CZ296288B6

CZ296288B6 - Farmaceutický prostredek pro prevenci a lécení nemocí, souvisejících s volnými radikály obsahující antioxidanty

Info

Publication number: CZ296288B6
Application number: CZ0144295A
Authority: CZ
Inventors: Malfroy-Camine@Bernard; Baudry@Michel
Original assignee: Eukarion, Inc.
Priority date: 1992-12-07
Filing date: 1993-12-06
Publication date: 2006-02-15
Also published as: JPH08504211A; LV10924B; SK74595A3; GB2277873B; GB9415050D0; DE69333775T2; NZ259200A; NO319454B1; PL175446B1; EP0746321A1; AU5741994A; NO952237D0; JP3502099B2; LV10924A; HUT72967A; OA10165A; US5827880A; GB2305107B; UA27949C2; US5403834A

Abstract

Farmaceutický prostredek pro prevenci nebo lécenínemocí, které souvisí s volnými radikály, vybraných ze skupiny sestávající z ischemicko/reoxygenacní události a iatrogenní jedovatosti volných radikálu, obsahující jako úcinnou slozku antioxidacní komplex salen-kov ve farmaceuticky prijatelné forme,pricemz antioxidacní komplex salen-kov je sloucenina obecného vzorce I a jeho pouzití pro lécení výse zmínených nemocí.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutických prostředků, které obsahují malé molekuly syntetických, katalytických antioxidantů a lapačů volných radikálů, které jsou určeny k léčení a profylaxi nemocí, způsobů využití malých molekul antioxidantů při prevenci a léčení patologických stavů, způsobů využití malých molekul antioxidantů při cílené ochraně tkání a/nebo buněk při protirakovinné chemoterapii a způsobů využití malých molekul antioxidantů při prevenci toxikologických poškození jedinců, kteří jsou vystaveni dráždivým oxidantům nebo jiným zdrojům oxidačního poškození, zejména těm, které jsou odvozeny od kyslíku, jako je hyperoxidový radikál. Prostředky a způsoby podle předkládaného vynálezu se také používají při prevenci oxidačního poškození při transplantaci lidských orgánů a pro inhibici reoxygenačních poškození, která následující reperfuzi ischemické tkáně. Prostředky a způsoby podle předkládaného vynálezu se také používají při chemoprevenci chemické kancerogeneze a změně metabolismu léků, který zahrnuje epoxidové meziprodukty nebo meziprodukty s volnými kyslíkovými radikály.

Dosavadní stav techniky

Molekulární kyslík je esenciální výživnou složkou pro nefakultativní aerobní organizmy jako je člověk. Kyslík se používá mnoha způsoby, zejména jako konečný akceptor elektronů v oxidační fosforylaci, v mnoha dioxygenázových reakcích, včetně syntézy prostaglandinů a vitamínu A z karotenoidů, v hostitelských hydroxylázových reakcích, včetně tvorby a modifikace steroidních hormonů a při aktivaci deaktivaci xenobiotik, včetně kancerogenů. Rozsáhlý systém P-450 využívá molekulární kyslík v důležitých, buněčných, hostitelských reakcích. Podobným způsobem využívá příroda volné radikály v mnoha různých enzymových reakcích.

Nadměrná koncentrace různých forem kyslíku a volných radikálů může způsobit vážné poškození živých systémů, včetně peroxidace membránových lipidů, hydroxylace bází nukleových kyselin a oxidace sulfurhydrylových skupin a dalších citlivých skupin v proteinech. Pokud jde o nekontrolovaný děj následují mutace a buněčná smrt.

Biologické antioxidanty zahrnují dobře definované enzymy jako jsou hyperoxidová dismutáza, kataláza, selenium glutathion peroxidáza a fosfolipid hydroperoxid glutathion peroxidáza. Neenzymatické biologické antioxidanty zahrnují tokoferoly a tokotrienoly, karotenoidy, chinony, bilirubin, kyselinu askorbovou, kyselinu močovou a proteiny, které váží kovy. Různé antioxidanty, ať mastné nebo vodorozpustné, se nalézají ve všech částech buněk a tkání, ačkoliv každý jednotlivý antioxidant často vykazuje vlastní charakteristickou distribuci. Tzv. ovothioly, což jsou merkaptohistidinové deriváty, také rozkládají peroxidy neenzymaticky.

O volných radikálech, zejména volných radikálech odvozených od molekulárního kyslíku se soudí, že hrají zásadní roli ve velkém množství biologických jevů. Očekává se, že mnoho z tzv. kritických nemocí zahrnuje patofyziologii kyslíkovými radikály („oxyradikál“) (Zimmermen JJ (1991) Chest 100: 189S). Oxyradikálové poškození může být důvodem patogenezeplicní toxicity kyslíku, syndromem respirační tísně dospělých (adult respirátory distress syndrome (ARDS)), bronchopulmonámí dysplasií, septickým syndromem a různými ischemicko-reperfuzními syndromy, včetně infarktu myokardu, mrtvice, srdečního selhání, transplantace orgánů, nekrotizující enterokolitida, akutní ledvinová nekróza a dalších nemocí. Oxyradikály mohou reagovat s proteiny, nukleovými kyselinami, lipidy a dalšími biologickými makromolekulami tak, že dochází k poškození buněk a tkání, zejména u vážně nemocných pacientů.

-1 CZ 296288 B6

Volné radikály jsou atomy, ionty nebo molekuly, které obsahují nepárový elektron (Pryor, WA (1976) Free Radicals in Biol. 1: 1). Volné radikály jsou obvykle nestabilní a vykazují krátký poločas života. Kyslík jako prvek je vysoce elektronegativní a snadno přijímá jeden elektron přenosem z cytochromů a jiných redukovaných buněčných složek, část O₂, který spotřebovává buňka při aerobní respiraci se redukuje na hyperoxidový radikál (·Ο₂~) (Cadenas E (1989) Ann. Rev. Biochem. 58: 79). Další redukcí *O₂“ vzniká peroxid vodíku (H₂O₂), hydroxylový radikál (•OH) a voda.

Volné radikály mohou pocházet z mnoha zdrojů, včetně aerobní respirace, monooxygenaČních reakcí léků a xenobiotik (např. trichlormethylových radikálů, CC1₃·, tvořených oxidací tetrachlormethanu) katalyzovaných cytochromem P-450 a ionizujícího záření. Například pokud jsou tkáně vystaveny působení gama záření, většina energie pohlcené buňkami je absorbována vodou a vede k štěpení kovalentní vazby kyslík - vodík ve vodě, kdy jeden z elektronů zůstává na vodíku a jeden na kyslíku tak, že vznikají dva radikály H· a ·ΟΗ. Hydroxylový radikál, ·ΟΗ, je nejreaktivnější radikál známý v chemii. Reaguje s biomolekulami a vyvolává řetězové reakce a může reagovat spurinovými nebo pyrimidinovými bázemi nukleových kyselin. Kancerogeneze vyvolaná zářením může být inicializována poškozením volnými radikály (BreimerLH (1988) Brit. J. Cancer 57: 6). Také například „oxidativní přetržení“ aktivovaných neutrofílů hojně vede k hyperoxidovým radikálům, o kterých se předpokládá, že jsou zásadním faktorem cytotoxického vlivu aktivovaných neutrofílů. Reperfuze ischemické tkáně také vede k vysoké koncentraci oxyradikálů, zejména hyperoxidu (Gutteridge JMC a Halliwell B (1990) Arch. Biochem. Biophvs. 283: 223). Navíc hyperoxid může být produkován fyziologicky endotheliálními buňkami pro reakci s oxidem dusičným, fyziologickým regulátorem, za tvorby peroxodusitanu, ONOCT, který se může rozpadat a zvyšovat množství hydroxylového radikálu, ·ΟΗ (Marletta MA (1989) Trends Biochem. Sci. 14: 488, Moncada a kol. (1989) Biochem. Pharmacol. 38: 1709, Saran a kol. (1990) Free Rad. Res. Commun. 10: 221, Beckman a kol. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. (U.S.A) 87: 1620). Další zdroje oxyradikálů jsou „únik“ elektronů z poškozených transportních řetězců elektronů mitochondrií nebo endoplazmatického retikula, syntéza prostaglandinů, oxidace katecholaminů a aktivace destiček.

Mnoho reakcí volných radikálů je velmi škodlivých pro buněčné složky, dochází k zesíťování proteinů, mutagenezi DNA a peroxidaci lipidů. Pokud již vzniknou, mohou volné radikály interagovat za vzniku dalších volných radikálů a neradikálových oxidantů jako je singletový kyslík (*Ο₂) a peroxidy. Odbourávání některých produktů reakcí volných radikálů může případně vést k vzniku škodlivých chemických látek. Například malondialdehyd je reakční produkt peroxř dizovaných lipidů, který reaguje s jakoukoliv molekulou, která obsahuje amin. Kyslíkové volné radikály také způsobují oxidativní modifikaci proteinů (Stadtman ER (1992) Science 257: 1220).

Aerobní buňky obecně obsahují množství obranných mechanizmů proti škodlivým účinkům oxyradikálů a jejich reakčních produktů. Hyperoxid dismutázy (SOD) katalyzuje reakci:

·Ο₂ + 2 H⁺-----> O₂ + H₂O₂, která odstraňuje hyperoxid a tvoří peroxid vodíku. H₂O₂ není radikál, ale je pro buňky toxický, odstraňuje se enzymaticky katalázou glutathion peroxidázu (GSH-Px). Kataláza katalyzuje reakci:

H₂O₂-----> 2 H₂O + O₂ a GSH-Px) odstraňuje peroxid vodíku tak, že jej využívá k oxidaci redukovaného glutathionu (GSH) na oxidovaný glutathion (GSSG) podle následující reakce:

GSH + H₂O₂----> GSSG + 2 H₂O.

-2CZ 296288 B6

Jiné enzymy, jako je fosfolipid hydroperoxid glutathion peroxidáza (PLOOH-GSH-Px), převádějí reaktivní fosfolipid hydroperoxidy, hydroperoxidy volných mastných kyselin a hydroperoxidy cholesterolu na příslušné neškodné alkoholy odvozené od mastných kyselin. Glutathion Stransferázy se také podílí na detoxifíkaci organických peroxidů. Za nepřítomnosti těchto enzymů a v přítomnosti přechodných kovů, jako je železo nebo měď, se mohou hyperoxid a peroxid vodíku účastnit následujících reakcí, ve kterých vzniká extrémně reaktivní hydroxylový radikál •OH:

•O₂“ + Fe³⁺--> O₂ + Fe²⁺

H₂O₂ + Fe²⁺--> ·ΟΗ + OH“ + Fe³⁺.

Kromě enzymatické detoxifikace volných radikálů a oxidačních činidel existuje také množství nízkomolekulárních antioxidantů, jako je glutathion, askorbát, tokoferol, ubichinon, bilirubin a kyselina močová, které slouží jako přirozené, fyziologické antioxidanty (Krinsky NI (1992) Proč. Soc. Exp. Biol. Med. 200: 248-54). Karotenoidy jsou další skupinou nízkomolekulárních antioxidantů a používají se jako ochrana proti oxidativnímu stresu a při chronických onemocněních. Canfíeld a kol. (1992) Proč. Soc. Exp. Biol. Med. 200: 260 sumarizuje popsané vztahy mezi karotenoidy a různými chronickými chorobami, včetně koronární nemoci srdce, kataraktu a rakoviny. Karotenoidy u některých pacientů výrazně snižují vznik určitých premalignantních podmínek, jako je leukoplakia.

V úsilí o prevenci škodlivých vlivů při tvorbě oxyradikálů během reoxygenace ischemické tkáně se používalo mnoho různých antioxidantů.

Jedním přístupem k prevenci poškození vyvolaného oxyradikály je zabránění tvorby oxyradikálů jako je hyperoxid. Chelátory iontů železa, jako je desferrioxamin (také nazývaný deferoxamin nebo Desferol) a další, inhibují tvorbu ·ΟΗ závislou na iontech železa a tak působí jako inhibitory tvorby volných radikálů (Gutteridge a kol. (1979) Biochem. J. 184: 469, HalliwelB (1989) Free Radical Biol. Med. 7: 645, Van der Kraaij a kol. (1989) Circulation 80: 158). Antioxidanty založené na amino-steroidní bázi jako jsou 21-aminosteroidy zvané „lazaroidy“ (např. U74006F) byly také navrženy jako inhibitory tvorby oxyradikálů. Desferrioxamin, allopurinol a další pyrazolopyrimidiny jako je oxypurinol, byly také testovány jako prevence tvorby oxyradikálů v modelovém systému myokardu (Bolli a kol. (1989) Circ Res. 65: 607) a při hemorrhagickém a endotoxickém šoku (DeGaravilla a kol. (1992) Drug Devel. Res. 25: 139). Nicméně každá z těchto sloučenin má při terapeutickém využití znatelné nevýhody. Například deferoxamin není ideální chelátor železa a jeho průchod do buňky je omezený.

Jiný přístup k prevenci poškození vyvolaného oxyradikály je katalytické odstraňování oxyradikálů jako je hyperoxid. Hyperoxid dismutáza a kataláza byly s určitým úspěchem intenzívně zkoumány jako ochranná činidla pokud se podávají k reperfuzátům v mnoha různých typech experimentů nebo pokud se podávají preischemicky (review v Gutteridge JMC a Halliwel B (1990) Arch. Biochem. Biophvs. 283: 223). Schopnost hyperoxid dismutázy získá na ceně při podávání SOD při léčení nebo prevenci různých medicínských stavů včetně reperfuzních zranění mozku a míchy (Uyama a kol. (1990) Free Radíc. Biol. Med. 8: 265, Lim a kol. (1986) Ann. Thorac. Surg. 42:282), endotoxemie (Schneider a kol. (1990) Circ. Shock 30: 97, Schneider a kol. (1989) Prog. Clin. Biol. Res. 308: 913) a infarktu myokardu (Patel a kol. (1990) Am. J. Physiol. 258: H369, Mehta a kol. (1989) Am. J. Physiol. 257: H1240, Nejima a kol. (1989) Circulation 79: 143, Finkce a kol. (1988) Arzneimittelforschung 38: 138, Ambrosio a kol. (1987) Circulation 75: 282) a osteoartritické a intestinální ischémie (Vohra a kol. (1989) J. Pediatr. Surg· 24: 893, Flohe L (1988) Mol. Cell. Biochem. 84: 123). O hyperoxid dismutáze bylo také popsáno, že má kladný vliv na léčení Crohnovy nemoci, lupus erythromatodes, žaludečních vředů, popálenin, toxicity kyslíku, selhání ledvin následkem transplantace a infekce herpes viry.

-3CZ 296288 B6

Alternativní přístup k prevenci poškození vyvolaného oxyradikály je lapání oxyradikálů jako je hyperoxid, obvykle nízkomolekulární lapači, které spíše než katalyticky působí stechiometricky. Látky odvozené od glutathionu byly využívány u různých modelových zvířat pro zeslabení poškození způsobeného oxyradikály. Například o TV-2-merkaptopropionylglycinu bylo zjištěno, že má ochranný vliv na myokardickou ischemii a reperfuzi u psů (Mitsos a kol. (1986) Curculation 73: 1077) a V-acetylcystein („Mucomyst“) byl použit pro léčení endotoxinové toxicity u ovcí (Bernard a kol. (1984) J, Clin. Invest. 73: 1772). O dimethylthiomočovině (DMTU) a butyl-cc-fenylnitronu (BPN) se předpokládá, že lapají hydroxylové radikály ·ΟΗ a ukazuje se, že snižují ischemicko-reperfuzní poškození u myokardu krys a králíků (Vander Heide a kol. (1987) J. Mol. Cell. Cardiol. 19: 615, Kennedy a kol. (1987) J Appl. Physiol. 63: 2426). Jako lapač volných radikálů se také používal mannitol, aby se snížilo poškození orgánů reoxygenací (Fox RB (1984) J. Clin. Invest. 74: 1456, Ouriel a kol. (1985) Circulation 72: 254). Jedna zpráva uvádí příklad nízkomolekulárního chelátu, který má aktivitu jako glutathion peroxidáza (Spector a kol. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 90: 7485).

Použití inhibitorů tvorby oxyradikálů a/nebo enzymů, které odstraňují hyperoxid a peroxid vodíku a/nebo nízkomolekulárních lapačů oxyradikálů je slibné pro prevenci reoxygenačního poškození, ke kterému může dojít v mnoha ischemicky patologických stavech a pro léčení nebo prevenci různých nemocí, které souvisí s volnými radikály. Nicméně každá z těchto skupin má některé nevýhody. Například inhibitory tvorby oxyradikálů obvykle chelatují přechodné kovy, které se využívají v důležitých enzymatických procesech v normálním fyziologickém stavu a při dýchání, navíc, dokonce i ve velmi vysokých dávkách, nebrání tyto inhibitory kompletně tvorbě oxyradikálů. Hyperoxid dismutáza a kataláza jsou velké polypeptidy, které je velmi drahé vyrobit, neprocházejí do buňky a skrz hematocerebrální bariéru a obecně je nutné podávat je parenterálně. Lapače volných radikálů působí stechiometricky a proto se rychle vyčerpají a musí se podávat ve vysokých dávkách, aby byly účinné.

Na základě výše uvedeného, je jasné, že je velká potřeba antioxidačního činidla, které je účinné při odstraňování oxyradikálů, zejména hyperoxidu a peroxidu vodíku, jehož výroba je levná, je stabilní a má výhodné farmakokinetické vlastnosti jako je schopnost procházet skrz hematocerebrální bariéru a procházet tkáněmi. Takovéto mnohostranné antioxidanty by nalezly využití ve farmacii, jako chemická ochrana a jako doplněk výživy. Jedním z předmětů předkládaného vynálezu je poskytnout novou třídu antioxidantů, které mají výhodně farmakologické vlastnosti a které katalyticky a/nebo stechiometricky odstraňují hyperoxid a/nebo peroxid vodíku.

Reference, které jsou zde diskutovány, jsou zde uvedeny pouze kvůli objevům, které popisují a které vznikly před datem přihlášení předkládaného vynálezu. Nic z toho, co je zde uvedeno, není přiznáním vynálezců, že by vynález provedli na základě předchozích vynálezů. Všechny publikace, které jsou zde uvedeny, jsou zároveň referencemi.

-4CZ 296288 B6

Podstata vynálezu

Vynález se týká farmaceutického prostředku pro prevenci nebo léčení nemocí, které souvisí s volnými radikály, který jako účinnou složku obsahuje antioxidační komplex salen-kov ve farmaceuticky přijatelné formě přičemž antioxidační komplex salen-kov je sloučenina obecného vzorce I:

R.

