NO319454B1

NO319454B1 - Farmasoytiske preparater basert pa syntetiske katalytiske fri-radikal-oppfangere anvendelige som anti-oksidanter for forebyggelse og terapi av sykdom

Info

Publication number: NO319454B1
Application number: NO19952237A
Authority: NO
Inventors: Bernard Malfroy-Camine; Michel Baudry
Original assignee: Eukarion Inc
Priority date: 1992-12-07
Filing date: 1995-06-06
Publication date: 2005-08-15
Also published as: GB2277873A; UA27949C2; NO952237L; US5403834A; RU2157213C2; AU697399B2; GB2305107A; NO952237D0; PL175446B1; HU225109B1; DE69333775D1; JPH08504211A; CA2150937A1; GB2305107B; CZ296288B6; EP0746321B1; HU9501644D0; DE69333775T2; OA10165A; JP3502099B2

Description

Område for oppfinnelsen

Denne oppfinnelse tilveiebringer farmasøytiske preparater av syntetiske katalytiske små-molekyl-antioksydanter og anvendelse av et antioksydant-salen-metallkompleks som definert i krav 1 til fremstilling av et farmasøytisk preparat for forhindring, stopping eller behandling av en fri-radikal-assosiert sykdomstilstand som er et resultat av en ubalanse av fri-radikaler, anvendelse av en profylaktisk effektiv dose av minst én type av et antioksydant-salen-metallkompleks med den strukturelle formel: hvor M, A, R1-R4, X1-X4, Y1-Y6 er som definert i krav 1, i en farmasøytisk akseptabel form til fremstilling av et farmasøytisk preparat for forhindring av fri-radikal-assosiert strålingskade og kjemisk skade hos en pasient, anvendelse av et antioksydant-salen-metallkompleks med den strukturelle formel:

hvor M, A, R1-R4, X1-X4, Y1-Y6 er som definert i krav 1 til fremstilling av et farmasøytisk preparat for forhindring eller reduksjon av alvorlighetsgraden av fri-radikal-skade på en pasient som er et resultat av behandling med ioniserende stråling eller administrering av et fri-radikal-dannende kjemoterapeutisk middel og anvendelse av en terapeutisk effektiv dose av et antioksidant-salen-metallkompleks som definert i krav 24, til fremstilling av et farmasøytisk preparat for forhindring, stopping eller behandling av nevrologisk skade fremkalt ved l-metyl-4-fenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) eller anoksi-skade.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Molekylært oksygen er et essensielt næringsemne for ikke-fakultative aerobe organismer, naturligvis omfattende mennesker. Oksygen anvendes på mange viktige måter, nemlig som den terminale elektronakseptor ved oksydativ fosforylering, ved mange dioksygenasereaksjoner, innbefattet syntese av prostaglandiner og av vitamin A fra karotenoider, i en rekke hydroksylasereaksjoner, innbefattet dannelse og modifisering av steroide hormoner, og ved både aktivering og inaktivering av xenobiotika, innbefattet karsinogener. Det ekstensive P-450-system anvender molekylært oksygen i en rekke viktige cellereaksjoner. På lignende måte anvender naturen frie radikaler i en rekke forskjellige enzymreaksjoner.

For høye konsentrasjoner av forskjellige former av oksygen og av frie radikaler kan ha alvorlige skadelige effekter på levende systemer, innbefattet peroksydasjonen av membran-lipider, hydroksylering av nukleinsyrebaser, og oksydasjon av sulfhydrylgrupper og av andre følsomme grupper i proteiner. Dersom de ikke kontrolleres vil resultatene bli mutasjoner og celledød.

Biologiske antioksydanter omfatter veldefinerte enzymer, slik som superoksyd-dismutase, katalase, selenglutation-peroksydase, og fosfolipid-hydroperoksydglutation-peroksydase. Ikke-enzymatiske biologiske antioksydanter omfatter tokoferoler og tokotrienoler, karotenoider, kinoner, bilirubin, askorbinsyre, urinsyre og metall-bindende proteiner. Forskjellige antioksydanter som er både lipid- og vannløselige, blir funnet i alle deler av celler og vev, selv om hver spesifikke antioksydant ofte har et karakteristisk fordelingsmønster. De såkalte ovotioler som er merkaptohistidinderivater, vil også dekomponere peroksyder ikke enzymatisk.

Frie radikaler, særlig frie radikaler avledet fra molekylært oksygen, blir antatt å spille en fundamental rolle i en rekke forskjellige biologiske fenomener. I virkeligheten er det blitt antydet at mye av det som betraktes som kritisk sykdom kan involvere oksygenradikal ("oksyradikal") patofysiologi (Zimmermann JJ (1991) Chest 100: 189S). Oksyradikal skade er blitt implikert i patogenesen av lungeoksygen-toksisitet, voksent åndenødssyndrom (ARDS), bronkopulmonær dysplasi, sepsis syndrom, og flere forskjellige ischemi/reperfusjonssyndromer, omfattende myokardialt infarkt, slag, hjerte-lunge-bypass, organtransplantering, nekrotiserende enterocolitis, akutt renal tubulær nekrose, og andre sykdommer. Oksyradikaler kan reagere med proteiner, nukleinsyrer, lipider og andre biologiske makromolekyler og frembringe skade på celler og vev, særlig i den kritisk syke pasient.

Frie radikaler er atomer, ioner eller molekyler som inneholder et uparet elektron (Pryor, WA (1976) Free Radicals in Biol. 1: 1). Frie radikaler er vanligvis ustabile og har korte halveringstider. Elementært oksygen er svært elektro-negativt og vil lett akseptere enkelt-elektronoverføring fra cytokromer og andre reduserte cellekomponenter; en del av det O2 som konsumeres av celler engasjert i aerob respirasjon blir enverdig redusert til superoksydradikal («Ch ) (Cadenas E. (1989) Ann. Rev. Biochem. 58: 79). Sekvensiell enverdig reduksjon av «O^ frembringer hydrogenperoksyd (H2O2), hydroksylradikal (•OH), og vann.

Frie radikaler kan skrive seg fra mange kilder, innbefattet aerob respirasjon, cytokrom P-450-katalysert mono-oksygeneringsreaksjoner av medikamenter og xenobiotika (f.eks. triklormetylradikaler, CClj», dannet ved oksydasjon av karbon-tetraklorid), bg ioniserende stråling. Når f.eks. vev blir utsatt for y-stråling, vil mesteparten av energien tilført cellene bli absorbert av vann og føre til spalting av de kovalente oksygen/hydrogen-bindinger i vann, og etterlate et enkelt elektron på hydrogen og ett på oksygen under dannelse av to radikaler H» og »OH. Hydroksylradikalet, »OH, er det mest reaktive radikal kjent i kjemien. Det reagerer med biomolekyler og setter igang kjedereaksjoner og kan virke sammen med purin eller pyrimidinbasene i nukleinsyrer. I virkeligheten kan strålings-indusert karsinogenese initieres ved fri radikal skade (L.H. Breimer (1988) Brit. J. Cancer 57: 6). F.eks. vil også den "oksydative sprengning" av aktiverte neutrofiler frembringe overflod av superoksyd-radikal, som blir antatt å være en essensiell faktor til å frembringe den cytotoksiske effekt av aktiverte neutrofiler. Reperfusjon av ischemisk vev vil også frembringe høye konsentrasjoner av oksyradikaler, typisk superoksyd (J.M.C. Gutteridge og B. Halliwell (1990) Arch. Biochem. Biophys. 283: 223). Dessuten kan superoksyd frembringes fysiologisk av endothele celler for reaksjon med nitrogenoksyd, en fysiologisk regulator, under dannelse av peroksynitritt, ONOO" som kan nedbrytes og gi opphav til hydroksylradikal, »OH (M.A. Marletta (1989) Trends Biochem. Sei. 14: 488; Moncada et al., (1989) Biochem. Pharmacol. 38: 1709; Såran et al., (1990) Free Rad. Res. Commun. 10: 221; Beckman et al., (1990) Proe. Nati. Acad. Sei. (U.S.A.) 87: 1629). Ytterligere kilder for oksyradikaler er "lekkasje" av elektroner fra sprengte mitokondriske eller endoplasmiske retikulære elektrontransportkjeder, prostaglandinsyntese, oksydasjon av katekolaminer, og blodplate-aktivering.

Mange fri-radikal-reaksjoner er svært skadelige for cellekomponenter; de tverrbinder proteiner, mutageniserer DNA, og peroksyderer lipider. Når de først er dannet kan frie radikaler virke sammen til å frembringe andre frie radikaler og ikke-radikal oksydanter som f.eks. singlett oksygen (^02) og peroksyder. Nedbrytning av noen av produktene fra fri-radikal-reaksjoner kan også danne potensielt skadelige kjemiske forbindelser. F.eks. er malondialdehyd et reaksjonsprodukt av peroksyderte lipider som reagerer med praktisk talt et hvilket som helst amin-holdig molekyl. Oksygen-frie radikaler forårsaker også oksydativ modifikasjon av proteiner (E.R. Stadtman (1992) Science 257: 1220).

Aerobe celler inneholder vanligvis flere forsvar mot de skadelige effekter av oksyradikaler og deres reaksjonsprodukter. Superoksyd-dismutaser (SOD) vil katalysere reaksjonen: 2 + 2 H+ —> 02 + H202 som fjerner superoksyd og danner hydrogenperoksyd. H202 er ikke et radikal, men det er toksisk for celler; det blir fjernet ved de enzymatiske aktiviteter av katalase og glutation-peroksydase (GSH-Px). Katalase vil katalysere reaksjonen: 2 H202 —> 2 H20 + 02

og GSH-Px vil fjerne hydrogenperoksyd ved å anvende det til å oksydere redusert glutation (GSH) til oksydert glutation (GSSG) etter følgende reaksjon:

2 GSH <+><H>202 —> GSSG + 2 H20

Andre enzymer, såsom fosfolipidhydroperoksyd-glutation-

peroksydase (PLOOH-GSH-Px), vil omdanne reaktive fosfolipid-hydroperoksyder, frie fettsyre-hydroperoksyder, og kolesterol-hydroperoksyder til tilsvarende ufarlige fettsyrealkoholer. Glutation S-transferaser deltar også ved detoksifiering av organiske peroksyder. I fravær av disse enzymer og i nærvær av overgangsmetaller, f.eks. jern eller kobber, kan superoksyd og hydrogenperoksyd delta i følgende reaksjoner som danner det ekstremt reaktive hydroksylradikal •OH": •02" + Fe<3+> —> 02 + <Fe2+>

H202 + Fe2+ —> «OH + OH" + Fe<3+>

I tillegg til enzymatisk detoksifiering av frie radikaler og oksyderende forbindelser vil en rekke forskjellige lavmolekylære antioksydanter som f.eks. glutation, askorbat, tokoferol, ubikinon, bilirubin og urinsyre tjene som naturlig forekommende fysiologiske antioksydanter (N.I. Krinsky (1992) Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 200:248-54). Karotenoider er en annen gruppe av små molekyl-antioksydanter og er blitt implikert som beskyttelsesmidler mot oksydativt stress og kroniske sykdommer. Canfield et al., (1992) Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 200: 260, sammenfatter rapporterte forhold mellom karotenoider og forskjellige kroniske sykdommer, innbefattet koronar hjertesykdom, katarakt og cancer. Karotenoider vil dramatisk redusere forekomsten av visse premalignante tilstander, slik som leukoplaki, hos noen pasienter.

I et forsøk på å forebygge de skadelige effekter av oksyradial-dannelse under reoksygenering av ischemisk vev er det blitt anvendt flere forskjellige antioksydanter.

Én strategi for å forebygge oksyradikal-indusert skade er å inhibere dannelsen av oksyradikaler slik som superoksyd. Jern-ion-chelatorer, slik som desferrioksamin (også kalt deferoksamin eller Desferol) og andre, vil inhibere jern-ion-avhengig •OH-dannelse og således virke som inhibitorer for fri radikaldannelse (Gutteridge et al., (1979) Biochem. J. 184: 469; B. Halliwell (1989) Free Radical Biol. Med. 7: 645; Van der Kraaij et al., (1989) Circulation 80: 158). Amino-steroid-baserte antioksydanter slik som 21-aminosteroidene betegnet som "lazaroider" (f.eks. U74006F) er også blitt foreslått som inhibitorer for oksyradikaldannelse. Desferrioksamin, allopurinol, og andre pyrazolpyrimidiner slik som oksypurinol, er også blitt testet for å forebygge oksyradikal-dannelse i et modellsystem med lammelse av hjertemuskelen (Bolli et al., (1989) Circ. Res. 65: 607) og etter blødningssjokk og endotoksisk sjokk (DeGaravilla et al., (1992) Drug Devel. Res. 25: 139). Hver av disse forbindelser har imidlertid betydelige ulemper for terapeutisk anvendelse. F.eks. er deferoksamin ikke en ideell jern-chelator, og dets cellepenetrasjon er ganske begrenset.

En annen strategi for å forebygge oksyradikal-indusert skade er katalytisk å fjerne oksyradikaler slik som superoksyd etter at de er dannet. Superoksyd-dismutase og katalase er blitt inngående utforsket, med et visst hell, som beskyttelsesmidler når de settes til reperfusater i mange typer eksperimenter eller når de settes til pre-ischemi (oversikt hos J.M.C. Gutteridge og B. Halliwell (1990) op.cit.). Tilgjengeligheten av rekombinant superoksyd-dismutase har tillatt mer utstrakt evaluering av effekten av administrering av SOD ved behandling eller forebyggelse av forskjellige medisinske tilstander innbefattet reperfusjonsskade av hjernen og ryggmargen (Uyama et al., (1990) Free Radic. Biol. Med. 8: 265; Lim et al., (1986) Ann. Thorac. Surg. 42: 282), endotoksemi (Schneider et al., (1990) Circ. Shock 30: 97; Schneider et al., (1989) Prog. Clin. Biol. Res. 308: 913, og hjertemuskel-infarkt (Patel et al., (1990) Am. J. Physiol. 258: H369; Mehta et al., (1989) Am. J. Physiol. 257: Hl240; Neijima et al., (1989) Circulation 79: 143; Fincke et al., (1988) Arzneimittelforschung 38: 138; Ambrosio et al.,

(1987) Circulation 75: 282), og for osteoartitt og intestinal ischemi (Vohra et al., (1989) J. Pediatr. Surg. 24: 893; L. Flohe (1988) Mol. Cell. Biochem. 84: 123). Superoksyd-dismutase er også blitt rapportert å ha positive effekter ved behandling av systemisk lupus-erytematose, Crohn's sykdom, mavesår, oksygentoksisitet, pasienter med brannsår, nyresvikt etter transplantering, og herpes simplex-infeksjon.

