HU225109B1 - Pharmaceutical compositions comprising antioxidant salen-metal complex and their use - Google Patents

Description

A találmány tárgyát gyógyszerkészítmények képezik, amelyek szintetikus, katalitikus kis molekulatömegű antioxidáns anyagokat és szabadgyök-fogókat tartalmaznak, és alkalmasak betegségek terápiás és megelőző kezelésére, továbbá a fenti kis molekulatömegű antioxidánsok alkalmazása patológiás állapot megelőzésére alkalmas gyógyszerkészítmények, szövet- és/vagy sejtfajták védelmére rákos kemoterápia során alkalmas gyógyszerkészítmények, továbbá oxidálószerek irritációs hatásának vagy más oxidációs károsodásnak, különösen oxigénalapú oxidálószerek, mint például szuperoxidgyök hatásának kitett betegekben toxikológiai károsodás megelőzésére alkalmas készítmények előállításánál. A találmány szerinti készítmények és eljárások továbbá alkalmazhatók humán transzplantációs szervek oxidatív károsodásának megelőzésére, valamint az ischaemiás szövetek reperfúziós visszaállítását követő oxigénellátásból eredő sérüléseinek inhibiálására. A találmány szerinti készítmények továbbá alkalmasak különféle kémiai karcinogénsérülések kémiai megelőzésére, valamint az epoxid vagy szabadgyöktermelő hatóanyag metabolizmusból eredő sérülések kezelésére.

A molekuláris oxigén alapvető tápanyag az aerob szervezetek számára, természetesen beleértve az embereket. Az oxigént a szervezet számos fontos úton használja fel, mint például terminális elektromos akceptor oxidatív foszforilezésben számos dioxigenázreakcióban, beleértve a prosztaglandinok és az A-vitamin kartenoidokból történő előállítását egy gazdaegyedben, a hidroxilázreakciókat, beleértve a szteroidhormonok képződését és módosítását, illetve a xenobiotikumok aktiválási és inaktiválási folyamatait, amelybe beleértjük a karcinogén anyagokat. A P-450 kiterjedt rendszer ugyancsak molekuláris oxigént használ a gazdaegyedben, amely fontos szerepet játszik sejtreakciókban. Hasonló módon a természet igen széles körű szabad gyököket alkalmaz enzimatikus reakciókban.

A különféle oxigén- és szabadgyök-formák túlzott koncentrációja súlyos károsítást okozhat az élő szervezetekben, amely lehet például a membránlipidek peroxidálása, a nukleinsavbázisok hidroxilezése és a szulfhidrilcsoportok oxidációja, valamint a fehérjék érzékeny részeinek oxidációja. Amennyiben ezt nem szabályozzuk, mutáció vagy sejtelhalás következne be.

A biológiai antioxidánsok jól meghatározott enzimek, mint például a szuperoxid dizmutáz, a kataláz, a szelénium glutation peroxidáz és a foszfoüpid-hidroperoxid glutation peroxidáz enzim. Nem enzimatikus biológiai antioxidánsok például a tokofelorok és a tokotrienolok, a karotenoidok, a kinonok, a bilirubin, az aszkorbinsav, a húgysav és a fémkötő fehérjék. Különféle antioxidánsok lipidben és vízben is oldhatóak, és ezek a sejtek és szövetek minden területen megtalálhatóak, azonban minden egyes specifikus antioxidáns gyakran egy jellemző eloszlási képet mutat. Az úgynevezett ovotiolok, amelyek merkapto-hisztidin-származékok, ugyancsak enzimatikus úton bontják le a peroxidokat.

A szabad gyökök, különösen a molekuláris oxigénből származó szabad gyökök valószínűleg alapvető szerepet játszanak különféle biológiai jelenségekben. Feltételezték, hogy a betegségek legnagyobb része a kritikus betegségek esetében oxigéngyököt is tartalmaz („oxigyök) a patofiziológiában [Zimmermen JJ (1991) Chest 100:189S]. Oxigyöksérülés szerepet játszik a tüdő-oxigéntoxicitás, a felnőtt légzőszervifáradás-szindróma (ARDS), a hörgőkkel kapcsolatos dysplasia, a sepsisszindróma és számos vértelenség-reperfúzió szindróma patológiájában, amely utóbbiak lehetnek például a szívizominfarktus, a gutaütés, a szív-tüdő megvezetés, a szervátültetés, az elhalást okozó enterocilitis, az akut vese tubuláris necrosis és egyéb betegségek. Az oxigyökök fehérjékkel, nukleinsavakkal, zsírokkal és egyéb biológiai makromolekulákkal reagálhatnak, és ezek a reakciók a sejtekben és szövetekben, különösen kritikus betegségben szenvedő betegekben károsodást okozhatnak.

Szabad gyököknek olyan atomokat, ionokat vagy molekulákat nevezünk, amelyek nem párosított elektronnal rendelkeznek [Pryor, WA (1976) Free Radicals in Bioi. 1: 1]. A szabad gyökök általában nem stabilak, és igen rövid felezési idővel rendelkeznek. Az elemi oxigén nagymértékben elektronegatív, és könnyen felvesz egy elektrontranszfer reakciók során elektront a citokrómokból és egyéb redukált sejtkomponensekből; az O₂ sejtek által elfogyasztott egy része, amely az aerob légzés során kerül a sejtekbe, egy vegyértékűre redukált szuperoxidgyök (·Ο₂~) [Cadenas E (1989) Ann. Rév. Biochem. 58: 79]. A szekvenciális egy vegyértékű redukció a •O₂ ^_-molekulából hidrogén-peroxidot (H₂O₂), hidroxilgyököt (·ΟΗ) és vizet képez.

A szabad gyökök számos forrásból származhatnak, mint például aerob légzés, citokróm Ρ-450-katalizált hatóanyag monooxigénezési reakciók, illetve xenobiotikumok (például a szén-tetraklorid oxidációjából származó CCI₃·, triklór-metil-gyökök) és ionizáló sugárzási reakciók. Például amennyiben a szövetek gamma-sugárzás hatásának kitettek, az energia legnagyobb része a sejtekben víz által abszorbeálódik, és a vízben az oxigén-hidrogén kovalens kötés hasítását eredményezi, és amelynek során a hidrogénatomon, illetve az oxigénatomon egy-egy elektron marad, és így két gyök, egy H· és egy ·ΟΗ keletkezik. A kémiában ismert legreaktívabb gyök a hidroxilgyök ·ΟΗ. Ez a gyök biomolekulákkal reagál és láncreakciókat indít, kölcsönhatásba tud lépni purin- vagy pirimidinbázisokkal, amelyek a nukleinsavakban találhatók. Kimutatták, hogy a radiációindukált karcinogenezis szabadgyök-károsodással indulhat [Breimer LH (1988) Brit. J. Cancer57:6]. Ezen túlmenően például az úgynevezett „oxidatív robbanása az aktivált neutrofil vegyületeknek igen nagy koncentrációjú szuperoxidgyököt eredményez, amely feltehetően az alapvető faktor, amely citotoxikus hatást fejt ki az aktivált neuprofilek hatása során. Az ischaemiás szövetek reperfúziója ugyancsak igen nagy koncentrációjú oxigyököket eredményez, amelyek jellemzően szuperoxidgyökök [Gutteridge JMC és Halliwell B (1990) Arch. Biochem. Biophys. 283: 223]. Ezen túlmenően szuperoxid keletkezhet a belhámsejtek eredményeként fiziológiai úton, amely reakció során nitrogén-oxid reagál,

HU 225 109 Β1 amely oxid egy fiziológiai szabályozóanyag, és a reakció során peroxid-nitrit, ONOO^- keletkezik, amely ezt követően bomlik, és így hidroxilgyök alakul ki, OH [Marietta MA (1989) Trends Biochem. Sci. 14:488; Moncada és munkatársai (1989) Biochem. Pharmacol. 38: 1709; Sárán és munkatársai (1990) Free Rád. Rés. Commun. 10: 221; Beckman és munkatársai (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:1620]. Más gyökforrás lehet, amely oxigyököket képez, az elektronok „kiáramlása”, a sérült mitokondriumból vagy a plazmán belüli reticularis elektrontranszport-láncokból, továbbá a prosztaglandinszintézisből, a katekolaminok oxidációjából, illetve a vérlemez-aktiválásból.

Számos szabadgyök-reakció igen káros hatást fejthet ki a sejtkomponensekre; a fehérjéket térhálósíthatja, a DNS-t mutagenezisben reagáltathatja, illetve a lipideket peroxidálhatja. Amennyiben a szabad gyökök egyszer kialakultak, ezek már kölcsönhatásba léphetnek, és egyéb más szabad gyököket képezhetnek, illetve nem gyökszerű oxidálószereket, mint például szinglet oxigént (¹O₂) és peroxidokat alakíthatnak ki. Bizonyos szabadgyök-reakciókban keletkezett termékek lebomlása ugyancsak potenciálisan káros kémiai molekulákat eredményezhet. Például a peroxidált lipidek egyik reakcióterméke a malondialdehid, és ez gyakorlatilag valamennyi aminocsoportot tartalmazó molekulával reagál. Oxigéntől mentes gyökök ugyancsak okozhatják fehérjék oxidatív módosulását [Stadtman ER (1992) Science 257:1220].

Az aerob sejtek általában számos védőmechanizmussal rendelkeznek, amellyel kivédik az oxigyökök és reakciótermékeik káros hatását. A szuperoxid dizmutáz (SODs) az alábbi reakciót katalizálja: 2·Ο₂ ^-+2Η⁺->Ο₂+Η₂Ο₂ ez a reakció szuperoxid eltávolítására alkalmas, és ebben hidrogén-peroxid keletkezik. A hidrogén-peroxid (H₂O₂) nem gyök típusú vegyület, azonban sejtekre toxikus hatást fejt ki; ezt a sejtekből a kataláz és a glutation peroxidáz (GSH-Px) enzimek aktivitása távolítja el. A kataláz enzim az alábbi reakciót katalizálja:

H₂O₂->2 H₂O+O₂ a GSH-Px a hidrogén-peroxidot úgy távolítja el, hogy felhasználja redukált glutation (GSH) oxidálására, és így oxidált glutation (GSSG) előállítására az alábbi reakció szerint:

GSH+H₂O₂^GSSG+2 H₂O

Egyéb enzimek, mint például a foszfolipid-hidroperoxid glutation peroxidáz (PLOOH-GSH-Px) átalakítják a reaktív foszfolipid-hidroperoxidokat, a szabad zsírsav-hidroperoxidokat és a koleszterin-hídroperoxidokat a megfelelő, nem veszélyes zsírsav-alkoholokká. A glutation S-transzferáz enzimek ugyancsak szerepet játszanak a szerves peroxidok detoxikálásában. Amennyiben ezek az enzimek nincsenek jelen, valamint átmenetifémek vannak a környezetben, amelyek lehetnek például vas vagy réz, a szuperoxid és a hidrogén-peroxid az alábbi reakciók révén különösen reaktív hidroxilgyököket ·ΟΗ^- képezhet:

•O₂ ^-+Fe⁺-»O₂+Fe²⁺

H₂O₂+Fe²⁺-»OH+OH^-+Fe⁺

A szabad gyökök és az oxidálórészecskék enzimes detoxifikálásán kívül számos alacsony molekulatömegű antioxidáns is szerepet játszik, mint például glutation, aszkorbát, tokoferol, ubikinon, bilirubin és húgysav, ezek a molekulák természetesen előforduló fiziológiai antioxidánsok [Krinsky NI (1992) Prox. Sox. Exp. Bioi. Med. 200:248-54]. A kis molekulatömegű antioxidánsok másik csoportja a karotenoidvegyületek, amelyek oxidatív stressz és krónikus betegségek elleni védőanyagként alkalmazottak [Canfield és munkatársai (1992) Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 200: 260], A karotenoidok alkalmazását különféle krónikus betegségek esetében leírták, amelyek lehetnek például koronaér-szív betegségek, kataraktus és rákos megbetegedés. A karotenoidok igen nagy mértékben csökkentik bizonyos veszély előtti állapotok kialakulását, mint például bizonyos betegségekben a leukoplakiát.

Abból a célból, hogy az ischaemiás szövetek újra oxigénnel ellátottsága során kialakuló oxigyökképződés káros hatásait megakadályozzák, különféle antioxidánsokat alkalmaznak.

Az egyik eljárás szerint az oxigyök által indukált károsodást úgy akadályozzák meg, hogy inhibiálják az oxigyökök, mint például a szuperoxid képződését. Például a vas-kelát képző anyagok, mint például a dezferrooxamin (más néven deferoxamin vagy Desferol) és egyéb kelátképzők inhibiálják a vasionfüggő ·ΟΗ gyökképződést, és így a szabadgyök-képződés inhibitoraiként alkalmazhatók [Gutteridge és munkatársai (1979) Biochem. J. 184: 469; Halliwell B (1989) Free Radical Bioi. Med. 7: 645; Van dér Kraaij és munkatársai (1989) arculation 80: 158]. Az amino-szteroid-alapú antioxidánsokat, mint például a 21-amino-szteroidokat, amelyeket „lazaroidoknak” neveznek (például U74006G), ugyancsak alkalmazzák oxigyökképződés-inhibitorként. A dezferrioxamint, az allopurinolt és egyéb pirazolo-pirimidinek, mint például az oxi-purinolt ugyancsak tesztvizsgálatban vizsgálták, milyen mértékben képesek egy szívizomernyesztő modellrendszerben megakadályozni az oxigyökképződést [Bolli és munkatársai (1989) Cirs. Rés. 65: 607], illetve milyen mértékben képesek ugyanerre vérzéses és endotoxikus sokkot követően [DeGaravilla és munkatársai (1992) Drug Devel. Rés. 25:139]. Azonban ezek a vegyületek jelentős hátránnyal rendelkeznek terápiás alkalmazás során. Például a deferoxiamin nem ideális vas-kelát képző, és a sejtbe történő behatolása korlátozott mértékű.

Más eljárás szerint az oxigyök által indukált károsodást úgy akadályozzák meg, hogy katalitikusán eltávolítják az oxigyököket, mint például szuperoxidot, miután ezek már kialakultak. A szuperoxid dizmutáz és kataláz igen széles körben alkalmazott erre a célra bizonyos sikerrel, és ezeket az anyagokat protektív hatóanyagként alkalmazzák a reperfúziós eljárás során számos kísérlet során, illetve preischaemiás esetekben is használják [Gutteridge JMC és munkatársai Halliwell B (1990) op. cit]. A rekombináns szuperoxid dizmutáz rendelkezésre áll, és emiatt ezt igen széles körben értékelték, meghatározták, hogy a kezelés során

HU 225 109 Β1

SOD-adagolás mit eredményez különféle betegségek kezelésében vagy megelőzésében, beleértve a reperfúziós sérülést az agyban, illetve a gerincvelőben [Uyama és munkatársai (1990) Free Radix. Bioi. Med. 8: 265; Lim és munkatársai (1986) Ann. Thorac. Surg. 42: 282], továbbá vizsgálták endotoxémia kezelésében [Schneider és munkatársai (1990) Circ. Shock 30: 97; Schneiderés munkatársai (1989) Prog. din. Bioi. Rés. 308: 913] és szívizominfarktus kezelésében [Patel és munkatársai (1990) Am. J. Physiol. 258: H369; Mehta és munkatársai (1989) Am. J. Physiol. 257: H1240; Nejima és munkatársai (1989) drculation 79:143; Fincke és munkatársai (1988) Arzneimittelforschung 38: 138; Ambrosio és munkatársai (1987) drculation 75: 282], végül ugyancsak vizsgálták osteoarthritis és bélischaemia kezelésében [Vohra és munkatársai (1989) J. Pediatr. Surg. 24:893; Flohe L (1988) Mól. Cell. Biochem. 84: 123], A szuperoxid dizmutázról továbbá leírták, hogy pozitív hatást gyakorol szisztémás lupus erythematosus, Crohn-betegség, gyomorfekélyek, oxigéntoxicitás, égéssérült betegek, veseelégtelenség, amely az átültetés után következik be, és herpes simplex-fertőzés kezelésére.

Az oxigyök által indukált károsodás más eljárás szerint úgy előzhető meg, hogy az oxigyököket, mint például a szuperoxidot képződésük után megkötik. Erre a célra általában kis molekulatömegű kötőanyagokat alkalmaznak, amelyek nem katalitikusán, hanem sztöchiometrikus mértékben reagálnak. Glutationnal analóg vegyületeket alkalmaztak különféle állatmodellekben abból a célból, hogy az oxigyöksérülést csökkentsék. Például az Ν-2-merkapto-propionil-glicinről kimutatták, hogy egy kutyamodellben szívizom-ischaemia és reperfúzió esetében védőhatást fejt ki [Mitsos és munkatársai (1986) drculation 73:1077], az N-acetil-ciszteint („Mucomyst”) alkalmazták birkákban endotoxintoxicitás kezelésére [Bernand és munkatársai (1984) J. din. Invest. 73: 1772]. A dimetil-tiokarbamidról (DMTU) és a butil-a-metil-nitronról (BPN) feltételezik, hogy hidroxilgyök- ·ΟΗ kötő hatással rendelkeznek, és ezekről kimutatták, hogy nyulakban és patkányszívizomban csökkentik az ischaemia-reperfúziós sérülést [Vander Heide és munkatársai (1987) J. Mól. Cell. Cardiol. 19: 615; Kennedy és munkatársai (1987) J. Appl. Physiol. 63: 2426]. A mannitot ugyancsak alkalmazzák szabadgyök-befogóként, például újraoxigénezés esetében szervekben történő sérülés csökkentésére [Fox RB (1984) J. din. Invest. 74: 1456; Ouriel és munkatársai (1985) drculation 72: 254], Egy más közleményben leírták, hogy kis molekulatömegű kelátképző a glutation peroxidáz hatását mimikáló aktivitást mutatott [Spector és munkatársai (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:7485],

A fentiek alapján az oxigyökképződés inhibitorai és/vagy a szuperoxid- és hidrogén-peroxid-eltávolító enzimek és/vagy a kis molekulatömegű oxigyökkötő anyagok valamennyien valószínűleg alkalmazhatók az újra oxigéntelítéses károsodás megelőzésére, amely folyamat igen gyakori esetben bekövetkezik ischaemiás patológiai állapotokban, illetve alkalmasak különféle szabad gyökökkel kapcsolatos betegségállapotok kezelésére vagy megelőzésére. Azonban ezen vegyületcsoportok valamennyije sok káros hatással rendelkezik. Például az oxigyökképződést inhibiáló anyagok általában átmenetifém-kelátok, amelyek alapvető enzimatikus folyamatokban játszanak szerepet a normál fiziológiás állapotban és a légzésben; ezen túlmenően ezek az inhibitorok még igen nagy dózisban adagolva sem inhibiálják tökéletesen az oxigyökképződést. A szuperoxid dizmutázok és kataláz nagy molekulatömegű polipeptidek, amelyek gyártása drága, a sejtbe nem hatolnak be, illetve nem hatolnak át a vér-agy gáton, és általában parenterális adagolási utat igényelnek. A szabadgyök-fogó vegyületek sztöchiometrikusan reagálnak, ennélfogva könnyen kiürülnek a szervezetből, és ahhoz, hogy hatásosan működjenek, magas dózisban adagolandók.

Ebből eredően szükséges olyan hatóanyag antioxidáns szer kidolgozása, amely hatékonyan eltávolítja a veszélyes oxigyököket, különösen a szuperoxidot és a hidrogén-peroxidot a szervezetből, és amely ugyanakkor olcsón előállítható, stabil és előnyös farmakokinetikai jellemzőkkel rendelkezik, például képes áthatolni a vér-agy gáton, és a szövetekbe behatolni. Az ilyen jó tulajdonságokkal rendelkező antioxidáns anyagok általában alkalmazhatók mint gyógyszerészeti készítmények, kemoprotektív hatóanyagok és esetleg élelmiszer-ipari adalék anyagok. A találmány tárgya új antioxidáns csoport, amely előnyös farmakológiai jellemzőkkel rendelkezik, és amely katalitikusán és/vagy sztöchiometrikusan eltávolítja a szuperoxidot és/vagy a hidrogén-peroxidot.

