Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych pochodnych indolizyny.Pochodne indolizyny wytwarzane sposobem we¬ dlug wynalazku przedstawione sa wzoram ogól¬ nym 1, w którym R oznacza prosty lub rozgale¬ ziony lancuch alkilowy o 1—8 atomach wegla, rodnik fenylowy, rodnik 3-chloro-4-metylofenylo- wy, 3,4-dwuchlorofenylowy lub rodnik fenylowy podstawiony jednym atomem fluoru, chloru lub bromu lub jednym rodnikiem metylowym lub me- toksylowym, zas Xi i X2, które moga byc takie same lub rózne, oznaczaja atom wodoru, chloru, bromu lub rodnik metoksylowy.Pochodne indolizyny wytwarzane sposobem we¬ dlug wynalazku wykazuja ^uzyteczne wlasciwosci farmakologiczne, a zwlaszcza stanowia inhibitory dzialania oksydazy ksantyny i dezaminazy adeno¬ zyny, jak równiez dzialania zwiekszajacego nerko¬ we wydzielanie, moczanów. Ponadto, stwierdzono, ze zwiazki powyzsze zwiekszaja efekt sercowo-naczy- niowy katecholamin.Zwiazki o wzorze 1 stosowane sa w lecznictwie fizjologicznych zaburzen wynikajacych z nadmiaru kwasu moczowego oraz zaburzen systemu immu- nizacji.Jako przyklady zaburzen wynikajacych z nad¬ miaru kwasu moczowego mozna wymienic dne lub guzki dnawe. W leczeniu takich zaburzen stosuje sie zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wyna- 10 i* 20 30 lazku w dawkach 300 mg dziennie dla czlowieka o wadze 60 kg.Jezeli chodzi o zaburzenia fizjologiczne wynika¬ jace z nieprawidlowosci systemu immunizacyjnego, które mozna leczyc zwiazkami wytwarzanymi spo¬ sobem wedlug wynalazku, mozna wymienic zapo¬ bieganie zjawiskom odrzucania przeszczepionych organizmów.Zwiazki o wzorze 1 znajduja równiez zastosowa¬ nie przy zaburzeniach sercowo-naczyniowych, któ¬ re mozna leczyc zwiekszajac efekty sercowp-na- czyniowe katecholamin, np. przy zaburzeniach mózgowego systemu naczyniowego i przy niewy¬ dolnosci serca.Zwiazki o wzorze 1 stosuje sie do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych lub weterynaryj¬ nych, zawierajacych jako substancje czynna có najmniej jedna pochodna indolizyny o wzorze 1, w polaczeniu z nosnikiem lub zatóbka farmaceu¬ tyczna.Sposób wedlug wynalazku wytwarzania zwiaz¬ ków o wzorze 1, w którym R, Xi i X* maja wy¬ zej podane znaczenie polega na reakcji bromu z pochodna benzoiloindolizyny o wzorze ogólnym 2, w którym R ma wyzej podane znaczenie, a Xi i X2, które moga byc takie same lub rózne, ozna¬ czaja atom wodoru, chloru, bromu lub rodnik me¬ toksylowy. Reakcje prowadzi sie w temperaturze pokojowej w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak dioksan i w obecnosci octanu metalu alkalicz- 125 597%: ?A 125 5»7 nego, np. octanu sodu, do otrzymania zadanego zwiazku o wzorze 1. Jako inny odpowiedni roz¬ puszczalnik mozna wymienic kwas octowy, który jednak moze byc stosowany tylko w przypadku, gdy zwiazek wyjsciowy o wzorze 2 jest jednopod- stawiony w czesci benzoilowej chlorem, bromem lub grupa metoksy.Powyzszy sposób wykonuje sie korzystnie wpro¬ wadzajac w kontakt jeden równowaznik molowy zwiazku o wzorze 2 z jednym, dwoma lub trzema równowaznikami .molowymi bromu. Stwierdzono, ze: — gdy stosuje sie jeden-równowaznik bromu, chlo¬ rowcowanie nastepuje selektywnie w pozycji 1 pierscienia indolizyny pochodnej benzoiloindolizy- ny o wzorze 2, przy czym zwiazek o wzorze 2 jest niepodstawiony albo podstawiony jedno- lub dwu¬ krotnie chlorem, bromem lub grupa metoksy. — gdy stosuje sie dwa równowazniki bromu, chlo¬ rowcowanie nastepuje nie tylko w pozycji 1 pier¬ scienia indolizyny zwiazku o wzorze 2, lecz takze w pozycjach 3 i 5 w czesci benzoilowej. Dlatego tez powyzszy sposób prowadzi sie korzystnie wy¬ chodzac ze zwiazku o wzorze 2, który posiada atom. chloru lub bromu lub grupe metoksy w czesci benzoilowej tak, aby uniknac otrzymywania mieszanin chlorowcowanych zwiazków. Oczywiste jest, ze gdy stosuje sie jeden równowaznik molo¬ wy 2-podstawionej-3-(3-chloro-3-brbmo-' lufr 3-rne- toksy-4-hydroksybenzoilo)-indolizyny o wzorze 2 oraz dwa równowazniki molowe bromu, konieczne jest rozdzielanie mieszaniny otrzymanych pochod¬ nych chlorowcowych.Rozdzielanie to prowadzi sie konwencjonalnymi sposobami, np. chromatografie kolumnowa. — gdy stosuje sie trzy równowazniki molowe bro¬ mu oraz jeden równowaznik molowy 2^podstawio- nej-3-(4-hydroksybenzoilo)-indolizyny o wzorze 2, otrzymuje sie selektywnie trójhalogenopochodna o wzorze 1.Strukture chemiczna zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku oznaczono za pomoca