiec stosuje się roślinę o nazwie Menyanthes trifoliata, który korzystnie ekstrahuje się kolejno metanolem, wodą rozcieńczonym roztworem alkalicznym i roztworem kwasu octowego, natomiast surowe frakcje polisacharydowe wytrąca się korzystnie acetonem.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania immunomodulatora z surowca roślinnego, znajdujący zastosowanie w produkcji preparatów działających na układ odpornościowy człowieka.

Z artykułu A.Sendl, N.Mulinacci, F.F.Vincieri, H.Wagner pt. „Antilnflammatory and Immunologically Active polysaccharides of Sedum telephium“, opublikowanego w czasopiśmie „Phytochemistry, 34(5), s.1357-1362,1993, znany jest sposób wytwarzania immunologicznie aktywnych polisacharydów z surowca roślinnego w postaci Sedum telephium. Zamrożone, liofilizowane i sproszkowane liście Sedum telephium ekstrahuje się eterem naftowym i metanolem, a oczyszczone ziele poddaje się ekstrakcji wodnej. Wodny ekstrakt przesącza się, oddziela przesącz i przy użyciu etanolu wytrąca się dwie surowe frakcje polisacharydowe. Jedną z nich oczyszcza się, otrzymując w efekcie żądany produkt końcowy, natomiast pozostałe po ekstrakcji wodnej ziele ekstrahuje się 0,5 M roztworem wodorotlenku sodowego, maceruje, odsącza i do roztworu wkrapla etanol. Wytrącony osad odwirowuje się, rozpuszcza w wodzie i usuwa z niego białka. Po oddzieleniu białek wytrąca się przy użyciu 0,5 objętości etanolu surową frakcję polisacharydową która po oczyszczeniu daje drugi produkt końcowy. Wytworzone znanym sposobem preparaty wykazują aktywność immunologiczną i mają właściwości przeciwzapalne. Pierwszy z preparatów przy stężeniu 1-10'² mg/cm³ powoduje podwyższenie stopnia fagocytozy o około 80%, w dawce 10 mg/kg powoduje znaczne zwiększenie szybkości eliminacji cząstek węgla z osocza krwi, a przy stężeniu 10 i 3 mg/kg wykazuje bardzo silne działanie przeciwzapalne. Oba preparaty stymulują aktywność makrofagów, powodując wzrost wydzielania czynnika nekrotycznego guzów (TNF-alfa) o 4000 jednostek.

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania immunomodulatora z surowca roślinnego, polegającego na wielokrotnej, wieloetapowej ekstrakcji surowca rozpuszczalnikami, a następnie usunięciu białek z ekstraktu, wytrąceniu surowych frakcji polisacharydowych, ich oczyszczeniu i chromatograficznym rozdzieleniu. Istota wynalazku polega na tym, że jako surowiec stosuje się roślinę o nazwie Menyanthes trifoliata, który korzystnie ekstrahuje się kolejno metanolem, wodę, rozcieńczonym roztworem alkalicznym i roztworem kwasu octowego, natomiast surowe frakcje polisacharydowe wytrąca się korzystnie acetonem.

Nowy surowiec użyty do wytwarzania immunomodulatorajest znacznie bogatszy w związki polisacharydowe niż surowiec znany. Surowe frakcje polisacharydowe w sposobie według wynalazku stanowią 1,5% suchej masy, natomiast w sposobie znanym nie wydziela się frakcji polisacharydowej za pomocą ekstrakcji kwasem octowym. Surowiec w postaci Menyanthes trifoliata nie wymaga liofilizacji, jest stosowany w postaci wysuszonego na powietrzu ziela i spełnia warunki farmakopealne. Ekstrakcja surowca metanolem jest mniej skomplikowana niż ekstrakcja dwoma rozpuszczalnikami, eterem naftowym i metanolem. Wytrącanie polisacharydów z roztworów wodnych przy użyciu acetonu jest tańsze niż używanie do tego celu etanolu.

183 705

Wynalazek jest objaśniony w przykładzie realizacji sposobu wytwarzania immunomodulatora z rośliny Menyanthes trifoliata.