(I) kde M je vybráno ze skupiny sestávající z Mn, Co, Fe, V, Cr a Ni, A je anion vybraný ze skupiny sestávající z negativně nabitých skupin PF₆, (aryl)₄, BF₄, B(aryl)₄, halogenidů, acetátů, triflátů a tosylátů nebo chybí, n je 0, 1 nebo 2,

Xi, X₂, X₃ a X₄ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, silylů, arylů, které sestávají z jednoho kruhu nebo z více kondenzovaných kruhů, které jsou nesubstituovány nebo výhodně substituovány, arylalkylů -R-Ar a -R-HetAr, kde Ar je arylová skupina, HetAr je heteroarylová skupina a R je alifatická skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem, které jsou případně dále substituovány, primárních alkylů, sekundárních alkylů, terciárních alkylů, kde alkyl je cyklická aikylová skupina nebo aikylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem, sestávající z jednoho až dvanácti atomů uhlíku a obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku, alkoxyskupin -O-R, kde R je aikylová skupina nesubstituovaná nebo substituovaná jedním nebo více substituenty vybranými z halogenu, alkylu, alkylthiolu, trifluormethylu, acyloxylu, hydroxylu, thiolu, karboxylu, aryloxylu, arylu, arylalkylů, heteroarylu, aminoskupiny, alkylaminoskupiny, dialkylaminoskupiny, morfolinu, piperidinu, pyrrolidin-l-ylu nebo piperazin-l-ylu, aryloxyskupin -Ο-Ar, kde Ar je aryl nebo aromatická skupina, aminoskupin, kvartérních aminů, heteroatomů a vodíku,

Yi, Y₂, Y₃, Y₄, Y₅ a Y₆ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, halogenů, alkylů sestávajících z jednoho až dvanácti atomů uhlíku, kde alkyl je cyklická aikylová skupina nebo aikylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem, obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku, arylů, které sestávají z jednoho kruhu nebo zvíce kondenzovaných kruhů, které jsou nesubstituovány nebo výhodně substituovány, arylalkylů -R-Ar a -R-HetAr, kde Ar je arylová skupina, HetAr je heteroarylová skupina a R je alifatická skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem, které jsou případně dále substituovány, silylů, aminoskupin, alkylů sestávajících z jednoho až dvanácti atomů uhlíku, kde alkyl je cyklická aikylová skupina nebo aikylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem, obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku, arylů, které sestávají z jednoho kruhu nebo zvíce kondenzovaných kruhů, které jsou nesubstituovány nebo výhodně substituovány, arylalkylů -R-Ar a -R-HetAr, kde Ar je arylová skupina, HetAr je heteroarylová skupina a R je alifatická skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem, které jsou případně dále substituovány, které nesou heteroatomy a halogen a

-5 CZ 296288 B6

Ri, R₂, R₃ a R₄ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, arylů, které sestávají z jednoho kruhu nebo zvíce kondenzovaných kruhů, které jsou nesubstituovány nebo výhodně substituovány, arylalkylů -R-Ar a -R-HetAr, kde Ar je arylová skupina, HetAr je heteroarylová skupina a R je alifatická skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem, které jsou případně dále substituovány, esterů mastných kyselin, což jsou substituenty odvozené odtržením atomu vodíku od mastných kyselin vybíraných ze skupiny sestávající z kyseliny palmitolejové, olejové, petroselenové, vakcenové, punikové, parinakové, gadolejové, cetolejové, linolové, linolenové, arachidonové, laurové, myristové, palmitové, stearové, eikosanové, dokosanové, substituovaných alkoxyarylů -O-R-Ar, kde R je cyklická alkylová skupina nebo alkylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem sestávající z jednoho až dvanácti atomů uhlíku a obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku, a Ar je aromatický substituent, primárních alkylů, sekundárních alkylů a terciárních alkylů, kde alkyl je cyklická alkylová skupina nebo alkylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem, sestávající z jednoho až dvanácti atomů uhlíku a obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku.

V souladu s výše uvedenými skutečnostmi jsou jedním z aspektů předkládaného vynálezu farmaceutické prostředky, které jsou účinnými antioxidanty a/nebo mají schopnost lapat volné radikály a fungují jako in vivo antioxidanty. Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují účinnou dávku přinejmenším jednoho komplexu salen-přechodný kov, obvykle komplexu salen-mangan jako je komplex salen-Mn(III). V jednom příkladu obsahuje farmaceutický prostředek komplex salen-Mn, který je chelátem Mn(III) s derivátem diaminu jako je ethylendiamin vázaná ke dvěma substituovaným salicylaldehydům. Tyto farmaceutické prostředly vykazují hyperoxid dismutázovou aktivitu a, s výhodou, také přeměňují peroxid vodíku na vodu (tj. katalázová aktivita). Farmaceutické prostředky jsou účinné při snižování patologického poškození, které je způsobeno tvorbou, oxyradikálů jako je hyperoxid a peroxidy a ostatní látky založené na volných radikálech.

Předkládaný vynález také poskytuje použití výše uvedeného komplexu salen-kov pro přípravu léčiva pro léčení a prevenci patologických stavů. Takovýchto prostředek, který obsahuje komplex salen-přechodný kov se podá v terapeutické nebo profylaktické dávce. Komplexy salen-přechodný kov, které se používají v metodách podle předkládaného vynálezu jsou obvykle komplexy salen-mangan, jako jsou komplexy salen-Mn(III). Předkládaný vynález poskytuje způsoby prevence nebo snížení ischemicko-reperfuzního poškození v tak citlivých tkáních jako je myokard a centrální nervová soustava. Předkládaný vynález také poskytuje způsoby prevence nebo snížení poškození buněk, které je způsobeno vystavením různým chemikáliím, které produkují potenciálně nebezpečné volné radikály, které spočívají v podávání prostředků, které obsahují přinejmenším jeden komplex salen-přechodný kov v terapeutické nebo profylaktické dávce, s výhodou komplex salen-mangan, který má znatelnou SOD aktivitu a který má znatelnou katalázovou aktivitu.

Antioxidační komplex salen-přechodný kov podle předkládaného vynálezu lze podávat mnoha různými způsoby, včetně parenterálního, povrchového a orálního.

V jednom aspektu předkládaného vynálezu je terapeutická nebo profylaktické dávka komplexu salen-přechodný kov podle předkládaného vynálezu podávána samostatně nebo v kombinaci s (1) jedním nebo více antioxidačními enzymy, jako je Mn-SOD a Cu, Zn-SOD nebo kataláza a/nebo (2) s jedním nebo více lapači volných radikálů jako je tokoferol, askorbát, glutathion, DMTU, A-acetylcystein nebo TV-2-merkaptopropionylglycin a/nebo (3) s jedním nebo více inhibitory oxyradikálů jako je desferrioxamin nebo allopurinol a/nebo jedním nebo více agens, která působí jako biologické modifíkátory, jako jsou inhibitory kalpainu. Složení těchto prostředků závisí na určitém patologickém stavu, který se má léčit, na způsobu podávání, na věku, pohlaví a stavu pacienta. Prostředky se podávají při různých indikacích včetně (1) prevence ischemickoreoxygenačního poškození, (2) ochrana orgánů před transplantací v anoxickém, hypoxickém nebo hyperoxickém stavu před transplantací, (3) pro ochranu normální tkáně před poškozením volnými radikály, které následuje po vystavení ionizujícímu záření a/nebo chemoterapii, např.

-6CZ 296288 B6 bleomycinem, (4) pro ochranu buněk a tkání před poškozením volnými radikály, které následuje po vystavení xenobiotikům, které tvoří volné radikály, buď přímo, nebo jako následek monooxygenace systémem cytochromu P-450, (5) pro zlepšení ochrany buněk, tkání orgánů a organizmů chladem, zvýšením životnosti znovu získaných vzorků a (6) pro profylaktické podávání jako prevence proti rakovině, stárnutí buněk, vzniku kataraktu, tvorbě aduktů malondialdehydu, HIV a makromolekulámímu zesíťování jako je zesíťování kolagenu.

V jednom aspektu předkládaného vynálezu je komplex salen-přechodný kov připraven pro orální podávání tvorbou farmaceutické dávky, která obsahuje excipient a ne méně než 1 pg nebo více než 10 gramů přinejmenším jednoho antioxidačního komplexu salen-přechodný kov podle předkládaného vynálezu. Výživové prostředky se podávají při léčení nemocí vyvolanýchvolnými radikály a/nebo při chemoprevenci neoplasie a/nebo oxidativního poškození, které souvisí s normálním aerobním mechanizmem.

V dalším aspektu předkládaného vynálezu se pufrovaný vodný roztok přinejmenším jednoho antioxidačního komplexu salen-přechodný kov podle předkládaného vynálezu v koncentraci přinejmenším 1 nM, ale ne vyšší než 100 mM připravuje pro podávání, obvykle v koncentraci 0,1 až 10 mM, obvykle intravenózní cestou pacientovi, který prodělal nebo se očekává, že prodělá (1) ischemickou příhodu, jako je infarkt myokardu, cerebrální ischemickou příhodu, transplantaci, srdeční operaci, operaci koronárních cév, operaci mozku, selhání ledvin, traumatické krvácení, (2) protinádorovou chemoterapii, která je prováděna látkami, které produkují volné radikály, (3) endotoxický šok nebo sepsi, (4) vystavení ionizujícímu záření, (5) vystavení exogenním chemickým sloučeninám, které jsou volné radikály, nebo produkují volné radikály, (6) tepelné nebo chemické popálení (7) pobyt v atmosféře s vyšším obsahem kyslíku nebo (8) apoptózu určené populace buněk (např. apoptóza lymfocytů). Pufrované vodné roztoky podle předkládaného vynálezu lze také použít, obvykle ve spojení s jinými zavedenými způsoby, pro kultury orgánů, buněčné kultury, udržování transplantovaných orgánů a zavlažování myokardu. Popisovány jsou také nevodné prostředky jako jsou prostředky založené na lipidech, včetně stabilizovaných emulzí. Antioxidační prostředky salen-kov jsou podávány různými způsoby včetně intravenózních injekcí, intramuskulámích injekcí, subdermálních injekcí, intraperikardiálních injekcí, povrchových aplikací, oftalmologických aplikací, výplachů, klystýrů, intraperitoneálních infúzí, inhalace, výplachů úst a dalších způsobů v závislosti na určitém medicínském nebo veterinárním použití.

V dalším aspektu předkládaného vynálezu se antioxidační komplexy salen-transitní kov podle předkládaného vynálezu používají k modulaci exprese přirozeně se vyskytujících genů nebo jiných polynukleotidových sekvencí, které kontrolují prvky odpovědi na oxidativní stres (např. prvek antioxidační odpovědi - ARE), jako je prvek antioxidační odpovědi genu glutathion Stransferázy nebo gen NAD(P)H chinon reduktázy. Antioxidační komplexy salen-kov lze použít k modulaci transkripce ARE regulovaných sekvencí v buněčných kulturách (např. ES buněk) a u celých zvířat, zejména u transgenních zvířat, ve kterých transgen obsahuje jednu nebo více ARE transkripcí regulovaných sekvencí.

Předkládaný vynález také obsahuje farmaceutické prostředky, které obsahují antioxidační komplexy salen-mangan, terapeutické užití takových antioxidačních komplexů salen-mangan v diagnostice, terapii a výzkumných účelech v lidské a veterinární medicíně.

Vynález také poskytuje způsoby prevence kazivosti potravin a oxidace aplikací účinného množství přinejmenším jednoho antioxidačního komplexu salen-kov do potravin. Vynález také poskytuje prostředky pro prevenci kazivosti potravin, které obsahují účinné množství přinejmenším jednoho antioxidačního komplexu salen-kov nepovinně přinejmenším s jednou další látkou, která chrání potraviny (např. butylovaný hydroxytoluen, butylovaný hydroxyanisol, sírany, dusičnan sodný, dusitan sodný). Například antioxidační komplex salen-kov se umísťuje do jídla, aby se snížila rychlost oxidačního rozkladu jídla, které je vystaveno molekulárnímu kyslíku.

-7CZ 296288 B6

Všechny publikace a patenty, které jsou v tomto dokumentu uvedeny jsou uvedeny jako reference.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 zobrazuje obecnou strukturu derivátů šálenu podle předkládaného vynálezu.

Obr. 2 zobrazuje derivát šálenu podle obecného vzorce uvedeného v Obr. 1, kde n je 0.

Obr. 3 zobrazuje struktury preferovaných sloučenin podle předkládaného vynálezu.

Obr. 4 zobrazuje schematicky vliv ischemicko—reoxygenačního děje na synaptický přenos v izolovaných vrstvičkách mozku.

Obr. 5 zobrazuje vliv komplexu salen-mangan na amplitudu EPSP, která následuje ischemickoreoxygenační děj.

Obr. 6 zobrazuje vliv komplexu salen-mangan na výchozí sklon EPSP, který následuje ischemicko-reoxygenační děj.

Obr. 7 zobrazuje vliv komplexu salen-mangan na průchodnost vrstviček mozku, která následuje ischemicko-reoxygenační děj.

Obr. 8 zobrazuje ochranný vliv komplexu salen-mangan u zvířat postižených iatrogenní Parkinsonovou nemocí.

Obr. 9 zobrazuje jak C7 chrání hippokampální vrstvičky před peroxidací lipidů vyvolanou kyselinou mléčnou.

Obr. 10 zobrazuje jak C7 chrání dopaminergické neurony u myší před degradací vyvolanou 6-OHDA.

Obr. 11 zobrazuje jak C7 chrání dopaminergické neurony u myší před degradací vyvolanou MPTP.

Definice

Pokud není dále definováno jinak, všechny technické a vědecké termíny, které se používají v tomto dokumentu, mají stejný význam jaký se běžně rozumí v problematice, do které tento vynález spadá. Ačkoliv lze k provedení předkládaného vynálezu použít kterékoliv ze způsobů a materiálů, které jsou podobné nebo stejné jako ty popsané v předkládaném vynálezu, preferované způsoby a materiály jsou popsány v tomto dokumentu. Pro účely předkládaného vynálezu jsou dále definovány následující termíny.

Tak jak se používá v tomto dokumentu „antioxidant“ je látka, která pokud je přítomna ve směsi nebo struktuře, která obsahuje oxidovatelné biologické molekuly, znatelně oddaluje nebo brání oxidaci těchto biologických molekul. Antioxidant může působit lapáním biologicky důležitých volných radikálů nebo jiných reaktivních kyslíkatých látek (·Ο₂ , H₂O₂, ·ΟΗ, HOCL, ferryl, peroxyl, peroxodusitan a alkoxyl) nebo působí preventivně proti jejich vzniku nebo převádí katalyticky volné radikály nebo jiné reaktivní kyslíkaté látky na méně reaktivní látky. Antioxidační komplex salen-přechodný kov podle předkládaného vynálezu má obecně znatelnou SOD aktivitu. Komplex salen-přechodný kov podle předkládaného vynálezu má antioxidační aktivitu, pokud tento komplex způsobí po přidání k buněčné kultuře nebo vzorku znatelné snížení množství volných radikálů, jako je hyperoxid nebo neradikálových reaktivních kyslíkatých látek, jako je

-8CZ 296288 B6 peroxid vodíku, ve srovnání se souběžně pěstovanou buněčnou kulturou nebo vzorkem, na který se nepůsobí komplexem. Vhodné koncentrace (tj. účinná dávka) lze stanovit různými způsoby, včetně generace empirické křivky dávka-odpověď, předpovědí síly a účinnosti pomocí metod QSAR nebo molekulárního modelování a dalších způsobů, které se používají ve farmacii. Protože oxidativní poškození je obecně kumulativní, neexistuje minimální prahová dávka, která by byla účinná, ačkoliv se u určitých nemocí dají stanovit minimální dávky, při kterých dochází k zaznamenatelnému terapeutickému nebo profylaktickému efektu. Antioxidační komplex salen-kov podle předkládaného vynálezu mohou mít glutathionperoxidázovou aktivitu.

Tak, jak se používá v tomto dokumentu „komplex salen-přechodný kov“ znamená sloučeninu, která má strukturu podle obecného vzorce I, obecného vzorce II, obecného vzorce III, obecného vzorce IV, obecného vzorce V, obecného vzorce VI, obecného vzorce VII, obecného vzorce VIII, obecného vzorce IX (viz dále) nebo kteroukoliv ze struktur Cl, C4, C6, C7, C9, C10, Cl 1, Cl2, C15, C17, C20, C22, C23, C25, C27, C28, C29 a C30 jak je vyobrazeno na obr. 3 a dále a s výhodou má strukturu, která odpovídá jedné ze struktur zobrazených na obr. 3 vybraných ze skupiny sestávající z C6, C7 a C12, ještě výhodněji má strukturu odpovídající C7 nebo C12 pro katalytické odstraňování hyperoxidu. Přechodný kov je obvykle vybrán ze skupiny sestávající z Mn, Mg, Co, Fe, V, Cr a Ni a nejvýhodněji Mn nebo Mg.

Tak, jak se používá v tomto dokumentu „nemoc, která souvisí s volnými radikály“ se vztahuje k patologickým stavům jedince, které vznikají přinejmenším částečně z tvorby nebo působení volných radikálů, zejména oxyradikálů a dalších reaktivních kyslíkatých látek in vivo. Tomu, kdo je vzdělán v této problematice je jasné, že většina patologických stavů souvisí s mnoha faktory, které přispívají k nemoci a označit nebo identifikovat hlavní příčinný faktor(y) pro jakýkoliv jednotlivý patologický stav je často extrémně obtížné. Z těchto důvodů, termín „nemoc“, která souvisí s volnými radikály“ zahrnuje patologické stavy, o kterých se v této problematice předpokládá, že poškození volnými radikály nebo reaktivními kyslíkatými látkami přispívá k nemoci nebo kde podávání inhibitoru volných radikálů (např. desferrioxaminu), lapače (např. tokoferol, glutathion) nebo katalyzátoru (např. SOD, kataláza) vede k znatelnému snížení symptomů, zvýšení šance na přežití nebo poskytne jiné znatelné klinické výhody při léčení nebo prevenci patologických stavů. Například, ale tyto příklady nejsou nijak omezující, nemoci, které jsou zde uvedeny se pokládají za nemoci, které souvisí s volnými radikály (např. ischemické reperfuzní poškození, zánětlivé nemoci, lupus erythematodes, infarkt myokardu, poškození míchy, Crohnova nemoc, autoimunitní nemoci (např. revmatická artritida, cukrovka), tvorba kataraktu, rozedma plic, žaludeční vředy, otrava kyslíkem, nádor nežádoucí apoptosa buněk, nemoc z ozáření a další patologické stavy, které jsou diskutovány v oddíle „Dosavadní stav techniky“ a dále).