En alternativ strategi for forebyggelse av oksyradikal-indusert skade er å oppfange oksyradikaler som superoksyd etter at disse er dannet, typisk ved anvendelse av små molekyl-oppfangere som virker støkiometrisk istedenfor katalytisk. Kongenerer av glutation er blitt anvendt i forskjellige dyremodeller til å svekke oksyradikal skade. F.eks. er det funnet at N-2-merkaptopropionylglycin vil gi beskyttende effekter i en hundemodell av myokardial ischemi og reperfusjon (Mitsos et al., (1986) Circulation 73: 1077) og N-acetylcystein ("Mucomyst") er blitt anvendt til behandling av endotoksin-toksisitet hos sau (Bernard et al., (1984) J. Clin. Invest. 73: 1772). Dimetyltiourea (DMTU) og butyl-a-fenylnitron (BPN) blir antatt å fange opp hydroksylradikalet, »OH, og er blitt vist å redusere ischemi-reperfusjonsskade i rotte-myokardium og i kaniner (Vånder Heide et al.,

(1987) J. Mol. Cell. Cardiol. 19: 615; Kennedy et al., (1987) J. Appl. Physiol. 63: 2426. Mannitol er også blitt anvendt som fri-radikaloppfanger for å redusere organskade under reoksygenering (R.B. Fox (1984) J. Clin. Invest. 74: 1456; Ouriel et al., (1985) Circulation 72: 254). I én rapport ble et små-molekyl-chelat angitt å ha aktivitet som en glutationperoksydaseimitator (Spector et al., (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 90: 7485).

Anvendelse av inhibitorer av oksyradikal-dannelse og/eller enzymer som fjerner superoksyd og hydrogenperoksyd og/eller små molekyloksyradikal-oppfangere har således alle vist løfte om å forebygge reoksygeneirngsskade til stede i flere forskjellige ischemiske patologiske tilstander og for behandling eller forebyggelse av forskjellige sykdomstilstander i forbindelse med fri-radikaler. Hver av disse kategorier har imidlertid flere ulemper. F.eks. vil inhibitorer av oksyradikaldannelse typisk chelatere overgangsmetaller som anvendes i essensielle enzymatiske prosesser i normal fysiologi og respirasjon; dessuten vil disse inhibitorer endog ved svært høye doser ikke fullstendig forebygge oksyradikaldannelse. Superoksyd-dismutaser og katalase er store polypeptider som det er dyrt å fremstille, som ikke penetrerer celler eller blod/hjerne-barrieren, og som generelt krever parenterale administrasjonsveier. Fri-radikal-oppfangere virker støkio-metrisk og blir således lett utarmet og må administreres i høye doseringer for å være effektive.

Basert på det foregående er det klart at det eksisterer et behov for antioksydantmidler som er effektive til å fjerne farlige oksyradikaler, særlig superoksyd og hydrogenperoksyd, og som er billige å fremstille, stabile, og har fordelaktige farmakokinetiske egenskaper, slik som evnen til å krysse blod/hjerne-barrieren og penetrere vev. Slike allsidige antioksydanter ville finne anvendelse som farmasøytika, kjemo-beskyttelsesmidler og muligens som diettsupplement. Det er ett formål ifølge denne oppfinnelse å tilveiebringe en klasse av nye antioksydanter som har fordelaktige farmakologiske egenskaper og som katalytisk og/eller støkiometrisk fjerner superoksyd og/eller hydrogenperoksyd.

Referansene diskutert her tilveiebringes utelukkende for sin åpenbaring før registreringsdatoen for foreliggende søknad. Intet heri skal oppfattes som en innrømmelse av at oppfinnerne ikke har rett til å antedatere en slik åpenbaring i kraft av tidligere oppfinnelse. Alle siterte publikasjoner er inkorporert heri ved referanse.

Sammendra<g> av oppfinnelsen

Ifølge de foregående formål tilveiebringes i ett aspekt av denne oppfinnelse farmasøytiske preparater som har potente antioksydante og/eller fri-radikal-oppfangende egenskaper og fungerer som in vivo antioksydanter. De farmasøytiske preparater ifølge denne oppfinnelse omfatter en terapeutisk effektiv dose av et antioksydant-salen-metallkompleks med den strukturelle formel:

M er Mn

A er hydrogen eller halogen

n er 0

XI og X3 er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og tertiære alkyler X2 og X4 er hydrogen

Yl og Y4 er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, primære alkyler, alkoksygrupper og tertiære alkyler

Y2, Y3, Y5 og Y6 er hydrogen

RI, R2, R3 og R4 er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, fenyl, benzyloksy, eller to av R-gruppene danner til sammen en C4-alkylenbro, hvor minst to av R-gruppene er H. Foretrukne utførelsesformer derav fremgår av kravene 2-8. Disse farmasøytiske preparater har den aktivitet at de dismuterer superoksyd (d.v.s. superoksyd-dismutaseaktivitet) og omdanner også fordelaktigvis hydrogenperoksyd til vann (d.v.s. katalaseaktivitet). De farmasøytiske preparater er effektive til å redusere patologisk skade relatert til dannelse av oksyradikaler, f.eks. superoksyd og peroksyder og andre fri-radikal-forbindelser.

Preparatene er anvendelige for behandling og forebyggelse av patologiske tilstander ved påføring eller administrering av blandinger av salen-overgangsmetall-komplekser i en terapeutisk eller profylaktisk dosering. Salen-overgangsmetall-komplekser som anvendes er typisk salen-mangan-komplekser, f.eks. Mn(m)-salen-komplekser. De kan forebygge eller redusere ischemisk/reperfusjonsskade på kritisk vev slik som myokardium og sentralnervesystemet, og videre forebygge eller redusere celleskade som skriver seg fra eksponering for forskjellige kjemiske forbindelser som frembringer potensielt skadelige fri-radikal-forbindelser, og er fortrinnsvis et salen-mangan-kompleks som har påvisbar SOD-aktivitet og fortrinnsvis også har påvisbar katalaseaktivitet. Salen-overgangsmetall-kompleksene med antioksydant effekt som anvendes i denne oppfinnelse blir administrert via flere forskjellige veier, omfattende parenteralt, lokalt og oralt.

Således administreres en terapeutisk eller profylaktisk dosering av et salen-overgangsmetall-kompleks alene eller sammen med (1) ett eller flere antioksydantenzymer, slik som et Mn-SOD, et Cu, Zn-SOD eller katalase, og/eller (2) én eller flere fri-radikal-oppfangere, slik som tokoferol, askorbat, glutation, DMTU, N-acetylcystein, eller N-2-merkaptopropionylglycin og/eller (3) én eller flere oksyradikale inhibitorer, slik som desferrioksamin eller allopurinol, og/eller ett eller flere biologiske modifiseringsmidler, slik som kalpain-inhibitorer. Formuleringene av disse blandinger er avhengig av den spesifikke patologiske tilstand som søkes behandlet eller forebygget, administrasjonsmåten og -formen, og pasientens alder, kjønn og tilstand. Disse blandinger administreres for forskjellige indikasjoner, innbefattet: (1) for å forebygge ischemisk/reoksygeneringsskade hos en pasient, (2) for å bevare organer for transplantering i anoksisk, hypoksisk eller hyperoksisk tilstand før transplantering, (3) for å beskytte normalt vev fra fri-radikal-indusert skade som følge av eksponering for ioniserende stråling og/eller kjemoterapi, som med bleomycin, (4) for beskyttelse av celler og vev fra fri-radikal-indusert skade som følge av eksponering for xenobiotiske forbindelser som danner fri-radikaler, enten direkte eller som følge av mono-oksygenering gjennom cytokrom P-450-systemet, (5) for å forbedre kryopreservasjon av celler, vev, organer og organismer ved å øke levedyktigheten av gjenvunne prøver, og (6) for profylaktisk administrering for å forebygge: karsinogenese, cellealdringsprosess, katarakt-dannelse, dannelse av malondialdehyd-addukter, HTV-patologi og makromolekylær tverrbinding, slik som kollagen-tverrbinding.

Salen-overgangsmetall-komplekser for administrering via oral vei kan formuleres som en farmasøytisk doseringsform omfattende en eksipient og ikke mindre enn 1 u.g og heller ikke mer enn ca. 10 g av minst ett antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleks. Diett-formuleringer administreres for terapi av fri-radikal-induserte sykdommer og/eller for kjemo-forebyggelse av neoplasi og/eller oksydativ skade i forbindelse med normal aerob metabolisme.

Bufrede vandige løsninger omfattende minst ett antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleks kan formuleres i en konsentrasjon på minst 1 nM, men ikke mer enn ca. 100 mM for administrering, vanligvis ved en konsentrasjon på ca. 0,1 til 10 mM, typisk på intravenøs måte, til en pasient som undergår eller forventes å undergå: (1) en ischemisk episode, slik som et myokardialt infarkt, cerebral ischemisk hendelse, trans-plantasjonsoperasjon, åpen hjertekirurgi, elektiv angioplasti, koronararterie-bypass-kirurgi, hjernekirurgi, renalt infarkt, traumatisk blødning, tourniquet-anvendelse, (2) anti-neoplastisk eller anti-helmintisk kjemoterapi ved anvendelse av et kjemoterapeutisk middel som danner frie radikaler, (3) endotoksisk sjokk eller sepsis, (4) eksponering for ioniserende stråling, (5) eksponering for eksogene kjemiske forbindelser som er fri-radikaler eller frembringer frie radikaler, (6) termiske eller kjemiske forbrenninger eller sårdannelser, (7) hyperbart oksygen, eller (8) apoptose av en forutbestemt cellepopulasjon (f.eks. lymfocytt-apoptose). De bufrede vandige løsninger ifølge denne oppfinnelse kan også anvendes, typisk i forbindelse med andre etablerte fremgangsmåter, for organkultur, cellekultur, vedlikehold av transplanteringsorganer, og myokardial irrigasjon. Ikke-vandige formuleringer, slik som lipid-baserte formuleringer tilveiebringes også, innbefattet stabiliserte emulsjoner. Antioksydant-salen-metall-blandingene blir administrert via forskjellige veier, innbefattet intravenøs injeksjon, intramuskulær injeksjon, subdermal injeksjon, intraperikardial injeksjon, kirurgisk irrigasjon, lokal påføring, oftalmologisk påføring, utskylling, kunstig ernæring, klystér, intraperitoneal infusjon, tåke-inhalasjon, oral skylling, og andre måter, avhengig av den spesifikke medisinske eller veterinære anvendelse som tilsiktes.

Antioksydative salen-overgangsmetall-komplekser kan også anvendes til å modulere ekspresjonen av naturlig forekommende gener eller andre polynukleotidsekvenser under transkripsjons-kontroll av et oksydativt stress-responselement (f.eks. et antioksydant responsivt element, ARE), slik som et antioksydant responselement av et glutation S-transferase-gen eller et NAD(P)H:kinon reduktase-gen. De antioksydative salen-metallkompleksene kan anvendes til å modulere transkripsjonen av ARE-regulerte polynukleotidsekvenser i cellekulturer (f.eks. ES-celler) og i intakte dyr, særlig i transgene dyr hvori et transgen omfatter ett eller flere ARE som transkripsjons-regulatoriske sekvenser.

Preparatene kan også anvendes for å forebygge ødeleggelse og oksydasjon av matvarer ved anvendelse på matvarer av en effektiv mengde av minst én antioksydant-salen-metallkompleks-forbindelse. Oppfinnelsen tilveiebringer også blandinger for å forebygge ødeleggelse av matvarer, omfattende en effektiv mengde av minst én forbindelse av antioksydant-salen-metallkompleks, eventuelt i kombinasjon med minst ett ytterligere matvarekonserveringsmiddel (f.eks. butylert hydroksytoluen, butylert hydroksyanisol, sulfater, natriumnitritt, natriumnitrat). F.eks. inkorporeres et antioksydant-salen-metall-kompleks i et næringsmiddel utsatt for harskning (f.eks. oksydasjon) for å redusere hastigheten av oksydativ dekomponering av matvaren når den utsettes for molekylært oksygen.

Alle publikasjoner og patentsøknader heri er inkorporert ved referanse i den samme grad som om hver enkelt publikasjon eller patentsøknad var spesifikt og individuelt angitt å være inkorporert ved referanse.

Kort beskrivelse av tepningene

Fig. 1 viser den generelle struktur av salenderivater som anvendes i oppfinnelsen.

Fig. 2 viser et salenderivat ifølge strukturen vist i fig. 1, hvor n er 0.

Fig. 3 viser strukturer av foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen.

Fig. 4 viser skjematisk effekten av en ischemisk/reoksygenerings-episode på synaptisk transmisjon i isolerte hjerneskiver. Fig. 5 viser effekten av et salen-Mn-kompleks på EPSP-amplituden etter en episode av ischemi/reoksygenering. Fig. 6 viser effekten av et salen-Mn-kompleks på EPSP initial helling etter en episode av ischemi/reoksygenering. Fig. 7 viser effekten av et salen-Mn-kompleks på hjemeskive-levedyktighet etter gjentatte episoder av ischemi/reoksygenering. Fig. 8 viser den beskyttende effekt av et salen-Mn-kompleks i en dyremodell av iatrogen Parkinsons sykdom. Fig. 9 viser at C7 beskytter hippokampale skiver mot melkesyre-indusert lipid peroksydasjon. Fig. 10 viser at C7 beskytter dopaminerge neuroner i mus-striatum mot 6-OHDA-indusert degenerering. Fig. 11 viser at C7 beskytter dopaminerge neuroner i mus-striatum mot MPTP-indusert degenerering.

Definisjoner

Dersom de ikke er definert på annen måte, skal alle tekniske og vitenskapelige betegnelser som anvendes her ha den samme betydning som vanligvis forstås av en vanlig fagmann på det område som denne oppfinnelse tilhører. Selv om hvilke som helst fremgangsmåter og materialer lignende eller tilsvarende dem beskrevet her, kan anvendes ved praktiseringen eller testingen av foreliggende oppfinnelse, er de foretrukne fremgangsmåter og materialer beskrevet. For formålet med foreliggende oppfinnelse er følgende betegnelser definert nedenfor.