Przykład. 1000 g suchego ziela Menyanthes trifoliata zalewa się 2,5 dm³ metanolu i pozostawia w temperaturze pokojowej na około 24 godziny. Następnie roztwór metanolowy dekantuje się, a ziele zalewa ponownie metanolem w ten sam sposób jak uprzednio, powtarzając tę czynność dwukrotnie. Połączone wyciągi metanolowe odparowuje się, a odmyte metanolem ziele zalewa 15 dm3 destylowanej wody o temperaturze 70°C i pozostawia na sześć godzin w temperaturze pokojowej, dokładnie mieszając co pewien czas. Operację powyższą powtarza się trzykrotnie. Połączone wyciągi wodne w ilości 4,5 dm3 zagęszcza się pod zmniejszonym ciśnieniem do objętości około 0,7 dm3, uzyskując ekstrakt wodny, a pozostałe po ekstrakcji wodnej ziele zadaje się 1.5 dm3 0,1 M roztworu wodorotlenku sodowego, przetrzymując całość przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, sporadycznie mieszając. Operację powtarza się czterokrotnie, uzyskując około 6 dm3 słabo alkalicznego wyciągu. Wyciąg zagęszcza się pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze nie przekraczającej 4°C, do objętości około 2 dm3. Ziele pozostałe po ekstrakcji rozcieńczonym wodorotlenkiem sodowym zadaje się czterokrotnie 1 dm3 wodnego roztworu kwasu octowego, o stężeniu 8%. Połączone wyciągi zagęszcza się do objętości około 0,5 dm3, uzyskując ekstrakt, który uzupełnia się 0,1 dm3 wody i 0,1 dm3 roztworu kwasu trichlorooctowego o stężeniu 3 0% i odwirowaj e w celu usunięcia wytrąconych białek, a do roztworu dodaj e 1,5 dm3 acetonu, odsącza osad, ponownie rozpuszcza w wodzie i wytrąca acetonem. Uzyskuje się 10 g surowej frakcji, którą poddaje się dializie, używając worka dializacyjnego oddzielającego substancje o masie cząsteczkowej 3500. Pozostały wewnątrz worka dializacyjnego roztwór odparowuje się, uzyskując 0,45 g błyszczącego ciemnobrunatnego preparatu, który rozdziela się na kolumnie chromatograficznej z wypełnieniem Biogel P-10. Otrzymuje się 0,42 g jednorodnego preparatu, wykazującego właściwości immunomodulujące. Produkt, zwany umownie frakcją C-4, badany metodą chromatografii kolumnowej na żelu Sephadex G-50 wykazuje pik odpowiadający m.cz.: 118 · 10⁴D. Po hydrolizie produktu za pomocą kwasu solnego i zobojętnieniu wykonano analizę chromatograficzną cienkowarstwową i bibułową. Wskazuje ona, że w skład badanej frakcji C-4 wchodzą następujące cukry: glukoza, galaktoza, arabinoza, sorboza, mannoza i kwas uronowy. Wyniki analizy elementarnej są zgodne z przewidywanymi dla frakcji polisacharydowych zawierających grupy aminowe i siarczanowe. Widmo IR wskazuje na charakter cukrowy preparatu oraz na obecność ugrupowań COO', CONH i S=O. Za pomocą analizy spektrofotometrycznej określono ilościowo zawartość cukrów obojętnych (~ 30%), aminocukrów (~ 1%) i kwasów uranowych (~ 4%).

Badania aktywności biologicznej wytworzonego preparatu przeprowadzono oceniając ich wpływ na proliferację ludzkich limfocytów w hodowlach in vitro oraz na ekspresję wybranych antygenów na powierzchni limfocytów ludzkich. Preparat w dawce 150 ąg/cm⁷’ hodowli in vitro powoduje obniżenie potencjału proliferacji ludzkich limfocytów o blisko 30%, nie wpływa znamiennie statystycznie na odsetek limfocytów CD4 i CDB, natomiast wzmaga ekspresję receptorów dla IL-2 oraz ekspresję antygenów HLA-DR. Te dwa ostatnie efekty mogą pośrednio wpływać na prezentacje obcych antygenów limfocytu T oraz (w dłuższym odstępie czasowym niż w 72 godzinnej hodowli in vitro) może nasilać proliferację limfocytów T zale-żnąod IL-2. Preparat taki może znaleźć zastosowanie jako dodatkowy preparat wzmagający immunologiczną odpowiedź limfocytów T, na przykład w chorobach wirusowy w pewnym stopniu także w chorobach nowotworowych.

183 705

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób wytwarzania immunomodulatora z surowca roślinnego, polegający na wielokrotnej, wieloetapowej ekstrakcji surowca rozpuszczalnikami, a następnie usuwaniu białek z ekstraktu, wytrąceniu surowych frakcji polisacharydowych, ich oczyszczeniu i chromatograficznym rozdzieleniu, znamienny tym, że jako surowiec stosuje się roślinę o nazwie Menyanthes trifoliata, który korzystnie ekstrahuje się kolejno metanolem, wodą rozcieńczonym roztworem alkalicznym i roztworem kwasu octowego, natomiast surowe frakcje polisacharydowe wytrąca się korzystnie acetonem.