Tak jak se používají v tomto dokumentu se termíny „SOD mimetický“ „hyperoxid dismutáza mimetický“ a „hyperoxid katalytický“ týkají sloučenin, které mají znatelnou katalytickou aktivitu při odstraňování hyperoxidu jak bylo určeno zkouškou. Obecně má SOD mimetická látka přinejmenším 0,001 procenta SOD aktivity lidského Mn-SOD nebo Zn, Cu-SOD na molámím základě, která byla určena standardními testovacími způsoby a/nebo má přinejmenším 0,01 jednotky aktivity SOD na mM podle SOD testu, který je použit dále a s výhodou přinejmenším 1 jednotku aktivity SOD na mM.

Termín „alkyl“ znamená cyklickou nebo případně rozvětvenou alkylovou skupinu, která sestává pouze z uhlíkových a vodíkových atomů a pokud není uvedeno jinak obsahuje jeden až dvanáct atomů uhlíku. Tento termín je dále vymezen skupinami jako je methyl, ethyl, w-propyl, izobutyl, Zerc-butyl, pentyl, pivalyl, heptyl, adamantyl a cyklopentyl. Alkylová skupina může být případně substituovaná jedním nebo více substituenty, např. halogenem, alkylem, alkoxyskupinou, alkylthioskupinou, trifluormethylem, acyloxyskupinou, hydroxyskupinou, merkaptoskupinou, karboxylem, aryloxyskupinou, arylem, arylalkylem, heteroarylem, aminoskupinou, alkylaminoskupinou, dialkylaminoskupinou, morfolinylem, piperidinylem, pyrrolidm-l-ylem, piperazin-l-ylem nebo jiným substituentem.

-9CZ 296288 B6

Termín „nižší alkyl“ znamená cyklický nebo případně rozvětvený jednovazný alkylový zbytek, který sestává z jednoho až šesti atomů uhlíku. Tento termín je dále vymezen skupinami jako je methyl, ethyl, n-propyl, z-propyl, w-butyl, /erc-butyl, z-butyl (nebo 2-methylpropyl), cyklopropylmethyl, z-amyl, zz-amyl a hexyl.

Termín „aryl“ nebo „Ar“ znamená jedno vaznou, nenasycenou, aromatickou, karbocyklickou skupinu, která sestává z jednoho kruhu (např. fenyl) nebo více kondenzovaných kruhů (např. naftyl nebo anthryl), která může být případně substituována např. halogenem, alkylem, alkoxyskupinou, alkylthioskupinou, trifluoromethylem, acyloxyskupinou, hydroxyskupinou, merkaptoskupinou, karboxylem, aryloxyskupinou, arylem, arylalkylem, heteroarylem, aminoskupinou, alkylaminoskupinou, dialkylaminoskupinou, morflinylem, piperidylem, pyrrolidin-l-ylem, piperazin-1ylem nebo jiným substituentem.

Termín „substituovaná alkoxyskupina“ označuje skupinu, která má strukturu -O-R, kde R je alkyl, který je substituovaný neinterferujícím substituentem. Termín „arylalkoxylová skupina“ označuje skupinu, která má strukturu -O-R-Ar, kde R je alkyl a Ar je aromatický substituent. Arylalkoxysubstituenty jsou podtřídou substituovaných alkoxyskupin. Příklady preferovaných substituovaných alkoxylových skupin jsou benzyloxy, naftyloxy a chlorbenzyloxy.

Termín „aryloxyskupina“ označuje skupinu, která má strukturu -Ο-Ar, kde Ar je aromatická skupina. Preferovaná aryloxy skupina je fenoxy.

Termín „heterocyklus“ označuje jednovaznou, nasycenou, nenasycenou nebo aromatickou, karbocyklickou skupinu, která má jeden kruh (např. morfolinyl, pyridyl nebo furyl) nebo několik kondenzovaných kruhů (např. indolizinyl nebo benzo[b]thienyl), a který obsahuje přinejmenším jeden heteroatom jako je N, O, P nebo S v kruhu, a který může být případně substituovaný např. halogenem, alkylem, alkoxyskupinou, alkylthioskupinou, trifluormethylem, acyloxyskupinou, hydroxyskupinou, merkaptoskupinou, karboxyskupinou, aryloxyskupinou, arylem, arylalkylem, heteroarylem, aminoskupinou, alkylaminoskupinou, dialkylaminoskupinou, morfolinylem, piperidylem, pyrrolidin-l-ylem, piperazin-l-ylem nebo dalších skupin. Termín „heteroaryl“ nebo „HetAr“ označuje aromatický heterocyklus.

„Arylaikylová skupina“ označuje skupinu -R-Ar a -R-HetAr, kde Ar je arylová skupina, HetAr je heteroaryl a R je alifatická skupina s případně rozvětveným řetězcem. Příklady arylalkylových skupin jsou benzyl a furfuryl. Arylalkylové skupiny mohou být volitelně substituované např. halogenem, alkylem, alkoxyskupinou, alkylthioskupinou, trifluormethylem, acyloxyskupinou, hydroxyskupinou, merkaptoskupinou, karboxyskupinou, aryloxyskupinou, arylem, arylalkylem, heteroarylem, aminoskupinou, alkylaminoskupinou, dialkylaminoskupinou, morfolinylem, piperidylem, pyrrolidin-l-ylem, piperazin-l-ylem nebo dalšími skupinami.

Tak, jak se používá v tomto dokumentu znamená termín „halo“ nebo „halogen“ fluor, brom, chlor a jod.

Tak, jak se používá ve strukturách, které jsou uvedeny dále „OBn“ znamená benzyloxylovou skupinu.

Tak, jak se používá v tomto dokumentu, znamená termín „aminoskupina“ chemickou skupinu -NR'R” kde R' a R jsou nezávisle vodík, alkyl nebo aryl. Termín „kvartérní amin“ označuje kladně nabitou skupinu -NfR^R', kde R', R a R' jsou nezávisle alkyl nebo aryl. Preferovaná aminoskupina je -NH₂.

Termín „silyl“ tak, jak se používá v tomto dokumentu označuje organokovové substituenty, ve kterých je přinejmenším jeden atom křemíku připojen k přinejmenším jednomu atomu uhlíku, příklad silylového substituentu je trimethylsilylový substituent (CH₃)₃Si- 10CZ 296288 B6

Termín „farmaceutické agens nebo lék“ tak jak se používá v tomto dokumentu označuje chemickou sloučeninu nebo přípravek, který je schopen vyvolat žádoucí terapeutický efekt pokud je podán pacientovi.

Další chemické termíny, které se používají v tomto dokumentu odpovídají běžnému použití v této problematice, tak jak je uvedeno v The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (editor Parker, S., 1985), McGraw-Hill, San Francisco, který je zde uveden jako reference.

Podrobný popis předkládaného vynálezu

Obecně je názvosloví, které se používá dále v tomto dokumentu, laboratorní postupy s buněčnými kulturami, analytické chemie, organická syntetická chemie a farmaceutické prostředky, které jsou popsány dále, dobře známé a běžně používané v této problematice. V chemické syntéze, chemické analýze, farmaceutických prostředcích, podávání těchto prostředků a léčení pacientů se používají standardní postupy.

Základ předkládaného vynálezu je neočekávané zjištění toho, že členové skupiny sloučenin původně popsané jako epoxidační katalyzátory, tzv. komplex salen-přechodný kov, také vykazují silnou hyperoxid dismutázovou aktivitu a/nebo katalázovou aktivitu a fungují jako katalyzátor pro odstraňování volných radikálů jak in vitro, tak in vivo. Komplexy salen-přechodný kov byly popsány jako chirální epoxidační katalyzátory pro různé aplikace v syntetické chemii (Fu a kol. (1991) J. Org, Chem. 56: 6497, Zhang W a Jacobsen EN (1991) J. Org. Chem. 56: 2296, Jacobsen a kol. (1991) J, Am. Chem. Soc. 113: 6703, Zhang a kol. (1990) J. Am. Chem, Soc. 112: 2801, Lee NH a Jacobsen EN (1991) Tetrahedron Lett. 32: 6533, Jacobsen a kol. (1991) J, Am, Chem. Soc. 113: 7063, Lee a kol. (1991) Tetrahedron Lett. 32: 5055). Nicméně komplexy salenpřechodný kov jsou také použitelné jako účinné antioxidanty pro různé biologické aplikace včetně jejich využití při prevenci nebo léčení nemocí, které souvisí s volnými radikály. Farmaceutické prostředky, výživové doplňky, zlepšená média pro buněčné a orgánové kultury, zlepšená média pro konzervaci chladem, povrchové masti a chemoprotektivní a radioprotektivní prostředky mohou být připraveny v účinném množství nebo koncentraci z přinejmenším jednoho antioxidačního komplexu salen-přechodný kov.

Katalytickou aktivitu komplexů salen-kov přeměňovat epoxidy lze také využít s výhodou k lapání nebo prevenci tvorby in vivo cytotoxických a/nebo kancerogenních epoxidových látek, které mohou vznikat v monooxygenačním systému cytochromu P-450 (např. benzo[a]pyren diol epoxid). Katalytické komplexy salen-kov mohou být s výhodou přidány do jídla nebo výživových doplňků (nebo podávány v jiné formě) jedincům, kteří jsou v nebezpečí vystavení polycyklickým uhlovodíkovým chemickým kancerogenům, jako jsou dělníci v petrochemickém průmyslu a barvářských továrnách. Navíc katalyticky aktivní komplexy salen-kov mohou být určeny pro podávání kuřákům (včetně pasivních kuřáků), aby se zlepšila detoxifíkace reaktivních epoxidů, které vznikají z cigaretového kouře.

Antioxidační komplexy salen-kov podle předkládaného vynálezu mohou částečně nebo úplně zastavit postup neurodegenerativních nemocí. Například o mutaci Cu/Zn hyperoxid dismutázy bylo popsáno, že má velký vliv na amyotropní laterální sklerózu (ALS) (Rosen a kol. (1993) Nátuře 362: 59, Deng a kol. (1993) Science 261: 1047). Podobné chyby v endogenní antioxidační ochraně mohou být zodpovědné za roztroušenou sklerózu, periferní neuropatii a podobně. Antioxidační komplexy salen-kov podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro léčení a profylaxi těchto neurodegenerativních nemocí (např. ALS, MS).

-11 CZ 296288 B6

Komplexy salenu-přechodný kov

V souladu s prvním aspektem předkládaného vynálezu, má komplex salen-přechodný kov následující strukturu obecného vzorce I:

(0| kde Mje ion přechodného kovu, s výhodou Mn, A je anion, obvykle Cl a n je 0, 1 nebo 2. X_b X₂, X₃ a X₄ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, silylů, arylů, arylalkylů, primárních alkylů, sekundárních alkylů, terciárních alkylů, alkoxylů, aryloxyskupin, aminoskupin, kvartérních aminů a heteroatomů, obvykle jsou X] a X₃ tatáž funkční skupina, obvykle vodík, kvartémí amin nebo terciární butyl a X₂ a X₄ jsou obvykle vodík. Y_bY₂, Y₃,Y₄, Y₅aY₆ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, halogenů, alkylů, arylů, arylalkylů, silylů, aminoskupin, alkylů nebo arylů, které nesou heteroatomy, aryloxyskupin a alkoxyskupin, s výhodou jsou Yj a Y₄ alkoxyskupiny, halogeny nebo aminoskupiny. Obvykle jsou Yj a Y₄ stejné. R_b R₂, R₃ a R4 jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z H, CH₃, C₂H₅, C₆H₅, O-benzylu, primárních alkylů, esterů mastných kyselin, substituovaných alkoxyarylů, aromatických skupin, které nesou heteroatom, arylalkylů, sekundárních alkylů a terciárních alkylů.

Podle skupiny příkladů, které se váží k prvnímu aspektu vynálezu, přinejmenším jedno z center Xi a X₃, s výhodou obě, obsahují substituent vybraný ze skupiny blokujících skupin, která sestává ze sekundárních a terciárních alkylových skupin, arylových skupin, silylů, heterocyklů a alkylových skupin, které nesou heteroatomické substituenty, jako je alkoxyl nebo halogen. S výhodou nesou obě centra X] a X₃ stejné substituenty, přičemž nejpreferovanější substituent je terciární alkylová skupina, jako je terciární butyl. Pokud Xj a X₃ nesou blokující substituent, pak jsou X₂a X₄, s výhodou vybrány ze skupiny neblokujících substituentů, jako je H, CH₃, C₂H₅ a primární alkyly, nej výhodněji H. Případně, tři ze substituentů X_b X₂, X₃ a X₄ mohou být vybrány ze skupiny blokujících substituentů.

V souladu s prvním aspektem předkládaného vynálezu, obvykle jeden a obecně ne více než dva ze substituentů R_b R₂, R₃ a R4 jsou vybrány ze skupiny sestávající z H, CH₃, C₂H₅ a primárních alkylů. Pro zjednodušení jsou tyto skupiny označovány jako neblokující skupiny. Pokud je Rj vybráno ze skupiny neblokujících skupin, pak jsou R₂ a R₃, s výhodou, vybrány ze skupiny blokujících skupin a obvykle se jedná o stejné skupiny, fenyl nebo benzyloxy. Pokud je R₂ vybráno ze skupiny neblokujících skupin, pak jsou R| a R₄, s výhodou, vybrány ze skupiny blokujících skupin. Podobně pokud je R₃ vybráno ze skupin neblokujících skupin, pak jsou Ri a R;, s výhodou, vybrány ze skupiny blokujících skupin. A konečně pokud je R; vybráno ze skupiny neblokujících skupin, pak jsou R₂ a R₃, s výhodou, vybrány ze skupiny blokujících skupin. Fenyl a benzyloxy jsou zejména preferované blokující skupiny pro substituci R_b R₂, R₃ a R;. Obvykle jsou blokující skupiny vybrány tak, aby byly stejné. Preferované příklady mají na místě R] a R4 benzyloxy nebo fenyl a na místě R₂ a R₃ vodík.

- 12CZ 296288 B6

Jinak řečeno, příklady podle prvního aspektu vynálezu vyžadují, aby na čtyřech centrech dostupných pro substituci na dvou uhlíkových atomech, které sousedí s dusíkem, byly s výhodou, jeden nebo dva substituenty neblokující skupiny.

S výhodou jsou neblokující skupiny, buď vodík, nebo methyl, ale nejvýhodněji, vodík. S výhodou jsou blokující skupiny, buď fenyl, benzyloxy, nebo terciární butyl, výhodněji fenyl nebo benzyloxy, nejběžněji fenyl.

S výhodou jsou Y₃ a Y₆ vodík, methyl, alkyl nebo aryl. Výhodněji vodík nebo methyl. Nejvýhodněji pak vodík.

Y_b Y₂, Y₄ a Y₅ jsou nezávisle vybrány a s výhodou obsazeny vodíkem, ačkoliv mohou být obsazeny substituenty nezávisle vybranými ze skupiny sestávající z vodíku, halogenů, alkylů, arylů, alkoxyskupin, substituovaných alkoxyskupin, nitroskupin a aminoskupin. Yj a Y₄ jsou s výhodou obsazeny methoxylem, ethoxylem, chlorem, bromem, jodem, primárním alkylem, terciárním butylem, primárním aminem, sekundárním aminem nebo terciárním aminem, nejvýhodněji methoxylem, chlorem, terciárním butylem nebo methylem.

V souladu s druhým aspektem předkládaného vynálezu, má komplex salen-přechodný kov následující strukturu obecného vzorce II:

kde M je ion přechodného kovu, s výhodou Mn, A je anion, obvykle Cl, kde přinejmenším jedno ze dvojice Xj nebo X₂ je vybráno ze skupiny sestávající z arylů, primárních alkylů, sekundárních alkylů, terciárních alkylů a heteroatomů, kde přinejmenším jedno ze dvojice X] a X₃ je vybráno ze skupiny sestávající z arylů, primárních alkylů, sekundárních alkylů, terciárních alkylů, heteroatomů a vodíku, s výhodou terciární butyl nebo vodík a kde Y_b Y₂, Y₃, Y₄, Y₅, Y₆, Z_b Z₂, Z₃, Z₄, Z₅, Z₆, Z₇, Z₈, Z₉, Zjo, Zn a Z_i2 jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, halogenů, alkylů, arylů, aminů, alkoxyskupin, substituovaných alkoxyskupin, arylalkylů, aryloxyskupin a alkylů, které nesou heteroatomy. S výhodou jsou Yj a Y₄ vybrány ze skupiny sestávající z nižších alkylů, alkoxyskupin, halogenů a aminoskupin, ještě výhodněji ze skupiny sestávající z methoxyskupiny, chloru a primárního aminu. Preferovaný příklad podle druhého aspektu předkládaného vynálezu je ten, kde Yi a Y₄ jsou methoxyskupina, Xi a X₃ jsou nezávisle vodík nebo terciární butyl a zbylé substituenty jsou vodíky.

-13 CZ 296288 B6

V souladu s třetím aspektem předkládaného vynálezu, má komplex salenu-přechodný kov následující strukturu obecného vzorce III:

(III), kde M je ion přechodného kovu, obvykle Mn, A je anion, obvykle Cl a n je 4, 5 nebo 6, kde X_bX₂, X3 a X₄ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z arylů, arylalkylů, aryloxyskupin, primárních alkylů, sekundárních alkylů, terciárních alkylů, alkoxyskupin, substituovaných alkoxyskupin, heteroatomů, aminoskupin a kvartémích aminů, s výhodou je přinejmenším jedno z dvojice X] nebo X₃ je vybráno ze skupiny sestávající z arylů, primárních alkylů, sekundárních alkylů, terciárních alkylů, kvartémích aminů, arylalkylů, heteroatomů a vodíku, kde jsou, s výhodou Xj a X₃ stejné a jsou to vodíky nebo terciární butyly, kde Y_b Y₂, Y₃, Y₄, Y₅ a Y₆ jsou vybrány ze skupiny sestávající z arylů, arylalkylů, primárních alkylů, sekundárních alkylů, terciárních alkylů, alkoxyskupin, substituovaných alkoxyskupin, aryloxyskupin, halogenů, heteroatomů, aminoskupin, kvartémích aminů a vodíku, s výhodou přinejmenším jedno z Yi nebo Y₄ jsou vybrány ze skupiny sestávající z arylů, primárních alkylů, sekundárních alkylů, terciárních alkylů, substituovaných alkoxyskupin, heteroatomů, aminů a halogenů, ještě výhodněji jsou Yi a Y₄ stejné a jsou to buď methoxyskupina, chlor, brom, jod, terciární butyl nebo amin. Rj a R4 jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, halogenů, primárních alkylů, sekundárních alkylů, terciárních alkylů, esterů mastných kyselin, alkoxyskupin, nebo arylů. S výhodou jsou Ri a R4 stejné, ještě výhodněji jsou Ri a R4 vodíky.