A fent megadott szakirodalmi idézetek kizárólag csak a jelen találmány tárgyának kidolgozása előtti állapot bemutatására szolgálnak. A jelen találmány a korábbi szakirodalmakban leírt semmilyen eredményt nem oltalmazza. A közleményeket referenciaként adtuk meg.

A fent leírtakkal összhangban a találmány tárgya gyógyszerkészítmény, amely potenciális antioxidáns és/vagy szabadgyök-fogó jellemzőkkel rendelkeznek, és in vivő antioxidánsként hatnak. A találmány szerinti gyógyszerkészítmény azzal jellemezhető, hogy legalább egy salen-átmenetifém komplex hatásos dózisát tartalmazza, amely jellemzően salen-mangán komplex, mint például salen-Mn(lll) komplex. A találmány szerinti egyik megvalósításnak megfelelően a találmány szerinti gyógyszerkészítmény azzal jellemezhető, hogy olyan salen-Mn komplexet tartalmaz, amely Mn(lll) diaminszármazékkal, mint például etilén-diaminnal képzett kelátja, amelyhez két szubsztituált szalicilaldehid kapcsolódik. Ezek a találmány szerinti gyógyszerkészítmények szuperoxid dizmutáz aktivitással rendelkeznek (azaz szuperoxid dizmutáz aktivitással), és előnyösen a hidrogén-peroxidot vízzé alakítják át (azaz katalázaktivitásúak). A találmány szerinti gyógyszerkészítmények hatásosak az oxigyökök, mint például szuperoxid vagy peroxidok vagy más szabad gyökök képződésével kapcsolatos patológiai károsodások csökkentésére.

HU 225 109 Β1

A találmány szerinti készítményekben alkalmazott salen-átmenetifém komplexek jellemzően salen-mangán komplexek, mint például Mn(lll)-salen komplexek. A találmány tárgya eljárás az ischaemiás/reperfúziós károsodás megelőzésére vagy csökkentésére alapvetően fontos szövetekben, mint például szívizomban és központi idegrendszeri szövetekben. A találmány tárgya továbbá e vegyületek alkalmazása sejtkárosodás megelőzésére vagy csökkentésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállításánál, amely károsodás különféle kémiai vegyületekkel kapcsolatos érintkezésből ered, amely vegyületek potenciálisan káros hatású szabad gyököket termelnek. Ezáltal lehetővé válik, hogy a salen-átmenetifém komplexek előnyösen valamely salen-mangán komplex egy formájának hatásos dózisát adagoljuk, amely terápiás vagy megelőző hatást fejt ki, és amely komplex mérhető SOD-aktivitással és előnyösen továbbá mérhető katalázaktivitással rendelkezik. A találmány szerinti antioxidáns salen-átmenetifém komplexeket különféle úton adagolhatjuk, például parenterális, helyi és orális úton.

A találmány szerinti készítménnyel valamely találmány szerinti salen-átmenetifém komplex terápiás vagy megelőző hatású dózisát adagoljuk önmagában vagy kombinációban, amely kombinációban alkalmazhatunk (1) egy vagy több antioxidáns enzimet, mint például Mn-SOD, valamely Cu, Zn-SOD vagy kataláz és/vagy (2) egy vagy több szabadgyök-kötő hatóanyag, tokoferol, aszkorbát, glutation, DMTU, N-acetil-cisztein vagy Ν-2-merkapto-propionil-glicin és/vagy (3) egy vagy több oxigyök-inhibitor, mint például dezferrioxamin vagy allopurinol, és/vagy egy vagy több biológiai módosító hatóanyag, mint például kalpaininhibitor. A fenti készítmény formált alakja függ a kezelendő vagy megelőzendő adott patológiai állapottól, az adagolás útjától és formájától, a kezelt beteg korától, nemétől és állapotától. A készítmények különféle indikációk esetében adagolhatok, amelyek lehetnek például (1) ischaemia/újra oxigéntelítés sérülés megelőzése betegekben, (2) szervek átültetéssel történő tartósítása anoxiás, hypoxiás vagy hyperoxiás állapotban a beültetés előtt, (3) normálszövetek védelme szabadgyök-indukált károsodástól, amely ionizáló besugárzás és/vagy kemoterápia következtében jöhet létre, amely lehet például bleomicinnel végzett terápia, (4) sejtek és szövetek védelme szabad gyök által indukált sérüléstől, amelyet xenobiotikus vegyületekkel történő érintkezés okozhat, amely vegyületek szabad gyököket termelnek közvetlenül vagy monooxigénezés révén, amely a citokróm P-450 rendszerrel történik, (5) krioprezerválás javítására sejtek, szövetek és szervek esetében vagy szervezetek esetében, a visszanyert egyedek életképességének növelésével, és (6) megelőző adagolás abból a célból, hogy megelőzzük a karcinogenezist, a sejtelöregedést, a kataraktképződést, a malondialdehid-adduktok képződését, a HIV-patológiát és a makromolekula-térhálósodást, mint például a kollagén-térhálósodást.

A találmány tárgya salen-átmenetifém komplexet tartalmazó formált alak, amely orális adagolásra alkalmas, és amelyet úgy állítunk elő, hogy a gyógyszerészetileg elfogadható dózisformát kiszerelőanyagból és nem kisebb mint 1 μg, de nem több mint 10 g legalább egy salen-átmenetifém komplex találmány szerinti antioxidáns anyagból állítunk elő. Az emészthető készítményformát szabadgyök-indukált betegségek és/vagy kemoterápiás daganatellenes kezelések és/vagy normál aerob metabolizmusból eredő oxidatív károsodás kezelésére adagoljuk.

A találmány tárgya továbbá puffereit vizesoldat-készítmény, amely legalább egy, találmány szerinti salen-átmenetifém komplex antioxidánst tartalmaz, legalább 1 nmol/l, de nem több mint kb. 100 mmol/l koncentrációban, és ezt megfelelő adagolási formává alakítjuk át, általában intravénás adagolás esetében kb. 0,1-10 mmol/l koncentrációban, és a készítményt az alábbi típusú betegségek kezelésére alkalmazzuk: (1) ischaemiás epizód, mint például szívizominfarktus, agyi ischaemiás jelenség, átültetési operáció, nyílt szívműtét, adott érplasztikai műtét, koronaér-megvezetési operáció, agyoperáció, veseinfarktus, traumás vérzés, tourniquet alkalmazás, (2) daganatellenes vagy féregellenes kemoterápiás kezelés, amely során a kemoterápiás szer szabad gyököt képez, (3) endotoxikus sokk vagy sepsis, (4) ionizáló sugárzással történő kezelés, (5) exogén kemikáliákkal való érintkezés, amelyek szabad gyökök vagy szabad gyököket termelnek, (6) termikus vagy kémiai égések, vagy fekélyek, (7) túlzott oxigénnyomás, vagy (8) előre meghatározott sejtpopuláció-apoptosis (például lymphocyte apoptosis). A találmány szerinti vizes puffereit oldatok ezen túlmenően alkalmazhatók jellemzően más jól kidolgozott eljárások segítségével szervtenyészetekre, sejttenyészetekre, átültetettt szerv fenntartására, illetve szívizomöblítésre. A találmány tárgykörébe beleértjük a nemvizes formált alakokat, mint például a lipidalapú készítményeket, beleértve a stabilizált emulziókat. Az antioxidáns hatású salen-fém készítményeket több úton adagolhatjuk, amely lehet például intravénás injekció, intramuszkuláris injekció, szubkután injekció, intraperikardiális injekció, sebészeti átöblítőkészítmény, helyi adagolás, szemben történő adagolás, mosás, gargalizálás, beöntés, intraperitoneális infúzió, párabelélegzés, orális öblítés és egyéb utak, amelyek a kívánt gyógyszerészeti vagy állatgyógyászati kezelésnek megfelelnek.

A találmány tárgya továbbá a találmány szerinti antioxidáns hatású salen-átmenetifém komplexek alkalmazása abból a célból, hogy a természetesen előforduló gének vagy egyéb polinukleotidszekvenciák expresszálását módosítsuk, az átírási szabályozás révén, amely átírás egy oxidatívstressz-válasz függvényt szabályoz (például egy antioxidánsra válaszoló elem, ARE), ilyen antioxidánselem-válasz függvényt kiváltó elem lehet a glutation S-transzferáz gén vagy a NAD(P)H:kinon reduktáz gén. Az antioxidáns salen-fém komplexek alkalmazhatók az ARE-szabályozott polinukleotidszekvenciák transzkripciójának módosítására sejttenyészetekben (például ES-sejtek esetében), illetve érintetlen állatokban, különösen olyan

HU 225 109 Β1 transzgén állatokban, amelyekben a transzgén egy vagy több ARE-egységgel, mint transzkripciós szabályozószekvenciával jellemezhető.

A találmány tárgya továbbá gyógyszerkészítmény, amely antioxidáns salen-mangán komplexeket tartalmaz, továbbá eljárás az ilyen antioxidáns salen-mangán komplexek terápiás alkalmazására, továbbá eljárás az antioxidáns salen-mangán komplexek és készítmények diagnosztikában történő alkalmazására, terápiás alkalmazására és kutatásban történő felhasználására, humán- és állatgyógyászati célból.

A találmány tárgya továbbá táplálék megromlásának megakadályozása, illetve oxidáció megakadályozása úgy, hogy a tápanyagban hatásos mennyiségű, legalább egy találmány szerinti salen-fém komplex anyagot alkalmazunk. A találmány tárgya továbbá készítmény, amely alkalmas arra, hogy táplálék megromlását megakadályozza, mely legalább egy antioxidáns hatású salen-fém komplex hatásos mennyiségét tartalmazza, kívánt esetben legalább egy másik tápanyag-tartósító hatóanyaggal kombinációban (amely lehet például butilezett hidroxi-toluol, butilezett hidroxi-amizol, szulfát, nátrium-nitrit, nátrium-nitrát) például valamely antioxidáns salen-fém komplexet tápanyagba foglalhatunk, amely avasodásnak (például oxidációnak) kitett, és így csökkentjük a tápanyag oxidatív lebomlását, amennyiben ez molekuláris oxigénnel érintkezik.

A megadott közlemények és szabadalmi bejelentések ilyen értelemben kezelendők.

Az ábrák rövid leírása

4. ábra: A 4. ábrán bemutatjuk az ischaemiás/újra oxigénnel való telítés jelenséget egy szinaptikus átvitel esetében izolált agymetszeteken.

5. ábra: Az ábrán bemutatjuk a salen-Mn komplex hatását egy ischaemia/újra oxigénnel való telítés epizódot követően az EPSP-amplitúdóra.

6. ábra: Az ábrán bemutatjuk a salen-Mn komplex hatását egy ischaemia/újra oxigénnel való telítés epizód esetében az EPSP kezdeti görbére.

7. ábra: Az ábrán bemutatjuk a salen-Mn komplex hatását egy ischaemia/újra oxigénnel való telítés ismételt epizódok után az agymetszet életképességére.

8. ábra: Az ábrán bemutatjuk a salen-Mn komplex hatását iatrogén Parkinson-betegségre való hatását állati modellekben.

9. ábra: Az ábrán bemutatjuk, hogy a C7 vegyület milyen védelmet nyújt hippocampalis metszetekben a tejsavindulált lipidperoxidálással szemben.

10. ábra: Az ábrán bemutatjuk, hogy a C7 milyen mértékben nyújt védelmet dopaminerg neuronokbán egérstriatumban 6-OHDA-indukált deformálódással szemben.

11. ábra: Az ábrán bemutatjuk, hogy a C7 milyen mértékben védi a dopaminerg neuronokat egérstriatumban MPTP-indukált degenerálódással szemben.

Elnevezések

Hacsak másképp nem jelezzük, valamennyi technikai és tudományos megnevezés a leírással azonos jelentésű, mint amelyet általában alkalmazunk a szakirodalomban. Azonban bármely eljárás és anyag, amely a leírtakkal hasonló vagy ekvivalens, alkalmazható a találmány szerinti eljárás gyakorlatában vagy tesztvizsgálataiban. A leírásban az előnyösen alkalmazható eljárásokat és anyagokat adjuk meg. A találmány szerinti készítmény és eljárás leírásában az alábbi elnevezéseket alkalmazzuk.

Az „antioxidáns” elnevezés alatt olyan anyagot értünk, amely elegyben vagy valamely szerkezetben foglalva, amely oxidálható szubsztrátokat vagy biológiai molekulákat tartalmaz, jelentősen csökkenti vagy megakadályozza a biológiai molekula szubsztrát oxidációját. Az antioxidánsok hatása lehet a biológiailag jelentős reaktív szabad gyökök, vagy más reaktív oxigéntartalmú molekulák (·Ο₂ ^_, H₂O₂, ·ΟΗ, HOCI, ferrilion, peroxilion, peroxi-nitrit és alkoxilgyök) hatását, vagy megakadályozza ezek képződését, vagy katalitikusán a szabad gyököket vagy egyéb reaktív oxigéntartalmú részecskéket egy kevésbé reaktív részecskévé alakít át. A találmány szerinti antioxidáns hatású salen-átmenetifém komplex vegyület általában mérhető SOD-aktivitással rendelkezik. A találmány szerinti salen-átmenetifém komplex vegyület antioxidáns aktivitással rendelkezik, amennyiben a komplex sejttenyészethez vagy tesztvizsgálati reakcióhoz történő adagolása során mérhető csökkenést okoz a szabadgyök-tartalomban, amely gyöktartalom lehet szuperoxid vagy nem gyök típusú reaktív oxigénrészecskékben, amely lehet például hidrogén-peroxid, összehasonlítva párhuzamos olyan sejttenyészetekkel vagy tesztvizsgálati reakciókkal, amelyek a fenti komplexszel nem kezeltek. Alkalmas koncentrációk (azaz hatásos dózis) meghatározhatók különféle eljárásokkal. Ezek az eljárások lehetnek például kísérleti dózis-válasz függvény görbe képzése, a potencia és hatásosság meghatározása valamely hasonló vegyület esetében, QSAR-eljárás alkalmazásával vagy molekuláris modellezéssel és egyéb gyógyszerészeti gyakorlatban alkalmazott eljárásokkal. Mivel az oxidatív károsodás általában kumulatív jellegű, nincs minimális határérték (vagy dózis) a hatásosság vonatkozásában, azonban egy mérhető terápiás vagy megelőző hatást kifejtő minimális dózist adott betegség esetében megállapíthatunk. A találmány szerinti antioxidáns salen-fém komplexek glutation peroxidáz aktivitással is rendelkezhetnek.

A leírásban a „salen-átmenetifém komplex” elnevezés alatt az (I), (II), (lll) vagy (IV), (V), (VI), (VII), (Vili), (IX) (lásd később) szerkezetet értjük, vagy bármely C1, C4, C6, C9, C10, C11, C12, C15, C17, C20, C22, C23, C25, C27, C28, C29 és C30 szerkezetet értünk, amelyeket a 3. ábrán és utóbb bemutatunk, előnyösen ilyen szerkezetek alatt a 3. ábrán bemutatott szerkezetek egyikét értjük, amelyek lehetnek C6, C7 és C12 mole6

HU 225 109 Β1 kulák, előnyösebben a C7 és C12 molekulák, amelyek alkalmasak a szuperoxid katalikus eltávolítására. A vegyületekben található átmenetifém jellemzően Mn, Mg, Co, Fe, V, Cr és Ni; előnyösebben Mn vagy Mg.

A „szabad gyökkel kapcsolatos betegség” elnevezés alatt olyan patológiai rendellenességeket értünk, amely legalább részben szabad gyökök képződésében vagy szabad gyökökkel történő érintkezésből, különösen oxigyökökkel kapcsolatos kontaktusból ered, vagy más reaktív oxigéntartalmú anyagokkal történő érintkezés okozza in vivő körülmények között. A szakember előtt nyilvánvaló, hogy a legtöbb patológiai állapot több faktortól eredő, és ebben a több faktor, ami a betegségállapothoz hozzájárul, különféle lehet. Az egyik faktor, amelyet úgy nevezünk, hogy alapvető okil faktor vagy faktorok egy adott betegségállapotban, de ennek meghatározása gyakran rendkívül nehéz. Ebből az okból a „szabad gyökkel kapcsolatos betegség” elnevezés alatt olyan patológiai állapotokat értünk, amelyek a szakirodalomban olyan körülmények, amelyek szabad gyökökből vagy reaktív oxigéntartalmú anyagokból származó reakciók következtében jönnek létre, amely gyökök, illetve oxigéntartalmú vegyületek a betegség patológiájában szerepet játszanak, illetve olyan betegségek, amelyek esetében szabadgyök-inhibitor (például dezferrioxamin), gyökfogók (például toxoferol, glutation) vagy katalizátorok (például SÓD, kataláz) adagolása az adott állapotban mérhető javulást okoz, csökkenti a szimptómákat, illetve növeli a túlélési időt, vagy egyéb detektálható klinikai előnyöket eredményez a patológiai állapot kezelésében vagy megelőzésében. Például nem limitáltan a fent leírt betegségállapotok, amelyek szabad gyökkel kapcsolatosak, az ischaemiás reperfúziós sérülés, a gyulladásos betegségek, a szisztémás lupus erythematosis, a szívizominfarktus, az agyvérzés, a traumás haemorrhagia, a gerincagytrauma, a Crohn-betegség, az autoimmun betegségek, mint például a reumás ízületi gyulladás, a diabétesz, továbbá a kataraktusképződés, az uveagyulladás, a kötőszöveti gázgyülem, a gyomorfekélyek, az oxigéntoxicitás, a daganatképződés, a nem kívánt sejtapoptosis, a sugárzásból eredő betegség és egyéb fent leírt patológiai állapotok.

A „SOD-mimetikus”, a „SOD-mimikáló”, a „szuperoxid dizmutáz mimetikus”, illetve a „szuperoxidkatalizátor” elnevezések alatt azt értjük, hogy a vegyületek mérhető katalitikus hatást fejtenek ki a szuperoxid lebontásában tesztvizsgálati eredmények alapján. Általában a SOD-mimetikus jellemző azt jelzi, hogy legalább a humán Mn-SOD vagy Zn, Cu-SOD moláris alapú 0,01 %-os hatását bírják a vegyületek, amely hatást standard tesztvizsgálati eljárásokkal határoztunk meg, és/vagy 1 mmol mennyiségre vonatkoztatva a SODtesztvizsgálat eredményeként (amelyet az alábbiakban adunk meg) legalább 0,01 SOD-egység-aktivitással rendelkeznek, legalább előnyösen 1 SOD-aktivitásúak mmol mennyiségre vonatkoztatva.

Az „alkilcsoport” elnevezés alatt ciklusos, elágazó szénláncú vagy egyenes szénláncú alkilcsoportokat értünk, amelyek szénatomot és hidrogénatomot tartalmaznak, hacsak másképp nem jelöljük, és amely csoportok 1-12 szénatomszámúak. Ilyen csoportok lehetnek például a metilcsoport, etilcsoport, n-propil-csoport, izobutilcsoport, terc-butil-csoport, pentilcsoport, pivalilcsoport, heptilcsoport, adamantilcsoport és ciklopentilcsoport. Az alkilcsoportok lehetnek szubsztituálatlanok, vagy egy vagy több szubsztituenst tartalmazhatnak, ahol a szubsztituensek lehetnek halogénatom, alkilcsoport, alkoxicsoport, alkil-tio-csoport, trifluor-metil-csoport, acil-oxi-csoport, hidroxilcsoport, merkaptocsoport, karboxilcsoport, aril-oxi-csoport, arilcsoport, aril-alkil-csoport, heteroarilcsoport, aminocsoport, alkil-amino-csoport, dialkil-amino-csoport, morfolinocsoport, piperidinocsoport, pirrolidin-1-il-csoport, piperazin-1-il-csoport vagy egyéb funkciós csoport.

A „kis szénatomszámú alkilcsoport” elnevezés alatt ciklusos elágazó vagy egyenes szénláncú egy vegyértékű alkilcsoportokat értünk, amelyek 1-6 szénatomot tartalmaznak, és amelyek lehetnek például metilcsoport, etilcsoport, n-propil-csoport, i-propil-csoport, n-butil-csoport, terc-butil-csoport, i-butil-csoport (vagy 2-metil-propil-csoport), ciklopropil-metil-csoport, iamil-csoport, n-amil-csoport és hexilcsoport.

