PL175446B1

PL175446B1 - Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania lub leczenia stanów chorobowych związanych z wolnymi rodnikami

Info

Publication number: PL175446B1
Application number: PL93309334A
Authority: PL
Inventors: Bernard Malfroy-Camine; Michel Baudry
Original assignee: Eukarion Inc
Priority date: 1992-12-07
Filing date: 1993-12-06
Publication date: 1998-12-31
Also published as: JPH08504211A; LV10924B; SK74595A3; GB2277873B; GB9415050D0; DE69333775T2; NZ259200A; NO319454B1; EP0746321A1; AU5741994A; NO952237D0; JP3502099B2; LV10924A; HUT72967A; OA10165A; US5827880A; GB2305107B; UA27949C2; US5403834A; HU225109B1

Abstract

1 95% wagowych przeciwutleniajacego kompleksu salenu i metalu o wzorze F IG . 1 w którym M jest wybrany z grupy obejmujacej Mn, Co, Fe, V, Cr i Ni, A oznacza anion, wartosc n wynosi 0 , 1 lub 2, X 1, X2, X 3 i X4 sa niezaleznie wybrane z grupy obejmujacej atom wodoru, grupy arylowe, grupy arylo-C1-12-alkilowe, pierwszo-, drugo- lub trzeciorzedowe grupy C 1-12-alkilow e, grupy C1-6-alkoksyl owe, grupy aryloksylowe, grupy aminowe, czwartorzedowe grupy aminowe, Y 1, Y2, Y3, Y4, Y5 i Y 6 sa niezaleznie wybrane z grupy obejmujacej atom wodoru, atom chlorowca, grupy C 1-12 alkilowe, grupy arylowe, grupy arylo-C1-12-alkilowe i grupy aminowe, a R 1, R2, R3 i R4 sa niezaleznie wybrane z grupy obejmujacej atom wodoru, grupy arylowe grupy estrów kwasów tluszczowych o 10-20 atomach wegla, podstawione grupy C 1-6alkoksyarylowe, pierwszo-, drugo lub trzeciorzedowe grupy C1-C12-alkilowe 6 Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania lub leczenia stanów chorobowych zwiazanych z wolnymi rodnikami, zwlaszcza epizodu niedokrwienno- reoksygenacyjnego i jatrogenicznej toksycznosci wolnorodnikowej, zawierajaca substancje czynna i znane srodki pomocnicze, znamienna tym, ze zawiera 0,001 95% wagowych co najmniej jednego rodzaju przeciwutleniajacego kompleksu salenu i metalu o wzorze F IG . 2 w którym M jest jonem metalu przejsciowego wybranym z grupy zawierajacej Mn, Co, Fe, V, Cr i Ni, A oznacza anion, wartosc n wynosi 4, 5 lub 6, X 1, X2, X3 i X4 sa niezaleznie wybrane z grupy obejmujacej grupy arylowe, grupy arylo-C -6 alkilowe, grupy aryloksylowe, pierwszo-, drugo- lub trzeciorzedowe grupy C 1-12 alkilowe, ewentualnie podstawione grupy C1-6-alkoksylowe, grupy aminowe, czwartorzedowe grupy aminowe i atom wodoru, Y1, Y2, Y 3 , Y 4, Y 5 i Y6 sa niezaleznie wybrane z grupy obejmujacej grupy arylowe, grupy arylo-C1-6-alkilowe, pierwszo-, drugo- lub trzeciorzedowe grupy alkilowe, ewentualnie podstawione grupy C1-6alkoksylowe, grupy aryloksylowe, atomy chlorowców, grupy aminowe, czwartorzedowe grupy aminowe i atom wodoru, a R 1 i R4 sa niezaleznie wybrane z grupy obejmujacej atom wodoru, atomy chlorowców, pierwszo-, drugo- lub trzeciorzedowe grupy C 1-16-alkilowe, grupy estrów kwasów tluszczowych o 10-20 atomach wegla, grupy C1-6-alkoksylowe i grupy arylowe 8 Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania lub leczenia stanów chorobowych zwiazanych z wolnymi rodnikami, zwlaszcza epizodu niedokrwienno- reoksygenacyjnego l jatrogenicznej toksycznosci wolnorodnikowej, zawierajaca substancje czynna i znane srodki pomocnicze, znamienna tym, ze jako substancje czynna zawiera 0,001-95% wagowych przeciwutleniajacego kompleksu salenu i metalu w postaci akceptowanej farmaceutycznie o wzorze PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania lub leczenia stanów chorobowych związanych z wolnymi rodnikami, zwłaszcza epizodu ^edokrwieyyo-reoksygeyacyjyego i jatrogenicznej toksyczności wolnorodnikowej, a w szczególnym wykonaniu kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania uszkodzeniom u chorego związanym z promieniowaniem wzzlyorodyikowym i uszkodzeniom chemicznym.

Kompozycje farmaceutyczne, stanowią syntetyczne Zrobyocząsteczkowe przeciwutleyiacre katalityczne i zmiatacze wolnych rodników do leczenia i zapobiegania chorób, i

175 446 stanów patologicznych, do celowanej ochrony tkanek i/lub typów komórek w czasie chemioterapii nowotworów oraz do zapobiegania uszkodzeniom toksycznym u osób narażonych na działanie drażniących środków utleniających lub innych źródeł szkodliwego działania utleniającego, szczególnie tlenopochodnych substancji utleniających, takich jak rodniki ponadtlenkowe. Kompozycje według wynalazku można również stosować do zapobiegania uszkodzeniom wywołanym przez działanie utleniające w przeszczepianych narządach ludzkich i do zapobiegania uszkodzeniom wywoływanym nagłym przywróceniem prawidłowego utlenienia po reperfuzji niedokrwionych tkanek. Środki i sposoby według wynalazku są również korzystne w chemoprewencji karcynogenezy chemicznej i zmian metabolizmu leków, z powstawaniem substancji pośrednich, takich jak epoksydy lub wolne rodniki tlenowe.

Stan techniki

Tlen cząsteczkowy jest podstawowym składnikiem odżywczym dla organizmów bezwzględnie tlenowych, w tym oczywiście dla człowieka. Tlen jest wykorzystywany w wielu ważnych przemianach metabolicznych, a mianowicie jako końcowy akceptor elektronów w fosforylacji oksydacyjnej, w wielu reakcjach dioksygenazowych, w tym w syntezie prostaglandyn i witaminy A z karotenoidów, w licznych reakcjach hydroksylazowych, w tym w syntezie i przemianach hormonów steroidowych, oraz zarówno w aktywacji, jak i inaktywacji ksenobiotyków, w tym substancji o działaniu rakotwórczym.

Powszechnie występujący układ P-450 wykorzystuje tlen cząsteczkowy w licznych ważnych reakcjach komórkowych. Podobnie natura wykorzystuje wolne rodniki w bardzo wielu reakcjach enzymatycznych. Nadmierne stężenie różnych form tlenu oraz wolnych rodników może wywierać poważne działania niepożądane na układy żywe, powodując np. peroksydację lipidów błon komórkowych, hydroksylację zasad kwasów nukleinowych i oksydację grup sulfhydrylowych oraz innych wrażliwych części białek. Przy braku odpowiedniego zabezpieczenia mogą wystąpić mutacje i śmierć komórki.

Do przeciwutleniaczy biologicznych należą ściśle określone enzymy, takie jak dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza, selenowa peroksydaza glutationowa oraz peroksydaza glutationowa hydroksynadtlenku fosfolipidowego. Do nieenzymatycznych przeciwutleniaczy biologicznych należą tokoferole i tokotrienole, karotenoidy, chinony, bilirubina, kwas askorbinowy, kwas moczowy i białka wiążące metale. Substancje przeciwutleniające, rozpuszczalne zarówno w tłuszczach, jak i w wodzie, występują we wszystkich komórkach i tkankach, jakkolwiek poszczególne przeciwutleniacze często wykazują charakteiystyczną dystrybucję. Również tak zwane owotiole, pochodne merkaptohistydyny, powodują nieenzymatyczny rozkład nadtlenków.

Uważa się, że wolne rodniki, szczególnie rodniki będące pochodnymi tlenu cząsteczkowego, odgrywają podstawową rolę w licznych zjawiskach biologicznych. Istotnie, twierdzi się, że rodniki tlenowe mogą odgrywać ważną rolę w patofizjologii ciężkich, zagrażających życiu stanów (Zimmermen JJ (1991) Chest 100:189S). Uszkodzenie wolnymi rodnikami tlenowymi ma znaczenie w patogenezie płucnego zespołu toksyczności tlenowej, zespole ostrej niewydolności oddechowej typu dorosłych (ARDS), dysplazji oskrzelowo-płucnej, zespole posocznicy oraz w licznych zespołach niedokrwienia - reperfuzji, jak np. zawał mięśnia sercowego, udar mózgu, operacje w krążeniu pozaustrojowym, przeszczep narządu, martwiejące zapalenie jelit, ostra martwica cewek nerkowych i inne choroby. Rodniki tlenowe reagują z białkami, kwasami nukleinowymi, lipidami i innymi makrocząsteczkami biologicznymi, powodując uszkadzanie tkanek i komórek, szczególnie u pacjentów w skrajnie ciężkim stanie.

Wolne rodniki są to atomy, jony lub cząsteczki, zawierające elektron niesparowany (Pryor, WA (1976), Free Radicals in Biol. 1:1). Wolne rodniki są zazwyczaj niestabilne i wykazują krótki czas półtrwania. Tlen pierwiastkowy jest silnie elektroujemny i łatwo przyłącza pojedyncze elektrony z cytochromów i innych zredukowanych składników komórek; część O2 zużywanego przez komórki uczestniczące w oddychaniu tlenowym jest

175 446 jednowartościowo redukowana do rodnika ponadtlenkowego (Ό2) (Cadenas E (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:79). W wyniku sekwencyjnej jednowartościowej redukcji · O2' powstaje nadtlenek wodoru (H2O2), rodnik hydroksylowy (- OH) i woda.

Wolne rodniki mogą pochodzić z wielu źródeł, w tym z oddychania tlenowego, reakcji monooksygenacji leków i ksenobiotyków, katalizowanych przez cytochrom P-450 (np. rodniki trójchlorometylowe, CCI3·, powstające w wyniku oksydacji czterochlorku węgla) i promieniowania jonizującego. Na przykład, po ekspozycji tkanek na promieniowanie gamma, większość energii nagromadzonej w komórkach jest pochłaniana przez wodę, co powoduje rozerwanie wiązań kowalencyjnych między tlenem i wodorem w wodzie, z pozostawieniem pojedynczego elektronu na wodorze i pojedynczego elektronu na tlenie, w wyniku czego tworzą się dwa rodniki, H· i -OH. Rodnik hydroksylowy, -OH, jest najbardziej reaktywnym znanym rodnikiem. Reaguje on z biocząsteczkami, wyzwalając reakcje łańcuchowe i może wzajemnie oddziaływać z zasadami purynowymi i pirymidynowymi kwasów nukleinowych. Karcynogeneza wywołana przez promieniowanie może być zapoczątkowywana przez uszkodzenie przez wolne rodniki (Breimer LH (1988) Brit. J. Cancer 57:6). I tak na przykład, w wyniku wybuchu oksydacyjnego uczynnionych neutrofili (granulocytów obojętnochłonnych) powstają duże ilości rodnika ponadtlenkowego, o którym sądzi się, że jest podstawowym czynnikiem w toksycznym działaniu uczynnionych neutrofili. W wyniku reperfuzji niedokrwionych tkanek także powstają rodniki tlenowe w dużym stężeniu, zwykle ponadtlenki (Gutteridge JMC i Halliwell B (1990) Arch. Biochem. Biophys. 283:223). Ponadto ponadtlenki mogą być wytwarzane fizjologicznie przez komórki śródbłonka, dla reakcji z tlenkiem azotu, regulatorem fizjologicznym, tworząc nadazotyn, ONOO', który ulega rozpadowi z powstaniem rodnika hydroksylowego · OH (Marletta MA (1989), Trends Biochem. Sci. 14:488; Moncada i wsp. (1989) Biochem. Pharmacol. 38:1709; Saran i wsp. (1990) Free Rad. Res. Comm. 10:221; Beckman i wsp. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:1620). Dodatkowym źródłem rodników tlenowych jest ucieczka elektronów z uszkodzonych łańcuchów transportu elektronów w mitochondriach lub siateczce endoplazmatycznej, synteza prostaglandyn, oksydacja katecholamin i aktywacja krwinek płytkowych.

Wiele reakcji z udziałem wolnych rodników silnie uszkadza składniki komórek; powodują one powstanie wiązań poprzecznych białek, mutacje DNA i peroksydację lipidów. Po powstaniu wolnych rodników mogą one reagować między sobą, tworząc następne wolne rodniki i nierodnikowe substancje utleniające, jak np. tlen pobudzony CO2) i nadtlenki. W wyniku rozkładu niektórych produktów reakcji z udziałem wolnych rodników mogą również powstawać potencjalnie szkodliwe substancje chemiczne. Na przykład, malonodwualdehyd jest produktem reakcji peroksydowanych lipidów, które wchodzą w reakcje z wszelkimi cząsteczkami zawierającymi aminy. Wolne rodniki tlenowe powodują również oksydacyjne zmiany białek (Stadtman ER (1992) Science 257:1220).

Komórki tlenowe są zwykle wyposażone w mechanizmy obronne przeciwko szkodliwemu wpływowi rodników tlenowych i produktów ich reakcji. Dysmutazy ponadtlenkowe (SOD) katalizują reakcję:

· O2' + 2 H⁺—> O₂ + H2O2 w wyniku której ponadtlenek jest usuwany i tworzy się nadtlenek wodoru. H2O2 nie jest rodnikiem, ale ma toksyczne działanie na komórki; jest on usuwany dzięki enzymatycznej aktywności katalazy i peroksydazy glutationowej (GSH-Px).

Katalaza katalizuje reakcję:

H2O2—>2 H2O + O2 a GSH-Px usuwa nadtlenek wodoru, wykorzystując go do utlenienia zredukowanego glutationu (GSH), w wyniku czego powstaje utleniony glutation (GSSG) w następującej reakcji:

GSH + H2O2—^GSSG + 2 H2O

Inne enzymy, jak np. peroksydaza glutationowa hydroksynadtłenku fosfolipidowego (PLOOH-GSH-Px), katalizują przemianę reaktywnych hydroksynadtlenków fosfolipidów,

175 446 hydroksynadtlenków wolnych kwasów tłuszczowych i hydroksynadtlenków cholesterolu do odpowiednich nieszkodliwych alkoholi kwasów tłuszczowych. Glutationo-S-transferazy uczestniczą również w detoksykacji nadtlenków organicznych. Przy braku tych enzymów i w obecności metali przejściowych, takich jak żelazo lub miedź, ponadtlenek i nadtlenek wodoru mogą wchodzić w następujące reakcje, w wyniku których powstaje bardzo aktywny rodnik hydroksylowy -OH':

Niezależnie od enzymatycznej detoksykacji wolnych rodników i substancji utleniających, istnieją liczne naturalne przeciwutleniacze fizjologiczne o niskiej masie cząsteczkowej, takie jak glutation, askorbinian, tokoferol, ubichinon, bilirubina i kwas moczowy (Krinsky NI (1992) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 200:248-54). Kolejną klasą przeciwutleniaczy drobnocząsteczkowych są karotenoidy, stanowiące czynniki zabezpieczające przed stresem oksydacyjnym i chorobami przewlekłymi. Canfield i wsp. (1992) Proc. Soc. EXp. Biol. Med. 200:260 podsumowali dotychczasowe doniesienia na temat związków między karotenoidami a różnymi chorobami przewlekłymi, jak np. choroba wieńcowa, zaćma i nowotwory. Karotenoidy wybitnie zmniejszają częstość występowania pewnych stanów przednowotworowych, takich jak leukoplakia (rogowacenie białe) u niektórych pacjentów.

Dla zapobiegania uszkadzającemu wpływowi tworzenia się wolnych rodników tlenowych po nagłym przywróceniu prawidłowego utlenowania niedokrwionych tkanek próbowano stosować różne substancje przeciwutleniające.

Jednym ze sposobów zapobiegania uszkodzeniu tkanek, wywołanemu rodnikami tlenowymi, jest hamowanie tworzenia rodników tlenowych, takich jak ponadtlenek. Środki chelatujące jony żelaza, takie jak deferoksamina (inna nazwa: Desferol) i inne, hamują zależne od żelaza powstawanie · OH, działające w ten sposób jako inhibitory tworzenia wolnych rodników (Gutteridge i wsp. (1979) Biochem. J. 84:469, Halliwell B. (1989), Free Radical Biol. Med., 7:645; Van der Kraaij i wsp. (1989) Circulation 80:158). Jako inhibitory tworzenia się wolnych rodników tlenowych proponowano również przeciwutleniacze aminosteroidowe, jak np. 21-aminosteroidy, zwane lazaroidami (np. U74006F). Przeprowadzono również badania nad deferoksaminą, ałlopurinolem i innymi pirazolopirymidynami, jak np. oksypurinol, dla zapobiegania wytwarzaniu się wolnych rodników w układzie modelowym ogłuszenia · mięśnia serca (Bolli i wsp. (1989) Circ. Res. 65:607), jak również po wstrząsie krwotocznym i endotoksycznym (DeGaravilla i wsp. (1992) Drug Devel. Res. 25:139). Jednakże wszystkie te związki wykazują znaczne wady w zastosowaniu leczniczym. Na przykład, deferoksamina nie stanowi idealnego chelatora żelaza, a jej penetracja do komórek jest dość ograniczona.

Innym sposobem zapobiegania uszkodzeniom wywoływanym przez wolne rodniki tlenowe jest katalityczne usuwanie wolnych rodników tlenowych, takich jak ponadtlenki, tuż po ich powstaniu. Przeprowadzono szeroko zakrojone badania nad dysmutazą ponadtlenkową i katalazą; osiągnięto pewne sukcesy w ich zastosowaniu jako czynników zabezpieczających przy dodawaniu do reperfuzatów w różnego rodzaju doświadczeniach lub przy podawaniu ich przed niedokrwieniem (przegląd tych badań przedstawili Gutteridge JMC i Halliwell B (1990) op. cit.). Dzięki dostępności rekombinacyjnej dysmutazy ponadtlenkowej możliwa była szersza ocena wpływu podawania SOD w leczeniu i zapobieganiu różnym stanom chorobowym, 'takim jak np. uszkodzenie reperfuzyjne mózgu i rdzenia kręgowego (Uyama i wsp. (1990) Free Radic. Biol. Med. 8:265; Lim i wsp. (1986) Ann. Thorac. Surg. 42:282), endotoksemia (Schneider i wsp. (1990) Circ. Shock 30:97, Schneider i wsp. (1989) prog. Clin. Biol. Res. 308:913), zawał mięśnia serca (Patel i wsp. (1990) Am. J. Physiol. 258:H369; Mehta i wsp. (1989) Am. J. Physiol. 257:H1240; Nejima i wsp. (1989) Circulation 79:143, Fincke i wsp. (1988) Arzneimittelforschung 38:138; Ambrosio i wsp. (1987) Circulation 75:282) oraz zapalenie stawów 'i kości i niedokrwienie jelit (Vohra i wsp. (1989) J. Pediatr. Surg. 24:893; Flohe L (1988) Mol. Cell. Biochem. 84:123). Istnieją również doniesienia na temat skuteczności dysmutazy ponadtlenkowej w leczeniu liszaja

175 446 rumieniowatego układowego, choroby Crohna, wrzodów żołądka, zespołu toksyczności tlenowej, oparzeń, u pacjentów z niewydolnością nerek, czekających na przeszczep oraz w zakażeniach wirusem opryszczki zwykłej.

Innym sposobem zapobiegania uszkodzeniom wywoływanym przez wolne rodniki tlenowe jest zmiatanie wolnych rodników tlenowych, takich jak ponadtlenki, po ich powstaniu, zwykle z zastosowaniem drobnocząsteczkowych zmiataczy, działających nie katalitycznie, lecz stechiometrycznie. Dla zmniejszenia uszkodzeń wywołanych rodnikami tlenowymi w różnych modelach zwierzęcych stosowano pochodne glutationu. Na przykład w modelu zwierzęcym (na psach) stwierdzono, że N-2-merkaptopropionyloglicyna ma działanie zabezpieczające w niedokrwieniu mięśnia sercowego i reperfuzji (Mitsos i wsp. (1986) Circulation 73:1077), a N-acetylocysteinę' (Mucomyst) stosowano do leczenia zatrucia endotoksynami u owiec (Bernard i wsp. (1984) J. Clin. Invest. 73:1772). Uważa się, że dimetylotiomocznik (DMTU) i butylo-a-fenylonitron (BPN) zmiatają rodnik hydroksylowy, · OH; udowodniono, że związki te zmniejszają uszkodzenie niedokrwiennoreperfuzyjne w mięśniu sercowym szczura i u królików (Vander Heide i wsp. (1987) J. Mol. Cell. Cardiol. 19:615; Kennedy i wsp. (1987) J. Appl. Physiol. 63:2426). Jako zmiatacz wolnych rodników dla zmniejszenia uszkodzenia narządów w czasie przywracania prawidłowego natlenowania (reoksygenacji) stosowano również mannitol (Fox RD (1984) J. Clin. Inwst 77:1446; Ouriel i wsp. (1995) Circulation 72:255). W j ednym doniesieniu opisano Ocobnoczątteczkowy chelat wykazujący aktywność podobną do peroksydazy glutationowej (Spector i wsp. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:7485).

Tak więc, zastosowanie inhibitorów tworzenia wolnych rodników tlenowych i/lub enzymów usuwających ponadtlenek i nadtlenek wodoru i/lub drobnocząsteczkowych zmiataczy wolnych rodników tlenowych okazało się obiecujące w zapobieganiu uszkodzeniu po przywróceniu prawidłowego natlenowania tkanek w wielu stanach patologicznych, związanych z niedokrwieniem, oraz w leczeniu i zapobieganiu różnym stanom chorobowym, związanym z wolnymi rodnikami. Jednakże, każda z tych kategorii ma kilka wad. I tak na przykład inhibitory tworzenia wolnych rodników tlenowych wykazują działanie chelatujące wobec metali przejściowych, wykorzystywanych w podstawowych procesach enzymatycznych prawidłowej fizjologii i oddychania; ponadto, nawet w bardzo wysokich dawkach, inhibitory te nie zapobiegają całkowicie tworzeniu się wolnych rodników tlenowych. Dysmutaza ponadtlenkowa i katalaza są to wielkocząsteczkowe polipeptydy, drogie w wytwarzaniu, które nie przenikają do komórek, nie przechodzą przez barierę krew-mózg i wymagają zwykle podawania drogą pozajelitową. Zmiatacze wolnych rodników działają ttechinmetrycznie, są więc łatwo usuwane i dla zapewnienia ich skuteczności należy je podawać w wysokich dawkach.

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr US-5 106 841 przedstawiono metaloorganiczne związki kobaltu i ich zastosowanie w leczeniu chorób powodowanych przez wirusy lub wirusowe zakażenia. W opisie tym rozważano, że związki metaloorganiczne mogłyby reagować z nadtlenkowymi rodnikami anionu O2. Jednakże, nie ujawniono w nim, że kompleksy kobaltu rzeczywiście wykazują aktywność SOD lub aktywność katalazy w chemicznych testach In vitro (np. testach SOD). W opisie tym nie wskazano ani nie zasugerowano, że ujawnione kompleksy kobaltu mogą być stosowane w leczeniu chorób związanych z wolnymi rodnikami. Wspomniano jedynie, że kompleksy kobaltu mogłyby reagować z nadtlenkami, ale nie zasugerowano żadnego związku in vivo z tą postulowaną aktywnością. Nie wskazano, oprócz przscrwwrrutowych żadnych innych zastosowań tych kompleksów kobaltu. Analiza kompleksów kobaltu według opisu US-5 106 841 wykazuje, że jon metalu jest kompleksowany przez sześć ligandów, a więc przez inną liczbę ligandów niż kompleksy salenu i metalu, które są substancjami czynnymi kompozycji według wynalazku.

W związku z powyższym jest oczywiste, że istnieje potrzeba opracowania nowych czynników przeciwutlaniających, skutecznie usuwających niebezpieczne wolne rodniki tlenowe, szczególnie ponadtlenki i nadtlenek wodoru, niedrogich w wytwarzaniu, stabilnych, posiadających korzystne właściwości farmakokinetyczne, takie jak zdolność przechodzenia

175 446 przez barierę krew-mózg i penetracji do tkanek. Takie uniwersalne przeciwutleniacze znalazłyby zastosowanie jako leki, środki chemoprotekcyjne i być może również dodatki pokarmowe. Jednym z celów wynalazku jest opracowanie klasy nowych przeciwutleniaczy, posiadających korzystne właściwości farmakologiczne i usuwających katalitycznie i/lub stechiometrycznie ponadtlenek i/lub nadtlenek wodoru.

Celem wynalazku jest opracowanie kompozycji farmaceutycznych o silnych właściwościach przeciwutleniająbycO i/lub zdolności do zmiatania wolnych rodników, działających jako przeciutleniacze również in vivo.

Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania lub leczenia stanów chorobowych związanych z wolnymi rodnikami, zwłaszcza epizodu niedokrwienno-reoksygenacyjnego i jatrogenicznej toksyczności wolnorodnikowej, zawierająca substancję czynną i znane środki pomocnicze, według wynalazku, jako substancję czynną zawiera 0,001-95% wagowych przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu o wzorze

w którym M jest wybrane z grupy obejmującej Mn, Co, Fe, V, Cr i Ni; A oznacza anion; wartość n wynosi 0, 1 lub 2; Χ1, Χ2, Χ3 i Χ4 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, grupy arylowe, grupy arylo-C1-12-alkilowe, pierwszo-, drugolub trzeciorzędowe grupy C--i2-aJkilowe, grupy Ci-6-alkoksylowe, grupy aryloksylowe, grupy aminowe, czwartorzędowe grupy aminowe; Y_b Y2, Y3, Y4, Y5 i Y- są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, atom chlorowca, grupy Cn-alkilowe, grupy arylowe, grupy arylo-Ci-^-alkilowe i grupy aminowe; a R1, R2, R3 i R4 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, grupy arylowe, grupy estrów kwasów tłuszczowych o 10-20 atomach węgla, podstawione grupy Cl-6-aCkoksyarylowe, pierwszo-, drugo- lub trzeciorzędowe grupy C1.12-alkilowe.

Kompozycja według wynalazku, korzystnie, zawiera przeciwutleniający kompleks salenu i metalu wybrany z grupy obejmującej Strukturę IV, Strukturę V, Strukturę VI, Strukturę VII, Strukturę VIII i Strukturę ΓΧ.

Kompozycja według wynalazku, korzystnie, zawiera przeciwutleniający kompleks salenu 1 metalu wybrany z grupy obejmującej C1, C4, C6, C7, C9, C15, C17, C20, C22, C23, C25, C27 i C28, a zwłaszcza SOD-mimetyczny C7.

Szczególnie korzystna kompozycja według wynalazku w jednostce dawkowania zawiera co najmniej około 10 mg C7 w postaci odpowiedniej do podawania pozajelitowego.

W innym wariancie wykonania kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania lub leczenia stanów chorobowych związanych z wolnymi rodnikami, zwłaszcza epizodu niedokrw1enno-reoksygenabyjnego i jatrogenicznej toksyczności wolnorodnikowej, zawierająca substancję czynną i znane środki pomocnicze, według wynalazku zawiera 0,001-95% wagowych co najmniej jednego rodzaju przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu o wzorze

175 446

R.

(C )

R

w którym M jest jonem metalu przejściowego wybranym z grupy zawierającej Mn, Co, Fe, V, Cr i Ni; A oznacza anion; wartość n wynosi 4, 5 lub 6; Xi, X2, X₃ i X·* są niezależnie wybrane z grupy obejmującej grupy arylowe, grupy arylo-Ci-s-alkilowe, grupy aryloksylowe, pierwszo-, drugo-, lub trzeciorzędowe grupy C--i2-alkilowe, ewentualnie podstawione grupy Ci-ó-alkoksylowe, grupy aminowe, czwartorzędowe grupy aminowe i atom wodoru; Yi, Y2, Y₃, Y4, Y5 i Yó są niezależnie wybrane z grupy obejmującej grupy arylowe, grupy arylo-Ci-ó-alkilowe, pierwszo-, drugo- lub trzeciorzędowe grupy alkilowe, ewentualnie podstawione grupy Ci-s-alkoksylowe, grupy aryloksylowe, atomy chlorowców, grupy aminowe, czwartorzędowe grupy aminowe i atom wodoru; a Rii R4 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, atomy chlorowców, pierwszo-, drugo- lub trzeciorzędowe grupy Ci-ió-alkilowe, grupy estrów kwasów tłuszczowych o i0-20 atomach węgla, grupy Ci-ó-alkoksylowe i grupy arylowe.

* Korzystnie, kompozycja według wynalazku zawiera przeciwutleniający kompleks salenu i metalu wybrany z grupy obejmującej Ci0, Cii, Ci2, C29 i C30.

W innym wariancie wykonania, kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania lub leczenia stanów chorobowych związanych z wolnymi rodnikami, zwłaszcza epizodu medokrwienno-reok8ygeyacyjnego i jatrogenicznej toksyczności wolyorodyikowej, zawierająca substancję czynną i znane środki pomocnicze, według wynalazku, jako substancję czynną zawiera 0,00i-95% wagowych prrrciwutleyiającego kompleksu salenu i metalu w postaci akceptowanej farmaceutycznie o wzorze (c )

R

w którym M jest manganem; A oznacza atom wodoru lub atom chlorowca; wartość n wynosi 0 4,5 lub 6, przy czym gdy n = 0 to Cn jest nieobecne, a gdy n = 4,5 lub 6, to Cn jest nasyconym łańcuchem węglowodorowym, R1 i R4 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, fenyl, grupę Cv4-alkoksylową, grupy estrów kwasów tłuszczowych o 8-i5 atomach węgla, X1 i X3 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, grupę C1-4-alkiłową, grupę aminową, grupę C1-4-alkiloaminową i atom chlorowca; Χ2 i X4 oznaczają atom wodoru; Y1 i Y4 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, grupę C1-4-alkilową, atomy chlorowców i grupę C1-4-alkoksylową; Y2, Y₃, Y5 i Yó oznaczają atom wodoru i wszystkie pozostałe położenia podstawników oznaczają atom wodoru.

Korzystnie, kompozycja według wynalazku zawiera przeciwutleniający kompleks salenu i metalu wybrany z grupy obejmującej C1, C4, C6, C7 i C9.

175 446

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera skuteczną dawkę co najmniej jednego kompleksu salenu i metalu przejściowego, typowo kompleksu salenu i manganu, jak np. kompleks salen-Mn (III). W jednym z wykonań wynalazku kompozycja farmaceutyczna zawiera kompleks salen-Mn, stanowiący chelat Mn (III) z pochodną dwuaminy, np. z etylenodwuaminą, związaną z dwoma podstawionymi salicyloaldehydami. Te kompozycje farmaceutyczne wykazują właściwości dysmutowania ponadtlenków (tzn. aktywność dysmutazy ponądtlenkowej) i, korzystnie, ' również konwersji nadtlenku wodoru do wody (tzn. aktywność katalazy). Kompozycje farmaceutyczne są skuteczne w ograniczaniu patologicznego uszkodzenia, związanego z tworzeniem się rodników tlenowych, takich jak ponadtlenek i nadtlenki, oraz innych rodzajów wolnych rodników.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku znajdują zastosowanie do leczenia i zapobiegania stanom patologicznym przez podawanie kompozycji zawierających kompleksy salenu i metalu przejściowego w dawkach leczniczych lub zapobiegawczych. Kompleksy salenu i metalu przejściowego, znajdujące się w kompozycjach według wynalazku, stanowią typowo kompleksy salenu i manganu, jak np. kompleksy Mn (III)-salen. Kompozycje te znajdują również zastosowanie do zapobiegania lub ograniczania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego najważniejszych tkanek, tzn. mięśnia serca i ośrodkowego układu nerwowego. Mogą być także stosowane do zapobiegania lub zmniejszania uszkodzenia komórek po ekspozycji na działanie różnych środków chemicznych, wytwarzających potencjalnie szkodliwe wolne rodniki, przez podawanie dawki skutecznej leczniczo lub zapobiegawczo co najmniej jednego rodzaju kompleksu salenu i metalu przejściowego, korzystnie, kompleksu salenu i manganu, wykazującego wykrywalną aktywność SOD, i, korzystnie, wykazującego również wykrywalną aktywność katalazy. Przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu przejściowego zawarte w kompozycjach według wynalazku można podawać różnymi drogami, w tym pozajelitowo, miejscowo i doustnie.

Kompleks salenu i metalu przejściowego podaje się, w dawce leczniczej lub zapobiegawczej, jako jedyny środek lub w połączeniu z (1) jednym lub kilkoma enzymami przeciwutleniającymi, jak Mn-SOD, Cu, Zn-SOD lub katalazą i/lub (2) jednym lub kilkoma zmiataczami wolnych rodników, jak tokoferol, askorbinian, głutation, DMTU, N-acetylocysteina lub N-2-merkaptopropionyloglicyna i/lub (3) jednym lub kilkoma inhibitorami rodników tlenowych, jak deferoksamina lub allopurinol i/lub z jednym lub kilkoma biologicznymi czynnikami modyfikującymi, jak inhibitory kalpainy. Postacie tych środków farmaceutycznych zależą od tego, do leczenia lub zapobiegania jakim konkretnym stanom patologicznym środek jest przeznaczony, od drogi i formy podania, jak również od wieku, płci i stanu ogólnego pacjenta. Środki te podaje się z różnych wskazań, w tym (1) w zapobieganiu uszkodzeniu niedokrwienno-reoksygenacyjnemu u pacjenta, (2) przy przechowywaniu narządów, przeznaczonych do przeszczepienia, w stanie anoksycznym, hipoksycznym lub hiperoksycznym, przed wykonaniem praeszczepienia, (3) w celu zabezpieczenia prawidłowych tkanek przed uszkodzeniem wywołanym wolnymi rodnikami po narażeniu pacjenta na promieniowanie jonizujące i/lub chemioterapię, np. bleomycyną, (4) w celu zabezpieczenia komórek i tkanek przed uszkodzeniem wywołanym wolnymi rodnikami w następstwie podawania środków ksenob^i^^i^y^cznych, które tworzą wolne rodniki, bezpośrednio lub na drodze monooksygenacji poprzez układ cytochromu P-450, (5) dla poprawy warunków kriokonserwacji (przechowywania w niskiej temperaturze) komórek, tkanek, narządów i organizmów przez zwiększenie żywotności próbek po ich odmrożeniu oraz w celu, (6) podawania profilaktycznego, w zapobieganiu karcynogenezie, starzeniu się komórek, powstawaniu zaćmy, tworzeniu się malonodwualdehydowych związków addycyjnych, patologii związanych z wirusem HIV oraz powstawaniu wiązań poprzecznych w makrocząsteczkach, np. powstawaniu wiązań poprzecznych w kolagenie.

175 446

W jednym z wykonań wynalazku kompleksy salenu i metalu przejściowego wytwarza się, w celu podawania doustnego, poprzez wytworzenie postaci farmaceutycznej, zawierającej zaróbkę i co najmniej 1 μ g, a co najwyżej 10 g, co najmniej jednego przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu przejściowego według wynalazku. Postacie do zastosowania jako dodatki pokarmowe podaje się w leczeniu chorób wywołanych wolnymi rodnikami i/lub w chemoprewencji nowotworzenia i/lub uszkodzenia oksydacyjnego, związanego z prawidłowym metabolizmem tlenowym. W innym wykonaniu wynalazku środek wytwarza się w postaci zbuforowanego roztworu wodnego, zawierającego co najmniej jeden kompleks salenu i metalu przejściowego według wynalazku w stężeniu, co najmniej 1 mM, lecz nie więcej niż 100 mM, do podawania, zwykle w stężeniu wynoszącym około 0,1-10 mM, typowo drogą dożylną, pacjentom, którzy przechodzą lub mogą przechodzić w najbliższej przyszłości (1) epizod niedokrwienia, jak zawał mięśnia sercowego, epizod niedokrwienia mózgu, operacja przeszczepienia narządu, zabieg operacyjny na otwartym sercu, wybiórcza angioplastyka, operacyjne założenie pomostu aortalno-wieńcowego (bypass), zabieg neurochirurgiczny na mózgu, zawał nerki, krwotok pourazowy, założenie opaski uciskowej, (2) chemioterapię przeciwnowotworową lub przeciwrobaczą z zastosowaniem środków chemioterapeutycznych, wytwarzających wolne rodniki, (3) wstrząs endotoksyczny lub posocznicę, (4) narażenie na promieniowanie jonizujące, (5) narażenie na egzogenne związki chemiczne, stanowiące wolne rodniki lub je wytwarzające, (6) termiczne lub chemiczne oparzenia lub owrzodzenia, (7) narażenie na działanie tlenu pod podwyższonym ciśnieniem lub (8) apoptozę określonej populacji komórek (np. apoptozę limfocytów). Zbuforowane wodne roztwory według wynalazku można również stosować, typowo w połączeniu z innymi znanymi sposobami, w hodowli narządów, hodowli komórek, przechowywaniu narządów przeznaczonych do przeszczepienia oraz w płukaniu mięśnia serca. Niniejszy wynalazek obejmuje również postacie niewodne, jak np. postacie na bazie lipidów, w tym emulsje stabilizowane. Przeciwutleniające środki zawierające salen i metal podaje się różnymi drogami, w tym poprzez wstrzyknięcie dożylne, wstrzyknięcie domięśniowe, wstrzyknięcie podskórne, wstrzyknięcie doosierclziowe, płukanie w czasie zabiegu operacyjnego, podanie miejscowe, podanie do worka spojówkowego, płukanie, podawanie przez zgłębnik do żołądka, wlewkę doodbytniczą, podawanie dootrzewnowe, inhalacje aerozolowe, płukanki do ust, oraz innymi drogami, w zależności od zamierzonego konkretnego zastosowania medycznego lub weterynaryjnego.

W innym wykonaniu niniejszego wynalazku przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu przejściowego według wynalazku stosuje się dla modulacji ekspresji naturalnie występujących genów lub innych sekwencji polinukleotydowych, pozostających pod kontrolą transkrypcyjną elementu odpowiedzi na stres oksydacyjny (np. element odpowiedzi przeciwutleniającej ARE), jak element odpowiedzi przeciwutleniającej genu glutationo-Stransferazy lub genu reduktazy NAD(P)H:-chinonu. Przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu stosować można w celu modulacji transkrypcji sekwencji polinukleotydowych, regulowanych przez ARE, w hodowlach komórkowych (np. komórki ES) i u zdrowych zwierząt, szczególnie u zwierząt transgenicznych, u których transgen zawieraa jedną lub kilka ARE jako sekwencje regulacji transkrypcyjnej.

Niniejszy wynaalaizek obejmuje środki farmaceutyczne, zawierające przeciwutleniające kompleksy salenu i manganu, wykorzystanie w lecznictwie takich przeciwutleniających kompleksów salenu i manganu, sposoby i środki do zastosowania przeciwutleniających kompleksów

175 446 salenu i manganu w diagnostyce, leczeniu i w pracach badawczych w naukach medycznych i weterynaryjnych.

Wszystkie publikacje i zgłoszenia patentowe włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie, w takim zakresie, jak gdyby każda z tych publikacji lub zgłoszeń patentowych z osobna wskazano jako włączone przez przywołanie.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia ogólną strukturę pochodnych salenu według wynalazku.

Figura 2 przedstawia pochodną salenu według struktury przedstawionej na fig. 1, gdy n=0.

Figura 3 przedstawia struktury korzystnych związków według wynalazku.

Figura 4 przedstawia schematycznie wpływ epizodu niedokrwienno-reoksygenacyjnego na przewodnictwo synaptyczne w izolowanych skrawkach tkanki mózgowej.

Figura 5 przedstawia działanie kompleksu salen-Mn na amplitudę EPSP po epizodzie niedokrwienno-reoksygenacyjnym.

Figura 6 przedstawia wpływ kompleksu salen-Mn na początkowe nachylenie krzywej EPSP po epizodzie niedokrwienno-reoksygenacyjnym.

Figura 7 przedstawia wpływ kompleksu salen-Mn na żywotność skrawka tkanki mózgowej po wielokrotnych epizodach niedokrwienno-reoksygenacyjnych.

Figura 8 przedstawia efekt ochronny kompleksu salen-Mn w modelach jatrogennej choroby Parkinsona.

Figura 9 przedstawia, że C7 zabezpiecza skrawki hipokampa przed peroksydacją lipidów, wywoływaną przez kwas mlekowy.

Figura 10 przedstawia, że C7 zabezpiecza neurony dopaminergiczne w prążkowiu myszy przed degeneracją wywoływaną przez 6-OHDA.

Figura 11 przedstawia, że C7 chroni neurony dopaminergiczne prążkowia myszy przed degeneracją wywoływaną przez MPTP.

O ile nie zdefiniowano inaczej, wszystkie określenia techniczne i naukowe, zastosowane w niniejszym opisie, mają to samo znaczenie, co powszechnie stosowane w dziedzinach, do których wynalazek należy. Jakkolwiek można stosować dowolne sposoby lub materiały, podobne lub równorzędne z przedstawionymi w niniejszym opisie, w wykorzystaniu lub badaniu niniejszego wynalazku, opisano korzystne sposoby i materiały. Dla celów niniejszego wynalazku poniżej zdefiniowano następujące określenia.

Przeciwutleniacz, w rozumieniu niniejszego opisu, stanowi substancję, która, zawarta w mieszaninie lub strukturze zawierającej jako substrat cząsteczkę biologiczną podlegającą utlenianiu, w znaczący sposób opóźnia lub zapobiega utlenianiu tej cząsteczki biologicznej, stanowiącej substrat. Przeciwutleniacze mogą wywierać swoje działanie poprzez zmiatanie biologicznie ważnych reaktywnych wolnych rodników lub innych postaci tlenu reaktywnego · O2, H2O2, · OH, HOCl, ferryl, peroksyl, peroksyazotyn i alkoksyl, albo poprzez zapobieganie ich tworzeniu się, albo katalizowanie przemiany wolnych rodników lub postaci reaktywnego tlenu w postacie mniej aktywne. Przeciwutleniający kompleks salenu i metalu przejściowego wykazuje zwykle wykrywalną aktywność SOD. Kompleks salenu i metalu przejściowego wykazuje aktywność przeciwutleniającą, jeżeli kompleks, po dodaniu go do hodowli tkankowej lub reakcji testowej, powoduje wykrywalny spadek ilości wolnego rodnika, jak np. ponadtlenku, lub nierodnikowej reaktywnej postaci tlenu, jak nadtlenek wodoru, w porównaniu z taką samą hodowlą tkankową lub reakcją testową, do których nie dodano kompleksu. Odpowiednie stężenie (tzn. dawkę skuteczną) można oznaczać różnymi metodami, np. wyznaczając empiryczną krzywą dawka-odpowiedź, przewidując siłę działania i skuteczność substancji pochodnej z zastosowaniem metod QSAR lub modelowania cząsteczkowego, oraz innymi metodami stosowanymi w naukach farmabeutybznycO. Ponieważ uszkodzenie oksydacyjne może się zwykle kumulować, nie istnieje minimalny poziom (lub dawka) progowa, odnoszące się do skuteczności, jakkolwiek można ustalić dawki minimalne dla uzyskania wykrywalnego efektu leczniczego lub zapobie175 446 gawczego w danym stanie chorobowym. Przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu mogą wykazywać aktywność peroksydazy glutationowej.

Kompleks salenu i metalu przejściowego, w rozumieniu niniejszego opisu, oznacza związek o strukturze zgodnej ze Strukturą I, Strukturą II, Strukturą III, Strukturą IV, Strukturą V, Strukturą VI, Strukturą VII, Strukturą VIII, Strukturą IX (por. poniżej), lub też jedną ze struktur C1, C4, C6, C7, C9, C10, C11, C12, C15, C17, C20, C22, C23, C25, C27, C28, C29 i C30, przedstawionych na fig. 3 i poniżej, korzystnie, o strukturze zgodnej z jedną ze struktur przedstawionych na fig.3 , dobraną z grupy, do której należą: C6, C7 i C12, jeszcze korzystniej, o strukturze zgodnej ze strukturą C7 lub C12, do katalitycznego usuwania ponadtlenków. Metal przejściowy jest typowo dobierany z grupy, do której należą: Mn, Mg, Co, Fe, V, Cr i Ni; najkorzystniej, stanowi go Mn lub Mg.

W rozumieniu niniejszego opisu choroba związana z wolnymi rodnikami oznacza nieprawidłowy stan pacjenta, wynikający przynajmniej częściowo z tworzenia się wolnych rodników lub z narażenia na nie, w szczególności wolnych rodników tlenowych, jak również innych postaci reaktywnego tlenu in vivo. Dla specjalisty jest oczywiste, że większość stanów patologicznych ma wieloczynnikowe podłoże, to znaczy, że w powstaniu stanu chorobowego odgrywają rolę różne czynniki, oraz, że ustalenie lub zidentyfikowanie najważniejszego czynnika, lub czynników, przyczynowych, w konkretnym, indywidualnym przypadku, bywa bardzo trudne. Dlatego też określenie choroba związana z wolnymi rodnikami obejmuje stany patologiczne, co do których istnieje w nauce pogląd, że uszkodzenie wywoływane przez wolne rodniki lub reaktywne postacie tlenu ma znaczenie w patogenezie stanu chorobowego lub też w których wykazano, że podawanie inhibitora wolnych rodników (np. deferoksyaminy), zmiataczy (np. tokoferolu, glutationu), lub katalizatora (SOD, katalaza) daje wyraźną poprawę, zmniejszając nasilenie objawów chorobowych, wydłużając czas przeżycia lub dając inne zauważalne korzyści kliniczne w leczeniu lub zapobieganiu stanom patologicznym. Nieograniczającymi przykładami stanów chorobowych, omawianych w niniejszym opisie należą: choroby związane z wolnymi rodnikami (np. uszkodzenie niedokrwienno-repeffuzyjne, choroby zapalne, liszaj rumieniowaty układowy, zawał mięśnia serca, udar mózgu, krwotok pourazowy, uraz rdzenia kręgowego, choroba Crohna, choroby autoimmunologiczne (np. reumatoidalne zapalenie stawów, cukrzyca), tworzenie się zaćmy, zapalenie błony naczyniowej oka, rozedma płuc, wrzody żołądka, zespół toksyczności tlenowej, nowotworzenie, niepożądana apoptoza komórkowa, choroba popromienna oraz inne stany patologiczne, omówione w rozdziale Stan techniki oraz poniżej).

Określenie substancja SOD-mimetyczna, substancja SOD-podobna, substancja podobna do dysmutazy ponadtlenkowej oraz katalizator ponadtlenkowy odnosi się do związków, które wykazują wykrywalną aktywność katalityczną co do dysmutacji ponadtlenków, określaną testami. Ogólnie, substancja SOD-mimetyczna posiada co najmniej około 0,001% aktywności ludzkiego Mn-SOD lub Zn/Cu-SOD, określanego w molach z zastosowaniem standardowych metod testowych i/lub posiada co najmniej 0,01 jednostki aktywności SOD na mM określanego w teście SOD, omówionym poniżej, korzystnie, co najmniej jedną jednostkę aktywności SOD na mM.

Określenie alkil oznacza cykliczną, rozgałęzioną lub nierozgałęzioną grupę alkilową, zawierającą wyłącznie węgiel i wodór, oraz, o ile nie zaznaczono inaczej, zawierającą jeden do dwunastu atomów węgla. W dalszej części niniejszego opisu podano przykłady wyjaśniające to określenie, tj. takie grupy jak metylowa, etylowa, n-propylowa, izobutylowa, t-butylowa, pentylowa, piwalilowa, heptylowa, iidamantylowa i cyklopentylowa. Grupy alkilowe mogą być ewentualnie podstawione jednym lub wieloma podstawnikami, np. atom chlorowca, grupę alkilową, alkoksylową, alkilotiolową, trifluorometylową, acyloksylową, hydroksylową, merkapylową, karboksylową, aryloksylową, arylową, aryloalkilową, heteroarylową, aminową, alkiloaminową, dialkilaminową, alkilaminową, morfolinową, piperydynową, pirolidynylo-1-ową, piperazynylo-1 lub inne grupy funkcyjne.

177 444

Określenie niższy alkil odnosi się do cyklicznych, rozgałęzionych lub prostołańcuchowych, jednzzwartzzścizzgych rodników alkilowych, zawierających jeden do sześciu atomów węgla. W dalszej części opisu podano przykłady wyjaśniające to określenie, omawiając rodniki takie, jak metylowy, etylowy, n-propylowy, i-propylowy, n-butylowy, t-butylowy, i-butylowy (czyli dwumetykzpropyk)wy), cyklzzprzzpylometykzwy, i-amylowy, n-amylowy i heksylowy.

Określenie aryl lub Ar oznacza jednowartościowe nienasycone aromatyczne grupy karbocykliczne, zawierające pojedynczy pierścień (np. fenylowa) lub wiele pierścieni skondensowanych (np. naftylowa lub antrylowa), które mogą być ewentualnie podstawione takimi grupami jak: atom chlorowca, grupa alkilowa, alkoksylową, alkilzztkzlzzwa, trifluorometylową, acyloksylowa, hydroksylowa, merkaptolowa, karbooksylowa, aryloksylowa, arylowa, aryloalkilowa, hetero^^rylowa, aminowa, alkilaminowa, dialkilaminowa, morfolinowa, piperydynowa, piroliZyyylo-1-owa, piperazynylo-i-owa lub inne.

Określenie podstawiona grupa alkoksylową odnosi się do grupy o strukturze -0-R, gdzie R stanowi grupa alkilowa, podstawiony nieczynnym podstawnikiem. Określenie grupa aryloalkoksylowa oznacza grupę o strukturze -0-R-Ar, gdzie R stanowi grupa alkilowa, a Ar stanowi podstawnik aromatyczny. Aryloalkoksyle są podgrupą podstawionych alkoksyli. Przykłady korzystnych podstawionych grup alkoksylowych stanowią grupy benzyloksylowa, naftyloksylowa i chlorzbemylzksylowa.

Określenie grupa aryloaksylowa odnosi się do grupy o strukturze -0-Ar, gdzie Ar stanowi grupę aromatyczną. Korzystną grupę aryloaksylową stanowi grupa femoksylzzwa.

Określenie grupa aryloalkilowa oznacza grupy -R-Ar, gdzie Ar stanowi grupę arylową, a R jest prostą lub rozgałęzioną grupę alifatyczną. Przykłady grup aryloalkilowych to np. grupa benzylowa i furfurylowa. Grupy aryloalkilowe mogą nie zawie-rać podstawników lub też zawierać podstawniki z grupami funkcyjnymi takimi, jak np. atom chlorowca, grupa alkilowa, alkoksylową, alkilotiolowa, trifluorometylową, acylokiźylowa, hydroksylowa, merkaptolowa, karboksylowa, aryloksylowa, arylowa, aryloalkilowa, heteroarylowa, aminowa, alkilaminowa, dialkilaminowa, morfolinowa, piperydynowa, pirolidynylo-i-owa, pipemzyny^-i-owa lub inne.

W rozumieniu niniejszego opisu, określenie atom chlorowca oznacza podstawnik atom fluoru, bromu, chloru lub jodu.

W strukturach opisanych poniżej symbol OBn oznacza grupę benzyloksylową.

Określenie grupa aminowa oznacza chemiczną grupę funkcyjną -NR'R, gdzie R' i R stanowią, niezależnie od siebie, wodór, grupę alkilową lub arylową. Określenie zcrnartorzędzwa grupa aminowa oznacza grupę - N'R'RR' o ładunku dodatnim, przy czym R', R i R' są dobrane niezależnie od siebie i stanowią grupy alkilowe lub arylowe. Korzystną grupę aminową stanowi -NH2.

Określenie środek farmaceutyczny lub lek w rozumieniu niniejszego opisu oznacza związek lub środek chemiczny, zdolny do wywoływania pożądanego efektu leczniczego przy prawidłowym podaniu go pacjentowi.

Inne określenia chemiczne w niniejszym opisie zastosowano zgodnie z konwencjonalnym zastosowaniem ich w nauce, jak to przedstawiono w 'The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, (wyd. Parker, S. i985), Mc-Graw-Hill, San Francisco.

Ogólnie, nomenklatura stosowana poniżej oraz metody laboratoryjne hodowli komórek, chemii analitycznej, organicznej chemii syntetycznej oraz wytwarzania farmaceutycznej postaci leku, opisane poniżej, są dobrze znane i powszechnie stosowane w nauce. Do syntezy chemicznej, analiz chemicznych, wytwarzania postaci farmaceutycznych i leczenia pacjentów stosuje się techniki standardowe.

Podstawą niniejszego wynalazku jest stwierdzenie, że związki należące do klasy, opisywanej pierwotnie jako katalizatory epoksydacji, tak zwane kompleksy salenu i metalu przejściowego, wykazują również znaczną aktywność dysmutazy ponaZtlenkowej i/lub aktywność katalazy oraz działanie katalityczne w usuwaniu wolnych rodników, zarówno in vitro, jak i in vivo. Kompleksy salenu i metalu przejściowego zostały opisane jako

175 446 chiralne katalizatory epoksydacji do różnych zastosowań w chemii syntetycznej (Fu i wsp. (1991), J. Org. Chem. 56:6497; Zhang W. i Jacobsen EN (1991) J. Org. Chem. 56:2296, Jacobsen i wsp. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113:6703; Zhang i wsp. (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:2801; Lee NH i Jacobsen EN (1991) Tetrahedron Lett. 32:6533; Jacobsen i wsp. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113:7063; Lee i wsp. (1991) Tetrahedron Lett. 32:5055). Jednakże, kompleksy salenu i metalu przejściowego są również skuteczne jako silne przeciwutleniacze w różnych zastosowaniach biologicznych, włączając w to ich zastosowanie jako środków farmaceutycznych w zapobieganiu lub leczeniu chorób związanych z wolnymi rodnikami. Środki farmaceutyczne, dodatki pokarmowe, ulepszone pożywki do hodowli komórek i narządów, ulepszone środki do kriokonserwacji, maści do zastosowania miejscowego oraz środki chemo- i radioprotekcyjne można wytwarzać z zastosowaniem co najmniej jednego kompleksu salenu i metalu przejściowego w skutecznej ilości lub stężeniu.

Aktywność katalityczna kompleksów salenu i metalu w inwersji epoksydów może być również wykorzystana do zwiększenia zmiatania lub do zapobiegania tworzeniu się in vivo cytotoksycznych i/lub rakotwórczych epoksydów, takich jak np., jak wytwarzane przez monooksygenacyjny system cytochromu P-450 (np. benzo-[a]-pirenodioloepoksyd). Katalityczne kompleksy salenu i metalu można, korzystnie, dodawać do produktów żywnościowych lub dodatków pokarmowych (lub podawać w innych postaciach) osobom narażonym na działanie wielopierścieniowych węglowodorowych rakotwórczych środków chemicznych, takim jak np. pracownicy przemysłu petrochemicznego i farbiarskiego. Ponadto, z katalitycznie aktywnych kompleksów salenu i metalu można wytwarzać środki do podawania osobom palącym (włączając w to biernych palaczy) dla zwiększenia detoksykacji reaktywnych epoksydów, tworzących się z dymu papierosowego.

Przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu można stosować do częściowego lub całkowitego hamowania postępu chorób neurodegeneracyjnych. Na przykład, stwierdzono, że mutacje w dysmutazie ponadtlenkowej Cu/Zn mają wyraźny związek ze stwardnieniem zanikowym bocznym (SLA) (Rosen i wsp. (1993), Nature 362:59, Deng i wsp. (1993) Science 261:1047). Podobne defekty w endogennym zabezpieczeniu przeciwutleniającym mogą odpowiadać za powstawanie stwardnienia rozsianego (SM), neuropatii obwodowych itp. Przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu można stosować do leczenia i zapobiegania takim chorobom neurodegeneracyjnym (np. SLA, SM).

Kompleksy salenu i metalu przejściowego

Zgodnie z pierwszą cechą niniejszego wynalazku, kompleks salenu i metalu przejściowego ma następującą strukturę:

Struktura I

R

Y

X

X gdzie M stanowi jon metalu przejściowego, korzystnie Mn; A stanowi anion, typowo Cl, a wartość n wynosi 0,1 lub 2. Xx, X2, X3 i Xt są niezależnie dobrane z grupy, do której należy atom wodoru, grupy arylowe, aryloalkilowe, pierwszo-, drugo- lub trzeciorzędowe

175 446 grupy alkilowe, grupy alkoksylowe, arylnkpylnwe, grupy aminowe i czwartorzędowe grupy aminowe, korzystnie Χ1 i Χ3 są z tej samej grupy funkcyjnej, zwykle jest to atom wodoru, czwartorzędowa grupa aminowa lub trzeciorzędowy butyl, natomiast X2 i Χ4 korzystnie oznacza atom wodoru. Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 i Y; są niezależnie dobrane z grupy, do której należą: atom wodoru, atom chlorowca, grupy alkilowe, arylowe, arylnalkrlnwe, grupy aminowe, arylnktylnwe, alkoksylowe; korzystnie, Y1 i Y4 stanowią grupy alkoksylowe, atom chlorowca lub grupy aminowe. Korzystnie, Y1 i Y.4 oznaczają taką samą grupę. R_b R2, R3 i R4 są niezależnie dobrane z grupy, do której należą: H, CH3, C2H5, o-benzyl, pierwszo-, drugo- lub tczeuinczęOnwe grupy alkilowe, grupy estrów kwasów tłuszczowych podstawione grupy alknksyarylnwe i grupy arylnalkrlnwe.

W jednym wykonaniu wynalazku, co najmniej jedno z miejsc Χ1 i Χ3, a korzystnie oba miejsca Χ1 i Χ3, zawierają podstawnik, dobrany z grupy podstawników blokujących, do której należą drugo- i trzeciorzędowe grupy alkilowe, grupy arylowe, grupy wielopierścieniowe i alkilowe, zawierające jako podstawniki grupy alkoksylowe lub atom chlorowca. Korzystnie, miejsca Χ1 i Χ3 zawierają ten sam podstawnik, który stanowi, najkorzystniej, trzeciorzędowa grupa alkilowa, np. trzeciorzędowa grupa butylowa. Korzystnie, kiedy Χ1 i Χ3 zawierają blokujący podstawnik, Χ2 i X dobiera się z grupy podstawników msblokujących, do których należy H, CH3, C2H5 i pisrwtznrzędnwe grupy alkilowe, najkorzystniej H. Zamiast tego, trzy lub cztery z miejsc Χ1, Χ2, Χ3 i Χ4 mają być dobrane z grupy podstawników blokujących.

Zgodnie z pierwszą cechą wynalazku, typowo jeden, a zwykle nie więcej niż dwa, spośród R1, R2, R3 i R4, dobrane są z grupy, do której należy H, CH3, 62¾ i pierwszorzędowe grupy alkilowe. Dla uproszczenia, grupę tę w dalszej części niniejszego opisu będzie się nazywać grupą nreblnkująuą. Jeżeli R1 dobrany jest z grupy nieblnkująuej, to R2 i R3 dobiera się, korzystnie, z grupy blokującej, a typowo R.2 i R3 są identyczne i stanowią grupę fenylową lub benzylnksylową. Jeżeli R2 dobrane jest z grupy nieblnkująuej, to R1 i R4 dobiera się, korzystnie, z grupy blokującej. Podobnie, jeżeli R3 jest dobierane z grupy nieblnkująuej, to Rji R4 dobiera się, korzystnie, z grupy blokującej. Wreszcie, jeżeli R4 jest dobierane z grupy nieblnkującej, to R2 i R3 są, korzystnie, dobierane z grupy blokującej. Grupy fenylowa i benzoksylowa są szczególnie korzystnymi grupami blokującymi dla podstawników w jednym z miejsc R1, R2, R3 i R^ Na ogół, dobiera się identyczne grupy blokujące. W korzystnej klasie wykonań R3 i R.4 stanowią grupy benzylnkpylnwe lub fenylowe, a R2 i R3 - wodór.

Innymi słowy, jedno z wykonań pierwszej cechy wynalazku wymaga, aby z czterech miejsc dostępnych do podstawienia na dwóch atomach węgla, przylegających do azotu, co najmniej jedna lub dwie, korzystnie, zawierały podstawnik z grupy nieblnkująuej.

Korzystnie, podstawnik nieblnkująuy stanowi wodór lub grupa metylowa, jednakże najkorzystniej - wodór. Korzystnie, podstawnik blokujący stanowi grupa fenylowa, benzyloksylowa lub trzeciorzędowa grupa butylowa, korzystniej, grupa fenylowa lub grupa benzyloktylnwą, najczęściej grupa fenylowa.

Korzystnie, Y3 i Yó stanowią wodór, grupa metylowa, alkilowa lub arylowa. Korzystniej, stanowią je wodór lub grupa metylowa. Najkorzystniej, stanowi je wodór.

Miejsca Y1, Y2, Y4 i Y5 dobiera się niezależnie i są one, korzystnie, zajęte przez wodór, jakkolwiek mrejtua te mogą również być zajęte przez podstawniki, dobrane niezależnie z grupy, do której należą: wodór, atom chlorowca, grupy alkilowe, arylowe, alkoksylowe, podstawione grupy alkoksylowe, grupy nitrowe i aminowe. Y1 i Y4 są, korzystnie, zajmowane przez podstawniki takie, jak grupy metnktylnwe, etoksylowe, chlor, brom, jod, pierwszorzędowe alkile, trzeciorzędowe butyle, pierwszorzędowe grupy aminowe, drugorzędowe grupy aminowe, a korzystniej grupy metok^sylowe, chlor, trzeurnrzęOnwe butyle lub podstawnik metylowy.

Zgodnie z drugą cechą wynalazku, kompleks salenu i metalu przejściowego ma strukturę:

175 446

Struktura II

gdzie M stanowi jon metalu przejściowego, korzystnie Mn, a A stanowi anion, typowo Cl; gdzie co najmniej jedno z miejsc Xi lub Χ2 dobiera się z grupy, do której należą: grupy arylowe, pierwszo-, drugo- lub trzeciorzędowe grupy alkilowe; gdzie co najmniej jedno z miejsc Xi lub Χ3 dobiera się z grupy, do której należą: grupy arylowe, pierwszo-, drugolub trzeciorzędowe grupy alkilowe, aryloalkile i wodór, korzystnie, trzeciorzędowe butyle lub wodór, i gdzie Yi, Y2, Y3, Y4, Y5, Yó Zi, Z2, Z3, Z4, Z5, Ze, Z-, Z₈, Z9, Z10, Z11 i Z12 dobiera się niezależnie z grupy, do której należą: wodór, atom chlorowca, grupy alkilowe, arylowe, aminowe, alkoksylowe, podstawione grupy alkoksylowe, aryloalkilowe, aryloksylowe i alkilowe. Korzystnie, Yi i Y4 dobiera się z grupy, do której należą: niższe grupy alkilowe, alkoksylowe, atom chlorowca i grupy aminowe, korzystniej, z grupy, do której należą: grupy metoksylowe, chlor i aminy pierwszorzędowe. Korzystnym wykonaniem, zgodnym z drugą cechą wynalazku, jest to, w którym Yi i Y4 stanowią grupy metoksylowe; Χ1 i Χ3 są niezależnie dobrane i stanowią wodór lub trzeciorzędowy butyl, a pozostałe podstawniki stanowi wodór.

Zgodnie z trzecią cechą wynalazku, kompleks salenu i metalu przejściowego ma następującą strukturę:

Struktura III

gdzie M stanowi jon metalu przejściowego, typowo Mn, natomiast A stanowi anion, typowo Cl; gdzie wartość n wynosi 4, 5 lub 6; gdzie Χ1, Χ2, Χ3 i Χ4 dobiera się niezależnie z grupy, do której należą: grupy arylowe, arylolkilowe, aryloksylowe, pierwszo-, drugo- lub trzeciorzędowe grupy alkilowe, grupy alkoksylowe, podstawione grupy alkoksylowe, grupy aminowe, czwartorzędowe grupy aminowe i wodór; korzystnie, co najmniej jedno z miejsc Χι lub Χ3 dobiera się z grupy, do której należą: grupy arylowe, pierwszo-, drugo- lub trzeciorzędowe grupy alkilowe, czwartorzędowe grupy aminowe, grupy aryloalkilowe i wodór; korzystnie, Χ1 i Χ3 są identyczne i stanowią wodór lub trzeciorzędowy butyl, gdzie Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 i Yó dobiera się z grupy, do której należą: aryloalkilowe, pierwszo-,

175 446 drugo- lub trzeciorzędowe grupy alkilowe, grupy alkoksylowe, podstawione grupy alkoksylowe, aryloaksylowe, atom chlorowca, grupy aminowe, czwartorzędowe grupy aminowe i wodór; korzystnie, co najmniej jedno z miejsc Y1 lub Y 4 dobiera się z grupy, do której należą: grupy arylowe, pierwszo-, drugo-, lub trzeciorzędowe grupy alkilowe, podstawione grupy alkoksylowe, grupy aminowe i atomy chlorowca; korzystniej, Y1 i Y 2 są identyczne i stanowią grupę metoksylową, chlor, brom, jod, trzeciorzędowy butyl lub grupę aminową. R1 i R2 dobiera się niezależnie z grupy, do której należą: wodór, atom chlorowca, pierwszo-, drugo- lub trzeciorzędowe grupy alkilowe, grupy estrów kwasów tłuszczowych, grupy alkoksylowe lub grupy arylowe. Korzystnie, R1 i R4 są identyczne; korzystniej, R1 i R4 stanowi wodór

Korzystne kompleksy przeciwutleniające salenu i metalu

Następujące rodzaje przeciwutleniających kompleksów salenu i metalu są korzystne do zastosowania w środkach według wynalazku; podstawniki nie omówione szczegółowo stanowi wodór:

Struktura IV

gdzie Y1 i Yz dobiera się niezależnie z grupy, do której należą: grupy metoksylowe, etoksylowe, metylowe, etylowe, t-butylowe, chlorowe, bromowe, jodowe, aminowe, aminy czwartorzędowe, grupy alkiloaminowe, dwualkiloaminowe i wodór; R1 i R2 dobiera się niezależnie z grupy, do której należą: grupy fenylowa, benzyloksylowa, chlorobenzyloksylowa, wodór, grupy aminowe, czwartorzędowe grupy aminowe i grupy estrów kwasów tłuszczowych. Korzystnie, Y1 i Y2 są identyczne.

Struktura V

gdzie R1 i R2 dobiera się niezależnie z grupy, do której należą: grupy fenylowa, benzyloksylowa, chlorobenzyloksylowa, wodór, grupy aminowe, czwartorzędowe grupy aminowe i grupy estrów kwasów tłuszczowych. Korzystnie, R1 i R2 są identyczne.

Struktura VI R-, r.

175 446 gdzie Y1 i Y 2 dobiera się niezależnie z grupy, do której należą: grupy metoksylowe, etoksylowe, metylowe, etylowe, t-butylowe, chlor, brom, jod, grupy aminowe, czwartorzędowe grupy aminowe, grupy alkiloaminowe, dwualkiloaminowe i wodór; R1 i R2 dobiera się niezależnie z grupy, do której należą: grupy fenylowa, benzylok^sylowa, chlorobenzyloksylowa, wodór, grupy aminowe, czwartorzędowe grupy aminowe i grupy estrów kwasów tłuszczowych. Korzystnie, Y1 i Y2 są identyczne, jak również R1 i R2 są identyczne.

Struktura VII

Ph^ /Ph

gdzie Χ dobiera się z grupy, do której należą: grupy metoksylowe, etoksylowe, metylowe, etylowe, t-butylowe, chlor, brom, jod, grupy aminowe, czwartorzędowe grupy aminowe, grupy alkiloaminowe, dwualkiloaminowe i wodór; Y dobiera się z grupy, do której należą: grupy t-butylowe, czwartorzędowe grupy aminowe, grupy aminowe i wodór.

Struktura VIII

R

gdzie R1 i R2 dobiera się niezależnie z grupy, do której należą: grupy aryloksylowe, alkoksylowe, arylowe i wodór; R' i R dobiera się niezależnie z grupy, do której należą: grupy alkilowe, arylowe i wodór. Korzystnie, co najmniej jedna z grup aminowych jest protonowana w fizjologicznym pH (np. pH 7,3-7,8). Korzystne grupy alkilowe R' lub R stanowią, lecz nie są do nich ograniczone, grupy metylowa, etylowa i propylowa.

Korzystne grupy R1 lub R2 stanowią, lecz nie są do nich ograniczone, grupy benzyloksylowa i clilorobenzyloksylowa. Korzystne grupy alkoksylowe R1 i R2 stanowią, lecz nie są do nich ograniczone, grupy etoksylowa i metoksylową.

Korzystny podtyp struktury VIII stanowi poniższa struktura ΓΧ, jednakże struktura VIII nie jest do niej ograniczona:

Struktura K

R

NH₂ H₂N

175 446 gdzie R dobiera się z grupy, do której należą: grupy alkilowe i wodór. Korzystnie, co najmniej jedna z grup aminowych jest protonowana w fizjologicznym pH (np. pH 7,3-7,8).

Do wytwarzania środków farmaceutycznych według wynalazku korzystne są następujące rodzaje przeciwutleniających kompleksów salenu i metalu przejściowego, wymienione w opisie z nazwy i numeru struktury (np. od C1 do C30) dla większej jasności opisu.

Cli

175 446

C20

λ //

175 446

C22

C23

C25

C27

C28

Środki farmaceutyczne

Korzystne środki farmaceutyczne według wynalazku zawierają skuteczną dawkę leczniczą lub zapobiegawczą co najmniej jednego kompleksu na bazie pochodnej salenu z jonem metalu przejściowego. Termin salen stosuje się w opisie na określenie ligandów, typowo powstających w reakcji kondensacji dwóch cząsteczek pochodnej salicyloaldehydu z jedną cząsteczką pochodnej dwuaminy. Jakkolwiek ligandy salenu wytwarza się z pochodnych etylenodwuaminy, można stosować również aminy propylową lub butylową do

175 446 wytwarzania analogicznych salenów i pochodnych salenu. Pochodne salenu są korzystne, a ich ogólną strukturę przedstawiono na fig. 1. Pochodną salenu, dla której wartość n wynosi 0, przedstawiono na fig. 2.

Jak to przedstawiono na fig. 1, dwa atomy azotu i dwa atomy tlenu są zorientowane do centrum ligandu salenowego, tworząc w ten sposób miejsce kompleksowe dla jonu metalu przejściowego M. Korzystnie, ten jon metalu przejściowego dobiera się z grupy, do której należą: Mn, Cr, Fe, Ni, Co, Ti, V, Ru i Os. Korzystniej, jon metalu przejściowego dobiera się z grupy, do której należą: Mn, Mg, Cr, Fe, Ni i Co. Najkorzystniej, jon metalu stanowi Mn.

Anion dobiera się, korzystnie, z grupy, do której należą: PFó, (aiylo)ą, BF4, B(arylo)4, halogenki, octany, triflany, tosylany, przy czym halogenki lub PF6 są korzystniejsze, a chlorki są najkorzystniejsze.

Figura 1 przedstawia również liczne miejsca dostępne dla podstawienia na ligandzie salenowym. Uważa się, że spośród tych miejsc R1, R2, R3, R4 oraz Χ1, Χ2, Χ3, Χ4, Y3 i Yó są najważniejsze w tym pierwszym kompleksie salenu i metalu przejściowego.

Struktury I, III, IV, VI, VII i VIII mogą zawierać jako podstawniki niezależnie dobrane estry kwasów tłuszczowych w położeniach R1, R2, R3 i R4. Estry kwasów tłuszczowych, o ile są obecne, zajmują typowo nie więcej niż dwa położenia podstawnikowe i są zazwyczaj identyczne.

Przykłady kwasów tłuszczowych, odpowiednich do wytwarzania związków według wynalazku przedstawiono w poniższych tabelach I, II i III:

Tabela 1

Atom węgla	C^3-(CH2)f--CH=CH)_g-(CH2>CO2H
f	g	h	Nazwa kwasu
16	5	1	7	Palmitoleinowy
18	7	1	7	Oleinowy
18	10	1	4	Petroselenowy
18	5	1	9	Wakcenowy
18	3	3	7	Punicynowy
18	1	4	7	Parinarowy
20	9	1	7	Gadoleinowy
22	9	1	9	Cetoleinowy

Tabela 2

Atom węgla	CH3-(CH2)_n-(CH=CH-CH2)m-(CH2)p-CO2H
f	g	h	Nazwa kwasu
18	4	2	6	Linolowy
18	1	3	6	Linolenowy
20	4	4	2	Arachidonowy

Tabela 3

Atom węgla	CH3-(CH2)wCO2H
w	Nazwa kwasu
1	2	3
12	10	Laurynowy
14	12	Mirystynowy
16	14	Palmitynowy

ciąg dalszy tabeli na str 24

175 446 ciąg dalszy tabeli

1	2	3
18	16	Stearynowy
20	18	Arachidynowy
22	20	Dokozanowy

Jak wiadomo, kwasy nienasycone występują w formach izomerycznych z powodu obecności jednego lub więcej położenia nienasyconego. Związki stosowane w kompozycji według wynalazku mogą zawierać jeden izomer podwójnego wiązania, jak też mieszaninę izomerów. Estry kwasów tłuszczowych można otrzymać znanymi technikami acylowania. Por. np. March, Advanced Organic Chemistry, wyd. 3, John Wiley & Sons, Nowy Jork (1985), str. 299,348 - 351 i 353 - 354, które włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie.

Korzystne przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu przejściowego

Figura 3 przedstawia strukturę korzystnych przeciwutleniających kompleksów salenu i metalu przejściowego. Na fig. 3 przedstawiono przykładowe przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu przejściowego. Szczególnie korzystne do wytwarzania środków farmaceutycznych i innych środków przeciwutleniających są związki C1, C4, C6, C7, C9, C10, C11 i C12. Uważa się, że C7 jest szczególnie korzystny z powodu łatwego wytwarzania i względnie hydrofitowej natury, odpowiedniej do zastosowania farmaceutycznego.

Korzystny kompleks salenu i metalu przejściowego o wysokiej aktywności dysmutazy ponadtlenkowej stanowi związek C12 o strukturze:

( >

i

C30

175 446

Szczególnie korzystny przeciwutleniający kompleks salenu i metalu przejściowego stanowi C7:

C7:

Przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu przejściowego wykazują zwykle wykrywalną aktywność dysmutazy ponadtlenkowej i, korzystnie, wykazują również aktywność katalazy. Korzystnie, C7 jest zarówno prosty w wytwarzaniu, jak i względnie hydrofilowy; własności te czynią ten związek szczególnie odpowiednim do zastosowania farmaceutycznego i wytwarzania preparatów farmaceutycznych w roztworach wodnych. Względnie hydrofitową naturę C7 można, korzystnie, wykorzystać w wytwarzaniu przeciwutleniających kompleksów salenu i metalu przejściowego, łatwo wchłanianych i transportowanych w organizmie ludzkim. Jedną z korzystnych właściwości farmakokinetycznych C7 stanowi zdolność skutecznego przechodzenia przez barierę krew-mózg.

Wytwarzanie przeciwutleniających kompleksów salenu i metalu przejściowego

Kompleksy salenu i metalu przejściowego wytwarza się zasadniczo tak, jak to opisano w US91/01915, zgłoszonym 21 marca 1991, Fu i wsp. (1991) J. Org. Chem. 56:6497; Zhang W. i Jacobsen EN (1991) J. Org. Chem. 56:2296; Jacobsen i wsp. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113:6703; Zhang i wsp. (1990) J. Am. Chem. Soc. 112: 2801; Lee NH i Jacobsen EN (1991) Tetrahedron Lett. 32:6533, Jacobsen i wsp. (1991) J. AM. Chem. Soc. 113:7063; Lee i wsp. (1991) Tetrahedron Lett. 32:5055.

Ogólnie, najkorzystniejszym sposobem wytwarzania przeciwutleniających kompleksów salenu i metalu przejściowego według wynalazku jest przeprowadzenie reakcji kondensacji z podstawionym salicyloaldehydem i z podstawioną dwuaminą. Ogólnie, związki te, w odpowiedniej ilości, poddaje się reakcji w stosunku molowym 2:1 w bezwodnym etanolu. Roztwory poddaje się destylacji zwrotnej, typowo przez 1 godzinę, a ligand salenowy strąca się w analitycznie czystej postaci po dodaniu wody lub też kompleks metalu wytwarza się bezpośrednio przez dodanie metalu w postaci octanu, halogenku lub soli triflanowej.

Następująca procedura jest ogólnym sposobem wytwarzania przeciwutleniających kompleksów salen-Mn według wzoru:

Ph Ph

Ligand salenowy ponownie rozpuszcza się w gorącym bezwodnym etanolu dla uzyskania roztworu 0,1 M. Do jednej części dodaje się Mn(OAC)2 · 4H2O w postaci stałej (2,0 równoważniki), a następnie roztwór poddaje się destylacji zwrotnej przez 1 godzinę. Następnie dodaje się około 3 równoważniki LiCl w postaci stałej i mieszaninę podgrzewa się w celu prowadzenia destylacji zwrotnej przez kolejne 0,5 h. Ochłodzenie mieszaniny do temperatury 0°C powoduje wytrącenie się kompleksu Mn(III) w postaci ciemnobrązowych kryształów, które następnie płucze się obficie H 2O i wyizolowuje przez filtrację z wydajnością około 75%. Dodatkową ilość materiału można uzyskać, dodając kroplami

175 446

H 2O do cieczy macierzystej. Sumaryczna wydajność katalizatora w tym etapie wynosi około 80 - 95% i co najmniej około 80 - 90% całkowitej wartości z optycznie czystej 1,2-dwufenyloetylenodwuaminy.

Innym przykładem tego sposobu jest następujący sposób wytwarzania przeciwutleniających kompleksów salen-Mn: najkorzystniej, dwuaminę początkową stanowi R,R- lub S,S-1,2dwuamino-1,2-dwufenyłoetan, natomiast początkowy salicyloaldehyd stanowi 3-tertobutylosalicyloaldehyd. Roztwór 2,0 mmol 3-terto-butylosalicyloaldehydu w 3 ml bezwodnego alkoholu dodaje się kroplami do roztworu 1,0 mmol (R,R)-1,2-dwuamino-1,2-dwufenyloetanu w 5 ml etanolu. Mieszaninę reakcyjną podgrzewa się w celu prowadzenia destylacji zwrotnej przez 1 godzinę, a następnie do gorącego (60°C) roztworu dodaje się 1,0 mmol Mn(Oac)2 · 4H2O wjednej części. Zabarwienie roztworu po dodaniu go natychmiast zmienia się z żółtego na brązowy. Mieszaninę poddaje się destylacji zwrotnej przez następne 30 minut, a następnie ochładza do temperatury pokojowej. Następnie dodaje się kroplami 10% roztwór NaCl (5 ml) i mieszaninę poddaje się mieszaniu przez 0,5 h. Następnie rozpuszczalniki usuwa się w próżni, a pozostałość rozciera na proszek z 50 ml CH2-Cl2 i 50 ml H2O. Warstwę organiczną rozdziela się, a brązowy roztwór płucze nasyconym NaCl. Oddzielenie fazy organicznej i usunięcie rozpuszczalnika pozwala uzyskać materiał surowy, który można rekrystalizować z CóH/C^ dla uzyskania kompleksu (R,R)-salen-Mn.

Synteza przeciwutleniających kompleksów salenu i metalu przejściowego może być wykonywana rutynowo przez fachowców na podstawie cytowanych publikacji. ,

Aktywność SOD wytwarzanych kompleksów salen-Mn oznacza się standardowymi metodami oznaczania aktywności SOD znanymi w technice i podanymi przykładowo poniżej. Kompleksy salen-metal mające co najmniej 0,01 jednostki aktywności SOD na milimol/litr w roztworze wodnym są przeciwutleniającymi kompleksami salen-metal; przeciwutleniające kompleksy salen-metal mają korzystnie co najmniej 1 jednostkę aktywności SOD na mihmol/litr; a korzystniej co najmniej 100 jednostek aktywności SOD na milimol/litr; przy czym mają często od 500 do 1000 jednostek aktywności SOD na mM lub więcej. Do pewnych zastosowań medycznych, gdy aktywność katalazy jest korzystnie uzupełniana, jest korzystne, aby mimetyczny SOD kompleks salen-metal posiadał także wykrywalną aktywność katalazy (np. C4, C7, C9, C10, C11, C12); zwykłe co najmniej 10 jednostek aktywności katalazy na mM, często co najmniej 100 jednostek aktywności katalazy na mM.

Preparaty farmaceutyczne

Preparaty farmaceutyczne zawierające przeciwutleniający kompleks salenu i metalu przejściowego według niniejszego wynalazku są przydatne do podawania miejscowego i pozajelitowego, tj. podskórnie, pomięśniowo lub dożylnie. Stwierdzenie faktu, że kompleksy salen-metal mają aktywność SOD in vitro, a także działają in vivo wskazuje, że kompleksy salen-metal są odpowiednimi mimetykami SOD do zastosowań farmaceutycznych. Przeciwutleniające kompleksy salen-metal nadają się do podawania ssakom, a więc ludziom i zwierzętom.

Kompozycje do podawania pozajelitowego zawierają zwykle roztwór przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu przejściowego lub jego koktajl rozpuszczony w akceptowalnym nośniku, korzystnie w nośniku wodnym. Ponieważ wiele kompleksów salen-Mn według wynalazku jest lipofilowych, jest korzystne włączenie do nośnika bazy hydrofobowej (np. poli(glikolu etylenowego), Tween 20). Można stosować różne nośniki wodne, takie jak np. woda, buforowana woda, 0,4% solanka, 0,3% glicyna itp. Roztwory te są sterylne i nie zawierają substancji w postaci cząstek. Te kompozycje mogą być sterylizowane zwykłymi znanymi sposobami sterylizacji. Mogą one zawierać także substancje pomocnicze akceptowalne farmaceutycznie, potrzebne w celu przybliżenia do warunków fizjologicznych, takie jak środki do nastawiania pH i buforujące, środki nastawiające toksyczność itp., np. octan sodowy, chlorek sodowy, chlorek potiisowy, chlorek wapniowy, mleczan sodowy itp. Stężenie przeciwutleniającego kompleksu/kompleksów salenu i metalu przejściowego w tych preparatach może się zmieniać w szerokich granicach, tj. od poniżej

175 446

2'7 około 1 nM, zwykle co najmniej około 0,1 mM, nawet do 100 mM i jest dobierane przede wszystkim na podstawie objętości płynu, lepkości itp., zgodnie z konkretnym wybranym sposobem podawania. Najczęściej przeciwutleniający kompleks salenu i metalu jest obecny w stężeniu 0,1 mM do 10 mM. Np. typowy preparat do zastrzyków dożylnych zawiera sterylny roztwór przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu (np. C7) o stężeniu 5 mM w roztworze Ringera. Ogólnie hydrofobowy charakter niektórych korzystnych przeciwutleniającycO kompleksów salenu i metalu wskazuje na to, że może być użyte vehiculum hydrofobowe lub veOiculum wodne zawierające detergent lub inny środek lipoCiCowa (np. Tween, NP-40, PEG); alternatywnie można podawać przeciwutleniające kompleksy salenu jako zawiesinę na nośniku wodnym, lub jako emulsję.

Tak więc, typowa kompozycja farmaceutyczna do zastrzyków domięśniowych może być tak przygotowana, aby zawierała 1 ml sterylnej buforowanej wody i około 1 - 100 mg przeciwutleniającego kompleksu/kompleksów salenu i metalu przejściowego. Typowa kompozycja do infuzji dożylnych może zawierać 250 ml sterylnego roztworu Ringera i około 100 - 1000 mg przeciwutleniającego kompleksu/kompleksów salenu i metalu przejściowego. Do lipofilowych preparatów salenu i metalu można dodawać środki lipofilowe. Obecne sposoby wytwarzania kompozycji do podawania pozajelitowego są znane lub oczywiste dla fachowców i są opisane bardziej szczegółowo, np. w Remington' Pharmaceutical Science, 15. wyd., Mack PublisOing Company, Easton, Pennsylvania (1980), który włącza się do niniejszego opisu jako odnośnik. Typową kompozycję farmaceutyczną do podawania miejscowego można przygotować z odpowiednimi maściami skórnymi, kremami, płynami, maściami i roztworami ocznymi, aerozolami oddechowymi i innymi zarobkami. Zarobki powinny być chemicznie kompatybilne z przeciwutleniającym kompleksem/kompleksami salenu i metalu przejściowego, które są aktywnymi składnikami preparatu i ogólnie nie powinny zwiększać rozkładu, denaturacji lub agregacji aktywnego składnika/składników. Zarobki zawierają często składniki lipofilowe, takie jak oleje i emulsje lipidowe.

Przeciwutleniający kompleks/kompleksy salenu i metalu przejściowego można liofilizować w celu przechowywania i ponownie przenosić do odpowiedniego nośnika przed użyciem. Fachowcy wiedzą, że liofilizacja i ponowne przeniesienie może spowodować w różnym stopniu zmniejszenie aktywności przeciwutleniąjącej i że stosowane ilości powinny uwzględniać to zmniejszenie.

Kompozycje zawierające przeciwutleniający kompleks/kompleksy salenu i metalu przejściowego lub ich koktajle mogą być podawane w leczeniu profilaktycznym i/lub terapeutycznym. Podczas podawania terapeutycznego podaje się kompozycje osobnie już dotkniętej danym stanem chorobowym związanym z wolnymi rodnikami, w ilości wystarczającej do wyleczenia, lub co najmniej do częściowego zahamowania stanu i jego komplikacji. Ilość odpowiednia do wykonania tego zadania określa się jako 'dawkę skuteczną terapeutycznie lub dawkę skuteczną. Skuteczne ilości do tego zastosowania zależą od ciężkości stanu, ogólnego stanu chorego i sposobu podawania, ale zwykle są w zakresie od około 1 mg do około 10 g przebiwutCeniającego kompleksu/kompleksów salenu i metalu przejściowego na jedną dawkę, przy czym zwykle stosuje się dawki od 10 mg do 2000 mg na jednego chorego. Np. w leczeniu epizodów ostrego niedokrwienia mięśnia sercowego/reoksydacji można podawać układowo około 100 do 1000 mg przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu (np. Cl) metodą infuzji dożylnej; co najmniej około 10 mg do 500 mg przeciwutleniającego kompleksu/kompleksów salenu i metalu można podawać metodą zastrzyku wewnątrzosierdziowego w celu spowodowanie podwyższonych miejscowych stężeń aktywności SOD w mięśniu sercowym.

W zastosowaniach profilaktycznych, kompozycje zawierające przeciwutleniający kompleks/kompleksy salenu i metalu przejściowego lub jego koktajle podaje się choremu nie znajdującemu się jeszcze w stanie chorobowym w celu zwiększenia odporności chorego lub opóźnienia rozwoju choroby. Taką ilość nazywa się dawką skuteczną profilaktycznie. W takim zastosowaniu, dokładne ilości zależą ponownie od stanu zdrowia chorego i

175 446 ogólnego poziomu odporności, lecz zwykle znajdują się w zakresie od 1 mg do 10 g na dawkę, a zwłaszcza od 10 do 1000 mg na jednego chorego. Typowy preparat przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu, takiego jak C7, będzie zawierał od około 25 do około 250 mg kompleksu salenu i metalu w postaci jednostkowej dawki.

Jednorazowe lub wielokrotne podawanie kompozycji może odbywać się z zastosowaniem wielkości dawek i sposobu dawkowania ustalonych przez leczącego lekarza. W każdym razie, preparaty farmaceutyczne powinny zapewniać ilości przeciwutleniającego kompleksu/kompleksów salenu i metalu przejściowego według niniejszego wynalazku wystarczające do skutecznego leczenia chorego.

Można także stosować zestawy z przedmiotowym przeciwutleniającym kompleksem/kompleksami salenu i metalu przejściowego w ochronie przeciwko lub w terapii stanów chorobowych związanych z wolnymi rodnikami. Tak więc, przedmiotowa kompozycja według niniejszego wynalazku może występować, zwykle w postaci liofilizowanej lub w postaci wodnego roztworu w pojemniku, albo sama lub w połączeniu z dodatkowymi przeciwutleniającym kompleksem/kompleksami salenu i metalu przejściowego pożądanego rodzaju. Przeciwutleniający kompleks/kompleksy salenu i metalu przejściowego są zawarte w zestawach łącznie z buforami, takimi jak Tris, fosforan, węglan itp., stabilizatorami, biocydami, obojętnymi białkami, np. albuminą surowicy itp. i z kompletem instrukcji stosowania. Substancje te zwykle są obecne w ilości poniżej około 5% wagowych w przeliczeniu na ilość przeciwutleniającego kompleksu/kompleksów salenu i metalu przejściowego i zwykle występują w całkowitej ilości co najmniej około 0,001 % w przeliczeniu na stężenie. Często jest korzystne dodawanie obojętnego wypełniacza lub zarobki w celu rozcieńczenia aktywnych składników, przy czym zaróbka może występować w ilości od 5 -99,999% wagowych w przeliczeniu na całą kompozycję.

Kompleksy salen - Mn, korzystnie związek C12 lub C7, można dodawać do roztworu stosowanego do zatrzymania serca z obniżeniem temperatury w stężeniu co najmniej 1 mM do preparatu roztworowego według Amano i in. (1982), Japn. J. Surg. 12:87. Do roztworu kardioplegicznego najkorzystniej dodaje się C7.

Dawkowanie SOD-mimetycznego kompleksu/kompleksów salenu i metalu zmienia się w zależności od każdego konkretnego zastosowania. Kompozycję zwykle podaje się układowo albo miejscowo. Podawanie układowe może oznaczać podawanie doustne lub pozajelitowe; podawanie miejscowe obejmuje zastosowania in situ. In situ oznacza np. podawanie SOD-mimetycznego kompleksu salenu i metalu za pomocą płukania dużą jednorazową endoskopową dawką do płukania i/lub zastrzyku okołożylnego lub za pomocą wlewu w przypadku leczenia metodą GI. Sposoby pozajelitowe mogą obejmować np. podawanie podskórne, śródskórne, domięśniowe i dożylne. Ilość SOD-mimetycznego kompleksu/kompleksów salenu i metalu znajduje się w zakresie 2 - 5000 mg lub powyżej, na ogół 10 - 1000 mg, zależnie od przerw w podawaniu i sposobu podawania oraz może obejmować od pojedynczej dawki doustnej, dawki pozajelitowej i/lub dawki miejscowej do wielokrotnych dawek doustnych, dawek pozajelitowych i/lub dawek miejscowych w ciągu kilku dni lub powyżej 5 tygodni. Dawkowanie może się także zmieniać w zależności od stanu chorobowego.

W przypadku podawania in vitro i w celach badawczych stosuje się przeciwutleniający kompleks/kompleksy salenu i metalu przejściowego w celu modulowania ekspresji występujących naturalnie genów lub innych sekwencji polinukleotydowych w warunkach transkrypcji kontroli elementu odpowiedzi na stres utleniający [np. przeciwutleniającego elementu odpowiedzi ARE (ARW - antioxidant response element)], takiego jak przeciwutleniający element odpowiedzi genu glutationowego, genu S-transferazy lub genu reduktazy NAD (P) H: chinon (Rozen i in., 1992, Arch. Biochem. Biophys. 292: 589.; Favreau i Pickett (1990) J. Biol. Chem.: 266: 4556; Rushmore i Pickett (1990) Methods Enzymol. 206: 409; Rushmore i Pickett (1990) J. Biol. Chem. 265: 14648; Keyse i in., (1992) Nature 359: 644. Transgeny, homologiczne konstrukty rekombinacyjne i epizomalne układy ekspresji (np. wektory ekspresji oparte na wirusach) zawierające sekwencję

175 446 polinukleotydową pod kontrolą jednego lub kilku ARE połączonych z promotorem mogą być przygotowywane przez fachowców sposobami znanymi w tej dziedzinie, jak również transformowane komórki i transgeniczne nieludzkie zwierzęta będące siedliskiem takich polinukleotydowych konstruktów. Przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu mogą być stosowane do modulowania transkrypcji regulowanych przez ARE sekwencji polinukleotydowych w hodowlach komórek (np. komórek ES) lub w nietkniętych zwierzętach, a zwłaszczzr w zwierzętach transgenicznych, w których transgen obejmuje jeden lub kilka ARE jako transkrypcyjne sekwencje regulacyjne. W wypadku! hodowli transformowanych lub transgenicznych komórek generuje się krzywą odpowiedzi na dawkę przez miareczkowanie szybkości transkrypcji sekwencji polinukleztyZowej kontrolowanej przez ARE względem rosnących stężeń przeciwutleniającego kompleksu/kompleksów salenu i metalu, który zmniejsza szybkość transkrypcji wywOlaną przez środki utleniające (np. nadtlenek benzoilu, środek powodujący ubytek glutationu) lub stres utleniający. I odwrotnie, duże zawartości SOD-mimetycznych kompleksów salenu i metalu mogą powodować utleniający stres i tworzenie się wolnych rodników. Podobne miareczkowanie odpowiedzi na dawkę można wykonać na zwierzętach transgenicznych, takich jak transgeniczne myszy, będące siedliskiem sekwencji transgenicznej kontrolowanej przez ARE.

Podawanie in vivo

Terapeutycznie lub farmaceutycznie skuteczną ilość przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu przejściowego podaje się choremu w celu leczenia lub zapobiegania stanom chorobowym związanym z działaniem wolnych rodników. Wymagana dawka zależy od rodzaju stanu chorobowego wywołanego przez wolne rodniki, ciężkości i przebiegu choroby, poprzedniej terapii, stanu zdrowia chorego i odpowiedzi na przeciwutleniający kompleksu salenu i metalu oraz oceny prowadzącego lekarza. Zwykle podaje się co najmniej jedną substancję przeciwutleniającego kompleksu salen - Mn jaOojd^d^^^ny słdddnikaktywny lub w kombinacji z jednym lub z kilkoma innymi składnikami aktywnymi, zwykle wybranymi z grupy obejmującej takie związki, jak N-merkaptopropZonyloglicyda, N-acetylocysteida, glutation, dimetylotiomocznik, Ze8ferrioksamida, mannitol, α-tokorefol, askorbinian, alłopurynol, 21-amino8trrzzizly, inhibitory kalpainy, związki antagonisty^z^ receptorów glutaminianu, plasminogenowy aktywator tkanki, streptokidara, urokinaza, die8teroiZony czynnik przeciwzapalny, kortyzon i karotenoidy. Przeclwutlediające kompleksy salen - Mn można także podawać razem z polipeptydami mającymi aktywność SOD i/lub katalazy, zwłaszcza wobec zdolności kompleksów salen - Mn, wpreeciwieństwie do polipeptydów SOD, do przekraczania bariery krew -mógg uuppełnin.nia układowego podawania SOD.

Niniejszy wynalazek znajduje zastosowanie w leczeniu chorych, cierpiących na stany chorobowe związane z wolnymi rodnikami, za pomocą profilaktycznie skutecznej lub terapeutycznie skutecznej ilości przeciwutlediającego kompleksu salenu i metalu przejściowego, zwykle kompleksu salen - Mn,Oord8stni e C7 ©pposób ten mzeenyćstepgwdny w leczeniu chorych w różnych stadiach ich stanów chorobowych lub w celu zapobieżenia rozwojowi stanów chorobowych związanych z wolnymi rodnikami. Ponadto, leczenie można stosować w celu zapobiegania lub zmniejszenia, jako środek profilaktyczny, związanemu z wiekiem prawdopodobieństwu rozwoju nowotworu i/lub związanej z wiekiem umieralności i/lub szybkości starzenia się.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierające przeciwutleniające kompleksy salmu i metalu można podawać chorym, którzy są zarażeni wirusem braku odporności u ludzi (np. wirusem HlV-i) lub są narażeni na zakażenie się tym wirusem. Przeciwutlrdlające kompleksy salen - metal, przykładowo CC, mogą zapobiegać indukcji lub hamować indukcje namnażania HIV-i w limfocytach CD4+ o współczynnik martwicy nowotworu (TNF) (TNF - tumor decro8ic factor) i/lub zapobiec uszkodzeniu lub śmierci komórek: CD4+ w konsekwencji infekcji HIV-i. Bez ograniczania się szczególną teorią namnażania HIV-i lub patogenezy HIV-i, uważa się, że podawanie przeciwutleniającego

175 446 kompleksu salenu i metalu, takiego jak C7, może hamować i/lub zwalniać rozwój patologii związanej z HIV-1 i/lub zmniejszyć szybkość ubytku populacji limfocytów CD4 * u osób zarażonych HIV. Przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu, takie jak C7, mogą także hamować patologię wynikającą z nadmiernych lub nieodpowiednich zawartości tNf, zarówno podczas AIDS jak i w innych stanach (np. w przypadku wstrząsu septycznego). Często podaje się dawkę 50 - 5(0)0 mg choremu z HIV i/lub z nadmierną lub nieodpowiednią zawartością TNF albo w pojedynczej dawce lub w wielokrotnych dawkach, w celu zmniejszenia lub opóźnienia rozwoju choroby i objawów klinicznych. Przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu można podawać terapeutycznie w celu leczenia chorób wirusowych innych niż HIV.

Ponieważ uszkodzenie utleniające występuje proporcjonalnie do ilości wolnych rodników i substancji z reaktywnym tlenem, oczekuje się, że podawanie przeciwutleniających kompleksów salenu i metalu przejściowego nawet w małych ilościach spowoduje ochronne działanie przeciwko uszkodzeniu utleniającemu; uważa się, że nie ma progowej wartości, poniżej której przeciwutleniające kompleksy salenu - Mn są niesuueczzne.

Zazwyczaj, podczas leczenia stanów chorobowych związanych z wolnymi rodnikami odpowiednia skuteczna dawka przeciwutleniającego kompleksu salenu i Mn będzie w zakresie 0,01 -1000 mg na kg wagi ciała osoby na dzień, korzystnie w zakresie 1 -100 mg na kg wagi ciała na dzień. Pożądaną dawkę rozkłada się korzystnie na dwie, trzy, cztery lub większą liczbę poddawek podawanych w odpowiednich odstępach czasu w ciągu całego dnia. Te poddawki można podawać w postaci jednostkowych dawek, np. zawierających od 5 do 10000 mg, korzystnie od 10 do 1000 mg składnika aktywnego na jedną postać dawkowania.

Stosowana w tym leczeniu kompozycja może mieć różne postacie. Są to np. postacie stałe, półstałe i ciekłe, takie jak tabletki, pigułki, proszki, ciekłe roztwory lub zawiesiny, preparaty liposomowe, roztwory do zastrzyków i wlewów. Korzystna postać zależy od przewidywanego sposobu podawania i zastosowania leczniczego. Zwykle podaje się dożylnie sterylny roztwór kompleksu salenu i metalu w wodnym rozpuszczalniku (np. w solance). Kompozycje zawierają także korzystnie zwykłe, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i środki pomocnicze, znane fachowcom. Patrz np. Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.: Easton, PA, 17-te wydanie (1985). Zwykle podawanie odbywa się doustnie lub pozajelitowo (włącznie z podawaniem podskórnym, domięśniowym, dożylnym i śródskórnym) lub też przez nakładanie miejscowe lub wlew do jamy ciała, lub też jako roztwór do zmywania tkanek podczas zabiegu chirurgicznego.

Jest oczywiście zrozumiałe, że kompozycje według wynalazku mogą być stosowane w połączeniu z innymi środkami przeciwutleniającymi, które wykazują aktywność SOD, aktywność katalazy, aktywność GSH-Px lub które są zmiataczami wolnych rodników lub inhibitorami tworzenia się wolnych rodników. Jakkolwiek można podawać samą kompozycję według wynalazku, to uważa się za korzystne podawanie jej jako część preparatu farmaceutycznego. Kompozycje według wynalazku zawierają w terapeutycznie lub farmaceutycznie skutecznej dawce co najmniej jeden związek łącznie z jednym lub kilkoma akceptowanymi farmaceutycznie lub terapeutycznie nośnikami i ewentualnie z innymi składnikami terapeutycznym. Zagadnienia te omówiono np. w Gilman i in. (redaktorzy) (1990) Goodman and GilmanS: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8. wydanie, Pergamon Press; i Remington', jak powyżej, każde z nich niniejszym włącza się do niniejszego opisu jako odnośniki. Omówiono tam sposoby podawania, np. podawanie doustnie, dożylne, dootrzewnowe i domięśniowe, i inne. Akceptowanymi farmaceutycznie nośnikami są następujące substancje: woda, solanka, bufory i inne związki, opisane np. w Merck Index, Merck & Co., Rahway, NJ., który włącza się do niniejszego opisu jako odnośnik.

Kompozycje farmaceutyczne podaje się pozajelitowo lub doustnie w leczeniu profilaktycznym i/lub terapeutycznym. Kompozycje farmaceutyczne można podawać w różnych postaciach dawkowania jednostkowego, zależnie od sposobu podawania. Np. postacie dawkowania odpowiednie do podawania doustnego obejmują proszek, tabletki, pigułki, kapsułki i drażetki.

175 446

Kompozycje farmaceutyczne są często podawane dożylnie. Tak więc, niniejszy wynalazek obejmuje kompozycje do podawania dożylnego, takie jak roztwór związku rozpuszczonego lub zawieszonego w akceptowanym nośniku, korzystnie w nośniku wodnym. Można stosować różne nośniki wodne, np. wodę, bufory wodne, 0,4% solankę itp. Często można rozpuścić przeciwutlsniający kompleks/kompl-ksy salsnu i metalu, takie jak C7 lub C12, w rozpuszczalniku organicznym (np. w dimstylosulfotlenku) i albo stosować bezpośrednio, albo rozcieńczać w rozpuszczalniku wodnym. Zwykle, te prz-ciwutlenrająu- kompleksy salsnu i metalu, które są stosunkowo lipofilowe (np. C9, C12), rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym, takim jak DMSO i, jeśli to jest pożądane, następnie rozcieńcza się je w bardziej polarnym rozpuszczalniku, takim jak woda. Te kompozycje są sterylizowane niekiedy za pomocą zwykłych znanych metod sterylizacji lub też mogą być sączone stsrylnis. Otrzymane wodne roztwory można pakować jako takie lub liofilizować je, przy czym preparat liofilizowany przed podawaniem łączy się ze sterylnym wodnym roztworem. Kompozycje mogą zawierać akceptowane farmaceutycznie substancje pnmouniuz-, potrzebne do przybliżenia ich do warunków fizjologicznych, takie jak środki do nastawiania pH i środki buforujące, środki do nastawiania tomczności, środki zwilżając- itp., np. octan sodowy, mleczan sodowy, chlorek sodowy, chlorek potasowy, chlorek wapniowy, monolaurynian sorbitu, nleinian tristanoloaminy itp.

Do kompozycji w postaci stałej można stosować zwykłe nietoksyczne stałe nośniki, takie jak np. farmaceutyczne odmiany mannitu, laktoza, skrobia, stearynian magnezowy, sacharyna sodowa, talk, celuloza, glikoza, sacharoza, węglan magnezowy itp. Do podawania doustnego przygotowuje się akceptowaną farmaceutycznie kompozycję nietoksyczną w wyniku dodania dowolnych spośród zwykle stosowanych zarobek, takich jak wymienione powyżej nośniki, do zwykle od 0,001 do 95% składnika aktywnego, korzystnie około 20%.

Kompozycje zawierające związki mogą być podawane w leczeniu profilaktycznym lub terapeutycznym. W zastosowaniach terapeutycznych podaje się kompozycje choremu uisrpiącsmu już na opisane powyżej stany chorobowe, w ilości wystarczającej do wyleczenia lub co najmniej do częściowego zatrzymania objawów stanu chorobowego i powikłań. Ilość odpowiednią do tego celu określa się jako ilość lub dawkę skuteczną terapeutycznie. Skuteczne ilości w tym zastosowaniu zależą od ciężkości stanu chorobowego i od wagi oraz ogólnego stanu chorego.

W zastosowaniach profilaktycznych podaje się kompozycje według wynalazku choremu podatnemu na zachorowanie. Taką ilość określa się jako ilość lub dawkę skuteczną profilaktycznie. Dokładne ilości w tym zastosowaniu zależą ponownie od stanu chorego i od jego wagi.

Do kompozycji w postaci stałej można stosować zwykle nietoksyczne stałe zarobki, takie jak np. farmaceutyczne odmiany mannitu, laktoza, skrobia, stearynian magnezowy, sacharyna sodowa, talk, celuloza, glikoza, sacharoza, węglan magnezowy itp. Związek aktywny określony powyżej może być użyty do wywarzania czopków z zastosowaniem jako nośnika np. triglicsrydów, np. Wrteptnli. Ο-Η- kompozycje do podawania farmaceutycznego mogą być np. przygotowane przez rozpuszczenie, rozproszeni- itp. określonego powyżej składnika aktywnego i ewentualnych pomocniczych środków farmaceutycznych w zaróbcs, takiej jak np. woda, solanka, wodny roztwór dekstrozy, gliceryna, etanol itp., przy czym wytwarza się roztwór lub zawiesinę. Jeśli to jest pożądane, kompozycje farmaceutyczne, które mają być podawane, mogą zawierać także mniejsze ilości nietoksycznych substancji pomocniczych, takich jak środki zw.ilzające lub emulgujące, środki buforując- wartość pH itp, np. octan sodowy, monolaurynian sorbitu, octan sodowy tristanoloaminy, olsiman trietanoloaminy itp. Stosowane obscnis sposoby przygotowywania takich postaci dawkowania są znane lub są oczywiste dla fachowców; patrz np. Remington' Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17. wydanie, 1985. Przeznaczona do podawania kompozycja lub preparat zawiera w każdym razie skuteczną ilość aktywnego związku/związków.

175 446

Do podawania doustnego otrzymuje się akceptowaną farmaceutycznie nietoksyczną kompozycję w wyniku wprowadzenia jednej ze zwykle stosowanych zarobek, takich jak np. farmaceutyczne odmiany mannitu, laktoza, skrobia, stearynian magnezowy, talk, celuloza, glikoza, sacharoza, węglan magnezowy itp. Takie kompozycje mają postać roztworów, zawiesin, tabletek, kapsułek, proszków, preparatów o przedłużonym działaniu itp. Takie kompozycje mogą zawierać od 0,01 do 95% aktywnego składnika, korzystnie od 1 do 70.

Podawanie pozajelitowe odbywa się zwykle za pomocą zastrzyków, podskórnie, domięśniowo lub dożylnie. Płyny do zastrzyków można przygotowywać w zwykłych postaciach, albo jak ciekłe roztwory lub zawiesiny, jako stałe postaci odpowiednie do wytwarzania roztworu lub zawiesiny w cieczy przed użyciem, albo jako emulsje. Odpowiednimi zarobkami są np. następujące substancje: woda, solanka, dekstroza, gliceryna, etanol itp. Ponadto, jeśli to jest pożądane, kompozycje farmaceutyczne, które mają być podawane, mogą zawierać także mniejsze ilości nietoksycznych substancji pomocniczych, takich jak środki zwilżające lub emulgujące, środki buforujące wartość pH itp, takie jak np. octan sodowy, monolaurynian sorbitu, oleinian trietanoloaminy itp.

Opracowany ostatnio sposób podawania pozajelitowego stosuje wszczepienie systemu zwalniającego lub opóźniającego uwalnianie, dzięki czemu utrzymuje się stały poziom dawkowania. Patrz np. patent US nr 3,710,795, który włącza się do niniejszego opisu jako odnośnik. Przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu mogą być podawane w postaci plastra przezskórnego (np. przenoszenie jontoforetyczne) do stosowania miejscowego lub układowego.

Po uzyskaniu zauważalnej poprawy stanu chorego stosuje się dawkę podtrzymującą, jeśli to jest potrzebne. Następnie można zmniejszyć dawkę lub częstość podawania, lub oba te czynniki, w funkcji objawów, do poziomu, przy którym utrzymuje się poprawa stanu. Leczenie można przerwać, gdy objawy ustąpiły w pożądanym stopniu. W dłuższym okresie czasu chorzy mogą wymagać jednak przerywanego leczenia przy nawrocie objawów stanu chorobowego lub jako środek profilaktyczny w celu zapobieżenia powrotowi tych objawów.

Przeciwutleniający kompleks/kompleksy salenu i metalu może być także dodawany do wynaczynionej krwi do transfuzji, aby zapobiec uszkodzeniu komórek i składników krwi przez oksyrodniki podczas przechowywania; podobnie, przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu mogą także zmniejszać oksyrodnikowe uszkodzenie komórek krwi in vivo.

Przebiwutleniający kompleks/kompleksy salenu i metalu może być także dodawany do roztworów do mycia i przechowywania narządów i tkanek, takich jak np. stosowane przy transplantacji narządów lub do mycia chirurgicznego. Np. wycięte narządy często umieszcza się w roztworze konserwującym przed transplantacją u biorcy. Włączenie co najmniej jednej substancji typu przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu do roztworu konserwującego, zwykle w stężeniu od około 0,01 mM do 10 mM, jest pożądane w celu zmniejszenia uszkodzenia powodowanego przez niedokrwienie podczas przechowywania i uszkodzenia powodowanego reperfuzją po reimplantacji u biorcy. Do dodawania do nich kompleksu salenu i metalu są odpowiednie różne roztwory opisane w technice, włącznie z opisanymi, ale nie tylko z nimi, w patencie US nr 5,145,771; Beyersdorf (1990) Chem. Absrr. 113: 84849 w; i w patentach US nr nr 4,879,283, 4,873,230 i 4,798,824, które włącza się do niniejszego opisu jako odnośniki.

Przeciwutleniający kompleks salenu i metalu jest zwykle obecny w roztworze do mycia lub przechowywania w stężeniu od około 10 uM do około 10 mM, a najczęściej około 1 mM. Np., jednak bez ograniczania wynalazku, odpowiedni roztwór do mycia zawiera roztwór Ringera (102 mM NaCl, 4 mM KCl, 3 mM CaCl2, 28 mM mleczanu sodowego, pH 7,0) lub roztwór Ringera z dodatkiem 0,01 mM adenozyny oraz przeciwutleniający kompleks C7 salenu i Mn o końcowym stężeniu 1 mM. Roztwór do mycia może zawierać dodatkowe przebiwztleniacze (np. glutation, alopurinol). Roztwory do przechowywania lub mycia zawierające przeciwutleniający kompleks salenu i metalu można stosować do lepszego przechowywania lub mycia narządów (np. nerki, wątroby, trzustki,

175 446 nerwowej tkanki płodowej, serca, przeszczepów naczyniowych, kości, wiązadła, skóry), przy czym uważa się, że poprawia to żywotność tkanki i zwiększa odporność na utleniające uszkodzenie (np. w konsekwencji niedokrwienia/reperfuzji).

Bez wiązania się szczególną teorią działania przeciwutleniacza lub teorią katalitycznego działania zmiatacza oksyrodników, uważa się, że nadmierne dawki lub stężenia katalitycznego kompleksu/kompleksów salenu i metalu mogą nawet wytwarzać wolne rodniki, takie jak ponadtlenek, być może w sposób analogiczny do obecności dużych ilości krążącego wolnego żelaza. Na tej podstawie uważa się, że należy unikać długotrwałego podawania nadmiernych dawek kompleksów salenu i metalu w terapii przeciwutleniającej. Jednakże uważa się także, że podawanie nadmiernych dawek aktywnego katalitycznie kompleksu salenu i metalu może być korzystnie stosowane do generowania wolnych rodników, takich jak ponadtlenek, na powierzchniach miejscowych (np. w leczeniu trądziku, leczeniu- raka skóry, brodawczaków) lub w hodowlach komórek lub u zwierząt transgenicznych będących siedliskiem transgenu pod transkrypcyjną kontrolą ARE. W celu zwiększenia generowania wolnych rodników (np. ponadtlenku) może być korzystne poddawanie powierzchni miejscowych, hodowli komórek lub zwierząt transgenicznych działaniu środowiska hiperbarycznego i/lub atmosfery wzbogaconej w tlen (tj. zawierającej więcej niż około 21% cząsteczkowego tlenu).

Zdolność przeciwutleniających kompleksów salenu i metalu do katalizowania rozkładu substancji zawierających aktywny tlen można korzystnie wykorzystać do zahamowania lub zwolnienia uszkodzeń tkanek i komórek biologicznych. Np. nadtlenek benzoilu stosuje się szeroko w leczeniu zmian trądzikowych; nadmierne lub nieodpowiednie stosowanie nadtlenku benzoilu (np. przypadkowe nałożenie go na oczy) można zneutralizować przez miejscowe (lub, jeśli to jest pożądane, układowe) podanie przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu (np. C7). Podobnie można zmniejszyć spowodowane przez oksyrodnik uszkodzenie tkanek łącznych (np. kolagenu), które mają być wystawione na działanie światła UV, dymu papierosowego lub na starzenie się, przez podawanie przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu, mniej więcej równocześnie z wystawieniem na działanie światła UV, dymu papierosowego lub innego procesu generującego oksyrodniki (np. na starzenie komórkowe).

Ochrona chemiczna i ochrona przed promieniowaniem

Przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu, zwykle przeciwutleniające kompleksy salenu i manganu, takie jak związek C7, stosuje się w celu ochrony komórek i tkanek przed działaniem, czynników wytwarzających wolne rodniki, takich jak promieniowanie jonizacyne i środki chemioterapii (np. bleomycyny). Korzystnie, podaje się ochronną dawkę zawierającą co najmniej około 1 μ g kompleksu salenu i Mn na kg wagi ciała, jednym lub kilkoma sposobami (np. doustnie, dożylnie, dootrzewnowe, przez płukanie żołądka, przez wlew, infuzję żyły wrotnej, miejscowo lub przez inhalację mgły), korzystnie przez wstrzyknięcie liposomów lub immunoliposomów dla celowego dostarczenia przeciwutleniających kompleksów salenu i manganu w celu ochrony normalnych komórek, np. przed toksycznością wolnorodnikową zwiąimną z chemioterapią lub radioterapią nowotworu. Przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu przejściowego podaje się choremu wstępnie przed rozpoczęciem chemioterapii i/lub radioterapii, zwykle na około 24 godziny przed rozpoczęciem, a korzystnie na około 3 do 6 godzin przed rozpoczęciem chemioterapii i/lub radioterapii. Przeciwutleniający kompleks salenu i Mn można podawać choremu w ciągu całego leczenia.

Roztwór przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu można kapsułkować np. w micelach, z wytwarzaniem immunoliposomów (patenty Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 5043164, 4957735, 4925661; Connor i Huang (1985), J. Cell Biol. 101: 582; Lasic DD (1992) Nature 355: 279; Novel Drug Delivery (redaktorzy Prescott LF i Nimmo WS. Wiley, Nowy Jork, 1989); Reddy i in. (1992) J. Immunol. 148:1585. Immunoliposomy zawierające przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu mają ugrupowanie docelowe

175 446 (np. monoklonalne przeciwciało), które kieruje immunoliposomy na komórki nowotworowe, które w przeciwnym razie są wrażliwe na radioterapię lub chemioterapię. Np. immunoliposomy mające monoklonalne przeciwciało, które wiąże się specyficznie z krwiotwórczym antygenem komórki macierzystej nieobecnym na komórkach rakowych osoby, mogą być użyte do kierowania przeciwutleniających kompleksów salenu i metalu na krwiotwórcze komórki macierzyste i w ten sposób mogą ochraniać wymienione komórki macierzyste przed działaniem radioterapii lub chemioterapii stosowanej w leczeniu raka. Taką strategię stosuje się korzystnie w przypadku, gdy środek chemioterapeutyczny tworzy wolne rodniki in vivo (np. bleomycyna).

Przeciwutleniające kompleksy salenu i Mn podaje się także w celu zapobieżenia uszkodzeniu radiacyjnemu lub uszkodzeniu chemicznemu przez środki generujące wolne rodniki. Personelowi wojskowemu i osobom pracującym w przemyśle jądrowym, medycynie jądrowej i/lub w przemyśle chemicznym można podawać profilaktycznie kompleksy salenu i Mn. Przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu można stosować także jako chemiczne środki ochronne w celu zapobiegania chemicznemu powstawaniu raka; w szczególności spowodowanemu przez czynnik rakotwórczy, który tworzy reaktywne pośrednie związki epoksydowe (np. benzo[a]-piren, benzantracen) lub przez czynnik rakotwórczy lub czynniki promujące bezpośrednio lub pośrednio tworzenie się wolnych rodników (np. fenobarbital, TPA, nadtlenek benzoilu, proliferaty peroksysomu; cyprofibrat, klofibrat). Osoby wystawione na działanie takich chemicznych środków rakotwórczych poddaje się wstępnemu leczeniu za pomocą przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu w celu zmniejszenia zapadalności lub ryzyka rozwoju nowotworu.

Przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu mogą być także wprowadzane do bazy lipofilowej (lub, jeśli to jest pożądane, do wodnego nośnika) w celu miejscowego stosowania w kosmetykach lub przeciwsłonecznych kremach i płynach. Typowy krem kosmetyczny lub przeciwsłoneczny zawiera od około 1 mg do 50 mg przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu na gram kosmetyku lub przeciwsłonecznego kremu lub płynu.

Przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu mogą być podawane także nurkom głębokościowym i osobom wystawionym na środowisko hiperbaryczne, gdy toksyczność tlenowa stanowi zagrożenie dla zdrowia. Podawanie osobom skutecznej dawki przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu może umożliwić oddychanie gazami hiperbarycznymi i/lub wzbogaconymi w tlen ze zmniejszeniem zagrożenia toksycznością tlenową. Uważa się także, że podawanie skutecznej dawki przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu może zmniejszyć toksyczność i uszkodzenie biologiczne związane z wystawieniem na działanie ozonu. Profilaktyczne podawanie przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu osobom wystawionym na działanie ozonu lub osobom, które mają być wystawione na takie działanie, powinno nadawać podwyższoną odporność na toksyczność ozonu, taką jak wywiane przez ozon uszkodzenie płuc obserwowane w strefach geograficznych o dużej zawartości ozonu (np. w Los Angeles).

Użyteczność, metody badania i podawanie

Przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu przejściowego, korzystnie kompleksy salenu i Mn, są użyteczne w leczeniu w celu ochrony przed niedokrwistym uszkodzeniem w stanach sercowych i niesercowych, włącznie z zawałem mięśnia sercowego, niewydolnością zastoinową serca, dusznicą bolesną, niemiarowością, zaburzeniemi krążeniowymi i udarem. Związki te hamują szkodliwe skutki niedokrwistości (zawał wieńcowy i reperfuzja serca; przejściowa niedokrwistość mięśnia sercowego lub CNS podczas operacji) bez bezpośredniego tłumienia kurczliwości mięśnia sercowego. Związki te są zatem skuteczne na zwierzęcych modelach sercowo-naczyniowych i CNS stanów chorobowych i będą użyteczne w leczeniu zawału mięśnia sercowego, udaru, uszkodzenia mózgu i operacjach przeszczepiania, w szczególności z reperfuzją miejsc zawałowych, niemiarowości, bolesnej dusznicy nocnej i dusznicy spowodowanej wysiłkiem fizycznym, niewydolności zastoinowej serca, udaru i innych zaburzeń krążeniowych, u ssaków, a zwłaszcza ' u ludzi. Przeciwutleniające kompleksy

175 446 salenu i manganu są stosowane jako dodatek do roztworów konserwujących stosowanych do mycia wyciętych narządów (np. serca, nerki, trzustki, wątroby, płuca) podczas przenoszenia i przechowywania wyciętego narządu przed operacją transplantacji, włącznie z przeszczepami skóry i przeszczepami rogówki. Roztwory konserwujące zwykle będą zawierać co najmniej około 1 μ M przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu, korzystnie co najmniej około 1 μ M przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu.

Podawanie aktywnego związki i soli może się odbywać dowolnym sposobem dodawania środków terapeutycznych. Sposoby te obejmują podawanie doustne, pozajelitowe, śródskórne, podskórne i inne sposoby układowe.- Korzystnym sposobem podawania jest podawanie doustne, z wyjątkiem tych przypadków, gdy osoba nie może połykać sama leków. W takich przypadkach może okazać się konieczne pozajelitowe podawanie kompozycji. Jeśli kompozycja zawiera przeciwutleniającą substancję salenu i metalu mającą podstawnik aminowy, który może być protonowany przy fizjologicznym pH, to zwykle jest korzystne, aby przeciwutleniający kompleks salenu i metalu był rozpuszczony lub zawieszony w roztworze o takim pH, przy którym zachodzi protonacja podstawnika aminowego.

Dość podawanego związku aktywnego zależy oczywiście od leczonej osoby, wagi jej ciała, ciężkości choroby, sposobu podawania oraz oceny prowadzącego lekarza. Jednakże, skuteczna dawka jest w zakresie od 0,01 do 50 mg/kg/dzień, korzystnie od 0,5 do 25 mg/kg/dzień. W przypadku przeciętnej osoby o wadze 70 kg daje to ilość od 0,7 do 3500 mg na dzień, lub korzystnie od około 35 do 1750 mg na dzień.

Ponieważ wszystkie efekty działania niniejszych związków salenu i Mn uzyskuje się według podobnego mechanizmu, to dawki i postacie podawania są w tym samym ogólnym i korzystnym zakresie dla wszystkich zastosowań.

Zadaniem następujących przykładów jest przedstawienie wynalazku, jednak bez jego ograniczania.

Przykłady doświadczalne Aktywności katalityczne in vitro

Oznaczono katalityczne aktywności przeciwutleniające kompleksów C1, C4, C6, C7, C9, C11 i C12 salenu i Mn (patrz fig. 3); aktywności ponadtlenowej dysmmutazy i katalazy oznaczano poniższą metodą.

Test

Aktywność SOD związków oznaczano przez ocenę hamowania redukcji cytochromu C wytworzonego przez system generujący wolne rodniki tlenowe: ksantyna plus oksydaza ksantynowa. Redukcję cytochromu C śledzono spektrofotometrycznie przy 550 nm sposobem opisanym przez Darr i in. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 258: 351. Stężenie oksydazy ksantynowej nastawia się tak, aby otrzymać szybkość redukcji cytochromu C przy 50 nm równą 0,025 jednostek absorbancji na minutę. W tych warunkach określa się jako jednostkę aktywności ilość aktywności SOD potrzebną do zahamowania szybkości redukcji cytochromu C o 50% (tj. do szybkości odpowiadającej 0,0125 jednostkom absorbancji na minutę). Kompleksy salenu i metalu identyfikuje się jako przeciwutleniacze, jeśli mają co najmniej 0,1 jednostki aktywności przy stężeniu 1 mM w tych znormalizowanych warunkach testu.

Aktywność katalazy mierzono metodą spektrofotometryczną, w której śledzono rozkład nadtlenku wodoru przy 240 nm według Aebi i in. (1984) Methods Enzymolog. 105: 121, który włącza się do niniejszego opisu jako odnośnik. Jednostkę aktywności katalazy określa się jako ilość enzymu (lub kompleksu salenu i metalu) potrzebną do rozłożenia 1 μ mola nadtlenku wodoru w ciągu jednej minuty.

Każdy ze związków przygotowywano w solance i każdy był trwały bez obserwowanej utraty stabilności po kilku tygodniach przechowywania w temperaturze pokojowej. Często jest pożądane rozpuszczenie kompleksu salenu i metalu najpierw w rozpuszczalniku organicznym (np. w DMSO) i następne rozcieńczenie roztworu do mniej polarnego rozpuszczalnika,

175 446 takiego jak woda. Jest to szczególnie korzystne w przypadku takich substancji salen - metal, które są bardziej hydrofobowe (np. C12).

Tabela IV pokazuje aktywności in vitro SOD i aktywności katalazy różnych testowanych kompleksów salen - Mn. Aktywności SOD i katalazy wyrażono w jednostkach/mM.

Tabela IV

Kompleks selen - Mn	Aktywność SOD	Aktywność katalazy
C1	308	262
C4	312	200
C6	812	0
C7	575	200
C9	111	20
C10	69	179
C11	101	46
C12	4397	144

Aktywności biologiczne in vivo

Szeroko stosowany test do oznaczania terapeutycznych zdolności cząsteczek w niedokrwistości mózgu (w udarze) polega na ocenie ich zdolności zapobiegania nieodwracalnemu uszkodzeniu spowodowanemu przez epizod niedokrwistości w plastrach mózgu utrzymywanych w warunkach fizjologicznych. Plastry mózgu szczura utrzymywano w komorze z powierzchnią rozdzielającąw sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym zawierającym: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM KH₂po4, 3 mM CaCl₂,1 mM MgCl₂, 26 mM NaHCO₃,10 mM D-glikozy i 2 mM L-askorbinianu, przez który w sposób ciągły przepuszczano gazową mieszaninę O₂:CO₂ (95:5). Atmosferę komory w sposób ciągły gazowano wymienioną mieszaniną, za wyjątkiem epizodu niedokrwistości, gdy zastąpiono ją przez N2. Aksony stymulowano elektrycznie i rejestrowano za pomocą mikroelektrod wytworzone pobudzające postsynaptyczne potencjały (EPSP) (EPSP - excitatory post-synaptic potential).

Figura 4 przedstawia schematycznie EPSP rejestrowany w warunkach normalnych (A), po upływie 5 minut od zastąpienia O 2 przez N2 (epizod niedokrwistości, B) oraz po upływie 30 do 40 minut od reoksygenacji (C). Wielkość trwałego uszkodzenia można ocenić ilościowo przez pomiar zarówno amplitudy (w mV), jak i początkowego nachylenia (w mV/s) krzywej EPSP.

Figury 5 i 6 przedstawiają ochronne działanie przeciwutleniające kompleksu salenu i Mn o oznaczeniu C7 w systemie niedokrwistości EPSP w plastrze mózgu szczura. Plastry mózgu inkubowano bez i w obecności 50 μ M C7 i poddawano epizodowi niedokrwiennoreoksydacyjnemu. Po 5 minutach rejestrowania linii podstawowej zastąpiono O2 przez N2 na okres średnio 5 minut. Następnie ponownie wprowadzano tlen i rejestrowano w ciągu dalszych 50 minut. Próbki z 50 μ M C7 wykazały, że zarówno amplituda jak i nachylenia EPSP powróciły do wartości przed niedokrwistością. Natomiast powrót w plastrach mózgu nie poddanych działaniu wynosił jedynie około 40% wartości sprzed niedokrwistości.

Jako dodatkową ocenę skuteczności określono udział zdolnych do życia plastrów po wielokrotnych epizodach niedokrwistości. Fig. 7 pokazuje, że bez żadnej obróbki ten udział procentowy jest bardzo mały (6%), to wzrasta on do 70% w przypadku plastrów poddanych działaniu 50 μM C7. Plaster uważano za zdolny do życia, gdy w wyniku zwiększania natężenia wzbudzania można było uzyskać EPSP o amplitudzie 3 mV.

Test na modelu zwierzęcym

Zwierzęcy model choroby Parkinsona obejmujący jatrogenne generowanie rodnika hydroksylowego przez MPTP (Chiueh i in. (1992) Synapse 11; 346, który włącza się do niniejszego opisu jako odnośnik) zastosowano do oceny ochronnego działania C7 względem

175 446 uszkodzenia spowodowanego przez wolne rodniki. Stwierdzono, że neiirotoksyrna, MPTP, prowadzi do zwyrodnienia neuronów w mózgu i dzięki temu stanowi dobry model wywołanej doświadczalnie choroby Parkinsona (np. toksyczności jatrogennej). Model ten jest teraz powszechnie przyjęty w technice do oceny potencjalnych środków terapeutycznych dla tej choroby.

Określano liczbę neuronów dopaminoergicznych w mózgach myszy poddanych działaniu albo: (1) samego MPTP, (2) samego przeciwutleniającego kompleksu C7 salenu i metalu, (3) wstępnemu działaniu C7, a następnie MPTP, albo (4) w nie poddanych działaniu próbkach kontrolnych, przez pomiar wiązania ligandu powtórnego wiązania dopaminy, czyli mazindolu. W próbach wiązania stosowano irytowany mazindol na próbkach gałki bladej, jądra ogoniastego i prążkowia mózgu myszy znanymi sposobami; specyficzne wiązanie trytowanego mazindolu oznaczano autoradiogaficznie lub metodą wiązania membranowego (specyficzne wiązanie z frakcją membrany). Doświadczenie prowadzono w ciągu 7 dni. Myszom grupy MPTP podawano śródotrzewnowo sam MPTP (40 mg/kg każdego dnia 1. i 2. dniu). Na myszy grupy MPTP + C7 działano wstępnie C7 (33 mg/kg, i.p.) bezpośrednio przed MPTP w 1. i 2. dniu, oraz podawano im sam C7 (33 mg/mg) w 3. dniu. Zwierzęta poświęcano po 7 dniach. Wyniki przedstawione na fig. 8 pokazują znaczny efekt ochronny nadawany in vivo przez kompleks C7 salen - Mn. Fig. 8 pokazuje, że na liczbę neuronów dopammoergicznybh obecnych w różnych obszarach mózgu myszy nie ma ujemnego wpływu przeciwutleniający kompleks C7 salenu i metalu, natomiast liczba neuronów dopa.minoergicznycO zmniejszyła się do około 15% wartości kontrolnych u myszy poddanych działaniu samego MPTP; jednak wstępne działanie za pomocą C7 prawie podwoiło liczbę przeżywających neuronów dopamlnoerglcznycO w myszach poddanych następnie działaniu MPTP. Brak toksyczności C7 pokazano na podstawie braku ujemnego wpływu zdrowotnego u zwierząt poddawanych działaniu Cl w trakcie siedmiodniowego testu.

Dane te pokazują, że kompleksy salen - Mn wykazują skuteczność terapeutyczną in vivo na zwierzęcych modelach choroby u ludzi, a także wykazują, że kompleksy salen - Mn przechodzą wydajnie przez barierę krew-mózg. Wzięte razem, dane te wskazują na bardzo dużą skuteczność kompleksów salen - Mn, w zapobieganiu uszkodzeniom spowodowanym przez wolne rodniki i uszkodzeniom niedokrwienno-reoksagenacyjnam w mózgu.

Wpływ C7 w izolowanych sercach szczurów przeładowanych żelazem i poddanych próbom niedokrwistości i reperfuzji

Szczury otrzymywały zastrzyki domięśniowe po 0,25 ml roztworu żelazo-dekstran (100 g wodorotlenku żelaza, 99 g dekstranu, woda do 1 litra) co trzeci dzień w ciągu 3 tygodni, aby uzyskać znaczne przeładowanie żelaza w tkance serca. Po zakończeniu tego działania znieczulano szczury za pomocą pentobarbitalu sodowego (40 mg/kg) i podawano im heparynę (1000 IU/kg) przez żyłę udową. Następnie usuwano serca i szybko perfundowano przez aortę metodą podaną przez Langendorffa [Langendorff, O., Pflugers Arch. 61:291, 18595] przy stałej szybkości przepływu 1,1 ml/min. Płynem perfuzyjnym był zmodyfikowany bufor Krebsa-Henseleita zawierający (w mol/l): NaCl 118, KCl 5,9, NaHCO3 25, MgCl2 1,2, NaH2PO4 0,6, CaCl2 2,4, glikoza 11. Utrzymywano pH na wartości 7,4 0,0,05przy cm^mpłyn perCuzyjny nasycano O2 - CO2 (9%¾ -5%^ tcntparzrutze 37°C. Apar at do perfuzji był w pełni termostatowany, dzięki czemu temperatura płynu perfuzyjnego wynosiła 37,0± (),5°C, dyb d^oddza! on oboorty. Db towej komrryb tub pb rozpczęci^iu perfuzji wprowadzano do aorty bardzo cienki balonik i nadmuchiwano go tak, aby uzyskać końcowe ciśnienie rozkurczowe 5 mm Hg. Pod koniec tego okresu rejestrowano skurczowe i rozkurczowe ciśnienia komorowe i częstość akcji8 serca za pomocą przetwornika ciśnienia połączonego z balonem komorowym. Obliczono rozwinięte ciśnienie lewej komory (lVDP) jako różnicę między ciśnieniem skurczowym i rozkurczowym i iloczyn HR x LVDP przyjmowano jako wskaźnik zużycia tlenu. Następnie poddawano serca 15 minutowemu całkowitemu globalnemu normotermicznemu niedokrwieniu, a potem 15 minutowej reperfuzji z

175 446 zastosowaniem płynu perfuzyjdego stosowanego początkowo. Podczas tej i5 minutowej reperfuzji śledzono częstość akcji serca oraz ciśnienia skurczowe i rozkurczowe. Wczesne migotania komór analizowano po i minucie od początku reperfuzji.

Zbadano trzy grupy doświadczalne. Grupa i (n = 7) , w Itiurroj escca pefSunPnwano standardowym płynem perfuznndnm (grupa kontrolna); grupa 2 (n = 8j j perfundowano w obecności dimrtylotiomoczdika (DMtU), i0 mM; grupa 3 (n = 8) - perfudpgwdpo wv obecności C7 (50 μ M).

Po reperfuzji w ciągu i5 minut przygotowywano po 3 serca z każdej grupy do mikroskopii elektronowej przez perfuzję 2,5% aldehydem glutarowym. Badano bardzo cienkie skrawki (grubość 500 - 600 A).

Wyniki

Poniższa tabela V zawiera częstości akcji serca (HR), ciśnienia skurczowe (SP), ciśnienia rozkurczowe (DP) i iloczyny HR x LVDP dla trzech grup doświadczalnych po i5 minutach perfuzji, przed niedokrwieniem (Przed), i minutę po reperfuzji (i Po) i i5 minut po reperfuzji (i5 Po). W tabeli pokazano także liczbę serc wykazujących epizody migotania komór w ciągu i minuty po reperfuzji.

Tabela V

	HR	SP	DP	HRxLVDP
	(akcje/min)	(mm Hg)	(mm Hg)	(x 10,3)
Próby kontrolne:
Przed	276 ± 11	78 ±7	6,3 ± 0,3	19,6 ± 1,6	-
1 Po	96 ± 0	40 ±6	23,3 ± 6,0	4,2 ± 1,7
15 Po	232 ± 15	62 ± 10	13,6 ± 4,2	12,6 ±2,3	-
+ DMTU
Przed	280 ± 10	97 ±4	4,7 ± 0,3	24,1 ± 0,6	-
1 Po	91 ± 10	62 ±9*	37,2 ± 10,0	3,5 ± 1,2
15 Po	226 ± 18	58 ±6	27,8 ± 9,4	9,4 ± 2,0	-
+ C7
Przed	278 ±7	90 ±2	5,4 ± 0,3	23,5 ± 0,9	-
1 Po	130 ± 13#	72 ± 8#	5,8 ± 0,5#	9,9 ± 0,8#@ 2/8
15 Po	241 ± 15	92 ± 15	8,3 ± 0,6	21,7 ± 3,4&@	-

* - p < 0,01, DMTU względem kontroli po tym samym czasie # - p < 0,01, C7 względem kontroli po tym samym czasie & - p < 0,05, względem kontroli po tym samym czasie @ - p < 0,01, względem DMTU po tym samym czasie

W tabeli VI podsumowano wyniki oceny serc mikroskopem elektronowym. Mitochondria sklasyfikowano do następujących typów:

typ A - normalne, typ B - spęczniane, nie popękane i typ C - z popękanymi membranami.

Sarkomery 8kla8yfiisonado do następujących typów: typ A - normalne i typ B - stykające się i/lub martwica.

175 446

Wyniki podawano w procentach. Liczby zanalizowanych mitochondrii wynosiły 1293, 1632 i 1595, odpowiednio dla grupy kontrolnej, grupy DMTU i grupy Cl.

Tabela VI

	Mitochondria	Sarkomery
Typ ^A	Typ b	Typ C	Typ A	Typ B
Próby kontrolne	10,4	21,0	68,5	21,3	78,7
+ DMTU	14,3*	19,5	66,2	13,7+	86,3+
+C7	31,0#±	15,2#@	53,8#±	60,6#±	39,4#±

* - p < 0,05, DMTU względem kontroli + - p < 0,01, MTU względem kontroli # - p < 0,01, C7 względem kontroli @ - p < 0,05, C7 względem DMTU ± - p < 0,01, C7 względem DMTU

Dane te pokazują, że C7 skutecznie chronił serca przed uszkodzeniem niedokrwiennoreoksydacyjnym. Ponadto, C7 był znacznie bardziej skuteczny niż przeciwutleniacz DMTU, jakkolwiek był stosowany w stężeniu 200 razy mniejszym.

Doświadczalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu (EAE)

EAE jest zwierzęcym modelem twardnienia rozsianego. 30 myszy SJL, samic, w wieku 10 tygodni, podzielono na dwie grupy - 20 sztuk grupa kontrolna i 10 sztuk - podana działaniu Cl.

Myszy obu grup były immunizowane peptydem encefalitogenicznym PLP w kompletnym adiuwancie Freunda podskórnie, a następnie za pomocą Petrussis Toxin (IV). Toksynę Petrussis powtarzano 3. dnia po immunizacji.

Na myszy grupy Cl działaoo codzieniue 1 1 mg/mysz, około 00 kg/kg) zasrrzykami

i.p., poczynając do dwu dni przed immunizacją do 14 dni po immunldkcji.

Zwierzęta klasyfikowano następująco:

stadium I : syndrom wiotkiego ogona stadium II: paraliż tylnej nogi stadium III: paraliż tylnej nogi - ruch powłóczysty stadium IV: paralitycma nieruchomość, utrata wagi.

Wyniki

Podczas trzeciego tygodnia po immunidacji, u 8 z 20 mysz w grupie kontrolnej rozwinęła się objawowa EAE: 2 - stadium I, 4 - stadium II/III, 2 - stadium IV.

Podczas takiego samego okresu, tylko jedna z 10 myszy w grupie leczonej C7 rozwinęła objawową EAE (stadium II).

Podczas piątego tygodnia, tj. trzy tygodnie od rktrdzmkeik leczenia za pomoc, a Cl, u 6 myszy w grupie Cl rozwinęła się objawowa EAE - 4 w stadium II i 2 w stadium IV.

Wyniki te wskazują, że podawanie Cl zapobiegało rozwojowi objawowej EAE i że choroba mogła się rozwijać po przerwaniu leczenia.

PerokyyOacja lipidów

Hipokampowe skrawki grubości 400 μ m otrzymywano ze szczurów Speagueka-Dawleya (150 - 200 g) i gromadzono we wstępnie natlenionej (95% 025% CO2) pożywce

175 446 fosforanowej Krebsa-Ringera (pH 7,4) zawierającej NaCl 120 mM, KCl 5 mM CaCh 1,3 mM, MgCh 1,2 mM, fosforan Na 16 mM (pH 7,4) i glikozę 10 mM. Po wstępnej inkubacji na łaźni wodnej w ciągu 15 minut w t-mp-raturze 35°C z mieszaniem zastąpiono bufor takim samym buforem (kontrolnym) lub buforem modyfikowanym (bufor mleczanowy) zawierającym NaCl 90 mM, KCl 5 mM, CaCh 1,3 mM, MgCh 1,2 mM, fosforan Na 16 mM i kwas ml-kowy 30 mM (pH 5,0). C7 (50 μ M) dodawano, jeśli był on obecny, podczas okresów inkubacji wstępnej i inkubacji Po 100 minutach z-brano skrawki i homogenizowano j- w 0,9 ml 5% TCA, podczas gdy 0,35 ml 5% TCA dodano do pożywki inkubacyjn-j. Peroksydację lipidów mi-rzono przez dodani- 0,25 ml odczynnika kwasu tinbarbrturow-go (TBAR) do 0,85 ml ekstraktów TCA i inkubowani- mieszaniny w ciągu 60 minut w temperaturze 85 - 93°C. Następni- ekstrahowano lipidy 2 x po 0,5 ml butanolu wirując w ciągu 10 s, a następnie odwirowując w ciągu 10 minut przy 2000 obrotów na minutę. Mierzono spektrofotomstryczni- absorbancję peroksydowanych lipidów w fazie alkoholowej przy 532 nm. Wyniki podawano w nmolach dial0ehydu malonow-go (MDA) stosując prawdziwy MDA do sporządzenia krzywej wzorcowej. Białka mierzono z próbki ekstraktów TCA stosując metodę Bradforda i końcowe wyniki obliczano jako nmoli utworzonego MDA/mg białka.

Wyniki

Figura 9 pokazuj- peroksydację lipidów po czasie 0 (bezpośrednio po skrawaniu) i po 10 min. inkubacji przy pH 7,4 (próbka kontrolna), przy pH 5,0 (mleczan) pod ni-ob-cność (LA) i w obecności (LA + C7) 50 μ M C7, w homog-nizatach skrawków (zakreskowan- słupki) i w pożywce inkubacyjnej (kropkowane słupki). Wyniki są śr-dnimi ± odchyleni- standardowe, przy czym grupa doświadczalna C-7 była grupą silnie znaczącą statystyczni- w porównaniu z grupą kontrolną (p < 0,01), podczas gdy mał- różnice między LA i LA + C7 nis są znaczące statystyczni-. Inkubacja skrawków hipokampowych przy użyciu 30 mM ml-czanu przy końcowym pH 5,0 powodowała znaczny wzrost p-roksydacji lipidów, jak to zmierzono w teście z kwas-m tiobarbiturowym. Inkubacja skrawków za pomocą C7 (50 μM) całkowicie usunęła wzrost peroksydacji lipidów. Powodowane prz-z mleczan wzrosty stęż-nia Oialdehydu malonowego zarówno w pożywkach inkubacyjnych (kropkowane słupki), jak i w homogenizatach skrawków (zakr-skowane słupki) były zablokowane przez C7. Inkubacja w ciągu 100 minut bez mleczanu, zarówno z C7 jak i b-z ni-go, ni- powodowała znaczącego wzrostu p-rOksydacji lipidów.

Dans te pokazują, że C7 zapobiega p-roktydacji lipidów powodowanej prz-z kwasicę. Wiadomo, że kwasica powoduje znaczne uszkodz-ni- oksydacyjne. P-roksydacja lipidów j-st knnt-kw-ncją taki-go uszkodzenia oksydacyjnego i stwierdzono, że wiąż- się ona z szeregi-m chorób u ludzi.

Mod-l- uszkodzeń in vitro

Anoksja w skrawkach hipokampa. Wykonano doświadczenia -lektrofizjologiczn- na skrawkach hipokampa (400 μ m) z dorosłych szczurów Sprague’a-Dawleya, przetrzymywanych w t-mp-raturz- 35°C w dwu międzyfazowych komorach z 50 mM C7 lub b-z ni-go. Szklaną rejestrującą mikropipetę umieszczono w warstwie promisniowej CA1 w c-lu rejestrowania pnstsynaptycznegn potencjału pobudzającego (EPSP) generowanego przez stymulację -l-ktryczną szlaku spoidła Schaffera prz-z bipolarną -l-ktrodę stymulacyjną przy częstości 0,033 Hz.

Podczas epizodów ni-dotleni-nia zastępowano dostarczany tlsn przez 100% gazowy azot. Azot dostarczano w ciągu 90 sekund po ciszy elektrycznej, po czym ponowni- wprowadzano tlen. Rejestrowano powrót EPSP (zarówno nachylenia, jak i amplitudy) w ciągu 50 minut, po czym oznaczano końcową żywotność skrawków, przy czym żywotność definiowano jako zdolność skrawka do generowania 3 mV EPSP.

175 446

Acydoza w skrawkach hipokampa. Skrawki hipokampa gromadzono we wstępnie natlenionym buforze fosforanowym Krebsa-Ringera z 50 μM C7 lub bez niego, w temperaturze 35°C na wstrząsanej łaźni wodnej. Po 15 minutach wstępnej inkubacji przenoszono skrawki do takiego samego buforu lub do buforu zawierającego 30 mM mleczanu, pH 5,0 (z C7 lub bez niego). Skrawki ze wszystkich grup zbierano po 100 minutach inkubacji i badano na peroksydację lipidów, na podstawie reakcji dialdehydu malonowego z kwasem tiobarbiturowym.

jądrze ogonias 3H-mazindolu

Model in vivo uszkodzenia neuronalnego

MPTP u myszy. Dorosłym myszom CFW, samcom (2.5 - 33 g) podawano dwa zastrzyki MPTP rozpuszczonego w normalnej solance (40 mg/kg, s.c.) w odstępie 24 godzin. Grupa zwierząt otrzymywała także C7 w trzech zastrzykach (33 mg/kg, s.c.) podawanych w odstępie 24 godzin, rozpoczynając 1 dzień przed rozpoczęciem leczenia MPTP. Zwierzęta poświęcono po upływie 7 dni od pierwszego zastrzyku MPTP i oceniano patologię neuronalną na podstawie wiązania ³H-mazindolu, liganda dla transportera dopaminy, z 10 mm mrożonymi wycinkami mózgu lub z homogenatami prążkowia.

6-OHDA u myszy. Dorosłe myszy CFW, samce, znieczulano za pomocą ketaminy i rumpunu i unieruchamiano w urządzeniu stereotaktycznym. 6-OHDA w postaci soli bromowodorku rozpuszczano w zwykłej solance z 1% askorbinianu i podawano 50 μ g do bocznej komory mózgu za pomocą 10μΐ strzykawki Hamiltona. Podawano C7 (66 mg/kg, i.p.) codziennie w ciągu 4 dni. Zwierzęta poświęcano po 7 dniach i patologię neuronalną oceniano na podstawie wiązania ³H-mazindolu z homogenatami prążkowia.

WYNIKI

C7 chroni skrawki hipokampa przed uszkodzeniem powodowanym przez anoksję

Skrawki hipokampowe poddawano działaniu warunków niedotlenienia z użyciem C7 (50 m μM) lub bez niego. Cl zapewniał znaczny stopień ochrony przed wywoływanym przez anoksję zmniejszeniem odpowiedzi synaptycznej u CA1. CC chroni przed spadkiem zarówno nachylenia EPSP (A) jak i amplitudy (B). (Oczyszczona wołowa SOD w tej samej próbie nie dawała żadnej ochrony).

Figura 10 pokazuje, że zastrzyk I.c.v. 6-OHDA (50 μ g) powoduje zmniejszenie o 6070% wiązania mazindolu w homogenatach z prążkowia po tej samej stronie od miejsca zastrzyków i o 33% z prążkowia po przeciwnej stronie (fig. 10). Stosowanie C7 (4 x 66 mg/kg) spowodowało znaczne zmniejszenie po tej samej strome i całkowitą ochronę po stronie przeciwnej.

Podawanie MPTP (2 x 40 mg/kg, s.c.) powodowało zmniejszenie o 75 -80 wiązania mazindolu. Działanie za pomocą C7 (3 x 33 mg/kg, i.p.) powodowało znaczny stopień (p < 0,05) ochrony przed zmniejszaniem wiązania ³H-mazindolu zarówno w gałce bladej, jak i w tym (zestaw A). Samo działanie C7 nie miało znaczącego wpływu na wiązanie mierzone w homogenatach prążkowia (zestaw B).

WNIOSKI

Przedstawione wyniki ilustrują ochronne efekty Syntetycznego Katalitycznego Zmiatacza (SCS), takiego jak C7, w różnych modelach uszkodzenia neuronalnego. C7 mógł chronić neurony przed ostrymi wczesnymi objawami uszkodzenia neuronalnego, takimi jak peroksydacja lipidowa i utrata żywotności synaptycznej, jak również przed długotrwałymi objawami uszkodzenia neuronalnego, takiego jak utrata neuronalna po 7 dniach od zastrzyku toksyny.

Ze względu na dodatnie efekty uzyskane podczas peryferalnych zastrzyków C7 na modelach in vivo uszkodzenia neuronalnego, uważa się, że kompleks jest trwały in vivo i że przechodzi przez barierę krew-mózg jak również przez membrany neuronalne.

Dodatnie efekty C7 w różnych modelach uszkodzenia neuronalnego wskazują że reaktywne substancje tlenowe, a zwłaszcza rodnik ponadtlenkowy, odgrywają ważną rolę w chorobach spowodowanych przez niedokrwienie i acydozę oraz w wywoływanej przez MPTP i 6-OHDA utracie dopaminergicznych neuronów czarnego prążkowia.

W końcu, ze względu na szeroki zasięg stanów chorobowych związanych z nadprodukcją rodników tlenowych, te wyniki świadczą o tym, że przeciwutleniające kompleksy salenu i metalu, takie jak: C7, mogą mieć wiele różnych zastosowań terapeutycziych.

Wynalazek bliżej ilustrują następujące przykłady kompozycji farmaceutycznych:

Przykład I. Kompozycja do infuzji dożylnych

Skład:

Kompleks salen - Mn 100 mg

Roztwór Ringera 1000 ml

Jałowa woda q.s.

1000 ml roztworu Ringera (102 mM NaCl, 4 mM KCL, 3 mM CaCl2, 28 mM mleczanu sodowego, pH 7,0) zmieszano z 100 mg kompleksu salenu Mn i uzupełniono jałową wodą w celu otrzymania kompozycji w jednostkowych dawkach zawierających 25 mg kompleksu salenu - Mn.

Przykład II. Kompozycja do podawania domięśniowego

Skład:

Kompleks salenu - Mn 100 mg

Jałowa buforowana woda .·.·

Do jałowej buforowanej wody dodano 100 mg kompleksu salenu - Mn isporąązżono oo podawania domięśniowego zawierającą 10 mg kompleksu salenu - Mn w dawceją0nostPowej.

Przykład III. Kompozycja do podawania doustnego

Skład:

Kompleks salenu - Mn 100 mg

Mannit 25 mg

Stearynian magnezowy 12 mg

Skrobia 363 mg

Celuloza mikrokrystaliczna 1500 mg

Składniki zmieszano, poddano granulowaniu i z tak przygotowanej mieszanki sporządzono tabletki do podawania doustnego.

175 446

fig.

Ph Ph

fig.

175 446

-6 mV

2-5 msek

EPSP

EPSP podczas epizodu niedokrwienia

EPS? po wyzdrowieniu z epizodu niedokrwienia

FIG.

175 446

Powrót amplitudy (% względem linii podstawowej)

Czas (minuty)

FIG.

175 446

Spadek amplitudy (% względem linii podstawowej)

Czas (minuty)

FIG. 6

175 446 żywotnych skrawków po jednym do trzech nJ •H c (U Ή £

O

Ό (U •H β

£5 o

4J <tf β Ό <D O O N O -H Μ Λ CM O

100

6020 -

Δ

Próbka kontrolna

C7 fig.

175 446 (pmoli/ml białka) Wiązanie mazindolu (pmoli/ml białka)

Gałka blada

n= 7 8 8 11

FIG. 8A

Prążkowie

n= 4 5 5 5

FIG. 8C

Jądro ogoniaste

8 8 11

FIG. 8B

Próbka kontrolna

175 446

FIG. 9

175 446

fi
fi i-4 O Ll 4-1 fi O 34	<	OO < 1
ίΰ	Q	Q
Λ	X	X D
O Li	O 1	O ω 1
Pi	Ό	o +

>1 fi

O

Li +J ω

•n <D fi •H

O <U

N

Li a

N >, fi

O

Li +J tn

FIG. 10

QJ ε

σι tn

a)

4-1 foępUto aUl/I0Uld) nąopuTzuui-HE stupzPtm

175 446

Autoradiografia

fig. iia

Wiązanie 3H-mazindoliipniol/ing biał J Wiązanie 3H-mazindolu (pmol/nigbiał)

Wiązanie membranowe

FIG. 11B

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz. Cena 6,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompooycja farmaceutyczna <J<z zapobiaponia lan toczę nia stnnów anoroboorych związanych z wolnymi rodnikami, zwłaszcza epizodu niedokrwienno-reoksygenacyjnego i jatrogenicznej toksyczności wolnorodnikowej, zawierająca substancję czynną i znane środki pomocnicze, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera 0,001-95% wagowych przeciwztCeniającego kompleksu saCenz i metalu o wzorze w którym M jest wybrany z grupy obejmującej Mn, Co, Fe, V, Cr i Ni; A oznacza anion; wartość n wynosi 0, 1 Cub 2; Xi, Χ2, Χ3 i Χ4 są niezależnie wydane z grupy obejmującej atom wodoru, grupy arylowe, grupy aryCo-Ci-12-aCkiCowe, pierwszo-, drugoCub trzeciorzędowe grupy Ci ^-alkilowe, grupy C—alkoksylowe, grupy aryloksylowe, grupy aminowe, czwartorzędowe grupy aminowe; Yi, Y2, Y3, Y4, Y5 i Y- są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, atom chlorowca, grupy Ci-i2-alkilowe, grupy arylowe, grupy arylo-Ci-12-alkilowe i grupy aminowe; a Ri, R2, R3 i R4 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, grupy arylowe, grupy estrów kwasów tłuszczowych o 10-20 atomach węgla, podstawione grupy Ci--alkoksyarylowe, pierwszo-, drugo- lub trzeciorzędowe grupy CM2-alkilowe.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera przeciwutleniający kompleks salenu i metalu wybrany z grupy obejmującej Strukturę IV, Strukturę V, Strukturę VI, Strukturę VII, Strukturę VIII i Strukturę lX.
3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera przeciwutleniający kompleks salenu i metalu wybrany z grupy obejmującej C1, C4, C6, C7, C9, C15, C17,C20, C22, C23, C25, C27 i C28.
4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako przeciwutleniający kompleks salenu i metalu zawiera SOD-mimetyczny C7.
5. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że w jednostce dawkowania zawiera co najmniej około 10 mg C7 w postaci odpowiedniej do podawania pozajelitowego.
6. Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania lub leczenia stanów chorobowych związanych z wolnymi rodnikami, zwłaszcza epizodu niedokrwienno-reoksygenacyjnego i jatrogenicznej toksyczności wolnorodnikowej, zawierająca substancję czynną i znane środki pomocnicze, znamienna tym, że zawiera 0,001-95% wagowych co najmniej jednego rodzaju przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu o wzorze

Y.

i

175 446 w którym M jest jonem metalu przejściowego wybranym z grupy zawierającej Mn, Co, Fe, V, Cr i Ni; A oznacza anion; wartość n wynosi 4, 5 lub 6; Xi, X2, X₃ i Xsą niezależnie wybrane z grupy obejmującej grupy arylowe, grupy arylo-C-6-alkilowe, grupy aryloksylowe, pierwszo-, drugo- lub trzeciorzędowe grupy C1-i2-alkilowe, ewentualnie podstawione grupy Ci-ó-alkoksylowe, grupy aminowe, czwartorzędowe grupy aminowe i atom wodoru; Yi, Y 2, Y3, Y4, Y5 i Yó są niezależnie wybrane z grupy obejmującej grupy arylowe, grupy arylo-Ci-6-alkilowe, pierwszo-, drugo- lub trzeciorzędowe grupy alkilowe, ewentualnie podstawione grupy Ci-6-alkoksylowe, grupy aryloksylowe, atomy chlorowców, grupy aminowe, czwartorzędowe grupy aminowe i atom wodoru; a Ri i R4 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, atomy chlorowców, pierwszo-, drugo- lub trzeciorzędowe grupy Ci-i6-alkilowe, grupy estrów kwasów tłuszczowych o 10-20 atomach węgla, grupy Ci-6-alkoksylowe i grupy arylowe.
7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że zawiera przeciwutleniający kompleks salenu i metalu wybrany z grupy obejmującej C10, Cii, C12, C29 i C30.
8. Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania lub leczenia stanów chorobowych związanych z wolnymi rodnikami, zwłaszcza epizodu niedokrwienno-reoksygenacyjnego i jatrogenicznej toksyczności wolnorodnikowej, zawierająca substancję czynną i znane środki pomocnicze, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera 0,001-95% wagowych przeciwutleniającego kompleksu salenu i metalu w postaci akceptowanej farmaceutycznie o wzorze w którym M jest manganem, A oznacza atom wodoru lub halogenek; wartość n wynosi 0, 4, 5 lub 6, przy czym gdy n = 0 to Cn jest nieobecne, a gdy n = 4, 5 lub 6, to Cn jest nasyconym łańcuchem węglowodorowym, Ri i R4 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, fenyl, grupę Ci-4-alkoksylową, grupy estrów kwasów tłuszczowych o 8-i5 atomach węgla; Xi i X₃ są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, grupę Ci-4-alkilową, grupę aminową, grupę Ci-4alkiloaminową i atom chlorowca; X2 i X4 oznaczają atom wodoru; Yi i Y4 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, grupę Ci-4-alkilową, atomy chlorowców i grupę Ci-4-alkoksylową; Y2, Y₃, Y5 i Yó oznaczają atom wodoru i wszystkie pozostałe położenia podstawników oznaczają atom wodoru.
9. Kompozycja według zastrz. 8t znamienna tym, ty zawiera prreciwutleniatący kompleks salenu i metalu wybrany z grupy obejmującej Ci, C4, C6, C7 i C9.