Som anvendt her skal en "antioksydant" være en substans som, når den er til stede i en blanding eller struktur inneholdende et oksyderbart substrat biologisk molekyl, signifikant forsinker eller forebygger oksydasjon av det substrat biologiske molekyl. Antioksydanter kan virke ved oppfanging av biologisk viktige reaktive fri-radikaler eller andre reaktive oksygenforbindelser («O^<->. t^C^, •OH, HOC1, ferryl, peroksyl, peroksynitritt og alkoksyl), eller ved å forebygge deres dannelse, eller ved katalytisk omdanning av det fri-radikal eller andre reaktive oksygenforbindelser til en mindre reaktiv forbindelse. Et antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleks som anvendes i oppfinnelsen vil generelt ha påvisbar SOD-aktivitet. Et salen-overgangsmetall-kompleks som anvendes i oppfinnelsen har antioksydant aktivitet dersom komplekset, når det settes til en cellekultur eller analysereaksjon, frembringer en påvisbar nedsettelse i mengden av et fritt radikal, slik som superoksyd, eller en ikke-radikal reaktiv oksygenforbindelse, slik som hydrogenperoksyd, sammenlignet med en parallell cellekultur eller analysereaksjon som ikke behandles med komplekset. Egnede konsentrasjoner (d.v.s. virksom dose) kan bestemmes ved forskjellige fremgangsmåter, innbefattet generering av en empirisk dose-responskurve, forutsigelse av potens og virkning av en kongener ved anvendelse av QSAR-metoder eller molekylær modellering, og andre fremgangsmåter som anvendes i de farmasøytiske vitenskaper. Siden oksydativ skade vanligvis er kumulativ, vil det ikke være noe minimum grensenivå (eller dose) med hensyn til virkning, selv om minimumsdoser for å frembringe en påvisbar terapeutisk eller profylaktisk effekt for spesielle sykdomstilstander kan etableres. Antioksydant-salen-metall-komplekser som anvendes i oppfinnelsen kan ha glutation-peroksydase-aktivitet.

Som anvendt her skal et "salen-overgangsmetall-kompleks" referere til en forbindelse som har en struktur ifølge struktur I, struktur II, struktur III eller struktur IV, struktur V, struktur VI, struktur VII, (se nedenfor) eller hvilken som helst av strukturene Cl, C4, C6, C7, C9, CIO, Cl 1, Cl2, Cl5, Cl7, C20, C22, C23, C25, C27, C28, C29 og C30 som vist i fig. 3 og nedenfor, som fortrinnsvis har en struktur tilsvarende én av strukturene vist i fig. 3 valgt fra gruppen bestående av: C6, C7 og Cl2; mer foretrukket en som har en struktur tilsvarende C7 eller Cl2-strukturen for katalytisk fjerning av superoksyd. Overgangsmetallet velges typisk fra gruppen bestående av: Mn, Mg, Co, Fe, V, Cr og Ni; og vil mest hensiktsmessig være Mn eller Mg.

Som anvendt her skal "fri-radikal-assosiert sykdom" referere til en patologisk tilstand hos et individ som i alle fall delvis skriver seg fra fremstilling av eller eksponering for frie radikaler, særlig oksyradikaler, og andre rekative oksygenforbindelser in vivo. Det er åpenbart for fagfolk på dette område at de fleste patologiske tilstander har flere årsaker, ved at flere faktorer som bidrar til sykdomstilstanden er til stede, og at tilordning eller identifisering av de overveiende årsaksfaktorer for en hvilken som helst individuell patologisk tilstand ofte er ekstremt vanskelig. Av disse grunner skal betegnelsen "fri-radikal-assosiert sykdom" omfatte patologiske tilstander som anerkjennes på dette område som tilstander hvor skade fra fri-radikaler eller reaktive oksygenforbindelser blir antatt å bidra til sykdomstilstandens patologi, eller hvor administering av en fri-radikal inhibitor (f.eks. desferrioksamin), oppfanger (f.eks. tokoferol, glutation), eller katalysator (f.eks. SOD, katalase) blir vist å frembringe en påvisbar fordel ved reduksjon av symptomer, økende overlevelse, eller ved å gi andre påvisbare kliniske fordeler ved behandling eller forebyggelse av den patologiske tilstand. Som eksempel, men ikke som begrensning, skal de sykdomstilstander som diskuteres her betraktes som fri-radikal-assosierte sykdommer (f.eks. ischemisk reperfusjonsskade, inflammatoriske sykdommer, systemisk lupus erythematose, myokardialt infarkt, slag, traumatisk blødning, ryggmargstrauma, Chron's sykdom, autoimmune sykdommer (f.eks. reumatoid artitt, diabetes), katarakt-dannelse, uveitis, emfysem, mavesår, oksygentoksisitet, neoplasi, uønsket celle-apoptose, strålngssykdom, og andre patologiske tilstander diskutert i bakgrunnsavsnittet og nedenfor).

Som anvendt her skal betegnelsene "SOD-mimetikum, "SOD-imitator", "superoksyd-dismutasemimetikum", og "superoksyd-katalysator" referere til forbindelser som har påvisbar katalytisk aktivitet for dismutering av superoksyd som bestemt ved analyse. Generelt vil et SOD-mimetikum ha minst ca. 0,001% av SOD-aktiviteten av human Mn-SOD eller Zn, Cu-SOD, på molbasis, som bestemt ved standard analysemetoder og/eller ha minst 0,01 enhet av SOD-aktivitet pr. mM ifølge den SOD-analyse som anvendes her nedenfor, fortrinnsvis minst 1 enhet av SOD-aktivitet pr. mM.

Betegnelsen "alkyl" refererer til en forgrenet eller rettkjedet alkylgruppe inneholdende bare karbon og hydrogen, og dersom intet annet er nevnt, inneholde 1 til 12 karbonatomer. Denne betegnelse eksemplifieres ytterligere ved grupper som metyl, etyl, n-propyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, pivalyl og heptyl.

Betegnelsen "lavere alkyl" refererer til et forgrenet eller rettkjedet enverdig alkylradikal med 1 til 6 karbonatomer. Ytterligere eksempler på denne betegnelse er slike radikaler som metyl, etyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, t-butyl, i-butyl, (eller 2-metylpropyl), i-amyl, n-amyl og heksyl.

Som anvendt her skal betegnelsen "halogen" eller "halogenid" referere til fluor, brom, klor og jod-substituenter.

Som anvendt i strukturene som følger skal betegnelsen "OBn" bety benzyloksy.

Betegnelsen "farmasøytisk middel eller medikament" som anvendt her skal referere til en kjemisk forbindelse eller blanding som er i stand til å indusere en ønsket terapeutisk effekt når den administreres korrekt til en pasient.

Andre kjemibetegnelser her blir anvendt ifølge konvensjonell anvendelse på dette område, som vist i eksemplene i The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (red. S. Parker, 1985), McGraw-Hill, San Francisco, inkorporert heri ved referanse).

Detaljert beskrivelse

Generelt skal den nomenklatur som anvendes i det følgende og laboratoriefremgangsmåtene i cellekultur, analytisk kjemi, organisk syntetisk kjemi, og farmasøytisk formulering beskrevet nedenfor være dem som er velkjent og vanlig anvendt i teknologien. Standard-teknikker anvendes for kjemisk syntese, kjemisk analyse, farmasøytisk formulering og avgivelse, og behandling av pasienter.

En basis for den foreliggende oppfinnelse er det uventede funn at medlemmer av en gruppe av forbindelser opprinnelig beskrevet som epoksydasjonskatalysatorer, de såkalte salen-overgangsmetall-komplekser, også har potent superoksyd-dismutaseaktivitet og/eller katalase-aktivitet og fungerer som katalysatorer for fri-radikal fjerning både in vitro og in vivo. Salen-overgangsmetall-kompleksene er beskrevet som chirale epoksydasjonskatalysatorer for forskjellige anvendelser i syntetisk kjemi (Fu et al., (1991) J. Org. Chem. 56: 6497; W. Zhang og E.N. Jacobsen (1991) J. Org. Chem. 56: 2296; Jacobsen et al., (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 6703; Zhang et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112: 2801; N.H. Lee og E.N. Jacobsen (1991) Tetrahedron Lett. 32: 6533; Jacobsen et al., (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 7063; Lee et al., (1991) Tetrahedron Lett. 32: 5055). Salen-overgangsmetall-komplekser er imidlertid også anvendelige som potente antioksydanter for forskjellige biologiske anvendelser, innbefattet deres anvendelse som farmasøytika for forebyggelse eller behandling av fri-radikal-assosierte sykdommer. Farmasøytiske formuleringer, diett-supplementer, forbedrede celle- og organkultur-medier, forbedrede kryokonserveringsmedier, lokal-salver, og kjemo-beskyttende og radio-beskyttende blandinger kan fremstilles med en effektiv mengde eller konsentrasjon av minst én antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleksforbindelse.

Den katalytiske aktivitet av salen-metall-komplekser til å interkonvertere epoksyder kan også fordelaktig anvendes til å oppfange eller forebygge dannelse in vivo av cytotoksiske og/eller karsinogene epoksydforbindelser, slike som kan dannes av cytokrom P-450-monooksygeneringssystemet (f.eks. benzo-[a]-pyrendiolepoksyd). Katalytiske salen-metall-komplekser kan fordelaktig inkluderes i matvarer eller diettsupplementer (eller administreres i andre former) til individer som har risiko for eksponering for polycykliske hydrokarbon-kjemiske karsinogener, slik som arbeidere i den petrokjemiske industri og ved farvestoff-fremstilling. Katalytisk aktive salen-metall-komplekser kan dessuten formuleres for administrering til røykere (innbefattet passive røykere) for å øke detoksifisering av reaktive epoksyder dannet fra sigarettrøyk.

Antioksydant-salen-metall-kompleksene som benyttes i foreliggende oppfinnelse kan finne anvendelse til delvis eller fullstendig å stanse progresjonen av neurodegenerative sykdommer. F.eks. er det blitt rapportert at mutasjoner i Cu/Zn-superoksyd-dismutase kan være sterkt assosiert med amyotrof lateral sklerose (ALS)

(Rosen et al., (1993) Nature 362: 59; Deng et al., (1993) Science 261: 1047). Lignende defekter i endogen antioksydant-beskyttelse kan være ansvarlig for multippel sklerose, perifere neuropatier og lignende. De antioksydative salen-metall-komplekser kan anvendes for behandling og profylakse av slike neurodegenerative sykdommer (f.eks.

ALS, MS).

Foretrukne antioksydant- salen- metall- forbindelser

De følgende genera av antioksydant-salen-metall-komplekser er foretrukket for anvendelse i blandingene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse. Når substituentene ikke er vist, skal de være hydrogen:

hvor Y| og Y4 uavhengig er valgt fra gruppen bestående av metoksy, etoksy, metyl, etyl, t-butyl, klor, brom, jod og hydrogen; R og R3 er som forut definert. Fortrinnsvis vil Y

og Y^ være identiske.

hvor R j og R3 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av: fenyl, benzyloksy, hydrogen.

Fortrinnsvis vil Rj og R^ være identiske.

hvor Y og Y4 er metoksy, etoksy, metyl, etyl, t-butyl, klor, brom, jod og hydrogen; Rj og R^ er uavhengig valgt fra gruppen bestående av: fenyl, benzyloksy, hydrogen.

Fortrinnsvis skal Y^ og Y2 være identiske, og R^ og R^ være identiske.

hvor Yi = Y4 og er valgt fra gruppen bestående av metoksy, etoksy, metyl, etyl, t-butyl, klor, brom, jod og hydrogen; Y er valgt fra gruppen bestående av t-butyl, og hydrogen.

Følgende forbindelser er foretrukne salen-overgangsmetall-komplekser antioksydative for formulering i farmasøytiske preparater, diettsupplementer, matvarekonserver, kosmetika, solforbrennings-beskyttelsesmidler og andre blandinger ifølge denne oppfinnelse og blir referert til ved struktur-nummer (f.eks. Cl til og med C28) for klarhet hele veien.

Farmasøytiske preparater

De foretrukne farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en terapeutisk eller profylaktisk effektiv dose av minst ett salen-derivat-basert kompleks av et overgangsmetall-ion. Betegnelsen "salen" anvendes her til å referere til de ligander som typisk dannes gjennom en kondensasjonsreaksjon av to molekyler av et salicylaldehyd-derivat med ett molekyl av et diaminderivat. Mens salen-ligander blir dannet fra etylendiaminderivater, kan propyl og butyldiaminer også anvendes til å gi analoge salenforbindelser og salen-derivater. Salen-derivater blir foretrukket, og deres generelle struktur er vist i fig. 1. Et salen-derivat hvor n er 0 er vist i fig. 2.

Som det kan sees i fig. 1 er de to nitrogenatomer og de to oksygenatomer orientert mot senteret av salen-liganden, og tilveiebringer således et komplekseringssete for overgangsmetall-ionet M. Fortrinnsvis vil dette metall-ion være valgt fra gruppen bestående av Mn, Cr, Fe, Ni, Co, Ti, V, Ru og Os. Mer foretrukket vil overgangsmetall-ionet være valgt fra gruppen bestående av Mn, Mg, Cr, Fe, Ni og Co. Mest foretrukket vil metall-ionet være Mn.

Fortrinnsvis er metall-ionet valgt fra gruppen bestående av PFg, (aryl)^, BF^,

B(aryl)4, halogenid, acetat, triflat, tosylat, hvor halogenidet eller PFg er mer foretrukket,

og klorid er mest foretrukket.

Fig. 1 viser også de mange seter tilgjengelige for substitusjon på salen-liganden. Av disse seter blir det antatt at R j, R2, R3,<R>4 og <X>j, X2, X^, X^, Yg og Yg er de mest viktige i dette første salen-overgangsmetall-kompleks.

Strukturene I, HI, IV, VI, VII og VHI kan ha uavhengig valgte fettsyreester-substituenter i Rj, R2, R3 og R^-posisjonene. Når de er til stede vil fettesyreesterne typisk okkupere ikke mer enn to substituentposisjoner og vanligvis være identiske.

Eksempler på fettsyrer egnet til fremstilling av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er gitt i tabellene I, II og HI nedenfor:

Det vil være klart at de umettede syrer forekommer i isomere former på grunn av tilstedeværelsen av den ene eller flere umettede posisjoner. Forbindelsene i følge foreliggende oppfinnelse er ment å inkludere de enkelte dobbeltbindings-isomerer, såvel som blandinger derav. Fettsyreesterne ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved kjente acyleringsteknikker. Se f.eks. March, Advanced Organic Chemistry, 3. utg., John Wiley & Sons, New York (1985), s. 299, 348-351 og 353-354., inkorporert heri ved referanse.

Foretrukne antioksydant- salen- overgangsmetall- komplekser

Fig. 3 viser strukturer av foretrukne antioksydant-salen-overgangsmetall-komplekser ifølge oppfinnelsen. Eksempler på antioksydant-salen-overgangsmetall-komplekser er vist i fig. 3. Forbindelsene Cl, C4, C6, C7, C9, CIO, Cl 1 og C12 er særlig foretrukket for formulering i farmasøytika og andre antioksydant-preparater ifølge oppfinnelsen. Det blir antatt at C7 er særlig foretrukket på grunn av dens greie fremstilling og relativt hydrofile karakter som er vel egnet til farmasøytisk anvendelse.

Et foretrukket salen-overgangsmetall-kompleks som har høy superoksyd-dismutaseaktivitet er C12-forbindelsen med strukturen:

Et særlig foretrukket antioksydant-salen-metall-kompleks ifølge oppfinnelsen er C7:

Antioksydant-salen-overgangsmetall-komplekser har generelt

påvisbar superoksyd-dismutaseaktivitet og har fortrinnsvis også katalaseaktivitet.