Preferované antioxidanty typu salen-kov

Následující obecné antioxidaění komplexy salen-kov jsou preferovány pro použití v prostředcích a způsobech podle předkládaného vynálezu; tam, kde nejsou uvedeny, substituenty je vodík:

obecný vzorec IV

(IV), kde jsou Y] a Y₂ nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z methoxyskupiny, ethoxyskupiny, methylu, ethylu, terc-butylu, chloru, bromu, jodu, aminoskupiny, kvartémího aminu, alkylaminu, dialkylaminu a vodíku, R₁ a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z fenylu, benzyloxyskupiny, chlórbenzyloxyskupiny, vodíku, aminoskupiny, kvartémího aminu nebo esteru mastné kyseliny. S výhodou jsou Yj a Y₂ stejné.

-14CZ 296288 B6 obecný vzorec V

(V), kde Rq a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z fenylu, benzyloxyskupiny, chlórbenzyloxyskupiny, vodíku, aminoskupiny, kvartémího aminu nebo esteru mastné kyseliny. 5 S výhodou jsou Ri a R₂ stejné.

obecný vzorec VI

kde jsou Yi a Y₂ nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z methoxyskupiny, ethoxyskupiny, methylu, ethylu, /erc-butylu, chloru, bromu, jodu, aminoskupiny, kvartémího aminu, alkylaminu, dialkylaminu a vodíku, Ri a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z fenylu, benzyloxyskupiny, chlórbenzyloxyskupiny, vodíku, aminoskupiny, kvartémího aminu nebo esteru mastné kyseliny. S výhodou jsou Yi a Y₂ stejné a Rj a R₂ stejné.

obecný vzorec VII

(VII), kde X je vybráno ze skupiny sestávající z methoxyskupiny, ethoxyskupiny, methylu, ethylu, ierc-butylu, chloru, bromu, jodu, aminoskupiny, kvartémího aminu, alkylaminu, dialkylaminu

-15 CZ 296288 B6 a vodíku, Y je vybráno ze skupiny sestávající z terc-butylu, kvartémího aminu, aminoskupiny a vodíku.

obecný vzorec VIII

(Vlil), kde Ri a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z aryloxyskupín, alkoxyskupin, arylů a vodíku R' a R jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z alkylů, arylů a vodíku. S výhodou, přinejmenším alespoň jedna z aminoskupinje protonovaná při fyziologickém pH (tj. pH 7,3 až 7,8). Preferované R' a R alkyly zahrnují, ale nejsou tímto výčtem omezeny, methyl, ethyl a propyl. Preferované R) a R₂ aryloxyskupiny zahrnují, ale nejsou tímto výčtem omezeny, benzyloxyskupinu a chlorbenzyloxyskupinu. Preferované R] a R₂ alkoxyskupiny zahrnují, ale nejsou tímto výčtem omezeny, ethoxyskupinu a methoxyskupinu.

Preferovaná podtřída obecného vzorce VIII zahrnuje, ale není tímto výčtem omezena, obecný vzorec IX:

kde R je vybráno ze skupiny sestávající z alkylů a vodíku. S výhodou, přinejmenším alespoň jedna z aminoskupinje protonovaná při fyziologickém pH (tj. pH 7,3 až 7,8).

Následující látky jsou preferované antioxidanty typu komplexu salen-přechodný kov, které se používají ve farmaceutických prostředcích, jako výživové doplňky, látky na ochranu potravin, kosmetiky, jako ochrana proti slunečnímu záření a v dalších prostředcích podle předkládaného vynálezu a pro naprostou jasnost jsou referovány číslem struktury (např. Cl až C30).

-16CZ 296288 B6

ΓΊ

- 17CZ 296288 B6

C10:

Cil:

C12:

Ph ^ph

- 18CZ 296288 B6

C17:

Ph Ph

C20:

C22:

C23:

Ph ^Pn

θηΟ θθ^η

C25:

- 19CZ 296288 B6

C27:

C28:

Farmaceutické prostředky

Preferované farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují terapeuticky nebo profylakticky účinné množství přinejmenším jednoho komplexu přechodného kovu s derivátem šálenu. Termín „salen“ tak, jak se používá v tomto vynálezu označuje ty ligandy, které jsou běžně tvořeny kondenzační reakcí dvou molekul derivátu salicylaldehydu s jednou molekulou derivátu diaminů. Ačkoliv jsou salenové ligandy tvořeny deriváty ethylendiaminu z propyl a butyl diaminů mohou být vytvořeny analogické šáleny. Obecná struktura preferovaných salenových derivátů je vyobrazena na obr. 1. Salenový derivát, kde je n = 0, je vyobrazen na obr. 2.

Jak je vidět z obr. 1, do centra salenového ligandů jsou orientovány dva dusíkové a dva kyslíkové atomy a tím vzniká komplexační centrum pro ion přechodného kovu M. S výhodou je tento kovový ion vybrán ze skupiny sestávající z Μη, I, Cr, Fe, Ni, Co, Ti, V, Ru a Os. Ještě výhodněji je ion přechodného kovu vybrán ze skupiny sestávající z Mn, Mg, Cr, Fe, Ni a Co. Nejvýhodněji je tento kovový ion Mn.

Anion je, s výhodou, vybrán ze skupiny sestávající z PF₆, (aryl)₄, BF₄, B(aryl)₄, halogenu, octanu, triflátu, tosylátu s tím, že halogen nebo PF₆ jsou preferovanější a chlorid je nejpreferovanější.

Obr. 1 také ukazuje mnoho center vhodných pro substituci na salenovém ligandů. Předpokládá se, že z těchto center jsou na tomto komplexu salen-kov nej důležitější R_b R₂, R₃, R₄ a X_b X₂, X₃, X₄, Y₃ a Y₆.

Struktury obecných vzorců I, III, IV, VI, VII a VIII mohou mít nezávisle vybrané substituenty typu ester mastné kyseliny v pozicích R_b R₂, R₃ a R₄. Pokud jsou v molekule přítomny, estery mastné kyseliny obvykle neobsazují více než dvě substituovatelné pozice a jsou stejné.

Příklady mastných kyselin vhodných pro přípravu sloučenin podle předkládaného vynálezu jsou uvedeny v Tabulkách I, II a III uvedených dále.

-20CZ 296288 B6

Tabulka I

CH₃-(CH₂)r-(CH=CH)_g-(CH₂)_h-CO₂H

Počet uhlíků	f	g	h	názve kyseliny
16	5	1	7	palmitolejová
18	7	1	7	olejová
18	10	1	4	petrolselenová
18	5	1	9	vakcenová
18	3	3	7	puniková
18	1	4	7	parinaková
20	9	1	7	gadolejová
22	9	1	9	cetolejová
Tabulka II

CH₃-(CH₂)_n-(CH=CH-CH₂)_m-(CH₂)_p-CO₂H

Počet uhlíků	f	g	h	názve kyseliny
18	4	2	6	linolová
18	1	3	6	linolenová
20	4	4	2	arachidonová

Tabulka III

CH₃-(CH₂)_w-CO₂H

Počet uhlíků	w	název kyseliny
12	10	laurová
14	12	myristová
16	14	palmitová
18	16	stearová
20	18	eikosanová
22	20	dokosanová

Je výhodné, že se nenasycené kyseliny objevují díky jedné nebo více nenasyceným vazbám v izomerních formách. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu zahrnují jak jednotlivé izomery, které vznikají na dvojné vazbě, tak i jejich směsi. Estery mastných kyselin podle předkládaného vynálezu se mohou získat známými acylačními postupy. Viz např. March, Advanced Organic Chemistry, 3. vydání, John Wiley & Sons, New York (1985), str. 299, 348-351 a 353354, které jsou zde uvedeny jako reference.

Preferované antioxidační komplexy salen-přechodný kov

Obrázek 3 zobrazuje struktury preferovaných antioxidačních komplexů salen-přechodný kov podle předkládaného vynálezu. Příklad antioxidačních komplexů salen-přechodný kov jsou zobrazeny na obr. 3. Sloučeniny Cl, C4, C6, C7, C9, C10, Cl 1 a C12 jsou zejména preferované pro použití do farmak a dalších antioxidačních prostředků podle předkládaného vynálezu. Předpokládá se, že zejména preferovaná je C7, z důvodu snadné přípravy a relativně hydrofilní povahy, která je vhodná pro její farmaceutické využití.

-21 CZ 296288 B6

Preferovaný komplex salen-kov, který má vysokou hyperoxid dismutázovou aktivitu je sloučenina Cl 2, která má strukturu:

C12:

och₃ další preferované sloučeniny na základě C12 jsou:

C29:

a C30:

Zejména preferovaný antioxidační komplex salen-kov podle předkládaného vynálezu je C7:

C7:

Antioxidační komplexy salen-přechodný kov mají obecně znatelnou hyperoxid dismutázovou aktivitu a s výhodou mají také katalázovou aktivitu. Výhodné je, že C7 se snadno připravuje a je relativně hydrofílní, což jsou vlastnosti, díky kterým je zejména vhodný pro farmaceutické

-22CZ 296288 B6 a použití a podávání ve vodných roztocích. Relativně hydrofilní povahy C7 lze také s výhodou využít pro antioxidační komplexy salen-kov, které jsou snadno absorbovány a dopravovány do lidského těla. O C7 se předpokládá, že má jednu výhodnou farmakokinetickou vlastnost, a to účinný průchod skrz hematocerebrální bariéru.

Příprava antioxidačních komplexů salen-přechodný kov

Příprava komplexů salen-přechodný kov se provádí přesně podle popisu v pracích US91/01915 podaném 21.3. 1991, Fu a kol. (1991) J. Org. Chem. 56: 6497, Zhang W a Jacobsen EN (1991) ío J. Org. Chem. 56: 2296, Jacobsen a kol. (1991) J. Am. Chem. Soc. 112: 2801, Lee NH a Jacobsen EN (1991) Tetrahedron Lett. 32: 6533, Jacobsen a kol. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 7063, Lee a kol. (1991) Tetrahedron Lett. 32: 5055, které jsou zde všechny uvedeny jako reference.

Obecně je preferovaný způsob jak připravit antioxidační komplexy salen-přechodný kov podle 15 předkládaného vynálezu kondenzační reakce substituovaného salicylaldehydu a substituovaného diaminu. Obecně reagují tyto sloučeniny v množství 2 ku 1 molárně v absolutním ethanolu. Roztok se obvykle zahřívá k varu pod zpětným chladičem v absolutním ethanolu. Roztok se obvykle zahřívá k varu pod zpětným chladičem po dobu jedné hodiny a salenový ligand se buď vysráží v analyticky čisté formě po přidání vody, nebo se přímo generuje kovový komplex přidáním ko20 vu v podobě octanové, halogenidové nebo triflátové soli.

Následující postup je obecný pro přípravu antioxidačních komplexů salen-Mn obecného vzorce X:

X

Salenový ligand se rozpustí v horkém absolutním ethanolu na roztok o koncentraci 0,1 M. Najednou se přidá pevný Mn(OAc)₂*4H₂O (2,0 ekvivalentu) a roztok se po dobu jedné hodiny zahřívá k varu pod zpětným chladičem. Pak se ke směsi přidají 3 ekvivalenty pevného LiCl a výsledná směs se zahřívá k varu pod zpětným chladičem po dobu další půl hodiny. Ochlazením směsi na 0 °C se vyloučí Mn(III) komplex jako tmavě hnědé krystaly, které se promyjí vodou a izolují 30 filtrací s výtěžkem 75 %. Další podíl látky lze získat když se do matečných louhů po kapkách přidá voda. Celkový výtěžek katalyzátoru v tomto kroku je obvykle 80 až 95 % a celkový výtěžek z opticky čistého 1,2-difenylethylendiaminu přinejmenším 80 až 90 %.

Další příklad způsobu přípravy antioxidačních komplexů salen-Mn je následující:

Nejvýhodněji se vychází zR,R- nebo £5M,2-diamin-l,2-difenylethanii a 3-terc-butylsalicylaldehydu. Roztok 2,0 mmol 3-terc-butylsalicylaldehydu ve 3 ml absolutního ethanolu se po kapkách přidá kroztoku 1,0 mmol (7?,7ř)-l,2-diamin-l,2-difenylethanu v 5 ml absolutního ethanolu. Reakční směs se po dobu jedné hodiny zahřívá k varu pod zpětným chladičem a pak se k horké40 mu roztoku (60 °C) najednou se přidá 1 mmol pevného Mn(OAc)₂*4H₂O. Barva roztoku se okamžitě po přidání změní ze žluté na hnědou. Výsledná směs se zahřívá k varu pod zpětným chladičem po dobu půl hodiny a pak se ochladí na teplotu místnosti. Po kapkách se přidá roztok 10% NaCl (5 ml) a směs se míchá půl hodiny. Rozpouštědla se vakuově odpaří a zbytek se

-23CZ 296288 B6 trituruje 50 ml CH2CI2 a 50 ml vody. Organická vrstva se oddělí a hnědý roztok se promyje nasyceným NaCl. Oddělení organické fáze a odpaření rozpouštědla poskytne surový materiál, který lze rekrystalizovat z C₆H(5/C6Hi4 na komplex (R,7?)-salen-Mn.

Syntézu antioxidačních komplexů salen-přechodný kov podle předkládaného vynálezu může rutinně provést podle citovaných prací každý, kdo je vzdělaný v dané problematice.

SOD aktivita připravených komplexů salen-Mn se stanovuje podle známých testovacích metod pro stanovení SOD aktivity, které jsou známé v této problematice ajejich příklady jsou uvedeny dále. Antioxidační komplexy salen-kov jsou komplexy salen-kov, které mají SOD aktivitu přinejmenším 0,01 jednotky na milimol/litr ve vodném roztoku, s výhodou mají antioxidační komplexy salen-kov SOD aktivitu přinejmenším 1 jednotka na milimol/litr a ještě výhodněji mají SOD aktivitu přinejmenším 100 jednotek na milimol/litr, často mají SOD aktivitu větší než 500 až 1000 jednotek na mM nebo více. Pro některá medicinální využití, pro která je vhodná i katalázová aktivita je výhodné, že SOD mimetické komplexy salen-kov mají také znatelnou katalázovou aktivitu (např. C4, C7, C9, C10, Cil, C12), obvykle přinejmenším 10 jednotek katalázové aktivity na mM a častěji přinejmenším 100 jednotek katalázové aktivity na mM.

Farmaceutické prostředky

Farmaceutické prostředky, které obsahují antioxidační komplexy salen-přechodný kov podle předkládaného vynálezu lze použít pro povrchové i parenterální podávání, tj. subkutánně, intramuskulárně nebo intravenózně. Zjištění, že komplexy salen-kov mají SOD aktivitu in vitro stejně jako in vivo ukazuje, že antioxidační komplexy salen-kov jsou vhodná SOD mimetika pro farmaceutické použití. Antioxidační komplexy salen-kov jsou vhodné pro podávání savcům včetně lidí nebo zvířat.

Prostředky pro parenterální podávání obecně obsahují roztok antioxidačního komplexu salenpřechodný kov nebo jejich směsi rozpuštěnou ve vhodném nosiči. Protože mnoho komplexů salen-Mn podle předkládaného vynálezu je lipofilních, je do nosiče zahrnut s výhodou hydrofobní základ (např. polyethylenglykol, Tween 20). Lze použít různé vodné nosiče, např. vodu, pufrovanou vodu, 0,4 % roztok soli ve vodě, 0,3% glycin a podobně. Tyto roztoky jsou sterilní a obecně neobsahují pevné částice. Tyto prostředky lze sterilizovat běžnými, dobře známými sterilizačními technikami. Prostředky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné prostředky podle toho jak vyžadují fyziologické podmínky jako jsou složky, které upravují pH nebo pufrují, upravují toxicitu a podobně, například octan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, mléčnan vápenatý atd. Koncentrace antioxidačních komplexů salen-přechodný kov v těchto prostředcích se může měnit v širokém rozmezí, tj. od méně než 1 nM, obvykle ale přinejmenším od 0,1 mM až do 100 mM a volí se podle objemu tekutiny, viskozitě atd. podle zvoleného režimu dávkování. Nejobvykleji je antioxidační komplex salen-kov přítomen v koncentraci 0,1 mM až 10 mM. Například běžný prostředek pro intravenózní injikování obsahuje sterilní roztok antioxidačního komplexu salen-kov (např. C7) v koncentraci 5 mM v Ringerově roztoku. Obecně hydrofobní povaha některých preferovaných antioxidačních komplexů salen-kov ukazuje, že lze použít hydrofobní vehikulum nebo vodné vehikulum, které obsahuje povrchově aktivní látku nebo jinou lipofdní látku (např. Tween, NP-40, PEG), případně mohou být antioxidační komplexy šálenu podávány jako suspenze ve vodném roztoku nebo jako emulze.

Běžný farmaceutický prostředek pro intramuskulární injikování obsahuje 1 ml sterilní pufrované vody a 1 až 100 mg antioxidačního komplexu(ů) salen-přechodný kov. Běžný prostředek pro intravenózní infuzi obsahuje 250 ml sterilního Ringerova roztoku a 100 až 1000 mg antioxidačního komplexu(ů) salen-přechodný kov. Lipofílní látky mohou být také zahrnuty v prostředcích, které obsahují lipofílní komplexy salen-kov. Způsoby přípravy parenterálně podávaných prostředků jsou tomu, kdo je vzdělaný v této problematice, jasné nebo známé a podrobněji jsou popsány například v knize Remingtonů Pharmaceutical Science, 15. vydání, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), která je zde uvedena jako reference. Běžný farmaceutický

-24CZ 296288 B6 prostředek pro povrchovou aplikaci může být vyroben s vhodnými mastmi, krémy, pleťovými vodami, oftalmickými mastmi a roztoky, aerosoly a dalšími excipienty. Excipienty by měly být chemicky slučitelné s antioxidačním komplexem(y) salen-přechodný kov, který je aktivní složkou(ami) prostředku a obecně by neměly přispívat k rozkladu, denaturaci nebo agregaci aktivní složky(ek). Často jsou excipienty lipofilní složky jako jsou oleje a lipidové emulze.

Antioxidační komplex(y) salen-přechodný kov podle předkládaného vynálezu mohou být lyofilizovány pro skladování a rekonstituovány ve vhodném nosiči před použitím. Lyofílizace a rekonstituce mohou vést k různému stupni ztráty antioxidační aktivity, a proto je třeba tuto ztrátu kompenzovat změnou podávaného množství.

Prostředky, které obsahují antioxidační komplex(y) salen-přechodný kov podle předkládaného vynálezu nebo jejich směs mohou být podávány za účelem léčebným a/nebo profylaktickým.

V léčebných aplikacích je prostředek podáván pacientovi, který již trpí určitou nemocí, která souvisí s volnými radikály v množství, které je dostatečné k vyléčení nebo přinejmenším částečnému zlepšení stavu. Odpovídající množství se definuje jako „terapeuticky účinná dávka“ nebo „účinná dávka“. Účinné množství závisí na prudkosti nemoci, obecném stavu pacienta a způsobu podávání, ale obecně se pohybuje v rozmezí od 1 mg do 10 g antioxidačního komplexu(ů) salenpřechodný kov na dávku s tím, že se spíše používají dávky od 10 mg do 2000 mg na pacienta. Například pro léčení akutních ischemicko-reoxygenačních stavů myokardu se podává 100 až 1000 mg antioxidačního komplexu salen-kov (např. C7) intravenózní infuzí, přinejmenším 10 mg až 500 mg antioxidačního komplexu(ů) salen-kov se podává intraperikardiální injekcí, aby se zvýšila místní koncentrace SOD aktivity v myokardu.