widm NMR, które potwierdzily budowe pochod¬ nych indolizyny o wzorze 1.Udowodniono, np. ze gdy 2-podstawiona-3-(4-hy- droksybenzoilo)-indolizyne bromuje sie sposobem wedlug wynalazku, tak aby otrzymac jednobromo- -pochodna, atom bromu przylaczony jest w po¬ zycji 1 pierscienia indolizyny: zarejestrowano cha¬ rakterystyke p-dwupodstawionego pierscienia aro¬ matycznego oraz nie stwierdzono singletu w odnie¬ sieniu do protonu Hi.Przykladowo podano w tablicy 1 dane NMR dla l-bromo-2-etylo-3-(4-hydroksybenzoilo)-indoli- zyny o wzorze 3.Podobnie, przy stosownaiu sposobu wedlug wy¬ nalazku 2-podstawionej-3 - (3-bromo-4-hydroksy- benzoilo)-indolizyny w celu otrzymania pochodnej dwubromOj drugi brom wprowadzany do czastecz¬ ki lokuje sie w pozycji 1 pierscienia indolizyny': widmo NMR wykazuje obecnosc atomu bromu w pozycji 1 indolizyny (brak protonu Hi) oraz atom bromu w pozycji orto w stosunku do rodnika hy¬ droksylowego (wielokrotnosc i przesuniecie che- 'Tablica* l : 10 15 20 25 35 1 Przesuniecie chemiczne (w ppm) < n — S* 9,0 dt *. 6,91 s7 7,23 K 7,56 AA£= 7,56 BB^6,90 1 Stale par w cps I..,=6,5 17.8 = 9 J5..= 7 (rozpuszczalnik: DM-SOdg, odniesienie: TMS czyli czterometylosilan) '. \ i- miczne zgadza z taka struktura)4; Przykladowo; da¬ ne NMR zarejestrowano dla i-Drdrno-2-etylo-3-(3- -bromo-4-hydroksybenzoilo)-indolizyny * o wzorze 4 zestawiono w tablicy 2.Tablica 2 1 Przesuniecie chemiczne (w ppm) k — ..*• 9,18 4t v 6,96 m *' 7,27 m s, .7,54.Hc =7,80d HB=7,55q HA=7,09d Stale par (w cps) Ja,b=8,4 J«,7=6,75 Jb,c=2,0 L,o=7,0 J7.8=8,8 (rozpuszczalnik: DMSOd6, odniesienie: TSM).W przypadku pochodnych trójbromowych, obec¬ nosc singletu przypisywana ugrupowaniu p-hydro- ksybenzoilowemu dowodzi, ze dwa atomy bromu wystepuja w pozycjach orto w stosunku do rod- 40 nika hydroksylowego.Przykladowo, dane NMR zarejestrowane dla 1- -bromo - 2-etylo-3-(3,5-dwubromo - 4-hydroksyben- zoilo)-indolizyny o wzorze 5 zestawiono w tabli¬ cy 3.Tablica 3 50 55 60 1 Przesuniecie (w ppm) k — K 9,28 dt *. 7,01 m K 7,33 m *B 7,77 dt 7,81s Stale par (w cps) J5.« = 7,0 Js,7 = 8,75 J5.6 = 6,5 (rozpuszczalnik: DMSOd6, odniesienie: TMS).Zwiazki o wzorze 2, w którym Xi i X* oznacza¬ ja wodory sa z opisu patentowego W. Brytanii, nr 1518443 zas inne zwiazki o wzorze 2 mozna wy¬ tworzyc sposobem w nim ujawnionym.Kwas moczowy w organizmie czlowieka wytwa- •8 rza sie przede wszystkim przez utlenianie hipo-5 125 597 6 ksantyny. i ksantyny katalizowane przez oksydaze ksantyny.Obecnie najczesciej stosowanym lekiem do lecze¬ nia pierwotnej nadmiernej ilosci kwasu moczowe¬ go we krwi przy dnie jest allopurynol. W przeci¬ wienstwie do czynników, które zwiekszaja nerko¬ we wydzielanie moczanów, allopurynol stanowi in¬ hibitor ostatniego etapu w biosyntezie kwasu mo¬ czowego.Allopurynol, którego struktura chemiczna jest zblizona do ksantyny i hipoksantyny, jest w ni¬ skich stezeniach doskonalym substratem oraz kom- petycyjnym inhihitorem oksydazy ksantyny. Hydró- ksypurynol, metabolit wytwarzany przez dzialanie oksydazy ksantyny na allopurynol stanowi wyjat¬ kowo silny niekompetycyjny inhibitor tego enzy¬ mu. Dlatego tez dzialanie inhibitujace zalezy od kinetyki dwóch reakcji, mianowicie utleniania do hydroksypurynolu z jednej strony i rozkladu kompleksu enzym-hydróksypurynol z drugiej strony.Inhibicja przedostatniego i ostatniego etapu w biosyntezie kwasu moczowego obniza stezenie plaz¬ my i wydzielania kwasu moczowego z moczem oraz zwieksza stezenie plazmy i nerkowe wydzie¬ lanie bardziej rozpuszczalnych prekursorów hydro- ksyparyny.Allopurynol zblizony jest do zasad purynowych.Dlatego tez moze równiez przeszkadzac w syste¬ mie metabolicznym zasad purynowych innych niz ksantyna, co moze byc zródlem zaburzen fizjolo¬ gicznych.Dlatego tez wskazane bylo opracowanie srodków, które nie sa podobne do zasad purynowych, a któ¬ re sa jednak zdolne, tak jak allopurynol, do wy¬ stepowania w charakterze inhibitorów w stosunku do dzialania oksydazy ksantyny i do zwalniania w ten sposób biosyntezy kwasu moczowego.Ponadto, allopurynol ma stosunkowo skompli¬ kowana strukture chemiczna, przez co synteza jego jest trudna. Bylo wiec waznym zagadnieniem opracowanie nowego inhibitora dzialania oksydazy ksantyny, latwiejszego do wytworzenia niz allo¬ purynol.Pochodne indalizyny wytwarzane sposobem we¬ dlug wynalazku spelniaja te wymagania. Jako szczególnie korzystne zwiazki mozna wymienic: 1- -bromo-2 - n-propyk-3-(3,5 - dibromo - 4-hydroksy- benzoilo)-indolizyne.Pochodne benzofuranu, zwlaszcza 3-(3,5-dibro- mo- i 3,5-dijodo-4-hydroksybenzoiló)-benzofuranu byly juz znane jako inhibitory dzialania oksydazy- ksantyny [Aren. Int. Pharmacodyn., 165, 25, (1967)].Obecnie stwierdzono, ze mozna znacznie zwiek¬ szyc efekt inhibitujacy powyzszych benzofuranów w stosunku do dzialania oksydazy ksantyny, zaste¬ pujac ugrupowanie benzofuranu pierscieniem in¬ dolizyny. Zwiazki te stanowia grupe nowych inhi¬ bitorów, które sa 10—20 razy bardziej aktywne niz znane pochodne benzofuranu.Pochodne indolizyny, wykazujace wlasciwosci far¬ makologiczne sa znane. Tak np. w wyzej wymie¬ nionej publikacji w Eur. J. Mod. Chem., stwierdzo¬ no, ze niektóre pochodne 3-(4-dwualkiloaminoalko- ksybenzoilo)-indolizyny, maja wlasciwosci przeciw- anginowe. Jednakze, nie znane byly dotychczas wlasciwosci pochodnych indolizyny jako inhibito¬ rów dzialania oksydazy ksantyny. 1 Na podstawie wiec znanego stanu techniki nie mozna bylo wiec przypuszczac, ze zwiazki wytwa¬ rzane sposobem wedlug wynalazku moglyby dzia¬ lac jako inhibitory dzialania oksydazy ksantyny.Jak juz wspomniano zwiazki wytwarzane spo- 1# sobem wedlug wynalazku dzialaja równiez jako inhibitory dzialania dezaminazy adenozyny. Testy Testy prowadzone na pochodnych benzofuranu, z których pewne zostaly opisane w cytowanej pu¬ blikacji w Arch. Int. Pharmacodyn, wykazaly, ze w dzialanie ich jako inhibitorów dzialania dezami¬ nazy adenozyny jest zadne lub bardzo slabe.Wiadoimo, ze calkowity brak odpornosci moze byc zwiazany z genetycznym brakiem dezaminazy, sugeruje to nowe kierunki poszukiwan srodków zdolnych do regulowania reakcji odpornosciowej.Wydaje sie, ze adenozyna i dezoksyadenozyna (lub jej metabolity, takie jak dezoksy-ATP) sa bezposrednio cytotoksyczne w stosunku do limfo- 25 cyitów i hamuja rozmnazanie sie, róznicowanie i dojrzewanie komórek odpornosciowych.Wiadomo, ze dezaminaza adenozyny, taka jak 3, 4,7,8-czterowodoro-3 - /0-D-rybofuranozylo - imidazo [4,5-d] [l,3]diazepinol 8 czyli coformycyna oraz 9- 30 -erytro-(2-hydroksy-3-nonylo)-adenina, czyli EHNA wzmagaja te cytotoksycznosc.Dlatego tez inhibitory dezaminazy adenozyny moglyby wywierac dzialanie obnizajace odpornosc przez zwiekszenie miedzykomórkowych poziomów 35 adenozyny lub jej metanolitów w limfocytach.W przeciwienstwie do obecnie stosowanych srod¬ ków do obnizania odpornosci, inhibitory dezamina¬ zy adenozyny moglyby wywierac' specyficzny efekt na komórki odpornosciowe. Ponadto, inhibitory te 40 moglyby byc stosunkowo malo toksyczne w sto¬ sunku do innych rodzajów komórek, poniewaz bio¬ synteza adenozyny do inozyny katalizowana przez dezaminaze adenozyny wydaje sie byc droga o stosunkowo nizszym znaczeniu w metabolizmie 45 puryn w wiekszosci komórek somatycznych..Analogicznie jak allopurynol, EHNA jest zblizo¬ na do zasad purynowych. Dlatego tez EHNA moze równiez przeszkadzac innym enzymom metaboliz¬ mu puryny i tam brak specyficznosci moze pro- 50 wadzic do zaburzen fizjologicznych.Testy prowadzone ze zwiazkami wytwarzanymi wedlug wynalazku w porównaniu z EHNA wyka¬ zaly, ze pochodne indolizyny o wzorze 1 wykazuja bardziej specyficzne dzialanie niz EHNA. 55 Wszystkie te wlasciwosci sprawiaja, ze pochod¬ ne indolizyny wytwarzane sposobem wedlug wy¬ nalazku stanowia wartosciowe inhibitory dezami¬ nazy adenozyny. Moga byc w zwiazku z tym sze¬ roko stosowane w immunopatologii, np. w zapo- 60 bieganiu zjawiskom odrzucania przeszczepionych organów, w przypadkach auto-immunizacyjnej choroby reumatycznej, takiej jak chroniczne poste¬ pujace zapalenie wielostawowe, w przypadkach wilka rumieniowego rozsianego, auto-immunizacyj- 65 nego zapalenia klebków nerkowych, chronicznego7 125 507 8 silnego zapalenia watroby, stwardnienia rozsiane¬ go itd.Znoszenie barier imimunizacyjnych nie jest jedy¬ nym potencjalnymi zastosowaniem terapeutycznym substancji dzialajacych jako inhibitory dezaminazy adenozyny. Moga one równiez wywolywac specy¬ ficzny efekt cytotdksyczny w rozwoju limfocytycz- nych tkanek nowotworowych. Podobnie, moglyby one równiez wzmagac aktywnosc przeciwnowotwo- rowych i przeciwwirusowych srodków, takich jak 3'-dezoksyadenozyna, czyli cordycepina. In vivo, arabinozyd adeniny (Ara-A) gwaltownie prze¬ ksztalca sie przez dezaminacje w arabinozyd hipo¬ ksantyny, zwiazek o mniejszej aktywnosci prze- ciwwirusowej i przeciwnowotworowej od arabino- zydu adeniny.Testy prowadzone