Fordelaktig er C7 både enkel å fremstille og er relativt hydrofil, egenskaper som gjør den særlig velegnet for farmasøytisk anvendelse og formulering i vandig løsning. Den relativt hydrofile karakter av C7 kan med fordel anvendes for å tilveiebringe antioksydant-salen-metall-komplekser som lett blir absorbert og transportert i det menneskelige legeme. Én fordelaktig farmakokinetisk egenskap av C7 blir antatt å være evnen til effektivt å krysse blod/hjerne-barrieren.

Fremstilling av antioksvdant- salen- overgangsmetall- komplekser

Fremstilling av salen-overgangsmetall-komplekser gjennomføres i alt vesentlig som beskrevet i US91/01915 registrert 21. mars 1991, Fu et al., (1991) J. Org. Chem. 56: 6497; W. Zhang og E.N. Jacobsen (1991) J. Org. Chem. 56: 2296; Jacobsen et al., (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 6703; Zhang et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112: 2801; N.H. Lee og E.N. Jacobsen (1991) Tetrahedron Lett. 32: 6553; Jacobsen et al., (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 7063; Lee et al., (1991) Tetrahedron Lett. 32: 5055, som alle er inkorporert heri som referanse.

Generelt vil den foretrukne vei for fremstilling av antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleksene være en kondensasjonsreaksjon med det substituerte salicylaldehyd og det substituerte diamin. Vanligvis blir mengder av disse forbindelser omsatt i et 2 til 1 molart forhold i absolutt etanol. Løsningene blir oppvarmet med tilbakeløp typisk i 1 time, og salen-liganden blir enten utfelt i analytisk ren form ved tilsetning av vann, eller metallkomplekset blir dannet direkte ved tilsetning av metallet som dets acetat, halogenid eller triflatsalt.

Følende fremgangsmåte er generell for fremstillingen av antioksydant-salen-Mn-komplekser med formelen:

Salen-liganden blir løst igjen i varm absolutt etanol under dannelse av en 0,1M løsning. Fast Mn(OAC)2#4H20 (2,0 ekv.) blir tilsatt i én porsjon og løsningen oppvarmet med tilbakeløp i 1 time. Ca. 3 ekv. av fast LiCI blir deretter tilsatt, og blandingen oppvarmet til tilbakeløp i ytterligere 0,5 time. Avkjøling av blandingen til 0°C gir Mn(IH)-komplekset som mørkebrune krystaller som blir vasket inngående med H2O og isolert ved filtrering i ca. 75% utbytte. En ytterligere avling av materiale kan oppnås ved dråpevis tilsetning av H2O til morvæsken. Kombinerte utbytter av katalysator er typisk ca. 80-95% for dette trinn, og ca. minst ca. 80-90% totalt fra det optisk rene 1,2-difenyletylendiamin.

Et annet eksempel på fremgangsmåten for fremstilling av antioksydant-salen-Mn-kompleksene er beskrevet som følger: Mest foretrukket vil utgangs-diaminet være R,R- eller S,S-I,2-diamino-l,2-difenyletan og utgangs-salicylaldehydet være 3-tert-butylsalicylaldehyd. En løsning av 2,0 mmol av 3-tert-butylsalicylaldehyd i 3 ml absolutt etanol blir satt dråpevis til en løsning av 1,0 mmol av (R,R)-l,2-diamino-l,2-difenyletan i 5 ml etanol. Reaksjonsblandingen oppvarmes til tilbakeløp i 1 time, og deretter settes 0,1 mmol av Mn(Oac)24H20 i én porsjon til den varme (60°C) løsning. Løsningens farve slår om umiddelbart fra gul til brun etter tilsetningen. Den oppvarmes med tilbakeløp i ytterligere 30 min. og avkjøles deretter til romtemperatur. En løsning av 10% NaCl (5 ml) blir deretter tilsatt dråpevis og blandingen omrørt i 0,5 time. Løsningsmidlene blir deretter fjernet i vakuum, og resten gnidd ut med 50 ml CH2-CI2 og 50 ml H2O. Det organiske sjikt fraskilles og den brune løsning vaskes med mettet NaCl. Separering av den organiske fase og fjerning av løsningsmiddel resulterte i et rått materiale som kan omkrystalliseres fra Cgjj 6/C^Hj^ under dannelse av et (R,R)-salen-Mn-kompleks.

Syntesen av antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleksene kan gjennomføres rutinemessig av vanlige fagfolk på dette område ifølge de siterte publikasjoner.

SOD-aktiviteten av de fremstilte salen-Mn-komplekser blir bestemt ifølge standard analysemetoder for SOD-aktivitet kjent på dette område og vist i eksemplene nedenfor. Salen-metall-komplekser som har minst 0,01 enhet av SOD-aktivitet pr. mmol/liter i vandig løsning er antioksydant-salen-metall-komplekser; fortrinnsvis vil antioksydant-salen-metall-komplekser ha minst ca. 1 enhet av SOD-aktivitet pr. mmol/liter; og mer foretrukket ha minst ca. 100 enheter av SOD-aktivitet pr. mmol/liter; og hyppig ha mer enn 500-1000 enheter av SOD-aktivitet pr. mM eller mer. For noen medisinske anvendelser hvor katalaseaktiviteten fortrinnsvis blir supplementert, er det fordelaktig at SOD-mimetikum salen-metall-komplekset også har påvisbar katalaseaktivitet (f.eks. C4, C7, C9, CIO, Cll, C12); typisk minst 10 enheter av katalaseaktivitet pr. mM, og hyppig minst 100 enheter av katalaseaktivitet pr. mM.

Farmasøytiske formulerin<g>er

Farmasøytiske preparater omfattende et antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleks ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendelige for lokal og parenteral administrering, d.v.s. subkutant, intramuskulært eller intravenøst. Det resultat at salen-metall-komplekser har SOD-aktivitet in vitro såvel som funksjon in vivo angir at antioksydant-salen-metall-kompleksene er egnede SOD-mimetika for farmasøytisk anvendelse. Antioksydant-salen-metall-kompleksene er egnet for adimistrering til pattdyr, innbefattet humane pasienter og veterinær-pasienter.

Preparatene for parenteral administrering vil vanligvis omfatte en løsning av et antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleks eller en blanding derav løst i en akseptabel bærer, fortrinnsvis en vandig bærer. Siden mange av salen-Mn-kompleksene er lipofile, er det fordelaktig å innta i bæreren en hydrofob base (f.eks. polyetylenglykol, Tween 20). Flere forskjellige vandige bærere kan anvendes, f.eks. vann, bufret vann, 0,4% saltløsning, 0,3% glycin og lignende. Disse løsninger er sterile og generelt fri for partikkelformig materiale. Disse preparater kan steriliseres ved konvensjonelle velkjente steriliseringsteknikker. Preparatene kan inneholde farmasøytisk akseptable hjelpesubstanser etter behov for å tilnærme fysiologiske betingelser, som pH-justerings-og bufrings-midler, toksisitetsjusteringsmidler og lignende, f.eks. natriumacetat, natriumklorid, kaliumklorid, kalsiumklorid, natriumlaktat o.s.v. Konsentrasjonen av antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleksene med virkning i disse formuleringer kan variere betydelig, d.v.s. fra mindre enn ca. 1 nM, vanligvis minst ca. 0,1 mM til så mye som 100 mM og vil bli valgt først og fremst basert på fluidvolumer, viskositeter o.s.v., ifølge den spesielle administrasjonsmåle som velges. Mest vanlig vil antioksydant-salen-metall-komplekset foreligge i en konsentrasjon på 0,1 mM til 10 mM. F.eks. vil en typisk formulering for intravenøs injeksjon omfatte en steril løsning av et antioksydant-salen-metall-kompleks (f.eks. C7) ved en konsentrasjon på 5 mM i Ringer's løsning. Den generelt hydofobe karakter av noen av de foretrukne antioksydant-salen-metall-komplekser vil angi at det kan anvendes en hydrofob bærer, eller en vandig bærer omfattende et tensid eller et annet lipofilt middel (f.eks. Tween, NP-40, PEG); alternativt kan antioksydant-salen-kompleksene administreres som en suspensjon i en vandig bærer,

eller som en emulsjon.

Således kan det lages opp en typisk farmasøytisk blanding for intramuskulær injeksjon som inneholder 1 ml sterilt bufret vann, og ca. 1-100 mg av antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleks(er). En typisk blanding for intravenøs infusjon kan lages opp til å inneholde 250 ml steril Ringer's løsning, og ca. 100-1000 mg av antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleks(er). Lipofile midler kan inkluderes i formuleringer av lipofile salen-metall-komplekser. Aktuelle fremgangsmåter for fremstilling av parenteralt administrerbare blandinger vil være kjent eller åpenbare for fagfolk på dette område, og er beskrevet mer i detalj i f.eks. Remington's Pharmaceutical Science, 15. utg. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), som inkorporeres heri ved referanse. Et typisk farmasøytisk preparat for lokal anvendelse kan lages med egnede hudsalver, kremer, lotioner, øyesalver og løsninger, resperatoriske aerosoler og andre eksipienter. Eksipienter bør være kjemisk forlikelige med antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleks(ene) som er de aktive bestanddeler av preparatet, og bør vanligvis ikke øke dekomponering, denaturering eller aggregering av aktive bestanddeler. Ofte vil eksipient-ene ha lipofile komponenter som oljer og lipid-emulsjoner.

Antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleksene kan lyofiliseres for lagring og rekonstitueres i en egnet bærer før anvendelse. Det vil bli forstått av fagfolk på dette område at lyofilisering og rekonstituering kan føre til varierende grader av tap av antioksydant aktivitet, og at anvendelsesnivået kan behøve justering for å kompensere.

Preparatene som inneholder de foreliggende antioksydant-salen-overgangsmetall-komplekser eller blandinger derav kan administreres for profylaktisk og/eller terapeutisk behandling. Ved terapeutisk anvendelse administreres preparatene til en pasient som allerede er påvirket av den særlige fri-radikal-assosierte sykdom, i en mengde som er tilstrekkelig til å helbrede eller i det minste delvis arrestere tilstanden og dens komplikasjoner. En mengde som er tilstrekkelig til å gjennomføre dette defineres som en "terapeutisk effektiv dose" eller "virksom dose". Mengder som er effektive for denne anvendelse vil avhenge av tilstandens alvorlighetsgrad, pasientens generelle tilstand og administrasjonsmåten, men vil vanligvis ligge i området fra ca. 1 mg til ca. 10 g av antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleks(er) pr. dose, med doseringer på fra 10 mg til 2000 mg pr. pasient som mer vanlig anvendt. F.eks. kan det for behandling av akutte myokardiale ischemi/reoksygenerings-episoder administreres systemisk ca. 100 til 1000 mg av et antioksydant-salen-metall-kompleks (f.eks. C7) ved intravenøs infusjon; minst ca. 10 mg til 500 mg av antioksydant-salen-metall-kompleks(er) kan administreres ved intraperikardial-injeksjon for å gi forhøyede lokale konsentrasjoner av SOD-aktivitet i myokardium.

I profylaktiske anvendelser administreres blandinger inneholdende antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleks(ene) eller blandinger derav til en pasient ikke allerede i en sykdomstilstand for å øke pasientens motstand eller for å sinke sykdommens progresjon. En slik mengde defineres til å være en "profylaktisk effektiv dose". Ved denne anvendelse vil de nøyaktige mengder igjen avhenge av pasientens helsetilstand og generelle immunitetsnivå, men vil vanligvis ligge i området fra 1 mg til 10 g pr. dose, spesielt 10 til 1000 mg pr. pasient. En typisk formulering av et antioksydant-salen-metall-kompleks slik som C7 vil inneholde mellom ca. 25 og

250 mg av salen-metall-komplekset i en enhetsdoseringsform.

Enkelte eller flere administrasjoner av blandingene kan utføres med dosenivå og doseringsmønster valgt av den behandlende lege. I ethvert tilfelle bør de farmasøytiske formuleringer tilveiebringe en mengde av antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleksene tilstrekkelig til effektivt å behandle pasienten.

Det kan også leveres kits for anvendelse med de aktuelle antioksydant-salen-overgangsmetall-komplekser for anvendelse ved beskyttelse mot eller terapi for en fri-radikal-assosiert sykdom. Den aktuelle blanding ifølge foreliggende oppfinnelse kan således tilveiebringes, vanligvis i lyofilisert form eller vandig løsning i en beholder, enten alene eller i forbindelse med ytterligere antioksydant-salen-overgangsmetall-komplekser av den ønskede type. Antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleksene er inkludert i disse kits med buffere, f.eks. Tris, fosfat, karbonat etc, stabilisatorer, biocider, inerte proteiner, f.eks. serum albumin, eller lignende, og et sett instruksjoner for anvendelse. Generelt vil disse materialer være til stede i mindre enn ca. 5 vekt% basert på mengden av antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleks(er), og foreligger vanligvis i en total mengde på minst ca. 0,001% igjen basert på konsentrasjonen. Ofte vil det være ønskelig å inkludere en inert ekstender eller eksipient for å fortynne de aktive bestanddeler, hvor eksipienten kan være til stede i fra ca. 1 til 99,999 vekt% av det totale preparat.

Salen-Mn-komplekser, fortrinnsvis forbindelse C12 eller C7, kan inkorporeres i en hypotermisk kardioplegia-løsning ved en konsentrasjon på minst ca. 1 mM i en løsningsformulering ifølge Amano et al., (1982) Jpn. J. Surg. 12: 87, inkorporert heri ved referanse. Mest foretrukket vil C7 være inkludert i kardioplegia-løsningen.

Doseringen av SOD-mimetikum salen-metall-kompleks(er) vil variere med hver spesielle anvendelse. Typisk administreres preparatet enten systemisk eller lokalt. Systemisk administrering inkluderer per os og parenteral vei; lokal administrering inkluderer in situ-anvendelser. In situ-metoder inluderer f.eks. administrering av et SOD-mimetikum salen-metall-kompleks ved endoskopisk bolusvask og/eller paravenøs injeksjon, eller i tilfellet behandling av lavere mave/tarm-kanal ved klystér. Parenterale veier kan inkludere f.eks. subkutan, intradermal, intramuskulær og intravenøs vei. Mengden av SOD-mimetikum salen-metall-kompleks(er) vil være i området fra ca. 2 til 5.000 mg eller mer, typisk 10 til 1000 mg, avhengig av administrasjonsintervallet og veien, som kan ligge i området fra en enkelt oral dose, parenteral dose og/eller lokal dose til flere orale doser, parenterale doser og/eller lokale doser i løpet av et par dager eller mer enn 5 uker. Doseringen kan også variere med sykdommens alvorlighetsgrad.