Az „arilcsoport” vagy „Ar csoport elnevezés alatt egy vegyértékű telítetlen aromás karbociklusos csoportokat értünk, amelyek egy gyűrűt tartalmaznak (például fenilcsoport), vagy több kondenzált gyűrűt tartalmaznak (például naftilcsoport vagy antranilcsoport), és amelyek kívánt esetben szubsztituálatlanok vagy szubsztituenst tartalmazhatnak, ahol a szubsztituens például lehet halogénatom, alkilcsoport, alkoxicsoport, alkil-tio-csoport, trifluor-metil-csoport, acil-oxi-csoport, hidroxilcsoport, merkaptocsoport, karboxilcsoport, aril-oxi-csoport, arilcsoport, aril-alkil-csoport, heteroarilcsoport, aminocsoport, alkil-amino-csoport, dialkil-amino-csoport, morfolinocsoport, piperidinocsoport, pírrolidin-1-il-csoport, piperazin-1-il-csoport vagy egyéb funkciós csoport.

A „szubsztituált alkoxicsoport elnevezés alatt az -O-R általános képletű csoportot értjük, ahol R jelentése alkilcsoport, amely egy nem befolyásoló jellegű szubsztituenssel szubsztituált. Az „aril-alkoxi-csoport” elnevezés alatt az -O-R-Ar általános képletű csoportokat értjük, ahol R jelentése alkilcsoport és Ar jelentése aromás szubsztituenscsoport. Az aril-alkoxi-csoportok szubsztituált alkoxicsoportok alcsoportját képezik. Ilyen előnyös szubsztituált alkoxicsoportok a benziloxi-csoport, a naftil-oxi-csoport és klór-benzil-oxicsoport.

Az „aril-oxi-csoport” elnevezés alatt -O-Ar általános képletű csoportokat értünk, ahol Ar jelentése valamely aromás csoport. Előnyös ilyen csoport a fenoxicsoport.

A „heterociklusos csoport” elnevezés alatt egy vegyértékű, telítetlen vagy aromás karbociklusos csoportot értünk, amely egyetlen gyűrűt tartalmaz (például morfolinocsoport, piridilcsoport vagy furilcsoport), vagy több kondenzált gyűrűt tartalmaz (például indolizinilcsoport vagy benzo[b]tienil-csoport), és amely legalább egy heteroatomot, amely lehet nitrogénatom, oxigén7

HU 225 109 Β1 atom, foszforatom vagy kénatom, tartalmaz a gyűrűn belül, és amely gyűrű kívánt esetben szubsztituálatlan vagy szubsztituált lehet, ahol a szubsztituensek lehetnek például halogénatom, alkilcsoport, alkoxiesoport, alkil-tio-csoport, trifluor-metil-csoport, acil-oxi-csoport, hidroxilcsoport, merkaptocsoport, karboxilcsoport, aril-oxi-csoport, arilcsoport, aril-alkil-csoport, heteroarilcsoport, aminocsoport, alkil-amino-csoport, dialkil-amino-csoport, morfolinocsoport, piperidinocsoport, pirrolidin-1-il-csoport, piperazin-1-il-csoport vagy egyéb funkciós csoport. A „heteroarilcsoport” vagy a „HetAr” elnevezés alatt aromás heterociklusos csoportot értünk.

Az „aril-alkil-csoport” elnevezés alatt -R-Ar általános képletű csoportokat és -R-HetAr általános képletű csoportokat értünk, amelyekben Ar jelentése valamely arilcsoport, HetAr jelentése heteroarilcsoport és R jelentése egyenes vagy elágazó szénláncú alifás csoport. Ilyen aralkilcsoportok például lehetnek a benzilcsoport és furfurilcsoport. Az aril-alkil-csoportok kívánt esetben szubsztituáltak lehetnek, vagy lehetnek szubsztituálatlanok is. A szubsztituensek ilyen esetben lehetnek például halogénatom, alkilcsoport, alkoxiesoport, alkil-tio-csoport, trifluor-metil-csoport, acil-oxi-csoport, hidroxilcsoport, merkaptocsoport, karboxilcsoport, aril-oxi-csoport, arilcsoport, aril-alkil-csoport, heteroarilcsoport, aminocsoport, alkil-amino-csoport, dialkil-amino-csoport, morfolinocsoport, piperidinocsoport, pirrolidin-1-il-csoport, piperazin-1-il-csoport vagy más funkciós csoportok.

A „haló” vagy „halogenid” elnevezés alatt fluoratomot, brómatomot, klóratomot és jódatomot értünk.

Az általános képletekben az „OBn” elnevezés alatt benzil-oxi-csoportot értünk.

A leírásban az „aminocsoport” elnevezés alatt -NR'R” általános képletű csoportokat értünk, ahol R' és R” jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport vagy arilcsoport. A „kvaterner amin elnevezés alatt a -N⁺R’R”R' általános képletű pozitívan töltött csoportot értjük, ahol az általános képletben R’, R, R’” jelentése egymástól függetlenül alkilcsoport vagy arilcsoport. Előnyös aminocsoport a -NH₂ képletű csoport.

A „szililcsoport” elnevezés alatt organofém szubsztituenseket értünk, amelyben legalább egy szilíciumatom található, ami legalább egy szénatomhoz kapcsolódik. Ilyen szililcsoport szubsztituensek a trimetil-szilil-csoport (CH₃)₃SiA „gyógyszerészeti hatóanyag vagy gyógyszer” elnevezés alatt olyan kémiai vegyületet vagy olyan készítményt értünk, amennyiben megfelelően adagoljuk a betegnek, a kívánt terápiás hatást fejti ki.

Az egyéb kémiai elnevezéseket a leírásban a szakirodalomban ismerteknek megfelelően alkalmazzuk, amelyet például a The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (ed. Parker, S., 1985), McGraw-Hill, San Francisco, közleményben leírtak, amelyet referenciaként adunk meg.

Általában a leírásban alkalmazott nevezéktan az alkalmazott sejttenyészeti laboratóriumi eljárások, az analitikai kémia, a szerves szintetikus kémia és a gyógyszerkészítmény előállításának eljárásai a szakirodalomban jól ismert eljárások. A kémiai szintézis, a kémiai analízis és a gyógyszerkészítmény előállításában standard technológiákat alkalmaztunk, illetve standardeljárás szerint végeztük a betegek kezelését, illetve a készítmény adagolását.

A jelen találmány azon a felismerésen alapul, hogy az epoxidáláskatalizátorként eredetileg leírt úgynevezett salen-átmenetifém komplex anyagok csoportja, ezen túlmenően hatásos szuperoxid dizmutáz aktivitással és/vagy katalázaktivitással is rendelkezik, és így katalizálja in vitro és in vivő módon is a szabadgyök-eltávolítást. A salen-átmenetifém komplexet, mint királis epoxidáláskatalizátorokat leírták különféle szintetikus kémiai eljárásban [Fu és munkatársai (1991) J. Org. Chem. 56: 6497; Zhang W és Jacobsen EN (1991) J. Org. Chem. 56:2296; Jacobsen és munkatársai (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 6703; Zhang és munkatársai (1990) J. Am. Chem. Soc. 112: 2801; Lee NH és Jacobsen EN (1991) Tetrahedron Lett. 32: 6533; Jacobsen és munkatársai (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 7063; Lee és munkatársai (1991) Tetrahedron Lett. 32: 5055]. Azonban a salen-átmenetifém komplexek ezen túlmenően hatásos antioxidánsként is működnek különféle biológiai alkalmazás esetében, beleértve gyógyszerkészítményként történő alkalmazásukat szabad gyökkel kapcsolatos betegségek megelőzésében vagy kezelésében. Legalább egy salen-átmenetifém komplex antioxidáns hatásos mennyiségével vagy koncentrációjával gyógyszerkészítményeket, élelmiszer-kiegészítő anyagokat, javított sejt- és szervtenyészetközeget, javított kriotartósítóközeget, helyi kenőcsöket és kemoprotektív vagy radioprotektív készítményeket állíthatunk elő.

A salen-fém komplexek katalitikus aktivitása, amellyel epoxidok interkonverzióját katalizálják, ugyancsak előnyösen alkalmazható citotoxikus és/vagy karcinogén epoxidrészecskék megkötésére, illetve képződésüknek in vivő megakadályozására, amely részecskék lehetnek például a citokróm P-450 monooxigénezési rendszer által előállított anyagok (például benzo[a]pirén-diol-epoxid). A katalitikus salen-fém komplexek előnyösen alkalmazhatók élelmiszerekben vagy tápanyagokban (vagy más formában adagolhatok) az adott betegnek, aki policiklusos szénhidrogén kémiai karcinogén hatásának kitett, mint például a petrokémiai iparban és a festékiparban dolgozó embereknek. Ezen túlmenően a katalitikusán aktív salen-fém komplexek dohányzóknak is készítményként adagolhatok (a passzív dohányzókat is beleértve) abból a célból, hogy a cigarettafüstből származó reaktív epoxidok detoxifikálását gyorsítsák.

A találmány szerinti salen-fém komplex antioxidáns vegyületek alkalmazásával a neurodegeneratív betegségek előrehaladását részlegesen vagy teljesen meg lehet állítani. Például a Cu/Zn szuperoxid dizmutázban található mutációk szorosan kapcsolódnak az izomsorvadásos oldalsó selerosis betegséghez (ALS) [Rosen és munkatársai (1993) Natúré 362:59; Deng és munkatársai (1993) Science 261:1047], Hasonló endogén an8

HU 225 109 Β1 tioxidáns módosulások felelősek a multiplex sclerosis, a perifériás neuropathia és hasonló betegségek kialakulásáért. A találmány szerinti antioxidáns salen-fém komplexek ilyen neurodegenerativ betegségek megelőzésében is felhasználhatók (például az ALS, MS).

Salen-átmenetifém komplexek

A találmány tárgya az (I) általános képletű salen-átmenetifém komplexek alkalmazása, ahol az általános képletben

M jelentése átmenetifém-ion, előnyösen Mn;

A jelentése anion, jellemzően Cl; és n jelentése 0, 1 vagy 2.

Xi, X₂, X3 és X₄ jelentése egymástól függetlenül lehet hidrogénatom, szililcsoport, arilcsoport, aril-alkil-csoport, elsőrendű alkilcsoport, másodrendű alkilcsoport, tercier alkilcsoport, alkoxicsoport, aril-oxi-csoport, aminocsoport, kvaterner aminocsoport, heteroatom és hidrogénatom; jellemzően

X-I és X₃ jelentése azonos funkciós csoport, és lehet hidrogénatom, kvaterner aminocsoport vagy tercier butilcsoport; és

X₂ és X₄ jelentése általában hidrogénatom.

Υι, Y₂, Y₃, Y₄, Y₅ és Y₆ jelentése egymástól függetlenül lehet hidrogénatom, halogénatom, alkilcsoport, arilcsoport, aril-alkil-csoport, szililcsoport, aminocsoport, heteroatomot tartalmazó alkilcsoport vagy arilcsoport, aril-oxi-csoport, alkoxicsoport és halogénatom.

Előnyösen Y·, és Y₄ jelentése alkoxicsoport, halogénatom vagy aminocsoport.

Jellemzően Yt, és Y₄ jelentése megegyező.

^R1 · ^r2· ^r3 ^{és r}4 jelentése egymástól függetlenül lehet hidrogénatom, metilcsoport, etilcsoport, fenilcsoport, O-benzil-csoport, elsőrendű alkilcsoport, zsírsav-észter-csoport, szubsztituált alkoxi-aril-csoport, heteroatomot tartalmazó aromás csoport, aril-alkil-csoport, másodrendű alkilcsoport és tercier alkilcsoport.

A találmány szerinti első vegyületcsoport esetében

Xt és X₃ helyzetek legalább egyike, előnyösen Xt és X₃ mindegyike valamely olyan szubsztituens, amely védőcsoport, és lehet például másodrendű vagy harmadrendű alkilcsoport, arilcsoport, szililcsoport, heterociklusos csoport és heteroatom szubsztituenst, mint például alkoxicsoportot vagy halogénatomot tartalmazó alkilcsoport. Előnyösen X-, és X₃ helyzetek azonos szubsztituenst tartalmaznak, amely szubsztituens legelőnyösebben tercier alkilcsoport, mint például tercier butilcsoport. Előnyösen amennyiben X1 és X₃ jelentése védőcsoport, akkor X₂ és X₄ jelentése nemvédőcsoport, mint például hidrogénatom, metilcsoport, etilcsoport és elsőrendű alkilcsoport, legelőnyösebben hidrogénatom. Más esetben az Xt, X₂, X₃ és X₄ csoportok közül három vagy négy jelentése is lehet védőcsoport szubsztituens.

A találmány szerinti első vegyületcsoport esetében jellemzően legalább egy és általában nem több mint két R_1f R₂, R₃ és R₄ csoport jelentése hidrogénatom, metilcsoport, etilcsoport vagy elsőrendű alkilcsoport. Ezeket a csoportokat nemvédőcsoportoknak nevezzük. Amennyiben Rt jelentése nemvédőcsoport, akkor R₂ és R₃ jelentése előnyösen védőcsoport, és jellemzően R₂ és R₃ jelentése megegyezik, és fenilcsoport vagy benzil-oxi-csoport. Amennyiben R₂ jelentése nemvédőcsoport, abban az esetben R₄ és R₄ jelentése előnyösen védőcsoport, hasonló amennyiben R₃ jelentése nemvédőcsoport, abban az esetben Rt és R₄ jelentése előnyösen védöcsoport. Végül amennyiben R₄ jelentése nemvédőcsoport, ebben az esetben R₂ és R₃ jelentése előnyösen védőcsoport. Különösen előnyös védőcsoportok a fenilcsoport és a benzil-oxi-csoport bármely Rt , R2, R3 és R₄ szubsztituensre vonatkoztatva. Előnyösen a védőcsoportok megegyező csoportok. Az előnyös vegyületek esetében Rt és R₄ jelentése benzil-oxi-csoport vagy fenilcsoport, és R₂, valamint R₃ jelentése hidrogénatom.

A találmány szerinti első vegyületcsoport esetében megkövetelt, hogy a két nitrogénatommal szomszédos szénatomon található négy szubsztitúciós helyzet legalább egy vagy két tagja nemvédőcsoport szubsztituenst tartalmaz.

Előnyösen a nemvédőcsoport szubsztituens hidrogénatom vagy metilcsoport, legelőnyösebben hidrogénatom. Előnyösen a védőcsoport szubsztituens fenilcsoport, benzil-oxi-csoport vagy terc-butil-csoport, legelőnyösebben fenilcsoport vagy benzil-oxi-csoport és legáltalánosabban fenilcsoport.

Előnyösen Y₃ és Y₆ jelentése hidrogénatom, metilcsoport, alkilcsoport vagy arilcsoport. Előnyösebben ezek jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport. Legelőnyösebben jelentésük hidrogénatom.

Az Yt, Y₂, Y₄ és Y₅ helyzeteket egymástól függetlenül választhatjuk ki, és ezek jelentése előnyösen hidrogénatom, azonban ezekben a helyzetekben szubsztituensek is lehetnek, amelyek egymástól függetlenül lehetnek hidrogénatom, halogénatom, alkilcsoport, arilcsoport, alkoxicsoport, szubsztituált alkoxicsoport, nitrocsoport és aminocsoport. Yt és Y₄ jelentése előnyösen metoxicsoport, etoxicsoport, klóratom, brómatom, jódatom, elsőrendű alkilcsoport, tercier butilcsoport, elsőrendű aminocsoport, másodrendű aminocsoport vagy tercier aminocsoport, legelőnyösebben metoxicsoport, klóratom, terc-butil-csoport vagy metilcsoport.

A találmány tárgya továbbá a (II) általános képletű salen-átmenetifém komplex vegyület alkalmazása, ahol az általános képletben

M jelentése átmenetifém-ion, előnyösen Mn; és

A jelentése anion, jellemzően Cl;

továbbá az általános képletben

Xt vagy X₂ legalább egyikének jelentése arilcsoport, elsőrendű alkilcsoport, másodrendű alkilcsoport, tercier alkilcsoport, vagy heteroatom; és legalább

Xt vagy X₃ egyikének jelentése arilcsoport, elsőrendű alkilcsoport, másodrendű alkilcsoport, tercier alkilcsoport, aril-alkil-csoport, heteroatom vagy hidrogénatom, előnyösen terc-butil-csoport vagy hidrogénatom; és ahol

Yi. ^2’ Y4- Y5, Υβ> 2i, Z₂, Z₃, Z₄, Z₅, Z₆, Z₇, Z₈, Z₉,

Z₁₀, Zt t , valamint Z₁₂ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, halogénatom, alkilcsoport, aril9

HU 225 109 Β1 csoport, aminocsoport, alkoxicsoport, szubsztituált alkoxicsoport, aril-alkil-csoport, aril-oxi-csoport és heteroatomot viselő alkilcsoport.

Előnyösen Y₁ és Y₄ jelentése kis szénatomszámú alkilcsoport, alkoxicsoport, halogénatom és aminocsoport, előnyösebben metoxicsoport, klóratom és elsőrendű aminocsoport. A második vegyületcsoportba tartozó vegyületek közül előnyösek, amelyekben Y-| és Y₄ jelentése az általános képletben metoxicsoport, Y-i és Y₃ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy terc-butil-csoport, és a többi szubsztituens jelentése hidrogénatom.

A találmány tárgya továbbá a (III) általános képletű salen-átmenetifém komplex vegyületek, ahol az általános képletben

M jelentése átmenetifém-ion, jellemzően Mn; és A jelentése valamely anion, jellemzően Cl; és n jelentése 4, 5 vagy 6;

Xi, X₂, X₃ és X₄ jelentése egymástól függetlenül lehet arilcsoport, aril-alkil-csoport, aril-oxi-csoport, elsőrendű alkilcsoport, másodrendű alkilcsoport, tercier alkilcsoport, alkoxicsoport, szubsztituált alkoxicsoport, heteroatom, aminocsoport, kvaterner aminocsoport és hidrogénatom; előnyösen legalább

X!, vagy X₃ egyikének jelentése arilcsoport, elsőrendű alkilcsoport, másodrendű alkilcsoport, tercier alkilcsoport, kvaterner aminocsoport, aril-alkil-csoport, heteroatom vagy hidrogénatom; előnyösen

X-, és X₃ jelentése megegyező és hidrogénatom vagy terc-butil-csoport; továbbá

Υ_Ί, Y₂, Y₃, Y₄, Y₅ és Y₆ jelentése arilcsoport, aril-alkil-csoport, elsőrendű alkilcsoport, másodrendű alkilcsoport, tercier alkilcsoport, alkoxicsoport, szubsztituált alkoxicsoport, aril-oxi-csoport, halogénatom, heteroatom, aminocsoport, kvaterner aminocsoport és hidrogénatom; előnyösen

Y·, vagy Y₄ legalább egyikének jelentése arilcsoport, elsőrendű alkilcsoport, másodrendű alkilcsoport, tercier alkilcsoport, szubsztituált alkoxi-csoport, heteroatom, aminocsoport és halogénatom; előnyösebben Yi és Y₄ jelentése megegyező, és lehet metoxicsoport, klóratom, brómatom, jódatom, terc-butil-csoport vagy aminocsoport.

R-, és R₄ jelentése egymástól függetlenül lehet hidrogénatom, halogénatom, elsőrendű alkilcsoport, másodrendű alkilcsoport, harmadrendű alkilcsoport, zsírsav-észter-csoport, alkoxicsoport vagy arilcsoport.

Előnyösen Rí és R₄ jelentése megegyező, és különösen előnyösen R·, és R₄ jelentése hidrogénatom.

Előnyös antioxidáns salen-fém komplexek Az alábbi antioxidáns salen-fém komplexek előnyösen alkalmazhatók a találmány szerinti készítményekben és eljárásokban, amely vegyületekben, ha nem jelöljük, a szubsztituensek jelentése hidrogénatom.

