PL164744B1

PL164744B1 - Sposób wytwarzania liofilizowanego srodka zawierajacego etery/ estry polihematoporflryny do leczenia fotodynamicznego lub diagnozowania pacjenta PL PL

Info

Publication number: PL164744B1
Application number: PL90285633A
Authority: PL
Inventors: Bruce E Haeger; James R Lawter; Vijay H Naringrekar; Michael C Cucolo
Original assignee: Quadra Logic Tech Inc
Priority date: 1989-06-14
Filing date: 1990-06-13
Publication date: 1994-10-31
Also published as: PT94344A; AR244549A1; HUT54888A; FI101597B1; AU5708990A; NO902634L; HU215522B; KR0164845B1; AU625549B2; CN1047973A; DE69029012T2; IE902137A1; IE902137L; CA2018751C; JP3112918B2; CZ283309B6; KR910000146A; CA2018751A1; NO176645B; RU2019990C1

Abstract

1. Sposób wytwarzania liofilizowanego srodka zawierajacego etery/estry polihema- toporfiryny do leczenia fotodynamicznego lub diagnozowania pacjenta, znamienny tym, ze sporzadza sie wodny niesolny roztwór eterów/estrów polihematoporfiryny, obniza sie tempe- rature roztworu az do calkowitego zamrozenia roztworu, a nastepnie poddaje sie zamrozony roztwór liofilizacji w podwyzszonej temperaturze az do otrzymania produktu o zadowalajacej zawartosci wilgoci resztkowej. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania liofilizowanego środka do użycia w leczeniu fotodynamicznym pacjenta lub diagnozowaniu.

Sposobem według wynalazku uzyskuje się liofilizowane środki farmaceutyczne zawierające nowotworowo selektywne związki pofirynowe użyteczne w terapii fotodynamicznej, a mianowicie stabilne liofilizowane środki farmaceutyczne zawierające preparat polihematopofirynowy znany jako PHOTOFRINII będący złożoną mieszaniną eterów i estrów hematoporfiryny jako komponentów pochodnej hematoporfiryny.

Terapia fotodynamiczna z wykorzystaniem porfiryn i związków pokrewnych znana jest w tej dziedzinie wiedzy od pewnego czasu. Już w latach czterdziestych stało się wiadome, że porfiryny wykazują zdolność do fluorescencji w tkance nowotworowej. Okazuje się, że porfiryny umiejscawiają się w tkance nowotworowej, gdzie absorbują światło o pewnych długościach fali, gdy zostają napromienione. Przez umiejscowienie fluorescencji wykrywa się nowotwór.

Zgodnie z tym, preparaty zawierające porfiryny są użyteczne w diagnozowaniu i wykryciu tych tkanek nowotworowych. Oprócz tego, związki pofirynowe wykazują też zdolność niszczenia tkanki nowotworowej gdy zostaną napromienione przy odpowiedniej długości fali, być może przez tworzenie tlenu singletowego [K. R. Weishaupt i in., Cancer Research, 2326 - 2329 (1976)].

Stosowanie tych związków absorbujących światło, zwłaszcza pokrewnych porfirynom, zostało mocno ugruntowane jako metoda leczenia nowotworów przy podawaniu układowym. Użyteczność związków polega na ich zdolności do lokalizowania tkanki nowotworowej, gdy zostanie uwolniona od normalnej otaczającej tkanki. [Patrz np., T. J. Dougherty i in., Cancer : Principles and Practice of Oncology, wyd. V. T. de Vita, jr. i in., 1836 - 1844 (1982)].

W uzupełnieniu do stosowania układowego w leczeniu nowotworów, nowsze publikacje podały alternatywne zastosowania związków porfirynowych. I tak np., zastosowanie porfiryn w leczeniu chorób skóry zostało opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 753 958. Zastosowanie związków uczulających na światło do wyjaławiania próbek biologicznych zawierających organizmy zakaźne, takie jak bakterie i wirusy, zostało ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 727 027, gdzie substancją uczulającą na światło jest furokumaryna i jej pochodne. Uczulające na światło porfiryny są użyteczne w wykrywaniu i leczeniu płytek miażdżycowych jak opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 4 512 762 i 4 574 682. Oprócz tego, w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 4 500 507 i 4 485 806 opisano zastosowanie porfiryn promieniotwórczo znakowanych do tworzenia obrazu nowotworu.

Preparatem uczulającym na światło szeroko stosowanym we wczesnych etapach terapii fotodynamicznej, tak do wykrywania jak i do leczenia, była surowa pochodna hematoporfiryny, zwana także pochodną hematoporfiryny, HpD, albo pochodną Lipsona, otrzymana i opisana przez Lipsona i in., w J. Natl. Cancer Inst., 26,1 - 8 (1961). Przy użyciu tego preparatu wykonano pokaźną pracę, a o zastosowaniu tej pochodnej do leczenia nowotworów istnieje wiele doniesień [Cancer Res., 38, 2628 - 2635 (1978); J. Natl. Cancer. Inst., 62, 231 - 237 (1979)].

Doughery i współpracownicy otrzymali skuteczniejszą postać pochodnej hematoporfiryny, uzyskując ją na drodze ultrafiltracji HpD w celu zmniejszenia ilości materiału niskocząsteczkowego. Praca ta stanowi przedmiot opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 649 151, włączonego do niniejszego opisu jako odnośnik, który dalej szczegółowo opisuje metody fototerapeutycznego działania na pacjenta przy użyciu opisanych tam środków. Tę postać leku stanowi obecnie złożona mieszanina zawierająca jednostki porfirynowe połączone wiązaniami eterowymi [T. J. Dougherty i in., Adv. Exp. Med. Biol., 160, 3 - 13 (1983)] i estrowymi [D. Kessel i in., Photochem. Photobiol., 36,463 - 568 (1987)]. Ta złożona mieszanina, przytaczana w niniejszym opisie jako etery/estry polihematoporfiryny (PHE) jest dostępna pod znakiem towarowym PHOTOFIRNII.

-Obecnie PHE otrzymuje się jako roztwór zawierający PHE w izotonicznym roztworze soli kuchennej, o stężeniu 2,5 lub 5 mg/ml. PHE ulega szybko rozkładowi przy ekspozycji na ciepło i jest więc względnie niestabilna w temperaturze pokojowej. Zgodnie z tym, roztwór trzeba utrzymywać w stanie zamrożenia w celu podtrzymania jego mocy. Oprócz tego, roztwór wykazuje tendencję do znacznego wytrącania się substancji czynnej, co czyni nieprzydatnym jego użycie jako produktu do wstrzykiwania, chyba że będzie on utrzymywany w stanie zamrożenia i rozmrażany bezpośrednio przed użyciem.

Jednakże, stosowanie takiego zamrożonego roztworu obciążone jest wieloma wadami. Ponieważ trzeba go utrzymywać w stanie zamrożenia, musi on być przesyłany i przechowywany wstanie zamrożenia, co wymaga stosowania specjalnych warunków związanych z zamrażaniem. I tak np., produkt trzeba przesyłać w specjalnych pojemnikach z użyciem suchego lodu itp. jako środka zamrażającego. Stanowi to główną wadę, obok kosztów i niezbędnych umiejętności posługiwania się tym preparatem. W miejscu użycia zamrożony roztwór musi być przechowywany w temperaturze -20°C, to jest poniżej temperatury pracy niektórych zamrażarek i wymaga to wyposażenia w specjalną aparaturę zamrażającą. Oprócz tego, zamrożony produkt potrzebuje pewnego czasu na rozmrożenie i nie nadaje się więc dla pacjenta do bezpośredniego użycia.

Tak więc, istnieje zapotrzebowanie na preparat PHE, który jest stabilny w temperaturze pokojowej w dłuższym okresie czasu, nie wymaga utrzymywania w zamrożeniu, a zatem nie wymaga specjalnych warunków przy jego przesyłaniu i przechowywaniu.

Jest rzeczą znaną w tej dziedzinie techniki, że liofilizacja produktu, który jest względnie niestały w roztworze wodnym, może dać w wyniku produkt stabilizowany i zdolny do dłuższego magazynowania niż roztwór wodny. Dodatkowo, produkt liofilizowany wykazuje w porównaniu z produktem sproszkowanym tę korzyść, że szybko się rozpuszcza i łatwo go rekonstytuować przed podaniem jako iniekcji. Dodatkową korzyścią wynikającą ze zliofilizowania produktu niestabilnego w roztworze wodnym jest to, że można go poddawać obróbce i napełniać nim pojemniki do dawkowania w stanie płynnym, a także można go wysuszyć w niskiej temperaturze, dzięki czemu eliminuje się niepożądane efekty termiczne, oraz można go przechowywać w stanie stałym, w którym może on być bardziej stabilny. [Patrz np. : Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. XV, str. 1483 - 1485 (1975)]. Stąd też, liofilizacja byłaby idealną metodą otrzymywania preparatu PHE, który mógłby wykazywać pożądaną stabilność w temperaturze pokojowej i nie wymagałby przechowywania w stanie zamrożenia.

Weinstein i in., w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 753 958, ujawniają miejscowo stosowany preparat pochodnej hematoporfiryny do leczenia łuszczycy i

164 744 innych chorób skórnych, który otrzymuje się za pomocą zliofilizowania roztworu PHE o stężeniu 5 mg/ml w roztworze soli i zrekonstytuowania go odpowiednim · nośnikiem do stosowania miejscowego.

Aczkolwiek liofilizacja zamrożonego roztworu PHE w roztworze soli może okazać się użyteczna jeśli chodzi o otrzymywanie produktu nadającego się do stosowania miejscowego, twórcy wynalazku stwierdzili, że napotyka się pewne problemy. Gdy liofilizuje się roztwór PHE w roztworze soli, przetwarzanie jest utrudnione, a utworzony produkt nie nadaje się do podawania w postaci iniekcji. Gdy usiłowano zliofilizować stężony roztwór PHE w roztworze soli, zawierający PHE w stężeniu 15 mg/ml i 5,4% chlorku sodowego (jest to ilość chlorku sodowego niezbędna do otrzymania roztworu izotonicznego po rekonstytucji wodą do iniekcji roztworu PHE o stężeniu 2,5 mg/ml) nastąpiło częściowe wytrącenie (wysolenie) składnika czynnego (PHE). W dodatku, w następstwie wytrącenia, filtracja koncentratu staje się bardzo trudna, zmuszając do częstej zmiany filtrów. Także, na filtrach usunięta zostaje pewna ilość składnika czynnego. Dalej, zliofilizowany produkt nie jest jednorodny i składa się z oddzielnych faz chlorku sodowego i PHE. Rozdzielenie się faz zachodzi prawdopodobnie podczas zamrażania wskutek różnicującej krystalizacji.

Alternatywnie, można liofilizować roztwór soli zawierający PHE w stężeniu 2,5 mg/ml, ale proces liofilizacji trwa wtedy bardzo długo, ponieważ należy usunąć większą ilość wody. Oprócz tego, napotyka się te same problemy z filtracją i wytrącaniem się w wyniku obecności chlorku sodowego.

Istnieje więc wyraźna potrzeba zapewnienia preparatu PHE, który jest stabilny w temperaturze pokojowej w dłuższym okresie czasu i który nie wymaga wobec tego zamrożenia, a pozwala ominąć problemy związane z liofilizacją wodnego roztworu PHE w roztworze soli.

Celem wynalazku jest więc zapewnienie sposobu przetwarzania PHE, którajest względnie niestała w roztworze wodnym, z wytworzeniem produktu stabilnego w temperaturze pokojowej przez czas dłuższy, zapewnienie preparatu PHE, który jest jednorodny i nadaje się do podawania w postaci iniekcji oraz zapewnienie sposobu liofilizowania roztworu PHE, który omija problemy związane z liofilizowaniem roztworu PHE w roztworze soli.