In vitro og forskningsadministrering

I et annet trekk ifølge denne oppfinnelse anvendes antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleksene til å modulere ekspresjonen av naturlig forekommende gener eller andre polynukleotidsekvenser under transkripsjonskontroll av et oksydativt stress-respons-element (f.eks, et antoksydant responsivt element, ARE), slik som et antioksydant responselement av et glutation S-transferase-gen eller et NAD(P)H:kinonreduktase-gen (Rosen et al., (1992) Arch. Biochem. Biophys. 292: 589; Favreau og Pickett (1991) J. Biol. Chem. 266: 4556; Rushmore og Pickett (1991) Methods Enzymol. 206: 409; Rushmore og Pickett (1990) J. Biol. Chem. 265: 14648; Keyse et al., (1992) Nature 359: 644, inkorporert heri som referanse). Transgene, homologe rekombinasjonskonstruksjoner, og episomale ekspresjonssystemer (f.eks. virus-baserte ekspresjonsvektorer) omfattende en polynukleotidsekvens under transkripsjonskontroll av ett eller flere ARE bundet til en promoter vil bli fremstilt av fagfolk på dette område ifølge fremgangsmåtene og retningslinjer tilgjengelig på dette område, og likeså vil transformerte celler og andre transgene dyr enn mennesker som har slike polynukleotidkonstruksjoner. Antioksydant-salen-metall-kompleksene kan anvendes til å modulere transkripsjonen av ARE-regulerte polynukleotidsekvenser i cellekulturer (f.eks. ES-celler) og i intakte dyr, særlig i transgene dyr hvori et transgen omfatter ett eller flere ARE som transkripsjons-regulerende sekvenser. For transformerte eller transgene cellekulturer genereres en dose-responskurve ved titrering av transkripsjonshastighet av den ARE-kontrollerte polynukleotidsekvens mot økende konsentrasjoner av antioksydant-salen-metall-kompleks(er, hvilket vil redusere tran-skripsjonshastigheten indusert av oksydantmidler (f.eks. benzoylperoksyd, glutation-utarmende middel) eller oksydativt stress. Motsatt kan høyt nivå av SOD-mimetikum salen-metall-komplekser frembringe oksydativt stress og fri-radikal-dannelse. Lignende dose-responstitrering kan gjennomføres i transgene dyr, slik som transgene mus, som har en ARE-kontrollert transgen sekvens.

In vivo- administrering

En terapeutisk eller farmasøytisk effektiv mengde av et antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleks administreres til en pasient for å behandle eller forebygge en fri-radikal-assosiert sykdom. Den nødvendige dosering vil avhenge av karakteren av den fri-radikal-assosierte sykdom, sykdommens alvorlighetsgrad og forløp, tidligere terapi, pasientens helsestatus og respons på antioksydant-salen-overgangsmetall-komplekset, og den behandlende leges bedømmelse. Typisk administreres minst én forbindelse av antioksydant-salen-Mn-kompleks som den eneste aktive bestanddel, eller i kombinasjon med én eller flere andre aktive bestanddeler, typisk valgt fra gruppen bestående av: N-2-merkaptopropionylglycin, N-acetylcystein, glutation, dimetyltiourea, desferrioksamin, mannitol, a-tokoferol, askorbat, allopurinol, 21-aminosteroider, calpain-inhibitorer, glutamat-reseptor-antagonister, vevs-plasminogen-aktivator, streptokinase, urokinase, ikke-steroid antiinflammatorisk middel, kortison og karotenoider. Antioksydant-salen-Mn-komplekser kan også administreres i forbindelse med polypeptider som har SOD og/eller katalaseaktivitet, særlig i betraktning av evnen til salen-Mn-kompleksene, i motsetning til SOD-polypeptidene, til å krysse blod/hjerne-barrieren og derved komplementere systemisk SOD-administrering.

De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen kan anvendes for behandling av pasienter, f.eks. mennesker, som har en fri-radikal-assosiert sykdom med en profylaktisk effektiv eller terapeutisk effektiv mengde av et antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleks, typisk et salen-Mn-kompleks, fortrinnsvis C7. Denne fremgangsmåte kan anvendes til behandling av pasienter på forskjellige trinn av deres sykdom, eller til å forebygge utvikling av fri-radikal-assosierte sykdommer hos pasienter. I tillegg kan preparatene administreres for å forebygge eller redusere, som et profylaktikum, den alders-justerte sannsynlighet for utvikling av en neoplasme og/eller den alders-justerte mortalitetsrate og/eller hastigheten av aldringsprosessen.

Antioksydant-salen-metall-kompleksene kan også administreres til pasienter som er infisert med et humant immunsvikt-virus (f.eks. HIV-1) eller som har risiko for å bli infisert med et humant immunsvikt-virus. Antioksydant-salen-metall-kompleksene,

eksempelvis C7, kan forebygge eller inhibere induksjon av HIV-1-replikasjon i CD4<+->

lymfocytter ved tumor-nekrosefaktor (TNF) og/eller forebygge skade på eller død av CD4

<+->celler som følge av HIV-1-infeksjon. Uten ønsket om å være bundet av noen som helst spesiell teori for HIV-1-replikasjon eller HIV-1-patogenese, blir det antatt at administrering av et antioksydant-salen-metall-kompleks, slik som C7, kan inhibere og/eller sinke utviklingen av HIV-1-relatert patologi og/eller kan redusere synkeraten for CD4<+->lymfocytt-populasjonen hos HIV-infiserte individer. Antioksydant-salen-metall-kompleksene, slik som Cl, kan også inhibere patologi som skriver seg fra et altfor høyt eller uhensiktsmessig nivå av TNF, både ved AIDS og andre tilstander (f.eks. septisk sjokk). Ofte vil en dosering på ca. 50 til 5.000 mg bli administrert til en pasient med HIV og/eller med altfor høyt eller uhensiktsmessig nivå av TNF, enten i enkelte eller flere doser, for å redusere eller sinke utviklingen av patologi og kliniske symptomer. Antioksydant-salen-metall-komplekser kan administeres terapeutisk for behandling av virus-sykdommer forskjellige fra HIV.

Siden oksydativ skade forekommer proporsjonalt med overfloden av frie radikaler og reaktive oksygenforbindelser, er det ventet at administrering av antioksydant-salen-overgangs-metall-komplekser selv på lavt nivå vil gi en beskyttende effekt mot oksydativ skade; det er således ventet at det ikke er noe grensenivå hvorunder antioksydant-salen-Mn-komplekser er ineffektive.

Generelt for behandling av fri-radikal-assosierte sykdommer vil en passende effektiv dose av antioksydant-salen-Mn-komplekset ligge i området fra 0,01 til 1000

milligram (mg) pr. kilogram (kg) legemsvekt av mottageren pr. dag, fortrinnsvis i området fra 1 til 100 mg pr. kg legemsvekt pr. dag. Den ønskede dosering presenteres fortrinnsvis i én, to, tre, fire eller flere underdoser administrert med hensiktsmessige intervaller i løpet av dagen. Disse underdoser kan administreres som enhets-doseringsformer, f.eks. inneholdende 5 til

10.000 mg, fortrinnsvis 10 til 1000 mg aktiv bestanddel pr. enhets-doseringsform.

Preparatet som anvendes i disse terapier kan være i flere forskjellige former.

Disse omfatter f.eks. faste, halv-faste og flytende doseringsformer, slik som tabletter, piller, pulvere, flytende løsninger eller suspensjoner, liposom-preparater, injiserbare og infusible løsninger. Den foretrukne form avhenger av den tilsiktede administrasjonsmåle og terapeutiske anvendelse. Typisk vil en steril løsning av et salen-metall-kompleks i et vandig løsningsmiddel (f.eks. saltløsning) bli administrert intravenøst. Preparatene inkluderer også fortrinnsvis konvensjonelle farmasøytisk akseptable bærere og adjuvanser som er kjent for fagfolk på dette område. Se f.eks. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.; Easton, PA, 17. utg. (1985). Generelt vil administreringen være ved oral eller parenteral (omfattende subkutan, intramuskulær, intravenøs og intradermal) vei, eller ved lokal påføring eller infusjon i et av legemets hulrom, eller som en badeløsning for vev under kirurgi.

Det bør naturligvis forstås at de aktive forbindelser kan anvendes i kombinasjon med andre antioksydantmidler som har SOD-aktivitet, katalaseaktivitet, GSH-Px-aktivitet, eller er fri-radikal-oppfangere eller inhibitorer av fri-radikal-dannelse. Selv om det er mulig å administrere den aktive bestanddel alene, blir det antatt fordelaktig å presentere den som del av en farmasøytisk formulering. Formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter minst én aktiv forbindelse i en terapeutisk eller farmasøytisk effektiv dose sammen med én eller flere farmasøytisk eller terapeutisk akseptable bærere og eventuelt andre terapeutiske bestanddeler. Forskjellige betraktninger er beskrevet, f.eks. hos Gilman et al., (red.) (1990) Goodman og Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics 8. utg., Pergamon Press; og Remington's supra, som begge inntas heri som referanse. Fremgangsmåter for administrering diskuteres der, f.eks. for oral, intravenøs, intraperitoneal eller intramuskulær administrering, og andre. Farmasøytisk akseptable bærere vil omfatte vann, saltløsning, buffere og andre forbindelser beskrevet f.eks. i Merck Index, Merck & Co., Rahway, NJ, inkorporert heri ved referanse.

De farmasøytiske preparater vil administreres ved parenteral eller oral administrering for profylaktisk og/eller terapeutisk behandling. De farmasøytiske preparater kan administreres i flere forskjellige enhets-doseringsformer avhengig av administreringsfremgangsmåten. F.eks. vil enhets-doseringsformer egnet for oral administrering inkludere pulvere, tabletter, piller, kapsler og dragéer.

De farmasøytiske preparater vil ofte bli administrert intravenøst. Denne oppfinnelse tilveiebringer således preparater for intravenøs administrering som omfatter en løsning av forbindelsen, løst eller oppslemmet i en akseptabel bærer, fortrinnsvis en vandig bærer. Flere forskjellige vandige bærere kan anvendes, f.eks. vann, bufret vann, 0,4% saltløsning og lignende. Ofte kan antioksydant-salen-metall-kompleks(ene), f.eks. Cl eller Cl2, løses i et organisk løsningsmiddel (f.eks. dimetylsulfoksyd) og enten anvendes direkte eller fortynnet i et vandig løsningsmiddel. Typisk løses antioksydant-salen-metall-komplekser som er relativt lipofile (f.eks. C9, Cl2) i et organisk løsningsmiddel som f.eks. DMSO og, om ønsket, fortynnes deretter i et mer polart løsningsmiddel, f.eks. vann. Disse preparater vil ofte bli sterilisert ved konvensjonelle velkjente steriliseringsteknikker, eller kan fortrinnsvis steril-ifltreres. De resulterende vandige løsninger kan forpakkes for anvendelse som de er, eller lyofilisert, idet det lyofiliserte preparat blir kombinert med en steril vandig løsning før administrering. Blandingene kan inneholde farmasøytisk akseptable hjelpesubstanser etter behov for tilnærmelse til fysiologiske betingelser, f.eks. pH-justerings- og bufringsmidler, tonisitets-justerende midler, fuktemidler og lignende, f.eks. natriumacetat, natriumlaktat, natriumklorid, kaliumklorid, kalsiumklorid, sorbitan-monolaurat, trietanolaminoleat og lignende.

For faste blandinger kan det anvendes konvensjonelle ikke-toksiske faste bærere som inkluderer f.eks. farmasøytiske kvaliteter av mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, talkum, cellulose, glukose, sukrose, magnesiumkarbonat og lignende. For oral administerering dannes en farmasøytisk akseptabel ikke-toksisk blanding ved inkorporering av hvilken som helst av de normalt anvendte eksipienter, f.eks. slike bærere som tidligere er oppført, og generelt 0,001-95% av aktiv bestanddel, fortrinnsvis ca. 20%.

Blandingene som inneholder forbindelsene kan administreres for profylaktisk og/eller terapeutisk behandling. Ved terapeutiske anvendelser administreres blandingene til en pasient som allerede lider av en sykdom, som beskrevet ovenfor, i en mengde tilstrekkelig til å helbrede eller i det minste delvis stanse symptomene på sykdommen og dens komplikasjoner. En mengde adekvat til å gjennomføre dette defineres som "terapeutisk effektiv mengde eller dose". Mengder som er effektive for denne anvendelse vil avhenge av sykdommens alvorlighetsgrad og pasientens vekt og generelle tilstand.

Ved profylaktiske anvendelser administeres preparater ifølge denne oppfinnelse inneholdende de aktive forbindelser til en pasient som er mottagelig for eller på annen måte har risiko for en bestemt sykdom. En slik mengde defineres til å være en "profylaktisk effektiv mengde eller dose". Ved denne anvendelse vil de presise mengder igjen avhenge av pasientens helsetilstand og vekt.

For faste blandinger vil konvensjonelle ikke-toksiske faste eksipienter inkludere f.eks. farmasøytiske kvaliteter av mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, talkum, celluloser, glukose, sukrose, magnesiumkarbonat og lignende. Den aktive forbindelse som definert ovenfor kan formuleres som stikkpiller ved anvendelse av f.eks. triglycerider, f.eks. Witepsolene, som bærer. Flytende farmasøytisk administrerbare blandinger kan f.eks. fremstilles ved å løse, dispergere o.s.v. en aktiv forbindelse som definert ovenfor og eventuelle farmasøytiske adjuvanser i en eksipient, slik som f.eks. vann, saltløsning, vandig dekstrose, glycerol, etanol og lignende, for derved å danne en løsning eller suspensjon. Om ønsket, kan den farmasøytiske blanding som skal administreres, også inneholde mindre mengder av ikke-toksiske hjelpesubstanser som fukte- eller emulgeringsmidler, pH-bufringsmidler og lignende, f.eks. natriumacetat, sorbitanmonolaurat, trietanolamin, natriumacetat, trietanolaminoleat o.s.v. Aktuelle fremgangsmåter for fremstilling av slike doseringsformer er kjent, eller vil være åpenbare for fagfolk på dette område; se f.eks. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17. utg. 1985. Blandingen eller formu-leringen som skal administreres vil i alle tilfeller inneholde en effektiv mengde av de aktive forbindelser.

For oral administrering dannes en farmasøytisk akseptabel ikke-toksisk blanding ved inkorporering av hvilken som helst av de normalt anvendte eksipienter, slik som f.eks. farmasøytiske kvaliteter av mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, talkum, celluloser, glukose, sukrose, magnesiumkarbonat og lignende. Slike blandinger tar form av løsninger, suspensjoner, tabletter, kapsler, pulvere, formuleringer med forsinket avgivelse og lignende. Slike blandinger kan inneholde 0,01-95% aktiv bestanddel, fortrinnsvis 1-70%.

