PL106942B1 - Sposob wytwarzania nowych pochodnych 1-hydroksy-3-alkilodwubenzo/b,d/piranu - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych pochodnych l-hydroksy^alkilodwu- benzo [b,d] piranu o wzorze 1, w którym oba pod¬ stawniki X i Y oznaczaja -atom wodoru badz jeden z mich oznacza atom wodoru a drugi grupe mety¬ lowa, jeden z podstawników R i R1 oznacza atom wodoru a drugi grupe hydroksylowa lub R i R1 lacznie oznaczaja atom tlenu grupy ketonowej, je¬ den z podstawników R2 i R3 oznacza atom wodoru a drugi grupe hydroksylowa lub R2 i R3 lacznie oznaczaja atom tlenu grupy ketonowej, a n ozna¬ cza liczbe 1—4. Zwiazki te wykazuja dzialanie przeciwbólowe.W opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 822 188, 3 808 234 i 3 864 492 Fager i wspólpracownicy opisali fermentacje A9—THC (l-hydroksy-3-n-pentylo-6,6,9-trójmetylo-6a,7,10,10a- -czterowodorodwubenzo[b,d]piranu za pomoca takich drobnoustrojów jak Cunninghamella bla- kesleeana, Streptomyces viridoilavus, Mucor pa- rasiticus, Aspergillus fonsecaeus i podobnych, pro¬ wadzaca do otrzymania podobnych pochodnych 4'-ihydjroksy, to jest zwiazików, w których nnpenty- 4owy lancuch boczny jest utleniony przy przed¬ ostatnim atomie wegla na skutek dzialania drob¬ noustrojów. Tak otrzymane zwiazki posiadaja wlasnosci antydepresyjne, Vidic i wspólpracownicy w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 3 897 306 opisali utlenianie izomeru (A*—THC) przez Streptomyces lavendu!lae lub Peliculiaria filamen- 25 30 tosa w celu otrzymania zupelnie innego zwiazku, w którym atoni wegla w polozeniu 7 jest hydro- ksylowany dajac pochodna 7-hydiroksy-A8—THC.Robertson i inni, Biomedical Mass Spectrometiry, 1975(2), 266^271, stwierdzaja, ze poddanie dziala¬ niu grzybem Syncephalastrum racemasum pochod¬ nych A9—THC, A8—THC, kannabinolu (3^hekBylo- -6,6,9-trójmetylo-6|H-'dwulbenzopiranol-l) i kannaibi- diolu (krystaliczny dwufenol o sumarycznym wzo¬ rze C2iH28f(OH)2 otrzymywany z dzikich konopi) prowadzi do otrzymania produktów, które posia¬ daja grupe hydroksylowa przy przedostatnim ato¬ mie wegla.Archer w opisie patentowym Stanów Zjednoczo¬ nych Ameryki nr 3928 598 stwierdzil, ze zwiazki szeregu 1^hydroksy-3Ha'l!ki!lo-'6,6a,7,840,l()a-s!zeiscao- wodoro^HHdwiuibenzoi[ib^d]piranonów^9 mozna wy¬ korzystac jako srodki antydepresyjne, przeciwileko- we, uspokajajace i przeciwbólowe. Zwiazki o takiej budowie zostaly zsyntezowane po raz pierwszy przez Fahrenholtiza i innych, J. Am. Cheim. Soc, 88, 2078 (1966), 89, 5934 (1967) jako zwiazki posred¬ nie do otrzymywania A8— lub A9—THC. (Patrz równiez opisy patentowe Stanów Zjedn. Ameryki nr 3 507 885 i 3 636 058). Ta sama grupa zwiazików A8— i A9—THC zostala omówiona przez Petrzilka w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 3 873 576.Otrzymanie l- zo[b,d]piranów badz l,9-dwuhydroksy-3-alkilo- 106942106942 3 -dwubenzo[b,d]piramów na drodze procesu chemicz¬ nego byloby niezwylkile trudne.Sposób otrzymywania nowych pochodnych Hiy- darokisy^-al!kiaodwuibeaizo[ib41piiranu polega wedlug wynalazku na tym, ze zwiazek o wzorze 2, w któ¬ rym oba podstawmiiki X i Y oznaczaja atom wo¬ doru badz jeden oznacza atom wodoru a drugi oznacza grupe metylowa, n oznacza liczbe 1, 2, 3 lub 4, jeden z podstawników R i R1 oznacza atom wodoru, a drugi grupe hydroksylowa, lub R i R1 lacznie oznaczaja atom tlenu grupy ketonowej, pod¬ daje sie utleniajacemu dzialaniu szczepu drobno¬ ustrojów Bacifl/Lus cereus.UiWeniajace dzialanie drobnoustrojów Bacillus ce¬ reus na dwubenzo-fpiranol-l-ony-9 lub dwubenzo- ' piranodiOle-1,9 moze zachodzic w standardowych warunkach fermentacji. W roztworze zawieraja¬ cymi kulture lub .,¦ wyhodowane komórki drobno¬ ustrojów mozna zebrac ponownie przeprowadzic w atan zawiesimy, a substrat dodac do otrzymanej zawiesimy.Nowe zwiazki o wzorze 1, wytworzone w proce¬ sie fermentacji, wyodrebniono ogólnie przyjetymi metodami eksitrakcji, oczyszczono metoda chroma¬ tografii cieczowej o wysokiej selektywnosci i/lub preparatywnej chromatografii cienkowarsitwowej.Budowe zwiazków oznaczono metoda spektrosko¬ pii magnetycznego rezonansu jadrowego, spekitro- skopii masowej, spektroskopii w nadfiolecie j. w podczerwieni.Sposobem wedlug wynalazku mozna otrzymac nastepujace zwiazki: Z trans-lHhy^rokBy-3-/l/, 2'Hdwuimetytloheprt;yao/- -6,6-dwumetylo-6,6a,7y8ylOglOa-szesciowodoro-9H- - a. trans-1,6', 9-trójnydroikisy-3-/i', 2'Hdwumetylo- heptyao/-6,6-dwaimetylo-^^ ro-9H-dwubenzo(b,d]piran b. trams^l,9^wnjmytiirolkisy-3-^l', 2'^dwumetyilohep- tyQoM,6^dwumetyikH6, 6a, 7, 8, 10, lOa-szesciowo- doro-9H-dwubenzo£b,d]piranon-6' c. taams-l,6'-dwuhydrolkisy-&-/l', 2'Hdwiumetylohep- tyllo/H6,6Hdwumetyilo-6, 6a, 7, 8, 10, lOanszesciowo- doro-9H-dwubenzo(b, d]piranon-9 d. /^HtranBHl^hydroiksy^3-/l', i2'-dwumetylohepty- lo/-6,6Hdwuimetylo/^6, 6a, 7, 8, 10, lOa-szesciowo- doro-9H-dwubenzo(b,d] piranpdion-6'9.Z taams-l-hydroksyHS^Il', l'Hdwumetykxktyilo/-6,- 6-diwiumetyOo^, Ga, 7, 8, 10, l<0a-fizesciowodoro^9H- HdwUbemzo|b, dlpiranonu-9. a. itrans^l,7/, 9ritrójhydroksy-3-/l', l'^dwumetylo- olkityao/-«,6Hdwumetyio-6, 6a, 7, 8, 10, lOa^azescio- wodozx-0Hndwubenzo|jb, djpiran b. traiis-il,9-dw.umydirpbsy-3n/l/, 1'^dwumetyaook- tyao/H6,6-«LwumetyilOH6, 6a, 7, 8, 10, lOa^szesciowo- doro-fl(H-dwulbenzo[b, dJpiiramon-7' v c. trams-l,7/-dwuihydroksy-3-^l/, l'-dwunietylook- tyi]o/H6,6^dwiumetyUo-6, 6a, 7, 8, 10, lOa^szesciowo- doro-fiH^dwubemzoOb, dJpiranon-9 n. /±/ntrans-l-hydroksy-3-/l', 1'ndwunietylookty- loZ-^^Hdwumetyao-e, 6a, 7, 8, 10, lOanszesciowodoro- -9H-diwiulbenzo[b, dJpiranodion-7',9. ' Z cis-l-hydrokisy-3-/l', l'-dwumetyaomepftyao/^6,6- -dwiumetyIo-6, 6a, 7, 8, 10, lOanszesciowodoro-OH- -dw/ubemzoflb, d]piffamonu-d. a. cis-1,6', 9-trójhydroksy-3-/l', l'noViumetylohep- tylo/-6, 6a, 7, 8, 10, lOa^zesciowodoro^H-dwiuben- zo[ib, djpiran. b. oiis-lv6%dwuhydroksy^3-i/il', i'-dwunietyl0hepty- 5 lo/-6, Ga, 7, 8, 10, 10a-szesciowodoro-9iH-dwubenzo- [ib, dJpiramon^9. c. cis-il,9-dwiuhydraksy-3-/l/, l'-dwumetylohepty- lo/-6,6-dwumetylo-6, 6a, 7, 8, 10, lOa-szesciowódoro- -9HHdwubenjzio[Ib, dJp;ranon-6'. io d. /±/nciis-l^hydirOk!sy^3-/l/, l'-d'wumetyloheptylo/- -6,6^dwumetylo-6, 6a, 7, 8, 10, lOa-fizesciowodoro- -9H^dwulbenzo[[b, dJpi)ranodion-6',9.Z trans-l-hydroksy-3-/l', l'^dwiumetyilopentylo/- -6,6-(dwiumetylo-6, 6a, 7, 8, 10, lOa-szesciowodoro- 15 -9H-dwiufbenzo[b, dlpiranomiu-9. a. trans-1,4', 9^trój pentylo/-6,6-dwumetylo-6, 6a, 7, 8, 10, lOa-szescio- wodoro-9H-dwubenizo[]b, djpiran. b. trans-l,9-dwuhydroksy-3-/l', l'-dwumetylopen- 20 tylo/-6,6HdwumetyilOH6, 6a, 7, 8, 10, lOa^szesciowo- doro^9H-dwubenzo[!b, d}pdiranon-4'. c. trans-l,4/^dwuihydiroikisy-3-/,l/, l^wumetylopen- tylo/-6,6wdwumetylo-6, 6a, 7, 8, 10, lOanszesciowo- doro-9HVdwubeinzo|lb, d]tpiramon-0, 25 d. /±/ntramis-l-hydrokisy-3-/l/, 1'^dwumietylopenty- lo/^6,6-dwiUmetyao-6, 6a, 7, 8, 10, lOanszesciowodo- ro-0H-dwubenzo|!b, dJpinanodion-4',9.Do innych zwiazków objetych zakresem wzoru 1 maleza: 30 cis-l5/-dwuhydroksy-lVl/,2,,6,6-(pieciomei;yao-3- -heksylo-6, 6a, 7, 8, 10, 10a-iszesciowodoro-0H-dwu-; benzo[ib, dJpdiranon-9 cis-1^2^6,6K:ziterometyio^3-ihekisylo^S, 6a, 7, 8, 10: lOa*szesciowodoro-0HHdwubenzo[!b, d]tpiiranotrdol-l,- 35 5',9 cis-l'X6,6-cziterometylo-3-pemLylo-6, 6a 7, 8, 10,- ' l0a^zesciowodoro^9HHdwubenzo [b, dlpiranotriol-1 ,- 4',9 cis-1^2^6,6-czt€rometylo-3ipenrtylo-6, 6a, 7, 8, 10 40 lOaHSzesciowodoro-giH^dwubeniz-olJb, d]piranodiol-l,- 4'-on-0 i podobne.Zwiazki okresilone wzorami 1 i 2 zawieraja cen¬ tra, asymetrii w polozeniach 6a, lOa oraz 9, gdy jeden z podstawników R lub R1 oznacza grupe 45 hydroksylowa a pozostaly oznacza a.tom wodoru.Ponadto centra asymetrii moga znajdowac sie w bocznym lancuchu grupy alkilowej, na przyklad. gdy grupa alkilowa jest grupa l,2^dwumetyilohep- tylowa, w bocznym lancuchu znajduja sie dwa 50 centra asymetrii w polozeniach C'i i CV Wyzej wspomniana synteza wedlug Fahrenholltza, w któ¬ rej podwójne wiazanie izomeryzuje z polozenia AGa/10a/ do polozenia AlO/lOa/ prowadzi do wy¬ tworzenia nacematu, w którym atom wegla w po-' 55 lozeniu 6a jesit asymetryczny, a atom wodoru'znaj¬ duje sie powyzej lub ponizej plaszczyzny skonden¬ sowanego ukladu pierscieniowego dwiubenzopiranu Uwodornienie podwójnego wiazania AlO/lOa/ przez dzialanie na przylklad aktywnym metalem cieklym 80 amoniaku prowadzi do powstania drugiego cen¬ trum asymetrii przy atomie wegUa w polozeniu lOa, ale wodór przylaczajacy sie do tego atomu wegla w warunkach uwodorniania lub redukcji bedzie zwykle zajmowal bardziej uprzywilejowana atomie wegla w polozeniu 6a, przy czym powsta¬ nie mniejsza iilosc zwiazku o komfdiguracji cis.Przez redukcje grupy ketonowej przy atomie we¬ gla w polozeniu 9 otrzymuje sie mieszanine izo¬ merów, w których grupa hydroksylowa jest w po¬ lozeniu osiowym (9ia) lulb równikowym (9(3). Tak wiec zwiazek, w którym lancuch boczny nie za¬ wiera centrów asymetrii, na przyklad l,9^dwuhy- droksy^n/l', l'^wumety{loheptylo^6,, 6a, 7, a, 10 10a-szesciowodoro^6HHdwiuibenzoi|]b, djpiran, bedzie wystepowac w postaci czterech racematów lub par racemdcznych dajac w sumie 8 stereoizomerów.Zwiazki takie jak l,9-dwuhydrokisy^3-/l/, 2'ndwu- metyaoiheptyao/-6,6Hdwumety,lo-6, 6a, 7, 8, 10, lOa- szesciowod)oiro-6H-dwubenzo [ib, djpdiraii zawieraja¬ ce dwa dodatkowe centra asymetrii w bocznym lancuchu beda posiadaly w sumie piec centrów asymetrii, mianowicie w polozeniach Ga, 9, lOa oraz w bocznym lancuchu w polozeniach C\ i C'j, dajac ogólem 32 mozliwe izomery wystepujace w postaci 16 racematów.Zwiazki posiadajace grupe ketonowa przy ato¬ mie wegla w polozeniu 9, beda posiadaly oczy¬ wiscie o jedno centrum asymetryczne mniej. Na przyklad, lnhycLrok]sy-3-/ll', l%dwumetydoheptyilo/-6 6-dwumetylo-6, 6a, 7, 8, 10, 10a-szesciowodoro-6H- -dwufbenzo[ib, d]pdiranon-9 bedzie wystepowal w po¬ staci 4 stereoizomerów zamiast 8 w jego analogach z grupa hydroksylowa w polozeniu 9.Poza tym, sposób wedlug wynalazku obejmujacy hydroksylowanie ostatniego atomu wejgla w bocz¬ nym lancuchu alkilowym prowadzi do powstania dodatkowego asymetrycznego wegla. Przypuszcza sie, ze proces hydrolksyilowania zachodzi w sposób stereoselektywny, to znaczy, ze tworzy sie w prze¬ wazajacej ilosci,- o ile nie wylacznie, jeden z dwóch mozliwych izomerów.Jesli koncowy produkt otrzymany sposobem we¬ dlug wynaflazfcu zawiera w lancuchu bocznym gru¬ pe ketonowa, nie posiada wówczas dodatkowego asymetrycznego weigla, a ilosc stereoizomerów be¬ dzie nde zmieniona w stosunku do ilosci obecnych w substracie. Proces fermentacji wedlug wynalaz¬ ku moze równiez prowadzic do powstania cen¬ trum asymetrii przy atomie weigla w polozeniu 9 na drodze redukcji zwiazku zawierajacego grupe ketonowa w polozeniu 9, uzytego jako substrat, co zwieksza o jeden ilosc asymetrycznych wegli.Przypuszcza sie, ze redukcja ta równiez przebiega w sposób stereospecyficzny, gidyz otrzymuje, sie tylko jeden z izomerów 9-hydroksy a mianowicie izomer 9S-hydiroksy. v Zwiazki wedlug wynalazku, okreslone wzorem 1, otrzymuje sie w nastepujacy sposób. liofilizowana kulture BacnilJius cereus NlELRL B-8172 hoduje sie na pozywce zawierajacej glu¬ koze, substancje mineralne, ekstralnt drozdzowy oraz inne skladniki. Nastepnie ikuflture przenosi sie do wiekszej kolby zawierajacej te sama po¬ zywke co poprzednia i drobnoustroje inkubuje sie przez okres 1^2 dni. Wtedy do kuOtury mozna dodac wybrany subsitrat, albo przygotowac zawie¬ sine komórek przez zebranie komórek z pozywki hodowlanej oraz ponowne ich przeprowadzenie w 10 15 20 25 stan zawiesiny w sterylnym roztworze buforowym.Substrat dodaje sie zazwyczaj w positaci roztworu etanolowego, a fermentacje prowadzi sie przez okres 4—8 dni. Wszystkie produkty przemiany oraz pozostaly material wyjsciowy odzyskuje sie przez ekstrakcje roztworu zawierajacego kulture, przed lub, po odfiltrowaniu komórek, rozpuszczal¬ nikiem nie mieszajacym sie z woda, takim jak octan etylu. Otrzymane ekstrakty organiczne la¬ czy sie, przemywa roztworem buforowym, suszy, filtruje, a nastepnie zateza do sucha pod obnizo¬ nym cisnieniem. Wyodrebnione w tej pozostalosci produkty fermentacji rozdziela sie nastepnie na kolumnie chromatograficznej.Alternatywnie, uitleniajacoHredukiujajce uklady en¬ zymatyczne obecne w komórkach mozna wyod¬ rebnic przez rozpuszczenie komórek, usuniecie po¬ zostalosci komórek przez odfiltrowanie i zebranie wyizolowanych enzymów w filtracie. Tak jak po¬ przednio, substrat dodaje sie do ukladu konwer- syjnego, w tym przypadku do wyizolowanego u- kladu enzymów* w odpowiednich stezeniach i mie¬ szanine reakcyjna wytrzasa sie az do wytworze¬ nia znacznej ilosci produktów o wzorze 1.Sposób wedlug wynalazku dokladniej objasnia nastepujacy przyklad.Frzytklad. Wyodrebniona plamke oznaczona jako Bacillus cereus NtEEL B^ai72 (A3fi650) hoduje sie przez 48—46 godzin na skosie, w temperaturze 25~-30°C, stosujac nastepujaca pozywke: wyciag z miesa wolowego 1,5 g, pepton 6,0 g, ekstrakt drozdzowy 3,0 g, agar 20 g, zdejonozowana woda 1 1. Pozywke sterylizuje sie w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 1i21°C. Kulture utrzy¬ muje sie na tym skosie w temperaturze 4°C. Ko¬ mórki z hodowanej przez 48—96 godzin kultury nastepnie liofilizuje sie i przechowuje w temper raturze 4°C. Ziliofildzowane komórki uzywa sie do zaszczepienia koliby z nastepujaca pozywka: 40 46 50 55 60 05 gftukoza ekstrakt drozdzowy (NH4)aS04 Na£04 KjHP04 MgS04*7 HjO FeS04-7 HjO MnSO4-4H*0 NaCl HiBO, OuS04-6 H*0 Na*MoC4-2HiO ZnSO4-7H*0 GaCli Oo01i''6H*0 zdejonizowana H*0 ao g 1,0 g 10 g 0,5 g 5,0g Mg 0,02 g 0,02 g 0,02 g 0,0 mmg 0,04 mg 0,2 mig 8,0 mg 0,05 mg 0,2 mig lfl 1. iDoprowaidza sie pH pozywki do 7,0 za pomoca stezonego wodnego roztworu kwasu solnego i ca¬ losc rozdziela sie na 50 lub 100 ml porcje w 250 lulb 500 md kolbach Erlenmeyera i kazda kol¬ be zatyka sie korkiem z waty. Kazda z erlemme- yerek zawierajacych roztwór sterylizuje sie w au- tokiLawde .tak jak poprzednio. Wysteryfllizowane kol¬ by zaszczepia sie ziMofiiizowana kultura NiRRL106942 B-8172 a nastepnieinkulbuje w temperaturze 30°C na obrcrtowej wytrzasarce (250 cta/lmin., skok 6 cm) w ciagu 24—^48 godzin.Komórki po fermentacji zbiera sie przez odwi¬ rowanie przy szybkosci obrotów 2300 otor/min w 5 czasie 20^30 mon., w temperaturze 4°C Plyn znad osadu oddziela sie przez dekantacje a zebrane ko¬ mórki przemywa sie 0,1 M fosforanowym roztwo¬ rem buforowym o pH = 6^7. Przemyte komórki przeprowadza sie ponownie w stan zawiesiny w l0 malej objetosci roztworu buforowego o ipH 7,0 badz w podobnym roztworze buforowym zawiera¬ jacym 3% glifcozy.Otrzymana zawiesine dzieli sie na 100—125 ml porcje umieszczajac w enlenmeyerkach o pojem- 15 nosci 500 ml. Do kazdej koiliby z zawiesina ko¬ mórek dodaje sie 80 mig DL-trans-a-hydroksyl-/!', l'Hdwumetyilopen!tyaio/-6,6-dwiumetyllo-6, 6a, 7, 8, 10. lOa^szesciowodoro- 9H -dwubenzo[b, d]pi{ranoou- 9 rozpuszczonego w 1,5 mil etanolu. Po dodaniu, kul- 20 ture inkubuje sie przez 4^h8 dni. Zawartosc kolb laczy sie razem i ekstrahuje czterokrotnie octa¬ nem etylu w ilosci równej polowie objetosci roz¬ tworu. Ekstrakty octanu etyJai laczy sie, przemy¬ wa dwukrotnie jedna dziesiata objetosci wody, **¦ suszy, a nastejpnie usuwa octan etylu przez odpa¬ rowanie pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymana pozostalosc zawiera niezmieniony wyjsciowy keton oraz mieszanine pieciu jwytworzonych w procesie fermentacyjnym produktów utlenienia ketonu. 30 Pozostalosc poddaje sie chromaitoigraifii cieczowej pod wysokim cisnieniem, stosujac gotowa kolumne wypelniona zelem krzemionkowym Merck 60, prze¬ myta wstepnie chloroformem pod cisnieniem azo¬ tu równym 046—0,45 ait. Pozostalosc rozpuszcza » sie w malej ojbjetosod chlorofoirmu, wstrzykuje do kolumny i chroanajtografuje mieszaninami rozpusz¬ czalników o wzrastajacych stezeniach octanu ety¬ lu. Frakcje z kolumny zawieraly te same produk¬ ty przemiany wyjsciowego ketomu jakie uzyskano ,* metoda chromatograifii cienkowarstwowej. Otrzy¬ many produkt przemiany oczyszcza sie dalej me¬ toda preparatywnej chromatografii cienkowarstwo¬ wej jak nastepuje.Pozostalosc otrzymana przez odparowanie do su- « cha polaczonych frakcji rozpuszcza sie w octanie etylu. Roztwór octanu etylu nanosi sie na cienko¬ warstwowe plytki' zelu kmzemionkowego, w ilosci 1s5—20 mg próbki roztworu na plytke. Plytki roz- - wija sie w ukladzie rozpuszczalników benzen-oc- *o tan etylu, w stosunku jak 1:1, suszy powietrzem i obserwuje w swietle nadfioletowym w celu ozna¬ czenia obszarów produktu przemiany. Obszary te eluuje. sie chloroformem i octanem etylu uzysku¬ jac czyisteprodukty. 55 Ponizej podano dalsze serie doswiadczen prze¬ prowadzonych zgodnie z powyzej opisanym sposo¬ bem postepowania.Seria L Sutostrat: DL-ltrans-l-hydroksy^3-/l', w l'-dwumetyloheptylo/-6,6-dwumetylo-6, 6a, 7y 8, 10, 10a-szesciowodoroH9HHdwu(benzO!|!b, ;;d]piranon-9; i/losc: 160 mg, czas inkubacji: 5 dni, metoda roz¬ dzialu: chromatografia na zelu krzemionkowym; przemiana: *? Produkty Rf 8 Eluernt Waga A 0,500 CHOI3 5,5 mg C 0,232 CHClsztyaEtOAy- »#/• OHOI3 10,1 mg D 179 lOtyo EtOAc- 90% CHCJI3 IV mg < Wyodrebniono równiez substrat oraz DL-trans- -l,9-dwuhydro(Jcsy-3-/l', l'ndwumetyaolieptyilio/-6,6- Hdwumetylo-6, 6a, 7, 8, 10, lOanszesciowodoro-OH- -dwubemzo|jb, d]piran (izomer 6aR, lOaR, 9R — produkt rediukcji grupy 9-keto ,do a-hydrotosylu).Zwiazki A, C i D wyodrebniono w postaci zól¬ tych olejów.- Seria II. Su/bstrat ten sam co w serii I; ilosc: 3,20 mig; czas inkubacji: 5 dni; metoda rozdzialu: ta sama co w serii I; przemiana: produkty: A, C, D patrz seria I; B Rf = 0,348, ehibwany CHC13, 17,5 mg.Seria III. Substrat: ten sam co w serii I; ilosc: 800 mg; czas inkubacji: 5 dni; metoda roz¬ dzialu: ta sama co w serii I; przemiana: produkty: A, B, C, D oraz pewna ilosc pochodnej 1,9-dwuhydroksy, bedacej produktem redukcji sulbstraitu.Zwiazek A. /±/-trans-3-/l', 1'Hdwiumetyflohep- tylo/-6, 6a, 7, 8, 10, 1Oa-szesciowodóro-1-hydroksy- -6,6-dwumetylo-9H-dwubenzoIb, d]piranodion-6', 9.Analiza w nadfiolecie: (roztwór w etanolu) kma* 208, 230 (zbocze pasma) oraz 280 om (e = 38000, 10000 i 200); analiza w podczerwieni: (roztwór w chloroformie) 3,04 (OH) oraz 5,08 um (C^p); mag¬ netyczny rezonans jadrowy protonowy: (roztwór w deutterochloroformie) 5 6,77 (simiglet odpowiada¬ jacy ffl, wymienia sie z DaO), 6£4, 6,30 (2 dub¬ lety odpowiadajace 1H kazdy, J = 2Hz, H2 i H4), 4,08 (szeroki dublet odpowiadajacy 1H,J = 14 Hz, Hid odpowiadajacy 2H, J = 7 Hiz, H5), 2,07 (singlet od¬ powiadajacy 3H, 0H3€=O), 1,47 (singdet odpowia¬ dajacy -3H, 6(3 -^CH3), 1,20 (simglet odpowiadajacy 6H, M dwie grupy CH3 przy tym samym atomie wegla) oraz 1,11 ppm (simglett odpowiadajacy 3H. 6 —CH3); dokladne oznaczenie masy czasteczkowej daje wartosc 336,2461 (obliczona dla C24H34P4 wy¬ nosi 318612457).Zwiazek B. /±/-trams^Wl', 1'^dwumetylohep- tylo/^6, 6a, 7, 8, 10, lOa^szesciowo^oro-1,6' dwuhy- dix)ksyH6,6^wiumetylo-9HHdwiubenzo0b, d]pdranon-9.Analiza w nadfiolecie: (roztwór w etanolu) \iaax 207*225 (zbocze pasma) oraz 280 mm (e = 16800, 4200 i 80); analiza w podczerwieni: (roztwór w chloroformie) 3,03 (OH) i 5,90 jim (C=0); magne¬ tyczny rezonans jadrowy protonowy: (roztwór w deuteroc.hloroforniie) 6 6,34 (singlet odpowiadajacy 2H, Hj i H4), 4,08 (szeroki dublet odpowiadajacy 1H, J = 14 Hz, Hitfd), 3,74 (multiplet odpowiada¬ jacy 1H, H^j), 3,02—ii,02 (3i2H) zwlaszcza przy 1,47 (sinrglet odpowiadajacy 3H, 60 —CH3), 1,20 (simglet odpowiadajacy 6H, dwie grupy CH3 przy tym sa¬ mym atomie wegla), 1,15 (dublet odpowiadajacy 3H, J = 6Hz, CHa-^OH) oraz 1,11 ppm (sdnglet odpowiadajacy 3H, 6a -hCH3); skrecenie plaszczyz¬ ny polaryzacji frx] 25 D +,46,3°.(C8, CHCI3); do¬ kladne oznaczenie masy czasteczkowej daje war-9 106942 10 tosc 388,2614 (obliczona dla C^HjtfCU wynosi 3&8,2613).Zwiazek C. trans-3^/1', l'-dwumetyloheptylo/-6, te, 7, 8, 10, 10a-szesciowodoro-l,9Hdwuhydroksy-6,- 6^wumetyIo^HHdw/ulbenzo|lb, d]piranon-6'.Analiza w nadfiolecie: (roztwór w etanolu) Xma* 20)8, 227 (zbocze pasma) oraz 280 nim (e = 19000, 4600 i 80); analiza w podczerwieni: (roztwór w chloroformie) 2,98 (OH) i 5y88 \vm (C=0); magne¬ tyczny rezonans jadrowy protonowy: (roztwór w deuterochloroformie) 6,34, 6,28 (dwa dublety od¬ powiadajace 1 (szeroki singlet odpowiadajacy 1H, H9 w poloze- mdu równikowym), 3,27 (szeroki dublet odpowiada¬ jacy 1H, J = 15 Hz, Hio w polozeniu równikowym), 3,0—^1^0i2 (32H) zwlaszcza przy 2,96 (szeroki simgleit odpowiadajacy 1H, Hi0a), 2,37 (triplet odpowiadaja- cy 3H, CH2-hC=0), 2,0« (sdnglet odpowiadajacy 3H, CH3C=0), 1,39 (singlet odpowiadajacy 3H, 60 —CH3), 1,19 (singlet odpowiadajacy ÓH, dwie gru¬ py CHs przy tym samym atomie wegla) oraz 1„06 ppm (singlet odpowiadajacy 3H, 6a —CHs); do¬ kladne oznaczenie masy czasteczkowej daje war¬ tosc 388,2614 (obliczona dla CuH3d04 wynosi 388,26113).Zwiazek D. trans^^l', l'-dwiunie*ylohepj;ylo/- -6, 6a, 7, 8, 10, lOaHSzesciowodoro-il,6^0Htrójhydro- ksy-6,6-dwumetylo-^H^wuibenzo(I!b, d]-piran.Analiza w nadfiolecie^ (roztwór w etanolu) Xmax 208, 225 ((zbocze pasma) oraz 275 nm (e = 30000, 7300 d 130); analiza w podczerwieni: (roztwór w chloroformie) 2,98 firn (OH); maignetyczny rezonans jadrowy protonowy: (roztwór w deuterochlorofor¬ mie) 6,34, 6,31 (dwa dublety odpowiadajace 1H kazdy, J = 2Hz, H^i H4), 4,28 (szeroki singlet od¬ powiadajacy 1H, H9 w polozeniu równikowym), 3,74 (multiplet odipowiadajacy 1H, H'6), 3^25 (szeroki dulblet odipowiadajacy 1H, J = 15 Hz, Hi0 w 'po¬ lozeniu równiikowym), 3,02-h1,0i2 (33H) zwlaszcza przy 2,96 (szeroki sdnigllet odpowiadajacy 1H, Hi0a), 1,37 lOsinglet odpowiadajacy 3ll, '60 -^CH3),1,19 (sin¬ glet odipowiadajacy 6H, idwie grupy CH3 przy tym samym atomie wegla), 1,15 (dublet odpowiadajacy 3H, J = 6 Hz, CH3CH—OH) oraz 1,06 ppm (singlet odipowiadajacy 3H, 6a —OH3); dokladne oznacze¬ nie masy czasteczikowej daje wartosc 3190,2769 (obli¬ czona dla C24H30O4 wynosi 390^2770).Charakterystyka drobnoustroju Bacillus cereus NRRL Bi8172. Bakterie te sa sklasyfikowane jako szczep BacilHus cereus ErankUand d Frankland. Sa duzymi paleczikami o ksztalcie zarodnilków, o prze¬ cietnych rozmiarach 4,7 pni X 1,6 |im, wyistepu- jaca w krótkich lancuszkach. Wystepuja w postaci GiramHdodatnie do Gram^zmielnnych i nie wydaja sie (byc rucfhliwe. Endospory sa elipsoidalne i za¬ sadniczo wystepuje centralnie lub przysrodkowo.Zarodniki otrzymuje sie z latwoscia w granicach 1®—<24 godzin na pozywce agarowej. Zarodki maja wielkosc 0,95 (iim X 1,7 (jum. Zarodnie nie sa na¬ brzmiale.Kolonie sa lekko chropowate, nieregularne, bia¬ lawo matowe, z pofalowanymi brzegami. Powierz¬ chnia kolonii jest matowa, bez wyraznego poly¬ sku. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Optymalna temperatura dla hodowli jest 30°C.Wzrost zachodzi w -temperaturach 8D^37°!C. W tem¬ peraturze powyzej 43°C rozwój nie zachodzi.W srodowisku soli amonowych, ale nie z Dngli- kozy i Dnmaitozy wytwarza sie kwas ale nie gaz.Ani kwas ani gaz nie powstaje z L^araibinozy, D- mannitu i D-ksyilozy. Nde tworzy sie indol ani H2S.Zelatyna jest szyfbko przeprowadzana w ciecz w ciagu 24 godzin, sikrobia jest hydrolizowaha, pep- tonizacja mleka i wytwarzanie kwasu jest powol¬ ne (6 dni). Kultura jest katalaza dodatnia i wy¬ twarza metyloacetylokanbinol.Kultura ta rózni sie od Bacillus megaterium tym, ze wytwarza metyloacetylokarlbinol d tym, ze nie wytwarza (kwasu z mannitu.Jak podano poprzednio zastapienie /±/-trans-l- hydiroksy-Si/l', l/^wumetyaoheptyilo/-6,6Hdwumety- I0-6, 6a, 7, 8, 10, lOa^zesciowodoro-OHHdwiubenzo- [ib, d]piranonuH9 innymi substraitaimi o wzorze 2. takim jak /±/-transH3-/l', l'^dwumetylohe(ptylo/-6,- 6Hdwumetyló^6, 6a, 7, 8, 10, 10a^szesciowodoro-i9H- dwubenzopb, d]pdranodiol-il^, w powyzszym proce¬ sie fermentacji prowadzi do otrzymania analogicz¬ nych czterech produktów: zwiazków posiadajacych albo grupe ketonowa albo hydroksylowa przy przedostatnim atomie wegla w lancuchu 'bocznym, albo grupe ketonowa albo hydroksylowa przy ato¬ mie wegla w polozeniu 0 (pierscienia dwuibenzo[b,- dlpiranu. 'Podobnie zamiast Bacallus cereus NRRL B-.8172 mozna stosowac inne drobnoustroje, takie jak Gumminighameilla tolakeselleeana, Cunningha- mella elegans, Streptomyces cinnamonous, Mucor parasijticus itp.Zwiazki wedlug wynalazku sa przydatne jako srodki przeciwbólowe. Ich aktywnosc przeciwbó¬ lowa zostala wykazana przez ich zdolnosc do ha¬ mowania skurczów u mylszy, wywolanych do- otirzewnym wstrzyknieciem kwasu octowego. Jest to typowy test laboratoryjny dla zbadania aktyw¬ nosci przeciwbólowej. Dawki polowicznej skutecz¬ nosci ED50, to znaczy wystarczajace do zahamo¬ wania skurczów w 50tyo, dla powyzszych zwiazków sa nastepujace: zwiazek A, powyzej 20 mgirtkg; zwiazek B, 8,0 .mg/kg; zwiazek C, 4,2 mg/kg; oraz zwiazek D, 2,0 mg/kg. Poza ich przydatnoscia jako srodków przeciwbólowych^ niektóre z tych zwiaz¬ ków wedlug wynalazku mozna stosowac jako zwiazki posrednie do wytwarzania innych zwiaz¬ ków wedlug wynalazku, przez redukcje lub utle¬ nianie. Na przyklad zwiazek A, zawierajacy ke¬ tonowa grupe funkcyjna przy atbmie wegla w po¬ lozeniu 9 w pierscieniu dwubenzo[fo, d]piranowym oraz przy przedostatnim • atomie wegla lancucha, mozna poddac redukcji borowodorkiem sodu w celu otrzymania zwiazku D, który zawiera grupy hydroksylowe przy tych samych atomach wegla.Podobnie zwiazki C i B mozna poddac redukcji w celu otrzymania zwiazku D.Przy zastosowaniu zwiazku wedlug wynalazku jako srodków przeciwbólowych, aktywny lek irioz- na zmieszac z farmaceutycznie' dopuszczalnjin roz¬ cienczalnikiem i mieszanina wprowadzic do zela¬ tynowych kapsulek, tak, aby kazda z 'kapsulek za¬ wierala jedna dawke usmierzajaca poszczególnego11 106942 12 lelku. Osoba wymagajaca usmierzajacego srodka moze zazywac od jednej do czterech Aaluch kap¬ sulek raz do czterech razy dziennie, zgodnie z za¬ leceniami lekarza. Srodki przeciwbólowe mozna stosowac równiez w postaci tabletek, zawiesin lub dowolnej innej.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wyiwarizainda nowych pochodnych 1- -hydroksy-3-alkilodwubenzd(b,d]piranu o wzorze 1, w którym oba podsiaiwndiki X i Y oznaczaja atom wodoru, badz jeden oznacza atom wodoru a drugi oznacza grupe metylowa, jeden z pary podstawników R i R1 oznacza atom wodoru a dru¬ gi grupe hydroksylowa lub R i R1 lacznie ozna¬ czaja atom tlenu grupy ketonowej, jeden z pary 10 15 podstawników R2 i R3 oznacza atom wodoru a po¬ zostaly oznacza grupe hydroksylowa lub R2 i R8 lacznie oznaczaja atom tlenu grupy ketonowej, a n oznacza liczbe 1, 2, 3 lub 4, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 2, w którym X, Y, R, R1 i n maja wyzej podane znaczenie, poddaje sie utle¬ niajacemu dzialaniu szczepu drobnoustrojów Ba- cillus cereus. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie szczep JBacillus cereus NRRL B-8172. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako sufostirat stosuje sie /+/-ftrains-l-hydroksy-3-/l', l/^dwlumetylohepitylo/-6,6Hdwumetyilo-6, 6a, 7, 8, 10. l 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substrait stosuje sie /+/- tylo:heptyilo/-6, 6a, 7, 8, 10, lOanszesciowodoro-SH- ^dwulbenzótb, d)pdirainodiol- Wzór t.CH, C-CH'-(CHJn-CHrCH8 X ^ NzórZ Drukarnia Narodowa, Zaklad Nr 6, zam. 28/80 Cena 45 zl PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wyiwarizainda nowych pochodnych 1- -hydroksy-3-alkilodwubenzd(b,d]piranu o wzorze 1, w którym oba podsiaiwndiki X i Y oznaczaja atom wodoru, badz jeden oznacza atom wodoru a drugi oznacza grupe metylowa, jeden z pary podstawników R i R1 oznacza atom wodoru a dru¬ gi grupe hydroksylowa lub R i R1 lacznie ozna¬ czaja atom tlenu grupy ketonowej, jeden z pary 10 15 podstawników R2 i R3 oznacza atom wodoru a po¬ zostaly oznacza grupe hydroksylowa lub R2 i R8 lacznie oznaczaja atom tlenu grupy ketonowej, a n oznacza liczbe 1, 2, 3 lub 4, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 2, w którym X, Y, R, R1 i n maja wyzej podane znaczenie, poddaje sie utle¬ niajacemu dzialaniu szczepu drobnoustrojów Ba- cillus cereus.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie szczep JBacillus cereus NRRL B-8172.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako sufostirat stosuje sie /+/-ftrains-l-hydroksy-3-/l', l/^dwlumetylohepitylo/-6,6Hdwumetyilo-6, 6a, 7, 8, 10. l
4. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substrait stosuje sie /+/- tylo:heptyilo/-6, 6a, 7, 8, 10, lOanszesciowodoro-SH- ^dwulbenzótb, d)pdirainodiol- Wzór t. CH, C-CH'-(CHJn-CHrCH8 X ^ NzórZ Drukarnia Narodowa, Zaklad Nr 6, zam. 28/80 Cena 45 zl PL