V profýlaktických aplikacích se prostředek, který obsahuje antioxidační komplex(y) salen-přechodný kov nebo jejich směs podává pacientovi, který ještě netrpí nemocí, aby se zvýšila jeho odolnost nebo zpomalil rozvoj nemoci. Takové množství se definuje jako „profylakticky účinná dávka“. Při tomto použití přesné množství opět závisí na stavu pacienta a obecném stavu jeho imunity, ale obecně je v rozsahu 1 mg až 10 g na dávku, zejména 10 až 1000 mg na pacienta. Běžný prostředek antioxidačního komplexu salen-kov jako je C7 obsahuje 25 až 250 mg komplexu salen-kov v jedné dávce.

Jednotlivé nebo několikanásobné podávání prostředků může být provedeno dávkami a způsobem, který vybere zkušený lékař. V každém případě, farmaceutické prostředky by měly poskytnout množství antioxidačního komplexu(ů) salen-přechodný kov podle předkládaného vynálezu, které postačuje k účinnému léčení pacienta.

Soupravy, které obsahují antioxidační komplex(y) salen-přechodný kov mohou být také použity jako ochrana proti nebo jako lék proti nemocem, které souvisí s volnými radikály. Prostředek podle předkládaného vynálezu je obvykle v lyofilizované podobě nebo vodném roztoku umístěn v nádobě, buď sám, nebo s dalším žádaným antioxidačním komplexem(y) žádaného typu. Antioxidační komplex(y) salen-přechodný kov jsou v soupravách s pufry jako je Tris, fosfátový, uhličitanový atd., stabilizátory, inertními proteiny, např. sérum albumin a podobně a návodem k použití. Obecně tvoří tyto materiály méně než 5 % hmotnostních vztaženo na množství antioxidačního komplexu(ů) salen-přechodný kov a obvykle v celkovém množství přinejmenším 0,001 % vztaženo na koncentraci. Často je žádoucí, aby se ke zředění aktivní složky použilo plnivo nebo excipient může tvořit 1 až 99,999 % hmotnostních prostředku.

Komplexy salen-kov, s výhodou sloučeniny C12 nebo C7 mohou být zahrnuty do hypothermního kardioplegního roztoku v koncentraci přinejmenším 1 mM do roztoku, který je popsán v práci Amano a kol. (1982) Jpn, J. Surg. 12: 87, která je zde uvedena jako reference. Nejvýhodněji je do tohoto roztoku zahrnut C7.

Dávkování SOD mimetického komplexu(ů) salen-kov se mění v závislosti na určité aplikaci. Obvykle se prostředek podává systémově nebo povrchově. Systémové podávání zahrnuje způso

-25CZ 296288 B6 by per os a parenterální, povrchové podávání zahrnuje aplikace in šitu. In šitu zahrnuje například podávání SOD mimetického komplexu salen-kov endoskopickým promytím a/nebo paravenózní injekcí nebo v případě léčení nižšího zažívacího traktu, klystýrem. Parenterální způsoby mohou zahrnovat například subkutánní, intradermální, intramuskulární nebo intravenózní způsoby. Množství SOD mimetického komplexu(ů) salen-kov se mění od 2 do 5,000 mg nebo více, obvykle 10 až 1000 mg v závislosti na intervalu a způsobu podání, které se mění od jedné orální dávky, parenterální dávky a/nebo povrchové dávky po několikanásobné orální dávky, parenterální dávky a/nebo povrchové dávky po dobu několika dnů nebo větší než 5 týdnů. Dávkování se také může měnit v závislosti na prudkosti nemoci.

Podávání in vitro a průzkumné podávání

V dalším aspektu podle předkládaného vynálezu, antioxidační komplexy salen-přechodný kov podle předkládaného vynálezu modulují expresi přirozeně se vyskytujících genů nebo jiných polynukleotidových sekvencí, které kontrolují transkripci elementů, které odpovídají na oxidativní stres (např. element antioxidační odpovědi, ARE) jako jsou elementy antioxidační odpovědi genu glutathin S-transferázy nebo gen NAD(P)H:chinon reduktázy (Rozen a kol. (1992) Arch, Biochem. Biophys. 292: 589, Favreau a Pickett (1991) J. Biol. Chem, 266: 4556, Rushmore aPickett (1991) Methods Enzymol. 206: 409, Rushmore a Pickett (1990) J. Biol, Chem, 265: 14648, Keyse a kol. (1992) Nátuře 359: 644, které jsou zde uvedeny jako reference). Transgeny, homologové rekombinační konstrukty a episomální expresní systémy (např. expresní vektory založené na virech), které obsahují polynukleotidové sekvence transkripční kontroly jednoho nebo více ARE připojené k promotoru mohou být vyrobeny každým, kdo je vzdělaný v této problematice, způsoby, které jsou v této problematice známé tak, jak transformované buňky atransgenní nelidská zvířata přechovávají takové polynukleotidové konstrukty. Antioxidační komplexy salen-kov lze použít k modulaci transkripce ARE regulovaných polynukleotidových sekvencí v buněčných kulturách (např. buňkách ES) a zvířatech, zejména u transgenních zvířat, u kterých transgen obsahuje jako regulační sekvence transkripce jeden nebo více ARE. Pro transformované nebo transgenní buněčné kultury se křivka závislosti reakce na dávce vynáší jako rychlost transkripce ARE kontrolované polynukleotidové sekvence proti zvýšení koncentrace antioxidačního komplexu(ů) salen-kov, který snižuje rychlost transkripce vyvolané oxidačními činidly (např. benzoylperoxid, činidla, která vyčerpávají glutathion) nebo oxidativním stresem. Naopak ovšem mohou vysoká množství SOD mimetických komplexů salen-kov vyvolat oxidativní stres a tvorbu volných radikálů. Podobně lze provést stanovení reakce na dávku u transgenních zvířat jako jsou transgenní myši, které nesou ARE kontrolovanou transgenní sekvenci.

Podávám in vivo

Terapeuticky nebo farmaceuticky účinné množství antioxidačního komplexu salen-přechodný kov se podle předkládaného vynálezu podává pacientovi jako prevence nebo léčení nemocí, které souvisí s volnými radikály. Požadovaná dávka závisí na povaze této nemoci, prudkosti a průběhu nemoci, předešlém léčení, pacientově stavu, reakci na antioxidační komplex salen-přechodný kov a posouzení lékařem. Obvykle se přinejmenším jeden antioxidační komplex salen-Mn podává jako základní aktivní látka nebo v kombinace s jednou nebo více dalšími aktivními látkami, obvykle vybranými ze skupiny sestávající z Á-2-merkaptopropionylglycinu, vV-acetylcysteinu, glutathionu, dimethylmočoviny, desferrioxaminu, mannitolu, cc-tokoferolu, askorbátu, allopurinolu, 21-aminosteroidů, inhibitorů kalpainu, antagonistů receptoru glutamátu, aktivátoru tkáňového plasminogenu, streptokinázy, urokinázy, nesteroidních protizánětlivých agens, kortisonu a karotenoidů. Antioxidační komplexy salen-Mn mohou být také podávány spolu s polypeptidy, které mají SOD a/nebo katalázovou aktivitu, zejména s ohledem na kapacitu komplexů salenMn, na rozdíl od SOD polypeptidů, procházet hematocerebrální bariéru, a tak doplňovat podávání SOD.

Předkládaný vynález zahrnuje způsob léčení pacientů, kteří trpí nemocí, která souvisí s volnými radikály profylakticky nebo terapeuticky účinným množstvím antioxidačního komplexu salen

-26CZ 296288 B6 přechodný kov, obvykle komplexu salen-Mn, s výhodou C7. Tento způsob lze použít k léčení pacientů v různých stadiích rozvoje nemoci nebo k prevenci rozvoje nemoci, která souvisí s volnými radikály. Navíc léčení lze použít jako prevence nebo zpomalení pravděpodobnosti rozvoje nádoru a/nebo úmrtnosti a/nebo stárnutí.

Antioxidační komplexy salen-kov podle předkládaného vynálezu mohou být také podávány pacientům, kteří jsou infikováni virem lidské imunodefícience (např. HIV-1) nebo, kteří jsou v ohrožení infekcí virem lidské imunodefícience. Antioxidační komplexy salen-kov, typický C7, mohou působit jako prevence nebo inhibice indukce replikace HTV-1 v CD4⁺ lymfocytech faktorem nádorové nekrózy (tumor necrosis factor TNF) a/nebo působit jako prevence poškození nebo smrti buněk CD4⁺ následkem infekce HIV-1. Bez vazby na nějakou určitou teorii replikace HIV-1 nebo HIV-1 patogeneze, se předpokládá, že podávání antioxidačních komplexů salenkov, jako je C7, může inhibovat a/nebo zpomalit rozvoj patologického stavu, který je způsoben HIV-1 a/nebo může snížit rychlost snížení populace lymfocytů CD4⁺ u jedinců infikovaných HIV. Antioxidační komplexy salen-kov, jako je C7 mohou také inhibovat patologický stav, který je následkem přebytku nebo nevhodného množství TNF, jak u AIDS tak u jiných stavů (např. septický šok). Obvykle se podávají pacientovi s HIV a/nebo přebytkem nebo nevhodným množstvím TNF, dávky 50 až 500 mg buď v jedné, nebo několika dávkách, aby se snížil nebo zpomalil rozvoj patologických a klinických symptomů. Antioxidační komplexy salen-kov mohou být podávány terapeuticky k léčení i jiných virových nemocí než je HIV.

Protože oxidativní poškození odpovídá množství volných radikálů a reaktivních kyslíkatých látek, očekává se, že podávání antioxidačních komplexů salen-přechodný kov dokonce i v nízkých dávkách bude mít ochranný vliv proti oxidativnímu poškození, také se předpokládá, že není žádná prahová dávka, pod kterou jsou antioxidační komplexy salen-kov neúčinné.

Obecně je pro léčení nemocí, které souvisí s volnými radikály, vhodná účinná dávka antioxidačních komplexů salen-Mn v rozsahu 0,01 až 1000 miligramů (mg) na kilogram (kg) tělesné hmotnosti příjemce denně, s výhodou v rozsahu 1 až 100 mg na kg tělesné hmotnosti denně. Žádaná dávka se, s výhodou podává v jedné, dvou třech, čtyřech nebo více menších dávkách ve vhodných intervalech během celého dne. Tyto menší dávky se mohou podávat jako jednotkové dávkové formy, které obsahují, například 5 až 10 000 mg, s výhodou 10 až 1000 mg aktivní složky na jednotkovou dávku.

Prostředky použité pro tato léčení mohou mít různou formu. Ta zahrnuje, například, pevnou, polopevnou, a tekutou dávkovači formu, jako jsou tablety, pilulky, prášek, kapalné roztoky nebo suspenze, liposomové preparáty, roztoky, které lze injikovat nebo použítjako infuze. Preferovaná forma závisí na zamýšleném způsobu podávání a terapeutickém použití. Obvykle se sterilní roztok komplexu salen-kov ve vodném roztoku podává intravenózně. Prostředky také s výhodou obsahují běžné farmaceuticky přijatelné nosiče a adjuvanty, které jsou člověku, který je vzdělaný v dané problematice známé. Viz. např., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.: Easton, PA, 17. vyd. (1985). Obecně je podávání buď orální, nebo parenterální (včetně subkutánního, intramuskulárního, intravenózního a intradermálního) nebo se aplikuje povrchově nebo infuzí do tělesných dutin nebo jako lázeň pro tkáně během operace.

Je ovšem jasné, že způsoby podle předkládaného vynálezu lze použít v kombinaci s jinými antioxidanty, které mají DOS aktivitu, katalasovou aktivitu, GSH-Px aktivitu nebo jsou to lapače volných radikálů nebo inhibitory tvorby volných radikálů. Ačkoliv je možné podávat aktivní složky podle předkládaného vynálezu samotné, předpokládá se, že je lepší podávat je jako součást farmaceutických prostředků. Prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují přinejmenším jednu ze sloučenin podle předkládaného vynálezu v terapeuticky nebo farmaceuticky přijatelnými nosiči a volitelně s dalšími terapeutickými složkami. Různé zřetele jsou popsány např. v Gilman a kol. (editoři) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Based of Therapeutics, 8. vydání, Pergamon Press a Remington‘s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 17. vyd. (1985), které jsou zde uvedeny jako reference. Způsoby podávání jsou

-27CZ 296288 B6 diskutovány dále, např. způsoby orálního, intravenózního, intraperitoneálního nebo intramuskulárního podávání a další. Farmaceuticky přijatelné nosiče jsou voda, roztok soli, pufry a další sloučeniny popsané např. v Měrek Index, Měrek & Co., Rahway, NJ, který je zde uveden jako reference.

Farmaceutické prostředky se podávají parenterálně nebo orálně za účelem profylace nebo léčení. Farmaceutické prostředky lze podávat v různých dávkovačích formách v závislosti na způsobu podávání. Například dávkovači formy vhodné pro orální podávání zahrnující prach, tablety, pilulky, kapsle a dražé.

Farmaceutické prostředky se často podávají intravenózně. Předkládaný vynález poskytuje prostředky pro intravenózní podávání, ke kterému se využívá roztok sloučeniny rozpuštěný nebo suspendovaný ve vhodném nosiči, s výhodou vodném nosiči. Použít lze mnoho vodných nosičů, např. vodu, pufrovanou vodu, 0,4 % roztok soli a podobně. Často může být antioxidační komplex(y) salen-kov, jak je C7 nebo C12 rozpuštěn v organickém rozpouštědle (např. dimethylsulfoxidu) a aplikován buď přímo, nebo po rozpuštění ve vodném roztoku. Obvykle jsou antioxidační komplexy salen-kov, které jsou relativně lipofilní (např. C9, Cl2), rozpuštěny v organickém rozpouštědle jako je DMSO a, pokud je to žádoucí, následně rozpuštěny v polárnějším rozpouštědle jako je voda. Tyto prostředky mohou být sterilizovány běžnými, dobře známými sterilizačními technikami nebo mohou být jako sterilní již filtrovány. Výsledný vodný roztok může být baven přímo nebo lyofilizován na preparát, který se míchá se sterilním vodným roztokem před podáváním. Prostředky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné látky, které jsou požadovány pro dosažení vhodných fyziologických podmínek, jako je úprava pH nebo pufrování, zvlhčovadla a podobně, například acetát sodný, mléčnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, monolaurát sorbitanu, oleát triethanolaminu a podobně.

Pro pevné prostředky se používají běžné nejedovaté pevné nosiče jakou jsou například mannitol, laktóza, škrob, stearát hořečnatý, sacharin sodný, talek, celulóza, glukóza, sacharóza, uhličitan hořečnatý a podobně ve farmaceutické čistotě. Pro orální podávání jsou farmaceuticky přijatelné nejedované prostředky tvořeny použitím jakéhokoliv normálního excipientu jako jsou nosiče uvedené výše a obecně 0,01 až 95 % aktivní složky, s výhodou 20 %.

Prostředky, které obsahují sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být podávány za účelem profylace nebo léčení. V terapeutických aplikacích se prostředky podávají pacientovi, který již trpí nemocí, která je popsána výše v množství, které postačuje k vyléčení nebo alespoň k částečnému pozastavení projevů nemoci a jejich komplikací. Množství, které je dostatečné, je definováno jako „terapeuticky účinné množství nebo dávka“. Účinné množství závisí na prudkosti nemoci, hmotnosti a celkovém stavu pacienta.

V profytaktických aplikacích se prostředky podle předkládaného vynálezu podávají pacienti, který má sklon neboje v nebezpečí nějaké nemoci. Takové množství se definuje jako „profylakticky účinné množství nebo dávka“. Při tomto způsobu použití, přesně množství opět závisí na hmotnosti pacienta a jeho stavu.

Pro pevné prostředky jsou běžné nejedovaté pevné excipienty, například mannitol, laktóza, škrob, stearát hořečnatý, sacharin sodný, talek, celulóza, glukóza, sacharóza, uhličitan hořečnatý a podobně ve farmaceutické čistotě. Aktivní složka, která je definována výše může být připravena k podávání jako čípek použitím, například, triglyceridů, například Witesolpu jako nosiče. Kapalné farmaceutické prostředky mohou být připraveny, například, rozpuštěním, dispergováním atd. aktivní složky, která je definována výše a nepovinné farmaceutické adjuvans v excipientu jako je, například voda, roztok soli, vodná dextrosa, glycerol, ethanol a podobně na roztok nebo suspenzi. Pokud je to žádoucí, farmaceutický prostředek, který je určen k podávání, může také obsahovat malá množství nejedovatých pomocných látek, jako jsou zvlhčovadla nebo emulgátory, pufry a podobně, například octan sodný, monolaurát sorbitanu, octan sodný triethanolaminu, oleát triethanolaminu atd. Způsoby přípravy takových dávkovačích forem jsou známé nebojsou tomu,

-28CZ 296288 B6 kdo je v uvedené problematice vzdělaný, jasné, například viz Remingtonů Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 17. vyd. 1985. Prostředek, který bude podáván, ale v každém případě obsahuje účinné množství aktivní sloučeniny.

Pro orální podávání, jsou farmaceuticky přijatelné nejedovaté prostředky tvořeny přidáním jakýchkoliv běžných excipientů, jako jsou, například mannitol, laktóza, škrob, stearát hořečnatý, sacharin sodný, talek, celulóza, glukóza, sacharóza, uhličitan hořečnatý a podobně ve farmaceutické čistotě. Tyto prostředky jsou ve formě roztoků, suspenzí, tablet, kapsulí, prášku a podobně. Tyto prostředky obsahují 0,01 až 95 % aktivní složky, s výhodou 1 až 70 %.

Parenterální podávání je obecně charakterizováno injikováním, subkutánním, intramuskulárním nebo intravenózním. Injekce mohou být připraveny v běžné formě, buď jako tekutý roztok, nebo suspenze, pevná látka, která se před injikováním rozpouští nebo suspenduje v kapalině, nebo jako emulze. Vhodné excipienty jsou, například, voda, roztok soli, dextrosa, glycerol, ethanol a podobně. Navíc, pokud je to žádoucí, farmaceutické prostředky mohou také obsahovat malá množství nejedovátých pomocných látek, jak jsou zvlhčovadla nebo emulgátory, pufry a podobně, například octan sodný, monolaurát sorbitanu, oleát triethanolaminu atd.