Parenteral administrering karakteriseres generelt ved injeksjon, enten subkutant, intramuskulært eller intravenøst. Injeksjoner kan fremstilles i konvensjonelle former, enten som flytende løsninger eller suspensjoner, faste former egnet for løsning eller suspensjon i væsken før injeksjon, eller som emulsjoner. Egnede eksipienter er f.eks. vann, saltløsning, dekstrose, glycerol, etanol eller lignende. I tillegg kan om ønsket de farmasøytiske preparater som skal administreres også inneholde mindre mengder av ikke-toksiske hjelpesubstanser som f.eks. fukte- eller emulgeringsmidler, pH-bufringsmidler og

lignende, f.eks. natriumacetat, sorbitanmonolaurat, trietanolaminoleat o.s.v.

En ganske nylig utformet fremgangsmåte for parenteral administrering anvender implantering av et system med langsom avgivelse eller forsinket avgivelse, slik at det opprettholdes et konstant doseringsnivå. Se f.eks. US-patent nr. 3.710.795, som er inntatt heri som referanse. Antioksydant-salen-metall-komplekser kan administreres som transdermalt plaster (f.eks. iontoforetisk overføring) for lokal eller systemisk påføring.

Når en påvisbar forbedring av pasientens tilstand har inntrådt, blir det om nødvendig administrert en vedlikeholdsdose. Deretter kan doseringen eller frekvensen av administreringen, eller begge, reduseres, som funksjon av symptomene, til et nivå hvor den forbedrede tilstand blir beholdt. Når symptomene er blitt lettet til det ønskede nivå kan behandlingen stanse. Pasientene kan imidlertid kreve intermittent behandling på langtidsbasis etter eventuelt tilbakefall av sykdomssymptomene, eller som et profylaktisk tiltak for å forebygge tilbakefall av sykdomssymptomene.

Antioksydant-salen-metall-kompleks(er) kan også settes til avtappet blod for transfusjon for å inhibere oksyradikal skade til blodcellene og -komponentene under lagring; på lignende måte kan antioksydant-salen-metall-komplekser også redusere oksyradikal skade på blodceller in vivo.

Antioksydant-salen-metall-kompleks(er) kan også settes til skylle- eller lagringsløsninger for organer og vev, slik som for organtransplantering eller for kirurgisk skylling. F.eks. kan utskårne organer ofte plasseres i en konserveringsløsning før transplantering i en mottager. Inklusjon av minst én type av oksydant salen-metall-kompleks i en konserveringsløsning, vanligvis ved en konsentrasjon på ca. 0,01 mM til 10 mM, er ønskelig for å redusere skade på grunn av ischemi under lagring, og reperfusjonsskade etter reimplantering i mottageren. Forskjellige løsninger beskrevet i teknologen er egnet for inklusjon av et salen-metall-kompleks, innbefattet men ikke begrenset til dem beskrevet i US-patent 5.145.771; Beyersdorf (1990) Chem. Abst. 113: 84849w; US-patent 4.879.283; US-patent 4.873.230; og US-patent 4.798.824, inntatt heri som referanse.

Typisk vil antioksydant-salen-metall-komplekset foreligge i skylle- eller lagringsløsningen i en konsentrasjon på ca. 10 uM til ca. 10 mM, og mest vanlig være til stede i 1 mM. Som eksempel, men ikke for å begrense oppfinnelsen, vil en egnet skylleløsning omfatte Ringer's løsning (102 mM NaCl, 4 mM KC1, 3 mM CaCl2, 28 mM

natriumlaktat, pH 7,0) eller Ringer's løsning med 0,1 mM adenosin, og antioksydant-

salen-Mn-komplekset C7 i en sluttkonsentrasjon på 1 mM. Skylleløsningen kan dessuten omfatte ytterligere antioksydanter (f.eks. glutation, allopurinol). Konservering av skylleløs-ninger inneholdende et antioksydant-salen-metall-kompleks kan anvendes til å gi forbedret lagring eller irrigasjon av organer (f.eks. nyre, lever, pankreas, lunge, føtalt neuralt vev, hjerte, åretransplantater, ben, ligament, sener, hud) som blir antatt å forbedre levedyktigheten av vevet og øke motstanden mot oksydantiv skade (f.eks. som en konsekvens av ischemi/reperfusjon).

Uten ønsket om å være bundet til noen spesiell teori for antioksydant eller katalytisk oksyradikal oppfangervirkning, blir det antatt at altfor høye doseringer eller konsentrasjoner av de katalytiske salen-metall-kompleks(er) som anvendes i denne oppfinnelse virkelig kunne frembringe frie radikaler, slik som superoksyd, muligens på en måte analog med tilstedeværelsen av store mengder av sirkulerende fritt jern. På denne basis blir det antatt at forlenget administrering av for høye doser av salen-metall-komplekser fortrinnsvis bør unngås for antioksydant-terapi. Det blir imidlertid også antatt at administrering av for høye doser av et katalytisk aktivt salen-metall-kompleks med fordel kan anvendes til generering av frie radikaler, slik som superoksyd, i lokale områder (f.eks. for akne-behandling, hudkreftbehandling, papilloma) eller i cellekulturer eller transgene dyr som har et transgen under transkripsjons-kontroll av et ARE. For å øke fri-radikal(f.eks. superoksyd)generering, kan det være fordelaktig å eksponere det lokale sted, cellekulturen eller det transgene dyr for et hyperbart miljø og/eller oksygen-anriket atmosfære (f.eks. høyere enn ca. 21% molekylært oksygen).

Alternativt kan antioksydant-salen-metall-kompleksenes evne til å katalysere dekomponeringen av reaktive oksygenforbindelser med fordel anvendes til å inhibere eller sinke skade på biologiske vev og celler. F.eks. vil benzoylperoksyd være en bredt anvendt behandling for aknelesjoner; for sterk eller uhensiktsmessig påføring av benzoylperoksyd (f.eks. utilsiktet påføring på øynene) kan behandles ved lokal (eller om ønsket, systemisk) administrering av et antioksydant-salen-metall-kompleks (f.eks. C7). På lignende måte kan oksyradikal-indusert skade på bindevev (f.eks. kollagen) etter eksponering for UV-lys, sigarettrøyking, og aldringsprosessen reduseres ved administrering av et antioksydant-salen-metall-kompleks omtrent samtidig med eksponeringen for UV-lys, sigarettrøyking, eller andre oksyradikal-genererende prosesser (f.eks. celle-aldringsprosessen).

Kjemobeskyttelse og radiobeskvttelse

Antioksydant-salen-overgangsmetall-komplekser, typisk antioksydant-salen-Mn-komplekser, slik som forbindelse Cl, blir anvendt til å beskytte celler og vev fra fri-radikal-produserende midler, slik som ioniserende stråling og kjemo-

terapeutiske midler (f.eks. bleomycin). Fortrinnsvis admini-

streres en beskyttende dosering omfattende minst ca. 1 u,g av salen-Mn-kompleks/kg legemsvekt via én eller flere av mange veier (f.eks. oral, intravenøs, intraperitoneal, intragastrisk skylling, klystér, portvene-infusjon, lokal eller inhalasjon av tåke), fortrinnsvis ved injeksjon av liposomer eller immuno-liposomer for målrettet avgivelse av antioksydant-salen-Mn-kompleksene for å beskytte normale celler, f.eks. mot fri-radikal-toksisitet i forbindelse med kjemoterapi eller radioterapi av neoplasma. Antioksydant-salen-overgangsmetall-kompleksene administreres fortrinnsvis til pasienten før starten av kjemoterapien og/eller radioterapien, vanligvis i løpet av ca. 24 timer før starten, og fortrinnsvis innenfor ca. 3 til 6 timer før starten av kjemoterapien og/eller radioterapien. Antioksydant-salen-Mn kan administreres kontinuerlig til pasienten under terapiforløpet.

F.eks. kan en løsning av et antioksydant-salen-metall-kompleks bli innkapslet i miceller under dannelse av immuno-liposomer (US-patent 5.043.164, US-patent 4.957.735, US-patent 4.925.661; Connor og Huang (1985) J. Cell. Biol. 101: 582; D.D. Lasic (1992) Nature 355: 279; Novel Drug Delivery (red. L.F. Prescott og W.S. Nimmo: Wiley, New York, 1989); Reddy et al., (1992) J. Immunol. 148: 1585; inkorporert heri ved referanse). Immunoliposomene som inneholder antioksydant-salen-metall-forbindelsene vil omfatte en mål-søkende gruppe (f.eks. monoklonalt antistoff) som målretter immunoliposomene mot ikke-neoplastiske celler som ellers er følsomme for radioterapi eller kjemoterapi. F.eks. kan immunoliposomer som har et monoklonalt antistoff som binder seg spesifikt til et hematopoetisk stamcelle-antigen som ikke er til stede på cancer-cellene hos dette individ, anvendes til å målrette antioksydant-salen-metall-komplekser mot hematopoetiske stamceller og derved beskytte nevnte stamceller mot radioterapi eller kjemoterapi anvendt til behandling av canceren. En slik strategi anvendes fortrinnsvis når det kjemoterapeutiske middel danner frie radikaler in vivo (f.eks. bleomycin).

Antioksydant-salen-Mn-kompIekser blir også administrert til individer for å forebygge strålingsskade eller kjemisk skade ved fri-radikal-genererende midler. Militært personell og personer som arbeider i kjerneindustrien, kjernemedisinen og/eller kjemisk industri kan administreres salen-Mn-komplekser profylaktisk. Antioksydant-salen-metall-komplekser kan også anvendes som kjemo-beskyttende midler for å forebygge kjemisk karsinogenese; særlig av karsinogener som danner reaktive epoksyd-mellomprodukter (f.eks. benzo-[a]-pyren, benzantracen) og av karsinogener eller befordringsmidler som danner frie radikaler direkte eller indirekte (f.eks. fenobarbital, TPA, benzoylperoksyd, peroksisom-proliferatorer; ciprofibrat, clofibrat). Personer utsatt for slike kjemiske karsinogener blir for-behandlet med et antioksydant-salen-metall-kompleks for å redusere forekomsten av eller risikoen for utvikling av neoplasi.

Antioksydant-salen-metall-komplekser kan også formuleres i en lipofil base (eller om ønsket en vandig bærer) for lokal påføring i kosmetika eller i kremer og lotioner til forebyggelse av solforbrenning. Et typisk kosmetikum eller krem eller lotion til forebyggelse av solforbrenning vil omfatte ca. mellom 1 mg og 50 mg av antioksydant-salen-metall-kompleks pr. gram kosmetikum eller krem eller lotion til forebyggelse av solforbrenning.

Antioksydant-salen-metall-komplekser kan også administreres til dypdykkere eller individer utsatt for hyperbart miljø hvor oksygentoksisitet representerer en helserisiko. Administrering av en virksom dose av et antioksydant-salen-metall-kompleks til et individ kan tillate innånding av hyperbariske og/eller oksygen-anrikede gasser med redusert risiko for oksygentoksisitet. Det blir også antatt at administrering av en virksom dosering av et antioksydant-salen-metall-kompleks kan redusere toksisitet og biologisk skade i forbindelse med eksponering for ozon. Profylaktisk administrering av et antioksydant-salen-metall-kompleks til mennesker som er eller vil bli eksponert for ozon, blir ventet å gi øket motstand mot ozontoksisitet, slik som den ozon-induserte lungeskade som merkes i geografiske områder med høyt ozon-nivå (f.eks. Los Angeles).

Anvendeli<g>het, testing og administrering

Forbindelsene som anvendes i denne oppfinnelse, antioksydant-salen-overgangsmetall-komplekser, fortrinnsvis salen-Mn-komplekser, er nyttige i behandlinger for beskyttelse mot ischemisk skade med hjerte- og ikke-hjertetilstander innbefattet myokardialt infarkt, kongestiv hjertesvikt, angina, arrytmi, sirkulatoriske forstyrrelser og slag. Forbindelsene vil inhibere de skadelige virkninger av ischemi (koronart infarkt og reperfusjon i hjertet; transient myokardial eller CNS-ischemi under kirurgi) uten direkte nedsettende virkninger på myokardial kontraktilitet. Forbindelsene er således effektive i dyremodeller for kardiovaskulære og CNS-sykdommer, og vil være nyttige for behandling av myokardialt infarkt, slag, hjerneskade, og transplanteringskirurgi, særlig med reperfusjon av infarktene områder, arrytmier, variant- og anstrengelses-indusert angina, kongestiv hjertesvikt, slag og andre sirkulatoriske forstyrrelser, hos pattedyr, særlig hos mennesker. Salen-Mn-kompleksene blir også inntatt i konserveringsløsninger anvendt til å bade utskårne organer (f.eks. hjerte, nyre, pankreas, lever, lunge) under transport og lagring av de utskårne organer før transplanteirngskirurgi, innbefattet hudtransplantering og hornhinnetransplantering. Konserveringsløsningene vil typisk omfatte minst ca. 1 u.M av et antioksydant-salen-metall-kompleks, fortrinnsvis minst ca. 1 uM av et antioksydant-salen-metall-kompleks.

Administrering av den aktive forbindelse og salter beskrevet her kan være via hvilken som helst av de aksepterte administrasjonsmåler for terapeutiske midler. Disse fremgangsmåter inkluderer oral, parenteral, transdermal, subkutan og andre systemiske måter. Den foretrukne administrerings-fremgangsmåte er oral, unntatt i de tilfeller hvor individet er ute av stand til å svelge, av seg selv, noen medisinering. I disse tilfeller kan det være nødvendig å administrere blandingen parenteralt. Dersom blandingen omfatter en antioksydant-salen-metall-forbindelse som har en aminosubstituent som kan protoneres ved fysiologisk pH, blir det vanligvis foretrukket at antioksydant-salen-metall-komplekset blir løst eller oppslemmet i en løsning med en pH hvorved aminosubstituenten blir protonen.

Mengden av aktiv forbindelse som administreres vil naturligvis være avhengig av individet som behandles, individets vekt, lidelsens alvorlighetsgrad, administreirngsmåten og den foreskrivende leges vurdering. En effektiv dosering vil imidlertid være i området 0,01 til 50 mg/kg/dag, fortrinnsvis 0,5-25 mg/kg/dag. For et menneske på gjennomsnittlig 70 kg ville dette bety 0,7-3500 mg pr. dag, eller fortrinnsvis ca. 35-1750 mg/dag.

Siden virkningene av salen-Mn-forbindelsene heri blir oppnådd gjennom en lignende mekanisme, vil doseringer (og administeirngsformer) være innenfor de samme generelle og foretrukne områder for alle disse anvendelser.

De følgende eksempler er fremlagt som illustrasjon.

Eksperimentelle eksempler

In vitro katalytiske aktiviteter

De antioksydant katalytiske aktiviteter av Cl, C4, C6, C7, C9, CIO, Cl 1 og C12 salen-Mn-kompleksene (se fig. 3) ble bestemt; superoksyd-dismutase og katalaseaktiviteten ble bestemt etter følgende fremgangsmåte.