(IV) általános képletű vegyület, ahol az általános képletben

Y₁ és Y₂ jelentése egymástól függetlenül metoxicsoport, etoxicsoport, metilcsoport, etilcsoport, terc-butil-csoport, klóratom, brómatom, jódatom, aminocsoport, kvaterner aminocsoport, alkil-amino-csoport, dialkil-amino-csoport és hidrogénatom;

R₁ és R₂ jelentése egymástól függetlenül fenilcsoport, benzil-oxi-csoport, klór-benzil-oxi-csoport, hidrogénatom, aminocsoport, kvaterner aminocsoport vagy zsírsav-észter-csoport.

Előnyösen Y! és Y₂ jelentése megegyező.

(V) általános képletű vegyület, ahol az általános képletben

R-ι és R₂ jelentése egymástól függetlenül fenilcsoport, benzil-oxi-csoport, klór-benzil-oxi-csoport, hidrogénatom, aminocsoport, kvaterner aminocsoport vagy zsírsav-észter-csoport.

Előnyösen R₁ és R₂ jelentése megegyező.

(VI) általános képletű vegyület, ahol az általános képletben

Yi és Y₂ jelentése egymástól függetlenül metoxicsoport, etoxicsoport, metilcsoport, etilcsoport, terc-butil-csoport, klóratom, brómatom, jódatom, aminocsoport, kvaterner aminocsoport, alkil-amino-csoport, dialkil-amino-csoport és hidrogénatom; továbbá

R₁ és R₂ jelentése egymástól függetlenül fenilcsoport, benzil-oxi-csoport, klór-benzil-oxi-csoport, hidrogénatom, aminocsoport, kvaterner aminocsoport vagy zsírsav-észter-csoport.

Előnyösen Y^ valamint Y₂ jelentése megegyező, továbbá R-ι és R₂ jelentése megegyező.

(VII) általános képletű vegyület, ahol az általános képletben

X jelentése metoxicsoport, etoxicsoport, metilcsoport, etilcsoport, terc-butil-csoport, klóratom, brómatom, jódatom, aminocsoport, kvaterner aminocsoport, alkil-amino-csoport, dialkil-amino-csoport és hidrogénatom;

Y jelentése terc-butil-csoport, kvaterner aminocsoport, aminocsoport és hidrogénatom.

(Vili) általános képletű vegyületek, ahol az általános képletben

Rt és R₂ jelentése egymástól függetlenül aril-oxi-csoport, alkoxicsoport, arilcsoport és hidrogénatom;

R’ és R” jelentése egymástól függetlenül alkilcsoport, arilcsoport és hidrogénatom.

Előnyösen legalább egyik aminocsoport fiziológiai pH(azaz pH 7,3-7,8) értéknél protonált. Előnyösen R’ és R” jelentése alkilcsoport, amely nem limitáltan lehet metilcsoport, etilcsoport és propilcsoport. Előnyös R₁ és R₂ aril-oxi-csoportok nem limitáltan lehetnek benzil-oxi-csoport és klór-benzil-oxi-csoport. Előnyös R₁ és R₂ alkoxicsoportok nem limitáltan lehetnek etoxicsoport és metoxicsoport.

Előnyös (Vili) általános képletű vegyületalcsoport, de nem limitáltan a (IX) általános képletű vegyületcsoport, ahol az általános képletben

R jelentése alkilcsoport vagy hidrogénatom, előnyösen legalább egy aminocsoport, fiziológiai pH(azaz pH 7,3-7,8) érték mellett protonált.

Az alábbi vegyületek előnyös antioxidáns találmány szerinti salen-átmenetifém komplexek, amely alkal10

HU 225 109 Β1 mázhatok gyógyszerkészítmény, élelmiszer-kiegészítők, élelmiszer-tartósítók, kozmetikumok, napvédő szerek és más találmány szerinti készítmények előállítására, és amelyeket a szerkezet nevével jelölünk (amely nevek C1-C30-ig terjedő számjelzések).

Gyógyszerkészítmények

A találmány szerinti előnyös gyógyszerkészítmények azzal jellemezhetők, hogy legalább egy salenszármazék-alapú átmenetifémion-komplex terápiásán vagy megelőzően hatásos mennyiségét tartalmazzák. A „sálén” elnevezés alatt olyan ligandumokat értünk, amelyek jellemzően két molekula, egy szalicilaldehid-származék és egy molekula diaminszármazék kondenzációs reakciójával képezhetők. Általában a salenligandumokat etilén-diamin-származékokból állítjuk elő, azonban analóg salenvegyületeket és salenszármazékokat állíthatunk elő propil- és butil-diaminok alkalmazásával. Előnyös vegyületek a salenszármazékok, amelyeknek általános szerkezetét az 1. ábrán mutatjuk be. A 2. ábrán olyan salenszármazékot mutatunk be, amelyben n jelentése 0.

Mint az 1. ábrából kitűnik, két nitrogén és két oxigén a salenligandum központja felé irányul, és így az átmenetifém M ionnak komplexálóhelyet biztosít. Előnyösen az alkalmazott fémion lehet Mn, Cr, Fe, Ni, Co, Ti, V, Ru és Os. Előnyösebben az alkalmazott átmenetifém-ion Mn, Mg, Cr, Fe, Ni és Co. Legelőnyösebben alkalmazható fémion a Mn.

Előnyösen az alkalmazott anion lehet PF₆, (aril)₄, BF₄, B(aril)₄, halogenid, acetát, triflát, tozilát, előnyösen halogenid vagy PF₆, legelőnyösebben kloridion.

Az 1. ábrából ugyancsak kitűnik, hogy több helyzetben a salenligandum szubsztituált lehet. Ezek a helyzetek az R₁, R_z, R₃, R₄ és X·,, X₂, X₃, X₄, Y₃ és Y₆ helyzetek, és ezek a legfontosabbak az első típusú salen-átmenetifém komplexben.

Az (I), (III), (IV), (VI), (VII), (Vili) általános képletű vegyietekben az R-|, R₂, R₃ és R₄ helyzetekben egymástól függetlenül zsírsav-észter-csoport szubsztituens lehet jelen. Amennyiben zsírsav-észter-csoport található a molekulában, ez maximum két szubsztitúciós helyzetet foglal el, és általában a csoportok megegyezőek.

A találmány szerinti vegyületek előállításában alkalmazható zsírsavakat az 1., 2. és a 3. táblázatokban mutatjuk be.

1. táblázat

CH3-(CH2)f-(CH=CH)g-(CH2)h-CO2H
Szénatom- szám	f	9	h	Sav neve
16	5	1	7	Palmitolajsav
18	7	1	7	Olajsav
18	10	1	4	Petroselenoilsav
18	5	1	9	Vaccenolsav
18	3	3	7	Punicinsav

CH3-(CH2)r(CH=CH)g-(CH2)h-CO2H
Szénatom- szám	f	9	h	Sav neve
18	1	4	7	Parinarinsav
20	9	1	7	Gadoleinsav
22	9	1	9	Cetoleinsav

2. táblázat

CH3-(CH2)n-(CH=CH-CH2)m-(CH2)p-CO2H
Szénatomszám	f	9	h	Sav neve
18	3	3	7	Punicinsav
18	1	4	7	Parinarinsav
20	9	1	7	Gadoleinsav

3. táblázat

CH3-(CH2)W-CO2H
Szénatomszám	w	Sav neve
12	10	Laurinsav
14	12	Mirisztinsav
16	14	Palmitinsav
18	16	Sztearinsav
20	18	Eikoszanoinsav
22	20	Dokoszanoinsav

A szakember felismeri, hogy a telítetlen savak izomer formákban létezhetnek, mivel egy vagy két telítetlen kötést tartalmaznak. A találmány szerinti vegyületek tárgykörébe beleértjük az egyes kettős kötés izomereket, valamint ezek keverékeit is. A jelen találmány szerinti vegyületekben alkalmazható zsírsav-észtereket ismert acilezési eljárásokkal állíthatjuk elő. Lásd például a March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York (1985), 299, 348-351 és 353-354 o. közleményt, amelyeket referenciaként adunk meg.

Előnyös antioxidáns salen-átmenetifém komplexek

A 3. ábrán bemutatjuk a találmány szerinti előnyös antioxidáns salen-átmenetifém komplexek szerkezetét. A 3. ábrán az antioxidáns salen-átmenetifém komplexek példáit mutatjuk be. Különösen előnyösen alkalmazhatók a találmány szerinti antioxidánskészítményekben és gyógyszerkészítményekben a C1, C4, C6, C7, C9, C10, C11 és C12 képletű vegyületek. Különösen előnyösen alkalmazható vegyület a C7 képletű vegyület, mivel ez könnyen előállítható és viszonylag hidrofil jellegű, ami a gyógyszerészeti alkalmazásban előnyös.

Előnyös salen-átmenetifém komplex, amely magas szuperoxid dizmutáz aktivitással rendelkezik, a C12 képletű vegyület.

HU 225 109 Β1

További előnyös C12-vel analóg vegyületek a C29 és a C30 képletű vegyületek.

Különösen előnyös találmány szerinti antioxidáns salen-fém komplex a C7 képletű vegyület.

A találmány szerinti antioxidáns salen-átmenetifém komplexek általában mérhető szuperoxid dizmutáz aktivitással és előnyösen továbbá katalázaktivitással rendelkeznek. A C7 képletű vegyület előnyös, mivel előállítása egyszerű és viszonylag hidrofil jellegű, amely jellemzője igen alkalmassá teszi gyógyszerészeti felhasználásra és vizes oldatban történő formulálásra. A C7 képletű vegyület viszonylag hidrofil jellege azt az előnyt biztosítja, hogy olyan antioxidáns salen-fém komplexeket alkalmazhatunk, amelyek az emberi testben könnyen abszorbeálódnak és áramlanak. A C7 képletű vegyület egyik előnyös farmakokinetikai tulajdonsága valószínűleg az, hogy könnyen áthalad a vér-agy gáton.

Az antioxidáns salen-átmenetifém komplexek előállítása

A salen-átmenetifém komplexeket az US91/01915 számú 1991. március 21-én benyújtott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben, továbbá Fu és munkatársai (1991) J. Org. Chem. 56:6497; Zhang W és Jacobsen EN (1991) J. Org. Chem. 56:2296; Jacobsen és munkatársai (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 6703; Zhang és munkatársai (1990) J. Tetrahedron Lett. 32:6533; Jacobsen és munkatársai (1991) J. Am. Chem. Soc. 113:7063; Lee és munkatársai (1991) Tetrahedron Lett. 32:5055 közleményekben írták le, amelyeket referenciaként adunk meg.

Általában a találmány szerinti antioxidáns salen-átmenetifém komplexeket előnyösen úgy állíthatjuk elő, hogy a szubsztituált szalicilaldehidet és a szubsztituált diamint kondenzációs reakcióban reagáltatjuk. Általában a fenti vegyületek reakcióelegyben alkalmazott mólaránya 2:1, és a reakciót vízmentes etanolban hajtjuk végre. Az oldatokat jellemzően 1 órán át visszafolyatás mellett forraljuk, majd a salenligandumot vagy analitikailag tiszta formában víz hozzáadásával csapadékként leválasztjuk, vagy közvetlenül fémkomplexet állítunk elő úgy, hogy a fémet acetát-, halogenid- vagy triflátsó formában az oldathoz adagoljuk.

Az alábbiakban ismertetjük a (X) általános képletű antioxidáns salen-Mn komplexek általános előállítási eljárását.

A salenligandumot forró, vízmentes etanolban újra oldjuk, és így 0,1 mol/l oldatot állítunk elő. Az oldathoz egy részletben 2,0 ekvivalens szilárd Mn(OAC)₂-4H₂O vegyületet adagolunk, majd az elegyet 1 órán át visszafolyatás mellett forraljuk. Ezt követően az elegyhez kb. 3 ekvivalens mennyiségű szilárd LiCI-vegyületet adagolunk, majd az elegyet további 0,5 órán át visszafolyatás mellett forraljuk. Ezután az elegyet 0 °C hőmérsékletre hűtjük, és így a Mn(lll)komplex sötétbarna kristályos anyagként kiválik. A kristályos anyagot vízzel alaposan mossuk, majd szűréssel kb. 75%-os termeléssel izoláljuk. További anyagot nyerhetünk ki az anyalúgból úgy, hogy ehhez vizet csepegtetünk. A katalizátor egyesített termelése általában kb. 85-95% ebben a lépésben, és kb. 80-90% az optikailag tiszta 1,2-difenil-etilén-diaminra vonatkoztatva.

A találmány szerinti antioxidáns salen-Mn komplexek másik előállítási eljárása az alábbi. Legelőnyösebben kiindulási diaminként R,R- vagy S,S-1,2-diamino-1,2-difenil-etánt alkalmazunk, és a kiindulási szalicilaldehid 3-terc-butil-szalicilaldehid. 2,0 mmol 3-terc-butil-szalicilaldehid 3 ml száraz metanolban készült oldatát hozzácsepegtetjük 1,0 mmol (R,R)-1,2diamino-1,2-difenil-etán 5 ml etanolban készült oldatához. A reakcióelegyet ezt követően 1 órán át visszafolyatás mellett forraljuk, majd a forró (60 °C) oldathoz egy részletben 1,0 mmol Mn(OAc)₂-4H₂O anyagot adagolunk. Az oldat színe sárgáról azonnal barnára változik a beadagolás során. Ezt az elegyet további 30 percen visszafolyatás mellett forraljuk, majd szobahőmérsékletre hűtjük. Ezt követően a keverékhez 5 ml 10%-os nátrium-klorid-oldatot csepegtetünk, és az elegyet 0,5 órán át keverjük. Az oldószert ezután vákuumban elpárologtatjuk, és a maradékot 50 ml diklór-metánnal és 50 ml vízzel eldolgozzuk. A szerves fázist elválasztjuk, majd a barna oldatot telített nátrium-klorid-oldattal mossuk. A szerves fázist elválasztjuk, majd az oldószert elpárologtatjuk, és így nyersterméket kapunk, amelyet benzol/ciklohexán oldószerelegyből átkristályosítunk, így (R.R)-salen-Mn komplexet kapunk.

A találmány szerinti antioxidáns salen-átmenetifém komplexek szintézisét szokásos eljárással a szakember elvégezheti az idézett szakirodalomban leírtaknak megfelelően.

Az előállított salen-Mn komplexek SOD-aktivitását szokásos tesztvizsgálattal mutathatjuk ki, amely tesztvizsgálatot a SOD-aktivitás kimutatására a szakirodalomban leírták. Az 1 mmol/l koncentrációjú vizes oldatban legalább 0,01 egység SOD-aktivitással rendelkező salen-fém komplexek antioxidáns salen-fém komplexek. Előnyösen az antioxidáns salen-fém komplexek 1 mmol/l koncentráció mellett legalább kb. 1 egység SOD-aktivitással rendelkeznek, különösen előnyösen SOD-aktivitásuk mmol/l koncentrációként legalább kb. 100 egység SOD-aktivitás. Gyakran ezek a vegyületek mmol-onként több mint 500-1000 egység SOD-aktivitással vagy ennél nagyobb aktivitással rendelkeznek. Amennyiben bizonyos gyógyászati célra katalázaktivitás is előnyös, előnyösen olyan salen-fém komplexet alkalmazunk, amely SOD-mimetikus jellemzői mellett mérhető katalázaktivitással is rendelkezik (például C4, C7, C9, C10, C11, C12 képletű vegyületek); jellemzően ezek a vegyületek mmol mennyiségre vonatkoztatva legalább 10 katalázaktivitás egységgel rendelkeznek, és sok esetben 1 mmol mennyiségre vonatkoztatva katalázaktivitásuk legalább 100 egység.

Gyógyszerkészítmények

A gyógyszerkészítmények, amelyek a találmány szerinti antioxidáns salen-átmenetifém komplexet tartalmazzák, alkalmasak helyi és parenterális, mint például szubkután, intramuszkuláris vagy intravénás adagolásra. Kimutattuk, hogy a salen-fém komplexek in vitro SOD-aktivitással rendelkeznek, továbbá ugyanígy

HU 225 109 Β1 funkcionálnak in vivő körülmények között is, ami azt jelzi, hogy az antioxidáns salen-fém komplexek alkalmasak gyógyszerészeti alkalmazásban SOD-mimézisre. Az antioxidáns salen-fém komplexek alkalmasak emlősöknek, az embert is beleértve, és állatgyógyászati pácienseknek történő adagolásra.

A parenterális adagolásra alkalmas készítmények általában valamely antioxidáns salen-átmenetifém komplex vagy komplexek elegyoldatai, amelyet úgy készítünk, hogy ezeket a vegyületeket elfogadható hordozóanyagban, előnyösen vizes hordozóanyagban oldjuk. Mivel számos találmány szerinti salen-Mn komplex lipofil jellegű, előnyösen a hordozóanyagban egy hidrofób bázist is alkalmazunk (például polietilénglikolt vagy Tween 20 vegyületet). Számos vizes hordozóanyagot alkalmazhatunk, amely lehet például víz, puffereit víz, 0,4%-os fiziológiás sóoldat, 0,3%-os glicin és hasonló oldatok. Ezek az oldatok általában sterilek és részecskétől mentesek. A készítmények szokásos, jól ismert sterilizálási eljárásokkal sterilizálhatok. A készítmények továbbá tartalmazhatnak gyógyszerészetileg elfogadható segédanyagokat, amelyek ahhoz szükségesek, hogy a megfelelő fiziológiai körülményeket biztosítsuk, és lehetnek például pH-beállitó és pufferező segédanyagok, toxicitást javító segédanyagok és hasonlók, mint például nátrium-acetát, nátrium-klorid, kálium-klorid, kalcium-klorid, nátrium-laktát stb. A fenti készítményekben az antioxidáns salen-átmenetifém komplex vagy komplexek koncentrációja széles körben változhat, és lehet például kevesebb mint kb. 1 nmol/l, általában legalább kb. 0,1 mmol/l, és lehet akár 100 mmol/l érték is. Ezt a koncentrációt általában a folyadéktérfogattól, a viszkozitástól stb.-től függően választjuk meg, és figyelembe vesszük az adagolás útját is. Általánosan az antioxidáns salen-fém komplex a készítményben 0,1-10 mmol/l közötti koncentrációban található. Például intravénás injektálás céljára jellemző készítmény az antioxidáns salen-fém komplex (például C7 képletű vegyület) steril oldatát 5 mmol/l koncentrációban jelenti, és az anyagot Ringer-oldatban tartalmazza. Néhány előnyös antioxidáns salen-fém komplex általános hidrofób természete azt eredményezi, hogy hidrofób hordozóanyagot is alkalmazhatunk, vagy egy detergenst vagy más lipofil segédanyagot tartalmazó vizes hordozóanyagot használunk (például Tween, NP-40, PEG); más megvalósítás szerint az antioxidáns salenkomplexeket szuszpenzió formában is adagolhatjuk vizes hordozóanyagban, vagy emulzióformát is alkalmazhatunk.

Jellemző intramuszkuláris injektálásra alkalmas gyógyszerkészítményt úgy állíthatunk elő, hogy ez 1 ml steril puffereit vizet és kb. 1-100 mg antioxidáns salen-átmenetifém komplexet vagy komplexeket tartalmazzon. Jellemző intravénás infúziós adagolásra alkalmas készítmény olyan készítmény, amely 250 ml steril Ringer-oldatot és kb. 100-1000 mg antioxidáns salen-átmenetifém komplexet vagy komplexeket tartalmaz. A lipofil salen-fémkomplexek formált alakjában lipofil segédanyagokat is alkalmazhatunk. A parenterálisan adagolható készítmények előállítási eljárását a szakember ismeri, és ezek megegyeznek a szakirodalomban leírt általános eljárásokkal, Remington Pharmaceutical Science, 15th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980) közleményben leírt eljárással, amely közleményt referenciaként adunk meg. Jellemző helyi alkalmazású gyógyszerkészítményt úgy állíthatunk elő, hogy megfelelő bőrkenőcsöt, -krémet, -lemosó oldatot, szemkenőcsöt és oldatot, belégzésre alkalmas aeroszolt és egyéb segédanyagokat alkalmazunk. A hordozóanyagok kémiailag kompatíbilisak legyenek az aktív hatóanyagként jelen levő antioxidáns salen-átmenetifém komplexszel vagy komplexekkel, és általában nem növelhetik az aktív hatóanyag lebomlását, denaturálódását vagy aggregálódását. Előnyösen az alkalmazott hordozóanyagok lipofil komponensek, mint például olajok és lipidemulziók.

A találmány szerinti antioxidáns salen-átmenetifém komplex vagy komplexek liofilizálhatók, és így tárolhatók, majd felhasználás előtt alkalmas hordozóanyaggal rekonstituálhatók. A szakember felismeri, hogy a liofilizálás és a rekonstituálás különféle mértékű antioxidáns aktivitás vesztéshez vezethet, és ennek következtében a koncentrációt ennek kompenzálására megfelelően be kell állítani.

A találmány szerinti antioxidáns salen-átmenetifém komplexet vagy komplexeket, vagy elegyeiket tartalmazó készítményeket megelőző és/vagy terápiás kezelésben is alkalmazhatjuk. A terápiás alkalmazás során a már adott szabad gyökkel kapcsolatos betegségben szenvedő betegnek a készítményeket olyan mennyiségben adagoljuk, amely hatásosan kúrálja vagy legalábbis részben megállítja a fennálló betegséget, illetve megszünteti ennek komplikációit. Ezt a fenti hatást kifejtő mennyiséget „terápiásán hatásos dózisnak” vagy „hatásos dózisnak” nevezzük. A hatásos dózis mennyisége függ a betegség súlyosságától, a beteg általános egészségi állapotától, az adagolás útjától. Az általában adagolt hatásos dózis kb. 1 mg-kb. 10 g antioxidáns salen-átmenetifém komplex vagy komplexek dózisonként, betegenként általában alkalmazott dózis kb. 10 mg-2000 mg közötti. Például akut szívizom-ischaemia/újra oxidénnel telítés epizód kezelésére szisztémás intravénás infúzió útján történő adagolás esetében kb. 100-1000 mg antioxidáns salen-fém komplexet (például C7 vegyületet) adagolhatunk; intraperitoneális injekció adagolási út esetén legalább kb. 10 mg-500 mg antioxidáns salen-fém komplexet vagy komplexeket adagolunk ahhoz, hogy megfelelő SOD-aktivitást, megnövelt lokális koncentrációt érjünk el a szívizomban.

A megelőző alkalmazás esetében a találmány szerinti antioxidáns salen-átmenetifém komplexet vagy komplexeket, ezek elegyét tartalmazó készítményeket olyan betegeknek adagoljuk, akik még nem betegségállapotúak, abból a célból, hogy ezek ellenálló képességét megnöveljük, illetve a betegség előrehaladását csökkentsük. Az ilyen esetben adagolt mennyiséget „megelőző kezelésben hatásos dózisnak” nevezzük. Az ilyen alkalmazás során az adott dózismennyiség függ a beteg egészségi állapotától és immunitásának általá13

HU 225 109 Β1 nos szintjétől, és általában betegenként 1 mg-10 g/dózis, különösen 10-1000 mg/dózis érték. Jellemző antioxidáns salen-fém komplex, mint például C7 képletű vegyület formált alakja kb. 25-250 mg salen-fém komplexet tartalmaz egy egységdózisban.

A készítményeket egyszer vagy több alkalommal is adagolhatjuk a megfelelő dózisszint alkalmazásával, és a dozirozás módját a kezelőorvos határozza meg. Bármely esetben a gyógyszerkészítmény a megfelelő mennyiségű találmány szerinti antioxidáns salen-átmenetifém komplexet vagy komplexeket biztosítsa ahhoz, hogy a beteg hatásos kezelése megtörténjen.

Készletformát állíthatunk elő a találmány szerinti antioxidáns salen-átmeneti komplex vagy komplexek felhasználására olyan betegek esetében, akiknek védelmét vagy terápiás kezelését kívánjuk megoldani szabad gyökkel kapcsolatos betegség esetében. így a találmány szerinti készítmény lehet egy olyan készítmény, amely liofilizált forma vagy vizes oldat tartályban, amely egy vegyületet tartalmaz, vagy további antioxidáns salen-átmenetifém komplexet vagy komplexeket is tartalmaz, amelyek kívánt típusúak. A készletben az antioxidáns salen-átmenetifém komplex vagy komplexek pufferekkel, mint például Trisz-, foszfát-, karbonát- stb. pufferekkel, stabilizálószerekkel, biocid anyagokkal, inért fehérjékkel, mint például szérumalbumin, vagy hasonlókkal együtt találhatók, továbbá a készletben az alkalmazás előirata is benne foglaltatik. Általában ezek az anyagok kevesebb mint kb. 5 tömeg%ban találhatók az antioxidáns salen-átmenetifém komplex vagy komplexek mennyiségére vonatkoztatva, és általában koncentrációban kifejezve összes mennyiségük legalább kb. 0,01%. Előnyösen a készletben inért töltő- vagy hordozóanyagot is belefoglalunk, amely hígítja az aktív hatóanyagokat, és a kiszerelőanyag a teljes készítmény mennyiségére vonatkoztatva kb. 1-99,999 tömeg% mennyiségben lehet jelen.

Találmány szerinti salen-Mn komplexeket, előnyösen a C12 vagy C7 képletű vegyületeket, hipotermiás szívbénulás oldatba is befoglalhatjuk legalább 1 mmol koncentrációban, amely oldatformát Amano és munkatársai (1982) Jpn. J. Surg. 12: 87, közleményében leírt eljárással állíthatunk elő, amely közleményt referenciaként adjuk meg. Legelőnyösebben a szívbénulás oldatban a C7 képletű vegyületet alkalmazzuk.

A SOD-mimetikus salen-fém komplex vagy komplexek dózisa minden egyes alkalmazás függvényében változik. Jellemzően a készítményt szisztémásán vagy helyileg adagoljuk. A szisztémás adagolás egyebek között lehet orális (vagy per os) vagy parenterális. A helyi alkalmazás in situ alkalmazást is magában foglal. Az in situ alkalmazás alatt azt értjük, hogy a SOD-mimetikus salen-fém komplexet testüregvizsgáló (endoszkópos) pilula mosófolyadék formában és/vagy paravénás injekció formában adagolhatjuk, vagy alsó gasztrointesztinális kezelés esetében beöntés formában is adhatjuk. A parenterális adagolási utak lehetnek például szubkután, intradermális, intramuszkuláris és intravénás adagolások. Az adagolás intervallumától és módjától függően a SOD-mimetikus salen-fém komplex vagy komplexek mennyisége kb. 2-5000 mg vagy ennél több közötti, jellemzően 10-1000 mg közötti lehet. Az adagolás lehet egyetlen orális dózis, parenterális dózis és/vagy helyi adagolású dózis, de lehet többszörös orális dózis, parenterális dózis és/vagy helyi adagolású dózis, amelyet több nap során adagolnak, vagy több mint 5 héten keresztül adnak. A dózis továbbá a betegség súlyosságától függően is változhat.

In vitro és kutatási adagolás A találmány tárgya továbbá a találmány szerinti antioxidáns salen-átmenetifém komplexek alkalmazása természetesen előforduló gének vagy egyéb polinukleotidszekvenciák expresszálásának modulálására, amely expresszálás transzkripciós kontroll alatt megy végbe, amelyet oxidatív stressz válaszelem szabályoz (például egy antioxidánsra válaszoló elem, ARE), mint például glutation S-transzferáz gén vagy NAD(P)H:kinon reduktáz gén antioxidáns válaszelem [Rozen és munkatársai (1992) Arch. Biochem. Biophys. 292: 598; Favreau és Pickett (1991) J. Bioi. Chem. 266: 4556; Rushmore és Pickett (1991) Methods Enzymol. 206: 409; Rushmore és Pickett (1990) J. Bioi. Chem. 265:144 648; Keyse és munkatársai (1992) Natúré 359: 644, a közleményeket referenciaként adjuk meg]. A szakember a szakirodalomban ismert módszerekkel és elvek alapján előállíthat transzgéneket, homológ rekombinációs szerkezeteket és episomal expresszáló rendszereket (például vírusalapú expresszálóvektorokat), amelyek polinukleotidszekvenciát tartalmaznak, amely szekvencia egy vagy több ARE-promotorhoz kötött anyag segítségével szabályozott, és ezek a szakemberek sejteket, illetve transzgén, nem humán állatokat átalakíthat, amelyek ilyen polinukleotidszerkezetet tartalmaznak. Az antioxidáns salen-fém komplexek alkalmasak arra, hogy az ARE-szabályozott polinukleotidszekvenciák transzkripcióját sejttenyészetekben modulálják (például ES-sejtek esetében), illetve intakt állatokban, különösen transzgén állatokban modulálják, ahol a transzgén egy vagy több ARE-tartalmú, amely transzkripciószabályozó szekvencia. A transzformált vagy transzgén sejttenyészetekben dózis-válasz függvényt állíthatunk elő úgy, hogy az ARE-szabályozott transzkripció sebességét vizsgáljuk polinukleotidszekvencia esetében az antioxidáns salen-fém komplex vagy fémkomplexek növekvő koncentrációja mellett. Ez a koncentráció oxidálóágensek hatására létrejött transzkripciósebességet (például ilyen oxidálószer lehet a benzoil-peroxid, a glutationkimerítő hatóanyag) vagy az oxidatív stressz hatására létrejövő transzkripció sebességét csökkenti. Ezzel szemben a nagy koncentrációjú SOD-mimetikus salen-fém komplexek oxidatív stresszt is okozhatnak, és szabadgyök-képződést eredményezhetnek. Hasonló dózis-válasz függvény meghatározást végezhetünk transzgén állatokban, mint például transzgén egérben, amely ARE-szabályozó transzgén szekvenciát tartalmaz.

In vivő adagolás

A találmány szerinti eljárásnak megfelelően valamely antioxidáns salen-átmenetifém komplexet adago14

HU 225 109 Β1 lünk terápiásán vagy gyógyszerészetileg elfogadható hatásos mennyiségben az ilyen kezelést igénylő betegnek, és így a szabad gyökkel kapcsolatos betegséget kezeljük vagy megelőzzük. A kívánt dózis mennyisége függ a szabad gyökkel kapcsolatos betegség típusától, a betegség előrehaladottságától és súlyosságától, a korábbi terápia típusától, a beteg egészségi állapotától, illetve az antioxidáns salen-átmenetifém komplexre adott válasz függvényétől, illetve a kezelőorvos véleményétől. Jellemzően legalább egy antioxidáns salen-Mn komplexet adagolunk aktív hatóanyagként, vagy ezt egy vagy több egyéb aktív hatóanyaggal kombinációban adagoljuk, amely aktív hatóanyagok az alábbiak lehetnek: Ν-2-merkapto-propionil-glicin, N-acetil-cisztein, glutation, dimetil-tiokarbamid, dezferrioxamin, mannitol, a-tokoferol, aszkorbát, allopurinol, 21-amino-szteroidok, kalpaininhibitorok, glutamátreceptor-antagonisták, szövetplazminogén-aktivátor, sztreptokináz, urokináz, nem szteroid gyulladásgátló hatóanyag, kortizon és karotenoidok. Az antioxidáns salen-Mn komplexek adagolhatok együttesen polipeptidekkel, amelyek SÓD és/vagy katalázaktivitásúak, különösen amiatt, hogy a salen-Mn komplexek a SÓD polipeptidekkel szemben képesek áthaladni a vér-agy gáton, ennélfogva a szisztémás SOD-adagolást kiegészítik.

A találmány szerinti készítményekkel kezelhetünk embereket szabad gyökkel kapcsolatos betegség esetében, megelőzően hatásos vagy terápiásán hatásos antioxidáns salen-átmenetifém komplex adagolásával, amely jellemzően salen-Mn komplex, előnyösen C7 képletű vegyület. Az eljárás alkalmazható a különböző betegségállapotú betegek kezelésére, amelyek esetében vagy a betegséget kezeljük, vagy a szabad gyökkel kapcsolatos betegségek kifejlődését megelőzzük. A kezelés ezen túlmenően alkalmazható abból a célból, hogy megelőző terápiaként a korral járó daganatos megbetegedés kifejlődés valószínűségét és/vagy a korral járó mortalitás mértékét és/vagy az akkor kialakulásának sebességét csökkentsük vagy megelőzzük.

A találmány szerinti antioxidáns salen-fém komplexek továbbá adagolhatok olyan betegeknek, akik humán immunhiányvírussal (például HÍV—1) fertőzöttek vagy veszélyeztetettek humán immunhiányvírussal való fertőzés vonatkozásában. Az antioxidáns salen-fém komplexek, mint például a C7 képletű vegyület, megakadályozhatja vagy inhibiálhatja a CD4⁺ limfocitákban a HIV-1-replikációt, amelyet a necrosisfaktor (TNF) indukál, és/vagy megakadályozhatja a HIV-1fertőzés eredményeként bekövetkező CD4⁺ sejtek sérülését vagy elpusztulását. Különösebb elmélet felállítása nélkül a HIV-1-replikációval vagy HIV-1-patogenezissel kapcsolatosan valószínű, hogy az antioxidáns salen-fém komplex, mint például C7 képletű vegyület adagolása inhibiálhatja és/vagy lassíthatja a HÍV—1 vírussal kapcsolatos patológia kialakulását, és/vagy csökkentheti a CD4⁺ limfocita populáció csökkenési sebességét a HIV-fertőzött betegekben. Az antioxidáns salen-fém komplexek, mint például C7 képletű vegyület adagolása ugyancsak inhibiálhatja a túlzott vagy nem megfelelő TNF-koncentrációból eredő patológiát akár AIDS-betegekben, akár más betegség esetében (például szeptikus sokk). Általában a HIV-fertőzött és/vagy túlzott vagy nem megfelelő TNF-koncentrációval rendelkező betegek számára kb. 50-5000 mg dózist adagolunk, amely dózist adagolhatjuk egyetlen vagy többszörös dózis formában, és így a klinikai szimptómákat, illetve a patológia kifejlődését csökkentjük vagy késleltetjük. Az antioxidáns salen-fém komplexeket terápiásán is adagolhatjuk egyéb HIV-től különböző vírusos betegségek kezelésére is.

Mivel az oxidatív károsodás a szabad gyök túlzott keletkezésével jár együtt, illetve a reaktív oxigénrészecskék koncentrációjának túlzott értékekor következik be, várhatóan egy antixodáns salen-átmenetifém komplex még alacsony koncentrációkban is védőhatást fejthet ki oxidatív károsodással szemben, és így várhatóan nincs határérték, ami alatt az antioxidáns salen-Mn komplexek hatástalanok.

Általában a szabad gyökkel kapcsolatos betegségek kezelésében az antioxidáns salen-Mn komplex alkalmas hatásos dózisa 0,01-1000 mg/kg testtömeg/nap, előnyösen 1-100 mg/kg testtömeg/nap közötti. Általában a kívánt dózist előnyösen egy, két, három, négy vagy több aldózisban adagoljuk a nap megválasztott időszakaiban. Ezeket az aldózisokat egységdózis formában adagolhatjuk, amelyek például 5-10 000 mg, előnyösen 10-1000 mg aktív hatóanyagot tartalmazhatnak dózisegységenként.

A fenti terápiákban alkalmazott készítmények különféle formák lehetnek. Ezek a formák lehetnek például szilárd, félszilárd és folyékony dózisformák, mint például tabletta, pilula, por, folyékony oldat vagy szuszpenzió, liposzómakészítmény, injektálható és infúzióban alkalmazható oldatformák. Az előnyösen alkalmazható forma az adagolás útjától, illetve a terápiás alkalmazástól függ. Jellemzően valamely salen-fém komplex vizes oldószerben (például fiziológiás sóoldatban) készült steril oldatát adagolhatjuk intravénás úton. A készítmények továbbá tartalmazhatnak szokásos gyógyszerészetileg elfogadható hordozó- és segédanyagokat, amelyeket a szakember ismer, lásd például Remington Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.: Easton, PS; 17th Ed. (1985) közleményét. Általában az adagolás orális vagy parenterális (például szubkután, intramuszkuláris, intravénás és intradermális) úton történik, vagy helyi adagolást alkalmazhatunk, vagy valamely testüregbe infúziót alkalmazhatunk, vagy szövetfürdőformát alkalmazhatunk sebészeti beavatkozás során.

Természetesen a találmány szerinti eljárásba beleértjük, hogy a találmány szerinti vegyületeket egyéb SOD-aktivitással rendelkező antioxidáns hatóanyagokkal, katalázaktivitású hatóanyagokkal, GSH-Px-aktivitású hatóanyagokkal, vagy szabadgyök-fogó reaktánsokkal vagy szabadgyök-képződést inhibiáló hatóanyagokkal együtt is alkalmazhatjuk. A találmány szerinti aktív hatóanyagot önmagában is adagolhatjuk, azonban előnyösen valamely gyógyszerkészítmény részeként adagoljuk. A találmány szerinti készítményekben

HU 225 109 Β1 a találmány szerinti, legalább egy vegyület található terápiásán vagy gyógyszerészetileg hatásos dózismennyiségben, továbbá egy vagy több gyógyszerészetileg vagy terápiásán elfogadható hordozóanyag található, és kívánt esetben egyéb terápiás hatóanyag található. Különféle ilyen készítmény-előállításokat írtak le a Gilman és munkatársai (eds) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapuetics. 8th Ed., Pergamon Press közleményben; valamint Remington’s fent leírt közleményében, amelyeket referenciaként adunk meg. Az adagolás eljárásait, például orális, intravénás, intraperitoneális vagy intramuszkuláris adagolást és egyéb adagolási formákat az alábbiakban ismertetjük. A gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagok lehetnek víz, fiziológiás sóoldat, pufferek és egyéb szakirodalomban, mint például Merck Index, Merck & Co., Rahway, NJ közleményben leírt anyagok, amely közleményt referenciaként adunk meg.

A gyógyszerkészítményeket parenterális vagy orális úton adagoljuk megelőző és/vagy terápiás kezelés céljából. A gyógyszerkészítményeket különféle egységdózis formában adagolhatjuk, amely egységdózisforma az adagolás útjának függvénye. Például orális adagolásra alkalmas egységdózisforma lehet por-, tabletta-, pilula-, kapszula- és drazséforma.

A gyógyszerkészítményeket gyakran intravénás úton adagoljuk. A találmány tárgya eszerint gyógyszerkészítmény, amely intravénás adagolásra alkalmas, és amely az aktív hatóanyag oldatát tartalmazza, vagy szuszpenzióját tartalmazza alkalmas hordozóanyagban, előnyösen vizes hordozóanyagban. Különféle vizes hordozóanyagokat alkalmazhatunk, amelyek lehetnek például víz, pufferezett víz, 0,4%-os fiziológiás sóoldat és hasonló anyagok. Gyakran az antioxidáns salen-fém komplexet vagy fémkomplexeket, mint például a C7 vagy C12 képletű anyagokat szerves oldószerben (például dimetil-szulfoxidban) oldhatjuk, és vagy közvetlenül alkalmazhatjuk, vagy vizes oldószerrel hígíthatjuk. Jellemzően az antioxidáns salen-fém komplexeket, amelyek viszonylag lipofil jellegűek (például a C9 és C12 képletű vegyületek), valamely szerves oldószerben oldjuk, amely lehet például dimetil-szulfoxid, és amennyiben kívánatos, ezt az oldatot polárosabb oldószerben, mint például vízben ezt követően hígítjuk. Ezeket a készítményeket esetenként szokásos, jól ismert sterilizálóeljárásokkal sterilizáljuk vagy steril szűrésnek vetjük alá. A kapott vizes oldatokat közvetlenül ebben a formában is csomagolhatjuk felhasználás céljából, vagy kívánt esetben liofilizálhatjuk, és a liofilizált készítményt a felhasználás előtt steril vizes oldattal rekonstruáljuk. A találmány szerinti készítmények tartalmazhatnak gyógyszerészetileg elfogadható segédanyagokat, amely a megfelelő fiziológiás jellemzők kialakításához szükségesek. Ilyen anyagok lehetnek a pH-beállító segédanyagok és pufferek, a tonicitást biztosító segédanyagok, nedvesítőszerek és hasonlók, mint például nátrium-acetát, nátrium-laktát, nátrium-klorid, kálium-klorid, kalcium-klorid, szorbitán-monolaureát, trietanol-amin-oletát és hasonlók.

Szilárd készítmények esetében nem toxikus szilárd hordozóanyagokat alkalmazhatunk, amelyek lehetnek például gyógyszerészeti tisztaságú mannit, laktóz, keményítő, magnézium-sztearát, nátrium-szacharinát, talkum, cellulóz, glükóz, szukróz, magnézium-karbonát és hasonló anyagok. Orális adagolás céljára gyógyszerészetileg elfogadható, nem toxikus készítményt állíthatunk elő úgy, hogy a szokásosan alkalmazott segédanyagokat, mint például a fent leírt anyagokat elegyítjük, és kb. 0,001-95% aktív hatóanyagot, előnyösen kb. 20% aktív hatóanyagot alkalmazunk a készítményben.

A találmány szerinti vegyületeket tartalmazó készítményeket megelőző és/vagy terápiás kezelésben is alkalmazhatjuk. Terápiás alkalmazás esetében a készítményeket olyan betegnek adagoljuk, aki már a fent leírt betegségek valamelyikében szenved. Olyan mennyiségben végezzük az adagolást, amely elegendő ahhoz, hogy a betegséget gyógyítsa, vagy a tüneteket legalább részben megszüntesse, vagy a betegség komplikációit megszüntesse. Az ilyen hatásos mennyiséget „terápiásán hatásos mennyiségnek vagy dózisnak” nevezzük. Az ilyen felhasználásra alkalmazott hatásos dózis a betegség súlyosságától, a beteg általános egészségi állapotától és testtömegétől függ.

A megelőző alkalmazás esetében a találmány szerinti vegyületeket tartalmazó készítményeket olyan betegnek adagoljuk, akik egy adott betegségre érzékenyek, vagy a betegséggel kapcsolatban veszélyeztetett helyzetben vannak. Az ilyen mennyiséget „megelőzően hatásos mennyiségnek vagy dózisnak” nevezzük. Ebben az alkalmazásban az aktív hatóanyag pontos mennyisége függ a beteg egészségi állapotától, illetve testtömegétől.

A szilárd készítményekben alkalmazható szokásos, nem toxikus szilárd hordozóanyagok lehetnek például gyógyszerészeti tisztaságú mannit, laktóz, keményítő, magnézium-sztearát, talkum, cellulózok, glükóz, szukróz, magnézium-karbonát és hasonlók. A fent megadott aktív hatóanyagot például kúp formában is készítménnyé alakíthatjuk, amely kúp formában triglicerideket, mint például Witepsolokat alkalmazhatunk hordozóanyagként. Folyékony gyógyszerészetileg adagolható készítményeket például úgy állíthatunk elő, hogy valamely aktív fent leírt hatóanyagot oldunk vagy diszpergálunk, és kívánt esetben gyógyszerészeti segédanyagokat adagolunk a hordozóanyaghoz. A hordozóanyag ebben az esetben lehet víz, fiziológiás sóoldat, vizes dextrózoldat, glicerol, etanol és hasonlók, amelyekkel oldatot vagy szuszpenziót képezhetünk. Amennyiben kívánatos, a gyógyszerkészítmény továbbá tartalmazhat kis mennyiségű, nem toxikus segédanyagokat, mint például nedvesítőszereket vagy emulzifikálószereket, pH-puffer anyagokat és hasonlókat, mint például nátrium-acetátot, szorbitán-monolaureátot, trietanol-amin-nátrium-acetátot, trietanol-amin-oleátot stb. Az ilyen dózisformák előállítása a szakirodalomban ismert, illetve a szakember könnyen felismeri ezeket, és leírták például a Remington Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania,

HU 225 109 Β1

17th Edition, 1985, közleményben. Az adagolt készítmény vagy formált alak minden esetben hatásos mennyiségű aktív hatóanyagot vagy hatóanyagokat tartalmaz.

Orális adagolás céljára gyógyszerészetileg elfogadható, nem toxikus készítmény állítható elő bármely, szokásosan alkalmazott hordozóanyaggal, amely lehet például gyógyszerészeti tisztaságú mannit, laktóz, keményítő, magnézium-karbonát és hasonló anyag. Az ilyen készítmények lehetnek oldat, szuszpenzió, tabletta, kapszula, por, fenntartott hatóanyag-kibocsátású készítmény és hasonló formák. A készítmények 0,01-95%, előnyösen 1-70% aktív hatóanyagot tartalmaznak.

A parenterális adagolás általában valamely injekcióforma, amelyet szubkután, intramuszkuláris vagy intravénás úton adagolhatunk. Az injektálható készítményt szokásos formában állíthatjuk elő, és ez lehet folyékony oldat vagy szuszpenzió, valamint szilárd forma, amely felhasználás előtt oldat- vagy szuszpenzióformává alakítható valamely folyadékban, vagy lehet emulzióforma. Alkalmazható hordozóanyagok lehetnek víz, fiziológiás sóoldat, dextrózoldat, glicerin, etanol vagy hasonlók. Ezen túlmenően amennyiben kívánatos, az adagolandó gyógyszerkészítmények kisebb mennyiségű, nem toxikus segédanyagokat is tartalmazhatnak, amelyek lehetnek például nedvesítőszerek, emulzifikálószerek, pH-puffer anyagok és hasonlók, mint például nátrium-acetát, szorbitán-monolaureát, trietanol-amin-oleát stb.

Újabban kidolgozott parenterális adagolási út során beültetésformát használnak, amely lassú hatóanyagvagy fenntartott hatóanyag-kibocsátású rendszer, és amely stabil állandó dóziskibocsátást biztosít, például a 3 710 795 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, amelyet referenciaként adunk meg. Az antioxidáns salen-fém komplexeket adagolhatjuk transzdermális tapasz (például iontoforetikus átvitelű) formában helyi vagy szisztémás adagolásban.

Amennyiben a kezelt beteg állapotának mérhető javulása történt, egy fenntartó dózist is alkalmazhatunk, amennyiben ez szükséges. Ebből eredően a dózist vagy az adagolás gyakoriságát vagy mindkettőt csökkenthetjük annak függvényében, hogy milyen tüneteket tapasztalunk, illetve hogy a javított állapot milyen szinten marad. Amennyiben a tünetek a kívánt könnyű állapotúvá válnak, a kezelést leállíthatjuk. A betegek ettől függetlenül igényelhetnek közbenső kezelést, nem hosszú ideig történő adagolással a betegség tüneteinek bármely visszatérése során, vagy megelőző kezelésként, amellyel a betegség tüneteinek visszatérését akadályozzuk.

Az antioxidáns salen-fém komplex vagy fémkomplexek továbbá alkalmazhatók adalék anyagként transzfúziós vérmintához, abból a célból, hogy a vérsejtekben az oxigyök által okozott károsodást inhibiálják, illetve az egyes komponensek sérülését meggátolják tárolás során. Hasonlóan az antioxidáns salen-fém komplexek csökkentik a vérsejtek in vivő oxigyök általi sérülését.

Az antioxidáns salen-fém komplex vagy fémkomplexek továbbá alkalmazhatók különböző szervek és szövetek tárolási oldataiban vagy öblítőoldataiban, abból a célból, hogy a szervátültetés esetén vagy sebészeti öblítőként funkcionáljanak. Például a kimetszett szerveket gyakran tárolóoldatba helyezik, mielőtt a befogadó szervbe beültetik. Legalább egy antioxidáns salen-fém komplex alkalmazása az ilyen tartósítóoldatban általában a 0,01 mmol-10 mmol koncentrációban kívánatos, abból a célból, hogy a tárolás során létrejövő ischaemia, majd a reperfúziós sérülés a beültetés során kivédhető legyen. Számos megfelelő salen-fém komplexet tartalmazó oldatot leírtak a szakirodalomban, így például az 5 145 771 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben, a Beyersdorf (1990) Chem. Abst. 113: 84849w közleményben, a 4 879 283 számú, a 4 873 230 számú és a 4 798 824 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben, amelyeket referenciaként adunk meg.

Jellemzően az antioxidáns salen-fém komplex az öblítő-vagy tárolóoldatban kb. 10 pmol/l-kb. 10 mmol/l, előnyösebben 1 mmol mennyiségben van jelen. Például alkalmas öblítőoldat lehet egy Ringer-oldat (102 mmol NaCI, 4 mmol KCI, 3 mmol CaCI₂, 28 mmol nátrium-laktát, pH 7,0) vagy 0,1 mmol adenozinnal kiegészített Ringer-oldat, és az antioxidáns salen-Mn komplex (C7 képletű vegyület) végső koncentrációja az oldatban 1 mmol. Az öblítőoldat ezen túlmenően további antioxidánsokat (például glutationt, allopurinolt) tartalmazhat. Az antioxidáns salen-fém komplexet tartalmazó tartósító- és öblítőoldatok alkalmazhatók különféle szervek megnövelt tárolására és öblítésére (például vese, máj, hasnyálmirigy, tüdő, magzati velőcsőszövet, szív, véredény-átültetés, csont, ligamendum, ín, bőr), amely kezelés megnöveli a szövet életképességét, és megnöveli oxidatív károsodással szembeni ellenállását (amely például ischaemia/reperfúzió következtében jöhet létre).

Anélkül, hogy elméletet kívánnánk felállítani az antioxidáns vagy katalitikus oxigyökkötő hatásával kapcsolatban, valószínű, hogy amennyiben a katalitikus salen-fém komplex vagy fémkomplexek, a találmány szerinti vegyületek túlzott dózisát adagoljuk, ezek szabad gyököket termelhetnek, amelyek lehetnek szuperoxid, és valószínűleg a folyamat abból ered, mint amit nagy mennyiségű, keringésben levő szabad vas jelenléte eredményez. Ennek alapján valószínű, hogy a salen-fém komplexek túlzott dózisának hosszas adagolása előnyösen elkerülendő az antioxidáns terápiában. Feltételezhető, hogy túlzott dózisú, katalitikusán aktív salen-fém komplexek adagolása elősegítheti szabad gyökök képződését, mint például szuperoxid kialakulását lokális területeken (például szőrtüszőgyulladás-kezelésben, bőrrákkezelésben, papillomakezelésben) vagy sejttenyészetekben vagy ARE transzkripciós szabályozás alatti transzgént tartalmazó transzgén állatokban. A szabadgyök-képződést (például szuperoxidkialakulás) növelni úgy lehet, hogy a lokális helyet, a sejttenyészetet vagy a transzgén állatot báriumban gazdag környezetbe helyezzük, és/vagy oxigénben

HU 225 109 Β1 gazdag atmoszférában tartjuk (például több mint 21% molekuláris oxigént tartalmazó környezetben). Más eljárás szerint a találmány szerinti antioxidáns salen-fém komplexek kapacitását a reaktív oxigénrészecskék lebontásának katalízisében előnyösen alkalmazhatjuk a biológiai szövetek és sejtek lassú lebontásának inhibiálására. Például a benzoil-peroxidot széles körben alkalmazzák acne kezelésére; a benzoil-peroxid túlzott vagy nem megfelelő alkalmazását (például véletlenszerű balesetes alkalmazását a szemekbe) kezelhetjük lokálisan (vagy kívánt esetben szisztémásán) úgy, hogy valamely antioxidáns salen-fém komplexet (például C7 képletű vegyületet) adagolunk. Hasonlóan a kötőszövetek oxigyökindukált sérülését (például a kollagén sérülését), amely UV-besugárzás következtében cigarettafüst, azaz dohányzás következtében, vagy annak következtében jöhet létre, csökkenthetjük valamely antioxidáns salen-fém komplex alkalmazásával, amely adagolást párhuzamosan végzünk az UV-besugárzással, a dohányzással vagy egyéb oxigyök-generáló folyamatokkal (például sejtelöregedéssel).

Kemoprotektív és radioprotektív alkalmazások

A találmány szerinti antioxidáns salen-fém komplexeket jellemzően az antioxidáns salen-Mn komplexeket, mint például a C7 képletű vegyületet alkalmazzuk sejtek és szövetek védelmére szabadgyök-képző szerekkel szemben, amely lehet például ionizáló besugárzás és kemoterápiás szerek hatása (például bleomycin hatása). Előnyösen a védődózis legalább kb. 1 pg salen-Mn komplex/kg testtömeg, amelyet egy vagy több úton adagolhatunk a számos út közül (például az adagolás lehet orális, intravénás, intraperitoneális, gyomormosás formájú, beöntés, májkapuér-infúzió, helyi adagolás vagy gőzinhalálás). Előnyösen alkalmazható adagolás liposzómák vagy immunoliposzómák injektálása az antioxidáns salen-Mn komplexek bejuttatására a normálsejtekbe abból a célból, hogy ezeket védelemmel lássuk el például olyan szabad gyökből eredő toxicitással szemben, amely kemoterápiából vagy radioterápiából ered daganatos betegségek között. Az antioxidáns salen-átmenetifém komplexeket előzetesen adagoljuk a betegnek a kemoterápia és/vagy radioterápia megkezdése előtt. Az adagolást általában a kezelés kezdete előtt kb. 24 órán belül adagoljuk, előnyösen a kezelés kezdete előtt, amely kemoterápia és/vagy radioterápia, kb. 3-6 órával adjuk. Az antioxidáns salen-Mn komplexek folyamatosan adagolhatok a betegnek a terápia folyamán.

Például valamely antioxidáns salen-fém komplexet micellákba kapszulázhatunk, és így immunoliposzómát képezhetünk [az 5 043 164 számú, a 4,957,735 számú és a 4,925661 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben; Connor és Huang (1985) J. Cell. Bioi. 101: 582; Lasic DD (1992) Natúré 355: 279; Növel Drug Delivery (eds. Prescott LF és Nimmo WS: Wiley, New York, 1989); Reddy és munkatársai (1992) J. Immunoi. 148:1585; amely közleményeket referenciaként adunk meg]; az immunoliposzómakészítmények, amelyek az antioxidáns salen-fém komplexeket tartalmazzák, azzal jellemezhetők, hogy egy olyan célegységet (például monoklón antitestet) tartalmaznak, amely az immunoliposzómákat a nem daganatos sejtekhez irányítja, amely sejtek egyébként radioterápiára vagy kemoterápiára érzékenyek lennének. Például az olyan immunoliposzómák, amelyek olyan monoklón antitestet tartalmaznak, amely specifikusan kötődik, valamely vérképző törzssejtantigénhez, amely nincs jelen a rákossejtekben az adott esetben, alkalmazható arra, hogy az antioxidáns salen-fém komplexeket a vérképző törzssejtekhez kösse, és így ezeket a törzssejteket védje a rákos megbetegedés kezelésében alkalmazott radioterápiával vagy kemoterápiával szemben. Az ilyen stratégiai kezelést előnyösen olyan esetben alkalmazzák, amikor a kemoterápiás hatóanyag in vivő szabad gyököket termel (például bleomycin).

Antioxidáns salen-Mn komplexeket adagolhatunk továbbá olyan betegeknek, akikben meg kívánjuk akadályozni a besugárzási sérülést vagy kémiai sérülést, amelyet szabadgyök-generáló anyagok okozhatnak. A katonai személyzetnek, illetve a nukleáris- vagy nukleáris gyógyászati és/vagy vegyiparban dolgozó személyeknek adagolhatunk megelőző célból salen-Mn komplexeket. Antioxidáns salen-fém komplexek ugyancsak adagolhatok kemoprotektív szerként abból a célból, hogy a kémiai karcinogenezist megakadályozzuk. Ezt az adagolást különösen olyan karcinogénekkel szemben alkalmazhatjuk, amelyek reaktív epoxi közbenső termékeket képeznek (például benzo[a]pirén, benzatracén), illetve olyan karcinogénekkel vagy promotor hatóanyagokkal szemben, amelyek közvetlenül vagy közvetett úton szabad gyököket állítanak elő (például fenobarbitál, TPA, benzoil-peroxid, peroxiszom proliferátorok; ciprofibrát, clofibrát). Az ilyen kémiai karcinogéneknek kitett személyeket előkezelhetjük antioxidáns salen-fém komplexekkel abból a célból, hogy a kifejlődő daganatos megbetegedés veszélyét és gyakoriságát csökkentsük.

Az antioxidáns salen-fém komplexeket továbbá lipofil alapanyaggal is formulálhatjuk (vagy kívánt esetben vizes hordozóanyaggal formulálhatjuk) helyi adagolás céljára, kozmetikumokba, vagy napfényvédő krémekbe vagy oldatokba. Egy általános kozmetikai vagy napfényvédő krém vagy oldat kb. 1 mg-50 mg antioxidáns salen-fém komplexet tartalmaz a kozmetikum vagy napfényvédő krém vagy oldat 1 g-jára vonatkoztatva.

Az antioxidáns salen-fém komplexek továbbá alkalmazhatók mélyfúrásvezetőknek, illetve olyan személyeknek, akik igen mély környezetben dolgoznak, ahol az oxigéntoxicitás egészségügyi veszélyt jelent. A hatásos dózisú antioxidáns salen-fém komplex adagolása ilyen személyek számára lehetővé teszi a lélegzést, illetve a mély területen történő lélegzést és oxigénben gazdagított gázok belélegzését anélkül, hogy az oxigéntoxicitás veszélye túlzott mértékű lenne. Feltehető, hogy hatásos dózisú, valamely antioxidáns salen-fém komplex adagolása csökentheti a toxicitást, illetve a biológiai károsodást, amelyet ózonnal történő érintkezés okozhat. Amennyiben olyan személyeknek, akik felte18

HU 225 109 Β1 hetően ózonnal kerülnek kapcsolatba, valamely antioxidáns salen-fém komplex adagolása megelőző kezelésben valószínűleg javított rezisztenciát vagy nem javított rezisztenciát eredményez ózontoxicitással szemben, amely lehet például ózonindukált tüdőkárosodás, amelyet megfigyeltek olyan geográfiai területeken, ahol az ózonkoncentráció magas (például Los Angeles).

Felhasználás, tesztvizsgálatok és adagolási utak

A találmány szerinti vegyületek, az antioxidáns salen-átmenetifém komplexek, salen-Mn komplexek alkalmasak szív- és nem szívbetegségek esetében ischaemiás károsodás elleni védelemre, beleértve a szívizominfarktust, a pangásos szívelégtelenséget, az anginát, az aritmiát, a keringési rendellenességeket és a gutaütést. A találmány szerinti vegyületek inhibiálják az ischaemia káros hatásait (a szívben a koronaér-infarktus és reperfúzió; a tranziens szívizom- vagy CNS-ischaemia sebészeti beavatkozás során) anélkül, hogy közvetlen káros hatást fejtenének ki a szívizom-kontraktilitásra. Ennélfogva a találmány szerinti vegyületek hatásosak állati modellekben szív-ér rendszeri és CNS-betegségek kezelésére, a vegyületek alkalmasak szívizominfarktus, gutaütés, agysérülés és átültetési sebészeti beavatkozás kezelésére, különösen amennyiben az infarktusos területek reperfúziója történik, továbbá aritmiák, variáns és fizikai megterhelés indukált angina, vérpangásos szívelégtelenség, gutaütés és egyéb keringési rendellenességek kezelésére emlősökben, különösen emberekben. A salen-Mn komplexeket továbbá alkalmazhatjuk tartósítóoldatokban, amelyeket kimetszett szervek tárolására vagy mosására alkalmaznak (például szív, vese, hasnyálmirigy, máj, tüdő) szállítás, illetve hosszas tárolás során, mielőtt a transzplantációs operációt elvégeznék. Ebbe beleértjük a bőrtranszplantációt és a szaruhártyatranszplantációt is. A tartósítóoldatok jellemzően legalább kb. 1 pmol valamely antioxidáns salen-fém komplexet, előnyösen legalább kb. 1 mmol antioxidáns salen-fém komplexet tartalmaznak.

Az itt leírt aktív vegyület és sói adagolása számos elfogadott adagolási úton történhet. Ezek az adagolások lehetnek orális, parenterális, transzdermális, szubkután és egyéb szisztémás adagolások. Előnyös adagolási mód az orális adagolás, kivéve azokat az eseteket, amennyiben a beteg képtelen gyógyszert elfogyasztani. Ezekben az esetekben szükség lehet a készítmények parenterális adagolására. Amennyiben egy aminocsoport szubsztituenst tartalmazó antioxidáns salen-fém komplexet alkalmazunk a készítményben, amely a fiziológiás pH-értéknél protonálható, általában előnyösen az antioxidáns salen-fém komplexet olyan pH-értékű oldatban oldjuk vagy szuszpendáljuk, amelyben az aminocsoport szubsztituens protonált.

Az adagolt aktív hatóanyag mennyisége természetesen függ a kezelt személytől, a beteg testtömegétől, a betegség súlyosságától, az adagolás útjától, illetve a kezelőorvos megállapításaitól. Általában hatásos dózis 0,01-50 mg/kg/nap közötti, előnyösen 0,5-25 mg/kg/nap közötti. Egy kb. 70 kg testtömegű felnőtt esetében ez a mennyiség 0,7-3500 mg/nap vagy előnyösen kb. 35-1750 mg/nap érték.

Mivel a salen-Mn találmány szerinti vegyületek hatása hasonló mechanizmuson keresztül történik, különböző esetekben a dózisok és az adagolás formái hasonló általános előnyös körhöz tartoznak a fenti felhasználásokban.

A találmány szerinti készítményt és alkalmazásokat az alábbi példákon részletesen bemutatjuk. A példák nem jelentik a találmány tárgykörének korlátozását.

Kísérleti példák

In vitro katalitikus aktivitások

A C1, C4, C6, C7, C9, C10, C11 és C12 képletű salen-Mn komplexek antioxidáns katalitikus aktivitását határoztuk meg: meghatároztuk a szuperoxid dizmutáz és a katalázaktivitást az alábbi eljárások segítségével.

Tesztvizsgálat

A találmány szerinti vegyületek SOD-aktivitását úgy határoztuk meg, hogy mértük a cytochrom redukció inhibiálást, amely cytochrom C anyagot az oxigén szabad gyököt generáló rendszer, a xanthin plusz, a xanthin oxidáz állít elő. A cytochrom C redukciót spektrofotometriás úton 550 nm érték mellett mértük a Darr és munkatársai (1987) Arch. Biochem. Ciophys. 258:351, közleményben leírt eljárásnak megfelelően, amely közleményt referenciaként adunk meg. A xanthin oxidáz koncentrációját úgy állítottuk be, hogy ez a cytochrom C redukció sebességét 550 nm értéknél 0,025 abszorpcióegység/perc sebességre állítsa be. Ilyen körülmények között a cytochrom C redukció sebességét 50%-ban inhibiáló mennyiség értéket határoztuk meg (azaz az abszorbancia 0,0125 egység/perc). Ezt tekintettük egy egység aktivitásnak. A salen-fém komplexekről kimutattuk, hogy akkor antioxidáns hatásúak, amennyiben legalább 0,1 aktivitásegységgel rendelkeznek 1 mmol/l koncentráció mellett a fenti standard tesztvizsgálati körülmények között.

A katalázaktivitást spektrofotometriás eljárással mértük, amelyben a hidrogén-peroxid lebomlását határoztuk meg 240 nm értéknél az Aebi és munkatársai (1984) Methods Enzymol. 105:121, közleményben leírt eljárásnak megfelelően, amely közleményt referenciaként adunk meg, egy egység katalázaktivitás az az enzimmennyiség (vagy salen-fém komplex mennyiség), amely ahhoz szükséges, hogy 1 perc alattt 1 gmol hidrogén-peroxidot lebontson.

Valamennyi vegyületet fiziológiás sóoldatban formuláztuk, és ezek stabilnak bizonyultak, több hét tárolás után szobahőmérsékleten megfigyelt aktivitásuk nem csökkent. Sok esetben előnyös a salen-fém komplexet először valamely szerves oldószerben (például dimetil-szulfoxidban) oldani, majd az oldatot polárosabb oldószerrel, mint például vízzel hígítani. Ez különösen előnyösen olyan salen-fém komplexek esetében, amelyek viszonylag hidrofób jellegűek (például C12 képletű vegyület).

A 4. táblázatban bemutatjuk az in vitro SÓD és kataláz aktivitását különféle salen-Mn tesztelt komplex19

HU 225 109 Β1 nek. A SÓD- és a katalázaktivitást egység/mmol értékben fejeztük ki.

4. táblázat

Salen-Mn komplex	SOD-aktivitás	Katalázaktivitás
C1	308	262
C4	312	200
C6	812	0
C7	575	200
C9	111	20
C10	69	179
C11	101	46
C12	4397	144

In vivő biológiai aktivitások

Széles körben alkalmazott tesztvizsgálat-molekulák terápiás hatásosságának meghatározására agyischaemia (gutaütés) esetében a hatásosság megállapítása, hogy a molekula milyen mértékben képes megakadályozni az anoxiás epizód által agymetszetekben indukált irreverzíbilis károsodást, amely agymetszeteket fiziológiai körülmények között tartanak. Patkányagymetszeteket 35 °C hőmérsékleten érintkezőkamrában mesterséges gerincvelő-folyadékban tartottunk, amely folyadék: 124 mmol NaCI-, 3 mmol KCI-, 1,25 mmol KH₂PO₄-, 3 mmol CaCI-, 1 mmol MgCI₂-, 26 mmol NaHCO₃-, 10 mmol D-glukóz- és 2 mmol L-aszkorbát-tartalmú, a közeget folytonosan O₂:CO₂ (5:5) gázeleggyel levegőztettük. A kamra atmoszféráját ugyancsak folyamatosan O₂:CO₂ (95:5) gázeleggyel levegőztettük, kivéve, amikor az anoxiás epizódot idéztük elő, mert ebben az időtartamban a gázelegyet N₂-gázzal helyettesítettük. A gerincet elektromosan stimuláltuk, majd inger posztszinaptikus feszültséget hoztunk létre (EPSPs), és ezt mikroelektródok segítségével mértük.

A 4. ábrán bemutatjuk a normálkörülmények között (A) 5 perccel az O₂ N₂-nel történő helyettesítés után (ischaemiás epizód B) és 30-40 perccel az újraoxigénezést követően (C) mért értékeiknek ábráját mutatjuk be. Az állandó károsodás kiterjedését az amplitúdó (mV) és a kezdeti meredekség (mV/mmp) értékben határoztuk meg az EPSP mérésével.

Az 5. és 6. ábrán bemutatjuk az antioxidáns salen-Mn komplex, amely a C7 képletű vegyület, védőhatását patkányagymetszetben ischaemia esetében EPSP-rendszer alkalmazásával. Az agymetszeteket 50 pmol C7 képletű vegyület nélkül vagy ennek jelenlétében inkubáltuk, majd ezt követően ischaemia/újraoxigénezés epizódnak tettük ki, 5 perc alapfelvétel után az O₂-gázt N₂-gázzal helyettesítettük átlagosan 5 perc időtartamon át. Ezt követően az O₂-gázt újra bevezettük, és a mérést további 50 percen át folytattuk. Az 50 pmol (C7) képletű vegyületet tartalmazó mintát amplitúdóban és az EPSPs görbe meredekségében is azt mutatták, hogy a minták ischaemia előtti állapotra kerültek vissza. Ezzel szemben a nem kezelt agymetszetek eredeti állapotra való visszakerülése kb. az eredeti ischaemia előtti állapot 40%-a volt.

Egy további hatásos vizsgálat során meghatároztuk az ismételt ischaemiás epizódok után maradó életképes metszeteket. A 7. ábrán bemutatjuk, hogy amennyiben aktív hatóanyagot nem használunk, ez a százalék igen alacsony (6%), és ez 50 pmol koncentrációjú, C7 képletű vegyülettel történő kezelés során a metszetekben egészen 70% érték is lehet. A metszetet akkor tekintettük életképesnek, amennyiben a stimuláció intenzitását növelve 3 mV EPSP-amplitúdót értünk el.

Állati modell tesztvizsgálat

Egy, a Chiueh és munkatársai (1992) Synapse 11: 346, közleményben leírt, amely közleményt referenciaként adunk meg, Parkinson-betegség állati modellt alkalmaztunk, amely MPTP segítségével generált iatrogén hidroxilgyök által kiváltott. Ebben a modellben vizsgáltuk a (C7) képletű vegyület védőhatását a szabad gyök által indukált károsodással szemben. A neurotoxin MPTP kimutathatóan a dopamínerg neuronok degenerálódásához vezet az agyban. Ebből eredően jó modell a kísérletileg indukált Parkinson-betegségre (például iatrogén toxicitásra). A modellt a szakirodalomban széles körben elfogadják és alkalmazzák a betegség potenciális terápiás hatóanyagainak értékelésére.

Az egér agyában található dopamínerg neuront az alábbi kezeléseknek vetettük alá: (1) MPTP egyedüli kezelés, (2) antixodáns salen-fém komplex (C7) képletű vegyület egyedüli kezelés, (3) (C7) előkezelés és ezt követően MPTP-kezelés, vagy (4) nem kezelt kontroll. A tesztvizsgálatokat úgy végeztük, hogy a dopamin újrafelvétel ligandum, a mazindol kötődését mértük. A szokásos eljárásoknak megfelelően tríciummal jelzett mazindolt alkalmaztunk a kötési vizsgálatokban glóbus pallidus, farkas nucleus és corpus striatum egéragymintákban. A tríciummal jelzett mazindolt, specifikus kötődését autoradiográfia vagy membránkötődés segítségével (specifikus kötődés a membránfrakcióhoz) mértük. A kísérletet 7 nap időtartam alatt végeztük. Az MPTP egércsoportot intraperitoneális úton egyedül MPTP hatóanyaggal kezeltük (40 mg/kg naponta az első és második napon). Az MPTP+C7 egér csoportot C7 (33 mg/kg intraperitoneális) hatóanyaggal kezeltük közvetlenül egy vagy két nappal az MPTP-kezelés előtt, illetve C7 (33 mg/kg) egyedüli kezelést alkalmaztunk a 3. napon. Az állatokat hét nap elteltével elpusztítottuk. Az eredményeket a 8. ábrán mutatjuk be, és ezek azt mutatják, hogy in vivő a salen-Mn komplex C7 képletű vegyület jelentős védőhatást fejtett ki. A 8. ábra azt mutatja, hogy az egéragy különféle területein jelen levő számos dopamínerg neuron nem károsodott az antioxidáns salen-fém komplex (C7) képletű vegyület hatására; azonban az MPTP hatóanyaggal önmagában kezelt egerekben a kontrollértékekhez képest a dopamínerg neuronok száma kb. 15%-kal csökkent, amennyiben (C7) anyaggal előkezelést végeztünk, a túlélő dopamínerg neuro20

HU 225 109 Β1 nők száma megkétszereződött olyan egerekben, amelyeket ezt követően MPTP hatóanyaggal kezeltünk.

A (C7) anyag toxicitásának hiányát úgy mutattuk ki, hogy a (C7)-kezelt állatokban a hétnapos tesztvizsgálati időtartam alatt káros egészségi hatások nem je- 5 lentkeztek.

Ezek az adatok azt mutatják, hogy a salen-Mn komplexek terápiás hatást fejtenek ki in vivő rágcsálómodellekben a humán betegséggel kapcsolatosan.

Ezen túlmenően a vizsgálat azt mutatja, hogy a sa- 10 len-Mn komplexek áthaladnak a vér-agy gáton, és ez az áthaladás igen hatásos. Ezeket az adatokat együttesen vizsgálva azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a salen-Mn komplexek igen nagy hatásosságot mutatnak a szabadgyök-indukált károsodás megelőzésében, 15 illetve az agyban az ischaemia/újra oxidálás sérülés megelőzésében.

(C7) hatása izolált vassal túlterhelt patkányszívre, amelyet ischaemia/reperfúziós kezelésnek 20 vetettünk alá

Patkányokat kezeltünk, és öthetes időtartamon át minden harmadik napon 0,25 ml intramuszkuláris injekcióban vas-dextrán oldatot (100 g vas-hidroxid, 99 g dextrán és 1 I térfogatra kiegészítő mennyiségű víz) 25 adagoltunk. így az egerekben a szívszövetekben jelentős vas-túlkoncentrációt alakítottunk ki. A kezelést befejezve a patkányokat érzéstelenítettük nátrium-pentobarbitál (40 mg/kg) segítségével, majd heparint (1000 lU/kg) adagoltunk a combi vénán keresztül. Ezt 30 követően a szíveket eltávolítottuk, majd gyorsan az aortát átöblítettük a Langerdorff- (Langendorff O., Pflügers Arch. 61: 291, 1985) eljárás szerint 11 ml/perc állandó áramlási sebességet alkalmazva. Az átöblítésre alkalmazott folyadék módosított Krebs-Henseleit-puf- 35 fér volt, amely ml/l koncentrációban az alábbi összetételű: NaCI 118; KCI 5,9, NaHCO₃ 25; MgCI₂ 1,2; NaH₂PO₄ 0,6; CaCI₂ 2,4; glükóz 1 I. A pH-értéket 7,4±0,05 értéken tartjuk, miközben az áramoltatott közeget O₂:CO₂ 95%-5% gázeleggyel 37 °C hőmérsék- 40 létén telítettük. A perfúziós berendezést úgy termosztáltuk, hogy a perfúziós közeg hőmérséklete amikor az aortát eléri, 37,0±0,5 °C érték volt. Egy különlegesen vékony ballont ültettünk be a bal kamrába közvetlenül az aortaperfúzió kezdése után, és ezt feltöltöttük, és végső 5 mm Hg diasztolés nyomást alakítottunk ki. A ballon beültetése után 15 perces stabilizációs periódust alkalmaztunk. A periódus végén a szisztolés és diasztolés kamranyomásokat és a szívfrekvenciát (HR) mértük egy nyomásátalakító segítségével, amelyet a kamraballonhoz kötöttünk. A bal kamra kifejlődött nyomását (LVDP) számítottuk a szisztolés és diasztolés nyomás különbségéből, és a HRxLVDP szorzatot pedig az oxigénfogyasztás-indexnek tekintettük. Ezt követően a szíveket 15 perc összes időtartam alatt komforthömérsékletű ischaemiának vetettük alá. Ezt követően 15 perc reperfúziót alkalmaztunk a fent kezdetben alkalmazott perfúziós közeggel. A 15 perc reperfúziós idő alatt a szívverés sebességét és a diasztolés, valamint szisztolés nyomást mértük. A korai kamrai fibrillációt analizáltuk 1 perccel a reperfúzió megindítása után.

Három kísérleti csoportot alkalmaztunk. Az első csoport (n=7), amelyben a szíveket a standard perfúziós folyadékkal öblítettük (kontrollcsoport volt); a második csoport (n=8) esetében a perfúziót dimetil-tiokarbamid (DMTU, 10 mmol) jelenlétében végeztük; a harmadik csoport (n=8) perfúzióját (C7) (50 mmol) jelenlétében végeztük.

perc reperfúzió után minden egyes csoportból három szívet kiválasztottunk, és elektromikroszkópos vizsgálatnak vetettük alá úgy, hogy perfúziót végeztünk 2,5% glutáraldehiddel. Különösen vékony metszeteket (500-600 Á vastagság) vizsgáltunk.

Eredmények

Az 5. táblázatban bemutatjuk a HR szívütési frekvenciát, az SP szisztolés nyomásokat, a DP diasztolés nyomásokat és a HRxLVDP szorzatokat a három kísérleti csoportra, az értékeket 15 perc perfúzió után az ischaemiás epizód előtt (előtt), 1 perc időtartam után a reperfúzió megkezdésétől (1 után) és 15 perc időtartammal a reperfúzió megkezdése után (15 után) mutattuk be. A táblázatban továbbá leírtuk azon szívek számát, amelyek a reperfúziót követően 1 perccel kamrai fibrilláció epizódot mutattak (VF).

5. táblázat

	HR (ütés/perc)	SP (mm Hg)	DP (mm Hg)	HRxLVDP (x10,3)	VF
Kontroll
Előtte	276±11	78±7	6,3±0,3	19,6±1,6	-
1 óra utána	96±0	40±6	23,3±6,0	4,2+1,7	5/7
15 óra utána	232±15	62±10	13,6±4,2	12,6±2,3	-
+DMTU
Előtte	280±10	97±4	4,7±0,3	24,1 ±0,6	-
1 óra utána	91±10	62±9*	37,2±10,0	3,5±1,2	3/8
15 óra utána	226±18	58±6	27,8±9,4	9,4±2,0	-

HU 225 109 Β1

5. táblázat (folytatás)

	HR (ütés/perc)	SP (mm Hg)	DP (mm Hg)	HRxLVDP («10,3)	VF
+C7
Előtte	278±7	90±2	5,4±0,3	23,5±0,9	-
1 óra utána	130±13#	72±8#	5,8±0,5#	9,9±0,8#	2/8
15 óra utána	241±15	92±15	8,3±0,6	21,7±3,4n±	-

*: p<0,01, DMTU a kontrollal szemben ugyanabban az időpontban #: p<0,01, C7 a kontrollal szemben ugyanabban az időpontban o: p<0,05, C7 a kontrollal szemben ugyanabban az időpontban ±: p<0,01, C7 a DMTU-val szemben ugyanabban az időpontban

A 6. táblázatban bemutatjuk a szívek elektromikroszkópos értékelésének eredményét. A mitokondriumokat az alábbi osztályokba soroltuk: A típus (normál), B típus (duzzadt, de nem károsodott) és C típus (szétszakadt membránok). A szarkomereket az alábbi csoportokba soroltuk: A típus (normál) és B típus (érintett és/vagy necrosisos). Az eredményeket %-értékben adtuk meg. Az analizált mitokondriumok száma a kontrollcsoport esetében 1293, a DMTU esetében 0632 és a C7 csoport esetében 1595 volt. Az analízis szarkomer szerek a kontrollcsoport esetében 1046, a DMTU csoport esetében 1173 és a C7 csoport esetében 1143 volt.

6. táblázat

	Mitokondriumok	Szarkomerek
A típus	B típus	C típus	A típus	B típus
Kontrollok	10,4	21,0	68,5	21,3	78,7
+DMTU	14,3*	19,5	66,2	13,7+	86,3+
+C7	31,0#±	15,2#n	53,8#±	60,6#±	39,4#±

*: p<0,05, DMTU a kontrollal szemben +: p<0,01, DMTU a kontrollal szemben #’. p<0,01, C7 a kontrollal szemben a: p<0,05, C7 a DMTU-val szemben ±: p<0,01, C7 a DMTU-val szemben

Az adatokból kitűnik, hogy a (C7) képletű vegyület hatásosan védi a szíveket az ischaemia/újraoxigénezés károsodástól funkcionális és szerkezeti szempontból egyaránt. Ezen túlmenően a C7 jelentősen hatásosabb, mint a DMTU antioxidáns még akkor is, hogyha ezt kétszázszor kisebb koncentrációban alkalmaztuk.

Kísérleti autoimmun agyvelőgyulladás (EAE)

Az EAE állati modell multiplex sclerosis vonatkozásában. 30 SJL nőstény egeret, amelyek 10 hetesek, két csoportra osztunk, és így 20 egeret kontrollként és 10 egeret (C7) kezeltként osztottunk és alkalmaztunk.

Mindkét csoport egereit immunizáltuk agyvelőgyulladást okozó PLP-peptiddel egy komplett Freund kiegészített szubkután oldattal, majd pertusszisztoxin(IV)-gyel A pertusszisztoxin-adagolást az immunizálás után három nappal megismételtük. A (C7) csoportba tartozó egereket naponta intraperitoneális injekció formában (1 mg/egér, kb. 40 mg/kg) kezeltük, és a kezelést az immunizálás előtt két nappal kezdtük, és ezt követő 14. napon fejeztük be.

Az állatokat az alábbi módon osztályoztuk:

I. állapot: Ernyedtfarok-szindróma

II. állapot: Hátsóláb-paralízis

III. állapot: Hátsóláb-paralízis - vonszolt mozgás

IV. állapot: Paralízises immobilitás, testtömegvesztés.

Eredmények

Az immunizálás utáni harmadik hét során a 20 kontroliegér közül 8 szimptómás EAE-betegséget mutatott 2 I. állapotú, 4 ll/lll. állapotú, 2 IV. állapotú.

Ugyanezen időtartamon a (C7)-kezelt csoport 10 állata közül csak egy mutatott ki szimptómás EAEbetegséget (II. állapot).

Az 5. hét folyamán, azaz három héttel azt követően, hogy a (C7)-kezelést befejeztük, a (C7) csoportból 6 egér mutatott szimptómás EAE-betegséget, 4 II. állapotú és 2 IV. állapotú.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a (C7)-kezelés megakadályozta a szimptómás EAE-betegség ki22

HU 225 109 Β1 alakulását, és a betegség kifejlődhet a kezelés megszakítása után.

Lipidperoxidálás

Hippocampalis metszeteket (400 prn vastag) nyertünk Sprague-DawIey-patkányokból (150-200 g), majd ezeket gyűjtöttük és 95% O₂/5% CO₂ atmoszférában előoxigént telítettük Krebs-Ringer-foszfát-közegben (pH 7,4), amely 120 mmol NaCI-, 5 mmol KCI-, 1,3 mmol CaCI₂-, 1,2 mmol MgCI₂-, 16 mmol nátrium-foszfát- (pH 7,4) és 10 mmol glükóztartalmú volt. 15 perc előinkubálást végeztünk keverés közben vízfürdőben 35 °C hőmérsékleten. Ezt követően a puffért ugyanilyen pufferrel (kontroll) vagy módosított pufferrel (laktátpuffer) helyettesítettük. Ez utóbbi 90 mmol NaCI-, 5 mmol KCI-, 1,3 mmol CaCI₂-, 1,2 mmol MgCI₂-, 16 mmol nátrium-foszfát- és 30 mmol tejsav(pH 5,0) tartalmú. Az egyes mintákban (C7) képletű anyagot (50 μηηοΙ) adagoltunk az előinkubálás és az inkubálási periódus során. 100 perc elteltével a metszeteket gyűjtöttük, majd homogenizáltuk 0,9 ml TCA 5%-os oldatban úgy, hogy 0,35 ml TCA 5%-os oldatot adagoltunk 0,5 ml inkubálási közeghez. A lipidperoxidálást 0,25 ml tiobartitursav reagens (TBAR) 0,5 ml TCA-extraktumhoz történő adagolással mértük, amely elegyet ezután 60 percen át 85-93 °C hőmérsékleten inkubáltunk. A lipideket ezt követően kétszer 0,5 ml 1 -butanollal örvénykeverés segítségével 10 másodpercen át extraháltuk. Ezután ezeket 2000 ford./perc érték mellett 10 percen át centrifugáltuk. Az alkoholos fázisban található peroxidált lipidek abszorpcióját spektrofotometriásán 532 nm érték mellett mértük. Az adatokat nmol malondialdehid (MDA) értékben fejeztük ki, és a standardgörbét eredeti MDA segítségével alakítottuk ki. A proteintartalmat a TCA-extraktumok kis mintájából határoztuk meg Bradford-eljárással, és a végső eredményeket nmol MDA-képződés/mg fehérje értékre számítottuk.

Eredmények

A 9. ábrán bemutatjuk a llpidperoxidálást a 0 időpontban (közvetlenül a kimetszés után), illetve 100 perccel a pH 7,4 értéken történő inkubálást követően (kontroll), továbbá bemutatjuk a pH 5,0 (laktát) érték melletti lipidperoxidálást hatóanyag nélkül (LA) vagy a hatóanyag jelenlétében (LA+C7), amely hatóanyag 50 μητιοΙ C7. A bemutatott adagok részben a metszethomogenátumra (szaggatott vonalak), részben az inkubálási közegre vonatkoznak (pontozott vonalak). Az adatok átlagértéke ±S. D., az eredmények esetében a C7 kísérleti csoport jelentősen statisztikailag eltérő a kontrollcsoporttal összehasonlítva (p<0,01), ugyanakkor amennyiben kis különbséget tapasztalunk az LA és LA+C7 csoport között, ez nem áll fenn. A hippocampalis metszetek 30 mmol laktáttal végső pH 5,0 értéknél végzett inkubálása a lipidperoxidálásban nagy növekedést eredményezett, amint ezt tiobartitursav tesztvizsgálattal mértük. A C7 (50 pmol) jelenlétében végzett metszetinkubálás teljesen megszüntette a lipidperoxidálás növekedését. A laktát által indukált malondialdehidkoncentráció-növekedést az inkubálási közegben (pontozott vonalak) és a metszethomogenátumban (szaggatott vonalak) a C7 által blokkolt. A 100 percen át végzett inkubálás laktát jelenléte nélkül a C7 jelenlétében vagy enélkül nem különösebb növekedést okozott a lipidperoxidálásban.

Az adatok azt mutatják, hogy a C7 képletű anyag megakadályozza a lipidperoxidálást, amelyet acidózis indukált. Az acidózis ismert oka a kiterjedt oxidatív károsodás indukálásának. A lipidperoxidálás az ilyen oxidatív károsodás következménye, és számos humán patológiában előfordul.

In vitro sérülés modellek

Anoxia hippocampalis metszetekben

Felnőtt Sprague-DawIey-patkányokból nyert hippocampalis metszeteken (400 μηη) elektrofiziológiai vizsgálatot végeztünk. A metszeteket 50 μίτιοΙ C7 jelenlétében vagy enélkül 35 °C hőmérsékleten két érintkezőkamrában tároltuk. A CA1 stratum radiatumba üvegmérő mikropipettát helyeztünk, és mértük az ingerlő posztszinaptikus feszültséget (EPSPs), amelyet Schaffer-idegközponti elektromos stimulálás útján idéztünk elő egy bipoláris stimulálóelektróddal 0,033 Hz frekvenciaértéken. Az anoxiás epizód során az oxigéntáplálást 100% nitrogéngázzal helyettesítettük. Az elektromos ingerlés szünetet követően a nitrogént 90 másodpercig vezettük be, majd az oxigénbevezetést ismét folytattuk. Az EPSPs (meredekség és amplitúdó) visszaállását 50 percen át mértük, ebben az időpontban a metszetek életképességét meghatároztuk. Az életképesség az az eset, amennyiben a metszet 3 mV EPSP generálására képes.

Hippocampalis metszetekben történő acidózis

Hippocampalis metszeteket gyűjtünk peroxigénezett Krebs-Ringer-foszfát-pufferben 50 pmol C7 jelenlétében vagy jelenléte nélkül, majd ezeket 35 °C-on rázatjuk vízfürdőben. 15 perc előinkubálás után a metszeteket ugyanebbe a pufferbe átvisszük vagy pufferben tároljuk, amely 30 mmol laktátot (pH 5,0) tartalmaz (C7 jelenlétében vagy anélkül). Valamennyi csoportban alkalmazott metszeteket 100 perc inkubálás után gyűjtöttük, és lipidperoxidálást vizsgáltunk, amelyet a malondialdehid tiobarbitursavval történő reakciója indikált.

Neuronsérülés in vivő modell

MPTP-egerekben óra időtartamon belül felnőtt hím CFW-egereknek (25-33 g) két MPTP-injekciót adagoltunk, amely normál fiziológiás sóoldatban oldott (40 mg/kg, szubkután). Az állatok egyik csoportja továbbá (C7) három injekciót kapott (33 mg/kg, szubkután), amelyeket 24 óra időközönként adagoltunk, és az MPTP-kezeléshez számított egy nappal előtt kezdtük az adagolást. Az első MPTP-injektálást követő hetedik napon az állatokat leöltük, majd idegpatológiai vizsgálatot végeztünk ³H-mazindolkötés-vizsgálattal, mely a dopamintranszportáló anyag liganduma. A kötődést 10 mm fagyasztott agymetszetekhez vagy striatum homogenátumhoz mértük.

HU 225 109 Β1

6-OHDA egerekben

Felnőtt hím CFW-egereket érzéstelenítettünk ketaminnal és rumpun segítségével, majd helyzetrögzítő eszközzel mozdulatlanná rögzítettük. 6-OHDA hidrobromidsó-formát normál fiziológiás sóoldatban 1 % aszkorbáttartalom mellett oldottunk, majd az oldatból 10 μΙ Hamilton fecskendővel 50 μg oldatot adagoltunk az oldalsó agykamrába. A (C7) (66 mg/kg intraperitoneális) képletű vegyület adagolását naponta végeztük 4 napon át. Az állatokat a 7 nappal később elpusztítottuk, és a neuronpatológiát vizsgáltuk a striatum homogenátumhoz való ³H-mazindol-kötődés alapján.

Eredmények

A (C7) képletű vegyület védelmet biztosít a hippocampalis metszeteknek anoxiaindukált károsodással szemben

Hippocampalis metszeteket tettünk ki anoxiás körülményeknek (C7) (50 pmol) jelenlétében vagy enélkül. A (C7) képletű vegyület jelentős mértékű védelmet biztosított az anoxiaindukált szinaptikus válasz csökkenésével szemben CA1 esetében. Az EPSP (A) meredekség, illetve (B) amplitúdó esetében a csökkenést a (C7) képletű vegyület megakadályozta. Tisztított marhaszérum-SOD ugyanilyen tesztvizsgálatban ilyen védelmet nem mutatott.

A 10. ábrán bemutatjuk, hogy 6-OHDA- (50 pg) injektálás az azonos oldali striatumból kapott homogenátumban 60-70%, és az ellenkező oldali striatumban 30%-os mazindolkötödés-csökkenést eredményezett (10. ábra). A (C7) (4*66 mg/kg) kezelés jelentős csökkenést eredményezett az ugyanazon oldali esetben, és teljes védelmet nyújtott az ellenkező oldali területen.

MPTP-adagolás (2*40 mg/kg szubkután) 75-80% mazindolkötés-csökkenést eredményez. A (C7)-kezelés (3*33 mg/kg intraperitoneális) jelentős védelmet eredményezett (p<0,05) a ³H-mazindol-kötődés csökkenésével szemben mind a glóbus pallidus, mind a farkas nucleus esetében (A panel). A (C7)-kezelés önmagában nem eredményezett jelentős hatást a ³H-mazindol-kötésre. Az ugyanilyen kezelés továbbá jelentős védelmet biztosított a ³H-mazindol-kötés csökkenésével szemben, amelyet a striatum homogenátumban mérhetünk (B panel).

Következtetések

A fenti eredményeket azt mutatják, hogy a (C7) képletű vegyület szintetikus katalitikus gyökfogó (SCS) különféle tesztvizsgálati neuronkárosodási modellekben védőhatást fejt ki. A (C7) képletű vegyület képes a neuronok védelmére akut, korai neuronkárosodás kifejlődésével szemben, mint például lipidperoxidációval és szinaptikus élőképesség-vesztés esetével szemben, ezen túlmenően alkalmas védelem kifejtésére, hosszú távú neuronsérülés, mint például neuronvesztés a toxininjektálás után 7 nappal, védelmére.

Mivel a (C7) vegyület perifériás injektálása esetében pozitív hatást tapasztaltunk in vivő modellekben neuronsérülés esetében, feltehető, hogy a komplex in vivő stabil, és áthalad a vér-agy gáton, valamint a neuronmembránokon.

A (C7) vegyület pozitív hatása különféle neuronsérülés-modelleken azt jelzi, hogy a reaktív oxigénrészecskék, különösen a szuperoxidgyök, jelentős szerepet játszik különféle patológiák esetében, amelyeket ischaemia és acidózis, továbbá MPTP- és 6-OHDA-indukált nigrostriatum dopaminerg neuronvesztés okoz.

Végül az oxigéntartalmú gyökök túlzott termelésével kapcsolatos patológiai esetek széles köre azt mutatja, hogy ezek az eredmények alátámasztják, hogy antioxidáns salen-fém komplexeket, mint például (C7) képletű vegyületet alkalmazhatunk széles körben terápiás célokra.

A fenti leírás során a találmány szerinti megvalósítás előnyös formáit mutattuk be, azonban ezek csak illusztrációként szolgálnak. A bemutatott példák nem kimerítők, ezenkívül nem korlátozzák a találmány tárgykörét, és természetesen a találmány tárgykörébe beleértendő valamennyi, a lényeget nem befolyásoló módosítás és változtatás.

Az ilyen fenti módosítások és változtatások a szakember előtt a szakirodalom ismeretében nyilvánvalóak.

Claims (28)

1. Gyógyszerkészítmény szabad gyökkel kapcsolatos betegségek megelőzésére vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy valamely (I) általános képletű antioxidáns salen-fém komplex gyógyszerészetileg elfogadható formájú terápiásán hatásos mennyiségű dózisát tartalmazza, ahol az általános képletben M jelentése Mn, Co, Fe, V, Cr és Ni;

A jelentése valamely anion;

n jelentése 0, 1 vagy 2;

Χμ K₂, X₃ és X₄ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, szililcsoport, arilcsoport, mely egy vegyértékű telítetlen aromás karbociklusos csoport és egy gyűrűt tartalmaz, előnyösen fenilcsoport, vagy több kondenzált gyűrűt tartalmaz, előnyösen naftilcsoport vagy antranilcsoport, és amelyek adott esetben szubsztituenst tartalmazhatnak, aril(1-12 szénatomos)-alkil-csoport, ahol az arilcsoport jelentése a fenti, elsőrendű, másodrendű vagy harmadrendű 1-12 szénatomos alkilcsoport, 1-12 szénatomos, adott esetben egy nem befolyásoló jellegű szubsztituenssel szubsztituált alkoxicsoport, aril-oxi-csoport, ahol az arilcsoport jelentése a fenti, -NR’R” általános képletű aminocsoport, ahol R’ és R egymástól függetlenül hidrogénatom, 1-2 szénatomos alkilcsoport vagy arilcsoport, ahol az arilcsoport jelentése a fenti, kvaterner aminocsoport, heteroatom vagy hidrogénatom;

Y·,, Y₂,Y₃,Y₄, Y₅ és Y₆ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, halogénatom, 1-12 szénatomos alkilcsoport, arilcsoport, aril-(1-12 szénatomos)-alkil-csoport, szililcsoport, aminocsoport, alkilcsoport vagy arilcsoport, amely heteroatomot tartalmaz és halogénatom; és

Rí, R₂, R3 és R₄ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, arilcsoport, zsírsav-észter-csoport,

HU 225 109 Β1 szubsztituált alkoxi-aril-csoport, heteroatomot tartalmazó aromás csoport, aril-(1-12 szénatomos)alkil-csoport, elsőrendű, másodrendű vagy harmadrendű (1-12 szénatomos) alkilcsoport.

2. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a szabad gyökkel kapcsolatos betegség ischaemia/újraoxigénezés epizód és iatrogén szabadgyök-toxicitás.

3. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy az antioxidáns salen-fém komplex a (IV), (V), (VI), (VII), (Vili) és (IX) általános képletű csoportok valamelyike.

4. A 3. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott antioxidáns salen-fém komplex a C1, C4, C6, C7, C9, C15, C17, C20, C22, C23, C25, C27 és C28 vegyületek valamelyike.

5. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott antioxidáns salen-fém komplex a (III) általános képletű vegyület, ahol az általános képletben

M jelentése átmenetifém-ion, amely lehet Mn, Co, Fe,

V, Cr és Ni;

A jelentése valamely anion;

n jelentése 4, 5 vagy 6 egész szám;

X₁, X₂, X₃ és X₄ jelentése egymástól függetlenül az 1. igénypont szerint definiált arilcsoport, aril-alkil-csoport, aril-oxi-csoport, alkilcsoport, alkoxicsoport, szubsztituált alkoxicsoport, heteroatom, aminocsoport, kvaterner aminocsoport vagy hidrogénatom;

^Y1> ^Y2· ^Y3> ^Y4' ^Y5 ®^{s γ}6 jelentése egymástól függetlenül az 1. igénypont szerint definiált arilcsoport, arilalkil-csoport, alkilcsoport, alkoxicsoport, szubsztituált alkoxicsoport, aril-oxi-csoport, halogénatom, heteroatom, aminocsoport, kvaterner aminocsoport vagy hidrogénatom;

R₁ és R₄ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, halogénatom, elsőrendű, másodrendű vagy harmadrendű alkilcsoport, zsírsav-észter-csoport, alkoxicsoport vagy arilcsoport.

6. A 3. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy az antioxidáns salen-fém komplex lehet a C10, C11, C12, C29 és C30 képletű vegyület.

7. A 2. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy az antioxidáns salen-fém komplex a SOD-mimetikus (C7) képletű vegyület.

8. A 7. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a gyógyszerkészítmény legalább kb. 10 mg (C7) képletű vegyületet tartalmaz parenterális adagolásra alkalmas formában.

9. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű antioxidáns salen-fém komplexek alkalmazása szabad gyökkel kapcsolatos betegségek megelőzésére, megállítására vagy kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására.

10. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a szabad gyökkel kapcsolatos betegség ischaemia/újraoxigénezés epizód és iatrogén szabadgyök-toxicitás.

11. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott antioxidáns salen-fém komplexet tartalmazó gyógyszerkészítményben található antioxidáns salen-fém komplex az (I), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (Vili) vagy (IX) általános képletű vegyület.

12. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott antioxidáns salen-fém komplex a C1, C4, C6, C7, C9, C10, C11, C12, C15, C17, C20, C22, C23, C25, C27, C28, C29 vagy C30 képletű vegyület.

13. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott salen-fém komplex a C7 képletű vegyület.

14. Az 1. igénypont szerinti, szabad gyökkel kapcsolatos sugárzási, illetve kemikália által okozott károsodás megelőzésére alkalmas készítmény.

15. A 14. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott antioxidáns salen-fém komplex a SOD-mimetikus (C7) képletű vegyület.

16. A 14. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott salen-fém komplex a kezelt beteg bőrére alkalmazható helyi adagolású formában kialakított.

17. A 16. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az antioxidáns salen-fém komplex napfényellenes krémben, napfényellenes lemosóban vagy kozmetikumban előállított formájú.

18. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű antioxidáns salen-fém komplexek alkalmazása ionizáló sugárzásból vagy szabadgyök-generáló kemoterápiás szer adagolásából eredő szabadgyök-károsító hatású jelenség csökkentésére vagy megelőzésére alkalmas készítmény előállítására.

19. A 18. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az adagolt salen-fém komplex a SOD-mimetikus (C7) képletű vegyület.

20. A 18. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a szabadgyök-generáló kemoterápiás hatóanyag a daganatellenes bleomycin.

21. A 18. igénypont szerinti alkalmazás az ionizáló sugárzás vagy a szabadgyök-generáló kemoterápiás kezelés előtt adagolandó készítmény előállítására.

22. Az 1. igénypont szerinti salen-fém komplexet tartalmazó, humán- vagy állatgyógyászati beteg számára alkalmas készítmény.

23. A 22. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a salen-fém komplexet immunoliposzóma formában tartalmazza.

24. Készítmény, amely 1. igénypont szerinti (I) általános képletű salen-fém komplexet és emlősvért tartalmaz.

25. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy valamely antioxidáns salen-fém komplex gyógyszerészetileg elfogadható formájának hatásos dózisát tartalmazza, ahol az antioxidáns salen-fém komplex a (III) általános képletű vegyület, ahol az általános képletben

M jelentése mangán;

A jelentése hidrogénatom vagy halogénatom; n jelentése 0, 4, 5 vagy 6, és ahol C_n nincs jelen, amennyiben n jelentése 0 és telített szénhidrogén25

HU 225 109 Β1 csoport, amennyiben n jelentése 4, 5 vagy 6 egész szám;

R-ι és R4 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, fenilcsoport, 1-6 szénatomos alkoxicsoport vagy zsírsav-észter-csoport;

X1 és X₃ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilcsoport, aminocsoport, mono- vagy di(1—6 szénatomos alkil)-amino-csoport vagy halogénatom;

X₂ és X4 jelentése hidrogénatom;

Y₁ és Y₄ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilcsoport, halogénatom vagy 1-6 szénatomos alkoxicsoport;

Y₂, Y3. ^Y5 ®^{s Y}6 jelentése hidrogénatom; továbbá valamennyi fennmaradó szubsztituens jelentése hidrogénatom.

26. A 25. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott antioxidáns sa5 len-fém komplex a C1, C4, C6, C7 vagy C9 képletű vegyület.

27. A 25. igénypont szerinti (Ili) általános képletű vegyületek alkalmazása MPTP vagy anoxiasérülés által indukált neuronsérülés megelőzésére, leállítására

10 vagy kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.

28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott antioxidáns salen-fém komplex (C7) képletű vegyület.