Nejnovějším pokrokem v parenterálním podávání je použití systémů, které umožňují pomalé uvolňování účinné látky tak, že je dosaženo konstantní obsah v průběhu uvolňování. Viz, např. US 3 710 795, který je zde uveden jako reference. Antioxidační komplexy salen-kov se mohou podávat transdermální cestou (např. iontoforetickým transportem) jak pro lokální tak pro celkové podávání.

Pokud je to nutné, podává se pacientovi, po zlepšení jeho stavu, udržovací dávka. Následně může být sníženo dávkování nebo frekvence s jakou se dávky podávají nebo oboje v závislosti na příznacích na množství, při kterém se zachová zlepšený stav. Pokud se příznaky zmírní na požadovanou úroveň, je možné s léčením přestat. Pacient nicméně může požadovat další dlouhodobé léčení ať proti recidivě příznaků nemoci, nebo profylakticky jako prevenci.

Antioxidační komplex(y) salen-kov se mohou také přidávat do krve určené k transfuzi, aby se omezilo oxyradikálové poškození krevních buněk a složek během skladování, podobně mohou antioxidační komplexy salen-kov snižovat oxyradikálové poškození krevních buněk také in vivo.

Antioxidační komplex(y) salen-kov mohou být také přidány do vyplachovacích nebo skladovacích roztoků pro orgány a tkáně jako například pro transplantace orgánů nebo výplachy po operacích. Například je vyjmutý orgán často umístěn do ochranného roztoku než se transplantuje příjemci. Zahrnutí přinejmenším jednoho antioxidačního komplexu salen-kov do ochranného roztoku, obvykle v koncentraci 0,01 mM až 10 mM, je žádoucí pro snížení ischemického poškození během skladování a reperfuzního poškození, které následuje po reimplataci příjemci. Pro přidání komplexu salen-kov jsou vhodné různé roztoky popsané v dané problematice včetně těch, ale tímto výčtem nejsou nijak omezeny, které jsou popsány v US 5 145 771, Beyersdorf (1990) ChemAbst. 113: 84849w, US 4 879 283, US 4 873 230, a US 4 798 824, které jsou zde uvedeny jako reference.

Obvykle je antioxidační komplex salen-kov přítomen ve vyplachovacím nebo skladovacím roztoku v koncentraci od 10 μΜ až 10 mM a nejobvykleji je přítomen v koncentraci 1 mM. Například, ale tímto příkladem předkládaný vynález není nijak vymezen, vhodný vyplachovací roztok obsahem Ringerův roztok (102 mM NaCl, 4 mM KC1, 3 mM CaCl₂, 28 mM mléčnanu sodného, pH 7,0) nebo Ringerův roztok s 0,1 mM adenosinu a antioxidační komplex salen-Mn C7 v koncentraci 1 mM. Vyplachovací roztok může dále obsahovat další antioxidanty (např. glutathion, allopurinol). Ochranné nebo vyplachovací roztoky, které obsahují antioxidační komplex salenkov lze využít ke zlepšení skladování nebo vyplachování orgánů (např. ledvin, jater, slinivky břišní, plic, plodové nervové tkáně, srdce, vaskulámích transplantátů, kosti, vaziva, šlach, kůže),

-29CZ 296288 B6 o kterém se předpokládá, že zlepší životnost tkáně a zvýší odolnost proti oxidativnímu poškození (např. jako důsledek ischemie/reperfuze).

Bez vazby na nějakou určitou teorii o působení antioxidačních nebo katalytických oxyradikálových lapačů, se předpokládá, že přebytečné dávky nebo koncentrace katalytického komplexu(ů) salen-kov podle předkládaného vynálezu může produkovat volné radikály, jako je hyperoxid, způsobem, který je podobný přítomnosti velkého množství volného železa. Na tomto základě se předpokládá, že se při antioxidačním léčení vysoké dávky komplexu salen-kov s výhodo nepodávají dlouhou dobu. Nicméně se také předpokládá, že podávání vysokých dávek katalyticky aktivního komplexu salen-kov se může využít ke generaci volných radikálů, jako je hyperoxid v určitých místech (např. pro léčení akné, léčení rakoviny kůže) nebo v buněčných kulturách nebo u transgenních zvířat, která nesou transgen, který je pod traskripční kontrolou ARE. Pro zlepšení generace volných radikálů (např. hyperoxidu) se s výhodou určitý místa, buněčné kultury nebo transgenní zvířata vyskytují přetlaku a/nebo atmosféře obohacené kyslíkem (např. více než 21 % molekulárního kyslíku).

Případně lze schopnosti antioxidačních komplexů salen-kov rozkládat reaktivní kyslíkaté látky využít s výhodou k inhibici nebo zpomalení poškození biologických tkání a buněk. Například benzoylperoxid se používá k léčení lézí akné, přebytečná nebo nevhodná aplikace benzoylperoxidu (např. náhodné zasažení očí) se může léčit místním (pokud je to nutné i celkovým) podáváním antioxidačního komplexu salen-kov (např. C7). Podobně poškození pojivové tkáně (např. kolagenu) vyvolané oxyradikály doprovázející vystavení UV záření, kouření cigaret a stárnutí může být omezeno podáváním antioxidačního komplexu salen-kov spolu s vystavením UV záření, kouřením cigaret nebo jinými procesy, při kterých vznikají oxyradikály (např. stárnutí buněk).

Chemoprotekce a radioprotekce

Antioxidační komplexy salen-přechodný kov, zejména antioxidační komplexy salen-Mn, jako je sloučenina C7, se používají k ochraně buněk a tkání před látkami, které produkují volné radikály, jako jsou chemoterapeutika (např. bleomycin) a ionizující záření. S výhodou se ochranná dávka, která obsahuje přinejmenším 1 pg komplexu salen-Mn/kg tělesné hmotnosti, podává jednou nebo více cestami (např. orálně, intravenózně, intraperitoneálně, výplachy zažívacího traktu, klystýrem, infuzí, povrchově nebo inhalací), s výhodou injekce liposomů nebo immunoliposomů do cílové tkáně pro antioxidační komplexy salen-kov, aby se ochránily normální buňky, například proti toxicitě volných radikálů, která je spojena s chemoterapií nebo radioterapií nádoru. Antioxidační komplexy salen-přechodný kov se s výhodou podávají pacientovi před chemoterapií a/nebo radioterapií, obvykle 24 hodin před a s výhodou 3 až 6 hodin před chemoterapií a/nebo radioterapií. Antioxidační komplex salen-Mn se může podávat pacientovi po celou dobu léčení.

Například může být roztok antioxidačního komplexu salen-kov obalen v micelách tak, že vzniknou immunoliposomy (US 5 043 164, US 4 957 735, US 4 925 661, Connor a Huang (1985) J. Cell Biol. 101: 582, Lasic DD (1992) Nátuře 355: 279, Novel, Drug Delivery (editoři prescott LF a Nimmo VS: Wiley, New York, 1989), Reddy a kol. (1992) J. Immunol. 148: 1585, které jsou zde uvedeny jako reference). Immunoliposomy, které obsahují antioxidační komplexy salen-kov obsahující cílovou složku (např. monoklonální protilátku), která cílí immunoliposomy do buněk, které nejsou nádorové a jsou jinak citlivé na radioterapii nebo chemoterapii. Například immunoliposomy, které obsahují monoklonální protilátku, která se specificky váže k antigenu kmene hematopoietických buněk, který neobsahují rakovinné buňky, mohou být použity jako cílené antioxidační komplexy salen-kov pro kmen hematopoietických buněk, a tak chránit uvedený kmen buněk proti radioterapii nebo chemoterapii, která se používá k léčení rakoviny. Této strategii se s výhodou využívá když chemoterapeutikum tvoří in vivo volné radikály (např. bleomycin).

Antioxidační komplexy salen-Mn se také podávají jedincům jako ochrana před poškozením radiací nebo chemikáliemi, které tvoří volné radikály. Vojáci a osoby, které pracují v jaderné me

-30CZ 296288 B6 dicíně a/nebo chemických závodech mohu dostávat komplexy salen-Mn profylakticky. Antioxidační komplexy salen-kov se také používají jako chemoprotekce proti chemikáliím, které mohou vyvolávat rakovinu, zejména kancerogeny, které tvoří reaktivní epoxidové meziprodukty (např. benzo-[a]-pyren, benzantracen) a kancerogeny, které tvoří nebo nepřímo tvoří kancerogeny (např. fenobarbital, TPA, bezoylperoxid, proliferátory peroxisomů: ciprofíbrát, klofibrát). Osobám které jsou vystaveny těmto kancerogenům se preventivně podává antioxidaění komplex salen-kov, aby se snížilo riziko vzniku nádoru.

Antioxidaění komplexy salen-kov se také mohou s lipofílním (nebo pokud je to žádoucí s vodným) nosičem používat pro povrchové aplikace v kosmetice nebo ochranných krémech a pleťovém mléku jako prevence spálení na slunci. Krém, pleťové mléko nebo kosmetický přípravek obvykle obsahuj 1 mg až 50 mg antioxidačního komplexu salen-kov na gram krému, pleťového mléka nebo kosmetického přípravku.

Antioxidační komplexy salen-kov se také mohou podávat hloubkovým potápěčům nebo jedincům, kteří jsou vystaveni přetlaku, kdy jedovatost kyslíku představuje ohrožení zdraví. Podávání účinné dávky antioxidačního komplexu salen-kov umožňuje dýchání za vyššího tlaku se snížením rizika jedovatosti kyslíku. Také se předpokládá, že podávání účinných dávek antioxidačního komplexu salen-kov může snížit jedovatost a biologické poškození, které je spojeno s vystavením ozónu. O profylaktickém podávání antioxidačního komplexu salen-kov lidem, kteří jsou nebo budou vystaveni ozónu se předpokládá, že zvýší odolnost proti jedovatosti ozónu, jako je poškození plic vyvolané ozónem zaznamenané v některých oblastech s vysokou koncentrací ozónu (např. Los Angeles).

Prospěšnost, testování a podávání

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu, antioxidační komplexy salen-přechodný kov, s výhodou komplexy salen-Mn, se používají k ochraně před ischemickým poškozením srdce včetně infarktu myokardu, selhání srdce, angíny, arytmie, oběhových nemocí a mrtvice. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu inhibují vliv ischemie (koronární infarkt a reperfuze srdce, ischemie srdce nebo CNS během operace) bez přímého vlivu na srdeční stahy. Sloučeniny jsou účinné u zvířat u nemocí srdce a CNS a jsou použitelné pro léčení infarktu myokardu, mrtvice, poškození mozku a transplantační chirurgie, zejména s reperfuzí oblastí postižených infarktem, arytmií, různých narušení vyvolaných angínou, selhání srdce a jiných nemocí oběhu u savců, zejména u lidí. Komplexy salen-kov se také používají do lázní pro orgány (např. srdce, ledviny, slinivka břišní, játra, plíce) během transportu a skladování před transplantací, včetně štěpů kůže a cév. Ochranné roztoky obvykle obsahují přinejmenším 1 μΜ antioxidačního komplexu salen kov, s výhodou přinejmenším 1 mM antioxidačního komplexu salen-kov.

Podávání aktivní sloučeniny a solí popsaných v tomto dokumentu se provádí jakýmkoliv běžným způsobem podávání terapeutik. Tyto způsoby zahrnují orální, parenterální, transdermální, subkutánní a další způsoby podávání. Preferovaný způsob podávání je orální, kromě těch případů kdy není léčený subjekt schopen polknout jakýkoliv lék. V těchto případech je nutné podávat prostředek parenterálně. Pokud prostředek obsahuje antioxidační komplex salen-kov, který má aminosubstituent, který může být protonován při fyziologickém pH, obvykle se preferuje, aby se antioxidační komplex salen-kov rozpustil nebo suspendoval v roztoku, který má pH, při kterém je aminosubstituent protonován.

Množství aktivní sloučeniny, které se podává, závisí ovšem na tom kdo je léčen, jakou má hmotnost, na prudkosti nemoci, způsobu podávání a posouzení lékařem. Nicméně, účinná dávka je v rozsahu 0,01 až 50 mg/kg/den, s výhodou 0,5 až 25 mg/kg/den. Pro člověka o hmotnosti 70 kg je tato dávka 0,7 až 3500 mg na den s výhodou 35 až 1750 mg na den.

-31 CZ 296288 B6

Protože se všechny účinky sloučenin salen-Mn, které jsou popsány v tomto dokumentu dosahují podobným mechanismem, dávkování (a způsobu podávání) jsou obecně ve stejných preferovaných rozmezích pro všechna použití.

Následující příklady slouží jako ilustrace a nějako omezení předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Katalytické aktivity in vitro

Stanovovaly se antioxidační katalytické aktivity komplexů salen-Mn, Cl, C4, C6, C7, C9, C10, Cil a C12 (viz obr. 3), hyperoxid dismutasová a katalasová aktivita s stanovovala následujícím způsobem.

Stanovení

SOD aktivita sloučenin se stanovovala vyhodnocením inhibice redukce cytochromu C produkované systémem, který generuje volné radikály kyslíku, xanthin a xanthin oxidasa. Redukce cytochromu C se sleduje spektrofotometricky při 550 nm způsobem popsaným v práci Darr a kol. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 258: 351, která je zde uvedena jako reference. Koncentrace xanthin oxidasy se nastavuje tak, že redukce cytochrému probíhá při 550 nm rychlostí, 0,025 jednotek absorbance za minutu. Za těchto podmínek je množství SOD aktivity nutné k inhibici rychlosti redukce cytochromu C o 50 procent (tj. na rychlost 0,0125 jednotek absorbance za minutu) definováno jako jednotková aktivita. Komplexy salen-kov se označují jako antioxidanty pokud mají aktivitu přinejmenším 0,1 jednotky při koncentraci 1 mM za těchto standardních podmínek stanovení.

Katalasová aktivita se měří pomocí spektrofotometrické metody, kdy se sleduje rozklad peroxidu vodíku při 240 nm způsobem popsaným v práci Aebi a kol. (1984) Methods Enzymol. 105: 121, která je zde uvedena jako reference. Jedna jednotka katalasové aktivity je definována jako množství enzymu (nebo komplexu salen-kov), které je nutné k rozložení 1 pmolu peroxidu vodíku za jednu minutu. Každá z těchto sloučenin byla rozpouštěna v roztoku soli a byla stabilní, bez ztráty aktivity během několika týdnů skladování při teplotě místnosti. Často je nutné, aby se komplex salen-kov nejprve rozpustil v organickém rozpouštědle (např. DMSO) a pak se tento roztok zředil polárnějším rozpouštědlem jako je voda. To je zejména preferováno u komplex salen-kov, které jsou relativně hydrofobní (např. C12).

Tabulka IV ukazuje SOD a katalasové aktivity různých testovaných komplexů salen-Mn in vitro. SOD a katalasové aktivity jsou uvedeny v jednotkách/mM.

-32CZ 296288 B6

Tabulka IV

komplex salen-kov	SOD aktivita	katalasová aktivita
Cl	308	262
C4	312	200
C6	812	0
C7	575	200
C9	111	20
C10	69	179
Cil	101	46
C12	4397	144

Biologické aktivity in vivo

Široce využívané stanovení terapeutické účinnosti molekul při mozkové ischémii sestává z hodnocení jejich schopnosti bránit nevratnému poškození vyvolanému anoxickým stavem v plátcích mozkové tkáně za fyziologických podmínek. Vrstvičky tkáně krysího mozku se při 35 °C umístily do komůrky, která obsahuje umělý mozkomíšní mok, který sestává ze 124 mM NaCl, 3 mM ío KC1, 1,25 mM KH₂PO₄, 3 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 26 mM NaHCO₃, 10 mM D-glukózy a 2 mM L-askorbátu a kontinuálně se probublává směsí O₂ : CO₂ (95 : 5). Atmosféra v komůrce se také průběžně sytí směsí O₂ : CO₂ (95 : 5) kromě momentu anoxického stavu, kdy je nahrazen N₂. Axony se elektricky stimulují a vyvolané excitační postsynaptické potenciály (EPSP) se zaznamenávaly mikroelektrodami.

Obr. 4 zobrazuje schematicky EPSP zaznamenané za normálních podmínek (A), pět minut po nahrazení O₂N₂ (ischemický stav B) a období 30 až 40 minut po reoxygenaci (C). Rozsah trvalého poškození lze stanovit měřením amplitudy (v mV) a výchozího sklonu (v mV/ms) EPSP.

Obrázky 5 a 6 zobrazují ochranný vliv antioxidačního komplexu salen-kov označeného C7 v ischemickém systému vrstviček tkáně krysího mozku. Vrstvičky mozkové tkáně byly inkubovány s a bez 50 μΜ C7 a vystaveny ischemii/reoxygenaci. Po 5 minutách zaznamenávání základní linie se O₂ nahradil N₂ na dobu 5 minut. Pak se opět vrátil O₂ a zaznamenávání pokračovalo ještě po dobu 50 minut. Vzorky s 50 μΜ C7 vykazovaly amplitudu i sklon EPSP jako před ische25 mickým stavem. Naopak plátky mozkové tkáně, které neobsahovaly C7 dosáhly pouze 40 % preischemických hodnot.

Pro další stanovení účinnosti se stanovila procenta živých vrstviček, která zůstala po opakovaném ischemickém stavu. Obr. 7 zobrazuje, že zatímco bez C7 je toto procento velmi nízké (6 %), 30 dosahovalo až 70 % vrstviček, na které se působilo 50 μΜ C7. Vrstvičky byly pokládány za živé pokud jejich EPSP mělo amplitudu 3 mV.

Testování na zvířecích modelech

Zvířecí model Parkinsonovy nemoci, který zahrnuje tvorbu iatrogenních hydroxylových radikálů pomocí MPTP (Chiueh a kol. (1992) Synapse 11: 346, která je zde uvedena jako reference), byl použit ke stanovení ochranného vlivu C7 na poškození vyvolané volnými radikály. Neurotoxin MPTP, vede k degeneraci dopaminergních neuronů v mozku, díky čemuž je to dobrý model experimentálně vyvolané Parkinsonovy nemoci (např. iatrogenní jedovatost). Tento model je 40 nyní široce přijímán v této problematice a používá se pro stanovení potenciálních terapeutik pro tuto nemoc.

Počet dopaminergních neuronů ve vrstvičkách mozkové tkáně myší, na které se působilo (1)

MPTP samotným, (2) antioxidačním komplexem salen-kov C7 samotným, (3) předléčení C7 a pak MPTP nebo (4) kontrolní vzorek, na který se ničím nepůsobilo, byl stanoven měřením vazby dopaminového ligandu, mazindolu. Tritiovaný mazindol byl použit pro studii vazby na

-33 CZ 296288 B6 vzorcích myšího mozku (globus pallidus, caudate nucleus a striatum) běžným způsobem, specifická vazba tritiovaného mazindolu se stanovila autoradiograficky nebo membránovým vázáním (specifické vázání k membránové frakci). Experiment se prováděl po dobu 7 dnů. Na myši ve skupině MPTP se působilo intraperitoneálně samotným MPTP (40 mg/kg každý den v den 1 a den 2). Na myši ve struktuře MPTP+C7 se působilo nejprve C7 (33 mg/kg i.p.) těsně před podáním MPTP v den 1 a den 2 a pak se v den 3 podalo 3 mg/kg C7. Po 7 dnech byla zvířata utracena. Výsledky zobrazené v obr. 8 ukazují jasný ochranný vliv komplexu dalen-Mn C7 in vivo. Obr. 8 ukazuje, že počet dopaminergních neuronů, který je přítomen v různých regionech myšího mozku není nepříznivě ovlivněn antioxidačním komplexem salen-kov C7, ale počet dopaminergních neuronů u myší, na které se působilo MPTP samotným se snížil na 15 % kontrolní hodnoty, ale předléčení C7 přibližně zdvojnásobilo počet dopaminergních neuronů, které přežily, u myší, na které se následně působilo MPTP. Nejedovatost C7 byla ukázána tím, že nedošlo k nepříznivým vlivům na myši, na které se působilo samotným C7 během doby 7 dnů.

Tato data ukazují, že komplexy salen-kov vykazují terapeutickou účinnost in vivo u hlodavčích modelů lidských nemocí a také ukazují, že komplexy salen-Mn účinně prochází hematocerebrální bariérou. Celkově data ukazují vysoký účinek komplexů salen-Mn při prevenci poškození vyvolaného volnými radikály a ischemicko/reoxygenačního poškození mozku.

Vliv C7 na izolovaná krysí srdce předávkovaná železem, vystavená ischemii a reperfuzi

Krysy dostaly intramuskulární injekci 0,25 ml roztoku železo-dextra (100 g hydroxidu železitého, 99 g dextranu, doplnit vodou do 1 1) každý třetí den po dobu 5 týdnů, aby se dosáhlo znatelného předávkování srdeční tkáně železem. Po této době byla u krys provedena anesteze pentabarbitalem sodným (40 mg/kg) a pak se jim podal stehenní žilou heparin (1,000 IU/kg). Pak se srdce vyjmula a rychle připojila aortou, způsobem podle Lagendorffa [Lagendorff, O., Pflůgers Arch. 61: 291, 1895] na konstantní průtok 11 ml/minutu. Perfusní kapalina byla upravený pufř Krebse-Henseleita, který obsahuje (v mmol/1): NaCl 118, KC1 5,9, NaHCO₃, 25, MgCl₂ 1,2, NaH₂PO₄ 0,6, CaCl₂ 2,4, glukóza 11. pH se udržovalo na hodnotě 7,4 ± 0,05 a toto perfusní médium se sytilo při 37 °C směsí O₂ - CO₂ (95 % až 5 %). Perfusní aparát byl plně termostatován tak, aby teplota perfusního média byla při dosažení aorty 37,0 ± 0,5 °C. Do levé komory se vložil ultratenký balónek těsně po napojení aorty a byl nafouknut tak, aby se získal diastolický tlak 5 mm Hg. Po umístění balónku následovalo 15 minut na stabilizaci systému. Po této době se odečetl systolický a diastolický tlak v levé komoře a rychlost tepu srdce (heart beat rate HR) se změřila převodníkem tlaku, který byl připojen na balónek v levé komoře. Vzniklý tlak v levé komoře (left venticular developed pressure LVDP) se vypočetl jako rozdíl mezi tlakem systolickým a diastolickým a součin HR x LVDP je index spotřeby kyslíku. Srdce se pak podrobila 15 minutové naprosté globální normothermické ischemii, která byla následována 15 minutami reprefuse perfusním médiem, které se použilo na začátku. Během 15 minut reperfuze se měřil tep, systolický a diastolický tlak. První fibrilace byly analyzovány 1 minutupo začátku reperfuze.

Studovaly se tři experimentální skupiny. Skupina 1 (n = 7), ve které byla srdce připojena na standardní perfusní roztok (kontrolní skupina), skupina 2 (n=8) byla připojena na perfusní roztok, který obsahoval dimethylthiomočovinu (DMTU, 10 μΜ) a skupina 3 (n=8), kde perfusní roztok obsahoval C7 (50 μΜ).

Po 15 minutách reperfuze byla 3 srdce z každé skupiny připravena pro elektronovou mikroskopii perfusí 2,5 % glutaraldehydem. Zkoumaly se ultratenké vrstvičky ((500 až 6OO).lO’^lom) (500 až 600 Á) tloušťky.

Výsledky

Následující Tabulka V ukazuje tep (HR), systolický tlak (SP), diastolický tlak (DP) a součin HR x LVPD ve třech experimentálních skupinách po 15 minutách perfuse, před ischemii (před),

-34CZ 296288 B6 minutu po reperfuzi (1 po) a 15 minut po reperfuzi (15 po). Tabulka také ukazuje počet srdcí, která vykazují fibrilaci 1 minutu po reperfuzi (VF).

Tabulka V

	HR (tepy/min)	SP (mm Hg)	DP (mm Hg)	HR x LVDP (x 10.3)	VF
kontrola:
před	276± 11	78 ±7	6,3 ± 0,3	19,6 ± 1,6	-
1 po	96 ±0	40 ±6	23,3 ± 6,0	4,2 ± 1,7	5/7
15 po	232 ± 15	62 ± 10	13,6 ±4,2	12,6 ±2,3	-
+DMTU:
před	280 ± 10	97 ±4	4,7 ± 0,3	24,1 ± 0,6	-
1 po	91 ± 10	62 ±9*	37,2 ± 10,0	3,5 ± 1,2	3/8
15 po	226 ± 18	58 ±6	27,8 ± 9,4	9,4 ± 2,0	-
+ C7:
před	278 ±7	90 ±2	5,4 ± 0,3	23,5 ± 0,9	-
1 po	130±13#	72 + 8#	5,8+ 0,5#	9,9 ± 0,8#±	2/8
15 po	241 ± 15	92 ± 15	8,3 ± 0,6	21,7±3,4Q±	-

*: p < 0,01, DMTU proti kontrole ve stejném čase #: p < 0,01, C7 proti kontrole ve stejném čase

Π: p < 0,05, C7 proti kontrole ve stejném čase ±: p < 0,01, C7 proti DMTU ve stejném čase

Tabulka VI shrnuje výsledky elektronové mikroskopie srdcí. Mitochondrie byly klasifikovány do skupiny typ A (normální), typ B (nabobtnalé, nerozbité) a typ C (prasklé membrány). Sarkomery byly klasifikovány do skupin typ A (normální) a typ B (kontaktované a/nebo nekrosa). Výsledky jsou vyjádřeny v procentech. Počet analyzovaných mitochondrií byl 1293, 1632 a 1595 pro kontrolu, skupinu DMTU a skupinu C7. Počet analyzovaných sarkomerů byl 1046, 1173 a 1143 pro kontrolu, skupinu DMTU a skupinu C7.

Tabulka VI

	mitochondrie typ A	typB	typC	sarkomery typA	typB
kontrola	10,4	21,0	68,5	21,3	78,7
+DMTU	14,3*	19,5	66,2	13,7+	86,3+
+C7	31,0#±	15,2#a	53,8#±	60,6#±	39,4#±

*: p < 0,05, DMTU proti kontrole +: p < 0,01, DMTU proti kontrole #: p < 0,01, C7 proti kontrole a: p < 0,05, C7 proti DMTU ±: p < 0,01, C7 proti DMTU

-35 CZ 296288 B6

Data ukazují, že C7 účinně chrání srdce před ischemicko reoxygenačním poškozením, jak funkčně, tak strukturně. Navíc je C7 znatelně účinnější antioxidant než DMTU, dokonce i když je použit v 200 krát nižší koncentraci.

Experimentální autoimunní encefalitida (EAE)

EAE je zvířecí model roztroušené sklerózy. 30 samic myší SJL, stáří 10 týdnů, bylo rozděleno na dvě skupiny 20 myší (kontrola) a 10 myší (léčení C7).

Myši z obou skupin byly imunizovány encefalitogenním PLP peptidem ve Freundově adjuvantu, subkutánně a následně se jim podal Petrissiho toxin (IV). Podávání Petrussiho toxinu bylo opakováno v den 3 po imunizaci.

Myši ve skupině C7 se léčily denně (1 mg/myš, přibližně 40 mg/kg) IP injekcí, ode dne 2 před imunizací do dne 14 po imunizaci.

Zvířata byla označena následovně:

stadium I: syndrom pokleslého ocasu stadium II: paralýza zadních končetin stadium III: paralýza zadních končetin- pohyb vláčením stadium IV: paralytická nepohyblivost, ztráta hmotnosti

Výsledky

Během třetího týdne po imunizaci měl 8 z 20 myší v kontrolní skupině příznaky rozvinuté EAE: 2 stadium I, 4 stadium IEIII, 2 stadium IV.

V tomtéž čase, měla pouze jedna z 10 myší ve skupině léčené C7 příznaky rozvinuté EAE (stadium II).

Během pátého týdne, tj. tři týdny poté, co bylo léčení pomocí C7 zastaveno, mělo 6 myší ve skupině léčené C7 příznaky rozvinuté EAE, 4 stadium II a 2 stadium IV.

Tyto výsledky ukazují, že léčení pomocí C7 brání rozvinutí příznaků EAE, a že nemoc se může rozvinout až po přerušení léčení.

Peroxidace lipidů

Hippokampální vrstvičky (400 pm tenké) ze Sprague-Dawleyových krys (150 až 200 g) byly umístěny v okysličeném (95 % O₂/5 % CO₂) Krebs-Ringerově fosfátovém médiu (pH 7,4), které obsahuje NaCl 120 mM, KC1 5 mM, CaCl₂ 1,3 mM, MgCl₂ 1,2 mM, Nafosfát 16 mM (pH 7,4) a glukózu 10 mM. Po 15 minutách preinkubace ve vodní lázni 35 °C teplé byl pufr nahrazen stejným (kontrola) nebo upraveným pufrem (laktátový pufr), který obsahuje NaCl 90 mM, KC1 5 mM, CaCl₂ 1,3 mM, MgCl₂, 1,2 mM, Nafosfát 16 mM (pH 7,4) a kyselinu mléčnou 30 mM (pH 5,0). Pak se během preinkubace a inkubace přidá C7 (50 μΜ). Po 100 minutách byly vrstvičky spojeny a homogenizovány v 0,9 ml TCA 5 % a 0,35 ml TCA 5 % se přidalo do 0,5 ml inkubačního média. Peroxidace lipidů se měřila přidáním 0,25 ml reagentu thiobarbiturové kyseliny (TBAR) do 0,85 ml TCA extraktů a inkubováním směsi po dobu 60 minut při 85 až 93 °C. Lipidy se pak extrahovaly 2 až 0,5 ml 1-butanolu třepáním po dobu 10 s a následnou centrifugací při 2000 ot./min po dobu 10 minut. Absorbance peroxidizovaných lipidů v alkoholické fázi se měřila spektrofotometricky při 532 nm. Data se vyjádřila jako nmoly malondialdehydu

-36CZ 296288 B6 (MDA) za použití skutečného MDA ke stanovení kalibrační křivky. Z proteinů se měřil alikvotní podíl z TCA extraktů za použití Bradfordovy metody a konečné výsledky se počítaly jako nmoly tvořeného MDA/mg proteinu.

Výsledky

Obr. 9 ukazuje peroxidaci lipidů v čase 0 (okamžitě po oddělení) a po 100 minutách inkubace při pH 7,4 (kontrola), při pH 5,0 (laktát) bez (LA) nebo s (LA+C7) 50 μΜ C7 ve vrstvičkách homogenátů (šrafované sloupce) a v inkubačním médiu (tečkované sloupce). Data jsou průměry ± S.D. (standardní odchylka) a experimentální skupina C7 byla statisticky velmi významná ve srovnání s kontrolou (p < 0,01) zatímco malé rozdíly mezi LA a LA+C7 nejsou. Inkubace hippokampálních vrstviček s 30 mM laktátu při pH 5,0 vede k velkému zvýšení peroxidace lipidů, jak bylo změřeno thiobarbiturovým testem. Inkubace vrstviček s C7 (50 μΜ) naprosto odstranila zvýšení peroxidace lipidů. Zvýšení koncentrace malondialdehydu vyvolané laktátem jak v inkubačním médiu (tečkované sloupce) tak v homogenátu vrstviček (šrafované sloupce) bylo blokováno C7. Inkubace po dobu 100 minut bez laktátu ať s nebo bez C7 nezpůsobila jakékoliv významné zvýšení peroxidace lipidů.

Tato data ukazují, že C7 brání peroxidaci lipidů vyvolané acidózou. O acidóze je známo, že vyvolává oxidativní poškození. Peroxidace lipidů je následkem takového oxidativního poškození a ukázalo se, že má vztah kmnoha patologickým stavům.

Modely poškození in vitro

Anoxie v hippokampálních vrstvičkách. Na hippokampálních vrstvičkách (400 pm) z dospělých Sprague-Dawleyových krys, které byly umístěny ve dvou komůrkách při 35 °C s nebo bez 50 mM C7, byly provedeny elektrofyziologické experimenty. Skleněná záznamová pipeta byla umístěna na CA1 stratům radiatum, aby zaznamenávala excitační postsynaptický potenciál (EPSP) vyvolaný elektrickou stimulací Schafer-commissural cesty bipolární stimulační elektrodou při frekvenci 0,033 Hz. Během anoxního děje je dodávání kyslíku nahrazeno 100% N₂. N₂ se dodává po dobu 90 sekund elektrického klidu, po kterém se obnoví dodávání O₂. Obnovení EPSP (tvaru i amplitudy) se zaznamenávalo po dobu 50 minut, po kterých byl stanoven čas celkové životnosti vrstviček s tím, že živost je definována jako schopnost plátků generovat 3 mV EPSP.

Acidóza v hippokampálních vrstvičkách. Hippokampální vrstvičky se umístily v okysličeném Krebs-Ringerově fosfátovém pufru snebo bez 50 μΜ C7 při 35 °C v třepané vodní lázni. Po 15 minutách preinkubace, byly vrstvičky přeneseny do téhož pufru nebo do pufru, který obsahuje 30 mM laktátu o pH 5,0 (s nebo bez C7). Vrstvičky ze všech skupin se po 100 minutách inkubace testovaly na peroxidaci lipidů jak bylo popsáno malondialdehydovou reakcí s thiobarbiturovou kyselinou.

Model neuronálního poškození in vivo

MPTP v myších. Dospělým samcům myší CFW (25 až 33 g) se daly dvě injekce MPTP rozpuštěného v normálním roztoku soli (40 mg/kg, subkutánně) po 24 hodinách. Skupina zvířat také dostala ve třech injekcích po 24 hodinách C7 (33 mg/kg, subkutánně) se začátkem 1 den před podáváním MPTP. Po 7 dnech od první injekce MPTP byla zvířata utracena a neuronální patologie se stanovovala vázáním ³H-mazindolu, ligandu pro dopaminový přenašeč do 10 mm zmrzlé mozkové tkáně nebo do striatálního homogenátu.

6-OHDA v myších. Byla provedena anesteze samců myší CFW ketaminem a rumpunem a jejich imobilizace ve stereotaxickém zařízení. 6-OHDA se jako hydrobromid rozpustil v normálním roztoku soli s 1 % askorbátu a 50 μg se dodalo do laterální komory pomocí 10 μΐ Hamiltonovy stříkačky. C7 (66 mg/kg, intraperitoneálně) se podávalo denně po dobu 4 dnů. Zvířata byla utra

-37CZ 296288 B6 cena o 7 dnů později a neuronální patologie se stanovovala vázáním ³H-mazindolu, ligandu pro dopaminový přenašeč do striatálního homogenátu.

Výsledky

C7 chrání hippokampální vrstvičky před poškozením vyvolaným anoxií

Hipokampální vrstvičky byly podrobeny anoxním podmínkám s nebo bez C7 (50 μΜ). C7 poskytuje jasné zlepšení ochrany proti snížení synaptické odpovědi vCAl, které je způsobeno anoxií. Snížení tvaru EPSP (A) a amplitudy EPSP (B) bylo zabráněno pomocí C7. Čištěný hovězí SOD v téže zkoušce neposkytoval žádnou ochranu.

Obr. 10 ukazuje i.c.v. injekce 6-OHDA (50 pg), které vedou k 60 až 70% snížení vázání mazindolu v homogenátech v ipsilaterálním striatu od místa injekce a 30% snížení v kontralaterálním striatu (obr. 10). Léčení pomocí C7 (4 x 66 mg/kg) vedlo k znatelnému snížení na ipsilaterální straně a úplné ochraně na kontralaterální straně.

Podávání MPTP (2 x 40 mg/kg, subkutánně) vedlo k 75 až 80% snížení vázání mazindolu. Léčení pomocí C7 (4 x 33 mg/kg, subkutánně) vedlo k znatelnému (p < 0,05) stupni ochrany proti snížení vázání ³H-mazindolu jak v globus pallidus tak v caudate nucleus (panel A). Samo léčení pomocí C7 nemá žádný znatelný vliv na vázání ³H-mazindolu. Totéž léčení také vede k znatelné ochraně proti snížení vázání ³H-mazindolu, které se měří v striatálních homogenátech (panel B).

Závěr

Tyto výsledky ilustrují ochranný vliv syntetického katalytického lapače (SCS) C7 na různých modelech neuronálního poškození. C7 byl schopen chránit neurony proti akutním projevům neuronálního poškození, jako je peroxidace lipidů a ztráta synaptické živosti, stejně jako proti déletrvajícím projevům neuronálního poškození, jako je neuronální ztráta 7 dnů po injekci toxinu.

Vzhledem k pozitivnímu vlivu, který se dostavil po periferní injekci C7 u in vivo modelů neuronálního poškození dovozujeme, že komplex je in vivo stabilní a prochází hematocerebrální bariérou stejně jako neuronálními membránami.

Pozitivní vliv C7 na různé modely neuronálního poškození ukazuje, že reaktivní kyslíkaté látky, zejména hyperoxidový radikál, hrají důležitou roli v patologickém stavu vyvolaném ischemii a acidózou a u ztrát nigrostriatálních dopaminergních neuronů vyvolaných MPTP a 6-OHDA.

Vzhledem k širokému rozsahu patologických stavů, které jsou spojeny s nadprodukcí kyslíkatých radikálů, podporují tyto výsledky myšlenku, že antioxidační komplexy salen-kov jako je C7 mohou mít široké rozmezí terapeutických aplikací.

Předchozí popis preferovaných příkladů předkládaného vynálezu byl předložen za účelem ilustrace a popisu. Není pokládán za vyčerpávající nebo omezující vynález v mnoha modifikacích a variantách, které jsou na základě vynálezu možné.

Takové modifikace a varianty, které jsou na základě předkládaného vynálezu jasné osobě, která je v dané problematice vzdělaná, patří do rámce tohoto vynálezu.

Průmyslová využitelnost

Prostředky podle předkládaného vynálezu lze použít pro prevenci a léčení všech nemocí, které souvisí s volnými radikály.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení nemocí, které souvisí s volnými radikály, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje antioxidační komplex salenkov ve farmaceuticky přijatelné formě, přičemž antioxidační komplex salen-kov je sloučenina obecného vzorce I:

kde M je vybráno ze skupiny sestávající z Mn, Co, Fe, V, Cr a Ni, A je anion vybraný ze skupiny sestávající z negativně nabitých skupin PF₆, (aryl)₄, BF₄, B(aryl)₄, halogenidů, acetátů, triflátů a tosylátů nebo chybí, n je 0, 1 nebo 2,

Xi, X₂, X₃ a X₄ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, silylů, arylů, které sestávají z jednoho kruhu nebo zvíce kondenzovaných kruhů, které jsou nesubstituovány nebo výhodně substituovány, ary laiky lů -R-Ar a -R-HetAr, kde Ar je arylová skupina, HetAr je heteroarylová skupina a R je alifatická skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem, které jsou případně dále substituovány, primárních alkylů, sekundárních alkylů, terciárních alkylů, kde alkyl je cyklická alkylová skupina nebo alkylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem, sestávající z jednoho až dvanácti atomů uhlíku a obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku, alkoxyskupin -O-R, kde R je alkylová skupina nesubstituovaná nebo substituovaná jedním nebo více substituenty vybranými z halogenu, alkylu, alkylthiolu, trifluormethylu, acyloxylu, hydroxylu, thiolu, karboxylu, aryloxylu, arylu, arylalkylu, heteroarylu, aminoskupiny, alkylaminoskupiny, dialkylaminoskupiny, morfolinu, piperidinu, pyrrolidm-l-ylu nebo piperazin-l-ylu, aryloxyskupin -Ο-Ar, kde Ar je aryl nebo aromatická skupina, aminoskupin, kvartérních aminů, heteroatomů a vodíku,

Yi, Y₂, Y₃, Y₄, Y_s a Y₆ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, halogenů, alkylů sestávajících z jednoho až dvanácti atomů uhlíku, kde alkyl je cyklická alkylová skupina nebo alkylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem, obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku, arylů, které sestávají z jednoho kruhu nebo z více kondenzovaných kruhů, které jsou nesubstituovány nebo výhodně substituovány, arylalkylů -R-Ar a -R-HetAr, kde Ar je arylová skupina, HetAr je heteroarylová skupina a R je alifatická skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem, které jsou případně dále substituovány, silylů, aminoskupin, alkylů sestávajících z jednoho až dvanácti atomů uhlíku, kde alkyl je cyklická alkylová skupina nebo alkylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem, obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku, arylů, které sestávají z jednoho kruhu nebo zvíce kondenzovaných kruhů, které jsou nesubstituovány nebo výhodně substituovány, arylalkylů -R-Ar a -R-HetAr, kde Ar je arylová skupina, HetAr je heteroarylová

-39CZ 296288 B6 skupina a R je alifatická skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem, které jsou případně dále substituovány, které nesou heteroatomy a halogen a

Ri, R₂, R₃ a R₄ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, arylů, které sestávají 5 z jednoho kruhu nebo zvíce kondenzovaných kruhů, které jsou nesubstituovány nebo výhodně substituovány, arylalkylů -R-Ar a -R-HetAr, kde Ar je arylová skupina, HetAr je heteroarylová skupina a R je alifatická skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem, které jsou případně dále substituovány, esterů mastných kyselin, což jsou substituenty odvozené odtržením atomu vodíku od mastných kyselin vybíraných ze skupiny sestávající z kyseliny palmitolejové, olejové, petro10 selenové, vakcenové, punikové, parinakové, gadolejové, cetolejové, linolové, linolenové, arachidonové, laurové, myristové, palmitové, stearové, eikosanové, dokosanové, substituovaných alkoxyarylů -O-R-Ar, kde R je cyklická alkylová skupina nebo alkylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem sestávající z jednoho až dvanácti atomů uhlíku a obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku, a Ar je aromatický substituent, primárních alkylů, sekundárních alkylů a terciár15 nich alkylů, kde alkyl je cyklická alkylová skupina nebo alkylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem, sestávající z jednoho až dvanácti atomů uhlíku a obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku.
2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, kde nemoc související svolnými radikály je 20 vybraná ze skupiny sestávající z ischemicko/reoxygenaění události a iatrogenní jedovatosti volných radikálů, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje antioxidační komplex salen-kov ve farmaceuticky přijatelné formě, přičemž antioxidační komplex salen-kov je sloučenina obecného vzorce I:

25 kde Mje vybráno ze skupiny sestávající z Mn, Co, Fe, V, Cr a Ni, A je anion vybraný ze skupiny sestávající z negativně nabitých skupin PF₆, (aryl)₄, BF₄, B(aryl)₄, halogenidů, acetátů, triflátů a tosylátů nebo chybí, n je 0, 1 nebo 2,

X], X₂, X₃ a X₄ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, silylů, arylů, které sestávají z jednoho kruhu nebo z více kondenzovaných kruhů, které jsou nesubstituovány nebo výhodně substituovány, arylalkylů -R-Ar a -R-HetAr, kde Ar je arylová skupina, HetAr je heteroarylová skupina a R je alifatická skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem, které jsou pří35 pádně dále substituovány, primárních alkylů, sekundárních alkylů, terciárních alkylů, kde alkyl je cyklická alkylová skupina nebo alkylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem, sestávající z jednoho až dvanácti atomů uhlíku a obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku, alkoxyskupin -O-R, kde R je alkylová skupina nesubstituovaná nebo substituovaná jedním nebo více substituenty vybranými z halogenu, alkylu, alkylthiolu, trifluormethylu, acyloxylu, hydroxylu, thiolu, 40 karboxylu, aryloxylu, arylu, arylalkylů, heteroarylu, aminoskupiny, alkylaminoskupiny, dialkylaminoskupiny, morfolinu, piperidinu, pyrrolidin-l-ylu nebo piperazin-l-ylu, aryloxyskupin

-40CZ 296288 B6

-Ο-Ar, kde Ar je aryl nebo aromatická skupina, aminoskupin, kvartérních aminů, heteroatomů a vodíku,

Y_b Y₂, Y₃, Y₄, Y₅ a Y₆ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, halogenů, alkylů sestávajících z jednoho až dvanácti atomů uhlíku, kde alkyl je cyklická alkylová skupina nebo alkylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem, obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku, arylů, které sestávají z jednoho kruhu nebo z více kondenzovaných kruhů, které jsou nesubstituovány nebo výhodně substituovány, arylalkylů -R-Ar a -R-HetAr, kde Ar je arylová skupina, HetAr je heteroarylová skupina a R je alifatická skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem, které jsou případně dále substituovány, silylů, aminoskupin, alkylů sestávajících zjednoho až dvanácti atomů uhlíku, kde alkyl je cyklická alkylová skupina nebo alkylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem, obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku, arylů, které sestávají zjednoho kruhu nebo zvíce kondenzovaných kruhů, které jsou nesubstituovány nebo výhodně substituovány, arylalkylů -R-Ar a -R-HetAr, kde Ar je arylová skupina, HetAr je heteroarylová skupina a R je alifatická skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem, které jsou případně dále substituovány, které nesou heteroatomy a halogen a

R_b R₂, R₃ a R₄ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, arylů, které sestávají zjednoho kruhu nebo zvíce kondenzovaných kruhů, které jsou nesubstituovány nebo výhodně substituovány, arylalkylů -R-Ar a -R-HetAr, kde Ar je arylová skupina, HetAr je heteroarylová skupina a R je alifatická skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem, které jsou případně dále substituovány, esterů mastných kyselin, což jsou substituenty odvozené odtržením atomu vodíku od mastných kyselin vybíraných ze skupiny sestávající z kyseliny palmitolejové, olejové, petroselenové, vakcenové, punikové, parinakové, gadolejové, cetolejové, linolové, linolenové, arachidonové, laurové, myristové, palmitové, stearové, eikosanové, dokosanové, substituovaných alkoxyarylů -O-R-Ar, kde R je cyklická alkylová skupina nebo alkylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem sestávající zjednoho až dvanácti atomů uhlíku a obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku, a Ar je aromatický substituent, primárních alkylů, sekundárních alkylů a terciárních alkylů, kde alkyl je cyklická alkylová skupina nebo alkylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem, sestávající zjednoho až dvanácti atomů uhlíku a obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku.
3. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že antioxidační komplex salen-kov je vybrán ze skupiny sestávající ze sloučenin obecných vzorců IV, V, VI, VII, VIII a IX:

kde Yi a Y₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z methoxyskupiny, ethoxyskupiny, methylu, ethylu, terc-butylu, chloru, bromu, jodu, aminoskupiny, kvartémího aminu, alkylaminu, dialkylaminu a vodíku, Rj a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z fenylu, benzyloxyskupiny, chlorbenzyloxyskupiny, vodíku, aminoskupiny, kvartémího aminu nebo esteru mastné kyseliny a Y| a Y₂ jsou s výhodou stejné;

-41 CZ 296288 B6 (V), kde R] a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z fenylu, benzyloxyskupiny, chlorbenzyloxyskupiny, vodíku, aminoskupiny, kvartémího aminu nebo esteru mastné kyseliny a Rj a R₂ jsou s výhodou stejné;

kde Yi a Y₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z methoxyskupiny, ethoxyskupiny, methylu, ethylu, terc-butylu, chloru, bromu, jodu, aminoskupiny, kvartémího aminu, alkylaminu, dialkylaminu a vodíku, Rj a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z fenylu, benzyloxyskupiny, chlorbenzyloxyskupiny, vodíku, aminoskupiny, kvartémího aminu nebo esteru mast10 né kyseliny a Yi a Y₂ jsou s výhodou stejné a R! a R₂ jsou s výhodou stejné;

Ph Ph (VII), kde X je vybráno ze skupiny sestávající z methoxyskupiny, ethoxyskupiny, methylu, ethylu, terc-butylu, chloru, bromu, jodu, aminoskupiny, kvartémího aminu, alkylaminu, dialkylaminu a vodíku, Y je vybráno ze skupiny sestávající z /erc-butylu, kvartémího aminu, aminoskupiny

15 a vodíku;

-42CZ 296288 B6 (Vlil), kde R] a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z aryloxyskupin, alkoxyskupin, arylů a vodíku R' a R jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z alkylů, arylů a vodíku;

(IX),

5 kde R je vybráno ze skupiny sestávající z alkylů a vodíku.
4. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že antioxidační komplex salen-kov je vybrán ze skupiny sestávající ze struktur Cl, C4, C6, C7, C9, Cl5, Cl7, C20, C22, C23, C25, C27 a C28:

Cl:

kde Ph je fenyl;

C4:

8nO ⁰⁸ⁿ kde OBn je benzyloxyskupina;

-43 CZ 296288 B6

C6:

kde Ph je fenyl;

C7:

kde Ph je fenyl;

C17:

kde Phje fenyl;

-44CZ 296288 B6

C20:

ch₃ (ch₂) _nco_2X____ .0₂C (CH₂) _nCH₃

C22:

Ph-^_ ^-Ph kde Ph je fenyl;

C23;

Ph_x__^Ph kde Ph je fenyl;

C25:

BnOv ____,OBn kde OBn je benzyloxyskupina;

-45CZ 296288 B6

C27:

C28:
5. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že antioxidační komplex salen-kov je sloučenina obecného vzorce III:

kde M je ion přechodného kovu vybraný ze skupiny sestávající zMn, Co, Fe, V, Cr a Ni,

A je anion vybíraný ze skupiny sestávající z negativně nabitých skupin PF₆, (aryl)₄, BF₄, B(aryl)₄, halogenidů, acetátů, triflátů a tosylátů, n je 4, 5 nebo 6,

X], X₂, X₃ a X₄ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z arylů, které sestávají z jednoho kruhu nebo z více kondenzovaných kruhů, které jsou nesubstituovány nebo výhodně substituovány, ary laiky lů -R-Ar a -R-HetAr, kde Ar je arylová skupina, HetAr je heteroarylová skupina a R je alifatická skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem, které jsou případně dále substituovány, aryloxyskupin -Ο-Ar, kde Ar je aromatická skupina, primárních alkylů, sekundárních alkylů, terciárních alkylů, kde alkyl je cyklická alkylová skupina nebo alkylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem, sestávající z jednoho až dvanácti atomů uhlíku a obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku, alkoxyskupin -O-R, kde R je alkyl, substituovaných alkoxyskupin -O-R, kde R je alkyl, který je substituovaný jedním nebo více substituenty vybranými ze skupiny sestávající z halogenu, alkylu, alkylthiolu, trifluormethylu, acyloxylu, hydroxylu, thiolu, karboxylu, aryloxylu, arylu, arylalkylu, heteroarylu, aminoskupiny, alkylaminoskupiny, dialkylaminoskupiny, morfolinu, piperidinu, pyrrolidin-l-ylu nebo piperazin-l-ylu, heteroatomů, aminoskupin, kvartérních aminů a vodíku,

-46CZ 296288 B6

Υι, Y2, Y3, Y4, Y5 a Yň jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající zarylů, které sestávají z jednoho kruhu nebo zvíce kondenzovaných kruhů, které jsou nesubstituovány nebo výhodně substituovány, arylalkylů -R-Ar a -R-HetAr, kde Ar je arylová skupina, HetAr je heteroarylová skupina a R je alifatická skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem, které jsou případně dále substituovány, primárních alkylů, sekundárních alkylů, terciárních alkylů, kde alkyl je cyklická alkylová skupina nebo alkylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem, obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku, alkoxyskupin -O-R, kde R je alkyl, substituovaných alkoxyskupin -O-R, kde R je alkyl, který je substituovaný jedním nebo více substituenty vybranými ze skupiny sestávající z halogenu, alkylu, alkylthiolu, trifluormethylu, acyloxylu, hydroxylu, thiolu, karboxylu, aryloxylu, arylu, arylalkylů, heteroarylu, aminoskupiny, alkylaminoskupiny, dialkylaminoskupiny, morfolinu, piperidinů, pyrrolidin-l-ylu nebo piperazin-l-ylu; aryloxyskupin -Ο-Ar, kde Ar je aryl nebo aromatická skupina, halogenů, heteroatomů, aminoskupin, kvartérních aminů a vodíku a

Ri, R₂, R₃ a R4 jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, halogenů, primárních alkylů, sekundárních alkylů, terciárních alkylů, kde alkyl je cyklická alkylová skupina nebo alkylová skupina s rozvětveným nebo přímým řetězcem, sestávající zjednoho až dvanácti atomů uhlíku a obsahující pouze atomy uhlíku a vodíku, esterů mastných kyselin, což jsou substituenty odvozené odtržením atomu vodíku od mastných kyselin vybíraných ze skupiny sestávající z kyseliny palmitolejové, olejové, petroselenové, vakcenové, punikové, parinakové, gadolejové, cetolejové, linolové, linolenové, arachidonové, laurové, myristové, palmitové, stearové, eikosanové, dokosanové, alkoxyskupin -O-R, kde R je alkyl, nebo arylů, které sestávají zjednoho kruhu, nebo z více kondenzovaných kruhů, které jsou nesubstituovány nebo výhodně substituovány.
6. Farmaceutický prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že antioxidační komplex salen-kovje vybrán ze skupiny sestávající ze struktur C10, Cil, C12, C29 a C30:

C10:

CU:

-47CZ 296288 B6

C12;
7. Farmaceutický prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že antioxidační komplex salen-kov je hyperoxid dismutáza-mimetický C7.
8. Farmaceutický prostředek podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se t í m , že obsahuje přinejmenším 10 mg struktury C7 a je ve formě vhodné pro parenterální podávání.
9. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 pro prevenci poškození volnými radikály jako nás-
10 ledku radiace nebo chemikálií, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje antioxidační komplex salen-kov, který je hyperoxid dismutáza-mimetický C7.

10. Farmaceutický prostředek podle nároku 9, vyznačující se tím, že obsahuje antioxidační komplex salen-kov, který je hyperoxid dismutáza-mimetický C7.
11. Farmaceutický prostředek podle nároku 9, vyznačující se tím, že obsahuje antioxidační komplex salen-kov a je určen pro povrchovou aplikaci na kůži pacienta.

-48CZ 296288 B6
12. Farmaceutický prostředek podle nároku 11,vyznačující se t í m , že obsahuje antioxidační komplex salen-kov a je ve formě opalovacího krému, opalovacího mléka nebo kosmetického přípravku.
13. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje komplex salen-kov a je určen pro použití v lidské nebo veterinární medicíně.
14. Farmaceutický prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že komplex salen-kov je umístěn v liposomech.
15. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje komplex salen-kov a savčí krev.
16. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že antioxidační komplex salen-kov je sloučenina obecného vzorce III:

R.

(ΙΠ) kde M je mangan,

A je H nebo halogen, n je 0, 4, 5 nebo 6, kdy Cn chybí pokud je n = 0 a je nasycený uhlovodíkový řetězec pokud n = 4, 5 nebo 6,

Ri a R4 jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z H, fenylu, nižší alkoxyskupiny-O-R, kde R je alkyl sestávající zjednoho až šesti atomů uhlíku, a nižšího esteru mastné kyseliny,

Xi a X₃jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z H, nižšího alkylu sestávajícího zjednoho až šesti atomů uhlíku, aminoskupiny, nižší alkyl- aminoskupiny a halogenu,

X₂ a X₄ jsou H,

Yi a Y₄ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z H, nižšího alkylu sestávajícího zjednoho až šesti atomů uhlíku, halogenu a nižší alkoxyskupiny-O-R, kde Rje alkyl sestávající zjednoho až šesti atomů uhlíku,

Y₂, Y₃, Y5 a Y₆ jsou H a všechny zbylé substituovatelné pozice jsou H.

-49CZ 296288 B6
17. Farmaceutický prostředek podle nároku 16, v y z n a č u j í c i se tím, že antioxidační komplex salen-kov je vybrán ze skupiny sestávající ze struktur Cl, C4, C6, C7 a C9:

Cl:

Ph._____Ph

C4:

^Βη·Ο\_ /^OBn

C6:

Ph. J?h

C7:

C9:

-50CZ 296288 B6
18. Použití antioxidačního komplexu salen-kov definovaného v nároku 1 pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení nemocí, které souvisí s volnými radikály.
19. Použití podle nároku 18, kde nemoci, které souvisí s volnými radikály jsou vybrány ze sku5 piny sestávající z ischemicko/reoxygenacní události a iatrogenní jedovatosti volných radikálů.