Analyse

SOD-aktiviteten av forbindelsene ble bestemt ved å evaluere inhiberingen av reduksjonen av cytokrom C frembragt av det oksygen fri-radikal-genererende system, xantin pluss xantin-oksydase. Cytokrom C-reduksjonen blir overvåket spektrofotometrisk ved 550 nm ifølge fremgangsmåten beskrevet hos Darr et al., (1987) Arch. Biochem. Biophys. 258: 351, inkorporert heri ved referanse. Konsentrasjonen av xantin oksydase blir justert slik at den frembringer en reduksjonshastighet for cytokrom C ved 550 nm på 0,025 absorbansenheter pr. min. Under disse betingelser defineres den mengde av SOD-aktivitet som kreves for å inhibere hastigheten av cytokrom C-reduksjon med 50% (d.v.s. til en hastighet på 0,0125 absorbansenheter pr. min.) som én aktivitetsenhet. Salen-metall-komplekser identifiseres som antioksydanter dersom de har minst 0,1 aktivitetsenhet ved en konsentrasjon på 1 mM under disse standard analysebetingelser.

Katalase-aktiviteten ble målt ved anvendelse av en spektrofotometrisk metode hvor dekomponeringen av hydrogenperoksyd blir overvåket ved 240 nm ifølge fremgangsmåten til Aebi et al., (1984) Methods Enzymol. 105: 121, inkorporert heri ved referanse. Én enhet av katalaseaktivitet defineres som den mengde av enzym (eller salen-metall-kompleks) som kreves for å dekomponere 1 u.mol av hydrogenperoksyd på 1 min.

Hver av forbindelsene ble formulert i saltløsning og var stabil uten noe aktivitetstap observert etter flere ukers lagring ved romtemperatur. Ofte er det ønskelig først å løse salen-metall-komplekset i et organisk løsningsmiddel (f.eks. DMSO) og deretter fortynne løsningen i et mere polart løsningsmiddel som f.eks. vann. Dette blir særlig foretrukket for salen-metall-forbindelser som er relativt hydrofobe (f.eks. Cl 2).

Tabell IV viser in vitro SOD og katalaseaktivitetene for de forskjellige salen-Mn-komplekser som er testet. SOD og katalaseaktivitetene er uttrykt som enheter/mM.

In vivo biologiske aktiviteter

En bredt anvendt analyse for bestemmelse av det terapeutiske potensial av molekyler i hjerne-ischemi (slag) består av evaluering av deres evne til å forebygge irreversibel skade indusert av en anoksisk episode i hjerneskiver holdt under fysiologiske betingelser. Rottehjerneskiver ble holdt ved 35°C i et fasegrense-kammer i et kunstig cerebrospinalt fluid inneholdende: 124 mM NaCl, 3 mM KC1,1,25 mM KH2P04, 3 mM

CaCl2,1 mM MgCl2, 26 mM NaHC03,10 mM D-glukose og 2 mM L-askorbat,

kontinuerlig gjennomgasset med en blanding av 02:C02 (95:5). Kammeratmosfæren ble også kontinuerlig gjenomgasset med blandingen av 02:C02 (95:5), unntatt under den anoksiske episode da den ble erstattet med N2. Aksoner ble elektrisk stimulert og de fremkalte eksitatoriske post-synaptiske potensialer (EPSP) ble registrert ved anvendelse av mikroelektroder.

Fig. 4 viser skjematisk et EPSP registrert under normale betingelser (A), 5 min. etter erstatning av 02 med N2 (ischemisk episode B), og 30-40 min. etter reoksygenering (C). Graden av permanent skade kan kvantifiseres ved å måle både amplituden (i mV) og den begynnende helling (i mV/msek.) av EPSP.

Figurene 5 og 6 viser den beskyttende virkning av antioksydant-salen-Mn-komplekset betegnet C7 i rottehjerneskive-ischemi-EPSP-systemet. Hjerneskiver ble inkubert i fravær eller nærvær av 50 uM C7 og underkastet en episode av ischemi/reoksygenering. Etter 5 min. basislinjeregistrering ble 02 erstattet med N2 i gjennomsnittlig 5 min. 02 ble deretter reintrodusert, og registreringen ble fortsatt i ytterligere 50 min. Prøver med 50 uM Cl viste at både amlituden og helningen av EPSP bedret seg til pre-ischemi-nivå. Derimot var forbedringen i ubehandlede hjerneskiver bare ca. 40% av pre-ischemi-nivå.

Som en ytterligere bestemmelse av virkningen ble prosentsatsen av levedyktige skiver etter gjentatte ischemiske episoder evaluert. Fig. 7 viser at denne prosentsats uten noen behandling er svært lav (6%), mens den var så høy som 70% i skiver behandlet med 50 uM C7. En skive ble betraktet som levedyktig dersom et EPSP med 3 mV amplitude kunne fremkalles ved å øke stimuleringsintensiteten.

Dyremodell- testing

En dyremodell av Parkinsons sykdom som involverte generering av iatrogent hydroksylradikal ved MPTP (Chiueh et al., (1992) Synapse 11: 346, inkorporert heri ved referanse) ble anvendt til evaluering av den beskyttende virkning av C7 på fri-radikal-indusert skade. Neurotoksinet, MPTP, er blitt vist å føre til degenerering av dopaminerge neuroner i hjemen, og således tilveiebringe en god modell for eksperimentelt indusert Parkinsons sykdom (f.eks. iatrogentoksisitet). Denne modell er nå bredt akseptert på dette område, og blir anvendt til evaluering av potensielle terapeutiske midler for denne sykdom.

Antallet dopaminerge neuroner i musehjerner behandlet med enten: (1) MPTP alene, (2) antioksydant-salen-metall-komplekset C7 alene, (3) forbehandling med C7 og deretter MPTP, eller (4) ubehandlede kontroller, ble analysert ved måling av bindingen av dopamin-gjenopptaks-liganden, mazindol. Tritiert mazindol ble anvendt til bindingsstudier på prøver av globus pallidus, caudate nucleus, og striatum fra musehjeme ifølge konvensjonelle fremgangsmåter, spesifikk binding av tritiert mazindol ble bestemt autoradiografisk eller ved membranbinding (spesifikk binding til membranfraksjonen). Eksperimentet ble gjennomført i løpet av et tidsrom på 7 dager. Mus i MPTP-gruppen ble behandlet intraperitonealt med MPTP alene (40 mg/kg hver dag på dagene 1 og 2). Mus i MPTP+C7-gruppen ble forbehandlet med C7 (33 mg/kg, i.p.) umiddelbart før MPTP på dagene 1 og 2, og ble gitt C7 (33 mg/kg) alene på dag 3. Dyrene ble avlivet etter 7 dager. Resultatene gjengitt i fig. 8 viser en signifikant beskyttende effekt overdratt in vivo ved salen-Mn-komplekset, Cl. Fig. 8 viser at antallet dopaminerge neuroner til stede i forskjellige regioner av musehjemen ikke ble skadelig påvirket av antioksydant-salen-metall-komplekset Cl; men dopaminerge neuroner ble redusert til ca. 15% av kontrollverdiene i mus behandlet med MPTP alene; forbehandling med C7 fordoblet imidlertid omtrent antallet av overlevende dopaminerge neuroner til stede i mus som deretter ble behandlet med MPTP. Mangel på toksisitet av C7 ble vist ved fravær av skadelige helsevirkninger i de C7-behandlede dyr i løpet av testperioden på 7 dager.

Disse data demonstrerer at salen-Mn-kompleksene har terapeutisk virkning in vivo i rottemodeller av human sykdom, og indikerer også at salen-Mn-kompleksene krysser blod/hjerne-barrieren effektivt. Sett i sammenheng indikerer disse data en dramatisk virkning av salen-Mn-komplekser til å forebygge fri-radikal-indusert skade og ischemi/reoksygeneringsskade i hjernen.

Effekt av C7 i isolerte iern- overbelastede rottehjerter utsatt for ischemi og reperfusjon

Rotter fikk en intramuskulær injeksjon av 0,25 ml av en jern/dekstran-løsning (100 g jernhydroksyd, 99 g dekstran, vann opp til 1 liter) hver tredje dag i løpet av et 5-ukers tidsrom for å oppnå en signifikant jern-overbelastning i hjertevev. Ved slutten av denne behandling ble rottene anestetisert med natriumpentobarbital (40 mg/kg) og heparin (1.000 IU/kg) ble administrert via en femoral vene. Hjertene ble deretter fjernet og hurtig perfusert gjennom aorta ifølge teknikken beskrevet av Langendorff [O. Langendorff, Pfiiigers Arch. 61: 291, 1995] ved konstant strømningshastighet på 11 ml/min. Perfusjonsfluidet var en modifisert Krebs-Henseleit-buffer inneholdende (i mmol/1): NaCl 118, KC1 5,9, NaHC03 25, MgCl2 1,2, Na<H>2P04 0,6, CaCl2 2,4, glukose 1 liter. pH ble holdt på 7,4 ± 0,05 når perfusjonsmediet var mettet med 02-C02 (95:5) ved 37°C. Perfusjonsapparatet var fullstendig termostatert slik at temperaturen av perfusjonsmediet var 37,0 ± 0,5°C når det nådde frem til aorta. En ultra-tynn ballong ble innført i det venstre hjertekammer umiddelbart etter starten av aorta-perfusjonen, og ble inflatert slik at det kunne oppnås et ende-diastolisk trykk på 5 mm Hg. En 15 min. stabiliserings-periode ble initiert umiddelbart etter ballongplasseringen. Ved slutten av denne periode ble systolisk og diastolisk hjertekammertrykk og hjerteslaghastighet (HR) registrert ved hjelp av en trykktransduser forbundet med hjertekammerballongen. Trykket utviklet i det venstre hjertekammer (LVDP:Left Ventricular Developed Pressure) ble beregnet ved forskjellen mellom systolisk og diastolisk trykk, og produktet HR x LVDP ble tatt som en indeks på oksygenforbruket. Hjertene ble deretter underkastet en 15 min. total global normotermisk ischemi, etterfulgt av 15 min. reperfusjon med perfusjonsmdiet anvendt til å begynne med. Under denne 15 min. reperfusjon ble hjertehastighet og diastolisk og systolisk trykk overvåket. Tidlig hjertekammer-fibrillering ble analysert 1 min. etter starten av reperfusjonen.

Tre eksperimentelle grupper ble studert. Gruppe 1 (n=7) hvori hjerter ble perfusert med standard perfusjonsvæsken (kontrollgruppen); gruppe 2 (n=8) ble perfusert i nærvær av dimetyltiourea (DMTU, 10 mM); gruppe 3 (n=8) ble perfusert i nærvær av C7 (50 uM).

Etter 15 min. reperfusjon ble 3 hjerter i hver gruppe preparert for elektronmikroskopi ved perfusjon med 2,5% glutaraldehyd. Ultra-tynne skiver (500-600Å tykkelse) ble undersøkt.

Resultater

Følgende tabell V viser hjertehastigheter (HR), systolisk trykk (SP), diastolisk trykk (DP), og produktene HR x LVDP, i de tre eksperimentelle grupper, etter 15 min. perfusjon, før ischemi (før), 1 min. etter reperfusjon (1 etter) og 15 min. etter reperfusjon (15 etter). Tabellen viser også det antall hjerter som viste episoder av hjertekammer-fibrillering 1 min. etter reperfusjon (VF).

#: p < 0,01, C7 versus-kontroll til samme tid.

□: p < 0,05, C7 versus-kontroll til samme tid.

p < 0,01, C7 versus-DMTU til samme tid.

Tabell VI sammenfatter resultatene fra elektronmikroskopi-evalueringen av hjertene. Mitokondriene ble klassifisert i type A (normale), type B (oppsvulmete, hele), og type C (sprengte membraner). Sarkomerer ble klassifisert i type A (normale) og type B (bragt i kontakt og/eller nekrose). Resultatene er uttrykt som prosentsatser. Antallet mitokondrier analysert var 1293,1632 og 1595 for henholdsvis kontroller, DMTU og C7-grupper. Antallet sarkomerer analysert var 1046, 1173 og 1143 for henholdsvis kontroller, DMTU og C7-grupper.

<*>: p < 0,05, DMTU versus-kontroll.

+: p < 0,01, DMTU versus-kontroll.

#: p < 0,01, C7 versus-kontroll.

□: p < 0,05, C7 versus-DMTU

±: p < 0,01, C7 versus-DMTU.

Disse data viser at C7 effektivt beskyttet hjerter fra ischemi/reoksygeneringsskade, både funksjonelt og strukturelt. I tillegg var C7 signifikant mer virksom enn DMTU, en antioksydant, selv om det ble anvendt ved en konsentrasjon 200 ganger lavere.

Eksperimentell autoimmun encefalitis ( EAE)

EAE er en dyremodell av multippel sklerose. 30 SJL hunnmus, 10 uker gamle, ble oppdelt i 2 grupper på 20 mus (kontroll) og 10 mus (C7-behandlet).

Mus i begge grupper ble immunisert med et encefalitogent PLP-peptid i komplett Freund's adjuvans subkutant, etterfulgt av Petrussis Toxin (IV). Petrussis toksin ble gjentatt på dag 3 post immunisering.

Musene i C7-gruppen ble behandlet daglig (1 mg/mus, ca. 40 mg/kg) ved IP-injeksjon, med start fra 2 dager før immunisering til og med dag 14 etter immunisering.

Dyrene ble bedømt som følger:

Trinn I: Kraftløs halesyndrom

Trinn II: Bakbenlammelse

Trinn HI: Bakbenlammelse - slepende bevegelse

Trinn IV: Lammende immobilitet, vekttap

Resultater

I løpet av den tredje uke etter immunisering utviklet 8 av 20 mus i konrollgruppen symptomatisk EAE: 2 trinn 1,4 trinn U/III, 2 trinn IV.

I løpet av det samme tidsrom var det bare én av 10 mus i den C7-behandlede gruppe som utviklet symptomatisk EAE (trinn H).

I løpet av den femte uke, d.v.s. tre uker etter at behandlingen med C7 var stanset, var det seks mus i C7-gruppen som utviklet symptomatisk EAE, 4 trinn II og 2 trinn IV.

Disse resultater indikerer at C7-behandling forebygget utvikling av symptomatisk EAE, og at sykdommen kunne utvikle seg etter avbrudd av behandlingen.