in vivo wykazaly, ze zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku moga dzialac jako inhibitory dezaminacji arabinozydu adenozyny, prowadzac do synergetycznego wzrostu aktywnosci przeciw opryszczkowej Ara-A dla myszy Jako korzystne zwiazki pod wzgledem dzialania dezaminazy adenozyny mozna wymienic nastepu¬ jace zwiazki: l-bromo-2-fenylo-3-(3-bromo-4-hydro- ksybenzoilo)-indolizyne, l-bromo-2-fenylo-(4-fluoro- fenylo)-3-(3-bromo-4-hydroksybenzoilo)-indolizyne.Jak juz wspomniano, zwiazki wytwarzane sposoT bem wedlug wynalazku wzmagaja ponadto efekty sercowo-naczyniowe katecholamin, co sprawia, ze sa one uzyteczne w leczeniu, np. zaburzen ukladu naczyniowego mózgu.W odniesieniu do serca wzmozenie efektu kate- cholanin powoduje wzrost Ikurczliwosci miesnia sercowego, co moze miec zastosowanie w leczeniu niewydolnosci serca i anginy peotoris.Przeprowadzono badanie w celu oceny aktywno¬ sci farmakologicznej zwiazków wytwarzanych spo¬ sobem wedlug wynalazku.Próby dotyczace badania dzialania w stosunku do oksydazy ksantyny i do dezaminazy adenozyny prowadzono „in vitro" w komorze absorpcyjnej spektrofotometru UV. Ponadto prowadzono in vivo próby dotyczace dzialania hamujacego wytwa¬ rzanie kwasu moczowego oraz efelktów hamuja¬ cych dzialanie dezaminazy adenozyny.I. Hamowane dzialanie oksydazy ksantyny. Pró¬ be prowadzono z oksydaza ksantyny otrzymana z mleka. Aktywnosc preparatu enzymatycznego mierzono za pomoca pomiaru wytwarzania kwasu moczowego, wychodzac z hipoksantyny w obecno¬ sci tlenu i buforowego roztworu fosforanowego.Stosowano nastepujace postepowanie doswiad¬ czalne: Do komory absorpcyjnej wprowadzono nastepu¬ jace roztwory: 1,5 ml 0,1 molowego buforowego roztworu fosforanu (jpH = 7,4) nasyconego tlenem, 0,3 ml 1-molowego roztworu etylenodwuaminoczte- rooctanu, 0,8 ml wody, 0,1 ml roztworu handlowej oksydazy ksantyny o znanymi stezeniu enzymu, 0,01 ml 3'10—3 molowego roztworu etanowego ba¬ danego zwiazku.Zawartosc komory absorpcyjnej inkubowano 2 minuty, po czym zapoczatkowano reakcje enzyma¬ tyczna dodajac 0,3 ml 10-8 molowego roztworu hipoksantyny do komory absorpcyjnej. W czasie reakcji prowadzono spektrofotometryczna reje¬ stracje szybkosci utleniania hipoksantyny w 293 * nm i w 37°C. Gestosc optyczna rejestrowano auto¬ matycznie. Te same pomiary prowadzono z roz¬ tworem kontrolnym, zawierajacym wszystkie po¬ wyzsze skladniki oprócz badanego zwiazku.W ten sposób otrzymano krzywa odpowiadajaca 10 zmianom gestosci optycznej w czasie dla roztworu zawierajacego inhibitor oraz bez inhibitora. Mie¬ rzono nachylenie obu krzywych i przeliczano na ilosc moli kwasu moczowego wytwarzanego na minute. Mozna wiec bylo porównac wartosci ob¬ liczyc, w procentach, inhibicje aktywnosci oksyda¬ zy ksantyny wywolana przez zwiazek wytwarzany sposobem wedlug wynalazku.Otrzymane wyniki zestawiono w tablicy 4 dla M róznych zwiazków o wzorze 1, których podstaw¬ niki wymienione w tablicy 4.Tablica 4 R 4-Metylofenyl n-Propyl Etyl 1 n-Propyl f 4-Metoksyfenyl n-Propyl fenyl Metyl Metyl Metyl Etyl xL H H Br Br Br Br Br " Cl OCH8 Cl OCH3 x2 H Cl H H H Br Br H H Cl H Hamowanie dzialania oksydazy ksantyny in vitro (w %) przy stezeniu 10-* M 48 84 93 97 80 95 48 44 21 46 25 II. Hamowanie dzialania dezaminazy adenozyny. 50 A. Test in wtro. Test prowadzono na dezami- nazie adenozyny otrzymanej z wnetrznosci ciele¬ cia. Stosowano nastepujace postepowanie: Do ko¬ mory absorpcyjnej wprowadzono nastepujace roz¬ twory: 55 2,7 ml 0,1 molowego buforowego roztworu fo¬ sforanu (pH = 7,4) 0,3 ml 10-4 lub 5 • IO-4 molo¬ wego roztworu adenozyny w buforowym roztworze fosforanu (stezenie koncowe adenozyny: 10-5 lub 5 • 10-5 mola), 60 0,01 ml 3-10"* molowego etanolowego roztworu badanego zwiazku (okolo 10 milijednostek).Zawartosc komór absorpcyjnych inkubowano 2 minuty, po czym zapoczatkowano reakcje enzy¬ matyczna dodajac 0,03 ml roztworu handlowej de^ •• zaminazy adenozyny o znanym stezeniu enzymtl.125 597 9 10 Reakcje prowadzono w 30°C i rejestrowano na spektrofotometrze: zarejestrowano obnizenie absor- bancji przy 265 mm wskutek przeksztalcenia ade¬ nozyny w inozyne za pomoca dezaminazy adeno¬ zyny. Powyzsza reakcje enzymatyczna ilustruje nastepujace równanie: . „ dezan:ii^aza Adenozyna H- H20 Inozyna + NH8 adenozyny Te znane pomiary prowadzone z roztworem kon¬ trolnym, zawierajacym wszystkie powyzsze sklad¬ niki z wyjatkiem badanego zwiazku.Wykreslono krzywe przedstawiajace spadek ab- sorbancji w czasie dla roztworu zawierajacego in¬ hibitor i dla roztworu kontrolnego.Zmieniono nachylenie krzywych i przeliczono je na ilosc moli inozyny wytworzona na jedna mi¬ nute, a nastepnie obliczono procent hamowania aktywosci dezaminazy adenozyny wywolanego przez badany zwiazek.Otrzymane wyniki zestawiano w Tablicy 5 dla zwiazku o wzorze 1, w którym znaczenie podstaw¬ ników podano w Tablicy 5.Tablica 5 — 40 R n-butyl n-pentyl | fenyl 4-bromofenyl | etyl | n-propyl izopropyl fenyl 2-bromofenyl 3-bromofenyl 4-fluorofenyl 4-chlorofenyl 1 3,4-dwuchlorofenyl 1 3-chloro-4-mety- lofenyl 1 izopropyl | n-pentyl 1 fenyl 1 fenyl Xl H H H H Br Br Br Br Br Br Br Br ~Br~ Br Br Br Br Cl X* H H H H H H H H H H H H H Br Br Br H Hamowanie dziala- 1 nia dezaminazy adenozyny in vitro (%) | Przy 10"5M adenozyna 45 32 — 26 74 82 75 100 50 53 100 i 58 51 52 57 33 53 —" Przy 5- MFM adenozyna — 52 — | — | — | 54 | 88 | — | — | 94 | — | — | — | — | 22 | 86 10 15 20 — 49 — 80 Badania porównawcze prowadzone z 2-etylo-3- -(4-hydroksybenzoilo)-benzofuranem i 2-fenylo-3-(3, 5-dwubromo-4-hydroksybenzoilo)-benzofuranem wy¬ kazaly, ze zwiazki te osiagaja odpowiednio tyliko 18% i 15%-owe haimowanie dezaminazy adenozyny przy stezeniu adenozyny 10"5 mola. 60 61 Zwiazki takie jak 2-etylo-, 2-izopropylo- i 2-n- -butylo-3-(3,5-dwubromo-4-hydroksybenzoilo) - ben^ zofurany oraz 2-etylo-3-(3,5-dwujodo-4-hydroksy- benzoilo)-benzofuran, sa jak sie okazalo calkowicie nieaktywne pod wzgledem hamowania dezaminazy adenozyny przy stezeniu 10~6 mola l-bromo-2-fe- nylp- oraz l-bromo-2-(4-fluorofenylo)-3^C3-;bromo-4- -hydroksybenzoilo)indolizyny wywoluja jiuz, odpo¬ wiedni o 80% i 86°/o hamowania dezaminazy ade¬ nozyny in vi'tro.Hamowanie dzialania dezaminazy adenozyny przez dwa powyzsze zwiazki badano równiez w nie naruszonych komorach inkubujac je (Krebs II) w obecnosci C14 adenozyny w stezeniu 5 • 10-5 mola i -mierzac tworzenie inozyny i C14 lipoksan- tyny. Dezaminacja adenozyny w tych komorach byla w, 50% hamowana w obecnosci 2 • 10~6 mola l-bromo-2-fenylo-3-(3 - bro*no-4-hydroksybenzoilo)- -indolizyny oraz 10"8 mola l-bromo-2-<4-fluorofe- nylo)-3-(3-bromo-4-hydroksybenzoilo)-indolizyny.B. Test i:i vivo. Test ten prowadzono w celu oznaczenia wplywu arabinozydu adenozyny (Ara- -A) oraz zwiazków wytwarzanych sposobem we¬ dlug wynalazku na wystepowanie zmian opryszcz- kowych na skórze i na smiertelnosc myszy nu/nu zaszczepionych H SV-1 (KOS).Pozbawione grasicy nagie (mu/nu) na myszy, w wieku 20—25 dni, zaszczepiono domiesniowo H SV-1 (KOS) przy 104-5 PFU (jednostki wytwa¬ rzania plytek) na mysz. Stosowano miejscowe Ara-A i/lub zwiazek wytwarzany sposobem we¬ dlug wynalazku w 1% roztworze dwumetylo-sulfo- tlenku, 4 razy dziennie w dniach 0, 1, 2, 3 i 4.Rejestrowano ilosc myszy ze zmianami na skórze (martwica o dlugosci co najmniej 5—10 mm) na calkowita ilosc zywych myszy.Wyniki przedstawiono na zalaczonym schemacie, na którym: Fig. 1 oznacza wyniki otrzymane dla myszy .kontrolnych, którym zastosowano tylko dwumetylosulfotlenek. Fig. 2 przedstawia wyniki przy stosowaniu samego Ara-A, Fig. 3 przedsta¬ wia wyniki przy stosowaniu l-bromo-2-£enylo-3-(3- -bromo-4-hydroksybenzoilo)-indolizyny, oznaczonej symbolem LB 31400, Fig. 4 przedstawia wyniki 'przy stosowaniu Ara-A w polaczeniu z LB 31400.Wyniki te wykazuja wyraznie, ze zwiazki wytwa¬ rzane sposobem wedlug wynalazku wzmagaja aktywnosc przeciwwirusowa arabinozyd adeniny.IV. Toksycznosc.Testy na ostra toksycznosc zwiazków wytwarza¬ nych sposobem wedlug wynalazku prowadzono na myszach.Przy dawkach 20 mg/kg l^bromo-2-fenylo lub l-bromo-2-(4-fluorofenylo)-3-(3-bromo-4-hydroksy- benzoilo)-indolizyny dozylnie nie stwierdzono przy¬ padków smiertelnych po 14 dniach.Podawanie 1500 mg/kg l-bromo-2-izopropylo- lub 2-etylo-3-(3,5-dibromo-4-hydroksybenzoilo) - indoli¬ zyny intragastrycznie dalo ten sam wynik.Jezeli chodzi o inne mozliwe wlasciwosci zwiaz¬ ków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku, nalezy zwrócic specjalna uwage na dzialanie ha¬ mujace, wywolywane przez te zwiazki na dezami- naze adenozyny. Poniewaz dzialanie takie wywo¬ luja równiez pewne znane zwiazki, np. coformy-11 125 597 12 cyna i 2'-dezoksycofor sciwosci przeciw pasozytnicze, mozliwe jest, ze zwiazki wytwarzane wedlug wynalazku równiez posiadaja wlasciwosci przeciwpasozytnicze, które moglyby byc bardzo uzyteczne w leczeniu zy¬ wiciela. Korzystne jest stosowanie w leczeniu zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wyna¬ lazku w postaci kompozycji farmaceutycznych lub weterynaryjnych, które moga miec postac dawek jednostkowych odpowiednich do wybranego spo¬ sobu podawania. Preparaty farmaceutyczne lub weterynaryjne moga miec postac dawek jednost¬ kowych doustnych, np. powlekanych lub niepo- wlekanych tabletek, twardych lub miekikich kap¬ sulek zelatynowych, paczkowanych proszków, za¬ wiesin lub syropów. Moga to byc równiez czopki doodbytnicze. Niezaleznie od formy preparatu far¬ maceutycznego lub weterynaryjnego wytwarza sie go laczac co najmniej jeden ze zwiazków o wzorze 1 z odpowiednim nosnikiem farmaceutycznym lub zaróbka, takim jak np. cukier mlekowy, skrobia, talk, stearynian magnezu, poliwinylopirolidon, kwas alginowy lub krzemionka koloidalna.Ponizsze przyklady blizej ilustruja wynalazek, nie ograniczajac jego zakresu.Przyklad L l-bromo-2-etylo-3-<4-hydroiksy- benzoilo)-indolizyna.Do mieszaniny 5,3 g (0,02 mola) 2-etylo-3-(4-hy- droksylbenzoilo)-indoiizyny, 56 g (0,04 mola) tfój- wodzian octanu sodu i 50 ml kwasu octowego i 50 mb kwasu octowego wkraplano w ciagu 3 i 3/4 godz. 3,25 g (0,021 mola) bromu w 50 ml kwasu octowego. Podczas tej operacji utrzymywano tempe¬ rature 20—22°C. Mieszanie kontynuowano 3/4 godz. po czym dodano 150 ml wody. Calosc mieszano dalsza godzine, a wytworzony osad odsaczono na pompie ssacej. Osad przeksztalcono w paste w 50 ml, a nastepnie 100 ml benzenu, co dalo 6,35 g ciala stalego, które rekrystalizowano z 90 ml me¬ tanolu.W ten sposób otrzymano 4,4 g l-bromo-2-etylo- .3-(4-hydroksybenzoilo) - indolizyny. Wydajnosc: 63,9Vi. Temperatura topnienia 160—161°C. Stosu¬ jac ten sposób i odpowiednie substraty otrzymano zwiazki zestawione w Tablicy 6.Przyklad II. l-bromo-2-etylo-3 - (3-tromo-4- -hydroksybenzoilo)-indolizyna.Do mieszaniny 1,3 g (0,004 mola 2-etyIó-3-(3- -bromo-4-hydroksybenzoilo)-indolizyny, 0,6 g (0,0£ mola) bezwodnego octanu sodu i 10 ml kwasu octowego wkroplono w ciagu 3 i 3/4 godz., mie¬ szajac 0,6 g (0,004 mola) bromu w 10 ml kwa*su octowego. Podczas tej operacji utrzymywano tem¬ perature pomiedzy 20 + 22°C. Calosc mieszano jeszcze 45 min., po czym wylano do 50 ml wody.Utworzony osad odsaczono na pompie ssacej i przemyto do obojetnosci. Otrzymano 1,4 g ciala stalego, które rekrystalizowano z 20 ml chlorofor¬ mu, otrzymujac 0,7 g l-bromo-2-etylo-3-(3-bromo- -4-hydroksybenzoilo)-indolizyny. Wydajnosc: 45%.Temperatura topnienia: 213—214°C.Stosujac ten sposób i odpowiednie substraty otrzymano zwiazki zestawione w Tablicy 7.Przyklad III. 14romo-2-etylo-3-(3,5-dibTomo- -4-hydroksybenzoilo)-indolizyna.Tablica 6 Zwiazek 1 1 1 l-Bromo-2-metylo-3-(4^hydroksy- -benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-n-butylo-3-(4-hydroksy- -benzoilo)-indo!izyna 1 l-Bromo-2-n-pentylo-3-(4-hydroksy- -benzóilo)-indolizyna 1-Bromo-2-n-heksylo-3-(4-hydroksy- -benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-£-n-heptylo-3-(4-hydroksy- -benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-n-oktylo-3-(4-hydroksy- -benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-fenylo-3-(4-hydroksy- -benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-(4-rnetylo-fenylo)-3-(4- -hydroksy-benzoilo)-indolizyna 1 i-Bromo-2^(4-bromo-fenylo)-3-(4- -hydroksy-benzoUo)-indolizyna l-Bromo-2-(3-bromo-fenylo)-3-(4- -hydroksy-benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-(3-chloro-4-metylo-feny- lo)-3-(4-hydroksy-benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-(3,4-dichloro-fenylo)-3-(4- 1 -hydroksy-benzoilo)-indolizyna Temperatura topnienia °c 2 | 238—239 (dwuchloroetan) 160—162 (benzen) 155—157 (dwuchloroetan) 162—163 (dwuchloroetan) 145—149 (benzen) 132—133 (dwuchloroetan) 210 (dioksan) 197—198 (dwuchloroetan) 220—225 (benzen) 225 (czterochlorek wegla) 210 (benzen) 240 (dwuchloroetan) Do roztworu 4,2 g (0,01 moda) 2-etylo-3n(3,5-di- bromo-4-hydroksybenzoilo)-inriolizyny w 100 ml dioksanu dodano 1,6 g (0,02 mola) bezwodnego octanu sodu. Energicznie mieszajac wkroplono roz- 40 twór 1,6 g (0,01 mola) bromu w 20 ml dioksanu.Temperature podczas wkraplania utrzymywano miedzy 20 a 22°C. Calosc mieszano dobra godzine, po czym produkt wylewano do 250 ml wody. Two¬ rzyl sie zólto-zielony osad, który odsaczono, prze- 45 mywano woda do obojetnosci. Po wysuszeniu pod zmniejszonym cisnieniem otrzymano 5,2 g surowe¬ go produktu, który rekrystalizowano z 50 ml dwu- chloretanu. Otrzymano w ten sposób, po oczysz¬ czeniu weglanu aktywnym 4,2 g l-bromo-2-etylo- 90 -3-(3,5^dibroimo-4-hydroksybenzoilo)-indolizyny. Wy¬ dajnosc: 83,6%. Temperatura topnienia: 195°C., Stosujac ten sposób i odpowiednie substraty otrzymano zwia-zki zestawione w Tablicy 8.Przyklad IV. 14romo-2-etylo^3,5-dibromo- 85 -4-hydroksyibenzoilo)-indolizyna.Do mieszaniny 5,3 g (0,02 mola) 2-etylo-3-(4-hy- droksybenzoilo)-indolizyny, 17,7 g (0,13 mola) trój- wodzianu octanu sodu i 50 ml kwasu octowego wkroplono w ciagu 3 godz. 10,55 g (0,055 mola) 60 bromu w 50 ml kwasu octowego. Temperature w czasie wkraplania utrzymywano miedzy 20^-22yC.Mieszano 18 godz. Nastepnie osad odsaczono na powyzsze i przemyto kwasem octowym i woda.Do przesaczu dodano 450 ml wody i calosc ponow- 65 nie przesaczono. Dwa osady polaczono i rekrysta-125 597 13 Tablica 7 14 Zwiazek | 1 1 ; l-Bromo-2-metylo-3-(3-bromo-47 | ^ydroksy-benzoilo)-indolizyna 1 i-Bfomo-2-n-prooylor3-(3-bromo-4- | -hydrokf3F-benzoilo)-indolizyna 1 l-Brómo-2-izopropylo-3-(3-bromo-4- 1 -hydroksy-benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-n-butylo-3-(3-bromo-4- -hydroksy-benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-n-pentylo-3-(3-bromo-4- [ -hydroksy-benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-n-heksylo-3-(3-bromo-4- 1 -hydroksy-benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-n-heptylo-3-(3-bromo-4- -hydrqksy-benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-n-oktylo-3-(3-bromo^4- -hydroksy-benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-fenylo-3-(3-bromo^4- 1 -hydroksy-benzoilo)-indolizyna I l-Bromo-2-(4-metylo-fenylo)-3-(3- 1 -bromo-4-hydroksy-benzoilo)-indoli- zyna 1 l-Bromo-2-(4-metoksy-fenylo)-3-(3- -bromo-4-hydroksy-benzoilo)-indoli- zyna l-Bromo-2-(4-fluoro-fenylo)-3-(3- -bromo-4-hydroksy-benzoilo)-indoli- zyna l-Bromo-2-(4-chloro-fenylo)-3-(3- -bromo-4-hydroksy-benzoilo)-indoli- zyna 1 l-Bromo-2-(4-bromo-fenylo)-3-(3- -bromo-4-hydroksy-benzoilo)-indoli- zyna l-Bromo-2-(3-bromp-fenylo)-3-(3- -bromo-4-hydroksy-benzoilo)-indoli- zyna 1 l-Bromo-2-(2-bromo-fenylo)-3-(3- -bromo-4-hydroksy-benzoilo)-indoli- 1 zyna 1 l-Bromo-2-(3-chloro-4-metylo-fenylo)- -3-(3-bromo-4-hydroksy-benzoilo)- -indolizyna l-Broino-2-(3,4-dichloro-fenylo)-3- (3-bromo-4-hydroksy-benzoilo)-indo- lizyna 1 l-Bromo-2-metylo-3-(3-chloro-4-hy- droksy-benzoilo)-indolizyna l-Bromo-2-etylo-3-(3-chloro-4-hy- droksy-benzoilo)-indolizyna 1-Bromo-2-n-propylo-3-(3-chloro-4- -hydroksy-benzoilo)-indolizyna l-Bromo-2-izopropylo-3-(3-chloro-4- -hydroksy-benzoilo)-indolizyna Temperatura ^topnienia °C 2 245—246 (dwuchloroetan) 189—191, (benzen) 130—132 (benzen) 183—184 (benzen) 174—175 (dwuchloroetan) , 175—177 (dwuchloroetan) 165—166 (dwuchloroetan) 161.5—163 (dwuchloroetan) 184.5—186_ (benzen) 231 (dwuchloroetan) 204—205 (dwuchloroetan) 196 (benzen) 228—230 (benzen) 240—245 (dwuchloroetan) 185^186 (czterochlorek wegla) | 213—214 (benzen) 201—202 (dwuchloroetan) 207—209 ^benzen) 228 / i (dioksan) 191—192 (dwuchloroetan) 180—181 (izopropanol) 174 (benzen) | 10 15 30 35 50 60 1 1 l-Bromo-2-n-butylo-3-(3-chloro-4- -hydroksy-benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-fenylo-3-(3-chloro-4-hy- droksy-benzoilo)-indolizyna l-Bromp-2-(4-ch!oro-fenylo)-3-(3- -chrplo-4-hydroksy-benzoilo)-indo!i- zyna l-Bromo-2-(3-bromo-fenylo)-3-(3- -chloro-4-hydroksy-benzollo)-indoli- zyna 1-Bromo-2-(4-bromo-fenylo)-3-(3- -chloro-4-hydroksy-benzoilo)-indoli- zyna l-Bromo-2-metylo-3-(3-inetoksy-4- -hydróksy-benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-etylo-3-(3-metoksy-4- | -hydroksy-benzoilo)-indolizyna 2 177—178 (dwuchloroetan) 198—199 (benzen) 212^213 (dwuchloroetan) 126—128 (benzen) 231—232 (dwuchloroetan) ,155 (metanol) 160 (metanol) | 65 lizowano z czterochlorku wegla. Otrzymano 7,9 g 1-bromo - 2-etylo-3K3,5^ibromo-4-hydroksybenzo- ilo)-indolizyny. Wydajnosc: 79^/t.Przyklad V. l-bromo-2-metylo-3-(3,5-dwu- chloro-4-hydroksybenzoilo)-indolizyna.Do roztworu 3,2 g (0,01 mola) 2-metylo-3-(3,5-di- chloro-4-hydroksybenzouo)-indolizyny w 100 ml dioksanu dodano 1,6 g (0,02 mola) bezwodnego octanu sodu. Energicznie mieszajac, wkroplono 1,6 g (0,01 mola) bromu w 20°C. Podczas wkraplania utrzymywano temperature miedzy 20 a 22°C. Na¬ stepnie calosc mieszano jeszcze gadzine, po czym produkt wylano do 250 ml wody. Tworzyl sie zól- to-zielony osad, który odsaczono i przemyto woda do obojetnosci przesaczu. Po wysuszeniu pod zmniejszonym cisnieniem otrzymano surowy pro-r dukt, który rekrys-talizowano z mieszaniny 80/20 dwuchloroetan/heptan. Otrzymano po oczyszczeniu, weglem aktywnym 1,7 g l-bromo-2-metylo-3-(3,5- -dichloro-4-hydroiksybenzoilo)-indolizyny. Wydaj* nosc: 42,6°/©. Temperatura topnienia: 240°C.Stosujac ten sposób i odpowiednie substraty otrzy¬ mano zwiazki zestawione w Tablicy 9.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych pochodnych in- dolizyny o wzorze ogólnym 1, w którymi R ozna-< cza prosty lub rozgaleziony lancuch alkilowy o 1—» 8 atomach wegla, rodnik fenylowy, rodnik 3-chlo- ro-4-metylofenylowy albo 3,4-dwuchlorofenylowy lub rodnik fenylowy podstawiony jednym atomem fluoru, chloru lub bromu, lub jednym rodnikiem metylowym lub7 metoksylowym a Xi i Xt, które moga byc takie same lub rózne, oznaczaja atom wodoru, chloru, bromu lub rodnik metoksylowy, znamienny tym, ze pochodna benzoiloindolizyny o wzorze ogólnym 2, w którym R, Xi i Xt maja wyzej podane znaczenie, poddaje sie reakcji z bro¬ mem w temperaturze pokojowej,"'w odpowiednim rozpuszczalniku i w obecnosci octanu metalu alka¬ licznego. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie jako rozpuszczalnik dioksan lub kwas125 597 15 16 Tablica8 Tablica 9 Zwiazki l-Bromo-2-metylo-3-(35-dibromo- -4-hydroksy-benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-n-propylo-3-(3,5-dibromo- 1 -4-hydroksy-benzoilo)-indolizyna 1 1-Bromo-2-izopropylo-3-(3,5-dibromo-| -4-hydroksy-benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-n-butylo-3-(3,5-dibromo- 1 T4-hydrok$y-benzoilo)-indolizyna I l-Bromo-2n-pentylo-3-(3,5-dibromo- 1 -4-hydfoksy-benzoilo)-indoL'zyna 1 l-Bromó-2-n-heksylo-3-(3,5-dibromo- -4-hydroksy-benzoilo)-indolizyna 1 l-BrOmo-2*n-heptylo-3-(3,5-dibromo- -4-hydroksy-benzoilo)-indolizyna 1 l-Brom0-2-n-oktylo-3-(3,5-dibromo- -4-hydroksy-benzoilo)-indolizyna 1 l-Brotoo-2-fenylo^3-(3,5-dibrorno-4- 1 hydroksy-benzóilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-(4-metylo-£enylo)-3-(35- 1 -4-hydroksy-benzoilo)-indolizyna 1 l-Bromo-2-(4-metoksy-feriylo)-3- -(3,5-dibromo-4-hydroksy-benzoilo)- -indolizyna l-Bromo-2-(4-fluoro-fenylo)-3-(3,5- -dibromo-4-hydroksy-benzoilo)-indo lizyna l-Bromo-2K4-chloro-fenylo)-3-(3,5- [ *dibfómo-4-hydroksy*benzoiio)-indó- lizyna 1-Bromó-2-(4-bromo-fenylo)-3-(3,5- -dibromo-4-hydroksy-benzoilo)-indo- lizyna 1 1-Bromo-2-(3-bromo-fenylo)-3-(3,5- -dibi* | lizyna l-Bromo-2-(2-bromo-fenyio)-3-(35- -dibromo-4-hydroksy-benzoilo)-indo- lizyna 1- Bromo-2-(3-chloro-4-metylo-fenylo)- -3 -(3,5-dibromo-4-hydroksy-benzo- ilo)-indolizyna l-Bromo-2-(3,4-dichloro-fenylo)-3- -(3|5-dibtomo-4-hydroksy-benzoilo)* -indolizyna Tempertaura topnienia °C | 254—255 (dwuchloroetan) 183—184 (benzen) 188—189 (czterochlorek wegla) 162—163 (heptan) 139—140 (czterochlorek wegla) | 152—153 (benzen) 167—168 (benzen) | 153—154 (benzen) 211—212 (benzen) 148—150 (cykloheksan/ /czterochlorek wegla) 167—168 (izopropanol) 191—192 (benzen) 203—204 (czterochlorek wegla) 203—204 (czterochlorek wegla) 269—270 (dwuchloroetan) 176—177 (czterochlorek wegla) 214—215,5 (dwuchloroetan) 244 (benzen) • Zwiazki l-Bromo-2-etylo-3-(3,5-dichloro-4- hydroksy-benzoilo)-indolizyna l-Bromo-2-fenylo-3-(3,5-dichloro-4- hydroksy-benzoilo)-indolizyna Temperatura topnienia °C 174 (dwuchloroetan/ /heptan 90/10) | 236 (dwuchloroetan/ /heptan 90/10) octowy, a jako octan metalu alkalicznego octan sodu. 3. Spsób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania l-bromo-2-n- -propylo-3-(3,5-dibrdmo-4 - hydroksybenzoilo)-indo- lizyny poddaje sie reakcji 2-n-propylo-M3,5-*dibro- rcio-4-hydroksybenzoiloMndolizyne z bromem. 4. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania l-toomo-2-fe- nylo-3-(3-bromo-4-hydroksybenzoilo)-indolizyny pod* daje sie reakcji 2-fenylo-3-(3Jbromo-4-hydroksy- benzoilo)-indolizyne z bromem. 5. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania l-bromo-2-(4* -fluorofenylo)-3-<3-b!romo-4-hydroksybenzoilo) - iri- dolizyny poddaje sie reakcji 2-(4-fluoTofenylo)-3- -(3-bromo-4-hydroksybenzoilo)4ndolizyne z bro^ mem. ll is 20 »125 597 BA WZÓR WZÓR U Br CH2CH3J 11 n O Br WZÓR 2 A B M CHjChUJ 0 A B' WZÓR 3 OH Fig.1 WZÓR 5 SCHEM AT 1 1 1 kontrolne! M;:*I!V-i mamm Y/YsYA/l 8 10 12 % Fig. 2 Ara A &sft3!0SiBHHK /A/XyYA CO 2 & 10 12 14 16 Fig. 3 1 1 1 i IB 3K00 W/ mmmm 8 10 12 % 16 18 Fig. k ' I l I I I Ara A* LB 3K00 WtMMM M fc 10 12 % 16 B oTy^zkowa ^ Smiertelni PL