Wynalazek opiera się na stwierdzeniu, że środek zawierający PHE jako substancję uczulającą na światło, który jest stabilny w temperaturze pokojowej w ciągu dłuższego okresu, można otrzymać za pomocą liofilizacji. Dalej, oparty jest on na stwierdzeniu, że problemy związane z liofilizowaniem roztworu PHE w roztworze soli można ominąć przez wyeliminowanie z roztworu chlorku sodowego i liofilizowanie PHE z roztworu wodnego oraz rekonstytuowanie rozcieńczalnikiem niesolnym, takim jak 5% glukoza do iniekcji.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że preparat eterów/estrów polihematoporfiriny stabilny w temperaturze pokojowej w ciągu dłuższego okresu można otrzymać za pomocą zliofilizowania substancji uczulającej na światło z roztworu niesolnego i zrekonstytuowania zliofilizowanego produktu rozcieńczalnikiem niesolnym. Wynalazek zapewnia sposób otrzymywania zliofilizowanej PHE, który realizuje się szybko z powodu niewielkiej objętości wyjściowej i który pozwala na ominięcie wytrącania się PHE, jako składnika roztworu, w wyniku czego otrzymuje się produkt o charakterze jednorodnym.

Według wynalazku sposób wytwarzania liofilizowanego środka zawierającego etery/estry polihematoporfiryny do leczenia fotodynamicznego lub diagnozowania pacjenta, polega na tym, że sporządza się wodny nie solny roztwór eterów/estrów polihematoporfiryny, obniża się temperaturę roztworu aż do całkowitego zamrożenia roztworu, a następnie poddaje się zamrożony roztwór liofilizacji w podwyższonej temperaturze aż do otrzymania produktu o zadowalającej zawartości wilgoci resztkowej.

Opis składnika czynnego (PHE) stosowanego w niniejszym wynalazku oraz sposoby jego wytwarzania są opisane w poprzednio wspomnianym opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 649 151.

Według wynalazku, liofilizowany preparat PHE wytwarza się z koncentratu zawierającego PHE o stężeniu około 15 mg/ml w wodzie. Koncentrat ten poddaje się procesowi liofilizacji i otrzymany produkt nadaje się do przechowywania i przesyłania. Liofilizowany produkt rekonstytuuje się przed użyciem rozcieńczalnikiem niesolnym, takim jak 5% glukoza do iniekcji, w

164 744 ilości wystarczającej do uzyskania izotonicznego roztworu PHE o stężeniu 2,5 mg/ml do użycia w diagnozowaniu, względnie leczeniu pacjenta.

W korzystnym sposobie realizacji wynalazku, około 5 ml koncentratu PHE o stężeniu około 15 mg/ml umieszcza się w fiolce nadającej się do liofilizacji. Każda fiolka opatrzona jest oznaczeniem stwierdzającym zawartość 75 mg eterów/estrów polihematoporfiryny na fiolkę. Każdą z 5 ml fiolek zamraża się następnie w komorze liofilizacyjnej w celu uzyskania temperatury produktu -35°C, lub niższej, w czasie wystarczającym do całkowitego zamrożenia produktu. Następnie poddaje się go liofilizacji przy podwyższonej temperaturze półek aż do uzyskania produktu o zadowalającej zawartości wilgoci, po czym przywraca się w komorze ciśnienie atmosferyczne i zamyka fiolki. Z powodu małej pierwotnej objętości napełnienia (5 ml) produkt liofilizuje się szybko, zazwyczaj w okresie 24-godzinnym. To znacznie redukuje koszty w porównaniu z liofilizacją dużych objętości roztworu bardziej rozcieńczonego. Powstały produkt można przechowywać w temperaturze pokojowej w ciągu ponad 6 miesięcy bez znaczniejszej utraty mocy. Przed podaniem pacjentowi liofilizowany produkt rekonstytuuje się 30 ml 5% glukozy do iniekcji, dostarczając izotoniczny roztwór o stężeniu 2,5 mg/ml.

Rozcieńczalnikiem używanym do rekonstytuowania produktu liofilizowanego korzystnie jest 5% glukoza do iniekcji, aczkolwiek można wykorzystać inne rozcieńczalniki niesolne, takie jak jałowa woda do iniekcji.

Gdy liofilizowany produkt zostanie rekonstytuowany izotonicznym roztworem soli i poddany filtracji z użyciem filtrów 0,2 pm, w mikroskopie optycznym obserwuje się znaczną ilość niepożądanych cząstek. W przypadku gdy produkt rekonstytuuje się glukozą do iniekcji, nie obserwuje się znaczniejszego tworzenia materiału nierozpuszczalnego. Tak więc, pożądane jest użycie rozcieńczalnika niesolnego.

Do produktu wytworzonego sposobem według wynalazku można włączyć także inne składniki. Mogą to być np. bufory dla wpływania na pH roztworu, środki zwilżające lub emulgujące, środki przeciwbakteryjne lub konserwujące, jeżeli jest to konieczne. Dla polepszenia charakterystyki liofilizowanego placka, można włączyć także środki zwiększające objętość nie będące elektrolitami takie jak mannitol lub glukoza. Wszystkie oczywiste odmiany podanego wyżej szczegółowego opisu jak również włączenie szeregu innych stosowanych nośników, uważa się za objęte zakresem wynalazku określonego w zastrzeżeniach patentowych.

Następujące przykłady przedstawiają porównanie preparatu liofilizowanego z dotychczas dostępnym roztworem zamrożonym. Przykładów nie należy interpretować jako ograniczających zakres wynalazku, podany w zastrzeżeniach.

Przykład I. Stężony roztwór PHE zawierający etery/estry polihematoporfiryny w stężeniu około 15 mg/ml sporządza się zgodnie ze sposobami postępowania przedstawionymi przez Dougherty’ego w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 649 151. Koncentrat przechowuje się w stanie zamrożenia i rozmraża przez liofilizowanie w łaźni z zimną wodą o temperaturze 3°C (± 2°C) aby dopuścić do stopniowego rozmrożenia się. Rozmrożony koncentrat następnie waży się i wprowadza do starowanego naczynia szklanego do mieszania, zabezpieczonego przed dostępem światła. Następnie miesza się materiał szarży aż do uzyskania jednorodności.

Po otrzymaniu jednorodnej mieszaniny dokonuje się pomiaru pH rozmrożonego koncentratu i doprowadza do pH 7,2 - 7,8 przy użyciu kwasu solnego lub 5% wodnego roztworu wodorotlenku sodowego, jeżeli jest to potrzebne. Następnie koncentrat filtruje się w warunkach jałowych z zastosowaniem dwuetapowego procesu filtracyjnego i z użyciem 0,45 pm prefiltra z polifluorku winylidenu, a następnie 0,2 pm jałowego filtra tego samego typu.

Po zakończeniu filtracji koncentratu, 30 ml fiolki napełnia się do stosownej objętości tak, aby uzyskać fiolki z oznaczeniem stwierdzającym zawartość 75 mg na fiolkę. Następnie fiolki umieszcza się w komorze do liofilizacji. Jałowy koncentrat zamraża się, w ciągu co najmniej 2 godzin, aż do uzyskania produktu o temperaturze -35°C lub niższej. Następnie koncentrat poddaje się liofilizacji przy temperaturze półek 35°C, aż temperatura produktu osiągnie poziom 20 - 25°C i utrzymuje się w tej temperaturze w ciągu 5 godzin. Następnie przywraca się w komorze ciśnienie atmosferyczne za pomocą przewietrzania bezwodnym azotem. Fiolki korkuje się, usuwa z kamory i uszczelnia.

164 744

Przed zastosowaniem do fotodynamicznego leczenia pacjenta, zawartość fiolki rekonstytuuje się przy użyciu 30 ml 5% glukozy do iniekcji.

Przykład Π. Liofilizowaną PHE o zawartości wilgoci poniżej 1%, mierzonej metodą Karla Fischera, otrzymuje się zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w powyższym przykładzie I, ale z wprowadzeniem dodatkowego etapu. A mianowicie, po przetrzymaniu produktu w temperaturze 20 - 25°C w ciągu 5 godzin, podwyższa się temperaturę produktu do 33 - 37°C i utrzymuje w tej temperaturze w ciągu 6-10 godzin. Następnie przywraca się w komorze ciśnienie atmosferyczne sposobem opisanym w powyższym przykładzie I, po czym fiolki korkuje się i uszczelnia.

Przykład HI. Liofilizowaną PHE otrzymuje się zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w powyższym przykładzie I. Następnie bada się produkt pod względem jego stabilności przy zmieniających się wartościach temperatury oraz przedziałach czasowych z wykorzystaniem chromatografii cieczowej wysokosprawnej (HPLC) w warunkach następujących:

Faza ruchoma A mieszanina tetrahydrofuranu, metanolu i wody zawierającej 0,02 lodowatego kwasu octowego 1 : 1: 1, pH doprowadzone do 5,0 - 5,1 przy użyciu NaOH.

90% tetrahydrofuran w wodzie.

Ultrasphere ODS, cząstki 5 pm.

Rozmiary 150 x 4,6 mm (Beckman).

otoczenia

1,0 ml/min pl absorbancja UV przy 410 nm

Faza ruchoma B : Kolumna:

Temperatura:

Prędkość przepływu: Wstrzykiwana objętość Sposób detekcjj: Program stosowania rozpuszczalnika :

- 100% faza ruchoma A aż do całkowitego wyeluowania piku protoporfiryny (około 9,5 do 13 minut)

- liniowy program do 100% fazy ruchomej B w ciągu minuty

- 100% fazy ruchomej B aż do całkowitego wyeluowania PHE (około 16 do 25 minut)

- liniowy program do 100% fazy ruchomej A w ciągu 3 minut

- zrównoważenie 100% fazą ruchomą A w ciągu co najmniej 5 minut między wstrzyknięciami.

Otrzymane wyniki zamieszczone są w poniższej tabeli 1.

Tabela 1 Zliofilizowana PHE Zawartość PHE, pole HPCL /%/

Warunki	Seria 1	Seria 2	Seria 3	Seria 4	Seria 5
Początkowo	100,00	100,00	100,00	100,00	100,00
- 20°C 6 miesięcy	95,2	95,6	98,7	-	-
3°C 3 miesiące	95,2	95,6	100,9	101,0	100,2
3°C 6 miesięcy	93,9	92,8	98,0	-	-
23°C 1 miesiąc	95,2	93,7	98,9	96,5	96,6
23°C 3 miesiące	93,4	93,3	93,5	94,7	94,7
23°C 6 miesięcy	93,0	93,7	93,0	-	-
37°C 1 miesiąc	93,2	92,7	93,6	93,4	92,6
37°C 3 miesiące	90,1	89,9	89,7	92,4	91,4

164 744

Uzyskane za pomocą HPLC dane z badań stabilności zamrożonego roztworu PHE w podobnych warunkach przedstawiają wyniki zamieszczone w poniższej tabeli 2.

Tabela 2 Zamrożony roztwór PHE Zawartość PHE, pole HPCL /%/

Warunki	Seria 1	Seria 2	Seria 3
Początkowo	100	100	100
- 20°C 6 miesięcy	92,9	101,3	-
5°C 3 miesiące	83,2	93,4	85,2
5°C 6 miesięcy	81,4	86,9	84,1
5°C 9 miesięcy	77,1	81,9	77,9
25°C 3 miesiące	82,4	91,2	83,8
25°C 6 miesięcy	86,4	93,9	87,8
25°C 9 miesięcy	77,1	91.5	88,8

Ocena danych zamieszczonych w tabelach 1 i 2 ukazuje, że liofilizowany środek zawierający PHE wytworzony sposobem według wynalazku odznacza się większą i bardziej konsekwentną stabilnością aniżeli zamrożony roztwór, a także zachowuje swoją moc w ciągu co najmniej 6 miesięcy w temperaturze pokojowej.

Przykład IV. Otrzymano liofilizowaną PHE zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w powyższym przykładzie I i badano pod względem substancji nierozpuszczalnych z użyciem licznika HIAC. Otrzymane wyniki zamieszczone są w poniższej tabeli 3.

Tabela 3 Liofilizowana PHE

Analiza materiału nierozpuszczalnego* Ilość cząstek na 30 ml pojemnik Seria do badania stabilności nr

Warunki	Seria 1	Seria 2	Seria 3	Seria 4	Seria 5
Początkowo	-	-	-	200	300
3°C 3 miesiące	-	-		400	300
3°C 6 miesięcy	4600	1400	500	-	-
23°C 3 miesiące	-			400	400
23°C 6 miesięcy	5700	1500	600	-	-

Wszystkie liczby odnoszą się do cząstek o wielkości > 10 pm * Pomiary przeprowadzono przy użyciu aparatu HIAC.

Analiza cząstek w zamrożonym roztworze przy użyciu licznika (Coulter) zamieszczona jest w poniższej tabeli 4.

Ocena powyższych danych ukazuje, że produkt liofilizowany utrzymuje poziom tworzenia cząstek znacznie poniżej sprecyzowania USP dotyczącego preparatów nadających się do wstrzykiwania (nie więcej niż 1 θ0θΟ cząstek o wielkości > 10 pm na pojemnik), podczas gdy roztwór

164 744

Tabela 4 Zamrożony roztwór PHE Analiza materiału nierozpuszczalnego * Ilość cząstek na 30 ml pojemnik Seria do badania stabilności nr

Warunki	Seria 1	Seria 2	Seria 3
Początkowo		1163	-
- 20°C 6 miesięcy	2039	4184	605
5°C 3 miesiące	6372	16664	4555
5°C 6 miesięcy	9565	28768	7160
5°C 9 miesięcy	19406	42730	21104
25°C 3 miesiące	14059	18457	10519
25°C 6 miesięcy	10211	5332	9742
25°C 9 miesięcy	32197	14338	23501

♦Pomiarów dokonano przy użyciu licznika (Coulter).

zamrożony wykazuje wyraźne tworzenie cząstek w temperaturze powyżej -20°C w niskich przedziałach czasowych (3 miesiące).

Przykład V. Liofilizowaną PHE otrzymaną zgodnie ze sposobem opisanym w powyższym przykładzie I bada się pod względem aktywności właściwej z wykorzystaniem sposobu postępowania ujawnionego przez T. Dougherty’ego i in., J. Nat. Cancer Inst., 55, 115. Zgodnie z tym sposobem postępowania nowotwory SNT-F od myszy dawców DBA/2HA implantuje się myszom DBA/2HA do badań. Po implantacji wybiera się 10 myszy o rozmiarach nowotworu 4x4 mm do 6 x 6 mm i wstrzykuje im dootrzewnowo, w ilości 4,2 mg/kg, PHE w roztworze otrzymanym przez rekonstytuowanie liofilizowanej PHE 5% glukozą w wodzie. Po upływie 24 godzin od podania napromieniowuje się nowotwory w ciągu 30 minut promieniowaniem czerwonym o długości fali 630 nm z użyciem lampy ksenonowej o wyładowaniu łukowym, z odległości, która odpowiada intensywności światła 157,5 mW/cm², co wynika z odczytu na mierniku mocy. Wyniki, które odpowiadają przejściu testu rozumie się jako nieobecność widocznego, lub wyczuwanego przy obmacywaniu nowotworu u 50% lub większej ilości z 10 myszy badanych po upływie 7 dni od napromienienia. Wyniki biotestu z użyciem rekonstytuowanej liofilizowanej PHE zamieszczone są w poniższej tabeli 5.

Tabela 5 Liofilizowana PHE

Dane z biotestu

Wyniki biotestu odnoszące się do serii do badania stabilności nr :

	Seria 1	Seria 2	Seria 3	Seria 4	Seria 5
Początkowo	Prz.	Prz.	Prz.	Prz.	Prz.
- 20°C 6 miesięcy	Prz.	Prz.	-	-	-
3°C 3 miesiące	Prz.	Prz.	-	Prz.	Prz.
3°C 6 miesięcy	Prz.	Prz.	Prz.	-	-
23°C 1 miesiąc	Prz.	Prz.	Prz.	Prz.	Prz.
23°C 3 miesiące	Prz.	Prz.	-	Prz.	Prz.
23°C 6 miesięcy	Prz.	Prz.	Prz.	-	-
37°C 1 miesiąc	Prz.	Prz.	Prz.	Prz.	Prz.
37°C 3 miesiące	Prz.	Prz.	-	Prz.	Prz.

W powyższej tabeli 5 użyto następującego skrótu : Prz. = przechodzi test

164 744

Wyniki biotestu dotyczącego zamrożonego roztworu PHE, przy użyciu tego samego sposobu postępowania jak przedstawiono powyżej, zamieszczone są w poniższej tabeli 6.

Tabela 6

Zamrożony roztwór PHE Dane z biotestu

Wyniki z biotestu odnoszące się do serii:

Warunki	Seria 1	Seria 2	Seria 3
Początkowo	Prz.	Prz.	-
- 20°C 3 miesiące	-	-	Prz.
- 20°C 6 miesięcy	N. prz.	Prz.	-
- 20°C 9 miesięcy	N. prz.	Prz.	N. prz.
5°C 3 miesiące	Prz.	Prz.	N. prz.
5°C 6 miesięcy	N. prz.	N. prz.	N. prz.
5°C 9 miesięcy	Prz.	N. prz.	Prz.
25°C 3 miesiące	N. prz.	Prz.	Prz.
25°C 6 miesięcy	N. prz.	N. prz.	N. prz.
25°C 9 miesięcy	Prz.	N. prz.	N. prz.

W powyższej tabeli 6 użyto następujących skrótów : Prz. = przechodzi test N. prz. = nie przechodzi testu.

Na podstawie porównania wyników zawartych w powyższych tabelach 5 i 6 staje się widoczne, że liofilizowana PHE wytworzona sposobem według wynalazku utrzymuje swoją aktywność biologiczną w testach in vivo w okresie co najmniej 6 miesięcy w temperaturze pokojowej, podczas gdy zamrożony roztwór wykazuje znaczne zmniejszenie aktywności biologicznej w podobnych warunkach.

Przykład VI. Liofilizowaną PHE zawierającą mannitol jako środek zwiększający objętość otrzymuje się zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w powyższym przykładzie I, za pomocą dodania mannitolu w ilości równej ilości wagowej PHE do rozmrożonego koncentratu w naczyniu szklanym do mieszania.

Przykład VII. Liofilizowaną PHE zawierającą glukozę jako środek zwiększający objętość otrzymuje się sposobem opisanym w powyższym przykładzie VI, z tą różnicą, że zamiast mannitolu używa się glukozy.

164 744

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania liofilizowanego środka zawierającego etery/estry polihematoporfiryny do leczenia fotodynamicznego lub diagnozowania pacjenta, znamienny tym, że sporządza się wodny niesolny roztwór eterów/estrów polihematoporfiryny, obniża się temperaturę roztworu aż do całkowitego zamrożenia roztworu, a następnie poddaje się zamrożony roztwór liofilizacji w podwyższonej temperaturze aż do otrzymania produktu o zadowalającej zawartości wilgoci resztkowej.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zamrożony roztwór liofilizuje się w podwyższonej temperaturze wynoszącej około 35°C, aż do osiągnięcia przez produkt temperatury 20-25°C, a następnie produkt utrzymuje się w tej temperaturze w ciągu około 5 godzin.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po utrzymaniu temperatury produktu wynoszącej około 20-25°C w ciągu około 5 godzin, podwyższa się temperaturę produktu do około 33-37°C i utrzymuje się tę temperaturę w ciągu około 6-10 godzin uzyskując liofilizowany środek wykazujący zawartość wilgoci mniejszą niż 1%.