Lipid- peroksvdasion

Hippokampale skiver (400 um tykke) ble oppnådd fra Sprague-Dawley-rotter (150-200 g) og oppsamlet i pre-oksygenert (95% 02/5% C02) Krebs-Ringer fosfatmedium (pH 7,4) inneholdende NaCl 120 mM, KC15 mM, CaCl2 1,3 mM, MgCl2

1,2 mM, Na-fosfat 16 mM (pH 7,4) og glukose 10 mM. Etter 15 min. pre-inkubering i et vannbad ved 35°C under omrøring, ble bufferen erstattet med den samme buffer (kontroll) eller en modifisert buffer (Iaktatbuffer) inneholdende NaCl 90 mM, KC1 5 mM, CaCl2 1,3

mM, MgCl2 1,2 mM, Na-fosfat 16 mM og melkesyre 30 mM (pH 5,0). Når det var til stede ble C7 (50 uM) tilsatt under preinkuberings- og inkuberingsperioden. Etter 100 min. ble skivene oppsamlet og homogenisert i 0,9 ml TCA 5%, mens 0,35 ml av TCA 5% ble satt til 0,5 ml av inkuberingsmediet. Lipid-peroksydasjonen ble målt ved tilsetning av

0,25 ml av et tiobarbitursyre-reagens (TBAR) til 0,85 ml av TCA-ekstraktene og inkubering av blandingen i 60 min. ved 85-93°C. Lipidene ble deretter ekstrahert med 2 x 0,5 ml 1-butanol ved vortexing i 10 sek., deretter sentrifugering ved 2.000 opm i 10 min. Absorbansen av peroksyderte lipider i alkoholfasen ble målt i et spektrofotometer ved 532 nm. Data ble uttrykt som nanomol av malondialdehyd (MDA) ved anvendelse av autentisk MDA til etablering av en standardkurve. Proteinene ble målt fra en alikvot av TCA-ekstraktene ved anvendelse av fremgangsmåten til Bradford, og sluttresultatene ble beregnet som nanomol MDA dannet pr. mg protein.

Resultater

Fig. 9 viser lipidperoksydasjon ved tiden 0 (umiddelbart etter seksjonering), og etter 100 min. inkubering ved pH 7,4 (kontroll), ved pH 5,0 (laktat) i fravær (LA) eller nærvær LA + C7 av 50 uM C7, i skivehomogenatene (skraverte søyler) og i inkuberingsmediet (prikkede søyler). Disse data er gjennomsnittsverdier ± S.D. og den C7-eksperimentelle gruppe var høyst statistisk signifikant sammenlignet med kontrollen (p < 0,01) mens de små forskjeller mellom LA og LA + C7 ikke er. Inkubering av hippokampale skiver med 30 mM laktat, til en slutt-pH på 5,0, resulterte i en stor økning i lipid-peroksydasjon, målt ved tiobarbitursyretesten. Inkubering av skivene med C7 (50 u.M) opphevet fullstendig økningen i lipid-peroksydasjon. Laktat-indusert økning i malondialdehyd-konsentrasjonen i både inkuberingsmediet (prikkede søyler) og i skivehomogenatene (skraverte søyler) ble blokkert av C7. Inkubering i 100 min. uten laktat, enten med eller uten C7, forårsaket ingen vesentlig økning i lipidperoksydasjon.

Disse data viser at C7 vil forebygge lipidperoksydasjon indusert av acidose. Acidose er kjent for å indusere betydelig oksydativ skade. Lipidperoksydasjon er en konsekvens av slik oksydativ skade, og er blitt funnet i forbindelse med flere humane patologier.

In vitro- modeller av skade

Anoxi i hippokampale skiver. Elektrofysiologiske eksperimenter ble gjennomført på hippokampale skiver (400 u.m) fra voksne Sprague-Dawley-rotter holdt ved 35°C i 2 grenseflate-kammere med eller uten 50 mM C7. En registrerende glass-mikropipette ble posisjonert i CA1 stratum radiatum for å registrere det eksitatoriske postsynaptiske potensial (EPSP) generert ved elektrisk stimulering av den Schaffer-kommissurale mekanisme med en bipolar stimuleringselektrode med frekvens på 0,033 Hz. Under anoksiske episoder ble oksygenforsyningen erstattet med 100% N2-gass. N2 ble levert i 90 sekunder etter elektrisk stillstand, hvoretter 02 ble innført igjen. Gjenvinning av EPSP (både helling og amplitude) ble registrert i 50 min., på hvilket tidspunkt den endelige levedyktighet av skivene ble bestemt, med levedyktigheten definert som skivens evne til å generere et EPSP på 3 mV.

Acidose i hippokam<p>ale skiver. Hippokampale skiver ble oppsamlet i preoksygenert Krebs-Ringer fosfatbuffer, med eller uten 50 uJvl C7, ved 35°C i vannbad med rysting. Etter 15 min. preinkubering ble skivene overført til den samme buffer eller i en buffer inneholdende 30 mM laktat, pH 5,0 (med eller uten C7). Skiver fra alle grupper ble oppsamlet etter 100 min. inkubering og testet for lipidperoksydasjon, som angitt ved malondialdehydreaksjon med tiobarbitursyre.

In vivo- modell av neuronskade

MPTP i mus. Voksne CFW hannmus (25-33 g) ble administrert to injeksjoner av MPTP løst i normal saltløsning

(40 mg/kg, s.k.) 24 timer etter hverandre. En gruppe av dyr fikk også C7 i tre injeksjoner (33 mg/kg, s.k.) administrert 24 timer etter hverandre, med start 1 dag før begynnelsen av MPTP-behandlingen. Dyrene ble avlivet 7 dager etter den første MPTP-injeksjon, og neuronpatologien ble bestemt ved binding av " iH-mazindol, en ligand for dopamintransportøren, til 10 mm frosne hjemesnitt eller til striatale homogenater.

6- OHDA i mus. Voksne CFW hannmus ble anestetisert med ketamin og rumpun, og immobilisert i en stereotaksisk anordning. 6-OHDA, som hydrobromidsaltet, ble løst i normal saltløsning med 1 % askorbat, og 50 ug ble administrert i det laterale hjertekammer ved hjelp av en 10 ul Hamilton sprøyte. C7 (66 mg/kg, i.p.) ble administrert daglig i 4

dager. Dyrene ble avlivet 7 dager senere, og neuronpatologien ble bestemt ved måling av <3>H-mazindolbindingen i striatale homogenater.

Resultater

C7 beskytter hippokampale skiver fra anoksi- indusert skade

Hippokampale skiver ble underkastet anoksiske betingelser med eller uten C7 (50 uM). C7 ga en signifikant grad av beskyttelse mot anoksi-indusert nedsettelse i synaptisk respons i CA1. Reduksjonen i både EPSP-hellingen (A) og amplutuden (B) ble forebygget av Cl. Renset bovin SOD i den samme analyse ga ingen beskyttelse.

Fig. 10 viser at I.c.v.-injeksjon av 6-OHDA (50 u,g) resulterte i en 60-70% nedsettelse i mazindolbindingen i homogenater fra striatum ipsilateralen fra injeksjonsstedet og 30% nedsettelse fra den kontralaterale striatum (fig. 10). Behandling med C7 (4 x 66 mg/kg) ga en signifikant reduksjon i den ipsilaterale side og en fullstendig beskyttelse i den kontralaterale side.

MPTP-administrering (2 x 40 mg/kg, s.k.) resulterte i en 75-80% nedsettelse i mazindolbindingen. C7-behandling (3 x 33 mg/kg, i.p.) forårsaket en signifikant (p<0,05)

grad av beskyttelse mot reduksjonen i H-mazindolbindingen i både globus pallidus, og den caudate nucleus (panel A). C7-behandling alene hadde ingen signifikant effekt på ' i H-mazindolbindingen. Den samme behandling ga også en signifikant beskyttelse mot reduksjonen i H-mazindolbindingen målt i striatale homogenater (panel B).

Konklusjoner

Disse resultater illustrerer de beskyttende virkninger av en syntetisk katalytisk oppfanger (SCS), C7, i forskjellige modeller av neuronskade. C7 var i stand til å beskytte neuroner fra akutte tidlige manifestasjoner av neuronskade, slik som lipid-peroksydasjon og tap av synaptisk levedyktighet, såvel som langtidsmanifestasjoner av neuronskade, slik som neurontap 7 dager etter toksin-injeksjon.

I betraktning av de positive effekter oppnådd med perifere injeksjoner av C7 i in vivo-modellene av neuronskade, konkluderer vi med at komplekset er stabilt in vivo og krysser blod/hjerne-barrieren såvel som neuronmembraner.

De positive effekter av Cl i forskjellige modeller av neuronskade indikerer at reaktive oksygenforbindelser, særlig superoksydradikalet, spiller en signifikant rolle i den patologi som induseres ved ischemi og acidose, og i MPTP- og 6-OHDA-indusert tap av nigrostriatale dopaminerge neuroner.

Endelig, i betraktning av det brede område av patologiske tilstander i forbindelse med overproduksjon av oksygenradikaler, vil disse resultater understøtte den idé at antioksydant-salen-metall-komplekser slik som Cl kan ha et bredt område av terapeutiske anvendelser.

Den foregående beskrivelse av de foretrukne utførelser av foreliggende oppfinnelse er blitt presentert med formålet illustrasjon og beskrivelse.

Claims

1. Farmasøytisk preparat for forebygging eller terapi av en fri-radikal-assosiert sykdom som er et resultat av en ubalanse av fri-radikaler, karakterisert ved at det inneholder en terapeutisk effektiv dose av et antioksydant-salen-metallkompleks med den strukturelle formel: M er Mn A er hydrogen eller halogen n er 0 X i og X3 er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og tertiære alkyler X2 og X4 er hydrogen Yi og Y4 er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, primære alkyler, alkoksygrupper og tertiære alkyler Y2, Y3, Y5 og Y6er hydrogen Ri, R2, R3 og R4 er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, fenyl, benzyloksy, eller to av R-gruppene danner til sammen en C4-alkylenbro, hvor minst to av R-gruppene er H.

2. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, hvor den fri-radikal-assosierte sykdom er valgt fra gruppen bestående av: ischemisk/reoksygenerings-episode og iatrogen fri-radikal-toksisitet.

3. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, hvor antioksydant-salen-metallkompleket er valgt fra gruppen bestående av: hvor R|, R3, Xi, Y! og Y4 er som angitt i krav 1, og i struktur VU er Y]=Y4, og Y er valgt fra gruppen bestående av t-butyl og hydrogen.

4. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, hvor antioksydant-salen-metallkomplekset er valgt fra gruppen bestående av:

5. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, hvor antioksydant-salen-metallkomplekset har den strukturelle formel:

6. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, hvor antioksydant-salen-metallkomplekset er valgt fra gruppen bestående av:

7. Farmasøytisk preparat ifølge krav 2, hvor antioksydant-salen-metallkomplekset er SOD-etterligningen som har den følgende formel:

8. Farmasøytisk preparat ifølge krav 7, hvor det farmasøytiske preparatet omfatter minst ca. 10 mg C7 i en form egnet for parenteral administrering, hvor C7 har den følgende formel:

9. Anvendelse av et antioksydant-salen-metallkompleks som definert i krav 1 til fremstilling av et farmasøytisk preparat for forhindring, stopping eller behandling av en fri-radikal-assosiert sykdomstilstand som er et resultat av en ubalanse av fri-radikaler.

10. Anvendelse ifølge krav 9, hvor den fri-radikal-assosierte sykdom er valgt fra gruppen bestående av: ischemi/reoksygeneringsepisode og iatrogen fri-radikal-toksisitet.

11. Anvendelse ifølge krav 9, hvor det farmasøytiske antioksydant-salen-metallkompleks-preparat omfatter et antioksydant-salen-metallkompleks valgt fra gruppen bestående av: hvori M, A, Rj-R*, X1-X4, Yi-Yg er som definert i krav 1, og i struktur VII er Y|=Y4, og Y er valgt fra gruppen bestående av t-butyl og hydrogen.

12. Anvendelse ifølge krav 11, hvor antioksydant-salen-metallkomplekset er valgt fra gruppen bestående av:

13. Anvendelse ifølge krav 10, hvor salen-metallkomplekset er C7 som har den følgende formel:

14. Anvendelse av en profylaktisk effektiv dose av minst én type av et antioksydant-salen-metallkompleks med den strukturelle formel: hvor M, A, R]-R4, X1-X4, YpY6 er som definert i krav 1, i en farmasøytisk akseptabel form til fremstilling av et farmasøytisk preparat for forhindring av fri-radikal-assosiert strålingskade og kjemisk skade hos en pasient.

15. Anvendelse ifølge krav 14, hvor antioksydant-salen-metallkomplekset omfatter den SOD-etterlignende C7 som har den følgende formel:

16. Anvendelse ifølge krav 14, hvor antioksydant-salen-metallkomplekset er formulert for topisk administrering på huden til pasienten.

17. Anvendelse ifølge krav 16, hvor antioksydant-salen-metallkomplekset er formulert som en sol-beskyttende krem, en sol-beskyttende losjon eller et kosmetikum.

18. Anvendelse av et antioksydant-salen-metallkompleks med den strukturelle formel: hvor M, A, R1-R4, Xj-X4, Yi-Ye er som definert i krav 1 til fremstilling av et farmasøytisk preparat for forhindring eller reduksjon av alvorlighetsgraden av fri-radikal-skade på en pasient som er et resultat av behandling med ioniserende stråling eller administrering av et fri-radikal-dannende kjemoterapeutisk middel.

19. Anvendelse ifølge krav 18, hvor antioksydant-salen-metallkomplekset er SOD-etterligningen C7 som har den følgende formel.

20. Anvendelse ifølge krav 18, hvor det fri-radikal-dannende kjemoterapeutiske middel er det antineoplastiske midlet bleomycin.

21. Anvendelse ifølge krav 18, hvor antioksydant-salen-metallkomplekset blir administrert til nevnte pasient før administrering av den ioniserende stråling eller fri-radikal-dannende kjemoterapeutiske middel.

22. Preparat ifølge krav 1, omfattende et antioksydant-salen-metallkompleks med den strukturelle formel: hvor M, A, R1-R4, X1-X4, Y1-Y6 er som definert i krav 1, formulert for avgivelse til et menneske eller en veterinærpasient.

23. Preparat ifølge krav 22, hvor salen-metallkomplekset blir formulert i immunoliposomer.

24. Farmasøytisk preparat for forebygging eller terapi av en fri-radikal-assosiert sykdom som er et resultat av en ubalanse av fri-radikaler, omfattende en terapeutisk effektiv dose av et antioksydant salen-metallkompleks i en farmasøytisk akseptabel form, hvor antioksydant-salen-metallkomplekset har den strukturelle formel: hvor M er mangan; A er H eller halogen; R1-R4, Xj-Xi, Y]-Y6 er som definert i krav 1.

25. Farmasøytisk preparat ifølge krav 24, hvor antioksydant-salen-metallkomplekset er valgt fra gruppen bestående av:

26. Anvendelse av en terapeutisk effektiv dose av et antioksidant-salen-metallkompleks som definert i krav 24, til fremstilling av et farmasøytisk preparat for forhindring, stopping eller behandling av nevrologisk skade fremkalt ved l-metyl-4-fenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) eller anoksi-skade..

27. Anvendelse ifølge krav 26, hvor nevnte farmasøytiske antioksydant- salen-metallkompleks-preparat er C7 som har den følgende formel: